JP3866582B2 - 炎症性疾患の検査方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炎症性疾患、特に炎症性腸疾患の存在、病態及び予後を適確に判定するための検査方法及び診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症性疾患の存在乃至病態及び予後の判定のための臨床指標は、当該疾患の診断及び治療に極めて有用である。殊に、炎症性腸疾患（IBD：inflammatory bowel disease）としての潰瘍性大腸炎（ＵＣ）やクローン病（ＣＤ）は、通常の炎症とは明らかに異なり、原因不明で再発再燃を繰り返し難治性であることから、治療経過にそくして、その病態を反映する適切な臨床指標が求められている。
【０００３】
臨床検査で一般に知られている炎症マーカーとしては、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）やシアル酸等の急性炎症性蛋白及び白血球数等の血液生化学検査があり、日常初期診療における基本的検査として利用されている。また、これらの１又は複数の併用が、その原疾患を問わずに、経過観察の指標として利用されている。上記ＩＢＤの治療に際しても同様の指標が利用されている。
【０００４】
しかし、これらの従来の炎症マーカーは、各種の炎症性疾患、特にＩＢＤの治療に対しては満足できるものではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、炎症性疾患、特にＩＢＤの存在、病態及び予後の新たな判定法及び診断薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は炎症性疾患患者の末梢血中の成分を種々検討してきたところ、炎症性疾患患者の末梢血中には炎症性刺激により形成された血小板−白血球複合体が検出されること、該疾患の治癒の程度に相応して該複合体の量が減少すること、すなわち、血小板−白血球複合体が炎症性疾患の新たな臨床指標になり、その測定によって、炎症性疾患の存在自体が判定、診断できるとともに、該疾患の進展、病態及び予後をも高い信頼性をもって判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、炎症性腸疾患の存在乃至病態を判定するための検査方法であって、末梢血における血小板−白血球複合体量を測定し、該測定値を当該検査における臨床指標とすることを特徴とする炎症性腸疾患の検査方法を提供するものである。また、本発明は、血小板特異的な細胞表面マーカーに対する抗体を含有する血小板検出試薬と白血球特異的な細胞表面マーカーに対する抗体を含有する白血球検出試薬とを含む末梢血の血小板−白血球複合体量測定試薬を含有する炎症性腸疾患の診断薬を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明により診断できる炎症性疾患としては、各種の炎症が挙げられるが、末梢血中の血小板−白血球複合体量との相関性が特に高いのは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）で代表される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。当該ＩＢＤは通常の炎症とは異なり、原因不明で難治性であることから、その病態を反映する良好な臨床指標が求められていた。
【０００９】
検体として用いられる末梢血は、被験者から常法に従い採血された末梢血であればよい。採血に際して特に制限はないが、抗凝固剤は、一般に、血小板又は白血球を活性化することが知られているものは使用を避けた方がよい。好ましい抗凝固剤としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）の塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａ−ＥＤＴＡ−３Ｋなど）やクエン酸塩などが挙げられる。
【００１０】
測定に際して、採血された末梢血から白血球画分を採取する。例えば末梢血を溶血操作後、遠心分離にて白血球画分を取得すればよい。白血球画分は必要に応じて洗浄するが、当該洗浄に用いる緩衝液は通常のものを用いることができる。
【００１１】
本発明において測定される血小板−白血球複合体は、血小板と白血球とが結合した複合体であれば特に制限されないが、血小板−好中球複合体又は血小板−単球複合体が好ましい。
【００１２】
血小板−白血球複合体の測定は、例えば末梢血由来の白血球分画に、血小板と特異的に結合する検出試薬（血小板結合試薬）と、所望の白血球に特異的に結合する検出試薬（白血球検出試薬／好中球検出試薬／単球検出試薬）との両者を反応させ、両試薬が結合した白血球分画を測定することにより行なわれる。
