JP3869094B2

JP3869094B2 - Endotoxin measurement method

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Publication number: JP3869094B2
Application number: JP30663797A
Authority: JP
Inventors: 弘志田村; 重則田中; 真紀渡邉
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1996-10-21
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2017-10-21
Also published as: JPH10185924A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシン等の検出に用いられているカブトガニの血球成分であるアメボサイト・ライセートを活性化する反応であるリムルス反応、特にエンドトキシンに特異的なリムルス反応において、エンドトキシンにより開始する系の最初の因子であるＣ因子と反応して活性化する非エンドトキシン様物質の影響の排除手段を用いたエンドトキシンの測定方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖であり、強い発熱性物質として知られている。また、エンドトキシンは、発熱以外にもマクロファージの活性化に伴うＴＮＦ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）等の炎症性サイトカインの遊離やエンドトキシンショックの誘発等、微量でも細菌感染による様々な病態を惹き起こすことが知られている。このため、注射用医薬品等におけるエンドトキシンの検出は重要で、米国や日本の薬局方ならびに生物学的製剤基準にもエンドトキシン試験法が収載されている。また、エンドトキシンはグラム陰性菌感染症におけるショックの主な原因と考えられており、グラム陰性菌感染症の診断、その治療効果及び予後の判定並びにエンドトキシンショックの早期診断等の目的から、血漿中のエンドトキシンの測定が行われている。
【０００３】
このエンドトキシン試験法であるリムルス試験法は、グラム陰性菌由来のエンドトキシンが、カブトガニの血球抽出成分（アメボサイト・ライセート）を活性化する反応（この反応をリムルス反応、それに用いる試薬はリムルス試薬と呼ばれている）に基づき、エンドトキシンを検出する方法で、より具体的にはゲル化法、ゲルの濁度変化を指標とする比濁法、発色合成基質の加水分解による発色を指標とする比色法とに現在大きく分類される。
１９７８年に、米国ＦＤＡはウサギ発熱試験との高い相関性からそれに替わる代替法として、リムルス試験法を許可し、ワクチンや血液製剤等の生物学的製剤を含む医薬品や医療用具の安全性試験に本テストが広く適用されるに至り、わが国においても、ウサギ発熱試験の代替法として、日本薬局方や生物学的製剤基準に収載された。
【０００４】
リムルス試薬に含まれるカブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単にライセートということもある）には、エンドトキシンと反応して活性化されるカスケードタイプの凝固系（Ｃ因子系）と（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下、β−Ｄ−グルカンということもある）と反応して活性化されるカスケードタイプの凝固系（Ｇ因子系）とが共存しており（第１図参照のこと）、前者の系のみを利用してエンドトキシンを特異的に測定する方法と、後者の系のみを利用してβ−Ｄ−グルカンを特異的に測定する方法がそれぞれ知られており（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, １４９，５５−６５（１９８５）、エンドトキシン特異的測定に関して；ＷＯ９０／０２９５１、ＵＳＰ５，１５５，０３２、ＵＳＰ５，１７９，００６、ＷＯ９２／０３７３６、ＷＯ９２／０６３８１、特開平６−２５８３２６、特公平２−１８０８０、β−Ｄ−グルカン特異的測定法に関して；ＷＯ９１／１９９８１、ＷＯ９２／１６６５１）、それぞれを特異的に測定するリムルス試薬もすでに発売されている。特に我が国の生物学的製剤基準では、リムルス測定用試料中にβ−Ｄ−グルカンが混入している場合が多いため、エンドトキシンに特異的なリムルス試薬を用いることと規定されている。
【０００５】
ところで、このエンドトキシン特異的リムルス試薬といえどもリムルス測定用試料（本明細書中では、リムルス反応を用いる測定に供するための試料を意味する。）によってはエンドトキシン以外にも反応する物質があることが知られている。すなわちトリプシン、トロンビン、Ｘａ因子等のセリンプロテアーゼ（リムルス反応は、ライセート中のセリンプロテアーゼの反応を利用しており、この中の凝固酵素と類似の作用を示すため陽性となる）、キモトリプシン（Ｃ因子をエンドトキシンの非存在下で活性化するため陽性となる）等、「エンドトキシン以外で、エンドトキシン特異的リムルス反応において反応する物質（エンドトキシン特異的リムルス反応偽陽性物質）」が知られている。
そのため、これらの物質を含むリムルス測定用試料、即ち血液（全血、血漿、血清）中のエンドトキシンをリムルス試薬で測定する場合には、エンドトキシンの活性をそこなうことなく、このリムルス反応偽陽性物質を排除する方法が知られている。
【０００６】
例えば、加熱処理を前提として、界面活性剤を含む水溶液でリムルス測定用試料を希釈して、このリムルス測定用試料中の偽陽性物質の影響を排除する手段が開示されている（特開平６−１１８０８６号公報）。
また、過塩素酸（ＰＣＡ）等の酸によりリムルス測定用試料を処理して、このリムルス測定用試料中のリムルス反応偽陽性物質の影響を排除する手段（特公昭６３−５５６７１号公報）や、ポリブレン等のヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物によりリムルス測定用試料を処理して、このリムルス測定用試料中のリムルス反応妨害因子の影響を排除する手段（特開平６−７０７９６号公報）等が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、最近、主に生物学的製剤において、日本薬局方発熱性物質試験により発熱性を呈しないにもかかわらず、エンドトキシン特異的リムルス反応で陽性となる現象が観察され、生物学的製剤基準に収載されたエンドトキシン試験法（エンドトキシン特異的リムルス反応）を用いたがため、医薬品の安全性が不当に評価される可能性が生じるに至った。
本発明者らはこの現象について解析し、このエンドトキシン特異的リムルス反応において偽陽性を呈する原因物質は、従来知られているリムルス反応活性化物質とは異なり、かつ上記のいずれのリムルス反応偽陽性物質排除手段によってもこの原因物質を排除することが困難であることを突き止めた。
【０００８】
従って、それら製剤中に混入するリムルス反応偽陽性物質のリムルス反応への影響を排除して、エンドトキシンのみを正確に測定する方法を提供することが、極めて重要な課題となる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この新規の原因物質およびその排除手段等について鋭意検討した結果、驚くべきことに非加熱条件下（具体的温度については後述する）で、リムルス測定用試料を、特定濃度の界面活性剤、及び、アルキルアミンと共存させることで、この原因物質の影響をリムルス反応系から排除できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、特定の性質を有するリムルス反応活性化物質（詳細は後述する）を、特定濃度の界面活性剤とアルキルアミンとを、用いる界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させることにより不活化させる工程を含むエンドトキシンの測定方法、を提供する発明である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
Ａ．リムルス反応活性化物質の特定単離手段について：
本発明に関わるリムルス反応活性化物質（以下、本発明リムルス反応活性化物質ともいう）は、エンドトキシン特異的リムルス反応において偽陽性を呈する新規な原因物質であり、以下の手段により特定単離する。
【００１２】
すなわち、本発明リムルス反応活性化物質は、リムルス測定用試料〔主に生物学的製剤（例えば、血液製剤，ワクチン，抗生物質等：これらの生物学的製剤については後述する）〕から、本発明リムルス反応活性化物質の物理的、化学的性質を利用した各種の分離手段により精製することができる。この分離手段としては、例えば通常のタンパク沈澱剤による処理，限外濾過，ゲル濾過，遠心分離，電気泳動，ゲル浸透クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー，疎水性クロマトグラフィー，透析法等を挙げることができる。なお、これらの分離手段を適宜組み合わせて用いることができることは勿論である。
【００１３】
これらの分離手段の中でもゲル浸透クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィーを用いたゲル浸透クロマトグラフィーが好ましい。
具体的には、リムルス測定用試料を当該クロマトグラフィーカラムにかけ、エンドトキシン及びβ−Ｄ−グルカンフリーの蒸留水を溶媒として溶出させる。溶媒の流速は特に限定されないが、０．５ml／分程度が好ましい。
【００１４】
溶出させた画分にポリミキシンＢ硫酸塩の水溶液を終濃度０．５mg／mlになるように加え、エンドトキシン活性を完全に抑えて、この画分をエンドトキシン特異的リムルス試薬で測定し、陽性画分を集めることにより、本発明リムルス反応活性化物質を得ることができる。
このようにして製造され得る本発明リムルス反応活性化物質は、主にワクチンやアルブミン製剤等の生物学的製剤に存在し、以下の性質を有する。また、これらの性質については、主に後述の実施例において詳述する。
【００１５】
（１）リムルス反応活性化能を有する。
（２）エンドトキシン特異的リムルス試薬に反応する。
（３）カブトガニのアメボサイト・ライセート由来のＣ因子を活性化する。
（４）発熱性物質試験により、発熱性を呈しない。
（５）エンドトキシンでない。
（６）（１→３）−β−Ｄ−グルカンでない。
（７）セリンプロテアーゼ活性を有しない。
（８）本物質にポリミキシンＢを共存させても、本物質のリムルス反応活性化能が低下しない。
（９）本物質にコリスチンを共存させても、本物質のリムルス反応活性化能が低下しない。
（１０）本物質を０．２M の塩酸で３７℃で６０分間処理しても、本物質のリムルス反応活性化能が低下しない。
（１１）本物質を０．２M の水酸化カリウムで３７℃で６０分間処理しても、本物質のリムルス反応活性化能が低下しない。
（１２）本物質をポリオキシエチレンヘキサデシルエーテルで処理することにより、本物質のリムルス反応活性化能が消失する。
【００１６】
本発明リムルス反応活性化物質の生体内における作用、毒性等は不明であるが、ブドウ球菌外毒素のＴＳＳＴ−１（Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1）で報告されているようなエンドトキシンの毒性を増強させる相乗作用（H.Fujikawa et al.,Infect Immun., 52, 134 (1986)）あるいは炎症性メディエーターの産生等エンドトキシンと類似の生理作用、毒性を有する可能性が考えられる。従って本発明により初めて単離された、本発明リムルス反応活性化物質は、その物質の生体内及び種々病態における作用を明らかにする上で、極めて重要である。また本発明により提供される、本発明リムルス反応活性化物質の測定方法は、このようなことからエンドトキシンの測定方法同様、極めて有用な情報を提供するものである。
【００１７】
また、本発明リムルス反応活性化物質は、主に生物学的製剤等に存在すること、及び日本国外から輸入された生物学的製剤に当該物質が比較的多く含まれていることが、本発明者らにより確認されている。本発明物質の由来は定かではないが、生物学的製剤製造の過程で混入する可能性も否定できない。本発明リムルス反応活性化物質の測定方法は、生物学的製剤の製造工程における当該物質混入のチェック、および最終製品のチェックへの利用も期待され、これにより、従来よりも安全性の高い生物学的製剤の提供にもつながることが期待される。本発明リムルス反応活性化物質の測定方法については、後述する。
【００１８】
Ｂ．本発明リムルス反応活性化物質の不活化手段について（以下、本発明リムルス反応活性化物質不活化方法ともいう）：
上記の本発明リムルス反応活性化物質がリムルス測定用試料中に含まれる場合には、リムルス試薬において偽陽性反応を惹起することになり、これによって所望する物質（例えば、エンドトキシン）の検出精度が低下することになり好ましくない。
【００１９】
本発明リムルス反応活性化物質の不活化手段としては、このリムルス反応活性化物質と界面活性剤とを、この界面活性剤の凝固点を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる方法を具体的に挙げることができる。
本発明で用いられる界面活性剤としては、エンドトキシンミセルに対する解離作用の結果、リムルス反応性を損なわせるものではなく、またリムルス反応の活性化および活性型セリンプロテアーゼに対する阻害作用がないものであれば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤または天然由来の界面活性剤など特に限定されないが、エンドトキシンに対する直接作用の少ない非イオン性界面活性剤を選択することが好ましい。なお、これらの界面活性剤を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００２０】
非イオン性界面活性剤の中でも、親水性部分にポリオキシエチレンを有する構造をもつ界面活性剤（以下、「ポリオキシエチレン類」ともいう）が好ましい。ポリオキシエチレン類としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（一般式、C _nH _2n+1(OCH₂CH₂)_xOHと表され、通常省略してC _nE_xと表記する）、
アルキル鎖とポリオキシエチレン鎖の間にフェニル基が入ったポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（C_nФE_x）及びアシルポリオキシエチレンソルビタン（C_nソルビタンE_x）などが挙げられ、これらは、それぞれBrij（C_nE _x）、Triton X（C _nФE _x）、Tween （C _nソルビタンE _x）という一般的名称（商品名）で呼ばれ、膜タンパク質の可溶化など多くの目的で汎用されている。
【００２１】
本発明で用いられるポリオキシエチレン類のポリオキシエチレン鎖（上記一般式中の「(OCH₂CH₂)_xOH」部分、「Ex」とも略記する）は、特に限定されないが、ｘ＝２〜２５の整数、好ましくはｘ＝４〜２３の整数、さらに好ましくはｘ＝７〜１３の整数である化合物が好ましい。また本発明で用いられるポリオキシエチレン類のアルキル基（上記式中の「C_nH_2n+1」部分、「Cn」とも略記する）の炭素数としては、特に限定されないが、ｎ＝８〜１８の整数である化合物が好ましい。
【００２２】
このようなポリオキシエチレン類としては、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテル（ポリオキシエチレンセチルエーテルともいう）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルならびにポリオキシエチレンソルビトールエステルなどが挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテルが極めて好ましい。
またこれらの界面活性剤は水溶液として用い、一定のミセルサイズを有するものが望ましい。
【００２３】
なお、これらの界面活性剤の水溶液の溶媒は、緩衝液であってもよい。緩衝液としては、Ｃ因子系の至適ｐＨ付近に調整された（具体的にはｐＨ７〜９程度）緩衝液であることが好ましく、例えばグッド緩衝液〔例えば、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸緩衝液），コラミンクロリド緩衝液，ＢＥＳ緩衝液，ＭＯＰＳ緩衝液，ＴＥＳ緩衝液，ＨＥＰＰＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸），Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液，グリシンアミド緩衝液，Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液，ＴＡＰＳ緩衝液等〕，トリス−塩酸緩衝液等を挙げることができる。
【００２４】
本発明リムルス反応活性化物質と共存させるこの界面活性剤の量は、本発明リムルス反応活性化物質の存在量や共存させる界面活性剤の種類、量等に応じて適宜変更可能であり、特に限定されない。具体的な界面活性剤の濃度としては、リムルス測定用試料に接した際の終濃度として、通常０．００５％〜０．８％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１％〜０．５％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは０．０５％〜０．３％（Ｗ／Ｖ）等が例示されるが、これらはあくまで例示であって、これらに限定されるものではない。
【００２５】
さらに界面活性剤水溶液にエンドトキシンフリーとする手段、例えば活性炭処理，メンブランフィルター処理，オートクレーブ処理等を施して、所望する界面活性剤水溶液を調製することができる。
【００２６】
界面活性剤又は界面活性剤の水溶液等をリムルス反応活性化物質を含むリムルス測定用試料と共存させる際の順序及び方法としては、界面活性剤がなんら修飾を受けることなくまた破壊されることなく、リムルス測定用試料中に所定の濃度になるよう共存されていればとくに限定されない。リムルス測定用試料と界面活性剤とを共存させる方法は、通常、リムルス測定用試料と界面活性剤とを添加して、十分混合することにより達成される。また、リムルス測定用試料と界面活性剤とを共存させる順序は、リムルス試薬中に界面活性剤等を加えておき、リムルス測定用試料との混合及び反応を同時に行っても発明の目的を達することができるが、リムルス反応の前に予めリムルス測定用試料と混合されている方が効果の点でより望ましい。リムルス測定用試料に混合する該界面活性剤等の水溶液の量としては、リムルス測定用試料１容に対して界面活性剤溶液０．１〜１０容で行うのが好ましいが、リムルス測定用試料中に所定の濃度の界面活性剤等が加えられ、かつその有効濃度が維持されていれば特に限定されない。
【００２７】
さらに、本発明リムルス反応活性化物質を不活化させるためには、上記の界面活性剤を、この界面活性剤の凝固点を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる必要がある。この界面活性剤の凝固点以下の温度では、界面活性剤とリムルス反応活性化物質とが共存した溶液が凍結してしまい、所望する不活化反応を円滑に進行させることが困難になり、５０℃を超えるとエンドトキシン等の測定対象物質も不活化されてしまい、その正確な測定が困難になるため好ましくない。
【００２８】
また、好ましくは１℃以上５０℃以下、より好ましくは４℃以上５０℃以下、さらに好ましくは４℃以上４５℃以下、特に好ましくは１５℃以上４０℃以下の温度下で、本発明リムルス反応活性化物質を界面活性剤と接触させることができる。
この点は特に本発明と同じく界面活性剤を用い、積極的に加熱することによってリムルス反応の偽陽性物質を不活化する従来技術（特開平６−１１８０８６号公報）と大きく異なる点である。
【００２９】
リムルス測定用試料と界面活性剤とを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる時間としては、とくにエンドトキシン分子及びその会合ミセルが物理化学的に安定で、容器へ吸着することがなければとくに限定されないが、通常数秒から５分間であり、１分間から２分間程度で十分である。このように、本発明で使用する界面活性剤のリムルス反応活性化物質に対する不活化作用に関しては、非常に短い時間でその目的を達することができる。
【００３０】
以上に述べた、本発明リムルス反応活性化物質不活化方法は、リムルス測定用試料中の本発明リムルス反応活性化物質の不活化にもそのまま適用できる。
本発明は、このようにリムルス測定用試料と界面活性剤とを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる、本発明リムルス反応活性化物質を不活化するための界面活性剤の使用を包含する。また後述するように、リムルス測定用試料に、界面活性剤に加えてアルキルアミンを共存させることがより好ましいことから、本発明には、リムルス測定用試料、界面活性剤及びアルキルアミンを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる、本発明リムルス反応活性化物質を不活化するための界面活性剤の使用も包含される。
【００３１】
このように、前記の本発明リムルス反応活性化物質を不活化する手段が提供され、これにより直接的には、界面活性剤により本発明リムルス反応活性化物質が不活化されたリムルス測定用試料が提供されるが、この不活化手段は、種々の形態において用いることが可能である。
例えば、リムルス測定用試料と界面活性剤とを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させることを前提とした、界面活性剤を含んでなるリムルス反応活性化物質の不活化剤としての形態に応用することが可能である。
【００３２】
また、この不活化剤を含んでなるリムルス試薬や、このリムルス試薬を含んでなるリムルス測定用キットあるいは不活化剤とリムルス試薬とを含んでなるリムルス測定用キットとしての形態に応用することも可能である。
ところで、本明細書中において「リムルス測定」とは、リムルス反応を用いる測定を意味し、「リムルス測定用キット」とは、リムルス反応を用いる測定に使用する、少なくともリムルス試薬を含むキットを意味する。
なお、リムルス測定用キットには、上記のリムルス試薬の他に、必要により任意の構成試薬を付加することができる。そのような試薬としては、例えばブランクテスト用蒸留水，反応試薬溶解・反応用緩衝液等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
このように本発明は、界面活性剤を含んでなる本発明リムルス反応活性化物質の不活化剤、およびこの不活化剤を含んでなるリムルス試薬及びリムルス試薬とこの不活化剤とを含むリムルス測定用キットをも提供する。なおこのリムルス試薬は、エンドトキシン特異的リムルス試薬であることが好ましい。
さらに本発明は、リムルス測定用試料に界面活性剤を、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させることを特徴とする、本発明リムルス反応活性化物質のリムルス反応に対する影響をリムルス測定用試料から排除する方法も包含する。
【００３４】
さらに本発明は、このようにして界面活性剤により本発明リムルス反応活性化物質が不活化されたリムルス測定用試料を包含する。
なお、ここに述べた本発明リムルス反応活性化物質を不活化させる対象となるリムルス測定用試料は、リムルス反応を用いてエンドトキシン等を検出するべき対象であれば特に限定されないが、特に本発明リムルス反応活性化物質の存在が多く認められる生物由来のリムルス測定用試料が好ましく、生物学的製剤が特に好適な対象となる。
【００３５】
この「生物学的製剤」は、全血を含む血液分画、すなわち全血，血漿，血清等を除外する概念である。具体的には、ワクチン製剤〔一般的にワクチンの接種により標的ウィルスに対する血中抗体価を上昇させ罹患率を低下させることを目的として調製されたものであり、通常ウィルス粒子を鶏卵尿膜腔内や脳内等の標的宿主内で増殖させた後、高度に精製したウィルス粒子を分解、不活化して得られる不活化ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン（インフルエンザＨＡワクチン），日本脳炎ワクチン等）又は弱毒化ワクチン等が挙げられる。〕、血液製剤〔通常血漿を出発材料とし、ｐＨ，イオン強度，エタノール濃度等の条件を種々変化させ、タンパク質の溶解度に基づく分別沈澱法（Ｃｏｈｎ分画法等）を用いて、高純度に分画、調製されたヒト血清アルブミンなどのヒト血漿タンパク質等〕、又は抗生物質等を挙げることができる。
【００３６】
なお、上記のワクチンは、通常ゼラチン等の安定化剤を加えた無色透明若しくはわずかに白濁した無臭の液状品としての形態を採る。また、凍結乾燥製剤もあり、これはやや黄白色味を帯びた粉状固体で、通常蒸留水を規定量加えることにより液状の形態で使用する。
【００３７】
Ｃ．本発明リムルス反応活性化物質の不活化手段を用いることによる、エンドトキシンの測定手段（以下、本発明エンドトキシン測定方法ともいう）：
このような本発明リムルス反応活性化物質の不活化手段を用いることにより、下記の工程を含んでなる、リムルス測定用試料中のエンドトキシンの測定方法が提供される。
下記の工程を含むリムルス測定用試料中のエンドトキシンの測定方法：
（１）リムルス測定用試料、界面活性剤及びアルキルアミンを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において、当該界面活性剤の終濃度が０．００５〜０．８％（Ｗ／Ｖ）となるように共存させる第１工程；
（２）第１工程により得られたリムルス測定用試料を、リムルス試薬によるリムルス反応を行わせて、エンドトキシンを測定する第２工程。
【００３８】
第１工程において、特定濃度の界面活性剤に加えてアルキルアミンを加えることにより、エンドトキシンの会合状態、分散状態を良好に維持することができ、溶解性や菌種による反応性の差を可能な限り小さくでき、再現性のあるデータが得られることが、本発明者らにより初めて見出された。また、リムルス測定用試料は、生物学的製剤であることが好ましい。好ましい生物学的製剤については前記した。
【００３９】
なお、本発明エンドトキシン測定方法は、前記した界面活性剤を含んでなる本発明リムルス反応活性化物質の不活化剤を含むリムルス試薬を用いることにより、より簡便に実施することができる。
また、本発明エンドトキシン測定方法において用いることができるリムルス試薬は、エンドトキシンの検出が可能なものであれば特に限定されないが、本発明リムルス反応活性化物質がエンドトキシンの検出系で偽陽性となることから、エンドトキシン特異的リムルス試薬であることが好ましい
【００４０】
ただし、リムルス測定用試料中にβ−Ｄ−グルカンが含有されていないことが明らかな場合には、エンドトキシン特異的リムルス試薬を必ずしも用いる必要はなく、エンドトキシンとβ−Ｄ−グルカンの両方を検出するリムルス試薬も用いることができる。
【００４１】
リムルス試薬としては、エンドトキシンの検出が可能なものであれば、合成基質法（エンドポイントアッセイ，カイネティックアッセイ）の他にも通常のゲル化ならびに比濁法（エンドポイントアッセイ，カイネティックアッセイ）等、特に限定されない。各種市販のリムルス試薬としては、トキシカラーシステムＬＳ−６，ＬＳ−２０，ＬＳ−２００，エンドスペシーＥＳー６，エンドスペシーＥＳー２００，パイロディック，プレゲル，プレゲルーＳ，プレゲルーＭ，パイロテルマルチテスト，パイロテルシングルテスト，パイロテルーＴ（以上、生化学工業販売）、リムルスＪテストワコー，リムルスＨＳ−Ｊテストワコー，リムルスＪシングルテストワコー，リムルスＨＳ−Ｊシングルテストワコー，リムルスＦテストワコー，リムルスＨＳ−Ｆテストワコー，リムルスＦシングルテストワコー，リムルスＨＳ−Ｆシングルテストワコー，リムルスＥＳ−IIテストワコー，リムルスＥＳーIIシングルテストワコー，リムルスＥＳ−III テストワコー，リムルスＥＳーＪテストワコー（以上和光純薬販売），パイロジェント，パイロジェントマルチテスト，パイロジェントシングルテスト，ＱＣＬ−１０００，カイネティックＱＣＬシステム（以上バイオウィッテーカー社製造、第一化学薬品販売），コーテストエンドトキシン（クロモジェニックＡＢ社販売），エンドクローム，エンドクロームーＫ（以上チャールスリバーラボラトリー社エンドセーフ販売）パイロセート（ヘマケム社販売）、パイロクローム（ケープコッド社販売）を挙げることができる。
【００４２】
これら市販のリムルス試薬の中で、エンドトキシンに特異的なものとしては、エンドスペシーとリムルスＥＳテストの２タイプを挙げることができる。また、これらの市販のリムルス試薬に限定されることなく、エンドトキシンとの反応により、Ｃ因子系の一連の酵素系（凝固系）が活性化されるものであれば、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス，タキプレウス・ロタンディカウダ（以上アジア産カブトガニ）、ならびにリムルス・ポリフェムス（北アメリカ産）属のカブトガニ血球から公知の方法でライセートを調製し、使用することも可能である。
【００４３】
具体的にはこれらカブトガニの血リンパ液から、例えば、J. Biochem.,80,1011-1021(1976)に記載の方法で、ライセートを調製することができる。「エンドトキシン特異的リムルス試薬」は、上記ライセートのＧ因子を特異的に阻害または吸着、除去すること（例えば、ＷＯ９０／０２９５１、ＵＳＰ５，１５５，０３２、ＵＳＰ５，１７９，００６、ＷＯ９２／０３７３６、ＷＯ９２／０６３８１、特願平５−６１４６４、またはＣ因子系成分を分画、再構成すること（例えば、特公平２−１８０８０、特公平３−１８０８０、Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, １４９，５５−６５（１９８５））により調製することができる。
【００４４】
また、Ｃ因子、後述のペプチド合成基質、緩衝液、２価金属塩等、あるいはＣ因子、Ｂ因子、後述のペプチド合成基質、緩衝液、２価金属塩等からも調製することができる。
ペプチド合成基質としては、活性型Ｃ因子の基質となり得るペプチド（例えば、Ｎ末端が保護されたＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ等の配列からなるペプチド、メトキシカルボニル−Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のＣ末端のアルギニンのカルボキシル基に発色性残基（例えば、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）アニリン、ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アニリン等）、発蛍光性残基（例えば、７−アミノメチルクマリン等）、発光性残基あるいはアンモニアなどがアミド結合により置換したペプチド合成基質が例示される。
すなわち、アミダーゼ活性を測定することによるエンドトキシンの測定は、活性型Ｃ因子がこれらの合成基質に作用して生成する反応生成物（ｐ−ニトロアニリン、アンモニア等）を測定することによって行うことができる。
具体的には被検液と、Ｃ因子、緩衝液、２価金属塩等を含む反応系に上記ペプチド合成基質を共存させて反応（必要に応じて生成物の他色素等への変換反応）させ、反応によって生成する色素、発蛍光物質、発光物質またはアンモニアを、それぞれ分光光度計（特公昭６３−２６８７１、特公平３−６６３１９等）、蛍光光度計、化学発光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４８８６０）等によって測定するという、すでにエンドトキシンの測定に採用されている方法を用いることができる。
【００４６】
リムルス測定用試料、界面活性剤及びアルキルアミンの三者を共存させる方法は特に限定されないが、アルキルアミンをあらかじめ界面活性剤と所定の濃度になるよう適宜混合した後、その混合液をリムルス測定用試料に直接混合等する方法が好ましい。リムルス測定用試料に対してアルキルアミンが所定の濃度に維持されていれば、アルキルアミンを共存させた後に界面活性剤を共存させる方法、または界面活性剤を共存させた後にアルキルアミンを共存させる方法、あるいはリムルス試薬の中にあらかじめアルキルアミンを共存させておく方法など、特に限定されない。
【００４７】
例えば、所定の濃度に調製された界面活性剤の水溶液に、アルキルアミンを通常、リムルス測定用試料に接触したときの終濃度で０．０００１％以上，０．０５％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは同０．００２％以上，０．０１％（Ｗ／Ｖ）以下になるよう添加するだけで、容易にその効果を発揮させることができ、本発明の効果を一層高めることが可能になった。
【００４８】
なお、アルキルアミンの含有量が、０．００１％（Ｗ／Ｖ）未満であると、所望する効果を発揮させることが困難となり好ましくなく、０．０５％（Ｗ／Ｖ）を越えると、含有量の増大に見合った効果の増強が現れず好ましくない。
【００４９】
アルキルアミンは置換基を有していてもよく、通常極性溶媒、水に可溶で容易に分解されることがないものであれば、とくに限定されないが、好ましくはメチルメタンアミン、エチルエタンアミン等の２級アミン、より好ましくは、ジメチルアミン、ジエチルエタンアミン等の３級アミンを挙げることができる。具体的には、Ｎ−エチルエタンアミン（ジエチルアミン）、２、２’−イミノジエタノール，ビス（２ーヒドロキシエチル）アミン（ジエタノールアミン）、Ｎ，Ｎージメチルメタンアミン（トリメチルアミン）、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン（トリエチルアミン）、トリス（２−ヒドロキシエチル）アミン（トリエタノールアミン）などを例示することができる。
【００５０】
Ｄ．本発明リムルス反応活性化物質の測定手段（以下、本発明リムルス反応活性化物質測定方法ともいう）：
本発明は生物学的製剤等に存在する本発明リムルス反応活性化物質を不活化し、エンドトキシンのみを特異的に測定する方法、すなわち医薬品の安全性試験をより適切に遂行する方法を提供するが、同時に本発明リムルス反応活性化物質のみを特異的に測定する方法を提供する。具体的には、本発明リムルス反応活性化物質及びエンドトキシンの総量（リムルス試薬と反応する物質の総量）を通常のリムルス試験を用いて測定し、種々の手段にて得られたエンドトキシンのみの値を差し引くことにより算定する。
【００５１】
また、エンドトキシンを酸、アルカリ又はポリミキシンＢ，コリスチン等のポリミキシン類等の、エンドトキシンのみを特異的に不活化する性質を有する物質（エンドトキシン不活化物質ともいう）を用いて、エンドトキシンのみを不活化し、本発明リムルス反応活性化物質を通常のリムルス試験で測定する方法も、本発明に包含される。
【００５２】
なお、これらのエンドトキシン不活化物質のうち、ポリミキシンＢ，コリスチン等のポリミキシン類は本物質の測定値を必ずしも正確に反映し得ない場合がある。すなわちポリミキシン類のエンドトキシン中和作用を抑制する物質がリムルス測定用試料中に共存する場合等がある。これに対して、酸又はアルカリで処理する場合は、このような問題点がなく、好ましいエンドトキシン処理方法として挙げることができる。
【００５３】
ここで、用いる酸は特に限定されないが、塩酸，硫酸，硝酸等の強酸が好ましい。また、アルカリも特に限定されないが、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の強アルカリが好ましい。通常、リムルス測定用試料に酸またはアルカリを添加し、共存させることによってリムルス測定用試料を処理する。
【００５４】
リムルス測定用試料中のこれらの酸又はアルカリの濃度は特に限定されるものではないが、リムルス測定用試料中の終濃度で０．０５M 以上が好ましく、０．０５〜０．２M 程度がより好ましい。
【００５５】
なお、エンドトキシン不活化済のリムルス測定用試料は、リムルス試薬による測定前に中和しておく必要がある。中和後、ｐＨが６〜９程度となるように中和することが好ましい。
【００５６】
具体的には、本発明は、下記の工程を含んでなる本発明リムルス反応活性化物質の測定方法である。
（１）リムルス試薬を用いて、リムルス測定用試料中のリムルス試薬と反応する物質を測定する第１工程。
（２）別途、本発明エンドトキシン測定方法で、リムルス測定用試料中のエンドトキシンを測定する第２工程。
（３）第１工程で得られたリムルス試薬と反応する物質の測定値と、第２工程で得られたエンドトキシンの測定値との差を用いて、本発明リムルス反応活性化物質の量を算出する第３工程。
【００５７】
ここでリムルス試薬は、第１工程で用いるリムルス試薬と、第２工程で用いるリムルス試薬とが、同種の試薬であることが必要である。すなわち、第１工程でエンドトキシン特異的リムルス試薬を用いる場合、第２工程でもエンドトキシン特異的リムルス試薬を用いる必要がある。用いることができるリムルス試薬は、前記した本発明エンドトキシン測定方法において用いることができるリムルス試薬と同様であり、エンドトキシン特異的リムルス試薬であることが好ましい。
【００５８】
また本発明は、下記の工程を含んでなる、リムルス測定用試料中の本発明リムルス反応活性化物質の測定方法も包含する。
（１）リムルス測定用試料をエンドトキシン不活化物質、特に酸又はアルカリで処理する第１工程。
（２）第１工程により得られたエンドトキシン不活化済のリムルス測定用試料を、リムルス試薬によるリムルス反応を行わせて、この反応系における変化を測定することにより本発明リムルス反応活性化物質を測定する第２工程。
なお、第１工程により得られたエンドトキシン不活化済のリムルス測定用試料は、リムルス試薬による測定前に中和しておく必要があることは上記した通りである。
また、ここで用いるリムルス試薬は、エンドトキシン特異的リムルス試薬であることが好ましい。
【００５９】
Ｅ．生物学的製剤中の真のエンドトキシン量の測定手段（本発明の生物製剤中エンドトキシン測定方法）
本発明の生物製剤中エンドトキシン測定方法は、従来公知の方法では不可能であることが判明した、生物学的製剤中の真のエンドトキシン量のリムルス反応による測定を可能にしたものである。本発明方法は、生物学的製剤中に含まれる本発明リムルス反応活性化物質を不活化し、その後リムルス試薬によりエンドトキシンを測定する一連の方法を包含する。
【００６０】
生物学的製剤中の本発明リムルス反応活性化物質の不活化は、リムルス試薬測定に供する生物学的製剤と界面活性剤とを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる、界面活性剤の使用により達成される。
また前記したように、リムルス試薬に供する生物学的製剤には、界面活性剤に加えてアルキルアミンを共存させることが好ましく、すなわちリムルス試薬測定に供する生物学的製剤、界面活性剤及びアルキルアミンを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる、界面活性剤とアルキルアミンの使用がより好ましい。
【００６１】
また本発明は、界面活性剤を、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させ、前記請求項１記載のリムルス反応活性化物質を不活性化することを特徴とする、リムルス試薬測定に供する生物学的製剤の前処理方法も包含する。
さらに本発明は、この前処理方法により得られる、界面活性剤により前記請求項１記載のリムルス反応活性化物質が不活化されていることを特徴とするリムルス試薬測定に供するための生物学的製剤も包含する。
【００６２】
このような生物学的製剤中のリムルス反応偽陽性物質の不活化により、下記の工程を含んでなる、生物学的製剤中のエンドトキシンの測定方法が提供される。
（１）生物学的製剤及び界面活性剤を、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下の温度において共存させる、この生物学的製剤中の前記請求項１記載のリムルス反応活性化物質を不活化する第１工程；
（２）第１工程により得られた生物学的製剤を、リムルス試薬によるリムルス反応を行わせて、この反応系における変化を測定することによりエンドトキシンを測定する第２工程。
【００６３】
なお第１工程において、リムルス測定用試料、界面活性剤及びアルキルアミンを、この界面活性剤の凝固点温度を超える温度から５０℃以下において共存させることがより好ましい。
また、用いることができるリムルス試薬は、前記した本発明エンドトキシン測定方法において用いることができるリムルス試薬と同様であり、エンドトキシン特異的リムルス試薬であることがより好ましい。
【００６４】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔製造例〕本発明リムルス反応活性化物質の製造
インフルエンザＨＡワクチン（ＩＨＡ−ＬｏｔＡ）及び日本脳炎ワクチン（ＪＥＣ−ＬｏｔＡ）５０μl をＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷとＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（いずれも東ソー製、いずれのカラムサイズも７×３０mm，容積１４．３cm³）とを連結させた高速液体クロマトグラフィーを用いたゲル浸透クロマトグラフィーにアプライし、エンドトキシン及びβ−Ｄ−グルカンを除去した蒸留水を溶媒として、０．５ml／分の流速で溶出させて１mlずつ分画した。インフルエンザＨＡワクチンを用いたときの溶出パターンを第２図に示す。
溶出した各画分にポリミキシンＢ硫酸塩の水溶液を、終濃度０．５mg／mlとなるように加え、エンドトキシン活性を完全に抑えた後、エンドスペシー〔エンドトキシン特異的リムルス試薬，生化学工業株式会社販売）で、リムルス反応活性を測定し、その陽性画分（活性を有する画分）を集め、本発明リムルス反応活性化物質を得た。
【００６５】
〔実施例１〕ワクチン製剤に混入するリムルス反応活性化物質とエンドトキシンの物性ならびに諸性質の比較
第１表に、インフルエンザＨＡワクチン（ＩＨＡーＬｏｔＡ）及び日本脳炎ワクチン（ＪＥＣーＬｏｔＡ）から、上記製造例において製造した本発明リムルス反応活性化物質の物性を各種精製エンドトキシン（E.coli 0111:B4, E.coli 055:B5, E.coli UKT-B, Salmonella minnesota R595, S.marcescens, S.typhimurium, S.abrtus equiより調製したWestphal型のエンドトキシン）と比較検討した結果を示す。それぞれ、表下に示した条件下で各リムルス測定用試料を処理した後、これらをエンドトキシン特異的リムルス試薬（エンドスペシー、生化学工業）とエンドトキシン及び(1→3)-β-D-グルカンフリーのマイクロタイタープレート（トキシペットプレート96F、生化学工業）を用いて30分間マイクロプレートレーダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業）内で反応させ、1分間当たりの吸光度［A405nm-492nm（対照波長）］変化率（mAbs/min）からエンドトキシン濃度を自動算出し、無処理のコントロールを100%としたときの、リムルス反応活性化物質とエンドトキシンの残存活性（%）を求めた。第１表より、インフルエンザＨＡワクチン、日本脳炎ワクチン等に混入するリムルス反応活性化物質は、カブトガニ血球中に存在するエンドトキシン感受性因子（Ｃ因子）を直接活性化する作用を有する、非セリンプロテアーゼ（Ｃ因子に対する活性化能及び凝固酵素前駆体に対する活性化能もなく、また合成基質に対する直接水解能もない）かつ非(1→3)-β-D-グルカン（Ｇ因子に対する活性化能がない）の分子で、高分子両親媒性ミセルを形成するエンドトキシンと類似の物性を有することが明らかとなった。なお、本活性化物質は低温下で長時間放置してもガラス試験管への吸着もなく、リムルス活性を安定に保持する性質を有することが判明した。
【００６６】

