JP3856174B2

JP3856174B2 - Extraction and purification method of plant DNA

Info

Publication number: JP3856174B2
Application number: JP34106697A
Authority: JP
Inventors: 正宏鈴木; 石田　　由和; 小松原　　秀介; 川上　　文清; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: JPH11169170A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物の組織、種子、根、花弁などの植物材料から、核酸結合性固相担体を用いて、ＤＮＡを簡便かつ純度よく抽出精製する方法ならびに該方法に用いるＤＮＡを抽出精製するための試薬に関する。該試薬は自動核酸抽出装置にも応用しうる。
【０００２】
【従来の技術】
核酸を含有する植物組織、種子、根、花弁などの植物材料から、核酸を抽出精製することは、これらの植物の品種改良や遺伝子工学を用いた植物培養細胞における有用物質の生産などの分野で重要なステップである。例えば、ある遺伝子について解析しようとする場合や、遺伝子の導入を確認する場合などは、まず、その遺伝子を保持する植物組織、種子、根、花弁などの植物材料から、その遺伝子、特にＤＮＡを抽出することが必要である。
【０００３】
一般に、生物材料に含まれるＤＮＡやＲＮＡなどの核酸は、遊離した状態で存在するわけでなく、タンパク質、脂質、糖から構成される細胞膜や細胞壁等の殻の中に存在し、ほとんどの場合、核酸自身もタンパクとの複合体を形成している。したがって、生物材料から核酸を抽出精製する場合には、まず超音波や熱による物理的破砕処理やプロテアーゼによる酵素処理、界面活性剤や変性剤による処理等を施すことにより、核酸を遊離させ、さらに、フェノール等の有機溶媒による抽出操作や超遠心分離、イオン交換体等の担体を使用したカラムクロマトグラフィー等により、破砕物中から核酸を精製する必要がある。これらの手法は、核酸や出発材料、さらには抽出した核酸の用途に応じて組み合わされ、それぞれ最適化されて用いられている。
【０００４】
植物組織、種子、根、花弁等の植物材料からＤＮＡを抽出精製する方法としては、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）法［1980. Nucl.Acid.Res. 8:4321-4325] が一般的によく用いられている。
このＣＴＡＢ法とは、下記工程を含む。
（１）植物組織、種子、根、花弁等の植物材料を乳鉢、乳棒等を用いて、液体窒素中でパウダー状になるまで粉砕した後、ＣＴＡＢ溶液を加えて、該材料中の植物細胞を溶解し、これによりＤＮＡを抽出し、かつ、タンパク、ポリサッカライドなどのＤＮＡ以外の成分をＣＴＡＢに結合させ、複合体とする。
（２）次に、クロロホルムなどの有機溶媒を用いて、ＣＴＡＢとタンパク、ポリサッカライドの複合体を有機溶媒層へ移行させ、ＤＮＡが含まれる水相のみを分離する。
（３）この水相に塩濃度を下げたＣＴＡＢ溶液（沈殿バッファー）を添加することにより、ＤＮＡを不溶化させ、ＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を沈殿させる。
（４）そして、イソプロパノール沈殿もしくは必要に応じて、塩化セシウム密度勾配遠心法（超遠心）によりＤＮＡを精製する。
【０００５】
この方法は数１０μｇものＤＮＡが抽出可能であるという利点をもつが、ＣＴＡＢによるＤＮＡの沈殿、ならびにイソプロパノール沈殿、あるいは超遠心分離という長時間を要するステップが必要なため、多数のサンプルを迅速に解析する必要のある場合には、より簡便かつ短時間でＤＮＡが抽出精製できる方法が要求される。
【０００６】
一方、簡便な核酸抽出法として、シリカ粒子を核酸結合性固相担体として使用する方法がある（特開平2-289596号公報）。この方法は、細胞などの生物材料にカオトロピック溶液、核酸結合性固相担体を添加することで、核酸を一段階で抽出する手法である。さらに、溶出液に水またはＴＥバッファーなど低濃度の緩衝液を使用するため、エタノール沈殿法などの脱塩、濃縮のための操作を経ることなく、抽出した核酸を直ちに後の解析に直接使用することができるという利点がある。しかしながら、この方法により植物組織、種子、根、花弁等の植物材料からＤＮＡの抽出を試みた場合、植物細胞のもつ、セルロースを主体とした強固な細胞壁により、カオトロピック溶液による細胞の溶解が不十分であったり、植物細胞に豊富に含まれるポリサッカライドやポリフェノールなどの二次代謝産物が、ＤＮＡの核酸結合性固相担体への吸着を阻害するため、動物細胞などと比較して、ＤＮＡの収量が非常に少ないという欠点を有する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題点を解決することにあり、植物組織、種子、根、花弁等の植物材料からＤＮＡを煩雑な操作を必要とすることなく、短時間でを抽出し、精製する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々、鋭意検討した結果、植物材料にまず、界面活性剤を用いた前処理を行い、次いで、カオトロピック剤の存在下に、核酸結合性固相担体により、植物材料からＤＮＡを簡便に抽出精製し得ることを見い出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とする植物ＤＮＡの抽出精製方法。
（ａ）植物材料に界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液を混合して、植物材料中の細胞を溶解し、
（ｂ）得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出する有機溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を分離し、
（ｃ）得られた水相にカオトロピック物質を含む吸着液および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカリ性条件下に混合させて、植物材料中の細胞に含まれるＤＮＡを核酸結合性固相担体上に吸着させ、
（ｄ）ＤＮＡを吸着させた核酸結合性固相担体を洗浄液にて洗浄して、植物細胞中に含まれる糖類およびタンパク類を除去し、次いで、
（ｅ）核酸結合性固相担体に結合したＤＮＡを溶出する。
【００１０】
また、本発明は（１）界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、（３）カオトロピック物質を含む吸着液、（４）核酸結合性固相担体、（５）洗浄液および（６）溶出液を含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出精製用試薬である。
【００１１】
【発明の実施態様】
本発明において用いられる植物材料としては、例えば、植物の組織や培養細胞のほかに、種子、根、花弁などが挙げられる。植物としては、単子葉植物、双子葉植物などがあり、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ムラサキツユクサ、パイナップル、コムギ、エンバク、サトイモなどが挙げられる。また、双子葉植物としては、タバコ、シロイヌナズナ、ケナフ、ジャガイモ、サツマイモ、アサガオ、メロン、ナス、ニンジン、ナタネ、ワタ等の草本性植物、ユーカリ、アカシア、コーヒー等の常緑広葉樹、ポプラ、クヌギ、ヤナギ、シラカバ、コナラ等の落葉樹などの木本性植物などが挙げられる。
【００１２】
本発明に使用する溶解液とは、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で使用する液体であり、界面活性剤を含有する。必要により、タンパク変性剤を添加してもよい。
界面活性剤としては、一般に細胞等から核酸を抽出する際に使用されるものであれば、特に限定されないが、具体例としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド等の陽イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、サルコシン等の陰イオン界面活性剤、トウイーン系界面活性剤、トリトン系界面活性剤などの非イオン界面活性剤、ホスファチジルエタノールアミン等の両性界面活性剤が挙げられる。特に、陽イオン界面活性剤が好ましく、さらにセチルトリメチルアンモニウムブロミドが好ましい。これらの界面活性剤は単独で、あるいは２種以上併用してもよい。
これらの界面活性剤の使用濃度は、界面活性剤の種類により異なり、通常、０．１〜１０容量％であり、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドを使用する場合には、０．１〜５容量％の範囲となることが好ましい。
【００１３】
タンパク変性剤としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン炭酸塩などのグアニジン塩、尿素などを含むカオトロピック物質などを挙げられる。特にグアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩などが好ましい。タンパク変性剤の使用濃度は、用いられる物質により異なり、通常、１０〜８０容量％、好ましくは４０〜７５容量％である。