【００１３】
血小板検出試薬は、白血球と結合せず、血小板と結合性を有するものであれば特に制限はないが、血小板特異的な細胞表面マーカーとして知られているＣＤ６１やＣＤ４１の特異抗体（J. Immunol. Methods, 1995 Nov. 16；187(1)：53-67、Vet. Immunol. Immunopathol., 1996 Aug；52）が好ましい。また、白血球検出試薬は、血小板と結合せず、白血球と結合性を有するものであれば特に制限はないが、所望の白血球成分に特異的な或いは共通の細胞表面マーカーの抗体を例示できる。例えば、好中球検出試薬としては抗ＣＤ１６抗体（Microsc. Res. Tech., 1994 Jul. 1；28(4)：277-85、Cytometry, 1997 Dec. 15；30(6)：313-6、Immunol. Methods, 2000 Jul. 31；241(1-2)：11-8.）、単球検出試薬とては抗ＣＤ１４抗体（J. Immunol., 1988 Jul. 15；141(2)：547-52.）が好ましい。
【００１４】
これら検出試薬には、結合の確認のための指標が付されているのが好ましい。標識は、採用する検出方法に従い、任意に選択される。簡便さからフローサイトメーターによる測定が好ましく、この場合には、検出試薬は蛍光標識される。蛍光標識も制限はなく、一般的なＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（R-phycoerythrin）などによる標識を採用できる。血小板結合試薬と白血球検出試薬とは異なる蛍光物質で標識される。これらの標識された検出試薬は、常法に従い製造できるが、市販品としても入手できる。
【００１５】
白血球分画と検出試薬との反応は、採用する検出試薬に応じて適宜設定される。検出試薬が抗体である場合は、通常の免疫反応に従えばよい。反応液は特に制限されないが、所望により、細胞成分の活性化を抑制するのに有効量のアジ化ナトリウムを含ませてもよい。また、反応は、特に制限されないが、細胞成分の活性化を抑制する上で、４℃程度にて行なうのが好ましい。
【００１６】
フローサイトメーターによる蛍光標識された細胞成分の測定は常法に従って行なわれる。血小板と白血球の複合体は、血小板検出試薬と白血球検出試薬の両者が結合した白血球亜集団として測定される。なお、所望の抗白血球抗体を利用したフローサイトメトリー解析により、目的とする白血球亜集団と、顆粒球、単球、リンパ球などの他の白血球亜分類とを区別する方法は広く普及しており（Acta. Cytol., 1975 Jul-Aug；19(4)：374-7、J. Clin. Immunol., 1982 Jul；2(3 Suppl)：32S-41S.）、使用する白血球検出試薬を適切に選択することにより目的とする白血球成分と血小板との複合体を測定することができる。
【００１７】
かくして測定された血小板−白血球複合体量は、例えば、検体に含まれる全白血球（白血球検出試薬と結合した細胞）当たりの百分率として、或いは、当該百分率にて算出された細胞濃度として表すことができ、臨床指標として利用される。
【００１８】
本発明の炎症性疾患診断薬は、検査キットとすることができる。当該検査キットは、血小板−白血球複合体の検出のための試薬、例えば、血小板結合試薬及び所望の白血球に対応した１又は複数の白血球結合試薬を有効成分として含む。当該検査キットは、さらに、当該測定系に利用される検出試薬などの任意の試薬を含むことができる。また、測定に当たって適当な試薬類、例えば抗体希釈液、反応希釈液、緩衝液、洗浄液などを含むこともできる。
【００１９】
本発明においては、かくして測定された末梢血における血小板−白血球複合体量を、炎症性疾患の臨床指標として利用する。炎症性疾患患者における血小板−白血球複合体量は、健常者におけるそれと対比して、有意に増加し、また、疾患の治療が進むに伴って低下する。この血小板−白血球複合体量及びその変化、特に血小板−白血球複合体量の経時的変化を臨床指標とすることによって、炎症性疾患の存在、病態及び予後を判定できる。前記の如く、特にＩＢＤの臨床指標として優れている。また、治療経過に応じて、血小板−白血球複合体量が低下するので、望ましい臨床指標として把握できる。
【００２０】
