JP3858650B2

JP3858650B2 - DNA testing method and apparatus

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Publication number: JP3858650B2
Application number: JP2001292783A
Authority: JP
Inventors: 良忠押田; 健二保田; 智高橋; 太作清野
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2021-09-26
Also published as: JP2003098087A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はそれ自体が蛍光を発するもの又は蛍光標識されたもの、特に蛍光標識されたＤＮＡを検出あるいは検査する方法及び装置に関する。特に、ビーズ又はドットアレー状に配列した蛍光を高感度・広ダイナミックレンジ・高速に検出、検査する方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光物体又は蛍光標識されたＤＮＡがビーズまたはドットアレー状に配列したサンプルを検出する方法として従来励起レーザ光を１スポット状にし、これをサンプルと励起レーザスポットを相対走査させて、得られる蛍光を検出していた。またサンプルの広い領域に励起光を面照射して、得られる蛍光を２次元ＣＣＤ等で蛍光検出していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の１スポットを照射し、相対走査して検出する場合、ビーズ又はドットアレーサンプルを全面隈なく走査するため下記に示すように実際に蛍光検出に有効に使われる時間の比率が非常に小さくなる。即ち、ビーズ又はドットの径をＤとし、ビーズ又はドットのピッチをＰとすると、アレーが正方碁盤目状であるとすると走査時間中蛍光検出に有効に使われる比率はπＤ^２／４Ｐ^２となる。例えばＤとＰの比を１：２とすると、この値は１９．６％、１：１．５としても３４．９％となる。このように半分以上の時間が検出に有効に使われないことに成る。
【０００４】
また１スポット光を照射して検出するため、サンプルが多数のビーズやドットからなる場合蛍光検出に多大な時間を要することに成り、高速検出が難しい。さらに高感度・広ダイナミックレンジで検出しようとすると、１ビーズ又は１ドットを励起する時間はある程度必要になり、高速検出を実現しようとすると感度とダイナミックレンジを犠牲にしなければならない
上記の第２の面照射し、２次元的に検出する場合も、上記の無駄な時間は同じであり、高感度・広ダイナミックレンジについても、困難と成る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決するため以下に示す手段を用いている。
【０００６】
蛍光物質が付着したビーズ又はドットアレーの直径に概ね等しいビーム径のスポット状の励起光を照射する。このビーズ又はドットアレーとこのスポット状励起光を相対的に走査して得られる蛍光を励起光から分離、検出する。この際、ビーズ配列の１ピッチ分の相対走査に要する時間内で概ね常時スポット励起光がビーズ又はドットアレーに照射するようにスポット励起光を追尾駆動する。この用にすることにより、従来問題となっていた、走査時間内のほとんどの時間を蛍光検出に利用することが可能になる。
【０００７】
また同様の効果を得る手段として、ビーズ又はドットアレーとスポット状励起光の相対走査により蛍光検出する際、１ピッチ分の相対走査に要する平均時間内で概ねスポット励起光がビーズ又はドットアレーを照射するように蛍光ビーズ又はドットアレー試料を１ピッチステップずつステップ移動させる。
【０００８】
さらに上記スポット励起光はマルチスポットとする。これにより同時に多数のビーズ又はドットを同時に検出することが可能になる。この結果、１ビーズ又はドットの検出にかけられる時間が更に長くなり、高感度・広ダイナミックレンジ・高速検出が実現できる。
【０００９】
上記のような検出を確実に行うため本発明ではスポット励起光がビーズ又はドットで反射もしくは回折した光分布の走査方向の偏りを検出し、この検出信号に基づいて、スポット励起光とサンプルの位置を補正する。
【００１０】
更に、スポット励起光がビーズ又はドットで反射もしくは回折した光分布のトラッキング方向の偏りを検出する。この検出信号に基づいてビーズ又はドットアレーの配列方向と直交する方向にスポット励起光の位置もしくは蛍光ビーズ又はドットアレー試料位置を補正する。このようにすることにより確実にほぼ常時励起光がビーズ又はドットを照射することになる。
【００１１】
また上記蛍光を検出する方法としてフォトンカウント検出法を用いる。これにより、上記の検出時間の長時間化の効果とあいまって蛍光が微弱なビーズ又はドットでも検出が可能になる。
【００１２】
更に上記ビーズ配列の１ピッチ分の相対走査に要する時間内で上記励起光の強度を段階的に変化させ、各段階での蛍光を分離検出する。このようにすることにより、サンプル内に蛍光が大きなものと微弱なものが混ざっていても、双方を精度良く検出することが可能になり、広ダイナミックレンジ検出が実現できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施形態例を用いて詳細に説明する。
【００１４】
図１は、蛍光標識されたＤＮＡがビーズ７１の表面に付着し、このビーズが蜂の巣状に２次元平面上に最密充填配列（但しＰ＞Ｄ）したＤＮＡビーズアレーサンプル７を励起光ビーム３０１，３０２，３０３……で照射し、蛍光検出している図である。ビーズ７１１１，７１２１，７１３１……には励起光ビーム３０１，３０２，３０３……がサンプル上の各ビーズ中心付近である３００１，３００２，３００３……を照射している。ＤＮＡビーズアレーサンプル７は図示しないｘステージにより太い矢印で示すようにｘ方向に連続一様速度Ｖｓで走査されている。
【００１５】
このため、図２の（Ａ）に示すように、図１の状態が時間（時刻）ｔ_１とすると、ビーズ７１１１はΔｔ（＝ｔ_ｎ ₊ _１−ｔ_ｎ）時間後の時刻ｔ_２ではビーズの配列ピッチＰ離れた図１の７１１２の位置に来ている。そこで励起光ビーム３０１，３０２，３０３……をｘ方向に太い矢印で示すようにｘ方向に速度Ｖｂで走査する。この時ほぼＶｂ＝Ｖｓとなるように走査する。７１１２の近くの位置までビームを走査したら図２の（Ｂ）に示すようにもとの位置即ち図１の３０１，３０２，３０３、……迄戻し、時刻ｔ２では再び速度Ｖｂでビームを走査する。
【００１６】
この動作をビーズの配列ピッチＰ進む毎に繰り返し、ｘ方向に配列する最後のビーズまで到達したら図示しないｙステージを用いてＤＮＡサンプル７を-ｙ方向に√３Ｐ／２だけ移動することにより、今まで検出していた図１のライン７１Ａ１，７１Ａ２，７１Ａ３……の隣のライン７１Ｂ１，７１Ｂ２……を上記の方法で検出することが出来る。Ｂのラインが検出終了すればマルチスポットの数をＮとすると-ｙ方向に√３Ｐ（Ｎ-１／２）移動し、上記の検出を繰り返す。このようにしてサンプル全面のビーズを検出する。
【００１７】
以上の説明で明らかなようにビーズの配列の１ピッチ分を走査する時間内のほとんどで励起光がビーズを照射している。このためこの時間内で蛍光検出を行うことが可能になる。即ち従来のようにサンプルの面全面を走査する場合には走査速度Ｖｓが同じとすると、ビームがビーズを過ぎる時間Ｄ／Ｖｓしか検出時間がなかったが、上記の方法を採用することにより、ほぼＰ／Ｖｓの時間検出に使える。更に従来の全面走査の場合には隣接ビーズの間も走査するためｙ方向のステップ移動の数を本方式に比べ、√３Ｐ／２Ｄ倍多くなり、この全サンプルを検出する時間が長くなる。