【００６７】
注）・発熱性：日本薬局方に記載のウサギ発熱試験に準じて実施、3時間後の最高体温（直腸温）から開始時の体温を差し引いた値が >0.55℃の時陽性とする。
・ポリミキシンＢ：同硫酸塩の水溶液（Sigma社，使用時：0.5mg/ml）
・酸：0.2M塩酸，37℃，60分処理
・アルカリ：0.2M水酸化カリウム，37℃，60分処理
・熱安定性：100℃、60分間処理
・溶液安定性：0.02M リン酸緩衝液（pH 7.0）、４℃、１０日間放置
・合成基質：Boc-Leu-Gly-Arg-pNA・塩酸塩（反応時：3.0 mM）
・Ｃ因子活性化能：精製Ｃ因子（Nakamura T.et al.,Eur.J.Biochem.154 ,511 -521(1986)の方法にて調製）を使用し、活性型Ｃ因子の合成基質のアミダーゼ活性により測定。
・抗Ｃ因子抗体による阻害：Ｃ因子に対するマウスモノクローナル抗体（２Ｃ１２）の250倍希釈液をリムルス測定用試料１容に対し１容添加後に測定を開始。
【００６８】
・Ｇ因子活性化能：精製Ｇ因子（Obayashi T.et al.,Clin.Chi,.Acta, 149, 55-65(1985)の方法にて調製）を使用し、活性型Ｇ因子の凝固酵素前駆体活性化能を合成基質のアミダーゼ活性により測定。
・凝固酵素前駆体活性化能：Ｇ因子同様、Obayashiらの方法により精製した凝固酵素前駆体の活性型凝固酵素への活性化能を合成基質のアミダーゼ活性により測定。
・金属イオン：NaCl,KCl,MgCl₂,CaCl₂水溶液（処理時：0〜1.5M）
・エンドトキシン吸着体：END-X-B15（カブトガニ血球中のエンドトキシン中和因子をリガンドとする吸着体、ケープコッド社製造、生化学工業販売）、パイロセップA&C（ヒスチジンをリガンドとする吸着体、田辺製薬製造、和光純薬工業販売）に接触させ、その未吸着画分を集め、エンドスペシーでエンドトキシンを測定した後、担体への吸着率（%）を算出。
＊：実施例２参照
【００６９】
〔実施例２〕リムルス反応活性化物質とエンドトキシンに対する各種界面活性剤の影響
上記製造例において製造したインフルエンザＨＡワクチン（ＩＨＡーＬｏｔＡ）又は日本脳炎ワクチン（ＪＥＣ−ＬｏｔＡ）から得た本発明リムルス反応活性化物質及びE.coli 0111:B4エンドトキシン（Westphal type、以下Et-B4、2EU/ml）25μｌをトキシペットプレート96Fに取り、ポリオキシエチレン系等の非イオン性界面活性剤（商品名Tween、Triton、Brij等、Sigma社、Aldrich社、和光純薬、同人化学研究所販売）の水溶液25μlを加え良く混合した後、エンドスペシー 50μlを添加し37℃、30分間反応させた後、実施例１と同様に、蒸留水をコントロールとして残存活性（％）を算出した。第２表より、適当な濃度の界面活性剤を添加すると、界面活性剤によっては両者の残存活性に大きな差異が認められることが判る。たとえば、Brij56と混合することにより、エンドトキシンの活性を良好に保ったまま、IHA中に混入するリムルス反応活性化物質を完全に不活化できることが明らかである。第２表から明らかなように、Brij56のほかにも、Triton N-101やTergitolなど類似の作用を有する界面活性剤があり、このような界面活性剤の水溶液をリムルス測定用試料中に適宜共存させておくことにより、リムルス測定用試料中に混入するリムルス反応活性化物質のリムルス反応への影響（偽陽性）を排除し、エンドトキシンのみを特異的に測定できることが見い出された。
【００７０】
【表１】