また、血液を体外循環させて末梢血の顆粒球や白血球を除去する白血球除去療法がＩＢＤやリウマチに治療効果を示すことが報告されている（J. Clin. Apheresis., 2001；16(1)：1-9、Ther. Apher., 1998 May；2(2)：93-6、同. 134-41、Rheumatol. Int., 1998；18(3)：113-8、Artif. Organs., 1997 Sep；21(9)：989-94.）が、このような炎症治療を目的とした白血球除去療法を、効果的かつ患者リスクを軽減して実施するために、本発明の臨床指標は好適に利用できる。本発明の指標が高い患者或いは時期にこの治療を行なうのが効果的であり、当該治療に最適な患者や治療時期の選択や治療の有効性の評価に有用である。
【００２１】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）末梢血白血球の調製
ＥＤＴＡ採血した血液１００μｌを試験管に分注し、溶血緩衝液（200mL精製水に0.73g EDTA-2Na, 1.66g NH4Cl及び0.2g KHCO3 を溶解した緩衝液）３mLを加え、ボルテックスミキサーで撹拌後室温で５分放置して溶血操作を行なった。３mLのＰＢＳ（pH７．６）を加えて再度撹拌し、冷却遠心分離機を使って４℃に冷却した状態で遠心分離（1500rpm, 5分）して末梢血白血球をペレットとして得た。このペレットを試験管内でほぐし、０．１％ＢＳＡ（bovine serum albumin）及び０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳの３mLを加えて再懸濁し、同様の遠心操作により白血球を沈降させペレットを得た（遠心洗浄操作）。この遠心洗浄操作を２回行ない洗浄された末梢血白血球を得た。
【００２３】
（２）血小板−白血球複合体の測定
血小板特異的な細胞表面マーカーとしてＣＤ６１、好中球特異的な細胞表面マーカーとしてＣＤ１６及び単球特異的な細胞表面マーカーとしてＣＤ１４を使用して、血小板とこれら白血球との複合体（血小板−好中球複合体及び血小板−単球複合体）を測定した。
【００２４】
すなわち、前記末梢血白血球を試験管内でほぐし、次の組み合わせの蛍光標識抗体（いずれもBecton Dickinson）の各２０μｌ／試験管を添加し、遮光状態で４℃の冷蔵庫内で４５分間反応させた（ｎ＝５）。
【００２５】
血小板−好中球複合体：ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６１マウス抗体（ＩｇＧ１）及びＰＥ標識抗ヒトＣＤ１６マウス抗体（ＩｇＧ１）
血小板−単球複合体：ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６１マウス抗体（ＩｇＧ１）及びＰＥ標識抗ヒトＣＤ１４マウス抗体（ＩｇＧ２ａ）
【００２６】
反応後、各試験管に０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳの３mLを加え、未反応の抗体を前記同様の遠心洗浄操作で洗浄除去した。得られたペレットをほぐし、１％ホルマリンを含むＰＢＳの１mLを加えて再懸濁し１５分間４℃で反応させた。ＰＢＳの３mLを各試験管に加え、遠心洗浄操作にてホルマリンを洗浄し、フローサイトメーター（Becton Dickinson FACS Calibur）を用いて血小板と白血球の複合体を解析した。これら複合体は、ＣＤ１６抗体又はＣＤ１４抗体との反応性によって分けられた白血球亜集団中の血小板特異抗体（ＣＤ６１抗体）陽性細胞として測定される。
【００２７】
尚、蛍光標識抗体を添加していない陰性対照及び血小板や白血球に反応性のない精製マウス抗体（蛍光標識コントロール抗体）を同様に使用し、マウスＩｇＧ１やマウスＩｇＧ２ａ抗体の細胞への非特異的な吸着度合を測定し、上記特異抗体の陽性と陰性を区別するカットオフ値を設定した。
尚、上記ＥＤＴＡ採血した血液の一部を使い、総合血液学検査装置（Technicon H-1 system）により、総白血球数、好中球数、単球数、リンパ球数を測定した。
【００２８】
（３）結果
炎症性腸疾患患者９名の及び健常者８名の測定結果を図１及び図２に示す。
図１は、血小板−好中球複合体の測定結果であり、縦軸は複合体濃度（×103/μl）を、横軸は被験者（図中の黒円は健常者、四角は潰瘍性大腸炎患者、三角はクローン病患者）をそれぞれ示す。図２は、同様に示した、血小板−単球複合体の測定結果である。
【００２９】
尚、複合体濃度は、総合血液学検査装置により測定した好中球又は単球の濃度を基にして、フローサイトメーターで解析したＣＤ１６陽性細胞（好中球）中に占める血小板−好中球複合体の割合（％）又は同ＣＤ１４陽性細胞（単球）中の血小板−単球複合体の割合（％）から算出した値である。