【００１８】
このように本方式を採用することにより、１ビーズを検出する時間が長くなり、従って蛍光が微弱でフォトンカウント法で蛍光強度を検出する場合には多くのフォトンが検出器に入り、高感度化される。また全面検出の時間が早くなり、高速検出が可能になる。
【００１９】
図３は本発明の蛍光ビーズ検出装置あるいは蛍光ビーズを用いるＤＮＡ検査装置の実施形態図である。１１及び１２は励起レーザ光源であり、１１は波長４８８ｎｍのレーザ、１２は波長５３２ｎｍのレーザである。それぞれのレーザビームは必要に応じて、本図では１２０１，１２０２で示すビーズ整形光学系により所望のビーム径にされる。所望のビーム径になった各レーザビームは１１１及び１２１のＡＯ偏向変調器(acoustic-optic deflector & modulator)に入射する。ＡＯ偏向変調器はこの中に実装されている水晶の超音波振動子に入力する高周波信号の周波数を変えることにより出射するレーザビームの回折角を変え、また入力高周波信号の振幅を変えることにより出射するレーザビームの強度を変える。
【００２０】
両レーザビームの光軸は紙面に垂直な方向に僅かにずれているので、４８８ｎｍと５３２ｎｍのレーザビームはミラー１１２と１２１により-ｚ方向（下方）に僅かに位置ずれし、また角度も平行から僅かにずれて進む。両光は凸レンズ１０１に入射し他の知平行に進み２つの穴が開いたピンホール板に入射する。それぞれのピンホールを通過した両光は偏光ビームスプリッタ２１を通過し、それぞれのビームが間隔Ｗから成る２つのビームになる。各波長の２つのビームは互いに直交する直線偏光になっているが、１／４波長板２２を通過することにより右及び左回りの円偏光になり、台形張り合われプリズム２３に入射する。この台形貼り合わせプリズムの貼り合わせ部分は偏光ビームスプリッタになっており、２つの台形の高さは僅かに違っているため１／４波長板２４に入射するときには各波長のビームは間隔が１／２Ｗで交互に直交する直線偏光の４本のビームになっている。
【００２１】
１／４波長板２４を通過すると各波長で４本のビームは交互に右および左回りの円偏光になり、第２の台形貼り合わせプリズム２５に入射する。このプリズムは２３と同じ構造であるが２個ある台形の高さの差が２３のそれの半分になっている。このためこのプリズムを通過したビームは各波長で間隔が１／８Ｗの８本のビームに成っており、１／４波長板２６を通過することにより、右と左の円偏光ビームが交互に並ぶ。
【００２２】
各波長で８本のビームがｘ方向の前後に平行に-ｚ方向に進み、波長分離ビームスプリッタ３０を通過し、チューブレンズ３１と対物レンズ３５により、ＤＮＡビーズサンプル７の８個のビーズアレーを図１に示すように同時に照射する。２波長のそれぞれ８個のビームはサンプル７上で図１に示すようにｙ方向に並び、図１には図示していないｘ方向のｍＰ（ｍは整数）離れたビーズの列を他方の波長のマルチビームが照射する。チューブレンズ３１と対物レンズ３５はピンホール１０２の像をサンプル７に１／Ｍの倍率で縮小結像するので、図１に示すようにビーズ７１の径Ｄとほぼ同程度かやや大きいスポット径になるようにピンホール径と倍率１／Ｍが設定されている。
【００２３】
制御回路８は既に図１と２を用いて説明したようにｘｙステージ６を図２の（Ａ）に示すようにｘ方向に走査し、サンプル上のビーズの端まで行くとｙ方向にステップ移動すると共に、ＡＯ偏向変調器を駆動し、図２の（Ｂ）に示すように２色のマルチビームをビーズの移動に合わせて同時に走査する。１ピッチ移動のほとんどの時間ビームがビーズを照射しているので、各ビーズにある蛍光標識からはこの間蛍光が発生している。発生した蛍光は対物レンズ３５とチューブレンズ３１を透過し、波長選択ビームスプリッタ３０で反射し、蛍光検出光学系５の窓５１を通りレンズ５２、開口付き遮光板５３レンズ５４を通過しマルチチャンネルフォトマル５０１と５０２に照射ビーズの蛍光像を結像する。５５は波長選択ビームスプリッタであり、４８８ｎｍで励起され５１０ｎｍ近傍の蛍光を透過し、５０１のマルチチャンネルフォトマルに導き、５３２ｎｍで励起され５７０ｎｍ近傍の蛍光を反射し、５０２のマルチチャンネルフォトマルに導く。
【００２４】
各マルチチャンネルフォトマル５０１及び５０２の前には上記の傾向波長整分のみを透過する干渉フィルタが設置されており、余分なノイズ光をこのフィルタでカットする。またこのフィルタとフォトマルの間に８個の蛍光スポットのみを通過させるピンホールアレーを設置することにより、図以外の場所から発生する蛍光灯のノイズ光をフォトマルの各チャンネルに入れないようにし、共焦点検出を行うことにより、更にＳＮの高い検出を行うことが出来る。
【００２５】
窓５１は蛍光波長から離れた波長の光をカットする色フィルタにすると、外部のノイズとなる迷光を遮光することになる。さらにチューブレンズと対物レンズから成るレンズ系は両テレセントリックにしてあるので、各ビーズから得られる蛍光の主光線は平行になっている。このため凸レンズ５２の焦点位置に遮光板５３を配置することにより、例え色フィルタからなる窓５１から外部の明光が入射してもほとんど遮光されることになる。
【００２６】
また図３の５５は上記の説明では１枚の一様な波長選択ビームスプリッタとしているが、これをｘ方向の前後で丁度２つの蛍光ビームの中間の位置を境にする２枚の特性の異なる波長選択ビームスプリッタにしても良い。即ちこのビーズの結像位置に近い部分では、両方の蛍光の像は完全に分離しているので、それぞれの蛍光色に最適な波長選択ビームスプリッタを２枚前後に置くことが可能になる。
【００２７】
各蛍光波長の８個のビーズ像はマルチチャンネルフォトマルの各チャンネルで検出される。１個のビーズの検出時間はほぼＰ／Ｖｓ（＝Δｔ）であるのでこの時間の間に来るフォトンの数を制御回路８で計数する。計数されたフォトン数はビーズの番地毎に又蛍光の色毎に制御回路のメモリに保存される。
【００２８】
このメモリに保存したデータを別途記憶しておいたデータと比較することにより、蛍光検出したＤＮＡの状態を検査・評価することができる。
また、上記求めたフォトン数の情報を、試料上のビーズの番地情報と共に、図示していない画面上に表示して、オペレータに結果を閲覧できるようにしても良い。
更に、この求めたフォトン数の情報を、試料上のビーズの番地情報と共に、通信手段を介して解析装置や分析装置、他の検査装置などに送信して用いることもできる。
サンプル上のビーズの中には非常に多くの蛍光分子がついているものもある。このような場合にはΔtの時間にフォトンが多く来過ぎて、この数をＮｐとしたとき、フォトンパルスの時間幅Δｔ_ｐに対し、Ｎｐ＞Δｔ／Δｔ_ｐとなってしまうと、パルスが重なり、計数することが困難になる。このように微弱な蛍光から非常に強い蛍光までを含むサンプルに対しては制御回路からＡＯ偏向変調器に、送る信号を以下のように制御して、上記の問題を解決する。
【００２９】
即ち、１ビーズを検出する時間Δｔを２分し、例えば前半のΔｔ／２の時間にはほぼ１００％の励起光を照射し、後半のΔｔ／２の時間には数％の励起光を照射するようにＡＯ偏向変調器の高周波の振幅を変化させる。このようにして強弱２種の励起光での蛍光をそれぞれ分離して検出する。このようにすることにより、蛍光分子が非常に少ない領域から非常に多い領域のビーズまで広いダイナミックレンジで正確に蛍光検出を行うことが可能になる。しかも１回の走査で、２個の蛍光標識を広ダイナミックレンジで検出することが可能になる。
【００３０】