【００１４】
本発明において使用する上記界面活性剤を抽出する有機溶媒とは、ＤＮＡの固相への結合を妨げるものでなく、かつ、溶解液中の界面活性剤を溶媒中に抽出しうるものであれば、特に限定されない。本発明において用いられる有機溶媒の具体例としては、水飽和フェノール、緩衝液飽和フェノール、クロロホルム、メタノール、1-ブタノール、3-メチル-1- プロパノール、アセトン等が挙げられる。これらのうち、有機溶媒を 2種以上混合したものが好ましく、さらにクロロホルムと3-メチル-1- プロパノールを適当な割合で混合したものが好ましい。
混合比は、有機溶媒の種類により選択されるが、例えばクロロホルム：3-メチル-1- プロパノール＝２４：１〜４８：１（容量比）である。
【００１５】
本発明に使用する吸着液には、カオトロピック物質が含まれる。カオトロピック物質としては、一般にカオトロピック物質として知られているような、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、さらにＤＮＡの固相への結合に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、沃化ナトリウム、沃化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられる。
カオトロピック物質の使用濃度は、用いられるカオトロピック物質により異なり、通常、約１〜８Ｍ、好ましくは３〜５Ｍであり、例えば、グアニジン塩酸塩を使用する場合には、４〜７．５Ｍの範囲である。
【００１６】
本発明において使用するカオトロピック物質を含む吸着液には、緩衝剤を含有させることが好ましい。これは、予め吸着液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に緩衝液として添加してもよい。この緩衝剤としては、一般に使用されるものであれば、特に限定されないが、中性乃至弱アルカリ性条件、すなわち、ｐＨ７〜９において緩衝能を有するものがより好ましい。例えば、トリス−塩酸、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、その使用濃度としては１〜５００ｍＭ、ｐＨは７〜９の範囲が好適である。
【００１７】
本発明において用いられる核酸結合性固相担体としては、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着、すなわち可逆的な結合により保持することができる親水性表面を有する担体であれば、特に限定されない。具体例としては、二酸化ケイ素、すなわち、シリカが好ましく用いられる。また、核酸との可逆的な結合を妨げるようなものでなければ、シリカから構成される他の物質、例えばガラス、ケイソウ土、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものや、超常磁性金属酸化物等の他の物質との複合体も含まれる。
また、この核酸結合性固相担体の形態としては、粒子、フィルター、反応容器等が具体的に挙げられるが特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましく、この際、粒径は０．０５〜５００μｍがより好適である。
【００１８】
本発明において用いられる洗浄液としては、固相担体からのＤＮＡの溶離を促進するものでなく、かつ、ＲＮＡ、タンパク類、糖類の固相への結合を妨げるものであれば、特に限定されない。具体的には、４〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜７０％エタノールが好ましく、これらの洗浄液を併用するとより好適である。つまり、まず、グアニジン塩酸塩溶液で洗浄した後、さらに４０〜７０％エタノールで洗浄するのが好ましい。また、初めに溶解・吸着工程にて使用した吸着液を洗浄液として使用すると、ゲノムＤＮＡとタンパクの除去により有効である。このとき、続いて４０〜７０％エタノールで洗浄するのが好ましい。
【００１９】
本発明において用いられる溶出液としては、固相からのＤＮＡの溶離を促進するものであれば、特に限定されない。具体的には、水あるいはＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）が好ましい。
【００２０】
本発明によるＤＮＡの抽出精製方法は、（ａ）植物材料中の細胞を界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液で植物細胞を溶解する工程、（ｂ）上記（ａ）にて使用した有機溶媒を除去する工程、（ｃ）溶解された細胞中のＤＮＡをカオトロピック物質の存在下に核酸結合性担体に吸着させる工程、（ｄ）吸着されたＤＮＡと糖類およびタンパク類を分離するために、核酸結合性担体を洗浄する工程および（ｅ）該核酸結合性担体から吸着されたＤＮＡを溶出する工程の５段階に大きく分けられる。
本発明では、核酸結合性固相担体が超常磁性金属酸化物を含む粒子であって、さらに磁力を利用して核酸結合性固相担体と液相を分離する工程を含むことがある。
【００２１】
（ａ）細胞溶解工程では、植物組織、種子、根、花弁などの植物材料を乳鉢、乳棒等を用いて、液体窒素中でパウダー状になるまで粉砕、または液体窒素を用いずに上記試料を適当な方法ですりつぶした後、界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液を加え、細胞を溶解する。
【００２２】
（ｂ）有機溶媒を除去する工程では、（ａ）細胞溶解工程で使用した溶解液をクロロホルムなどの上記有機溶媒で抽出する。具体的には、得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出する有機溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を分離する。
【００２３】
（ｃ）次いで、吸着工程では、水相にカオトロピック物質を含む溶液および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカリ性条件下、好ましくはｐＨ７〜９付近にて添加する。このカオトロピック溶液、核酸結合性固相担体は別々に添加しても、あるいは同時に添加しても良い。
【００２４】
（ｄ）洗浄工程は、上記（ａ）〜（ｃ）工程を経て得られた植物材料、溶解液、吸着液、核酸結合性固相担体の混合物から、ＤＮＡを吸着した核酸結合性固相担体のみを可能な限り分離する工程である。このとき、洗浄液を使用して、約２〜３回程度、繰り返し洗浄することが好ましい。
【００２５】
本発明における液相と固相との具体的な分離手段としては、使用する核酸結合性固相担体の形態により異なり、核酸結合性固相担体が粒子の形態である場合には、遠心分離、ろ過、カラム操作等が好ましい。さらには、粒子内に超常磁性金属酸化物を含ませておいたものを固相担体として使用すれば、磁石等を用いた簡便な磁気分離法が可能となり、より好適である。
【００２６】
（ｅ）溶出工程は、上記（ｄ）工程におけるＤＮＡが吸着した核酸結合性固相担体から該ＤＮＡを溶離させる工程である。このとき回収したＤＮＡは、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、制限酵素やＤＮＡポリメラーゼ等を使用した酵素反応に直接使用することができる。
【００２７】
本発明によるＤＮＡの抽出精製方法は、単純な工程から構成されるため、固相の分離操作や試薬分注操作を自動化した核酸抽出装置へ容易に応用しうる。
【００２８】
本発明のＤＮＡの抽出精製試薬は、（１）界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、（３）カオトロピック物質を含む吸着液、（４）核酸結合性固相担体、（５）洗浄液および（６）溶出液を含む。試薬キットとしては、上記（１）〜（６）を任意に組み合わせる。その組成比は、使用目的に応じて種々選択されるが、その一例としては、（１）界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液、約１００〜４００μｌ、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、約１００〜４００μｌ、（３）カオトロピック物質を含む吸着液、約４００〜８００μｌ、（４）核酸結合性固相担体、約１０〜１００μ、（５）洗浄液、約５００〜１０００μｌおよび（６）溶出液、約５０〜２００μｌがある。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
タバコ緑葉からのＤＮＡの抽出
核酸抽出試料として、タバコ緑葉を用い、（ｉ）下記ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）溶液（本発明）、（ii）カオトロピック物質だけを含む溶液（従来法）の２種類の溶解液で、ＤＮＡ抽出の比較を行った。
タバコの葉を採取後、直ちに液体窒素にて凍結し、予め液体窒素で冷却した乳鉢、乳棒を用いてパウダー状になるまで粉砕し、これをＤＮＡ抽出試料とした。
【００３０】
この抽出試料１００ｍｇに

を加えて、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した後、６５℃の湯浴で１０分間加熱し、細胞を溶解させるとともに、ポリサッカライド、タンパクのＣＴＡＢとの結合を促進した。この１０分間の間に５秒間の攪拌を２回行った。
【００３１】
続いて、３００μｌのクロロホルム溶液 (クロロホルム：イソアミルアルコール =２４：１ )を加えて、よく攪拌した後、12,000回転で１分間遠心分離を行い、水層を回収した。これを７Ｍグアニジン塩酸塩で、８５０μｌにボリュームアップし、４０μｌの０．５ｇ／ｍｌ磁性シリカ粒子 (粒径１〜１０μｍ、四三酸化鉄粒子３０％含有、比表面積２８０ｍ²/ｇ、細孔容積０．０２５ｍｌ／ｇ、表面細孔直径２〜６ｎｍ：鈴木油脂社製 )の懸濁液を添加し、室温で１０分間攪拌した。
【００３２】
次に、マイクロチューブを磁気スタンド（ＭＰＣ−Ｍ：ダイナル社製 )に設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を除去した。さらに、マイクロチューブを磁気スタンドから外し、９００μｌの洗浄液（7Mグアニジン塩酸塩、50 mM トリス−塩酸 (pH 7.5) ）を加えて十分に攪拌した後、同様に磁気スタンドに設置して上清を除去することにより、粒子を洗浄した。同様にして、９００μｌの洗浄液にて再度、粒子を洗浄し、続いて９００μｌの７０％エタノールで２回粒子を洗浄した。
上清を除去した後、１００μｌのＴＥバッファーを添加し、室温で１０分間攪拌した後、磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。回収液量はおよそ１００μｌであった。
【００３３】
抽出精製は各溶解液について、ｎ＝２で行い、抽出精製液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図１に示す。レーン１はラムダファージＤＮＡの HindIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は本発明法で抽出したもの、レーン４、５はカオトロピック物質を含む溶液だけで抽出したもの (従来法 )を示している。
図１から、本発明方法による抽出精製物が、従来法の抽出精製物と比較して、収量が大幅に改善されていることが確認できた。
【００３４】
参考例１
ＰＣＲによるｒｂｃＬ遺伝子の検出
上記実施例 1にて得られた抽出精製液（本発明）に対して、ｒｂｃＬ遺伝子 (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit gene、葉緑体ゲノム上に存在 )をターゲットとして、ＰＣＲを行うことにより、該抽出精製液中の葉緑体由来ＤＮＡの検出を試みた。
設計したプライマーの増幅断片は約１．３ｋｂである。ＰＣＲには、ＫＯＤＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。鋳型には実施例１で抽出精製したＤＮＡを１００ｎｇ用いた。反応は全量を１００μｌとし、９４℃で１分間ホットスタートを行った後、９８℃、２０秒間、６２℃、２秒間、７４℃、９０秒間を３０サイクル実施して、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲはＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ２０００ (Perkin Elmer社製 )で実施した。
反応液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図２に示す。
【００３５】
図中、レーン１、８はラムダファージＤＮＡの HindIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は実施例１に示す方法により抽出精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターンを示している。約１．３ｋｂの目的の増幅断片が得られ、葉緑体ＤＮＡの抽出精製ならびに抽出精製したＤＮＡがそのまま、ＰＣＲに用いることができることが確認できた。
【００３６】
参考例２
ｒｂｃＬ−ＭＴ(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit N-methyltransferase gene 、核ゲノム上に存在 )をターゲットとして、ＰＣＲを行うことにより、実施例１にて得られた抽出精製液（本発明）中の核由来ＤＮＡの検出を試みた。プライマーは２組設計し、それぞれの増幅断片は、▲１▼約 2.2kb、▲２▼約 4.6kbである。
ＰＣＲには、ＫＯＤＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。鋳型には実施例 1で抽出精製したＤＮＡを１００ｎｇ用いた。反応は全量を１００μｌとし、９４℃で１分間ホットスタートを行った後、
▲１▼２．２ｋｂ断片
９８℃、２０秒間、６５℃、２秒間、７４℃、２分間を３０サイクル
▲２▼４．６ｋｂ断片
９８℃、２０秒間、６６℃、２秒間、７４℃、４分間を３５サイクル
実施し、ＰＣＲを行った。
なお、ＰＣＲはＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ２０００ (Perkin Elmer社製) で実施した。
【００３７】
反応液のうち、７μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図２に示す。
図中、レーン１、８はラムダファージＤＮＡの HindIII消化物からなるサイズマーカー、レーン４、５は実施例１にて抽出精製したＤＮＡの２．２ｋｂのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レーン６、７は実施例１にて抽出精製したＤＮＡの４．６ｋｂのＰＣＲ増幅産物の泳動パターンを示している。それぞれ約２．２ｋｂ、４．６ｋｂの目的の増幅断片が得られ、核ＤＮＡ抽出ならびに抽出したＤＮＡがそのまま、ＰＣＲ、さらにはｌｏｎｇＰＣＲに用いることができることが確認できた。
【００３８】
実施例２
タバコ緑葉からのＤＮＡの抽出
核酸抽出試料として、タバコ緑葉を用い、（ｉ）下記ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）およびグアニジン塩酸塩を含む溶液（本発明）、（ii）グアニジン塩酸塩だけを含む溶液（従来法）の２種類の溶解液で、ＤＮＡ抽出の比較を実施例１と同様にして行った。
【００３９】