【００７１】
〔実施例３〕各種生物学的製剤中のエンドトキシン測定に対する各種界面活性剤の効果
リムルス反応活性化物質を高濃度に含む生物学的製剤［インフルエンザＨＡワクチン（ＩＨＡーＬｏｔＢ、原液）、日本脳炎ワクチン（ＪＥＣーＬｏｔＢ、原液）及び2.5%(W/V)に調製した人血清アルブミン（ＨＳＡーＬｏｔＹ１）］25μlをマイクロプレートにそれぞれ分注し、Tergitol、Triton N-101及びBrij 56（いずれもSigma社販売）の各水溶液25μlを混合時に0.004〜0.25% (W/V)になるように加え、良く攪拌（室温で１分間）した後、エンドスペシー50μlを加え、実施例１に示す方法でエンドトキシン濃度を求め、その値が無添加（蒸留水）をコントロールとした時の値に比べどの程度残存したか、そのリムルス活性残存率（%）を算出した。また、リムルス反応活性化物質をほとんど含まない各種生物学的製剤に既知濃度（1.2EU/ml）のエンドトキシン（Et-B4）を添加し、蒸留水を100%として添加回収率（%）を算出した。第３表より明らかなように、適当な濃度に調製した界面活性剤の水溶液を用いれば、非特異的なエンドトキシンの反応が残存せず、エンドトキシンのみを特異的に測定し得る条件を設定することが可能である。すなわち、それぞれ適当な濃度の界面活性剤水溶液とリムルス測定用試料とを混合したのみで、エンドトキシン回収率が良好でかつリムルス測定用試料と混合した後の非特異的なエンドトキシン活性（リムルス反応活性化物質の反応性）を無くすることができ、リムルス測定用試料中のエンドトキシンのみを特異的に測定できることが判る。第３表より、IHAに関しては、Brij 56、JECに関しては、Tergitol、Triton N-101及びBrij 56 、HSAに関しては、Brij 56の適当な濃度の水溶液を用いれば、上記の目的を達成できることは明らかである。
【００７２】

【００７３】
〔実施例４〕各種生物学的製剤中のエンドトキシン測定におけるBrij56の濃度の影響
実施例３で使用した各種生物学的製剤25μlに混合時に0〜0.5%(W/V)になるように調製したBrij 56水溶液25μlを添加した後、エンドスペシー50μlを加え、実施例１に記載の方法でエンドトキシン濃度（EU/ml）を測定し、同時にそれぞれのBrij 56水溶液の濃度におけるエンドトキシン添加回収率（％）を第３図にまとめて示した。Brij 56水溶液の濃度が高まるに伴い、リムルス活性（非特異的エンドトキシン濃度）及びエンドトキシン添加回収率は有意に低下する。従って、エンドトキシンの添加回収率を良好に維持しつつ、非特異的エンドトキシン（リムルス反応活性化物質）活性を最大限に抑制し得るBrij 56の濃度が適宜選択される。この選択された濃度範囲においては、リムルス測定用試料中に混入するリムルス反応活性化物質を不活化し、エンドトキシンのみを特異的に測定し得ることが明らかである。
【００７４】
〔実施例５〕各種生物学的製剤中のエンドトキシン測定におけるBrij混合時の温度並びに混合後の各温度における放置時間の影響
インフルエンザＨＡワクチン（ＩＨＡーＬｏｔＢ）25μlに混合時に0.125%(W/V)になるようにBrij 56 水溶液を加えて、4〜80℃で１分間混合した。別に混合後、さらに同一温度で１〜２０分間放置した。それらのエンドトキシン活性の相対値（蒸留水をコントロール(100%)にした時のリムルス活性残存率）とエンドトキシンの添加回収率（%）を算出した。第４図に各温度で１分間攪拌したときの結果を示した。第４図より、その界面活性剤の水溶液をリムルス測定用試料に加えて、４〜５０℃でで１分間攪拌しただけで、エンドトキシン回収率を良好に保ちかつリムルス活性を最大限に抑制し得ることが判明した（４〜４０℃では，５分間放置してもリムルス活性残存率もエンドトキシン添加回収率も特に影響されなかった。）。さらに、６０℃以上の加熱条件下では、むしろエンドトキシン活性が安定に保持されず、リムルス測定用試料中のエンドトキシンを正確に測定することは不可能であった。
【００７５】
〔実施例６〕各種生物学的製剤中のエンドトキシン測定に対するポリミキシンＢ、ＥＤＴＡ−４Ｎａ及びＢｒｉｊ５６の影響
実施例３と同様の生物学的製剤を含む計6ロットの製剤25μlを使用し、ポリミキシンＢ硫酸塩（Sigma社販売、2mg/mlの）水溶液25μlあるいは10 mMのEDTA-4Na水溶液25μlあるいは0.25%(W/V) Brij 56水溶液25μlと混合し、エンドスペシー50μlを加え、実施例１に記載の方法と同様に、エンドトキシン濃度（EU/ml）を求めた。また、ポリミキシンＢ、EDTA-4Na、Brij 56のいずれをも加えないコントロール（エンドトキシンとリムルス反応活性化物質の総量）を１とし、各条件下における活性のコントロールに対する比率を算出した。所定の濃度のポリミキシンＢまたはEDTA-4Na水溶液の添加によりリムルス測定用試料中に含まれるエンドトキシンのみが特異的に不活化し、Brij 56添加によりリムルス測定用試料中に含まれるリムルス反応活性化物質のみが特異的に不活化すると仮定すると、それぞれの添加により得られた値のコントロールに対する比率を合計するとエンドトキシンとリムルス反応活性化物質の総量である１に等しくならなければならない。第５図ーＡ及びＢ（別ロットで同様の試験を実施）から明らかなように、いずれの生物学的製剤においても、それぞれの総和は、１±０．０５（ＣＶ＝５％、ｎ＝３）で、その仮定が正しいことが立証された。このことから、Brij 56の水溶液を所定の濃度になるようにリムルス測定用試料と共存させただけで、リムルス反応活性化物質のみを不活化し、エンドトキシンを特異的に測定する事ができるということが判る。
【００７６】
〔実施例７〕各種生物学的製剤の希釈用量反応性
実施例３と同様の生物学的製剤に、0.25%(W/V) Brij 56水溶液を等量ずつ加え、その後に蒸留水あるいは0.125% Brij 56水溶液で×2〜×32に調製した希釈液25μlならびに、あらかじめ蒸留水で×2〜×32に調製した希釈液25μlをトキシペットプレート96Fに取り、それぞれ蒸留水と0.25%(W/V) Brij 56の水溶液25μlを添加した後良く攪拌し、エンドスペシー50μlを加え、実施例１に記載した方法でエンドトキシン濃度を測定した。それぞれの値を真のエンドトキシン値、すなわち0.25%(W/V) Brij 56水溶液25μlをリムルス測定用試料25μlに加えて得られる測定値で除して得られる相対活性（%）を各希釈率においてプロットした。第６図ＡーＣに示すように、あらかじめ蒸留水で希釈したリムルス測定用試料にBrij 56の水溶液を加えたものについては、各希釈率において安定した相対活性が得られたのに対し、リムルス測定用試料にBrij 56の水溶液を加えた後、蒸留水で希釈したものは、希釈率の増大とともに測定値が上昇する傾向を示した。これに対し、リムルス測定用試料にBrij 56の水溶液を加えた後、蒸留水のかわりに0.125% (W/V) Brij 56の水溶液で希釈した場合は、あらかじめ蒸留水で希釈したリムルス測定用試料にBrij 56の水溶液を加えた時と同様、安定した相対活性を示し、良好な希釈用量反応性が認められた。このことから、一度Brij 56で不活化を受けたリムルス反応活性化物質は、蒸留水を加え希釈すること（すなわち、Brij 56の濃度が測定用試料中から希釈されること）により、その活性の一部に可逆的な回復現象がみられるが、Brij 56で不活化させ、その濃度と同一濃度になるようにBrij 56でリムルス測定用試料を希釈したものは、このような回復現象は全く認められず、どの希釈率でも一定のエンドトキシン値を示すことが判る。
【００７７】
この点が、これまで公知のリムルス反応偽陽性物質等の性質、並びに主に血液をリムルス測定用試料として作出されたリムルス反応偽陽性物質等の不活化法と大きく異なる点である。すなわち、これらの偽陽性物質等は、その不活化法で、一旦不活化されてしまえば、その後どのような処理をしてももはや全くリムルス活性は回復しないことが知られているからである。
本発明リムルス反応活性化物質は、一定濃度の上述した特定の界面活性剤共存下のみではじめてそのリムルス反応活性化能が抑制されるものである。従って、本発明リムルス反応活性化物質の影響を排除して、リムルス測定試料中の真のエンドトキシンのみをリムルス試薬で正確に測定する場合には、常に上記特定の界面活性剤の一定濃度を共存させておく必要がある。この点が、従来のリムルス反応偽陽性物質等の不活化法に関わるエンドトキン測定法と大きく異なる点である。
【００７８】
〔実施例８〕各種リムルス試薬による生物学的製剤中のエンドトキシン測定実施例３で使用した各種生物学的製剤に0.3%(W/V) Brij 30水溶液を等量添加し、エンドスペシー又は各種リムルス試薬を加え、リムルス測定用試料中のエンドトキシン濃度（EU/ml）を標準エンドトキシンＥＴ−Ｂ４を用いて測定した。
その結果を第４表に示す。
【００７９】