図３の３４は励起光を低い反射率で反射させるビームスプリッタである。このビームスプリッタで反射した励起光はレンズ４１に入射する。このレンズ４１は対物レンズの瞳を４分割ポジションセンサ４０のセンサ面に結像する。また４分割ポジションセンサ４０の前には図７に詳細を示すマスク４０がある。
【００３１】
前述したように８個のマルチスポットビームはチューブレンズの光軸に平行に入射し、対物レンズの瞳中心に各ビームが集まる。対物レンズを透過した８本のビームは図４の３００に示すように垂直にビーズを照射する。ビーズの表面で反射する光５０２はビーズの中心からずれ、入射角がθとなると、反射光は垂線から大きな角度２θで反射し、対物レンズには入射しなくなる。
【００３２】
他方ビーズの表面で屈折しビーズの中に入った励起光はビーズの下の面で反射しビーズの上面で屈折し、光軸に対しαの角度で上方に出てくる。この屈折する光は図５の３００１Ａに示すようにビーズの中心から大きく外れた光も対物レンズに戻る際光軸からの角度αが小さく、ほとんどが対物レンズに入射する。
【００３３】
対物レンズの瞳の位置でビーズからの戻り光の位置はビーズから出てくる光の光軸とのなす角度で決まり、対物レンズのＮＡに相当する角度θ_ＮＡ（＝ｓｉｎ^−１ＮＡ）より小さい角度は対物レンズを通過し、大きい光は通過しない。図６に示すようにこの瞳Ｃの内部で白い部分、即ち瞳の中心Ｏから放射状にＡまでと、ＢからＣまでを除いた、ＡからＢまでの領域に来る光のみを検出するようにする。この白い部分を通過する光は、ビーズの球面で反射するものは図５の円弧部３００２Ａに入射する光３００２であり、ビーズで屈折し戻ってくるものは図５の円弧部３００１Ａに入射する光３００１のみとなる。
【００３４】
ビーズで屈折して戻ってくる光５０１´は入射時に矢印Ｗ１で示した広い範囲からの光が図６の瞳内の白い部分に戻ってくるのに対し、表面で反射する光は入射時にＷ２で示した狭い範囲からの光しか図６の瞳内の白い部分に戻らない。しかも表面で反射する光は屈折して戻ってくる光とは瞳の逆側に戻ってくる。
【００３５】
以上の戻り光の瞳上での性質を用いて、図７に示すように瞳を結像する位置に置いた４分割ポジションセンサ４０の前に図６の瞳内の白い部分に相当する４４０１を透過部とし、他の部分を社高部とするマスク４４を図７のように設置する。このマスク４４の背面には図８に示すような４分割ポジションセンサ４０がある。４分割ポジションセンサ４０は４つの独立なセンサ４０１，４０２，４０３及び４０４がギャップ４００を隔てて配置されており、各センサから上下の端子Ａ１，Ａ２及び左右の端子Ｂ１，Ｂ２が対角状に出ている。
【００３６】
Ａ１，Ａ２の方向は励起マルチスポットのアレー方向であり、Ｂ１，Ｂ２はアレーと直角な方向である。図４〜図６を用いて説明したようにビーズに対し励起スポット光がアレーの方向にずれていればＡ１，Ａ２の端子間で電圧変化を生じるので図１５ニ示すようにこの差（符号を含め）信号を増幅する。この励起スポットのアレー方向のずれ信号をＡＤ変換し、制御回路８に入力する。同様にＢ１，Ｂ２の電圧差を差動増幅し、ＡＤ変換したアレーと直交する方向のずれ信号を制御回路８に入力する。
【００３７】
この２方向のずれを検知したなら、図１５に示すようにアレーと直交する方向については図３のＡＯ偏向変調器１１１及び１２１に入力する高周波信号の周波数をずれが少なくなるように制御回路により変化させ、アレーの方向に付いてはｘｙステージ６のｙステージを制御回路８により制御し、ずれを補正する。
【００３８】
図９は本発明の蛍光標識ドットアレー検査装置の実施形態図である。７２はスポッタあるいはインクジェット等で打点されたＤＮＡのドットである。ドット径は数十ミクロンでありこれがドット径の数倍のピッチＰで正方状に配列している。このドットを同時に複数照射する励起光学系は図１と概ね同じであるが、ドット系が大きい分照射ビーム径が数十ミクロンに成るような設計がされている。図１０は上記のマルチ励起スポット形成光学系を省略した光学系が示されている。マルチスポット励起光３は図１同様３１のチューブレンズと３５の対物レンズによりサンプル７上のドットアレーを同時照射している。励起光により生じた蛍光は図１と同様にして蛍光検出系５により２波長励起光に対する２波長の蛍光を検出する。
【００３９】
以下に本実施例におけるサンプルと励起マルチスポットの位置関係について図１７を用いて説明する。なお後に説明する図１６に示すビーズアレーの検出においても同様な位置関係の動作になる。
【００４０】
図１７（Ａ）はビーズアレーまたはドットアレーサンプルの位置の時間変化を表し、（Ｂ）は励起光の位置を表す。ステージはビーズ又はドットアレーの配列ピッチＰ相当の距離をステップ的に移動し、ｔ_ｎ ₊ _１-ｔ_ｎ＝Δｔより若干短い時間内で検出を行う。従って基本的には励起光は図１７（Ｂ）のように静止している。
【００４１】
図１６のビーズ検出の場合には先に図１で説明したビーズからの反射光を対物レンズの瞳と協約な位置に設置した４分割ポジションセンサでビーズの中心と励起光スポットが一致していることを検出し、ずれている場合には制御する。
【００４２】
図９のドットアレーの場合には図１０に示す光学系を用いて、励起光とドットの位置ずれを検出して、このずれを補正する。以下図１０を用いて詳細に説明する。図１０のハーフミラー３４はサンプルのドットから反射した励起光の一部を反射し、レンズ４１１に導く。４４０は図１１に詳細図を示す０次光カットフィルタであり、サンプルから反射した光の０次光を図１１の４４０２で遮光する。即ちレンズ４１１による対物レンズ３５の瞳の結像位置にこの０次光フィルタが設置されており、サンプルで反射した励起光の正反射光が、このフィルタの４４０２で遮光され、回折した光のみがこのフィルタの４４０１を通過してくる。
【００４３】
ドットアレーの各ドットはプローブＤＮＡと溶媒等を含んだ液体をスポッタ又はインクジェット機構により打点された後、蛍光標識されたターゲットＤＮＡをハイブリダイゼションさせたものである。従ってドットの部分はその周囲のガラス基板に比べ盛り上がっている。このため個々のレーザ光が照射されると、この盛り上がり部で光が屈折し、反射した光は０次光とは異なる方向に回折する。この結果この回折光のみ０次光カットフィルタ４４０の４４０１を通過することに成る。
【００４４】
図１２はマルチスポット励起光３がサンプルのドットアレー７２をずれた状態で照射しているところを示している。このようにずれた状態で照射すると反射し、０次カットフィルタを通過した光は図１０のレンズ４１２により撮像センサ４３０の面上に図１３に示すように、ドットのエッジ部が明るくその他の場所は暗く結像する。そこで撮像センサとして例えば図１４に示すように４分割センサをドットの０次カットフィルタ透過像７２１のアレーピッチと等しいピッチで配列しておく。またこの４分割センサの中心は、もし励起光とドットが一致していれば像の中心と一致するように配置されている。
【００４５】
このため図１２のようにずれていると図１４のように０次カットフィルタ透過像７２１は４分割センサの中心からずれて結像する。この結果４分割センサの４３３、４３１の順に検出強度が強く、４３２，４３４にはほとんど光が来ないようになる。この結果先に説明した図１５の差動増幅器を用いることにより、ずれの２次元的な方向が分かり、制御回路８を介してステージ６を微動制御することにより、ずれを補正し正しい位置に励起光が照射するように出来る。
【００４６】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように本発明により、ビーズ又はドットアレーから成る蛍光物体あるいは蛍光標識を付着したＤＮＡサンプルを検出したい部分のみに励起光を照射し、蛍光検出できるようになり、高感度・広ダイナミックレンジ・高速に検出することが可能になった。この結果、今後の医療検査等で大量サンプルを扱う領域での高精度、高速検査に非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による蛍光ビーズアレー検出の状態を説明するビーズアレーサンプルの斜視図である。