図１より、末梢血中の血小板−好中球複合体は、健常者群（平均±標準偏差：0.170±0.166×103/μl、n＝8）に比べ、炎症性腸疾患患者群（平均±標準偏差：0.646±0.475×103/μl、n＝9）で有意に高値を示し（Mann-Whitney U test：P＝0.0029）、炎症性腸疾患の病態変化によって末梢血中の血小板−好中球複合体が増加することが分かる。図２より、末梢血中の血小板−単球複合体も、健常者群（平均±標準偏差：0.088±0.039×103/μl、n＝6）に比べて炎症性腸疾患患者群（平均±標準偏差：0.268±0.164×103/μl、n＝9）で有意に高値を示した（Mann-Whitney U test：P＝0.0251）。
尚、図２においては、血中の単球数が少ないため、血小板−単球複合体の割合（％）を測定するに十分な単球が回収できなかった健常者２例は除外されている。
【００３０】
実施例２ 血液体外循環治療による血小板−白血球複合体の測定
活動期の炎症性腸疾患患者の末梢血中の血小板−白血球複合体を測定し、患者の治療経過に伴う変化を観察した。患者は本研究への参加の同意が得られた潰瘍性大腸炎患者２名及びクローン病患者１名の計３名である。
【００３１】
血液体外循環治療は、血液体外循環装置（Adacolumn；日本抗体研究所）を用いた白血球除去療法（前記の文献と同様）を週１回のペースで連続５週（５回）実施された。血小板−白血球複合体の測定は、治療開始直前（Ｐｒｅ）、治療３回目前（２回治療後：３Ｗ）及び治療５回目前（４回治療後：５Ｗ）の３時点で前記実施例１に従い行なった。尚、ＥＤＴＡ採血した血液は、検査時まで４℃で保存し、採血後３時間以内に測定した。また、同時採血した血液にて、臨床検査によるＣ反応蛋白（ＣＲＰ）の血中濃度測定を行い、加えて、問診により採血日の便回数を調査した。
【００３２】
結果を図３に示す。同図において、縦軸は前記した複合体濃度を、横軸は測定時点をそれぞれ示し、図中の「(a)Neu-plt」は血小板−好中球複合体を、「(b)Mono-plt」は血小板−単球複合体の測定結果を示す。また、図中の線（１）は患者１（潰瘍性大腸炎）を、同（２）は患者２（潰瘍性大腸炎）を、同（３）は患者３（クローン病）における測定結果を示す。
患者末梢血中の血小板−好中球複合体及び血小板−単球複合体は、便回数や炎症性の自覚症状（腹痛、下痢）等の治療による症状改善に伴い、その数が減少した。特に、治療開始前に便回数の多かった（１３回／日）患者２では、治療に伴って便回数が減少し、（３Ｗ及び５Ｗ：２回）、これに応じた複合体数の減少が認められた。
便回数とこれらの複合体測定値との相関性は、複合体の測定、ＣＲＰの測定及び便回数の記録があった計１４検体（実施例１及び２における潰瘍性大腸炎検体１０例及びクローン病検体４例）において解析し（spearman rank correlation）、血小板−好中球複合体の割合（ρ＝0.566、P＝0.0412）及び血小板−単球複合体濃度（ρ＝0.741、P＝0.0076）との間で相関性を認めた。尚、ＣＲＰ測定値と便回数との間では明らかな相関性は認められなかった（ρ＝0.101、P＝0.1138）。
以上より、血小板−好中球複合体及び血小板−単球複合体は、炎症性腸疾患患者の炎症病態を反映する指標であることが分かる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の検査方法によれば、炎症性疾患、特に炎症性腸疾患の存在、病態及び予後が的確に診断できることから、治療手段や治療時期の選択及び治療の有効性の評価が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】末梢血中の血小板−好中球複合体の測定結果であり、縦軸は複合体濃度（×103/μl）を、横軸は被験者（図中の黒円は健常者、四角は潰瘍性大腸炎患者、三角はクローン病患者）をそれぞれ示す。
【図２】末梢血中の血小板−単球複合体の測定結果であり、縦軸は複合体濃度（×103/μl）を、横軸は被験者（図中の黒円は健常者、四角は潰瘍性大腸炎患者、三角はクローン病患者）をそれぞれ示す。
【図３】治療中の炎症性腸疾患患者末梢血中の血小板−白血球複合体の測定結果であり、縦軸は、前記した複合体濃度を、横軸は測定時点をそれぞれ示し、図中の「(a)Neu-plt」は血小板−好中球複合体を、「(b)Mono-plt」は血小板−単球複合体の測定結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、炎症性疾患、特に炎症性腸疾患の存在、病態及び予後を適確に判定するための検査方法及び診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症性疾患の存在乃至病態及び予後の判定のための臨床指標は、当該疾患の診断及び治療に極めて有用である。殊に、炎症性腸疾患（IBD：inflammatory bowel disease）としての潰瘍性大腸炎（ＵＣ）やクローン病（ＣＤ）は、通常の炎症とは明らかに異なり、原因不明で再発再燃を繰り返し難治性であることから、治療経過にそくして、その病態を反映する適切な臨床指標が求められている。
【０００３】
臨床検査で一般に知られている炎症マーカーとしては、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）やシアル酸等の急性炎症性蛋白及び白血球数等の血液生化学検査があり、日常初期診療における基本的検査として利用されている。また、これらの１又は複数の併用が、その原疾患を問わずに、経過観察の指標として利用されている。上記ＩＢＤの治療に際しても同様の指標が利用されている。
【０００４】
しかし、これらの従来の炎症マーカーは、各種の炎症性疾患、特にＩＢＤの治療に対しては満足できるものではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、炎症性疾患、特にＩＢＤの存在、病態及び予後の新たな判定法及び診断薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は炎症性疾患患者の末梢血中の成分を種々検討してきたところ、炎症性疾患患者の末梢血中には炎症性刺激により形成された血小板−白血球複合体が検出されること、該疾患の治癒の程度に相応して該複合体の量が減少すること、すなわち、血小板−白血球複合体が炎症性疾患の新たな臨床指標になり、その測定によって、炎症性疾患の存在自体が判定、診断できるとともに、該疾患の進展、病態及び予後をも高い信頼性をもって判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、炎症性腸疾患の存在乃至病態を判定するための検査方法であって、末梢血における血小板−白血球複合体量を測定し、該測定値を当該検査における臨床指標とすることを特徴とする炎症性腸疾患の検査方法を提供するものである。また、本発明は、血小板特異的な細胞表面マーカーに対する抗体を含有する血小板検出試薬と白血球特異的な細胞表面マーカーに対する抗体を含有する白血球検出試薬とを含む末梢血の血小板−白血球複合体量測定試薬を含有する炎症性腸疾患の診断薬を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明により診断できる炎症性疾患としては、各種の炎症が挙げられるが、末梢血中の血小板−白血球複合体量との相関性が特に高いのは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）で代表される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。当該ＩＢＤは通常の炎症とは異なり、原因不明で難治性であることから、その病態を反映する良好な臨床指標が求められていた。
【０００９】
検体として用いられる末梢血は、被験者から常法に従い採血された末梢血であればよい。採血に際して特に制限はないが、抗凝固剤は、一般に、血小板又は白血球を活性化することが知られているものは使用を避けた方がよい。好ましい抗凝固剤としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）の塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａ−ＥＤＴＡ−３Ｋなど）やクエン酸塩などが挙げられる。
【００１０】
測定に際して、採血された末梢血から白血球画分を採取する。例えば末梢血を溶血操作後、遠心分離にて白血球画分を取得すればよい。白血球画分は必要に応じて洗浄するが、当該洗浄に用いる緩衝液は通常のものを用いることができる。
【００１１】
本発明において測定される血小板−白血球複合体は、血小板と白血球とが結合した複合体であれば特に制限されないが、血小板−好中球複合体又は血小板−単球複合体が好ましい。
【００１２】
血小板−白血球複合体の測定は、例えば末梢血由来の白血球分画に、血小板と特異的に結合する検出試薬（血小板結合試薬）と、所望の白血球に特異的に結合する検出試薬（白血球検出試薬／好中球検出試薬／単球検出試薬）との両者を反応させ、両試薬が結合した白血球分画を測定することにより行なわれる。
【００１３】
血小板検出試薬は、白血球と結合せず、血小板と結合性を有するものであれば特に制限はないが、血小板特異的な細胞表面マーカーとして知られているＣＤ６１やＣＤ４１の特異抗体（J. Immunol. Methods, 1995 Nov. 16；187(1)：53-67、Vet. Immunol. Immunopathol., 1996 Aug；52）が好ましい。また、白血球検出試薬は、血小板と結合せず、白血球と結合性を有するものであれば特に制限はないが、所望の白血球成分に特異的な或いは共通の細胞表面マーカーの抗体を例示できる。例えば、好中球検出試薬としては抗ＣＤ１６抗体（Microsc. Res. Tech., 1994 Jul. 1；28(4)：277-85、Cytometry, 1997 Dec. 15；30(6)：313-6、Immunol. Methods, 2000 Jul. 31；241(1-2)：11-8.）、単球検出試薬とては抗ＣＤ１４抗体（J. Immunol., 1988 Jul. 15；141(2)：547-52.）が好ましい。
【００１４】
これら検出試薬には、結合の確認のための指標が付されているのが好ましい。標識は、採用する検出方法に従い、任意に選択される。簡便さからフローサイトメーターによる測定が好ましく、この場合には、検出試薬は蛍光標識される。蛍光標識も制限はなく、一般的なＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（R-phycoerythrin）などによる標識を採用できる。血小板結合試薬と白血球検出試薬とは異なる蛍光物質で標識される。これらの標識された検出試薬は、常法に従い製造できるが、市販品としても入手できる。
【００１５】
白血球分画と検出試薬との反応は、採用する検出試薬に応じて適宜設定される。検出試薬が抗体である場合は、通常の免疫反応に従えばよい。反応液は特に制限されないが、所望により、細胞成分の活性化を抑制するのに有効量のアジ化ナトリウムを含ませてもよい。また、反応は、特に制限されないが、細胞成分の活性化を抑制する上で、４℃程度にて行なうのが好ましい。
【００１６】
フローサイトメーターによる蛍光標識された細胞成分の測定は常法に従って行なわれる。血小板と白血球の複合体は、血小板検出試薬と白血球検出試薬の両者が結合した白血球亜集団として測定される。なお、所望の抗白血球抗体を利用したフローサイトメトリー解析により、目的とする白血球亜集団と、顆粒球、単球、リンパ球などの他の白血球亜分類とを区別する方法は広く普及しており（Acta. Cytol., 1975 Jul-Aug；19(4)：374-7、J. Clin. Immunol., 1982 Jul；2(3 Suppl)：32S-41S.）、使用する白血球検出試薬を適切に選択することにより目的とする白血球成分と血小板との複合体を測定することができる。
【００１７】
かくして測定された血小板−白血球複合体量は、例えば、検体に含まれる全白血球（白血球検出試薬と結合した細胞）当たりの百分率として、或いは、当該百分率にて算出された細胞濃度として表すことができ、臨床指標として利用される。
【００１８】
本発明の炎症性疾患診断薬は、検査キットとすることができる。当該検査キットは、血小板−白血球複合体の検出のための試薬、例えば、血小板結合試薬及び所望の白血球に対応した１又は複数の白血球結合試薬を有効成分として含む。当該検査キットは、さらに、当該測定系に利用される検出試薬などの任意の試薬を含むことができる。また、測定に当たって適当な試薬類、例えば抗体希釈液、反応希釈液、緩衝液、洗浄液などを含むこともできる。
【００１９】
本発明においては、かくして測定された末梢血における血小板−白血球複合体量を、炎症性疾患の臨床指標として利用する。炎症性疾患患者における血小板−白血球複合体量は、健常者におけるそれと対比して、有意に増加し、また、疾患の治療が進むに伴って低下する。この血小板−白血球複合体量及びその変化、特に血小板−白血球複合体量の経時的変化を臨床指標とすることによって、炎症性疾患の存在、病態及び予後を判定できる。前記の如く、特にＩＢＤの臨床指標として優れている。また、治療経過に応じて、血小板−白血球複合体量が低下するので、望ましい臨床指標として把握できる。
【００２０】
また、血液を体外循環させて末梢血の顆粒球や白血球を除去する白血球除去療法がＩＢＤやリウマチに治療効果を示すことが報告されている（J. Clin. Apheresis., 2001；16(1)：1-9、Ther. Apher., 1998 May；2(2)：93-6、同. 134-41、Rheumatol. Int., 1998；18(3)：113-8、Artif. Organs., 1997 Sep；21(9)：989-94.）が、このような炎症治療を目的とした白血球除去療法を、効果的かつ患者リスクを軽減して実施するために、本発明の臨床指標は好適に利用できる。本発明の指標が高い患者或いは時期にこの治療を行なうのが効果的であり、当該治療に最適な患者や治療時期の選択や治療の有効性の評価に有用である。
【００２１】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）末梢血白血球の調製
ＥＤＴＡ採血した血液１００μｌを試験管に分注し、溶血緩衝液（200mL精製水に0.73g EDTA-2Na, 1.66g NH4Cl及び0.2g KHCO3 を溶解した緩衝液）３mLを加え、ボルテックスミキサーで撹拌後室温で５分放置して溶血操作を行なった。３mLのＰＢＳ（pH７．６）を加えて再度撹拌し、冷却遠心分離機を使って４℃に冷却した状態で遠心分離（1500rpm, 5分）して末梢血白血球をペレットとして得た。このペレットを試験管内でほぐし、０．１％ＢＳＡ（bovine serum albumin）及び０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳの３mLを加えて再懸濁し、同様の遠心操作により白血球を沈降させペレットを得た（遠心洗浄操作）。この遠心洗浄操作を２回行ない洗浄された末梢血白血球を得た。
【００２３】
（２）血小板−白血球複合体の測定
血小板特異的な細胞表面マーカーとしてＣＤ６１、好中球特異的な細胞表面マーカーとしてＣＤ１６及び単球特異的な細胞表面マーカーとしてＣＤ１４を使用して、血小板とこれら白血球との複合体（血小板−好中球複合体及び血小板−単球複合体）を測定した。
【００２４】
すなわち、前記末梢血白血球を試験管内でほぐし、次の組み合わせの蛍光標識抗体（いずれもBecton Dickinson）の各２０μｌ／試験管を添加し、遮光状態で４℃の冷蔵庫内で４５分間反応させた（ｎ＝５）。
【００２５】
血小板−好中球複合体：ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６１マウス抗体（ＩｇＧ１）及びＰＥ標識抗ヒトＣＤ１６マウス抗体（ＩｇＧ１）
血小板−単球複合体：ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６１マウス抗体（ＩｇＧ１）及びＰＥ標識抗ヒトＣＤ１４マウス抗体（ＩｇＧ２ａ）
【００２６】
反応後、各試験管に０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳの３mLを加え、未反応の抗体を前記同様の遠心洗浄操作で洗浄除去した。得られたペレットをほぐし、１％ホルマリンを含むＰＢＳの１mLを加えて再懸濁し１５分間４℃で反応させた。ＰＢＳの３mLを各試験管に加え、遠心洗浄操作にてホルマリンを洗浄し、フローサイトメーター（Becton Dickinson FACS Calibur）を用いて血小板と白血球の複合体を解析した。これら複合体は、ＣＤ１６抗体又はＣＤ１４抗体との反応性によって分けられた白血球亜集団中の血小板特異抗体（ＣＤ６１抗体）陽性細胞として測定される。
【００２７】
尚、蛍光標識抗体を添加していない陰性対照及び血小板や白血球に反応性のない精製マウス抗体（蛍光標識コントロール抗体）を同様に使用し、マウスＩｇＧ１やマウスＩｇＧ２ａ抗体の細胞への非特異的な吸着度合を測定し、上記特異抗体の陽性と陰性を区別するカットオフ値を設定した。
尚、上記ＥＤＴＡ採血した血液の一部を使い、総合血液学検査装置（Technicon H-1 system）により、総白血球数、好中球数、単球数、リンパ球数を測定した。
【００２８】
（３）結果
炎症性腸疾患患者９名の及び健常者８名の測定結果を図１及び図２に示す。
図１は、血小板−好中球複合体の測定結果であり、縦軸は複合体濃度（×103/μl）を、横軸は被験者（図中の黒円は健常者、四角は潰瘍性大腸炎患者、三角はクローン病患者）をそれぞれ示す。図２は、同様に示した、血小板−単球複合体の測定結果である。
【００２９】
尚、複合体濃度は、総合血液学検査装置により測定した好中球又は単球の濃度を基にして、フローサイトメーターで解析したＣＤ１６陽性細胞（好中球）中に占める血小板−好中球複合体の割合（％）又は同ＣＤ１４陽性細胞（単球）中の血小板−単球複合体の割合（％）から算出した値である。
図１より、末梢血中の血小板−好中球複合体は、健常者群（平均±標準偏差：0.170±0.166×103/μl、n＝8）に比べ、炎症性腸疾患患者群（平均±標準偏差：0.646±0.475×103/μl、n＝9）で有意に高値を示し（Mann-Whitney U test：P＝0.0029）、炎症性腸疾患の病態変化によって末梢血中の血小板−好中球複合体が増加することが分かる。図２より、末梢血中の血小板−単球複合体も、健常者群（平均±標準偏差：0.088±0.039×103/μl、n＝6）に比べて炎症性腸疾患患者群（平均±標準偏差：0.268±0.164×103/μl、n＝9）で有意に高値を示した（Mann-Whitney U test：P＝0.0251）。
尚、図２においては、血中の単球数が少ないため、血小板−単球複合体の割合（％）を測定するに十分な単球が回収できなかった健常者２例は除外されている。
【００３０】
実施例２ 血液体外循環治療による血小板−白血球複合体の測定
活動期の炎症性腸疾患患者の末梢血中の血小板−白血球複合体を測定し、患者の治療経過に伴う変化を観察した。患者は本研究への参加の同意が得られた潰瘍性大腸炎患者２名及びクローン病患者１名の計３名である。
【００３１】
血液体外循環治療は、血液体外循環装置（Adacolumn；日本抗体研究所）を用いた白血球除去療法（前記の文献と同様）を週１回のペースで連続５週（５回）実施された。血小板−白血球複合体の測定は、治療開始直前（Ｐｒｅ）、治療３回目前（２回治療後：３Ｗ）及び治療５回目前（４回治療後：５Ｗ）の３時点で前記実施例１に従い行なった。尚、ＥＤＴＡ採血した血液は、検査時まで４℃で保存し、採血後３時間以内に測定した。また、同時採血した血液にて、臨床検査によるＣ反応蛋白（ＣＲＰ）の血中濃度測定を行い、加えて、問診により採血日の便回数を調査した。
【００３２】
結果を図３に示す。同図において、縦軸は前記した複合体濃度を、横軸は測定時点をそれぞれ示し、図中の「(a)Neu-plt」は血小板−好中球複合体を、「(b)Mono-plt」は血小板−単球複合体の測定結果を示す。また、図中の線（１）は患者１（潰瘍性大腸炎）を、同（２）は患者２（潰瘍性大腸炎）を、同（３）は患者３（クローン病）における測定結果を示す。
患者末梢血中の血小板−好中球複合体及び血小板−単球複合体は、便回数や炎症性の自覚症状（腹痛、下痢）等の治療による症状改善に伴い、その数が減少した。特に、治療開始前に便回数の多かった（１３回／日）患者２では、治療に伴って便回数が減少し、（３Ｗ及び５Ｗ：２回）、これに応じた複合体数の減少が認められた。
便回数とこれらの複合体測定値との相関性は、複合体の測定、ＣＲＰの測定及び便回数の記録があった計１４検体（実施例１及び２における潰瘍性大腸炎検体１０例及びクローン病検体４例）において解析し（spearman rank correlation）、血小板−好中球複合体の割合（ρ＝0.566、P＝0.0412）及び血小板−単球複合体濃度（ρ＝0.741、P＝0.0076）との間で相関性を認めた。尚、ＣＲＰ測定値と便回数との間では明らかな相関性は認められなかった（ρ＝0.101、P＝0.1138）。
以上より、血小板−好中球複合体及び血小板−単球複合体は、炎症性腸疾患患者の炎症病態を反映する指標であることが分かる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の検査方法によれば、炎症性疾患、特に炎症性腸疾患の存在、病態及び予後が的確に診断できることから、治療手段や治療時期の選択及び治療の有効性の評価が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】末梢血中の血小板−好中球複合体の測定結果であり、縦軸は複合体濃度（×103/μl）を、横軸は被験者（図中の黒円は健常者、四角は潰瘍性大腸炎患者、三角はクローン病患者）をそれぞれ示す。
【図２】末梢血中の血小板−単球複合体の測定結果であり、縦軸は複合体濃度（×103/μl）を、横軸は被験者（図中の黒円は健常者、四角は潰瘍性大腸炎患者、三角はクローン病患者）をそれぞれ示す。
【図３】治療中の炎症性腸疾患患者末梢血中の血小板−白血球複合体の測定結果であり、縦軸は、前記した複合体濃度を、横軸は測定時点をそれぞれ示し、図中の「(a)Neu-plt」は血小板−好中球複合体を、「(b)Mono-plt」は血小板−単球複合体の測定結果を示す。
Claims (6)
- 炎症性腸疾患の存在乃至病態を判定するための検査方法であって、末梢血における血小板−白血球複合体量を測定し、該測定値を当該検査における臨床指標とすることを特徴とする炎症性腸疾患の検査方法。
- 血小板−白血球複合体が、血小板−好中球複合体又は血小板−単球複合体である請求項１記載の検査方法。
- 血小板−白血球複合体量の経時変化を臨床指標とする請求項１又は２記載の検査方法。
- 血小板特異的な細胞表面マーカーに対する抗体を含有する血小板検出試薬と白血球特異的な細胞表面マーカーに対する抗体を含有する白血球検出試薬とを含む末梢血の血小板−白血球複合体量測定試薬を含有する炎症性腸疾患の診断薬。
- 血小板−白血球複合体が、血小板−好中球複合体又は血小板−単球複合体である請求項４記載の診断薬。
- 血小板−白血球複合体量の経時変化を臨床指標とする請求項４又は５記載の診断薬。
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