JPH09327291A - Extraction and purification of rna - Google Patents

Extraction and purification of rna

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JPH09327291A
JPH09327291A JP14912896A JP14912896A JPH09327291A JP H09327291 A JPH09327291 A JP H09327291A JP 14912896 A JP14912896 A JP 14912896A JP 14912896 A JP14912896 A JP 14912896A JP H09327291 A JPH09327291 A JP H09327291A
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JP
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rna
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nucleic acid
solid phase
phase carrier
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JP14912896A
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Japanese (ja)
Inventor
Katsunori Ikeda
Yoshikazu Ishida
Hideki Kamimura
Fumikiyo Kawakami
Yoshihisa Kawamura
秀喜 上村
川上  文清
川村  良久
勝徳 池田
石田  由和
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
東洋紡績株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To purify an RNA in a high purity for a short time without requiring complicated operations by adding a lytic liquid containing a chaotropic substance, an organic solvent and a nucleic acid-bonding solid-phase carrier to a biological material such as a cell under acidic conditions, washing the resultant solid-phase carrier adsorbing the RNA thereon and treating the washed solid-phase carrier with an eluent. SOLUTION: A lytic liquid at pH 3-6 containing a chaotropic substance such as a guanidine thiocyanate, an extracting liquid comprising an organic solvent such as a water-saturated or a buffer solution-saturated phenol and a nucleic acid-bonding solid-phase carrier comprising particles, etc., containing a superparamagnetic metallic oxide are added, mixed or brought into contact with a biological material such as a cell under acidic conditions to adsorb an RNA contained in the biological material on the solid-phase carrier. The solid-phase carrier adsorbing the RNA thereon is then washed with a wash liquid and the RNA is eluted from the washed solid-phase carrier with an eluent to thereby extract and purity the RNA from the biological material such as the cell in a high purity for a short time without requiring complicated operations.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は細胞等の生物材料から、核酸結合性固相担体を用いてRNAを簡便かつ純度よく抽出精製する方法ならびに該方法に用いるRNAを抽出精製するための試薬キットに関する。 From a biological material of the present invention such as cells BACKGROUND OF THE INVENTION The reagent kit for extracting and purifying RNA used in the process and method for conveniently and good purity extracted and purified RNA using nucleic acid binding solid carrier on. 該試薬キットは自動核酸抽出装置にも応用しうる。 Reagent kit may be applied to automated nucleic acid extraction apparatus.

【0002】 [0002]

【従来の技術】核酸を含有する細胞等の生物材料からの核酸の抽出精製は、遺伝子工学や臨床診断の分野では重要なステップである。 Extraction purification of nucleic acids from biological materials such as cells containing BACKGROUND ART nucleic acid is an important step in the field of genetic engineering and clinical diagnosis. 例えば、ある遺伝子について解析しようとする場合、まず、その遺伝子を保持する細胞等の生物材料からDNAやRNAといった核酸を抽出することが必要である。 For example, if to be analyzed for a gene, it is first necessary to extract the nucleic acids such as DNA and RNA from biological material such as cells that retain the gene. また、細菌やウイルスといった感染体の検出のためのDNA/RNA診断においても、血液等の生物材料から細菌やウイルスの核酸を抽出した後、 Also in DNA / RNA diagnostics for infection of detecting such bacteria and viruses, after extracting the nucleic acid of bacteria and viruses from biological materials such as blood,
検出することが必要である。 It is necessary to detect. 一般に、生物材料に含まれるDNAやRNAといった核酸は、遊離した状態で存在するわけでなく、タンパク質、脂質、糖から構成される細胞膜や細胞壁等の殻の中に存在し、ほとんどの場合、 Generally, the nucleic acid such as DNA or RNA contained in the biological material, but not present in a free state, proteins, lipids, present in the shell, such as the cell membrane and cell wall composed of a sugar, in most cases,
核酸自身もタンパク質との複合体を形成している。 Nucleic acid itself forms a complex with the protein. したがって、生物材料から核酸を抽出精製する場合には、まず超音波や熱による物理的破砕処理やプロテアーゼによる酵素処理、界面活性剤や変性剤による処理等を施すことにより核酸を遊離させ、さらに、フェノール等の有機溶媒による抽出操作や超遠心分離、イオン交換体等の担体を使用したカラムクロマトグラフィー等により、破砕物中から核酸を精製する必要がある。 Therefore, when extracting and purifying nucleic acid from a biological material is first enzymatic treatment with physical disruption treatment or protease by ultrasound or heat, to release the nucleic acid by performing treatment by surfactants or denaturing agents, and further, extraction and ultracentrifugation with an organic solvent such as phenol, by a carrier column chromatography using such as ion exchangers, it is necessary to purify the nucleic acids from crushed in. これらの手法は、 These approaches,
核酸や出発材料、さらには抽出した核酸の用途に応じて組み合わされ、それぞれ最適化されて用いられている。 Nucleic acid or starting materials, and further combined in accordance with the extracted nucleic acid applications are used are optimized respectively.