【図２】（Ａ）ビーズアレーの位置変化を示すグラフ、（Ｂ）マルチスポット励起光の位置変化を示すグラフである。
【図３】本発明による蛍光ビーズアレー検出装置の概略構成を示す正面図である。
【図４】ビーズに照射する励起光と反射光の関係を説明するビーズの断面図である。
【図５】ビーズに照射する励起光と反射光の関係を説明するビーズの断面図である。
【図６】対物レンズの瞳上でのビーズ反射光の状態を示す平面図である。
【図７】ビーズ反射光を検出する４分割センサの平面図である。
【図８】ビーズ反射光を検出する４分割センサの平面図である。
【図９】本発明による蛍光ドットアレー検出の状態を説明するビーズアレーサンプルの斜視図である。
【図１０】本発明による蛍光ドットアレー検出装置の概略構成を示す正面図である。
【図１１】０次光カットフィルタの平面図である。
【図１２】マルチスポット励起光がずれた状態で照射されたビーズアレーサンプルの正面の断面図である。
【図１３】マルチスポット励起光がずれた状態で照射されたビーズアレーサンプルの平面図である。
【図１４】 4分割センサ上に投影された励起光の０次カットフィルタ透過像の状態を示す4分割センサアレイの平面図である。
【図１５】４分割センサの信号を処理する回路のブロック図である。
【図１６】本発明による蛍光ビーズアレー検出の状態を説明するビーズアレーサンプルの斜視図である。
【図１７】（Ａ）ビーズアレーの位置変化を示すグラフ、（Ｂ）マルチスポット励起光の位置変化を示すグラフである。
【符号の説明】
５・・・蛍光検出光学系６・・・ＸＹステージ７・・・ＤＮＡビーズアレーサンプル８・・・制御回路１１，１２・・・励起レーザ光源３０・・・波長分離ビームスプリッタ３１・・・チューブレンズ３５・・・対物レンズ４０・・・4分割ポジションセンサ５５・・・波長選択ビームスプリッタ７１・・・ビーズ３０１，３０２，３０３・・・励起光ビーム１１１，１２１・・・ＡＯ偏向変調器５０１，５０２・・・マルチチャンネルフォトマル[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and an apparatus for detecting or inspecting a fluorescent substance or a fluorescently labeled substance, particularly a fluorescently labeled DNA. In particular, the present invention relates to a method and apparatus for detecting and inspecting fluorescence arranged in a bead or dot array with high sensitivity, wide dynamic range, and high speed.
[0002]
[Prior art]
As a method for detecting a sample in which a fluorescent object or fluorescently labeled DNA is arranged in a bead or dot array, a conventional excitation laser beam is formed into one spot, and this is used to relatively scan the sample and the excitation laser spot to obtain the obtained fluorescence. It was detected. Further, the excitation light is irradiated onto a wide area of the sample, and the resulting fluorescence is detected with a two-dimensional CCD or the like.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
When the above-mentioned one spot is irradiated and detected by relative scanning, the bead or dot array sample is scanned all over the surface, so that the ratio of time actually used for fluorescence detection becomes very small as shown below. . That is, if the bead or dot diameter is D and the bead or dot pitch is P, the ratio that is effectively used for fluorescence detection during the scanning time is πD ² / 4P ² if the array is a square grid. . For example, if the ratio of D and P is 1: 2, this value is 19.6%, and even if it is 1: 1.5, it becomes 34.9%. Thus, more than half of the time is not effectively used for detection.
[0004]
Further, since detection is performed by irradiating one spot light, when the sample is composed of a large number of beads and dots, it takes a long time for fluorescence detection, and high-speed detection is difficult. Furthermore, when trying to detect with high sensitivity and wide dynamic range, it takes some time to excite one bead or one dot, and when realizing high speed detection, sensitivity and dynamic range must be sacrificed. Even when surface irradiation is performed and two-dimensional detection is performed, the above-described wasted time is the same, and it is difficult to achieve high sensitivity and a wide dynamic range.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention uses the following means in order to solve the above problems.