【００８０】
第４表より、Brij 30の水溶液をリムルス測定用試料に加えた後、種々リムルス試薬を用いてリムルス測定用試料中のエンドトキシン濃度を測定したが、いずれの製剤についてもほぼ同様の傾向を示し、測定法，測定試薬が異なっても、Brij30をリムルス測定用試料中に共存させただけで、エンドトキシンのみ特異的に測定し得ることが判る。
【００８１】
〔実施例９〕アルキルアミンのエンドトキシン反応性に及ぼす効果
主にO抗原多糖の鎖長が異なる種々のＳ型及びＲ型エンドトキシン（E.coli O111:B4 3 種、E.coli UKT-B、E.coli 0113、Salmonella minnesota R595、S.minnesota R5(Rc)、S.typhosa、S.enteritidis）水溶液のそれぞれの水希釈系列（n=9）25μlにBrij 56の水溶液（0.25%）25μl加えて混合後、エンドスペシー50μlを添加し、実施例に示す方法でエンドトキシン濃度（EU/ml）求め、両対数軸にてプロットした。その結果、エンンドトキシンの種類により相互に力価が異なる傾向を示したが、この不均一性がトリエチルアミンを0.005%(W/V)になるように予めBrij 56の水溶液に加えておくと第７図−Ａ，Ｂに示すように、結果は良好な集束を示した（重相関＝0.844）。また、エンドトキシンをほとんど含まないインフルエンザＨＡワクチン（ＩＨＡーＬｏｔＭ）に同様に各種エンドトキシンを添加して用量依存性を確認した結果、第８図−Ａ，Ｂに示すように、Brij 56のみを共存させた場合に比べ、トリエチルアミンを添加した場合の方が、より良好な集束（重相関＝0.850）を示すことが判る。従って、Brij 56の水溶液に所定の濃度のトリエチルアミンを添加することにより、エンドトキシンの分散状態が良好に維持され、溶解性や菌種による反応性の差を可能な限り小さくすることが可能であり、リムルス測定試料中のエンドトキシンがより正確に測定できることが明らかとなった。
【００８２】
〔実施例１０〕各種生物学的製剤中の平行線定量法によるエンドトキシンの測定
各種生物学的製剤計３ロット（ＩＨＡーＬｏｔＤ、ＪＥＣーＦ、ＨＳＡーＹ２）の蒸留水希釈系列（4点）、それぞれ25μlに、キット化したBrij混液［0.25%(W/V)Brij56 + 0.010%(W/V)トリエチルアミン］25μlを添加攪拌し、キット添付のエンドスペシー50μlを加え、ウェルリーダーＳＫ601で37℃、30分間反応させ、1分間当たりの吸光度変化率（mAbs405-492nm/min）を専用の平行線定量ソフト（EG301、生化学工業販売）で解析し、日本薬局方標準エンドトキシン（E .coli UKT-B）を用いてエンドトキシン濃度（EU/ml）を算出した。第９図に示すように、いずれのリムルス測定用試料についても良好な平行線と再現性が得られ、本キットは生物学的製剤中のエンドトキシンを特異的かつ精度良く定量する事が可能であった。
【００８３】
〔実施例１１〕各種生物学的製剤中の本発明リムルス反応活性化物質の測定実施例８に記載の各種生物学的製剤50μlに、等量の0.2M NaOHを加え、37℃１時間加温後 0.2M HCl 50μlを加え中和した。その50μlに、エンドスペシー50μlを加え、37℃で30分間反応させ(A)て、本発明リムルス反応活性化物質量を測定した。一方、NaOHの代わりに蒸留水を用いて測定したエンドトキシンと本発明リムルス反応活性化物質の総量(C)、及びこの製剤25μlに0.25% Brij 56 25μl添加後、エンドスペシー 50μlを加え、測定したエンドトキシン量(B)もあわせて表記した。
【００８４】
第５表に示すように、IHA、JEC、HSA各製剤においても、NaOHを加え、37℃で加温したのみで、製剤中に混入する本発明リムルス反応活性化物質のみを特異的に測定することが可能であることが判る。また、この製剤にBrij 56の水溶液を加えて得られたエンドスペシー測定値に、本法により得られた本発明リムルス活性化物質の量を加えて得られた値は、エンドトキシンと本発明リムルス反応活性化物質の総量とほぼ等しい値を示したことから、本法により本発明リムルス反応活性化物質量を的確に測定し得ることが明らかである。
【００８５】
第５表
───────────────────
各種製剤 A B C ( ):A＋B
───────────────────
IHA 14.0 3.0 17.3 (17.0)
JEC 2.9 0.2 3.2 ( 3.1)
HSA 9.4 0 9.3 ( 9.4)
───────────────────
【００８６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、主に生物学的製剤中に混入する発熱活性を持たない非エンドトキシンリムルス反応活性化物質を簡便、迅速に不活化し、エンドトキシンのみをリムルス試薬にて精度良く測定する方法を提供する。本発明により、生物学的製剤中のエンドトキシン量が正しく測定されることになり、従って生物学的製剤の安全性評価をより適切に実施することができ、医療への大きな貢献につながる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カブトガニ凝固系のカスケード機構を示した図面である。
【図２】高速液体クロマトグラフィーによるインフルエンザワクチン中の本発明リムルス反応活性化物質の溶出パターンを示した図面である。
【図３】生物学的製剤中のエンドトキシン測定における種々の濃度の界面活性剤の効果を示した図面。
【図４】生物学的製剤中のエンドトキシン測定における、界面活性剤添加後の温度及び時間の影響を示した図面。
【図５】ポリミキシンＢ，ＥＤＴＡ−４Ｎａ及び界面活性剤のエンドトキシン測定に及ぼす影響を示した図面である。
【図６】希釈用量反応性を示した図面である。
【図７】各種のエンドトキシン反応性に及ぼす界面活性剤とトリエチルアミンの影響（蒸留水系）を示した図面である。
【図８】各種エンドトキシン反応性に及ぼす界面活性剤及びトリエチルアミンの影響（生物学的製剤系）を示した図面である。
【図９】平行線定量法による生物学的製剤中のエンドトキシンの測定を示した図面である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention is a Limulus reaction that is a reaction that activates Amebosite lysate, which is a blood cell component of horseshoe crab used for detection of endotoxin and the like, particularly in a Limulus reaction specific to endotoxin,This invention relates to a method for measuring endotoxin using means for eliminating the influence of a non-endotoxin-like substance that reacts with and activates factor C, which is the first factor in the system initiated by endotoxin.
[0002]
[Prior art]
Endotoxin is a lipopolysaccharide present in the outer cell wall membrane of Gram-negative bacteria, and is known as a strong pyrogen. In addition to fever, endotoxin induces various pathologies caused by bacterial infection, even in trace amounts, such as the release of inflammatory cytokines such as TNF and interleukin-1 (IL-1) associated with macrophage activation and the induction of endotoxin shock. It is known to wake up. For this reason, detection of endotoxins in injectable drugs and the like is important, and endotoxin test methods are listed in the pharmacopoeia and biopharmaceutical standards of the United States and Japan. Endotoxin is considered to be the main cause of shock in Gram-negative bacterial infections. For purposes such as diagnosis of Gram-negative bacterial infection, determination of its therapeutic effect and prognosis, and early diagnosis of endotoxin shock, Endotoxin measurements are being made.
[0003]
The Limulus test, which is an endotoxin test method, is a reaction in which endotoxin derived from Gram-negative bacteria activates the blood cell extract component (Amebosite lysate) of horseshoe crab (this reaction is called Limulus reaction, and the reagent used for it is called Limulus reagent The endotoxin detection method, more specifically, the gelation method, the turbidimetric method using the turbidity change of the gel as an index, and the colorimetric method using the color developed by hydrolysis of the chromogenic synthetic substrate as an index And is now broadly classified.
In 1978, the US FDA approved the Limulus test method as an alternative method because of its high correlation with the rabbit fever test, and was used for safety testing of pharmaceuticals and medical devices including biological products such as vaccines and blood products. Since this test has been widely applied, it has been listed in Japanese Pharmacopoeia and Biopharmaceutical Standards as an alternative to the rabbit fever test in Japan.
[0004]
The horseshoe crab, amebocyte lysate (hereinafter sometimes simply referred to as lysate) contained in the Limulus reagent includes a cascade type coagulation system (factor C system) activated by reaction with endotoxin and (1 → 3) -β. A cascade type coagulation system (factor G system) activated by reacting with -D-glucan (hereinafter sometimes referred to as β-D-glucan) (see FIG. 1); A method for specifically measuring endotoxin using only the former system and a method for specifically measuring β-D-glucan using only the latter system are known (Obayashi T. et al ., Clin. Chim. Acta, 149, 55-65 (1985), for endotoxin-specific measurements; WO 90/02951, USP 5,155,032, USP 5,179,006, WO 92/0. 736, WO92 / 06181, JP-A-6-258326, JP-B-2-18080, β-D-glucan-specific measurement method; WO91 / 19981, WO92 / 16651), and Limulus reagents that specifically measure each of them are already on sale Has been. In particular, the biopharmaceutical standard in Japan stipulates that a Limulus reagent specific for endotoxin is used because β-D-glucan is often mixed in a sample for measuring Limulus.
[0005]
By the way, even though this endotoxin-specific Limulus reagent is used, there are substances that react in addition to endotoxin depending on the sample for measuring Limulus (in the present specification, a sample used for measurement using the Limulus reaction). Are known. That is, serine proteases such as trypsin, thrombin, factor Xa, etc. (the Limulus reaction uses the reaction of serine protease in lysate and is positive because it exhibits a similar action to the coagulation enzyme therein), chymotrypsin (factor C) "A substance that reacts in an endotoxin-specific limulus reaction other than endotoxin (endotoxin-specific limulus reaction false positive substance)" is known.
Therefore, when measuring endotoxin in a sample for measuring Limulus containing these substances, that is, blood (whole blood, plasma, serum) with Limulus reagent, this Limulus reaction false-positive substance is used without impairing the endotoxin activity. Methods to eliminate are known.
[0006]
For example, on the premise of heat treatment, a means for diluting a sample for measuring Limulus with an aqueous solution containing a surfactant and eliminating the influence of false positive substances in the sample for measuring Limulus is disclosed (Japanese Patent Laid-Open No. 6-1994). 118086).
Further, a means for treating a sample for measuring Limulus with an acid such as perchloric acid (PCA) to eliminate the influence of a false positive substance in the Limulus reaction in the sample for measuring Limulus (Japanese Patent Publication No. 63-55671), A means for treating a sample for measuring Limulus with a hexadimethrin compound such as polybrene and an alkali metal hydroxide to eliminate the influence of a Limulus reaction interfering factor in the sample for measuring Limulus (Japanese Patent Laid-Open No. 6-70796) is known. It has been.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, recently, a phenomenon that is positive in endotoxin-specific Limulus reaction has been observed mainly in biological products, although it does not show pyrogenicity in the Japanese Pharmacopoeia pyrogen test, Since the listed endotoxin test method (endotoxin-specific Limulus reaction) was used, it was possible that the safety of the drug could be evaluated improperly.
The present inventors analyzed this phenomenon, and the causative substance exhibiting false positive in this endotoxin-specific Limulus reaction is different from the conventionally known Limulus reaction activator, and any of the above Limulus reaction false positive substances It has been found that it is difficult to eliminate this causative substance even by means of exclusion.
[0008]
  Therefore, it is extremely important to provide a method for accurately measuring only endotoxin by eliminating the influence on the Limulus reaction of Limulus reaction false positive substances mixed in these preparations.It becomes a problem.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
  The inventorofAs a result of intensive studies on the causative substance and its exclusion means, surprisingly, under non-heating conditions (specific temperatures will be described later),By allowing a sample for measuring Limulus to coexist with a surfactant and alkylamine at a specific concentration.The present inventors have found that the influence of this causative substance can be eliminated from the Limulus reaction system.
[0010]
  That is, the present invention relates to a Limulus reaction activator having specific properties (details will be described later),The invention provides an endotoxin measurement method comprising a step of inactivating a surfactant having a specific concentration and an alkylamine by coexistence at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to be used to a temperature of 50 ° C. or lower. .
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
A. About specific isolation means of Limulus reaction activator:
The Limulus reaction activator according to the present invention (hereinafter also referred to as the Limulus reaction activator of the present invention) is a novel causative substance that exhibits a false positive in the endotoxin-specific Limulus reaction, and is specifically isolated by the following means.
[0012]
That is, the Limulus reaction activator of the present invention is obtained from the sample for measuring Limulus [mainly biological preparations (for example, blood preparations, vaccines, antibiotics, etc .: these biological preparations will be described later)]. It can be purified by various separation means utilizing the physical and chemical properties of the Limulus reaction activator. Examples of the separation means include treatment with an ordinary protein precipitating agent, ultrafiltration, gel filtration, centrifugation, electrophoresis, gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography. Graphy, dialysis, etc. Needless to say, these separation means can be used in appropriate combination.
[0013]
Among these separation means, gel permeation chromatography, particularly gel permeation chromatography using high performance liquid chromatography is preferred.
Specifically, the sample for measuring Limulus is applied to the chromatography column and eluted with endotoxin and β-D-glucan-free distilled water as a solvent. The flow rate of the solvent is not particularly limited, but is preferably about 0.5 ml / min.
[0014]
To the eluted fraction, an aqueous solution of polymyxin B sulfate was added to a final concentration of 0.5 mg / ml. Endotoxin activity was completely suppressed, and this fraction was measured with an endotoxin-specific Limulus reagent. By collecting the above, the limulus reaction activator of the present invention can be obtained.
The Limulus reaction-activating substance of the present invention that can be produced in this manner is mainly present in biological preparations such as vaccines and albumin preparations, and has the following properties. Further, these properties will be described in detail mainly in examples described later.
[0015]
(1) It has the ability to activate Limulus reaction.
(2) Reacts with endotoxin-specific Limulus reagent.
(3) Activate factor C derived from horseshoe crab amebocyte lysate.
(4) Exothermic substance test shows no exothermicity.
(5) Not endotoxin.
(6) Not (1 → 3) -β-D-glucan.
(7) No serine protease activity.
(8) Even if polymyxin B coexists with this substance, the ability to activate the Limulus reaction of this substance does not decrease.
(9) Even if colistin coexists with this substance, the ability to activate the Limulus reaction of this substance does not decrease.
(10) Even if this substance is treated with 0.2 M hydrochloric acid at 37 ° C. for 60 minutes, the ability to activate the Limulus reaction of this substance does not decrease.
(11) Even if this substance is treated with 0.2 M potassium hydroxide at 37 ° C. for 60 minutes, the ability to activate the Limulus reaction of this substance does not decrease.
(12) By treating this substance with polyoxyethylene hexadecyl ether, the ability to activate the Limulus reaction of this substance disappears.
[0016]
Although the in vivo action and toxicity of the Limulus reaction activator of the present invention are unknown, it enhances the toxicity of endotoxin as reported by TSST-1 (Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1) of staphylococcal exotoxin There is a possibility of having similar physiological action and toxicity as endotoxin such as synergistic action (H. Fujikawa et al., Infect Immun., 52, 134 (1986)) or production of inflammatory mediators. Therefore, the Limulus reaction-activating substance of the present invention isolated for the first time according to the present invention is extremely important for clarifying the action of the substance in vivo and in various pathological conditions. In addition, the measurement method of the Limulus reaction activator of the present invention provided by the present invention provides extremely useful information like the endotoxin measurement method.
[0017]
In addition, the limulus reaction-activating substance of the present invention is mainly present in biological preparations and the like, and that a relatively large amount of the substance is contained in biological preparations imported from outside Japan. Have been confirmed. Although the origin of the substance of the present invention is not clear, the possibility of contamination in the process of manufacturing a biological preparation cannot be denied. The method for measuring a Limulus reaction-activating substance of the present invention is also expected to be used for checking the contamination of the substance and the final product in the manufacturing process of the biological product. It is also expected to lead to the provision of practical preparations. The method for measuring the Limulus reaction-activating substance of the present invention will be described later.
[0018]
B. About the means for inactivating the Limulus reaction-activating substance of the present invention (hereinafter also referred to as the method of deactivating the Limulus reaction-activating substance of the present invention):
When the above-described Limulus reaction-activating substance is contained in the Limulus measurement sample, a false positive reaction is induced in the Limulus reagent, thereby reducing the detection accuracy of a desired substance (for example, endotoxin). This is not preferable.
[0019]
As a means for inactivating the Limulus reaction activator of the present invention, a method in which the Limulus reaction activator and a surfactant coexist at a temperature from the temperature exceeding the freezing point of the surfactant to 50 ° C. or less is specifically mentioned. Can be mentioned.
As the surfactant used in the present invention, as long as it does not impair the Limulus reactivity as a result of the dissociation action on endotoxin micelles, and does not activate the Limulus reaction and does not inhibit the active serine protease, it is positive. There are no particular restrictions on ionic surfactants, anionic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants or naturally occurring surfactants, but nonionic surfactants with little direct action on endotoxins It is preferable to select. In addition, it is also possible to use these surfactants in combination as appropriate.
[0020]
Of the nonionic surfactants, surfactants having a structure having polyoxyethylene in the hydrophilic portion (hereinafter also referred to as “polyoxyethylenes”) are preferable. Polyoxyethylenes include polyoxyethylene alkyl ethers (general formula, C_nH_{2n + 1}(OCH₂CH₂)_xOH, usually abbreviated C_nE_x),
Polyoxyethylene alkylphenyl ether (C) with a phenyl group between the alkyl chain and the polyoxyethylene chain_nФE_x) And acyl polyoxyethylene sorbitan (C_nSorbitan E_x), And these are the Brij (C_nE_x), Triton X (C_nФE_x), Tween (C_nSorbitan E_x) And is commonly used for many purposes such as solubilization of membrane proteins.
[0021]
The polyoxyethylene chain of the polyoxyethylene used in the present invention (“(OCH₂CH₂)_x"OH" moiety, also abbreviated as "Ex") is not particularly limited, but compounds having an integer of x = 2 to 25, preferably an integer of x = 4 to 23, more preferably an integer of x = 7 to 13. preferable. Further, the alkyl group of the polyoxyethylenes used in the present invention (“C” in the above formula)_nH_{2n + 1}The number of carbon atoms in the “part” (also abbreviated as “Cn”) is not particularly limited, but a compound where n is an integer of 8 to 18 is preferable.
[0022]
Examples of such polyoxyethylenes include polyoxyethylene dodecyl ether, polyoxyethylene hexadecyl ether (also referred to as polyoxyethylene cetyl ether), polyoxyethylene isooctyl phenyl ether, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, polyoxyethylene. Examples include fatty acid esters and polyoxyethylene sorbitol esters.
Among these, polyoxyethylene hexadecyl ether is very preferable.
These surfactants are preferably used as aqueous solutions and have a certain micelle size.
[0023]
In addition, the solvent of the aqueous solution of these surfactants may be a buffer solution. The buffer is preferably a buffer adjusted to around the optimum pH of the factor C system (specifically, about pH 7 to 9). For example, Good buffer [for example, HEPES (N-2-hydroxyethyl) Piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid buffer), collamine chloride buffer, BES buffer, MOPS buffer, TES buffer, HEPPS buffer (N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-3-propane) Sulfonic acid), Tricine buffer, glycinamide buffer, Bicine buffer, TAPS buffer, etc.], Tris-hydrochloric acid buffer, and the like.
[0024]
The amount of the surfactant coexisting with the limulus reaction activator of the present invention can be appropriately changed depending on the amount of the present limulus reaction activator present and the type and amount of the coexisting surfactant, and is particularly limited. Not. The specific surfactant concentration is usually 0.005% to 0.8% (W / V), preferably 0.01% to 0.5% as the final concentration when contacting the sample for measuring Limulus. % (W / V), more preferably 0.05% to 0.3% (W / V) and the like are exemplified, but these are merely examples and are not limited thereto.
[0025]
Furthermore, a desired aqueous surfactant solution can be prepared by subjecting the aqueous surfactant solution to endotoxin-free means such as activated carbon treatment, membrane filter treatment, and autoclave treatment.
[0026]
As a sequence and method for coexisting a surfactant or an aqueous solution of a surfactant with a sample for measuring Limulus containing a Limulus reaction activator, the surfactant is not modified or destroyed at all. There is no particular limitation as long as it is present in the sample for measuring Limulus so as to have a predetermined concentration. The method for allowing the sample for measuring Limulus and the surfactant to coexist is usually achieved by adding the sample for measuring Limulus and the surfactant and mixing them well. In addition, the order in which the sample for measuring Limulus and the surfactant coexist can achieve the object of the invention by adding a surfactant or the like in the Limulus reagent and mixing and reacting with the sample for measuring Limulus simultaneously. However, it is more desirable from the viewpoint of the effect that it is preliminarily mixed with the sample for measuring Limulus before the Limulus reaction. The amount of the aqueous solution of the surfactant or the like to be mixed with the Limulus measurement sample is preferably 0.1 to 10 volumes of the surfactant solution per 1 volume of the Limulus measurement sample. There is no particular limitation as long as a predetermined concentration of surfactant or the like is added and the effective concentration is maintained.
[0027]
Furthermore, in order to inactivate the Limulus reaction activator of the present invention, it is necessary to coexist the above-mentioned surfactant at a temperature exceeding the freezing point of this surfactant to 50 ° C. or less. At a temperature below the freezing point of the surfactant, the solution in which the surfactant and the Limulus reaction activator coexist is frozen, making it difficult to smoothly carry out the desired inactivation reaction. If it exceeds, the substance to be measured such as endotoxin is inactivated, and its accurate measurement becomes difficult, which is not preferable.
[0028]
Also, the limulus reaction activity of the present invention is preferably carried out at a temperature of 1 ° C. or more and 50 ° C. or less, more preferably 4 ° C. or more and 50 ° C. or less, further preferably 4 ° C. or more and 45 ° C. or less, and particularly preferably 15 ° C. or more and 40 ° C. or less. The chemical can be contacted with a surfactant.
This is a point that is greatly different from the prior art (Japanese Patent Laid-Open No. 6-118086) in which a surfactant is used and the false positive substance of the Limulus reaction is inactivated by positive heating as in the present invention.
[0029]
The time required for the sample for measuring Limulus and the surfactant to coexist at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to 50 ° C. or less is particularly that the endotoxin molecule and its associated micelles are physicochemically stable, Although it is not particularly limited as long as it does not adsorb to the liquid, it usually takes several seconds to 5 minutes, and about 1 minute to 2 minutes is sufficient. Thus, the purpose of the inactivating action of the surfactant used in the present invention on the Limulus reaction-activating substance can be achieved in a very short time.
[0030]
The above-described method for inactivating the Limulus reaction-activating substance of the present invention can be directly applied to the inactivation of the Limulus reaction-activating substance of the present invention in the sample for measuring Limulus.
The present invention inactivates the Limulus reaction-activating substance of the present invention, in which the sample for measuring Limulus and the surfactant coexist at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to 50 ° C. or less. Use of a surfactant. As will be described later, since it is more preferable that a sample for measuring Limulus coexists with an alkylamine in addition to a surfactant, the present invention includes a sample for measuring Limulus, a surfactant and an alkylamine. Also included is the use of a surfactant to inactivate the Limulus reaction activator of the present invention that coexists at a temperature above the freezing point temperature of the activator up to 50 ° C.
[0031]
Thus, means for inactivating the above-described Limulus reaction-activating substance of the present invention is provided, whereby a Limulus-measuring sample in which the Limulus reaction-activating substance of the present invention is inactivated by a surfactant is directly provided. Although provided, this inactivation means can be used in various forms.
For example, a Limulus reaction activator comprising a surfactant based on the premise that a sample for measuring Limulus and a surfactant coexist at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to 50 ° C. or less. It is possible to apply to the form as an inactivating agent.
[0032]
It is also possible to apply to the form of a Limulus reagent comprising this inactivating agent, a Limulus measuring kit comprising this Limulus reagent, or a Limulus measuring kit comprising an inactivating agent and a Limulus reagent. It is.
In the present specification, “Limulus measurement” means measurement using a Limulus reaction, and “Limulus measurement kit” means a kit containing at least a Limulus reagent used for measurement using a Limulus reaction. .
In addition to the above-described Limulus reagent, any component reagent can be added to the Limulus measurement kit as necessary. Examples of such reagents include, but are not limited to, blank test distilled water, reaction reagent dissolution / reaction buffer, and the like.
[0033]
Thus, the present invention provides an inactivating agent for the Limulus reaction-activating substance of the present invention comprising a surfactant, a Limulus reagent comprising the inactivating agent, and a Limulus measurement comprising the Limulus reagent and the inactivating agent. A kit is also provided. The Limulus reagent is preferably an endotoxin-specific Limulus reagent.
Furthermore, the present invention is characterized in that a surfactant is allowed to coexist in a sample for measuring Limulus at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to a temperature of 50 ° C. or less, and the Limulus reaction of the Limulus reaction activator of the present invention is characterized in that Also included is a method for eliminating the influence on the sample for measuring Limulus.
[0034]
Further, the present invention includes a sample for measuring Limulus in which the Limulus reaction-activating substance of the present invention is inactivated by a surfactant in this way.
The limulus measurement sample to be inactivated by the limulus reaction activator described herein is not particularly limited as long as endotoxin or the like is to be detected using the limulus reaction. Biologically-derived limulus measurement samples in which a large amount of reaction activator is observed are preferred, and biological preparations are particularly suitable targets.
[0035]
This “biological product” is a concept that excludes blood fractions containing whole blood, that is, whole blood, plasma, serum and the like. Specifically, vaccine preparations (generally prepared for the purpose of increasing the blood antibody titer against the target virus and reducing the morbidity by inoculating the vaccine) Inactivated vaccine (for example, influenza vaccine (influenza HA vaccine), Japanese encephalitis vaccine, etc.) or attenuated obtained by degrading and inactivating highly purified virus particles after growing in a target host such as or in the brain And the like. ], Blood products (usually starting with plasma, varying the conditions such as pH, ionic strength, ethanol concentration, etc., and using a fractional precipitation method (Cohn fractionation method, etc.) based on protein solubility, And human plasma proteins such as human serum albumin prepared], or antibiotics.
[0036]
In addition, said vaccine takes the form as a colorless and transparent or slightly cloudy odorless liquid goods which added stabilizers, such as gelatin normally. There is also a freeze-dried preparation, which is a powdery solid with a slightly yellowish white taste, and is usually used in a liquid form by adding a prescribed amount of distilled water.
[0037]
  C. Endotoxin measurement means by using the inactivation means of the Limulus reaction activator of the present invention (hereinafter also referred to as the present endotoxin measurement method):
  By using such a means for inactivating the limulus reaction-activating substance of the present invention, a method for measuring endotoxin in a sample for measuring limulus comprising the following steps is provided.
  A method for measuring endotoxin in a sample for measuring Limulus comprising the following steps:
(1) Sample for measuring Limulus,Surfactant and alkylamine, At temperatures above the freezing point temperature of this surfactant to below 50 ° CThe final concentration of the surfactant is 0.005 to 0.8% (W / V)First step to coexist;
(2) A second step of measuring endotoxin by causing the sample for measuring Limulus obtained in the first step to undergo a Limulus reaction with a Limulus reagent.
[0038]
  In the first step,By adding an alkylamine in addition to a surfactant at a specific concentration, the association and dispersion of endotoxin can be maintained well, and the difference in solubility and reactivity depending on the bacterial species can be minimized and reproduced. It was first found by the present inventors that sexual data can be obtained.Also,The sample for measuring Limulus is preferably a biological product. Preferred biologics are described above.
[0039]
In addition, this invention endotoxin measuring method can be implemented more simply by using the Limulus reagent containing the inactivation agent of the above-mentioned Limulus reaction activator containing the surfactant.
In addition, the Limulus reagent that can be used in the endotoxin measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it can detect endotoxin, but the Limulus reaction activator of the present invention is false positive in the endotoxin detection system. It is preferably an endotoxin-specific Limulus reagent
[0040]
However, when it is clear that the sample for measuring Limulus does not contain β-D-glucan, it is not always necessary to use an endotoxin-specific Limulus reagent, and both endotoxin and β-D-glucan are detected. Limulus reagents can also be used.
[0041]
As long as the Limulus reagent can detect endotoxin, in addition to the synthetic substrate method (endpoint assay, kinetic assay), ordinary gelation and turbidimetric methods (endpoint assay, kinetic assay), etc. There is no particular limitation. Various commercially available Limulus reagents include Toxicolor System LS-6, LS-20, LS-200, Endspecy ES-6, Endspecy ES-200, Pyrodic, Pregel, Pregel-S, Pregel-M, Pyrotel Multitest, Pyro. Tel Single Test, Pyroteru T (sold by Seikagaku Corporation), Limulus J Test Wako, Limulus HS-J Test Wako, Limulus J Single Test Wako, Limulus HS-J Single Test Wako, Limulus F Test Wako, Limulus HS-F Test Wako, Limulus F Single Test Wako, Limulus HS-F Single Test Wako, Limulus ES-II Test Wako, Limulus ES-II Single Test Wako, Limulus ES-III Test Wako, Limulus ES-J Test Wako Pure Drug Sales), Pyrogent, Pyrogent Multi Test, Pyrogent Single Test, QCL-1000, Kinetic QCL System (manufactured by BioWittaker, Daiichi Chemical Sales), Cotest Endotoxin (Chromogenic AB Sales) ), Endchrome, Endchrome M (Charles River Laboratories End Safe Sales) Pyrosate (Hemakem Sales), Pyrochrome (Cape Cod Sales).
[0042]
Among these commercially available Limulus reagents, there are two types specific to endotoxin: Endospecies and Limulus ES test. Further, without being limited to these commercially available Limulus reagents, any one that activates a series of factor C-based enzyme systems (coagulation systems) by reaction with endotoxin can be used as Takipreus tridentatsu, Takipreus gigas. It is also possible to prepare and use a lysate by a known method from Tachypleus rotan dikauda (Asian horseshoe crab) and Limulus polyphemus (North American) horseshoe crab blood cells.
[0043]
Specifically, lysates can be prepared from the hemolymph of these horseshoe crabs by, for example, the method described in J. Biochem., 80, 1011-1021 (1976). “Endotoxin-specific Limulus reagent” specifically inhibits, adsorbs or removes factor G of the lysate (for example, WO 90/02951, USP 5,155,032, USP 5,179,006, WO 92/03736, WO 92/3736). 06381, Japanese Patent Application No. 5-61464, or fractionation and reconstitution of C-factor-based components (for example, Japanese Patent Publication No. 2-18080, Japanese Patent Publication No. 3-18080, Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, 149, 55-65 (1985)).
[0044]
It can also be prepared from factor C, a peptide synthesis substrate, buffer solution, divalent metal salt, etc. described later, or factor C, factor B, a peptide synthesis substrate, buffer solution, divalent metal salt, etc., described below.
As a peptide synthesis substrate, a peptide that can be a substrate of active factor C (for example, a peptide consisting of a sequence such as Val-Pro-Arg, Leu-Gly-Arg, Ile-Glu-Ala-Arg, etc., in which the N-terminus is protected, A chromogenic residue (eg, p-nitroaniline, p- (N, N-diethylamino) aniline, p- (N) is added to the carboxyl group of arginine at the C-terminal of methoxycarbonyl-D-hexahydrotyrosyl-Gly-Arg). -Ethyl-N-β-hydroxyethyl) aniline, etc.), fluorescent residues (for example, 7-aminomethylcoumarin, etc.), luminescent residues, ammonia, etc. are substituted with amide bonds. .
That is, endotoxin can be measured by measuring amidase activity by measuring reaction products (p-nitroaniline, ammonia, etc.) produced by the action of active factor C on these synthetic substrates. .
Specifically, the above-mentioned peptide synthesis substrate is allowed to coexist in a reaction system containing a test solution and a factor C, buffer solution, divalent metal salt, etc. (conversion reaction of the product to other dyes, if necessary) A dye, a fluorescent substance, a luminescent substance or ammonia produced by the reaction, respectively, a spectrophotometer (Japanese Examined Patent Publication No. Sho 63-26871, Japanese Examined Patent Publication No. 3-66319, etc.), a fluorophotometer, a chemiluminescence measuring device, an ammonia detection electrode (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 62-148860) can be used, and a method that has already been adopted for the measurement of endotoxin can be used.
[0046]
There are no particular limitations on the method of coexisting the sample for measuring Limulus, a surfactant and an alkylamine, but the alkylamine is mixed with a surfactant in advance to a predetermined concentration, and the mixture is used for Limulus measurement. A method of directly mixing the sample is preferred. If alkylamine is maintained at a predetermined concentration relative to the sample for measuring Limulus, a method of coexisting alkylamine and coexisting surfactant or a method of coexisting surfactant and coexisting alkylamine Alternatively, there is no particular limitation such as a method in which an alkylamine is previously present in the Limulus reagent.
[0047]
For example, in an aqueous solution of a surfactant prepared at a predetermined concentration, alkylamine is usually 0.0001% or more and 0.05% (W / V) or less in a final concentration when contacting the sample for measuring Limulus. Preferably, the effect can be easily exerted only by adding 0.002% or more and 0.01% (W / V) or less, and the effect of the present invention can be further enhanced. It was.
[0048]
In addition, when the content of the alkylamine is less than 0.001% (W / V), it is difficult to exert the desired effect, and when the content exceeds 0.05% (W / V), it is contained. An increase in the effect corresponding to the increase in the amount does not appear, which is not preferable.
[0049]
The alkylamine may have a substituent and is not particularly limited as long as it is soluble in a normal polar solvent and water and is not easily decomposed, but preferably methylmethanamine, ethylethanamine, etc. Secondary amines, and more preferably tertiary amines such as dimethylamine and diethylethanamine. Specifically, N-ethylethanamine (diethylamine), 2,2′-iminodiethanol, bis (2-hydroxyethyl) amine (diethanolamine), N, N-dimethylmethanamine (trimethylamine), N, N-diethyl Examples include ethanamine (triethylamine) and tris (2-hydroxyethyl) amine (triethanolamine).
[0050]
D. Means for measuring the Limulus reaction-activating substance of the present invention (hereinafter also referred to as the method of measuring the Limulus reaction-activating substance of the present invention):
The present invention provides a method for inactivating the limulus reaction activator of the present invention present in a biologic and the like and specifically measuring only endotoxin, that is, a method for more appropriately performing a pharmaceutical safety test. At the same time, the present invention provides a method for specifically measuring only the Limulus reaction-activating substance. Specifically, the total amount of the Limulus reaction-activating substance and endotoxin of the present invention (total amount of the substance that reacts with the Limulus reagent) is measured using a normal Limulus test, and the value of only endotoxin obtained by various means is measured. Calculate by subtracting.
[0051]
In addition, endotoxin is inactivated only by using a substance (also referred to as endotoxin inactivating substance) having a property to specifically inactivate only endotoxin, such as polymyxin such as acid, alkali or polymyxin B and colistin. A method for measuring the limulus reaction activator of the present invention by a normal limulus test is also included in the present invention.
[0052]
Of these endotoxin inactivating substances, polymyxins such as polymyxin B and colistin may not always accurately reflect the measured value of this substance. That is, a substance that suppresses the endotoxin neutralizing action of polymyxins may coexist in the sample for measuring Limulus. On the other hand, when processing with an acid or an alkali, there is no such a problem and it can mention as a preferable endotoxin processing method.
[0053]
Here, the acid to be used is not particularly limited, but strong acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid are preferable. Moreover, although an alkali is not specifically limited, Strong alkalis, such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, are preferable. Usually, an acid or alkali is added to a sample for measuring Limulus, and the sample for measuring Limulus is processed by coexisting it.
[0054]
The concentration of these acids or alkalis in the sample for measuring Limulus is not particularly limited, but the final concentration in the sample for measuring Limulus is preferably 0.05M or more, more preferably about 0.05 to 0.2M. .
[0055]
Note that the endotoxin-inactivated limulus measurement sample must be neutralized before measurement with the limulus reagent. After neutralization, it is preferable to neutralize so that the pH is about 6-9.
[0056]
Specifically, the present invention is a method for measuring a Limulus reaction-activating substance of the present invention comprising the following steps.
(1) A first step of measuring a substance that reacts with the Limulus reagent in the Limulus measurement sample using the Limulus reagent.
(2) Separately, a second step of measuring endotoxin in the sample for measuring Limulus by the method for measuring endotoxin of the present invention.
(3) Using the difference between the measured value of the substance reacting with the Limulus reagent obtained in the first step and the measured value of endotoxin obtained in the second step, the amount of the Limulus reaction-activating substance of the present invention is calculated. 3rd process to do.
[0057]
Here, the Limulus reagent requires that the Limulus reagent used in the first step and the Limulus reagent used in the second step are the same type of reagents. That is, when an endotoxin-specific limulus reagent is used in the first step, it is necessary to use an endotoxin-specific limulus reagent also in the second step. The Limulus reagent that can be used is the same as the Limulus reagent that can be used in the above-described endotoxin measurement method of the present invention, and is preferably an endotoxin-specific Limulus reagent.
[0058]
The present invention also includes a method for measuring the Limulus reaction-activating substance of the present invention in a sample for measuring Limulus, comprising the following steps.
(1) A first step of treating a sample for measuring Limulus with an endotoxin inactivating substance, particularly an acid or an alkali.
(2) The limulus reaction-activating substance of the present invention is measured by measuring the change in this reaction system by causing the limulus reaction using the limulus reagent for the endotoxin-inactivated limulus measurement sample obtained in the first step. 2nd process to do.
As described above, the endotoxin-inactivated limulus measurement sample obtained in the first step needs to be neutralized before measurement with the limulus reagent.
The Limulus reagent used here is preferably an endotoxin-specific Limulus reagent.
[0059]
E. Means for measuring the amount of true endotoxin in biological products (method for measuring endotoxin in biological products of the present invention)
The method for measuring endotoxin in a biologic according to the present invention enables measurement of the true endotoxin content in a biologic by a Limulus reaction, which has been found to be impossible by a conventionally known method. The method of the present invention includes a series of methods for inactivating the limulus reaction-activating substance of the present invention contained in a biological preparation, and then measuring endotoxin with a limulus reagent.
[0060]
The inactivation of the Limulus reaction activator of the present invention in the biological preparation is carried out by bringing the biological preparation and the surfactant to be used for the Limulus reagent measurement to a temperature not lower than the freezing point temperature of the surfactant and not higher than 50 ° C. In the presence of a surfactant.
In addition, as described above, it is preferable that an alkylamine coexist in addition to the surfactant in the biological preparation to be used in the Limulus reagent, that is, the biological preparation, surfactant and alkylamine to be used in the Limulus reagent measurement. It is more preferable to use a surfactant and an alkylamine which are allowed to coexist at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to a temperature of 50 ° C. or less.
[0061]
Further, the present invention is characterized in that the surfactant is allowed to coexist at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to a temperature of 50 ° C. or less to inactivate the Limulus reaction activator according to claim 1. In addition, a pretreatment method of a biological product to be subjected to Limulus reagent measurement is also included.
Furthermore, the present invention provides a biological preparation for use in measuring a Limulus reagent, wherein the Limulus reaction activator according to claim 1 is inactivated by a surfactant obtained by this pretreatment method. Is also included.
[0062]
The inactivation of the Limulus reaction false positive substance in such a biological product provides a method for measuring endotoxin in the biological product comprising the following steps.
(1) Limulus reaction activation according to claim 1, wherein the biological preparation and the surfactant coexist at a temperature above the freezing point temperature of the surfactant to a temperature of 50 ° C. or less. A first step of inactivating the substance;
(2) A second step of measuring endotoxin by causing the biological preparation obtained in the first step to undergo a Limulus reaction with a Limulus reagent and measuring changes in this reaction system.
[0063]
In the first step, it is more preferable that the sample for measuring Limulus, the surfactant and the alkylamine coexist at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant at 50 ° C. or less.
The Limulus reagent that can be used is the same as the Limulus reagent that can be used in the above-described endotoxin measurement method of the present invention, and more preferably an endotoxin-specific Limulus reagent.
[0064]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[Production Example] Production of the Limulus Reaction-Activating Substance of the Present Invention
50 μl of influenza HA vaccine (IHA-LotA) and Japanese encephalitis vaccine (JEC-LotA) were added to TSKgel G4000SW and TSKgel G3000SW (both manufactured by Tosoh, both column sizes 7 × 30 mm, volume 14.3 cm)^Three1) each by elution at a flow rate of 0.5 ml / min using distilled water from which endotoxin and β-D-glucan have been removed as a solvent. Fractionated. The elution pattern when the influenza HA vaccine is used is shown in FIG.
To each eluted fraction, an aqueous solution of polymyxin B sulfate was added to a final concentration of 0.5 mg / ml, and the endotoxin activity was completely suppressed, followed by endospecy [endotoxin-specific Limulus reagent, sold by Seikagaku Corporation. ), The Limulus reaction activity was measured, and the positive fraction (the fraction having activity) was collected to obtain the Limulus reaction activator of the present invention.
[0065]
[Example 1] Comparison of physical properties and properties of Limulus reaction activator and endotoxin mixed in vaccine preparation
Table 1 shows the properties of the limulus reaction activator of the present invention produced in the above production examples from influenza HA vaccine (IHA-LotA) and Japanese encephalitis vaccine (JEC-LotA).E.coli 0111: B4,E.coli 055: B5,E.coliUKT-B,Salmonella  minnesotaR595,S.marcescens,S.typhimurium,  S.abrtus equiThe results of comparative examination with Westphal-type endotoxin prepared from the above are shown. After processing each sample for measuring limulus under the conditions shown in the table below, these were treated with endotoxin-specific limulus reagent (Endospecy, Seikagaku) and endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan-free. Change in absorbance [A405nm-492nm (control wavelength)] per minute by reacting in microplate radar (Well Reader SK601, Seikagaku) for 30 minutes using a microtiter plate (Toxipet Plate 96F, Seikagaku) The endotoxin concentration was automatically calculated from the rate (mAbs / min), and the remaining activity (%) of the limulus reaction activator and endotoxin was determined when the untreated control was taken as 100%. From Table 1, the Limulus reaction activator mixed in influenza HA vaccine, Japanese encephalitis vaccine, etc., has a function of directly activating endotoxin sensitivity factor (factor C) present in horseshoe crab blood cells, non-serine protease (C No ability to activate factors and clotting enzyme precursors, and no direct hydrolytic ability to synthetic substrates) and non- (1 → 3) -β-D-glucan (no ability to activate factor G) It was revealed that these molecules have physical properties similar to those of endotoxin that forms polymeric amphiphilic micelles. The activated substance was found not to be adsorbed on a glass test tube even when left at a low temperature for a long time, and has the property of stably maintaining the Limulus activity.
[0066]

[0067]
Note) ・ Pyrogenicity: Carry out in accordance with the rabbit fever test described in the Japanese Pharmacopoeia, and positive if the value obtained by subtracting the starting body temperature from the maximum body temperature (rectal temperature) after 3 hours is> 0.55 ° C.
Polymyxin B: An aqueous solution of the same sulfate (Sigma, used: 0.5 mg / ml)
・ Acid: 0.2M hydrochloric acid, 37 ℃, 60 minutes treatment
・ Alkali: 0.2M potassium hydroxide, 37 ℃, 60 minutes treatment
・ Thermal stability: 100 ℃, 60 minutes treatment
-Solution stability: 0.02M phosphate buffer (pH 7.0), left at 4 ° C for 10 days
・ Synthetic substrate: Boc-Leu-Gly-Arg-pNA ・ hydrochloride (during reaction: 3.0 mM)
C factor activation ability: purified factor C (Nakamura T. et al., Eur. J. Biochem.154, 511-521 (1986)) and measured by the amidase activity of the synthetic substrate of active factor C.
Inhibition by anti-factor C antibody: Measurement was started after adding 1 volume of a 250-fold diluted solution of mouse monoclonal antibody (2C12) to factor C to 1 volume of Limulus measurement sample.
[0068]
-Factor G activation ability: Using purified factor G (prepared by the method of Obayashi T. et al., Clin. Chi, Acta, 149, 55-65 (1985)) Precursor activation ability was measured by the amidase activity of the synthetic substrate.
Coagulase precursor activation ability: Like factor G, the ability of the coagulase precursor purified by the method of Obayashi et al. To activate coagulase is measured by the amidase activity of the synthetic substrate.
・ Metal ions: NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂Aqueous solution (during treatment: 0 to 1.5M)
・ Endotoxin adsorbent: END-X-B15 (adsorbent with endotoxin neutralizing factor in horseshoe crab blood cells, manufactured by Cape Cod, Seikagaku Corporation), Pirocep A & C (adsorbent with histidine ligand, Tanabe Seiyaku) Manufacturing, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), collecting the unadsorbed fractions, measuring endotoxin with Endspecies, and calculating the adsorption rate (%) on the carrier.
*: See Example 2
[0069]
[Example 2] Effects of various surfactants on Limulus reaction activator and endotoxin
The Limulus reaction activator of the present invention obtained from the influenza HA vaccine (IHA-LotA) or Japanese encephalitis vaccine (JEC-LotA) produced in the above production example, andE.coli 0111: Take 25 μl of B4 endotoxin (Westphal type, hereinafter Et-B4, 2EU / ml) on Toxipet Plate 96F, and use polyoxyethylene-based nonionic surfactant (trade names Tween, Triton, Brij, etc., Sigma) , Aldrich, Wako Pure Chemical Co., Ltd., sold by Dojin Chemical Laboratories), add 25 μl of aqueous solution, mix well, add 50 μl of endospecy, react at 37 ° C. for 30 minutes, and control distilled water as in Example 1. As a residual activity (%). From Table 2, it can be seen that when a surfactant having an appropriate concentration is added, there is a large difference in the residual activity depending on the surfactant. For example, by mixing with Brij56, it is clear that the Limulus reaction activator mixed in IHA can be completely inactivated while maintaining the endotoxin activity well. As is clear from Table 2, there are other surfactants having similar action, such as Triton N-101 and Tergitol, in addition to Brij56, and an aqueous solution of such a surfactant coexists in the sample for measuring Limulus as appropriate. It was found that, by making it possible to eliminate the influence (false positive) on the Limulus reaction of the Limulus reaction activator mixed in the Limulus measurement sample, only endotoxin can be specifically measured.
[0070]
[Table 1]

[0071]
[Example 3] Effect of various surfactants on endotoxin measurement in various biological preparations
Biological preparations containing high concentrations of Limulus reaction activator [Influenza HA vaccine (IHA-LotB, stock solution), Japanese encephalitis vaccine (JEC-LotB, stock solution) and 2.5% (W / V) human serum albumin (HSA-LotY1)] 25 μl is dispensed into microplates, and 25 μl of each aqueous solution of Tergitol, Triton N-101 and Brij 56 (all sold by Sigma) is 0.004 to 0.25% (W / V) when mixed. Add 50 μl of Endospecy after thoroughly stirring (at room temperature for 1 minute), determine the endotoxin concentration by the method shown in Example 1, and the value is compared with the value when no additive (distilled water) is used as a control. The degree of remaining Limulus activity (%) was calculated. In addition, endotoxin (Et-B4) with a known concentration (1.2EU / ml) is added to various biological products that contain almost no Limulus reaction activator, and the recovery rate (%) is calculated with distilled water as 100%. did. As can be seen from Table 3, if a surfactant aqueous solution prepared at an appropriate concentration is used, nonspecific endotoxin reaction does not remain, and conditions for specifically measuring endotoxin alone should be set. Is possible. That is, by mixing a surfactant aqueous solution and a sample for measuring Limulus at an appropriate concentration, the endotoxin recovery rate is good and the non-specific endotoxin activity (Limulus reaction activation after mixing with the sample for Limulus measurement). It is clear that only the endotoxin in the sample for measuring Limulus can be specifically measured. From Table 3, it is clear that the above objectives can be achieved by using Brij 56 for IHA, Tergitol, Triton N-101 and Brij 56 for JEC, and Brij 56 for HSA with appropriate concentrations of Brij 56. It is.
[0072]

[0073]
[Example 4] Effect of Brij56 concentration on endotoxin measurement in various biological preparations
After adding 25 μl of Brij 56 aqueous solution prepared so as to be 0 to 0.5% (W / V) at the time of mixing to 25 μl of various biologics used in Example 3, 50 μl of Endospecy was added, and as described in Example 1 The endotoxin concentration (EU / ml) was measured by the method, and the endotoxin addition recovery rate (%) at the concentration of each Brij 56 aqueous solution was shown together in FIG. As the concentration of the Brij 56 aqueous solution increases, the limulus activity (non-specific endotoxin concentration) and the endotoxin addition recovery rate decrease significantly. Therefore, the concentration of Brij 56 capable of suppressing the nonspecific endotoxin (Limulus reaction activator) activity to the maximum while appropriately maintaining the addition recovery rate of endotoxin is appropriately selected. In this selected concentration range, it is clear that the Limulus reaction-activating substance mixed in the sample for measuring Limulus can be inactivated and only endotoxin can be specifically measured.
[0074]
[Example 5] Effect of temperature at Brij mixing and standing time at each temperature after mixing in endotoxin measurement in various biological preparations
Brij 56 aqueous solution was added to 25 μl of influenza HA vaccine (IHA-LotB) so as to be 0.125% (W / V) at the time of mixing, and mixed at 4 to 80 ° C. for 1 minute. After mixing separately, the mixture was further allowed to stand at the same temperature for 1 to 20 minutes. The relative values of the endotoxin activities (remaining limulus activity when distilled water was used as a control (100%)) and the endotoxin addition recovery rate (%) were calculated. FIG. 4 shows the results when stirring was performed for 1 minute at each temperature. From FIG. 4, it is possible to maintain a good endotoxin recovery rate and to suppress the limulus activity to the maximum by simply adding an aqueous solution of the surfactant to the sample for measuring Limulus and stirring at 4 to 50 ° C. for 1 minute. (From 4 to 40 ° C., the remaining rate of limulus activity and the recovery rate of endotoxin addition were not particularly affected even when left for 5 minutes.) Furthermore, under the heating conditions of 60 ° C. or higher, endotoxin activity is not maintained stably, and it has been impossible to accurately measure endotoxin in a sample for measuring Limulus.
[0075]
[Example 6] Effect of polymyxin B, EDTA-4Na and Brij 56 on endotoxin measurement in various biological preparations
A total of 6 lots of 25 μl containing the same biological products as in Example 3 were used, 25 μl of polymyxin B sulfate (Sigma, 2 mg / ml) aqueous solution 25 μl or 10 mM EDTA-4Na aqueous solution 25 μl or 0.25% (W / V) 25 μl of Brij 56 aqueous solution was mixed, 50 μl of endospecy was added, and the endotoxin concentration (EU / ml) was determined in the same manner as described in Example 1. Further, the control (total amount of endotoxin and Limulus reaction activator) to which none of polymyxin B, EDTA-4Na and Brij 56 was added was 1, and the ratio of the activity to the control under each condition was calculated. Only the endotoxin contained in the sample for measuring Limulus is specifically inactivated by the addition of polymyxin B or EDTA-4Na aqueous solution of the prescribed concentration, and only the Limulus reaction activator contained in the sample for measuring Limulus by adding Brij 56 Assuming that is specifically inactivated, the sum of the ratio of the value obtained with each addition to the control should equal 1 which is the total amount of endotoxin and limulus reaction activator. As is clear from FIGS. 5A and B (similar tests performed in different lots), the sum of each biologic was 1 ± 0.05 (CV = 5%, n = 3) proved that the assumption was correct. From this, it is possible to inactivate only the Limulus reaction activator and specifically measure endotoxin by coexisting an aqueous solution of Brij 56 with a sample for measuring Limulus to a predetermined concentration. I understand.
[0076]
[Example 7] Dilution dose response of various biological preparations
An equal amount of 0.25% (W / V) Brij 56 aqueous solution was added to the same biological preparation as in Example 3, and then 25 μl of a diluted solution prepared in distilled water or 0.125% Brij 56 aqueous solution to × 2 to × 32 In addition, take 25 μl of the diluted solution prepared in × 2 to × 32 with distilled water in advance on the Toxipet Plate 96F, add 25 μl each of distilled water and 0.25% (W / V) Brij 56 aqueous solution, and stir well. 50 μl was added, and the endotoxin concentration was measured by the method described in Example 1. Relative activity (%) obtained by dividing each value by the true endotoxin value, that is, the measurement value obtained by adding 25 μl of 0.25% (W / V) Brij 56 aqueous solution to 25 μl of Limulus measurement sample at each dilution ratio Plotted. As shown in FIGS. 6A to 6C, in the case where an aqueous solution of Brij 56 was added to a sample for measuring Limulus previously diluted with distilled water, stable relative activity was obtained at each dilution rate, whereas Limulus was obtained. A sample diluted with distilled water after adding an aqueous solution of Brij 56 to the sample for measurement showed a tendency for the measured value to increase as the dilution rate increased. On the other hand, after adding an aqueous solution of Brij 56 to a sample for measuring Limulus and then diluting with an aqueous solution of 0.125% (W / V) Brij 56 instead of distilled water, the sample for measuring Limulus previously diluted with distilled water As in the case of adding an aqueous solution of Brij 56, stable relative activity was exhibited and a good dilution dose response was observed. Therefore, once the Limulus reaction-activating substance that has been inactivated by Brij 56 is diluted by adding distilled water (that is, the concentration of Brij 56 is diluted from the sample for measurement), Some reversible recovery phenomena are observed, but this recovery phenomenon is completely observed when the sample for Limulus measurement is diluted with Brij 56 to inactivate with Brij 56 and the same concentration as that. It can be seen that all dilutions show a constant endotoxin value.
[0077]
This is a point that is greatly different from the properties of known Limulus reaction false positive substances and the like, and the inactivation method of Limulus reaction false positive substances produced mainly using blood as a sample for measuring Limulus. That is, it is known that once these false positive substances are inactivated by the inactivation method, the Limulus activity is no longer recovered at all after any treatment.
The Limulus reaction-activating substance of the present invention is one whose ability to activate the Limulus reaction is suppressed only in the presence of a specific concentration of the above-mentioned specific surfactant. Therefore, when eliminating the influence of the Limulus reaction activator of the present invention and accurately measuring only the true endotoxin in the Limulus measurement sample with the Limulus reagent, a certain concentration of the specific surfactant is always present together. It is necessary to keep. This point is greatly different from the endotokin measurement method related to the inactivation method of the conventional Limulus reaction false positive substance and the like.
[0078]
[Example 8] Measurement of endotoxins in biological preparations using various Limulus reagents 0.3% (W / V) Brij 30 aqueous solution was added in an equal amount to the various biological preparations used in Example 3, and Endospecies or various Limulus reagents were added. And the endotoxin concentration (EU / ml) in the sample for measuring Limulus was measured using standard endotoxin ET-B4.
The results are shown in Table 4.
[0079]

[0080]
From Table 4, after adding an aqueous solution of Brij 30 to the sample for measuring Limulus, the endotoxin concentration in the sample for measuring Limulus was measured using various Limulus reagents. It can be seen that only endotoxin can be specifically measured only by allowing Brij30 to coexist in the sample for measuring Limulus, even if the measurement method and measurement reagent are different.
[0081]
[Example 9] Effect of alkylamine on endotoxin reactivity
Various S-type and R-type endotoxins that differ mainly in the O antigen polysaccharide chain length (E.coli O111: B4 3 types,E.coli UKT-B,

E.coli

0113,Salmonella minnesota R595,S.minnesotaR5 (Rc),S.typhosa,S.enteritidis) After adding 25 μl of aqueous solution of Brij 56 (0.25%) to 25 μl of each aqueous dilution series (n = 9) and mixing, 50 μl of Endospecy was added, and the endotoxin concentration (EU / ml) was determined by the method shown in the Examples. Plotted on the logarithmic axis. As a result, the titers differed depending on the type of endotoxin. However, when this heterogeneity was added to an aqueous solution of Brij 56 in advance so that triethylamine was 0.005% (W / V), it was found that As shown in FIGS. A and B, the results showed good focusing (multiple correlation = 0.844). In addition, as a result of confirming dose dependency by adding various endotoxins to influenza HA vaccine (IHA-LotM) containing almost no endotoxin, as shown in FIGS. 8A and B, only Brij 56 was allowed to coexist. It can be seen that better focusing (multiple correlation = 0.850) is obtained when triethylamine is added than when the triethylamine is added. Therefore, by adding a predetermined concentration of triethylamine to an aqueous solution of Brij 56, the dispersion state of endotoxin can be maintained well, and the difference in solubility and reactivity depending on the bacterial species can be minimized. It was revealed that endotoxin in the Limulus measurement sample can be measured more accurately.
[0082]
[Example 10] Measurement of endotoxin by parallel line determination in various biological preparations
Diluted water dilution series (4 points) of 3 lots of various biologics (IHA-LotD, JEC-F, HSA-Y2), each 25 μl, Brij mixed solution [0.25% (W / V) Brij56 + Add 0.010% (W / V) triethylamine], stir, add 50 μl of endospecy attached to the kit, and react at 37 ° C. for 30 minutes with well reader SK601. Change the absorbance per minute (mAbs405-492 nm / min) Analyzed with dedicated parallel line quantitative software (EG301, Seikagaku Kogyo), Japanese Pharmacopoeia standard endotoxin (E .coli The endotoxin concentration (EU / ml) was calculated using UKT-B). As shown in Fig. 9, good parallel lines and reproducibility were obtained for any sample for measuring Limulus, and this kit was able to quantify endotoxin in biological products specifically and accurately. It was.
[0083]
[Example 11] Measurement of Limulus reaction activator of the present invention in various biological preparations To 50 μl of various biological preparations described in Example 8, an equal amount of 0.2M NaOH was added and heated at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, 50 μl of 0.2M HCl was added for neutralization. 50 μl of the endospecies was added to 50 μl, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes (A), and the amount of the limulus reaction activator of the present invention was measured. On the other hand, the endotoxin and the total amount of the Limulus reaction activator of the present invention (C) measured using distilled water instead of NaOH, and 25 μl of this preparation, 25 μl of 0.25% Brij 56, and then 50 μl of Endospecy were added. (B) is also shown.
[0084]
As shown in Table 5, in each of the IHA, JEC, and HSA preparations, only the Limulus reaction activator of the present invention mixed in the preparation is specifically measured only by adding NaOH and heating at 37 ° C. It turns out that it is possible. In addition, the value obtained by adding the amount of the limulus activating substance of the present invention obtained by this method to the measured value of the endospecies obtained by adding an aqueous solution of Brij 56 to this preparation is the endotoxin and the limulus reaction activity of the present invention. It was clear that the amount of the Limulus reaction-activating substance of the present invention can be accurately measured by this method because the value was almost equal to the total amount of the activating substance.
[0085]
Table 5
───────────────────
Various preparations A B C (): A + B
───────────────────
IHA 14.0 3.0 17.3 (17.0)
JEC 2.9 0.2 3.2 (3.1)
HSA 9.4 0 9.3 (9.4)
───────────────────
[0086]
【The invention's effect】
As described above, the present inventionmainlyProvided is a method for easily and rapidly inactivating non-endotoxin limulus reaction-activating substances having no pyrogenic activity mixed in biological preparations, and measuring only endotoxin with a limulus reagent with high accuracy. According to the present invention, the amount of endotoxin in a biological product can be correctly measured, and thus the safety evaluation of the biological product can be performed more appropriately.It leads to a big contribution to medical care.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a drawing showing a cascade mechanism of a horseshoe crab coagulation system.
FIG. 2 is a drawing showing an elution pattern of a Limulus reaction-activating substance of the present invention in an influenza vaccine by high performance liquid chromatography.
FIG. 3 shows the effect of various concentrations of surfactants on the measurement of endotoxins in biologics.
FIG. 4 shows the effect of temperature and time after addition of a surfactant on the measurement of endotoxins in biological preparations.
FIG. 5 is a drawing showing the influence of polymyxin B, EDTA-4Na and a surfactant on endotoxin measurement.
FIG. 6 shows dilution dose response.
FIG. 7 is a drawing showing the influence (distilled water system) of surfactant and triethylamine on various endotoxin reactivity.
FIG. 8 is a drawing showing the influence of a surfactant and triethylamine on various endotoxin reactivity (biological formulation system).
FIG. 9 is a drawing showing measurement of endotoxin in a biological preparation by parallel line quantification.

Claims

A method for measuring endotoxin in a sample for measuring Limulus comprising the following steps:
(1) The final concentration of the surfactant is 0.005 to 0.8% when the sample for measuring Limulus, the surfactant, and the alkylamine are at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant to 50 ° C. or less. A first step of coexisting so as to be (W / V) ;
(2) A second step of measuring endotoxin by causing the sample for measuring Limulus obtained in the first step to undergo a Limulus reaction with a Limulus reagent.

The method for measuring endotoxin according to claim 1, wherein the surfactant is a nonionic surfactant.

3. The nonionic surfactant is one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether and acyl polyoxyethylene sorbitan. The measuring method of endotoxin as described.

The method for measuring endotoxin according to any one of claims 1 to 3, wherein the Limulus reagent is an endotoxin-specific Limulus reagent.

A method for measuring endotoxin in a biologic comprising the following steps:
(1) The final concentration of the surfactant is 0.005 to 0.8% at a temperature exceeding the freezing point temperature of the surfactant and the biological agent, surfactant and alkylamine at a temperature of 50 ° C. or lower. A first step of coexisting so as to be (W / V) ;
(2) A second step of measuring endotoxin by causing the biological preparation obtained in the first step to undergo a Limulus reaction with a Limulus reagent.

The method for measuring endotoxin according to claim 5, wherein the surfactant is a nonionic surfactant.

The nonionic surfactant is one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether and acyl polyoxyethylene sorbitan. The measuring method of endotoxin as described.

The method for measuring endotoxin according to any one of claims 5 to 7, wherein the Limulus reagent is an endotoxin-specific Limulus reagent.