【００４０】
抽出精製は各溶解液について、ｎ＝２で行い、抽出精製液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図３に示す。
レーン１はラムダファージＤＮＡの HindIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は本発明法で抽出したもの、レーン４、５はカオトロピック物質を含む溶液だけで抽出したもの (従来法 )を示している。
図３から、本発明方法による抽出精製物が、従来法の抽出精製物と比較して、収量が大幅に改善されていることが確認できた。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解液を使用し、界面活性剤を除去した後、カオトピック物質を含む吸着液および核酸結合性固相を中性乃至弱アルカリ性条件下に使用することにより、植物材料に含まれるＤＮＡを特異的に該固相に吸着させ、さらに溶出液を使用して、洗浄液にて糖類およびタンパク類を除去して、煩雑な後処理操作を必要とすることなく、植物ＤＮＡを簡便に回収し、抽出精製することができる。
さらに、本発明では植物細胞のもつセルロースを主体とした強固な細胞壁によるカオトロピックを含む溶液による細胞の不十分な溶解、植物細胞に豊富に含まれるポリサッカライドやポリフェノールなどの二次代謝産物による、ＤＮＡの核酸結合性固相担体への吸着阻害などの問題点を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法または従来法により、タバコ緑葉から抽出精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代える写真である。
【図２】本発明方法により、タバコ緑葉から抽出精製された葉緑体ＤＮＡおよび核由来ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代える写真である。
【図３】本発明方法または従来法により、タバコ緑葉から抽出精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代える写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is a method for extracting and purifying DNA from plant materials such as plant tissues, seeds, roots, petals and the like using a nucleic acid-binding solid phase carrier in a simple and high-purity manner, and for extracting and purifying DNA used in the method. It relates to a reagent. The reagent can also be applied to an automatic nucleic acid extraction apparatus.
[0002]
[Prior art]
Extraction and purification of nucleic acids from plant materials such as plant tissues, seeds, roots, and petals that contain nucleic acids is used in fields such as breeding of these plants and production of useful substances in plant cultured cells using genetic engineering. This is an important step. For example, when trying to analyze a gene or confirming the introduction of a gene, the gene, especially DNA, is first extracted from the plant material holding the gene, seeds, roots, petals, etc. It is necessary to.
[0003]
In general, nucleic acids such as DNA and RNA contained in biological materials do not exist in a free state, but are present in shells such as cell membranes and cell walls composed of proteins, lipids, and sugars. The nucleic acid itself forms a complex with the protein. Therefore, when extracting and purifying nucleic acid from biological materials, first, nucleic acid is liberated by applying physical disruption treatment with ultrasound or heat, enzyme treatment with protease, treatment with surfactant or denaturing agent, etc. It is necessary to purify the nucleic acid from the crushed material by extraction with an organic solvent such as phenol, ultracentrifugation, column chromatography using a carrier such as an ion exchanger, and the like. These techniques are combined and optimized according to the use of nucleic acids, starting materials, and extracted nucleic acids.
[0004]
As a method for extracting and purifying DNA from plant materials such as plant tissues, seeds, roots, and petals, the CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) method [1980. Nucl. Acid. Res. 8: 4321-4325] is generally well used. It is used.
This CTAB method includes the following steps.
(1) Plant materials such as plant tissue, seeds, roots, petals, etc. are pulverized in liquid nitrogen using a mortar, pestle or the like until powdered, and then a CTAB solution is added to plant cells in the material. Dissolve, extract DNA, and bind components other than DNA, such as protein and polysaccharide, to CTAB to form a complex.
(2) Next, using an organic solvent such as chloroform, the complex of CTAB, protein, and polysaccharide is transferred to the organic solvent layer, and only the aqueous phase containing DNA is separated.
(3) A CTAB solution (precipitation buffer) with a reduced salt concentration is added to the aqueous phase to insolubilize DNA and precipitate a CTAB-DNA complex.
(4) Then, the DNA is purified by isopropanol precipitation or, if necessary, cesium chloride density gradient centrifugation (ultracentrifugation).
[0005]
This method has the advantage that several tens of micrograms of DNA can be extracted, but it requires a long time step such as DNA precipitation by CTAB and isopropanol precipitation or ultracentrifugation. When it is necessary to do this, a method that can extract and purify DNA more simply and in a short time is required.
[0006]
On the other hand, as a simple nucleic acid extraction method, there is a method using silica particles as a nucleic acid-binding solid phase carrier (Japanese Patent Laid-Open No. 2-289596). This method is a technique for extracting nucleic acid in one step by adding a chaotropic solution and a nucleic acid-binding solid phase carrier to a biological material such as a cell. In addition, since a low-concentration buffer such as water or TE buffer is used as the eluate, the extracted nucleic acid is directly used for subsequent analysis without any desalting or concentration operations such as ethanol precipitation. There is an advantage that you can. However, when DNA is extracted from plant materials such as plant tissues, seeds, roots, and petals by this method, the lysis of the cells by the chaotropic solution is insufficient due to the strong cell wall mainly composed of cellulose possessed by the plant cells. Since secondary metabolites such as polysaccharides and polyphenols abundantly contained in plant cells inhibit the adsorption of DNA to nucleic acid-binding solid phase carriers, the yield of DNA compared to animal cells, etc. Has the disadvantage of very few.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and extract and purify DNA from plant materials such as plant tissues, seeds, roots, and petals in a short time without requiring complicated operations. Is to provide a method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various earnest studies to solve the above problems, the present inventors first performed a pretreatment using a surfactant on a plant material, and then performed a nucleic acid-binding solid phase in the presence of a chaotropic agent. It has been found that DNA can be easily extracted and purified from plant material using a carrier, and the present invention has been achieved.
[0009]
That is, the present invention includes the following steps (a) to (e) for extracting and purifying plant DNA.
(A) Mixing a lysing solution containing a surfactant and, if necessary, a protein denaturing agent, into the plant material to lyse cells in the plant material;
(B) An organic solvent for extracting a surfactant is added to the obtained cell lysate, and after mixing, the aqueous phase and the organic solvent phase are separated,
(C) The obtained aqueous phase is mixed with an adsorbent containing a chaotropic substance and a nucleic acid-binding solid phase carrier under neutral to weakly alkaline conditions, and the DNA contained in the cells in the plant material is mixed with the nucleic acid-binding solid phase. Adsorb on a carrier,
(D) The nucleic acid-binding solid phase carrier on which DNA is adsorbed is washed with a washing solution to remove saccharides and proteins contained in plant cells,
(E) The DNA bound to the nucleic acid binding solid phase carrier is eluted.
[0010]
The present invention also includes (1) a solution containing a surfactant and optionally a protein denaturing agent, (2) an organic solvent for extracting the surfactant, (3) an adsorbing solution containing a chaotropic substance, and (4) a nucleic acid binding property. A plant DNA extraction / purification reagent comprising a solid phase carrier, (5) a washing solution, and (6) an eluate.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the plant material used in the present invention include seeds, roots, and petals in addition to plant tissues and cultured cells. Examples of plants include monocotyledonous plants and dicotyledonous plants, and examples of monocotyledonous plants include rice, corn, purple duckweed, pineapple, wheat, oat, and taro. In addition, dicotyledonous plants include herbaceous plants such as tobacco, Arabidopsis, kenaf, potato, sweet potato, morning glory, melon, eggplant, carrot, rapeseed, and cotton, eucalyptus, acacia, coffee, etc. And woody plants such as deciduous trees such as birch and quercus.
[0012]
The lysis solution used in the present invention is a liquid used for the purpose of disrupting cell membranes or denaturing proteins contained in cells, and contains a surfactant. If necessary, a protein denaturant may be added.
The surfactant is not particularly limited as long as it is generally used when nucleic acids are extracted from cells or the like. Specific examples include dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide and the like. Nonionic surfactants such as cationic surfactants, sodium dodecyl sulfate, sodium N-lauroyl sarcosine, sodium cholate, sodium lauryl sulfate, sarcosine, etc., tween surfactants, triton surfactants Agents, amphoteric surfactants such as phosphatidylethanolamine. In particular, a cationic surfactant is preferable, and cetyltrimethylammonium bromide is more preferable. These surfactants may be used alone or in combination of two or more.
The use concentration of these surfactants varies depending on the type of surfactant and is usually 0.1 to 10% by volume. For example, when cetyltrimethylammonium bromide is used, 0.1 to 5% by volume is used. It is preferable to be in the range.
[0013]
Examples of the protein denaturant include guanidine salts such as guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate and guanidine carbonate, and chaotropic substances including urea. In particular, guanidine hydrochloride and guanidine thiocyanate are preferable. The use concentration of the protein denaturant varies depending on the substance used, and is usually 10 to 80% by volume, preferably 40 to 75% by volume.
[0014]
The organic solvent for extracting the surfactant used in the present invention does not prevent the binding of DNA to the solid phase and can extract the surfactant in the solution into the solvent. There is no particular limitation. Specific examples of the organic solvent used in the present invention include water saturated phenol, buffer saturated phenol, chloroform, methanol, 1-butanol, 3-methyl-1-propanol, acetone and the like. Of these, a mixture of two or more organic solvents is preferable, and a mixture of chloroform and 3-methyl-1-propanol at an appropriate ratio is preferable.
The mixing ratio is selected depending on the type of organic solvent, and is, for example, chloroform: 3-methyl-1-propanol = 24: 1 to 48: 1 (volume ratio).
[0015]
The adsorbing liquid used in the present invention contains a chaotropic substance. The chaotropic substance is not particularly limited as long as it has an action of increasing the water solubility of a hydrophobic molecule, which is generally known as a chaotropic substance, and further contributes to the binding of DNA to a solid phase. Not. Specific examples include guanidine thiocyanate, guanidine hydrochloride, sodium iodide, potassium iodide, sodium perchlorate and the like.
The use concentration of the chaotropic substance varies depending on the chaotropic substance used, and is usually about 1 to 8M, preferably 3 to 5M. For example, when guanidine hydrochloride is used, it is in the range of 4 to 7.5M. .
[0016]
The adsorbing liquid containing the chaotropic substance used in the present invention preferably contains a buffer. This may be contained in the adsorbing solution in advance, or may be added as a buffer after lysing the cells. The buffering agent is not particularly limited as long as it is generally used, but more preferably has a buffering capacity under neutral to weakly alkaline conditions, that is, pH 7-9. For example, tris-hydrochloric acid, sodium tetraborate-hydrochloric acid, potassium dihydrogen phosphate-sodium tetraborate buffer, etc. are used, and the use concentration is preferably 1 to 500 mM, and the pH is preferably in the range of 7 to 9. .
[0017]
The nucleic acid-binding solid phase carrier used in the present invention is not particularly limited as long as it has a hydrophilic surface capable of adsorbing nucleic acid in the presence of chaotropic ions, that is, holding it by reversible binding. As a specific example, silicon dioxide, that is, silica is preferably used. If it does not prevent reversible binding to nucleic acids, other substances composed of silica, such as glass, diatomaceous earth, or those that have been surface-treated by chemical modification, superparamagnetic Complexes with other substances such as metal oxides are also included.
Specific examples of the form of the nucleic acid-binding solid phase carrier include particles, filters, reaction vessels, and the like, but are not particularly limited. Among these, considering the efficiency of adsorption and elution, the form of particles is more preferable. In this case, the particle diameter is more preferably 0.05 to 500 μm.
[0018]
The washing solution used in the present invention is not particularly limited as long as it does not promote elution of DNA from the solid phase carrier and prevents binding of RNA, proteins, and saccharides to the solid phase. Specifically, 4-7.5M guanidine hydrochloride solution or 40-70% ethanol is preferable, and it is more preferable to use these cleaning solutions in combination. That is, first, it is preferable to wash with 40 to 70% ethanol after washing with guanidine hydrochloride solution. Further, when the adsorbing solution used in the dissolution / adsorption process first is used as a washing solution, it is more effective for removing genomic DNA and proteins. At this time, it is preferable to subsequently wash with 40 to 70% ethanol.
[0019]
The eluent used in the present invention is not particularly limited as long as it promotes elution of DNA from the solid phase. Specifically, water or TE buffer (10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA, pH 8.0) is preferable.
[0020]
The method for extracting and purifying DNA according to the present invention comprises (a) a step of lysing plant cells with a lysate containing a surfactant and, if necessary, a protein denaturant, in the plant material; Removing the organic solvent, (c) adsorbing the lysed DNA on the nucleic acid binding carrier in the presence of a chaotropic substance, and (d) separating the adsorbed DNA from saccharides and proteins. The process is roughly divided into five steps: a step of washing the nucleic acid binding carrier and a step (e) of eluting the adsorbed DNA from the nucleic acid binding carrier.
In the present invention, the nucleic acid-binding solid phase carrier may be a particle containing a superparamagnetic metal oxide, and may further include a step of separating the nucleic acid-binding solid phase carrier and the liquid phase using magnetic force.
[0021]
(A) In the cell lysis step, plant materials such as plant tissue, seeds, roots, and petals are pulverized using mortar, pestle or the like until they are powdered in liquid nitrogen, or the above sample is used without using liquid nitrogen. After grinding by an appropriate method, a lysis solution containing a surfactant and, if necessary, a protein denaturant is added to lyse the cells.
[0022]
(B) In the step of removing the organic solvent, (a) the lysate used in the cell lysis step is extracted with the organic solvent such as chloroform. Specifically, an organic solvent that extracts a surfactant is added to and mixed with the obtained cell lysate, and then the aqueous phase and the organic solvent phase are separated.
[0023]
(C) Next, in the adsorption step, a solution containing a chaotropic substance in the aqueous phase and a nucleic acid-binding solid phase carrier are added under neutral to weakly alkaline conditions, preferably at a pH of about 7-9. The chaotropic solution and the nucleic acid binding solid phase carrier may be added separately or simultaneously.
[0024]
(D) The washing step includes a nucleic acid-binding solid phase carrier that adsorbs DNA from a mixture of the plant material, the lysate, the adsorption solution, and the nucleic acid-binding solid phase carrier obtained through the above steps (a) to (c). It is the process which isolate | separates only as much as possible. At this time, it is preferable to repeatedly wash about 2 to 3 times using a washing solution.
[0025]
Specific means for separating the liquid phase and the solid phase in the present invention varies depending on the form of the nucleic acid-binding solid phase carrier to be used. When the nucleic acid-binding solid phase carrier is in the form of particles, centrifugation, Filtration, column operation, etc. are preferred. Furthermore, if a particle in which superparamagnetic metal oxide is contained in the particles is used as a solid phase carrier, a simple magnetic separation method using a magnet or the like is possible, which is more preferable.
[0026]
(E) The elution step is a step of eluting the DNA from the nucleic acid-binding solid phase carrier adsorbed with the DNA in the step (d). The DNA recovered at this time can be directly used for an enzyme reaction using a restriction enzyme, a DNA polymerase, or the like without performing desalting and concentration operations such as dialysis and ethanol precipitation.
[0027]
Since the DNA extraction and purification method according to the present invention is composed of simple steps, it can be easily applied to a nucleic acid extraction apparatus in which solid phase separation operation and reagent dispensing operation are automated.
[0028]
The DNA extraction and purification reagent of the present invention comprises (1) a solution containing a surfactant and, if necessary, a protein denaturant, (2) an organic solvent for extracting the surfactant, (3) an adsorption solution containing a chaotropic substance, 4) Nucleic acid-binding solid phase carrier, (5) Wash solution and (6) Eluate. As a reagent kit, the above (1) to (6) are arbitrarily combined. The composition ratio is variously selected according to the purpose of use. As an example, (1) a solution containing a surfactant and, if necessary, a protein denaturant, about 100 to 400 μl, (2) a surfactant An organic solvent to be extracted, about 100 to 400 μl, (3) an adsorption solution containing a chaotropic substance, about 400 to 800 μl, (4) a nucleic acid binding solid phase carrier, about 10 to 100 μl, (5) a washing solution, about 500 to 1000 μl and (6) There is about 50-200 μl of eluate.
[0029]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Extraction of DNA from tobacco green leaves Tobacco green leaves are used as nucleic acid extraction samples, and (i) the following CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) solution (the present invention), (ii) a solution containing only a chaotropic substance (conventional method) Comparison of DNA extraction was performed using the two types of lysates.
After collecting tobacco leaves, it was immediately frozen in liquid nitrogen and ground using a mortar and pestle previously cooled with liquid nitrogen until it became powdery, and this was used as a DNA extraction sample.
[0030]
To this extracted sample 100mg

After stirring with a vortex mixer for 10 seconds, the mixture was heated in a 65 ° C. water bath for 10 minutes to lyse cells and promote the binding of polysaccharides and proteins to CTAB. During this 10 minutes, stirring for 5 seconds was performed twice.
[0031]
Subsequently, 300 μl of a chloroform solution (chloroform: isoamyl alcohol = 24: 1) was added and stirred well, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 1 minute to collect an aqueous layer. The volume was increased to 850 μl with 7 M guanidine hydrochloride, and 40 μl of 0.5 g / ml magnetic silica particles (particle size 1 to 10 μm, containing 30% iron tetroxide particles, specific surface area 280 m ² / g, pore volume 0.025 ml / g, surface pore diameter 2 to 6 nm: manufactured by Suzuki Yushi Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.
[0032]
Next, the microtube was placed on a magnetic stand (MPC-M: manufactured by Dynal) to collect magnetic silica particles, and the supernatant was removed. Remove the microtube from the magnetic stand, add 900 μl of washing solution (7M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5)) and stir well, then place it on the magnetic stand and remove the supernatant. By doing so, the particles were washed. Similarly, the particles were washed again with 900 μl of washing solution, and then the particles were washed twice with 900 μl of 70% ethanol.
After removing the supernatant, 100 μl of TE buffer was added and stirred at room temperature for 10 minutes, and then placed on a magnetic stand to collect magnetic silica particles, and the supernatant was collected. The recovered liquid volume was approximately 100 μl.
[0033]
Extraction purification is performed for each lysate at n = 2, and 5 μl of the extraction / purification solution is subjected to agarose gel electrophoresis. After ethidium bromide staining, the photographed result is shown in FIG. Lane 1 is a size marker consisting of HindIII digest of lambda phage DNA,

lanes

2 and 3 are extracted by the method of the present invention, and lanes 4 and 5 are extracted only with a solution containing a chaotropic substance (conventional method). Yes.
From FIG. 1, it was confirmed that the yield of the extract and purified product according to the method of the present invention was greatly improved as compared with the extract and purified product of the conventional method.
[0034]
Reference example 1
Detection of rbcL gene by PCR For the extraction and purification solution (invention) obtained in Example 1 above, the rbcL gene (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit gene, chloroplast) Detection of chloroplast-derived DNA in the extracted and purified solution was performed by PCR using the target (existing on the genome).
The amplified fragment of the designed primer is about 1.3 kb. For the PCR, KOD Dash DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. 100 ng of the DNA extracted and purified in Example 1 was used as a template. The reaction was performed in a total volume of 100 μl, hot-started at 94 ° C. for 1 minute, and then subjected to PCR by carrying out 30 cycles of 98 ° C., 20 seconds, 62 ° C., 2 seconds, 74 ° C., and 90 seconds. PCR was performed with a DNA thermal cycler PJ2000 (manufactured by Perkin Elmer).
2 μl of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the result of photography after ethidium bromide staining is shown in FIG.
[0035]
In the figure, lanes 1 and 8 are size markers composed of HindIII digests of lambda phage DNA, and

lanes

2 and 3 show electrophoresis patterns of PCR amplification products of DNA extracted and purified by the method shown in Example 1. The target amplified fragment of about 1.3 kb was obtained, and it was confirmed that the extraction and purification of chloroplast DNA and the extracted and purified DNA can be used for PCR as they are.
[0036]
Reference example 2
Extraction-purified solution obtained in Example 1 (this book) was obtained by performing PCR using rbcL-MT (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit N-methyltransferase gene, present on the nuclear genome) as a target. (Invention) Attempts were made to detect the nucleus-derived DNA. Two sets of primers are designed, and each amplified fragment is (1) about 2.2 kb and (2) about 4.6 kb.
For the PCR, KOD Dash DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. 100 ng of the DNA extracted and purified in Example 1 was used as a template. The total volume of the reaction was 100 μl, and after a hot start at 94 ° C. for 1 minute,
(1) 2.2 kb fragment 98 ° C., 20 seconds, 65 ° C., 2 seconds, 74 ° C., 2 minutes, 30 cycles (2) 4.6 kb fragment 98 ° C., 20 seconds, 66 ° C., 2 seconds, 74 ° C., 4 PCR was performed with 35 cycles of minutes.
PCR was performed with a DNA thermal cycler PJ2000 (manufactured by Perkin Elmer).
[0037]
Of the reaction solution, 7 μl was subjected to agarose gel electrophoresis, and after ethidium bromide staining, the photographed result is shown in FIG.
In the figure, lanes 1 and 8 are size markers consisting of HindIII digest of lambda phage DNA, lanes 4 and 5 are electrophoresis patterns of 2.2 kb PCR amplification products of the DNA extracted and purified in Example 1, lanes 6 and 7 Shows the migration pattern of the 4.6 kb PCR amplification product of the DNA extracted and purified in Example 1. The target amplified fragments of about 2.2 kb and 4.6 kb were obtained, respectively, and it was confirmed that the nuclear DNA extraction and the extracted DNA can be used as they are for PCR and long PCR.
[0038]
Example 2
Extraction of DNA from tobacco green leaf Tobacco green leaf is used as a nucleic acid extraction sample, and (i) a solution containing the following CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) and guanidine hydrochloride (the present invention), (ii) guanidine hydrochloride Comparison of DNA extraction was performed in the same manner as in Example 1 using two types of lysis solutions containing only the solution (conventional method).
[0039]

[0040]
Extraction purification is carried out for each lysate at n = 2, and 5 μl of the extraction purification solution is subjected to agarose gel electrophoresis, and the result of photography after ethidium bromide staining is shown in FIG.
Lane 1 is a size marker consisting of HindIII digest of lambda phage DNA,

lanes

2 and 3 are extracted by the method of the present invention, and lanes 4 and 5 are extracted only with a solution containing a chaotropic substance (conventional method). Yes.
From FIG. 3, it was confirmed that the yield of the extract and purified product according to the method of the present invention was greatly improved as compared with the extract and purified product of the conventional method.
[0041]
【The invention's effect】
According to the present invention, a detergent containing a surfactant and, if necessary, a protein denaturant is used, the surfactant is removed, and then the adsorbed solution containing the chaotopic substance and the nucleic acid-binding solid phase are neutral to weakly alkaline. When used under conditions, the DNA contained in the plant material is specifically adsorbed to the solid phase, and the eluate is used to remove saccharides and proteins with a washing solution, which is a complicated post-treatment operation. Plant DNA can be easily recovered and extracted and purified.
Furthermore, in the present invention, DNA is generated by secondary metabolites such as polysaccharides and polyphenols abundantly contained in plant cells, insufficient lysis of the cells by a solution containing chaotropic cells with a strong cell wall mainly composed of cellulose of plant cells. Problems such as inhibition of adsorption to the nucleic acid-binding solid phase carrier can be solved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph replacing a drawing showing an agarose gel electrophoresis pattern of DNA extracted and purified from tobacco green leaves by the method of the present invention or the conventional method.
FIG. 2 is a photograph replacing a drawing showing an agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplification products of chloroplast DNA and nucleus-derived DNA extracted and purified from tobacco green leaves by the method of the present invention.
FIG. 3 is a photograph replacing a drawing showing an agarose gel electrophoresis pattern of DNA extracted and purified from tobacco green leaves by the method of the present invention or the conventional method.

Claims

A method for extracting and purifying plant DNA, comprising the following steps (a) to (e):
(A) Any one or more cationic surfactants comprising dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or cetyltrimethylammonium bromide in plant material , or dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or cetyltrimethylammonium bromide Mixing a lysate containing one or more cationic surfactants and protein denaturants consisting of lysing cells in plant material,
(B) To the obtained cell lysate, an organic solvent for extracting any one or more cationic surfactants consisting of dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or cetyltrimethylammonium bromide was added and mixed, Separating the aqueous phase and the organic solvent phase,
(C) A neutral or weak nucleic acid-binding solid phase carrier having a hydrophilic surface capable of holding a nucleic acid by reversible binding in the presence of an adsorbent containing a chaotropic substance and chaotropic ions in the obtained aqueous phase. by mixing under alkaline conditions, the DNA contained in the cell in the plant material is adsorbed to the nucleic acid binding solid phase carrier,
(D) the nucleic acid binding solid phase support adsorbing the DNA was washed with washing solution, removing the sugars and proteins such included in the plant cell, then
(E) eluting the DNA bound to the nucleic acid binding solid carrier.

The method for extracting and purifying DNA according to claim 1, wherein the protein denaturant is a chaotropic substance.

The method for extracting and purifying DNA according to claim 1, wherein the organic solvent is chloroform or a mixture of chloroform and isoamyl alcohol.

The method for extracting and purifying DNA according to claim 1, wherein the nucleic acid-binding solid phase carrier is a particle.

2. The method for extracting and purifying DNA according to claim 1, wherein the eluate for eluting the DNA bound to the nucleic acid binding solid phase carrier is water or TE buffer.

2. The nucleic acid-binding solid phase carrier is a carrier containing a superparamagnetic metal oxide, and further comprises a step of separating the nucleic acid-binding solid phase carrier and the liquid phase using magnetic force. DNA purification and purification method.

(1) Any one or more cationic surfactants consisting of dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or cetyltrimethylammonium bromide, or any of dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or cetyltrimethylammonium bromide Or a solution containing one or more cationic surfactants and a protein denaturing agent , (2) an organic solvent for extracting the surfactant, (3) an adsorbing solution containing a chaotropic substance, and (4) in the presence of chaotropic ions. A reagent for extracting and purifying plant DNA, comprising a nucleic acid-binding solid phase carrier having a hydrophilic surface capable of holding nucleic acid by reversible binding , (5) a washing solution, and (6) an eluate.