[0006]
Spot-like excitation light having a beam diameter approximately equal to the diameter of the beads or dot array to which the fluorescent material is attached is irradiated. The fluorescence obtained by relatively scanning the bead or dot array and the spot-like excitation light is separated from the excitation light and detected. At this time, the spot excitation light is driven for tracking so that the spot excitation light is irradiated on the beads or the dot array almost always within the time required for the relative scanning of one pitch of the bead array. By using this, most of the time within the scanning time, which has been a problem in the past, can be used for fluorescence detection.
[0007]
As a means of obtaining the same effect, when detecting fluorescence by relative scanning of a bead or dot array and spot-like excitation light, the spot excitation light irradiates the bead or dot array within the average time required for one pitch of relative scanning. Then, the fluorescent beads or the dot array sample is moved step by step by one pitch.
[0008]
Further, the spot excitation light is a multi-spot. This makes it possible to detect a large number of beads or dots simultaneously. As a result, the time taken to detect one bead or dot is further increased, and high sensitivity, a wide dynamic range, and high speed detection can be realized.
[0009]
In order to reliably perform the detection as described above, the present invention detects the deviation in the scanning direction of the light distribution in which the spot excitation light is reflected or diffracted by beads or dots, and based on this detection signal, the position of the spot excitation light and the sample is detected. Correct.
[0010]
Further, the deviation in the tracking direction of the light distribution in which the spot excitation light is reflected or diffracted by the beads or dots is detected. Based on this detection signal, the position of the spot excitation light or the position of the fluorescent bead or dot array sample is corrected in a direction orthogonal to the array direction of the beads or dot array. This ensures that the excitation light irradiates the beads or dots almost always.
[0011]
The photon count detection method is used as a method for detecting the fluorescence. Thereby, it becomes possible to detect even beads or dots with weak fluorescence, combined with the effect of increasing the detection time.
[0012]
Furthermore, the intensity of the excitation light is changed stepwise within the time required for relative scanning of one pitch of the bead array, and the fluorescence at each step is separated and detected. By doing so, even if a sample with a large amount of fluorescence and a weak one are mixed, both can be detected with high accuracy, and wide dynamic range detection can be realized.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to an embodiment.
[0014]
In FIG. 1, a fluorescently labeled DNA is attached to the surface of a bead 71, and a DNA bead array sample 7 in which the beads are packed in a two-dimensional plane in a honeycomb shape (where P> D) is used as an excitation light beam 301. , 302, 303..., And fluorescence detection. The excitation light beams 301, 302, 303,... Are irradiated on the beads 7111, 7121, 7131,. The DNA bead array sample 7 is scanned at a continuous uniform speed Vs in the x direction as indicated by a thick arrow by an x stage (not shown).
[0015]
Therefore, as shown in FIG. 2A, when the state of FIG. 1 is time (time) t ₁ , the bead 7111 is beaded at time t ₂ after Δt (= t _n ₊ ₁ −t _n ) time. 1 is located at a position 7112 in FIG. Therefore, the excitation light beams 301, 302, 303... Are scanned at a velocity Vb in the x direction as indicated by thick arrows in the x direction. At this time, scanning is performed so that Vb = Vs. When the beam is scanned to a position close to 7112, the beam is returned to the original position shown in FIG. 2B, that is, 301, 302, 303,... In FIG. .
[0016]
This operation is repeated every time the bead arrangement pitch P advances, and when the last bead arranged in the x direction is reached, the DNA sample 7 is moved by √3P / 2 in the −y direction using the y stage (not shown). The lines 71B1, 71B2,... Adjacent to the lines 71A1, 71A2, 71A3,. When the detection of the line B is completed, assuming that the number of multi-spots is N, it moves by √3P (N−1 / 2) in the −y direction, and the above detection is repeated. In this way, beads on the entire surface of the sample are detected.
[0017]
As is clear from the above description, the excitation light irradiates the beads in most of the time for scanning one pitch of the array of beads. For this reason, fluorescence detection can be performed within this time. That is, when the entire scanning surface of the sample is scanned as in the conventional case, if the scanning speed Vs is the same, the detection time is only the time D / Vs when the beam passes the beads, but by adopting the above method, It can be used for P / Vs time detection. Further, in the case of the conventional full-surface scanning, since the adjacent beads are also scanned, the number of step movements in the y direction is increased by √3P / 2D times compared to the present method, and the time for detecting all the samples becomes longer.
[0018]
By adopting this method in this way, it takes a long time to detect one bead. Therefore, when the fluorescence intensity is weak and the fluorescence intensity is detected by the photon counting method, many photons enter the detector and increase the sensitivity. Is done. In addition, the entire surface detection time is shortened and high-speed detection is possible.
[0019]
FIG. 3 is a diagram showing an embodiment of the fluorescent bead detection apparatus or DNA testing apparatus using the fluorescent beads of the present invention. 11 and 12 are excitation laser light sources, 11 is a laser having a wavelength of 488 nm, and 12 is a laser having a wavelength of 532 nm. Each laser beam is made to have a desired beam diameter by a bead shaping optical system indicated by reference numerals 1201 and 1202 in this drawing as required. Each laser beam having a desired beam diameter is incident on the AO deflection modulators 111 and 121 (acoustic-optic deflector & modulator). The AO deflection modulator changes the diffraction angle of the emitted laser beam by changing the frequency of the high-frequency signal input to the quartz crystal ultrasonic transducer mounted therein, and outputs it by changing the amplitude of the input high-frequency signal. Change the intensity of the laser beam.
[0020]
Since the optical axes of both laser beams are slightly shifted in the direction perpendicular to the paper surface, the laser beams of 488 nm and 532 nm are slightly shifted in the -z direction (downward) by the mirrors 112 and 121, and the angles are also parallel. Proceed slightly off. Both lights enter the convex lens 101, travel in parallel to another direction, and enter a pinhole plate having two holes. The two lights that have passed through the respective pinholes pass through the polarization beam splitter 21, and the respective beams become two beams having a distance W. The two beams of each wavelength are linearly polarized light orthogonal to each other, but pass through the quarter-wave plate 22 to become right and left-handed circularly polarized light and are incident on the prism 23 by being trapezoidally bonded. The bonding portion of the trapezoidal bonding prism is a polarization beam splitter, and the heights of the two trapezoids are slightly different. There are four beams of linearly polarized light alternately orthogonal at 2W.
[0021]
When passing through the quarter-wave plate 24, the four beams at each wavelength are alternately turned clockwise and counterclockwise circularly polarized light and enter the second trapezoidal bonding prism 25. This prism has the same structure as 23, but the height difference of the two trapezoids is half that of 23. For this reason, the beams that have passed through the prism are eight beams with a wavelength of 1/8 W at each wavelength. By passing through the quarter wavelength plate 26, the right and left circularly polarized beams are alternately arranged. .