【0003】細胞等の生物材料からRNAを抽出精製する方法としては、いわゆるAGPC法[Analytical Biochem As a method for extracting and purifying RNA from biological material such as cells, the so-called AGPC method [Analytical Biochem
istry 162, 156-159 (1987) ]が一般的によく用いられている。 istry 162, 156-159 (1987)] is used generally well. この方法は、(1)細胞等の生物材料にグアニジンチオシアン酸塩とフェノール、クロロホルムを含む溶液を順次、添加して細胞膜や細胞壁を破壊し、核酸に結合しているタンパク質を変性させ、さらにゲノムDN The method comprises: (1) biological material in guanidine thiocyanate and phenol, such as cells, a solution containing chloroform successively, were added to destroy the cell membrane and cell wall, denature the protein bound to nucleic acids, genomic DN
Aを有機相へ分配させ、(2)遠心分離によりRNAが含まれる水相のみを分離し、(3)この水相にエタノール又はイソプロパノールを添加することによりRNAを不溶化させ(エタノール沈殿法又はイソプロパノール沈殿法)、(4)さらに遠心分離によってRNAのみを分離させることを利用した方法である。 To distribute the A into the organic phase, (2) by centrifugation to separate only the aqueous phase containing the RNA, (3) RNA was insolubilized by the addition of ethanol or isopropanol to the aqueous phase (ethanol precipitation or isopropanol precipitation), a method utilizing the fact that the separation of only RNA by further centrifugation (4). このAGPC法は、他の超遠心分離法を利用するRNA抽出精製法と比較して、短時間かつ簡便にRNAが得られるという長所がある。 The AGPC method, as compared to the RNA extraction and purification processes utilizing other ultracentrifugation in a short time and simply is advantageous in that RNA is obtained. しかし、この方法には遠心分離や水相の分離という煩雑な操作や、エタノール沈殿法あるいはイソプロパノール沈殿法という長時間を要するステップが必要なため、特に臨床診断など多サンプルを迅速に解析する必要のある場合には、より簡便かつ短時間でRNAが抽出精製できる方法が要求される。 However, complicated operation and that the separation of the centrifugation and the aqueous phase in this method, since long time of ethanol precipitation or isopropanol precipitation necessary steps requiring the need for particularly rapid analysis of multiple-sample such as clinical diagnosis in some cases, RNA is required is a method that can be extracted and purified in a more convenient and shorter time.

【0004】一方、簡便な核酸抽出法としてシリカを核酸結合性固相担体として使用する方法がある[特開平2- On the other hand, silica is to use as nucleic acid binding solid phase carrier as a simple nucleic acid extraction method [JP-2-
289596号公報]。 289,596 JP]. この方法は、細胞などの生物材料から核酸を一段階で抽出することが可能なうえ、溶出液として水またはTEバッファーなど低濃度の緩衝液を使用するため、エタノール沈殿法などの脱塩、濃縮のための操作を経ることなく、抽出した核酸を直ちに後の解析に直接使用することができるという利点がある。 This method, upon which can be extracted from biological material such as cell nucleic acid in a single step, to use the buffer of low concentration, such as water or TE buffer as eluent, desalination such as ethanol precipitation, concentrated without performing an operation for, there is an advantage that it is possible to directly use the extracted nucleic acid analysis after immediately. しかし、この方法により細胞からRNAの抽出を試みた場合、ゲノムDNAもRNAと同様にシリカ担体へ吸着するため、 However, when trying to extract from the cells of RNA by this method, since the genomic DNA also adsorbed to RNA as well as the silica support,
回収液中にはRNAのほかに多量のゲノムDNAが混入する。 During the recovery liquid is mixed a large amount of genomic DNA in addition to the RNA. そのため、RNAのみを得るためには、さらに酵素処理や超遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の精製操作をおこなうことが必須である。 Therefore, in order to obtain the RNA alone, further enzyme treatment and ultracentrifugation, it is essential to carry out the purification operation such as column chromatography.

【0005】 [0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来から存在する技術の上記問題点を解決することであり、 OBJECTS OF THE INVENTION It is an object of the present invention is to solve the above problems of the conventional existing art,
細胞等の生物材料からRNAを煩雑な操作を必要とすることなく、短時間かつ高純度でRNAを抽出し、精製する方法を提供することである。 Without a biological material such as cells require complicated operations to RNA, it is to extract the RNA in a short time and with high purity, which provides a method of purification.

【0006】 [0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、適当なpHを有する溶解液、有機溶媒、および核酸結合性固相担体により、生物材料からRNAを簡便に抽出精製し得ることを見い出し、本発明に達した。 Means for Solving the Problems The present inventors have found, after extensive studies to solve the above problems, solution having a suitable pH, organic solvents, and the nucleic acid-binding solid support from a biological found that it is possible to easily extracted and purified RNA, it reached the present invention.

【0007】すなわち、本発明は、下記工程(a)〜 [0007] That is, the present invention, the following steps (a) ~
(c)を含むことを特徴とするRNAの抽出精製方法である。 An RNA extraction and purification method which comprises a (c). (a)細胞等の生物材料に、カオトロピック物質を含む溶解液、有機溶媒からなる抽出液、および核酸結合性固相担体を酸性条件下に添加、混合あるいは接触させることにより、生物材料に含まれるRNAを固相上に吸着させ、(b)上記(a)工程にてRNAを吸着させた固相担体を洗浄液により洗浄し、(c)上記(b)工程にて洗浄した固相から、溶出液によりRNAを溶出させる。 The biological material such as (a) cell, lysate containing chaotropic substances, extract consisting of an organic solvent, and adding a nucleic acid binding solid carrier under acidic conditions, by mixing or contact, contained in biological material RNA was adsorbed on a solid phase, the solid phase carrier having adsorbed RNA was washed with the washing solution, the solid phase was washed with (c) above (b) step in (b) above (a) step, elution the RNA is eluted by the liquid.

【0008】本発明では、核酸結合性固相担体が超常磁性金属酸化物を含む粒子であって、さらに磁力を利用して核酸結合性固相担体と液相を分離する工程を含むことがある。 [0008] In the present invention, nucleic acid-binding solid phase carrier is a particle comprising a superparamagnetic metal oxide, may further comprise the step of separating the nucleic acid-binding solid phase carrier and the liquid phase by using a magnetic force .

【0009】また、本発明はカオトロピック物質を含む溶解液、pH3〜6の緩衝液、有機溶媒からなる抽出液、核酸結合性固相担体、洗浄液および溶出液を含むR Furthermore, lysates present invention comprising a chaotropic agent, buffer pH 3-6, extracted solution comprising an organic solvent, comprising a nucleic acid binding solid phase support, the washing solution and the eluate R
NAの抽出精製試薬キットである。 It is NA extraction and purification reagent kit.

【0010】 [0010]

【発明の実施態様】本発明によるRNAの抽出精製方法は、(a)溶解・吸着工程、(b)洗浄工程、(c)溶出工程の3段階に大きく分けられる。 Extraction and purification method of the RNA according to the invention embodiment of the Invention, (a) dissolving and adsorption step, (b) washing process is roughly divided into three stages of (c) elution step.

【0011】(a)溶解・吸着工程では、細胞等の生物材料に細胞溶解液、有機溶媒、核酸結合性固相担体を酸性条件下に添加、混合あるいは接触させることにより、 [0011] (a) in dissolving and adsorption step, the cell lysate biological material such as cells, an organic solvent, adding a nucleic acid binding solid carrier under acidic conditions, by mixing or contacting,
生物材料を溶解し、生物材料に含まれるRNAを核酸結合性固相へ吸着させる。 Dissolving biological material, to adsorb the RNA contained in the biological material to a nucleic acid binding solid phase. 上記溶解液、有機溶媒、核酸結合性固相担体を細胞等の生物材料に、別々に添加しても、あるいは同時に添加しても良い。 The solution, an organic solvent, a nucleic acid binding solid carrier in biological materials such as cells, be added separately, or may be added simultaneously. 本発明においては、カオトロピック物質を含む溶解液、有機溶媒からなる抽出液、および核酸結合性固相担体を酸性条件下、好ましくはpH3〜6、さらに好ましくはpH4付近にて添加、混合あるいは接触させることを特徴とする。 In the present invention, solution containing a chaotropic substance, extract consisting of organic solvents, and nucleic acid-binding solid phase carrier under acidic conditions, is preferably pH 3-6, more preferably added at about pH 4, mixing or contact it is characterized in.

【0012】本発明において用いられる生物材料としては、例えば組織や培養細胞、細菌培養物の他に、全血や血清、白血球等の血液成分、唾液、尿、精液等の体液が挙げられる。 [0012] As the biological material used in the present invention, for example, tissue or cultured cells, in addition to the bacterial cultures, whole blood and serum, blood components such as leukocytes, saliva, urine, and body fluids semen like.

【0013】本発明において使用するカオトロピック物質を含む溶解液には、緩衝剤を含有させることが好ましい。 [0013] solution containing a chaotropic agent to be used in the present invention preferably contains a buffering agent. これは、予め溶解液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に緩衝液として添加してもよい。 It is also be included in the pre-dissolved solution, or may be added as a buffer after cell lysis. この緩衝剤としては、一般に使用されるものであれば、特に限定されないが、pH3〜6の範囲のいずれかのpHにおいて緩衝能を有するものがより好ましい。 As the buffering agent, as long as it is used generally, it is not particularly limited, and more preferably has a buffering capacity in any of the pH in the range of pH 3-6. 例えば、酢酸ナトリウム−酢酸、酢酸ナトリウム−塩酸等が挙げられ、 For example, sodium acetate - acetic acid, sodium acetate - hydrochloride and the like,
その使用濃度としては1〜500mM、pHは3〜6の範囲が好適である。 As the use concentration 1 to 500 mM, pH in the range of 3 to 6 is preferred.

【0014】本発明において用いられる溶解液には、カオトロピック物質が含まれる。 [0014] dissolving solution used in the present invention include chaotropic substance. このカオトロピック物質としては、一般にカオトロピック物質として知られているような、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、さらにRNAの固相への結合に寄与するものであれば特に限定されない。 As the chaotropic substance, generally as known as chaotropic substance, it has the effect of increasing the water solubility of hydrophobic molecules, particularly limited as long as it further contributes to binding to the solid phase of the RNA not. 具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、よう化ナトリウム、よう化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられる。 Specifically, guanidine thiocyanate, guanidine hydrochloride, sodium iodide, potassium iodide, sodium and the like perchlorate. これらのうち、RNAを分解するリボヌクレアーゼに対する阻害効果の大きいグアニジンチオシアン酸塩が好ましく用いられる。 Among these, a large guanidine thiocyanate inhibitory effect against ribonucleases degrade RNA is preferably used. これらのカオトロピック物質の使用濃度は、用いられるカオトロピック物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、3 Use concentration of these chaotropic substances, depends on the chaotropic agent used, for example, when using a guanidine thiocyanate is 3
〜5.5Mの範囲となるように使用するのが好ましい。 Preferably it used to be in the range of ~5.5M.

【0015】また、カオトロピック物質を含む溶解液には、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で、界面活性剤を含有させてもよい。 Further, the solution containing the chaotropic substance, for the purpose of denaturing the proteins contained in the destruction or cells of the cell membrane, may contain a surfactant.
この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば、特に限定されないが、具体的には、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の非イオン界面活性剤、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド等の陽イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、N‐ラウロイルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ホスファチジルエタノールアミン等の両性界面活性剤が挙げられる。 As the surfactant, if generally intended to be used for nucleic acid extraction from cells, such as, but not limited, specifically, polyoxyethylene octylphenyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxy nonionic surfactants such as sorbitan monooleate, dodecyl trimethyl ammonium bromide, dodecyl trimethyl ammonium chloride, cationic surfactants such as cetyl trimethyl ammonium bromide, sodium dodecyl sulfate, N- lauroyl sarcosine sodium, sodium cholate or the like anionic surfactants, amphoteric surfactants such as phosphatidyl ethanolamine. これらのうち、N−ラウロイルサルコシンナトリウムが好ましく用いられる。 Of these, N- lauroyl sarcosine sodium are preferably used. これらの界面活性剤の使用濃度は、用いられる界面活性剤により異なり、例えば、N‐ラウロイルサルコシンナトリウムを使用する場合には、0.1〜2%の範囲となるように使用するのが好ましい。 Use concentration of these surfactants depend surfactant used, for example, when using N- lauroyl sarcosine sodium is preferably used so that 0.1 to 2%.

【0016】本発明において用いられる有機溶媒としては、RNAの固相への結合を妨げるものでなく、かつD [0016] As the organic solvent used in the present invention is not preclude the binding of RNA to the solid phase, and D
NAの固相への結合を妨げるものであれば、特に限定されない。 As long as it prevents the binding of NA of the solid phase is not particularly limited. この原理についての詳細は不明であるが、有機溶媒を液相に添加することにより液相の極性を適度に下げ、そのことによって、分子表面の極性が異なるRNA Is unknown details on this principle, moderately lowering the polarity of the liquid phase by adding an organic solvent in the liquid phase, by the polarity of the molecular surface is different RNA
とDNAに固相との結合の選択性を付与しているものと考える。 We thought of as imparting the selectivity of binding to solid phase DNA with. 本発明において用いられる有機溶媒の具体例としては、水飽和フェノール、緩衝液飽和フェノール、クロロホルム、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、3-メチル-1- プロパノール、アセトン等が挙げられる。 Specific examples of the organic solvent used in the present invention, water-saturated phenol, buffer-saturated phenol, chloroform, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 3-methyl-1-propanol, acetone or the like and the like. これらのうち、水飽和フェノールのみ、あるいは水飽和フェノールとクロロホルムを適当な割合で混合したものが好ましい。 Of these, water-saturated phenol alone, or that the water-saturated phenol and chloroform were mixed in an appropriate ratio is preferred.

【0017】本発明において用いられる核酸結合性固相担体としては、カオトロピックイオンの存在下で核酸を吸着、すなわち可逆的な結合により保持することができる親水性表面を有する担体であれば、特に限定されない。 [0017] As the nucleic acid-binding solid phase carrier used in the present invention, the adsorption of nucleic acid in the presence of chaotropic ions, that is, if a carrier having a hydrophilic surface which can be held by reversible binding, particularly limited not. 具体的には、二酸化ケイ素、すなわちシリカが好ましく用いられる。 Specifically, silicon dioxide, namely silica is preferably used. また、前記のような核酸との可逆的な結合を妨げるようなものでなければ、シリカから構成される他の物質、例えばガラス、ケイソウ土、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものや、超常磁性金属酸化物等の他の物質との複合体も含まれる。 Further, those unless such that interfere with the reversible binding of the nucleic acids, such as, subjected other materials composed of silica, glass, diatomaceous earth, or a surface treatment by chemical modification thereof and, complex with other substances, such as superparamagnetic metal oxides are also included. また、この核酸結合性固相担体の形態としては、粒子、フィルター、反応容器等が具体的に挙げられるが特に限定されない。 As the form of the nucleic acid binding solid phase support particle, a filter, although the reaction vessel and the like specifically not particularly limited. これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましく、このとき粒径は0.05 Of these, more preferred embodiment of the consideration of particles the efficiency of the adsorption and elution, the particle size at this time is 0.05
〜500μmがより好適である。 ~500μm is more suitable.

【0018】(b)洗浄工程は、上記(a)における生物材料、溶解液、有機溶媒、核酸結合性固相担体の混合物から、RNAが吸着した核酸結合性固相担体のみを可能な限り分離する工程である。 [0018] (b) washing step, the biological material in the above (a), solution, organic solvent, separated from the mixture of nucleic acid-binding solid phase carriers, RNA is as far as possible only those nucleic acid binding solid carrier adsorbed it is a step for. このとき、洗浄液を使用して約1〜3回程度、繰り返し洗浄するのが好ましい。 At this time, the order of about 1 to 3 times with washing solution, preferably repeatedly washed.

【0019】本発明における液相と固相との具体的な分離手段としては、使用する核酸結合性固相担体の形態により異なり、核酸結合性固相担体が粒子の形態である場合には、遠心分離、ろ過、カラム操作等が好ましい。 [0019] As a specific separation means between the liquid and solid phases in the present invention differs depending on the form of the nucleic acid binding solid carrier to be used, if the nucleic acid binding solid phase carrier is in the form of particles, centrifugation, filtration, column operation or the like are preferable. さらには、粒子内に超常磁性金属酸化物を含ませておいたものを固相担体として使用すれば、磁石等を用いた簡便な磁気分離法が可能となり、より好適である。 Furthermore, the use of which had been moistened with superparamagnetic metal oxide in the particles as the solid support enables simple magnetic separation method using a magnet or the like is more preferable.

【0020】本発明において用いられる洗浄液としては、固相担体からのプラスミドDNAの溶離を促進するものでなく、かつ、ゲノムDNAやタンパク質の固相への結合を妨げるものであれば特に限定されない。 [0020] As the cleaning liquid used in the present invention is not intended to promote the elution of the plasmid DNA from the solid phase support, and is not particularly limited as long as it prevents the binding to the solid phase of the genomic DNA and protein. 具体的には、3〜5.5Mグアニジンチオシアン酸溶液あるいは40〜100%エタノールが好ましく、これらの洗浄液を併用するとより好適である。 Specifically, it is preferable 3~5.5M guanidine thiocyanate solution or from 40 to 100% ethanol, it is more preferable that a combination of these cleaning liquid. つまり、まず、グアニジンチオシアン酸溶液で洗浄した後、さらに40〜10 That is, first, after washing with a solution of guanidine thiocyanate, further 40-10
0%エタノールで洗浄するのが好ましい。 Preferably washed with 0% ethanol. また、初めに溶解・吸着工程にて使用した細胞溶解液および有機溶媒を洗浄液として使用すると、ゲノムDNAとタンパク質の除去により有効である。 Moreover, the use of cell lysates and an organic solvent used in dissolving and adsorption step initially as a cleaning liquid, which is more effective removal of genomic DNA and proteins. このとき、続いて40〜10 At this time, followed by 40 to 10
0%エタノールで洗浄するのが好ましい。 Preferably washed with 0% ethanol.

【0021】(c)溶出工程は、上記(b)工程におけるRNAが吸着した核酸結合性固相担体から該RNAを溶離させる工程である。 [0021] (c) eluting step is a step of eluting the RNA from (b) above nucleic acid-binding solid phase carrier RNA in the process are adsorbed. 従って、本発明において用いられる溶出液としては、固相からのRNAの溶離を促進するものであれば、特に限定されない。 Accordingly, the elution solution used in the present invention, as long as it promotes the elution of RNA from the solid phase is not particularly limited. 具体的には、水あるいはTEバッファー[10mMトリス塩酸緩衝液、1mMEDT Specifically, water or TE buffer [10 mM Tris-HCl buffer, 1MMEDT
A、pH8.0]が好ましい。 A, pH8.0] is preferred. このとき回収したRNAは、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、逆転写酵素等を使用した酵素反応に直接使用することができる。 At this time it recovered RNA is desalted, such as dialysis and ethanol precipitation, without performing a concentration operation can be used directly in the enzymatic reaction using reverse transcriptase and the like.

【0022】本発明によるRNAの抽出精製方法は、単純な工程から構成されるため、固相の分離操作や試薬分注操作を自動化した核酸抽出装置へ容易に応用しうる。 The extraction and purification method of the RNA according to the present invention, since it is made up of a simple process, can be easily applied separation or reagent dispensing operation of the solid phase to an automated nucleic acid extraction apparatus.

【0023】本発明のRNAの抽出精製試薬キットは、 [0023] RNA extraction and purification reagent kit of the present invention,
カオトロピック物質を含むpH3〜6の溶解液、有機溶媒からなる抽出液、核酸結合性固相担体、洗浄液および溶出液を含む。 Including lysates pH3~6 containing chaotropic substances, extract consisting of an organic solvent, a nucleic acid binding solid phase support, the washing solution and elution solution.

【0024】 [0024]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, a more detailed description of the present invention through examples, the present invention is not limited to these examples. 実施例1 HeLa細胞からのRNAの抽出精製 (1)HeLa細胞の調製 HeLa細胞を10%牛胎児血清(Gibco BRL 社製)含有ダルベッコ変法イーグル培地 (ニッスイ社製)培地1 EXAMPLE 1 HeLa cell RNA extraction and purification of the (1) Preparation of HeLa cells HeLa cells with 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co.) containing Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by Nissui) Medium 1
5mlで37℃、4日間培養した。 37 ° C. in 5 ml, and cultured for 4 days. 培養終了後、トリプシン処理により遊離した細胞を15ml容遠心分離管へ移し、1,000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去した後、10mlのPBS[137mM 塩化ナトリウム、2.7mM After completion of the culture, the free cells by trypsinization was transferred to a 15ml ml centrifuge tube, 1,000 rpm, and centrifuged for 5 minutes, the supernatant was removed, 10ml of PBS [137 mM sodium chloride, 2.7 mM
塩化カリウム、4.3mMリン酸水素二ナトリウム、1.4mM Potassium chloride, 4.3 mM disodium hydrogen phosphate, 1.4 mM
リン酸二水素カリウム(pH7.4 )]にて懸濁した。 It was suspended in potassium dihydrogen phosphate (pH 7.4)]. これについて細胞数を計測したところ7×10 7個であった。 This will was 7 × 10 7 cells where the cells were counted. これをチューブ当たりの細胞数が1×10 6個となるように1.5ml容マイクロチューブに分注し、3,00 This number of cells per tube was dispensed into 1.5ml ml microtube to 1 × 10 6 cells, 3,00
0rpm、5分間遠心分離し、上清を除去することにより得られた細胞ペレットを抽出材料とした。 0 rpm, centrifuged for 5 minutes, the cell pellet obtained by removing the supernatant was extracted material.

【0025】(2)RNAの抽出精製 上記(1)にて調製した細胞に500μlの細胞溶解液[4Mグアニジンチオシアン酸、25mMクエン酸ナトリウム(pH7.0 )、0.5%N−ラウロイルサルコシンナトリウム、0.1M2−メルカプトエタノール]を加えて溶解させ、続いて50μlの2M酢酸ナトリウム−酢酸 (pH4. [0025] (2) cells 500μl of cell lysate prepared in RNA Extraction Purification (1) [4M guanidine thiocyanate, 25mM sodium citrate (pH 7.0), 0.5% N-lauroyl sarcosine sodium, 0.1 M2- dissolved mercaptoethanol] was added, followed by 2M sodium acetate 50 [mu] l - acetic acid (pH 4.
0)、さらに500μlの水飽和フェノールを加え、激しく混合した。 0), further added 500μl of water-saturated phenol, and mixed vigorously. これに、40μlの0.5g/ml磁性シリカ粒子(粒径1〜10μm、四三酸化鉄粒子 30%含有、 This, 40 [mu] l of 0.5 g / ml magnetic silica particles (particle size 1 to 10 [mu] m, triiron tetroxide particles containing 30%,
比表面積 280m 2 /g、細孔容積 0.025ml/g、表面細孔直径2〜6nm:鈴木油脂社製)の懸濁液を添加し、室温で10 A specific surface area of 280 meters 2 / g, pore volume 0.025 ml / g, surface pore diameter 2-6 nm: adding a suspension of Suzuki Yushi Co., Ltd.), 10 at room temperature
分間混合した。 It was mixed minutes. 次に、マイクロチューブを磁気スタンド(MPC-M :ダイナル社製)に設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を除去した。 Next, the microtube magnetic stand: installed in (MPC-M Dynal) collect magnetic silica particles, the supernatant was removed. さらに、マイクロチューブを磁気スタンドから外し、1mlの洗浄液[5.3Mグアニジンチオシアン酸、52mMトリス−塩酸(pH6.4 )]を加えて十分に混合した後、同様に磁気スタンドに設置して上清を除去することにより、粒子を洗浄した。 Moreover, removing the micro tube from the magnetic stand, 1 ml of washing solution [5.3 M guanidine thiocyanate, 52 mM Tris - HCl (pH 6.4)] and were mixed thoroughly by adding similarly installed in a magnetic stand the supernatant by removing, the particles were washed. 同様にして、 In the same way,
1mlの洗浄液にて再度、粒子を洗浄し、続いて1ml Again in 1ml of washing liquid, washing the particles, followed by 1ml
の70%エタノールで2回、100%エタノールで1回粒子を洗浄した。 Twice with 70% ethanol, washed once particles in 100% ethanol. 上清を除去した後、マイクロチューブを55℃に設定したヒートブロック上に設置し、20分間放置することによりチューブ内のエタノールを蒸発除去し、粒子を乾燥させた。 After removal of the supernatant was placed onto a heat block set microtube to 55 ° C., the ethanol in the tube was evaporated off by standing for 20 minutes, to dry the particles. これに100μlの滅菌水を添加し、室温で10分間混合した後、磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。 To this was added sterile water 100 [mu] l, were mixed at room temperature for 10 minutes, collect the magnetic silica particles was placed on a magnetic stand and the supernatant was recovered. 回収液量はおよそ80μlであった。 Elution volume was approximately 80 [mu] l.

【0026】回収液のうち、10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図1(レーン1)に示す。 [0026] Among the recovery liquid, subjected 10μl to agarose gel electrophoresis, showing ethidium bromide staining, the results were photographed in Fig. 1 (lane 1). 図1(レーン1) Figure 1 (lane 1)
から明らかなように、本発明の方法により抽出されたR As is clear from, R extracted by the method of the present invention
NAサンプル中には、ゲノムDNAの混入はほとんど認められず、本発明の方法によってRNAを純度よく抽出精製できることが確認できた。 During NA sample, contaminating genomic DNA is not substantially observed, it was confirmed that the RNA be good purity extracted and purified by the method of the present invention.

【0027】(3)RT−PCRによるヒトトランスフェリンレセプターRNAの検出 上記(2)にて得られた回収液に対して、ヒトトランスフェリンレセプターRNAをターゲットにRT−PCR [0027] (3) the obtained recovered liquid by detecting said human transferrin receptor RNA by RT-PCR (2), RT-PCR of the human transferrin receptor RNA to the target
をおこなうことにより、回収液中のRNAの検出を試みた。 By performing the attempted detection of RNA in the recovered solution. RT−PCRは、市販の試薬キットRT−PCR RT-PCR using a commercially available reagent kit RT-PCR
high(東洋紡績社製)とヒトトランスフェリンレセプター増幅用プライマー(CL5407-1:Clontech社製)を使用して行った。 high (manufactured by TOYOBO) and human transferrin receptor amplification primers (CL5407-1: Clontech, Inc.) as the mobile phase. まず、上記(2)にて得られた回収液のうち、10μlにM−MLV逆転写酵素、逆転写用プライマーを含む逆転写用試薬を加え、最終液量を20μ First, of the recovered liquid obtained in the above (2), M-MLV reverse transcriptase in 10 [mu] l, the reverse transcription reagents containing reverse transcription primer was added and the final volume 20μ
lとし、これを42℃、20分間保温して逆転写反応をおこなった。 And l, which 42 ° C., was subjected to reverse transcription reaction by incubating 20 min. また、並行して逆転写酵素を加えずに同様な操作をおこない、これを逆転写反応のネガティブコントロールとした。 Further, the same operation without adding reverse transcriptase in parallel, as a negative control for reverse transcription reaction this. 次に、逆転写後の反応液に耐熱性DN Next, heat resistance DN to the reaction solution after the reverse transcription
Aポリメラーゼを含むPCR用試薬を加え、最終液量を100μlとし、DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer C Adding reagents for PCR including A polymerase, the final volume and 100μl, DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer C
etus社製)にて95℃、1分間、56℃、1分間、72 etus Ltd.) at 95 ° C., 1 min, 56 ° C., 1 minute, 72
℃、1分間を30サイクル実施し、PCRをおこなった。 ° C., for 1 minute to 30 cycles of, was subjected to PCR. 反応液のうち、10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図2に示す。 Of the reaction mixture, subjecting the 10μl to agarose gel electrophoresis, showing ethidium bromide staining, the results were photographed in Fig. 図中、レーン1はランダムファージDN In the figure, lane 1 is random phage DN
AのPstI消化物からなるサイズマーカー、レーン2は実施例1に示す方法により抽出精製されたRNAのRT− Size marker consisting of PstI digests of A, lane 2 is the RNA extracted purified by the method shown in Example 1 RT-
PCR増幅産物の泳動パターン、レーン3は逆転写反応のネガティブコントロールを使用したときのPCR増幅産物の泳動パターンを示す。 Electrophoresis pattern of the PCR amplification product, lane 3 shows the electrophoresis pattern of the PCR amplification product when using the negative control of the reverse transcription reaction. 図2から明らかなように、 As apparent from FIG 2,
逆転写反応をおこなった反応液(レーン2)のみに増幅産物が見られ、本発明の方法によりRNAの抽出が可能で、直ちにRT−PCRによる解析に使用できることが確認できた。 The reaction solution was subjected to reverse transcription reaction only (lane 2) amplification products are seen in the method of the present invention can be RNA extraction, it was confirmed that it was possible immediately used for analysis by RT-PCR.

【0028】 実施例2 C型肝炎ウイルス(HCV)R [0028] Example 2 C-type hepatitis virus (HCV) R
NAの抽出精製 (1)1×10 7コピー/mlのHCVが含まれている血清を陰性血清により希釈して2×10 5 〜2×10 3 NA extraction and purification of (1) 1 × 10 7 and the serum that contains copies / ml of HCV diluted with negative serum 2 × 10 5 ~2 × 10 3
コピー/mlの希釈系列をつくり、これらを抽出材料とした。 Making a dilution series of copies / ml, were those with the brewing material. 各希釈系列の血清サンプル50μl( 1×10 4 Of each dilution series serum sample 50μl (1 × 10 4 ~
1×10 2コピー相当)を使用して、実施例1と同様な方法によりRNAの抽出をおこなった。 Use 1 × 10 2 copies equivalent), was subjected to extraction of RNA in the same manner as in Example 1.

【0029】(2)RT−PCRによるHCV・RNA [0029] (2) HCV · RNA by RT-PCR
の検出 上記(1)にて得られた回収液に対して、HCV・RN The obtained recovered liquid in the detection above (1), HCV · RN
Aの非翻訳領域をターゲットにRT−PCRをおこなうことにより、回収液中のHCV・RNAの検出を試みた。 By performing RT-PCR untranslated regions of A to the target, attempting to detect HCV · RNA in the recovered solution. RT−PCRは、市販の試薬キットRT−PCR RT-PCR using a commercially available reagent kit RT-PCR
high(東洋紡績社製)を使用しておこなった。 It was carried out using the high (Toyobo Co., Ltd.). まず、(1)にて得られた回収液のうち5μlにM−ML First, M-ML to 5μl of recovered liquid obtained in the (1)
V逆転写酵素、逆転写用プライマーを含む逆転写用試薬を加え、最終液量を20μlとし、これを42℃、60 V reverse transcriptase, a reverse transcription reagents containing reverse transcription primer was added and the final volume and 20 [mu] l, which 42 ° C., 60
分間保温して逆転写反応をおこなった。 It was subjected to a reverse transcription reaction by incubating minutes. 次に、逆転写後の反応液に耐熱性DNAポリメラーゼを含むPCR用試薬を加え、最終液量を25μlとし、DNA Thermal Cycl The PCR reagent comprising a thermostable DNA polymerase to the reaction solution after the reverse transcription was added and the final volume and 25 [mu] l, DNA Thermal Cycl
er(Perkin Elmer Cetus社製)にて、まず、94℃、3 By er (Perkin Elmer Cetus Co., Ltd.), first, 94 ℃, 3
0秒間、53℃、30秒間、72℃、1分間を38サイクル、さらにPCR用試薬を加え、最終液量を30μl 0 sec, 53 ° C., 30 seconds, 72 ° C., 1 minute 38 cycles, further PCR reagent was added, 30 [mu] l of final volume
とし、94℃、30秒間、50℃、1分間、72℃、1 And then, 94 ° C., 30 seconds, 50 ° C., 1 min, 72 ° C., 1
分間を28サイクル実施することにより、二段階のPC By minute during the carrying out 28 cycles, a two-stage PC
Rをおこなった。 It was carried out R. 反応液のうち、10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図3に示す。 Of the reaction mixture, subjecting the 10μl to agarose gel electrophoresis, showing ethidium bromide staining, the results were photographed in Figure 3. 図中、レーン1は、ラムダファージDNAのPstI消化物からなるサイズマーカー、 In the figure, Lane 1, size marker consisting of PstI digests of lambda phage DNA,
レーン2〜7は実施例2に示す方法により抽出精製されたRNAのRT−PCR増幅産物の泳動パターンであり、レーン2及びレーン3は1×10 4コピー、レーン4及びレーン5は1×10 3コピー、レーン6及びレーン7は1×10 2コピー相当のHCVを含む血清サンプルを使用したときの結果を示す。 Lane 2-7 are electrophoresis pattern of RT-PCR amplification products of RNA extracted purified by the method shown in Example 2, lanes 2 and 3 are 1 × 10 4 copies, lane 4 and lane 5 is 1 × 10 3 copies, lane 6 and lane 7 shows the results of using a serum sample comprising 1 × 10 2 copies equivalent of HCV. 図3から明らかなように、1×10 4コピーおよび1×10 3コピー相当のH As apparent from FIG. 3, 1 × 10 4 copies and 1 × 10 3 copies equivalent H
CVを含む血清サンプルについて増幅産物が見られ、本発明の方法により血清サンプルからのHCV・RNAの抽出が可能で、直ちにRT−PCRによる解析に使用できることが確認できた。 For serum samples containing CV observed amplification product, the method of the present invention can be extracted HCV · RNA from serum samples, it was confirmed that it was possible immediately used for analysis by RT-PCR.

【0030】 比較例1従来法と比較して純度よくRNAを抽出精製できることを確認するため、カオトロピック物質とシリカ粒子を利用した従来法によりRNAの抽出を試みた。 [0030] Since as compared with Comparative Example 1 conventional method to make sure that you can extract purification good purity RNA, was attempted to extract the RNA by a conventional method using a chaotropic agent and silica particles. 実施例1(1)にて調製した細胞に、900μlの細胞溶解液 [4.7Mグアニシジンチオシアン酸、46mMトリス塩酸(pH6.4) 、1.2%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、20mM EDTA]を加えて溶解させ、続いて40μ The cells prepared in Example 1 (1), cell lysate 900 [mu] l [4.7 M guanylyl hepcidin thiocyanate, 46 mM Tris-HCl (pH 6.4), 1.2% polyoxyethylene octyl phenyl ether, 20 mM EDTA] was added dissolved Te, followed by 40μ
lの0.5mg/ml磁性シリカ懸濁液を添加し、室温で10分間混合した。 Was added 0.5 mg / ml magnetic silica suspension l, it was mixed at room temperature for 10 minutes. 次に、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して磁性シリカを集め、上清を除去した。 Next, collect magnetic silica by installing a micro tube magnetic stand, the supernatant was removed.
次いで、実施例(2)の方法と同様にして、1mlの洗浄液 [5.3Mグアニジンチオシアン酸、52mMトリス塩酸(p Then, in the same manner as in Example (2), 1 ml of washing solution [5.3 M guanidine thiocyanate, 52 mM Tris-HCl (p
H6.4)]で 2回、 1mlの70% エタノールで 2回、100%エタノールで 1回粒子を洗浄した。 H6.4)] twice, twice with 70% ethanol 1 ml, was washed once particles in 100% ethanol. 上清を除去した後、マイクロチューブを55℃に設定したヒートブロック上に設置し、20分間放置することによりチュブ内のエタノールを蒸発除去し、粒子を乾燥させた。 After removal of the supernatant was placed onto a heat block set microtube to 55 ° C., by leaving for 20 minutes to evaporate off the ethanol in Chubut, to dry the particles. これに100μl 100μl to this
の滅菌水を添加し、室温で10分間混合した後、磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。 It was added sterile water, followed by mixing at room temperature for 10 minutes, collect the magnetic silica particles was placed on a magnetic stand and the supernatant was recovered. 回収液量はおよそ80μlであった。 Elution volume was approximately 80 [mu] l. 回収液のうちの10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結果を図1(レーン2)に示す。 The 10μl of recovered solution was subjected to agarose gel electrophoresis, showing ethidium bromide staining, the results were photographed in Fig. 1 (lane 2). 図1(レーン2)から明らかなように、比較例1に示した従来法より抽出されたサンプル中には、 Figure 1 As is clear from (lane 2), the sample extracted from the conventional method shown in Comparative Example 1,
ゲノムDNAが多量に混入することが確認された。 That the genomic DNA is a large amount of contamination has been confirmed.

【0031】 [0031]

【発明の効果】本発明によれば、適当な溶解液と核酸結合性固相を酸性条件下に使用することにより、生物材料に含まれるRNAを特異的に吸着させ、さらに適当な溶出液を使用することにより、煩雑な後処理操作を必要とすることなく該RNAを簡便に回収し、抽出精製できる。 According to the present invention, by using a suitable solution and a nucleic acid binding solid phase under acidic conditions, specifically adsorb the RNA contained in the biological material, the more appropriate eluate by using, the RNA was easily recovered without the need for complicated post-treatment, can be extracted and purified.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】本発明の方法と従来法により、培養細胞から抽出精製されたRNAのアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代える写真である。 The method and the conventional method of the present invention; FIG is a photograph substituted for drawing showing the agarose gel electrophoresis pattern of the extracted and purified from cultured cells RNA.

【図2】本発明の方法により、培養細胞から抽出精製されたRNAのRT−PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代える写真である。 By the method of the invention; FIG is a photograph substituted for drawing showing the agarose gel electrophoresis pattern of RT-PCR amplification product of the extracted and purified from cultured cells RNA.

【図3】本発明の方法により、HCV陽性血清から抽出精製されたRNAのRT−PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代える写真である。 By the method of the present invention; FIG is a photograph substituted for drawing showing the agarose gel electrophoresis pattern of the extracted purified RNA of RT-PCR amplification products from HCV-positive sera.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Kawakami BunKiyoshi Tsuruga, Fukui Prefecture Toyo-cho, No. 10 No. 24 manufactured by Toyobo Co., Ltd. Tsuruga Bio the laboratory (72) inventor Yoshihisa Kawamura Tsuruga, Fukui Prefecture Toyo-cho, No. 10 No. 24 Toyobo Co., Ltd. Tsuruga Bio the laboratory

Claims (11)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 下記工程(a)〜(c)を含むことを特徴とするRNAの抽出精製方法。 1. A following step (a) ~ RNA extraction and purification method which comprises a (c). (a)細胞等の生物材料に、カオトロピック物質を含む溶解液、有機溶媒からなる抽出液、および核酸結合性固相担体を酸性条件下に添加、混合あるいは接触させることにより、生物材料に含まれるRNAを固相上に吸着させ、 (b)上記(a)工程にてRNAを吸着させた固相担体を洗浄液により洗浄し、 (c)上記(b)工程にて洗浄した固相から、溶出液によりRNAを溶出させる。 The biological material such as (a) cell, lysate containing chaotropic substances, extract consisting of an organic solvent, and adding a nucleic acid binding solid carrier under acidic conditions, by mixing or contact, contained in biological material RNA was adsorbed on a solid phase, the solid phase carrier having adsorbed RNA was washed with the washing solution, the solid phase was washed with (c) above (b) step in (b) above (a) step, elution the RNA is eluted by the liquid.
  2. 【請求項2】 酸性条件がpH3〜6である請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 2. Extraction purification process of claim 1 wherein the RNA acidic conditions are pH 3-6.
  3. 【請求項3】 カオトロピック物質を含む溶解液のpH pH of 3. A solution containing chaotropic substances
    が3〜6である請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 Extraction and purification process according to claim 1, wherein the RNA but is 3-6.
  4. 【請求項4】 カオトロピック物質がグアニジンチオシアン酸塩である請求項1に記載のRNAの抽出精製方法。 4. RNA extraction and purification method of claim 1 chaotropic substance is a guanidine thiocyanate.
  5. 【請求項5】 有機溶媒が水飽和フェノールまたは緩衝液飽和フェノール、クロロホルム、またはこれらの組み合わせである請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 Wherein the organic solvent is water-saturated phenol or buffer-saturated phenol, chloroform or RNA extraction and purification method of claim 1, wherein a combination thereof.
  6. 【請求項6】 核酸結合性固相担体がシリカを含む担体である請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 6. The extraction and purification process according to claim 1, wherein the RNA is a carrier comprising a nucleic acid binding solid phase carrier silica.
  7. 【請求項7】 核酸結合性固相担体が粒子である請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 7. The extraction and purification process according to claim 1, wherein the RNA is a nucleic acid binding solid phase carrier particle.
  8. 【請求項8】 核酸結合性固相担体が超常磁性金属酸化物を含む粒子である請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 8. The extraction and purification process according to claim 1, wherein the RNA is a particle comprising a nucleic acid binding solid phase carrier superparamagnetic metal oxide.
  9. 【請求項9】 抽出液が水あるいはTEバッファーである請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 9. extract extraction purification process of claim 1 wherein the RNA is water or TE buffer.
  10. 【請求項10】 核酸結合性固相担体が超常磁性金属酸化物を含む担体であって、さらに、磁力を利用して核酸結合性固相担体と液相を分離する工程を含むことを特徴とする請求項1記載のRNAの抽出精製方法。 10. The nucleic acid-binding solid phase carrier a carrier comprising a superparamagnetic metal oxide, further comprising comprising the step of separating the nucleic acid-binding solid phase carrier and the liquid phase by using a magnetic force extraction and purification process according to claim 1, wherein the RNA that.
  11. 【請求項11】 カオトロピック物質を含む溶解液、p 11. A solution comprising a chaotropic agent, p
    H3〜6の緩衝液、有機溶媒からなる抽出液、核酸結合性固相担体、洗浄液および溶出液を含むRNAの抽出精製試薬キット。 Buffer H3~6, extract, RNA extraction and purification reagent kit comprising a nucleic acid binding solid phase support, the washing solution and elution solution comprising an organic solvent.
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