[0022]
Eight beams at each wavelength travel in the -z direction parallel to the front and rear of the x direction, pass through the wavelength separation beam splitter 30, and the eight bead arrays of the DNA bead sample 7 are formed by the tube lens 31 and the objective lens 35. As shown in FIG. Eight beams of two wavelengths are aligned in the y direction on the sample 7 as shown in FIG. 1, and a row of beads separated by mP (m is an integer) in the x direction, not shown in FIG. Irradiation of multiple beams. Since the tube lens 31 and the objective lens 35 reduce and form an image of the pinhole 102 on the sample 7 at a magnification of 1 / M, the spot diameter is almost the same as or slightly larger than the diameter D of the bead 71 as shown in FIG. The pinhole diameter and the magnification 1 / M are set so that
[0023]
As described with reference to FIGS. 1 and 2, the control circuit 8 scans the xy stage 6 in the x direction as shown in FIG. 2A, and when it reaches the end of the bead on the sample, it moves stepwise in the y direction. At the same time, the AO deflection modulator is driven, and two-color multi-beams are simultaneously scanned in accordance with the movement of the beads as shown in FIG. Since the beam is radiated to the beads for most of the time of one pitch movement, fluorescence is generated from the fluorescent label on each bead during this time. The generated fluorescence passes through the objective lens 35 and the tube lens 31, is reflected by the wavelength selection beam splitter 30, passes through the window 51 of the fluorescence detection optical system 5, passes through the lens 52, the apertured light shielding plate 53 lens 54, and multichannel photo. A fluorescent image of the irradiated beads is formed on the dots 501 and 502. Reference numeral 55 denotes a wavelength selective beam splitter, which is excited at 488 nm and transmits fluorescence near 510 nm, leads to a multi-channel photomultiplier at 501, is excited at 532 nm, reflects fluorescence near 570 nm, and leads to a multi-channel photomultiplier at 502. .
[0024]
In front of each multi-channel photomultiplier 501 and 502, an interference filter that transmits only the above-mentioned tendency wavelength sorting is installed, and excess noise light is cut by this filter. In addition, by installing a pinhole array that allows only 8 fluorescent spots to pass between this filter and the photomultiplier, the noise light of fluorescent lamps generated from places other than the figure is prevented from entering each channel of the photomultiplier. By performing confocal detection, detection with a higher SN can be performed.
[0025]
If the window 51 is a color filter that cuts light having a wavelength away from the fluorescence wavelength, stray light that becomes external noise is shielded. Further, since the lens system composed of the tube lens and the objective lens is both telecentric, the chief ray of fluorescence obtained from each bead is parallel. For this reason, by arranging the light shielding plate 53 at the focal position of the convex lens 52, even if external bright light is incident from the window 51 made of a color filter, for example, the light is almost shielded.
[0026]
Further, 55 in FIG. 3 is a single uniform wavelength selection beam splitter in the above description, but this has two different characteristics at the middle of the two fluorescent beams before and after in the x direction. A wavelength selective beam splitter may be used. That is, in the portion close to the image forming position of the beads, both fluorescent images are completely separated, so that it becomes possible to place two wavelength selective beam splitters optimum for the respective fluorescent colors.
[0027]
Eight bead images of each fluorescence wavelength are detected in each channel of the multichannel photomultiplier. Since the detection time of one bead is approximately P / Vs (= Δt), the number of photons that come during this time is counted by the control circuit 8. The counted number of photons is stored in the memory of the control circuit for each address of the bead and for each fluorescent color.
[0028]
By comparing the data stored in this memory with the separately stored data, the state of the fluorescence-detected DNA can be examined and evaluated.
The information on the number of photons obtained may be displayed on a screen (not shown) together with the address information of the beads on the sample so that the operator can view the result.
Further, the obtained information on the number of photons can be transmitted together with the address information of the beads on the sample to an analysis apparatus, an analysis apparatus, another inspection apparatus or the like via a communication means.
Some beads on the sample have a very large number of fluorescent molecules. Such is the case too came photon number in time of Δt, when this number was Np, for the time width Δt _p of the photon pulse, and becomes Np> Δt / Δt _p, pulse overlap It becomes difficult to count. For the sample including such weak fluorescence to very strong fluorescence, the signal to be sent from the control circuit to the AO deflection modulator is controlled as follows to solve the above problem.
[0029]
That is, the time Δt for detecting one bead is divided into two minutes, for example, approximately 100% of the excitation light is irradiated during the first half Δt / 2, and several percent of the excitation light is irradiated during the second Δt / 2 time. Thus, the high frequency amplitude of the AO deflection modulator is changed. In this way, the fluorescence of the two types of excitation light is separated and detected. By doing so, it is possible to accurately detect fluorescence in a wide dynamic range from a region having very few fluorescent molecules to a bead having a very large amount of molecules. Moreover, it is possible to detect two fluorescent labels with a wide dynamic range in one scan.
[0030]
Reference numeral 34 in FIG. 3 denotes a beam splitter that reflects the excitation light with a low reflectance. The excitation light reflected by this beam splitter enters the lens 41. This lens 41 forms an image of the pupil of the objective lens on the sensor surface of the four-division position sensor 40. A mask 40 whose details are shown in FIG.
[0031]
As described above, the eight multi-spot beams are incident in parallel to the optical axis of the tube lens, and each beam is collected at the center of the pupil of the objective lens. The eight beams transmitted through the objective lens irradiate the beads vertically as indicated by 300 in FIG. When the light 502 reflected from the surface of the bead deviates from the center of the bead and the incident angle becomes θ, the reflected light is reflected from the perpendicular at a large angle 2θ and does not enter the objective lens.
[0032]
On the other hand, the excitation light that is refracted on the surface of the bead and enters the bead is reflected on the lower surface of the bead, refracted on the upper surface of the bead, and emerges upward at an angle α with respect to the optical axis. As shown in 3001A of FIG. 5, this refracted light has a small angle α from the optical axis when returning to the objective lens, and most of the light is incident on the objective lens.
[0033]
The position of the return light from the bead at the position of the pupil of the objective lens is determined by the angle formed with the optical axis of the light emitted from the bead, and is smaller than the angle θ _NA (= sin ⁻¹ NA) corresponding to the NA of the objective lens. The angle passes through the objective lens and no large light passes. As shown in FIG. 6, only the light within the pupil C is detected, that is, only the light coming in the region from A to B excluding from the center O of the pupil to A and radially from B to C. To do. The light that passes through the white part is light 3002 that is incident on the arc portion 3002A of FIG. 5 that is reflected by the spherical surface of the bead, and the light that is refracted by the bead is incident on the arc portion 3001A of FIG. Only 3001.
[0034]
The light 501 ′ refracted and returned by the bead returns light from a wide range indicated by the arrow W1 upon incidence to the white portion in the pupil of FIG. 6, whereas the light reflected on the surface is W2 upon incidence. Only the light from the narrow range shown in FIG. 6 returns to the white part in the pupil of FIG. Moreover, the light reflected from the surface returns to the opposite side of the pupil from the light that is refracted and returned.
[0035]
Using the above-mentioned property of the return light on the pupil, 4401 corresponding to the white portion in the pupil of FIG. 6 is placed in front of the 4-split position sensor 40 placed at the position where the pupil is imaged as shown in FIG. A mask 44 having a transmission portion and the other portion as a company height portion is installed as shown in FIG. On the back surface of the mask 44, there is a four-divided position sensor 40 as shown in FIG. In the quadrant sensor 40, four independent sensors 401, 402, 403 and 404 are arranged with a gap 400 therebetween, and upper and lower terminals A1, A2 and left and right terminals B1, B2 are diagonally arranged from each sensor. Out.
[0036]
The directions of A1 and A2 are the array directions of the excitation multi-spot, and B1 and B2 are directions perpendicular to the array. As described with reference to FIGS. 4 to 6, if the excitation spot light is shifted in the direction of the array with respect to the beads, a voltage change occurs between the terminals A1 and A2. Amplify the signal. The deviation signal in the array direction of the excitation spot is AD converted and input to the control circuit 8. Similarly, the voltage difference between B1 and B2 is differentially amplified, and a shift signal in the direction orthogonal to the AD converted array is input to the control circuit 8.
[0037]
If the deviation in these two directions is detected, the control circuit causes the frequency of the high-frequency signal input to the AO deflection modulators 111 and 121 in FIG. 3 to be reduced in the direction orthogonal to the array as shown in FIG. For the direction of the array, the y stage of the xy stage 6 is controlled by the control circuit 8 to correct the deviation.
[0038]
FIG. 9 is a diagram showing an embodiment of the fluorescently labeled dot array inspection apparatus of the present invention. Reference numeral 72 denotes a dot of DNA hit by a spotter or an ink jet. The dot diameter is several tens of microns, and this is arranged in a square shape at a pitch P several times the dot diameter. The excitation optical system for irradiating a plurality of dots simultaneously is substantially the same as in FIG. 1, but the design is such that the irradiation beam diameter is several tens of microns due to the larger dot system. FIG. 10 shows an optical system in which the above multi-excitation spot forming optical system is omitted. The multi-spot excitation light 3 is simultaneously irradiated with a dot array on the sample 7 by 31 tube lenses and 35 objective lenses as in FIG. The fluorescence generated by the excitation light is detected by the fluorescence detection system 5 in the same manner as in FIG.
[0039]
Hereinafter, the positional relationship between the sample and the excitation multi-spot in this embodiment will be described with reference to FIG. The operation of the same positional relationship is also performed in the detection of the bead array shown in FIG. 16 described later.
[0040]
FIG. 17A shows the time change of the position of the bead array or the dot array sample, and FIG. 17B shows the position of the excitation light. Stage the arrangement pitch P corresponding distance of beads or dots array moves stepwise, to detect in a slightly shorter time than _{_{_{_{t n + 1 -t n = Δt}}}} . Therefore, basically, the excitation light is stationary as shown in FIG.
[0041]
In the case of the bead detection shown in FIG. 16, the center of the bead and the excitation light spot coincide with each other by a 4-split position sensor in which the reflected light from the bead described above with reference to FIG. This is detected, and if it is shifted, control is performed.
[0042]
In the case of the dot array of FIG. 9, the optical system shown in FIG. 10 is used to detect the positional deviation between the excitation light and the dot and correct this deviation. This will be described in detail below with reference to FIG. The half mirror 34 in FIG. 10 reflects a part of the excitation light reflected from the sample dots and guides it to the lens 411. Numeral 440 is a zero-order light cut filter whose detailed view is shown in FIG. 11, and the zero-order light reflected from the sample is shielded by 4402 in FIG. That is, this zero-order light filter is installed at the imaging position of the pupil of the objective lens 35 by the lens 411, and the regular reflection light of the excitation light reflected by the sample is shielded by this filter 4402, and only the diffracted light is received. It passes through 4401 of this filter.
[0043]
Each dot of the dot array is obtained by spotting a liquid containing a probe DNA and a solvent by a spotter or an ink jet mechanism and then hybridizing a fluorescently labeled target DNA. Therefore, the dot portion is raised compared to the surrounding glass substrate. For this reason, when each laser beam is irradiated, the light is refracted at the rising portion, and the reflected light is diffracted in a direction different from the zero-order light. As a result, only this diffracted light passes through 4401 of the 0th-order light cut filter 440.
[0044]
FIG. 12 shows a state in which the multi-spot excitation light 3 is radiated in a state where the sample dot array 72 is shifted. Light that is reflected when irradiated in such a shifted state and passes through the 0th-order cut filter is brightened on the edge of the image sensor 430 by the lens 412 in FIG. 10 as shown in FIG. Forms a dark image. Therefore, as an image sensor, for example, as shown in FIG. The center of the quadrant sensor is arranged so as to coincide with the center of the image if the excitation light and the dot coincide.
[0045]
For this reason, when shifted as shown in FIG. 12, the zero-order cut filter transmission image 721 is shifted from the center of the four-divided sensor as shown in FIG. As a result, the detection intensity is strong in the order of 433 and 431 of the quadrant sensor, and light hardly comes to 432 and 434. As a result, by using the differential amplifier shown in FIG. 15 described above, the two-dimensional direction of the deviation is known, and the stage 6 is finely controlled via the control circuit 8 to correct the deviation and excite it at the correct position. Light can be irradiated.
[0046]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, it becomes possible to detect fluorescence by irradiating only a portion to be detected with a fluorescent object composed of beads or a dot array or a DNA sample to which a fluorescent label is attached. Dynamic range and high speed detection are now possible. As a result, it is very effective for high-accuracy and high-speed inspection in an area where a large amount of sample is handled in a future medical inspection or the like.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a perspective view of a bead array sample for explaining a state of fluorescent bead array detection according to the present invention.
2A is a graph showing a change in position of a bead array, and FIG. 2B is a graph showing a change in position of multi-spot excitation light.
FIG. 3 is a front view showing a schematic configuration of a fluorescent bead array detection device according to the present invention.
FIG. 4 is a cross-sectional view of a bead for explaining the relationship between excitation light and reflected light applied to the bead.
FIG. 5 is a cross-sectional view of a bead for explaining the relationship between excitation light and reflected light applied to the bead.
FIG. 6 is a plan view showing a state of bead reflection light on the pupil of the objective lens.
FIG. 7 is a plan view of a four-divided sensor that detects bead reflection light.
FIG. 8 is a plan view of a four-divided sensor that detects bead reflection light.
FIG. 9 is a perspective view of a bead array sample for explaining a state of fluorescent dot array detection according to the present invention.
FIG. 10 is a front view showing a schematic configuration of a fluorescent dot array detection device according to the present invention.
FIG. 11 is a plan view of a zero-order light cut filter.
FIG. 12 is a front cross-sectional view of a bead array sample irradiated with the multi-spot excitation light shifted.
FIG. 13 is a plan view of a bead array sample irradiated in a state where multi-spot excitation light is shifted.
FIG. 14 is a plan view of a quadrant sensor array showing a state of a zero-order cut filter transmission image of excitation light projected on the quadrant sensor.
FIG. 15 is a block diagram of a circuit for processing a signal of a quadrant sensor.
FIG. 16 is a perspective view of a bead array sample for explaining a state of fluorescent bead array detection according to the present invention.
17A is a graph showing a change in position of a bead array, and FIG. 17B is a graph showing a change in position of multi-spot excitation light.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 5 ... Fluorescence detection optical system 6 ... XY stage 7 ... DNA bead array sample 8 ... Control circuit 11, 12 ... Excitation laser light source 30 ... Wavelength separation beam splitter 31 ... Tube Lens 35 ... Objective lens 40 ... 4-split position sensor 55 ... Wavelength selection beam splitter 71 ... Beads 301, 302, 303 ... Excitation light beam 111, 121 ... AO deflection modulator 501 , 502 ... Multi-channel photomulti

Claims

Excitation light is irradiated to a sample in which fluorescent beads or fluorescent dots with fluorescently labeled DNA attached are arranged one-dimensionally or two-dimensionally, and the fluorescence generated from the sample is detected by the excitation light irradiation to detect the fluorescence A method of inspecting the fluorescence-labeled DNA based on the fluorescence information, wherein the sample is continuously moved in one direction, and a plurality of spot-like excitation lights are respectively moved continuously. The fluorescent beads or fluorescent dots of the sample are irradiated so that the spot-like excitation light continues to irradiate the fluorescent beads or fluorescent dots of the sample while the sample moves by one pitch of the array. The plurality of spot-like excitation lights are driven to be tracked by a deflector, and when the sample moves by one pitch of the array, the plurality of spot-like excitation lights are moved in the one direction by the optical deflector. The plurality of spot-like excitation lights are scanned at a speed faster than the movement in the one direction in a pair direction, and the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots at positions shifted by one pitch of the array on the sample are irradiated. Thus, the plurality of spot-like excitation lights are sequentially irradiated onto the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample in a time that is not less than half of the time required for the sample to perform relative scanning for one pitch of the array. DNA testing method .

Excitation light is irradiated to a sample in which fluorescent beads or fluorescent dots with fluorescently labeled DNA attached are arranged one-dimensionally or two-dimensionally, and the fluorescence generated from the sample is detected by the excitation light irradiation to detect the fluorescence A method for inspecting the fluorescence-labeled DNA based on the fluorescence information, wherein the sample is moved stepwise by one pitch in one direction, and the sample is moved stepwise by one pitch and stopped. A plurality of spot-like excitation lights are irradiated to the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample respectively in a state, and a part of the fluorescence generated from the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample by the irradiation is applied to the sample Specularly reflected light from the light is shielded and detected by a four-split light receiving element, and the position where the plurality of spot-like excitation light is irradiated is determined based on the detection result by the four-split light receiving element. When the position of the plurality of spot-like excitation light is shifted by an optical deflector, the position where the plurality of spot-like excitation light is irradiated is adjusted. Fluorescence generated from the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample irradiated with the plurality of spot-like excitation light in the state where the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots are located, and the detected fluorescence A DNA testing method comprising testing the fluorescently labeled DNA by comparing information with previously stored data .

2. The DNA testing method according to claim 1 , wherein tracking driving of the plurality of spot-like excitation lights by the optical deflector is performed in synchronization with continuous movement of the sample in one direction .

Intensities of the plurality of spot-like excitation lights are changed stepwise by the optical deflector within a time for irradiating the plurality of spot-like excitation lights for one pitch of the array of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample. The method for testing DNA according to claim 1 or 2, wherein fluorescence at each stage is separated and detected.

3. The confocal detection of the fluorescence generated from the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample by irradiating the plurality of spot-like excitation lights via a pinhole array. DNA testing method.

An excitation light source, a plurality of spot-like excitation light forming means for forming a plurality of spot-like excitation light from the excitation light emitted from the excitation light source, and fluorescent beads or fluorescent dots to which fluorescently labeled DNA is attached are one-dimensional or two-dimensional. A table means for placing a sample arranged in a dimension and moving in at least one direction, and a plurality of spot-like excitation light forming means on a plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample placed on the table means Excitation light irradiation means for irradiating a plurality of spot-like excitation lights formed, and the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots according to the movement of the sample that moves as the table means moves continuously in the one direction When a plurality of spot-like excitation lights irradiated on the light source are driven by an optical deflector and the sample moves by one pitch of the array, the optical deflector causes the spot-like excitation lights to be tracked. A plurality of fluorescent beads at positions shifted by one pitch of the array on the sample by scanning the electromotive force in a direction opposite to the one direction at a speed faster than the movement in the one direction. Or, the tracking drive means for irradiating the fluorescent dots, and the fluorescence generated from the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots irradiated with the plurality of spot excitation lights driven by the tracking drive means to detect the fluorescence A fluorescence detection means for outputting a corresponding signal, the plurality of spot-like excitation light forming means, the table means, the excitation light irradiation means, the tracking drive means, and the fluorescence detection means, and from the fluorescence detection means And a control means for inspecting the fluorescently labeled DNA in response to an output signal .

An excitation light source, a plurality of spot-like excitation light forming means for forming a plurality of spot-like excitation light from the excitation light emitted from the excitation light source, and fluorescent beads or fluorescent dots to which fluorescently labeled DNA is attached are one-dimensional or two-dimensional. A table means that can place samples arranged in a dimension and move stepwise by one pitch in at least one direction, and the plurality of spot shapes in a state where the table means stops moving by one pitch step in one direction. Excitation light irradiating means for irradiating a plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample with a plurality of spot-like excitation lights formed by the excitation light forming means, respectively, and a plurality of spot-like excitation lights respectively by the excitation light irradiating means Irradiation position monitoring means for monitoring the irradiation position when irradiating a plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample; and Irradiation position deviation correction means for correcting deviations of the irradiation positions of the plurality of spot-like excitation lights detected by monitoring the irradiation position, and the plurality of spots in a state where the irradiation positions are corrected by the irradiation position deviation correction means A fluorescent detection means for detecting fluorescence generated from a plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample irradiated with the excitation light, and the fluorescently labeled DNA based on the fluorescence information detected by the fluorescence detection means A DNA testing apparatus comprising a testing means for testing .

7. The tracking drive unit performs tracking driving of the plurality of spot-like excitation lights by the optical deflector in synchronization with continuous movement in one direction of the table unit. DNA testing equipment .

The optical deflector of the tracking drive means controls the intensity of the plurality of spot-like excitation lights irradiated to the fluorescent beads or fluorescent dots of the sample by the excitation light irradiating means, and the plurality of spot-like excitation lights 8. The DNA test according to claim 6 or 7 , wherein the intensity of the plurality of spot-like excitation lights is changed in a stepwise manner within a time for irradiating one pitch of the array of fluorescent beads or fluorescent dots of a sample. Equipment .

The fluorescence detection means detects the fluorescence generated from the plurality of fluorescent beads or fluorescent dots of the sample through the pinhole array by irradiating the plurality of spot-like excitation lights with the excitation light irradiation means. 8. The DNA testing apparatus according to claim 6 or 7, wherein: