JP3856162B2

JP3856162B2 - Thermostable DNA polymerase with reduced exonuclease activity and use thereof

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Publication number: JP3856162B2
Application number: JP19891096A
Authority: JP
Inventors: 小松原　　秀介; 北林　　雅夫; 秀喜上村; 川上　　文清; 川村　　良久; 昌宏高木; 忠行今中
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1996-07-29
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2016-07-29
Also published as: JPH1042871A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はエキソヌクレアーゼ活性が低減された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該酵素を用いた核酸の増幅方法ならびに該方法に使用する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸を増幅する技術に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究が多くなされている。ＰＣＲ反応に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモフィラス(Thermusthermophilus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ(Tthポリメラ−ゼ) やサーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラ−ゼ(Taqポリメラーゼ) などが用いられてきた。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、核酸の取り込みの際の正確性に欠けたり、増幅効率が低いなどの問題がある。
【０００３】
また、超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、たとえばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ、WO92/09689、特開平5-328969号公報）、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラーゼ、特開平6-7160号公報）、パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(KODポリメラーゼ、特開平7-298879号公報）なども知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これら超好熱始原菌由来のポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が存在し、核酸の取り込みの際の正確性は、ＴａｑポリメラーゼやＴｔｈポリメラーゼに比べて優れている。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは核酸の増幅効率が充分でないなどの問題がある。また、超好熱始原菌、例えばパイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来のポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が存在し、ＰＣＲの反応時間、酵素量、プライマー濃度等の条件が狭いとの問題がある。
【０００５】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応の上記問題点は、エキソヌクレアーゼ活性が強すぎることに起因すると考えられる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、このエキソヌクレアーゼに関して高度に保存されたアミノ酸領域が知られている（EXO I, EXO II, EXO III 、図１）。エキソＩ（ＥＸＯＩ）領域にはＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフが存在し、これらのアミノ酸、Ｄ（アスパラギン酸）とＥ（グルタミン酸）はエキソヌクレアーゼ活性に必須であることが知られている。これらのアミノ酸、ＤとＥを中性アミノ酸であるＡ（アラニン）に置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減させることが報告されている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol.268, 1965-1975)。しかしながら、この場合は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が弱くなりすぎており、核酸の取り込みの際の正確性や増幅効率に問題があり、新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、該酵素のＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることを見い出した。
更に、これら改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、従来からＰＣＲに使用されている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性および増幅効率が優れていることを見いだし、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０００８】
また、本発明は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少なくとも１つのアミ酸を他のアミノ酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子である。
【０００９】
本発明は上記遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクターである。
【００１０】
本発明は上記遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞である。
【００１１】
本発明は上記遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼの製造法である。
【００１２】
本発明はＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法である。
【００１３】
本発明は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜１２のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬である。
【００１４】
【発明の実施態様】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であって、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフを含むエキソ１（ＥＸＯ１）領域を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、その起源を問わない。例えば、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ、パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。
【０００１５】
本発明では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、改変前の酵素に比べて、９５％以下、好ましくは９０〜０％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が得られる。置換するアミノ酸の種類によって、種々の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られる。
【００１６】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であり、さらに、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも２０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる。
【００１７】
また、本発明の別な実施態様としては、さらに下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
【００１８】
本発明の別な実施態様としては、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【００１９】
本発明では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフとしては、例えばＰｈｅＡｓｐＩｌｅＧｌｕＴｈｒがある。
【００２０】
本発明の一実施態様としては、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４０番目、第１４２番目および第１４４番目の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【００２１】
本発明のさらに具体な例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ₂（Ｉｌｅ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
また、配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４４番目のＸ₃（Ｔｈｒ）をバリン（Ｖａｌ）に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００２２】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００２３】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。

【００２４】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.8 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム，1mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブにに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００２５】
本発明において、ＤＮＡ合成速度とは、単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液(20mM Tris-HCl(pH7.5), 8mM塩化マグネシウム、7.5mM ジチオスレイトール、100 μg/ml BSA, 0.1mM dNTP, 0.2 μCi [α-³²P]dCTP)を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（50mM 水酸化ナトリウム、10mM EDTA, 5% フィコール、0.05% ブロモフェノールブルー) を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ/HindIIIを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求める。
【００２６】
本発明において、熱安定性とは、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理での残存活性を意味する。
【００２７】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、天然型ＫＯＤポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白工学的手法により、天然型ＫＯＤポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下した新規な酵素を製造する方法がある。
【００２８】
変異を導入するためのＫＯＤポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一実施態様は、パイロコッカス(Pyrococcous) ｓｐ．ＫＯＤ由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子を用いた。
【００２９】
本発明の別な実施態様は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入して、天然型ＫＯＤポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下した新規な酵素を製造する。
【００３０】
天然型ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は、既知のいかなる方法でも用いることができる。例えば天然型ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子ＤＮＡと変異源となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などから、蛋白工学的な手法、例えばＰＣＲ法や部位特異的変異などの方法を用いることができる。また、遺伝子修復機構が欠損されたため、高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸菌を用いた in vivoでの変異の導入も可能である。
本発明で使用したカメレオン site-directed mutagenesisキット（ストラタジーン社製）とは、(1) 目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーと選択プライマーとアニーリングさせる。(2) 次にＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成を行った後、ライゲースにてライゲーション反応を行う。(3) 選択プライマー中に存在しないが、鋳型となるプラスミドに存在する制限酵素でプラスミドを切断し、変異の挿入されていないＤＮＡを切断する。(4) 次に残されたプラスミドで大腸菌を形質転換する。(5) 形質転換体から変異プラスミドを調製し、(3),(4) を繰り返し、目的とする変異の挿入されたプラスミドを得る方法である。
【００３１】
上記改変ポリメラーゼ遺伝子をベクターに挿入して、例えば大腸菌を形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。
菌体を破砕する方法は、公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば超音波処理やガラスビール破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素を熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。次に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、両者の活性比率を天然型ＫＯＤポリメラーゼを比較することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した酵素をスクリーニングすることができる。
【００３２】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、公知のいかなる手法を用いても良く、例えば下記方法がある。
栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後、硫安沈殿によりＫＯＤポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイオテク）ゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
この操作の後、Ｑセファロース、ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一のバンドを示す程度に純化される。
【００３３】
本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することができる。プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、１方は他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返す。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、２価イオン、例えばマグネシウムイオンおよび１価イオン、例えばアンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液およびこれらのイオンを含むともに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤、例えばTriton X-100および緩衝液が存在していてもよい。
【００３４】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンまたは／およびカリウムイオン、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含む。
【００３５】
次に実施例を用いて本発明を説明する。
参考例１
超好熱始原菌ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
鹿児島県子宝島にて単離した超好熱始原菌ＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、超好熱始原菌ＫＯＤ株の染色体ＤＮＡを調製した。パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ) の保存領域アミノ酸配列に基づき、２種のプライマー(5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' および5'-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3')を合成した。この２種のプライマーを使用し、調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。
【００３６】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡ断片をプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Ｋｂｐ）。さらに、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドｐＢＳ（ストラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物より大腸菌(E.coli JM109)を形質転換して、ライブラリーを作製した。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライブラリーから、ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(E.coli JM109/pSBKOD1)を取得した。
【００３７】
取得したクローン株、(E.coli JM109/pSBKOD1)よりプラスミド、ｐＳＢＫＯＤ１を回収し、常法に従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１）。
【００３８】
完全なポリメラーゼ遺伝子を作成するため、２箇所の介在配列（１３７４〜２４５３ｂｐ：２７０８〜４３１６ｂｐ）をＰＣＲ融合法により取り除いた。ＰＣＲ融合法では、クローン株より回収したプラスミドを鋳型に、３組のプライマーを組み合わせて、各々ＰＣＲを行い、介在配列を除いた３断片を増幅した。この際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の断片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように設計した。また、両端には別々な制限酵素サイト（Ｎ末端側：ＥｃｏＲＶ、Ｃ末端側：ＢａｍＨＩ）が創出されるように設計した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中、構造上中央に位置する断片と、Ｎ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。また、同様に構造上、中央に位置する断片と、Ｃ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。このようにして得られた２種の断片を用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端にＥｃｏＲＶ、Ｃ末端にＢａｍＨＩサイトを有するＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断片を取得した。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘導可能な発現ベクター、ｐＥＴ−８ｃのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用し、サブクローニングして、組換え発現ベクター（ｐＥＴ−ｐｏｌ）を得た。なお、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ｐｏｌは、生命工学工業研究所へ寄託されている（ＦＥＲＭＢＰ−５５１３）。
【００３９】
実施例１
ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子のサブクローニング
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミドｐＥＴ−ｐｏｌからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。
すなわちｐＥＴ−ｐｏｌを制限酵素、ＸｂａＩとＢａｍＨＩ（東洋紡製）で切断し、約２．３ｋｂのＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片をライゲーションキット（東洋紡製 Ligation high) を用いて、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）と連結した。次に、市販のコンピテントセル（東洋紡製 competent high JM109)を用いて形質転換を行った。
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で３５℃で１６時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。さらに、部分塩基配列を確認してＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＫＯＤ１を得た。
【００４０】
実施例２
改変型遺伝子（ＩＮ）の作製および改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例１で得られたプラスミドｐＫＯＤ１を用いて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₂のイソロイシンをアスパラギンに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつプラスミドを作製した（ｐＫＯＤＩＮ）。
作製はカメレオンsite-directed mutagenesisキット（ストラタジーン社製）を用いた。方法は取扱説明書に準じて行った。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号５に記載のプライマーを用いた。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＩＮ）を得た。
【００４１】
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、ｐ．Ａ．２に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で３０℃、１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＩＮ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの破砕緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-メルカプトエタノール、1mM EDTA) に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。
次に, 細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0), 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20, 0.1%ノニデットP40, 50%グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＮ）を得た。
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。
【００４２】

【００４３】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合後、上記熱処理液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。
酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００４４】
実施例３
変異体（ＩＥ）遺伝子の作製および改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₂のイソロイシンをグルタミン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＥ）。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号６に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＥ）を得た。
【００４５】
実施例４
変異体（ＩＱ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₂のイソロイシンをグルタミンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＱ）。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号７に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＱ）を得た。
【００４６】
実施例５
変異体（ＩＤ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₂のイソロイシンをアスパラギン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＤ）。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号８に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＤ）を得た。
【００４７】
実施例６
変異体（ＴＶ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にてＥＸ０１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₃のチロシンをバリンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＴＶ））。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＴＶ）を得た。
【００４８】
実施例７
変異体（ＩＫ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にてＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのＸのうち、Ｘ₂のイソロイシンをリジンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＫ）。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＫ）を得た。
【００４９】
実施例８
変異体（ＩＲ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にてＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのＸのうち、Ｘ₂のイソロイシンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＲ））。
選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＲ）を得た。
【００５０】
実施例９
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の確認
上記実施例２〜８で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を以下の方法にて測定した。対照として、天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）を用いた。５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.8 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム, 1mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5μg トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブにに分注し、上記ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ０．５ユニット、１ユニット、１．５ユニット加えて、７５℃で１０分間反応させた。氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡを５０ｍｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、2%ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合した。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離した。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定した。
図２に各ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性とＤＮＡの分解率を示した。更に天然型のＫＯＤポリメラーゼとのエキソヌクレアーゼ活性の比を図３に示した。このように本発明によれば様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることを示した。
天然型のＫＯＤポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対して、ＩＮは約９５％、ＩＥは約７６％、ＩＱは約６４％、ＩＤは約５２％、ＴＶは約４８％、ＩＫは約３０％、ＩＲは約０％の同活性を有していた。
【００５１】
実施例１０
改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ
天然型ＫＯＤポリメラーゼまたは改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＮ，ＩＥ，ＩＱ，ＩＤ，ＴＶ，ＩＫ，ＩＲを用いて、ＰＣＲ反応を行った。５０ｍｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム, 1mM MgCl₂, 0.2mM dNTP, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 1ng の制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたプラスミドpBR322、１０ピコモルの配列表１２、１３記載のプライマー）に各酵素を２．５ユニット加えてＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用いた。また反応条件は９４℃、３０秒→６８℃、２分３０秒を２５サイクル行った。
また、Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡製）も同様にしてＰＣＲ反応を行った。ただし、反応液組成は（10mM Tris-HCl(pH8.8 at 25 ℃), 50mM KCl,1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTP, 0.1% Triton X-100, 1ng の制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたプラスミドpBR322、１０ピコモルの配列表１２および１３記載のプライマー）で行った。反応終了後、５ｍｌの反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、約４．３kbのターゲットの増幅を確認した。
図４にアガロースゲル電気泳動の結果を示した。この結果、改変型ＤＮＡポリメラーゼＩＮ，ＩＥ，ＩＱ，ＩＤ，ＴＶ，ＩＫ，ＩＲを用いてＰＣＲを行った場合、天然型のＫＯＤポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅であった。
【００５２】
実施例１１
改変型ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲでのＤＮＡ合成の正確性の測定
天然型のＫＯＤポリメラーゼ、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＥ、ＩＤ、ＩＫ、ＩＲおよびＴａｑポリメラーゼについて、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の正確性を以下の方法にて測定した。
プラスミドｐＵＲ２８８（Current Protocols in Molecular Biology 1.5.6に記載）を制限酵素ＳｃａＩで切断した。このプラスミドを１ｎｇ用いて実施例１０記載の方法と同様の方法にてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、約5.３kbのターゲットの増幅を確認した。残りの反応液をフェノール／クロロホルム処理し、次にエタノール沈殿を行った。沈殿を乾燥後５０μｌのＨｉｇｈバッファー（50mM Tris-HCl(pH7.5),100mM NaCl,10mM MgCl₂, 1mM DTT)に溶解した。さらに制限酵素ＳｃａＩ（東洋紡製）を１０ユニット加えて、３７℃で１６時間反応させた。アガロースゲル電気泳動にて目的の増幅産物を分離し、その部分のアガロースを切り出した。このアガロースからジーンクリーン２（BIO101社製）を用いてＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡ１０ｎｇを１０μｌになるようにＴＥバッファー（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)で希釈し、ライゲーションキット（東洋紡製Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ）の反応液１０μｌを加えて１６℃で３０分間反応した。次に市販のコンピーテントセル（東洋紡製 competent high JM109) を用いて形質転換を行った。
【００５３】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（IPTG、ナカライテスク社製）、０．７％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ（ナカライテスク社製））を含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で３５℃で１６時間培養し、コロニーをカウントした。ｐＵＲ２８８にはｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）が存在する。従って、ＰＣＲ中のＤＮＡ合成が正確に行われた場合、上記寒天培地では青いコロニーを形成する。逆にＤＮＡ合成中に誤りが起こり、ｌａｃＺ遺伝子のコードするβ−ガラクトシダーゼ活性が低下あるいは欠失した場合、薄い青色ないしは白色のコロニーを形成する。この薄い青コロニーと白コロニーを変異コロニーとして、各酵素を用いた場合の変異率（％）を表１に示した。
【００５４】
【表１】

【００５５】
表１に示したように、本発明で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＥ、ＩＤ、ＩＫ、ＩＲは、天然型のＫＯＤポリメラーゼには劣るものの、Ｔａｑポリメラーゼより変異率が低く、すなわちＤＮＡ合成の正確性が高かった。
【００５６】
【発明の効果】
本発明では、例えばパイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡの合成速度や熱安定性を保持したまま、改変前の該酵素に比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させた改変型耐熱性酵素を作り出すことができた。
また、ＤＮＡ合成速度が少なくとも２０塩基／秒であって、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間処理で１０％以上の残存活性を保持することができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであって、改変前の酵素に比べて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下した酵素を用いることにより、改変前の酵素を用いるよりも増幅効率が上昇する。
【００５７】
【配列表】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

【図面の簡単な説明】
【図１】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソ（ＥＸＯ）領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】改変型ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性とＤＮＡ分解率を示す図である。
【図３】天然型ＫＯＤとのエキソヌクレアーゼ活性の比率を示す図である。
【図４】改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動の写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a thermostable DNA polymerase with reduced exonuclease activity, a nucleic acid amplification method using the enzyme, and a reagent used in the method.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, much research has been conducted on heat-resistant DNA polymerases used in techniques for amplifying nucleic acids such as polymerase chain reaction (PCR). The thermostable DNA polymerase used in the PCR reaction is mainly DNA polymerase (Tth polymerase) derived from Thermus thermophilus or DNA polymerase (Taq polymerase) derived from Thermus aquaticus. I came. However, these heat-resistant DNA polymerases have problems such as lack of accuracy during nucleic acid incorporation and low amplification efficiency.
[0003]
Further, DNA polymerases derived from hyperthermophilic archaeons such as thermostable DNA polymerases derived from Pyrococcus furiosus (Pfu polymerase, WO92 / 09689, JP-A-5-328969), Thermococcus litoralis (Thermococcus litoralis) -derived heat-resistant DNA polymerase (Tli polymerase, JP-A-6-7160), Pyrococcus sp. A heat-resistant DNA polymerase derived from KOD1 (KOD polymerase, JP-A-7-298879) is also known.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Polymerases derived from these hyperthermophilic archaeons have 3'-5 'exonuclease activity, and the accuracy of nucleic acid incorporation is superior to Taq polymerase and Tth polymerase. However, these heat-resistant DNA polymerases have problems such as insufficient nucleic acid amplification efficiency. Also, hyperthermophilic archaeons such as Pyrococcus sp. The polymerase derived from KOD1 has a 3'-5 'exonuclease activity and has a problem that conditions such as PCR reaction time, enzyme amount, primer concentration and the like are narrow.
[0005]
The above problem of the PCR reaction using a DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity is considered to be caused by too strong exonuclease activity. In the amino acid sequence of DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, amino acid regions highly conserved with respect to this exonuclease are known (EXO I, EXO II, EXO III, Fig. 1). X in the exo I area₁DX₂EX_ThreeThere is a motif and these amino acids, D (aspartic acid) and E (glutamic acid) are known to be essential for exonuclease activity. It has been reported that exonuclease activity is deleted or reduced to 1 / 10,000 or less by substituting these amino acids, D and E, with A (alanine) which is a neutral amino acid (Kong et al. (1993)). Journal of Biological Chemistry, vol. 268, 1965-1975). However, in this case, the 3'-5 'exonuclease activity is too weak, and there is a problem in the accuracy and amplification efficiency at the time of nucleic acid incorporation, and a new thermostable DNA polymerase has been awaited.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the inventors of the present invention, in the thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X present in the EXO1 region of the enzyme.₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₁, X₂And X_ThreeIt has been found that by substituting at least one of the amino acids with another amino acid, thermostable DNA polymerases having various strengths of 3'-5 'exonuclease activity can be obtained.
Furthermore, these modified thermostable DNA polymerases have been found to have better accuracy and amplification efficiency than thermostable DNA polymerases conventionally used in PCR, and have reached the present invention.
[0007]
That is, the present invention relates to an amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region in the amino acid sequence of a thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₁, X₂And X_ThreeA thermostable DNA polymerase characterized by being an enzyme in which at least one amino acid is substituted with another amino acid.
[0008]
The present invention also relates to an amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region in the amino acid sequence of a thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₁, X₂And X_ThreeA gene encoding a thermostable DNA polymerase in which at least one amino acid is replaced with another amino acid.
[0009]
The present invention is a recombinant vector in which the above gene is inserted into a vector.
[0010]
The present invention is a recombinant host cell obtained by transforming a host cell with a recombinant vector in which the above gene is inserted into the vector.
[0011]
The present invention relates to a heat-resistant DNA characterized by culturing a recombinant host cell obtained by transforming a host cell with a gene recombinant vector in which the above gene is inserted into a vector, and collecting a heat-resistant DNA polymerase from the culture. This is a method for producing a polymerase.
[0012]
The present invention is a nucleic acid amplification method characterized in that DNA is used as a template, a primer, dNTP and the above heat-resistant DNA polymerase are reacted to extend the primer to synthesize a DNA primer extension product.
[0013]
The present invention relates to two primers, dNTP, wherein one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, the thermostable DNA polymerase according to any one of claims 1 to 12, divalent ions, It is a reagent for nucleic acid amplification containing a valent ion and a buffer solution.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The thermostable DNA polymerase of the present invention is an amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region in the amino acid sequence of a thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₁, X₂And X_ThreeWherein at least one amino acid is substituted with another amino acid,₁DX₂EX_ThreeThe thermostable DNA polymerase having an exo 1 (EXO1) region containing a motif does not matter its origin. For example, a thermostable DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus, a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. Examples include heat-resistant DNA polymerase derived from KOD1, heat-resistant DNA polymerase derived from Thermotoga maritima, and the like.
[00015]
In the present invention, the amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region in the amino acid sequence of a thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₁, X₂And X_ThreeBy substituting at least one of the amino acids with another amino acid, an enzyme having 3'-5 'exonuclease activity of 95% or less, preferably 90 to 0%, can be obtained as compared with the enzyme before modification. Depending on the type of amino acid to be substituted, various thermostable DNA polymerases having 3'-5 'exonuclease activity can be obtained.
[0016]
As one embodiment of the present invention, an amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region in the amino acid sequence of a thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₁, X₂And X_ThreeIn addition, there are modified thermostable DNA polymerases having the following physicochemical properties:
Action: It has a DNA synthesis activity and has a 3'-5 'exonuclease activity that is 95% or less compared to the enzyme before modification.
DNA synthesis rate: at least 20 bases / second
Thermal stability: Residual activity of 10% or more can be maintained by treatment at 95 ° C. for 6 hours at pH 8.8 (measured value at 25 ° C.).
[0017]
Further, as another embodiment of the present invention, there is a modified thermostable DNA polymerase having the following physicochemical properties.
Action: It has a DNA synthesis activity and has a 3'-5 'exonuclease activity that is 95% or less compared to the enzyme before modification.
DNA synthesis rate: at least 30 bases / second
Thermal stability: Residual activity of 60% or more can be maintained by treatment at 95 ° C. for 6 hours at pH 8.8 (measured value at 25 ° C.).
[0018]
Another embodiment of the present invention is a modified thermostable DNA polymerase having the following physicochemical properties:
Action: It has a DNA synthesis activity and has a 3'-5 'exonuclease activity that is 95% or less compared to the enzyme before modification.
DNA synthesis rate: at least 30 bases / second
Thermal stability: Residual activity of 60% or more can be maintained by treatment at 95 ° C. for 6 hours at pH 8.8 (measured value at 25 ° C.).
Optimal temperature: about 75 ° C
Molecular weight: 88-90 KDa
Amino acid sequence: an amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, X₁DX₂EX_ThreeAmino acid sequence in which at least one amino acid of the motif is replaced with another amino acid
[0019]
In the present invention, the amino acid sequence present in the exo 1 (EXO1) region in the amino acid sequence of a thermostable DNA polymerase having 3'-5 'exonuclease activity, X₁DX₂EX_ThreeAn example of the motif is PheAspIleGluThr.
[0020]
One embodiment of the present invention is a modified thermostable DNA polymerase having the following physicochemical properties.
Action: It has a DNA synthesis activity and has a 3'-5 'exonuclease activity that is 95% or less compared to the enzyme before modification.
DNA synthesis rate: at least 30 bases / second
Thermal stability: Residual activity of 60% or more can be maintained by treatment at 95 ° C. for 6 hours at pH 8.8 (measured value at 25 ° C.).
Optimal temperature: about 75 ° C
Molecular weight: 88-90 KDa
Amino acid sequence: an amino acid sequence obtained by substituting at least one of the 140th, 142nd and 144th amino acids with another amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
[0021]
As a more specific example of the present invention, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the 142nd X₂And heat-resistant DNA polymerase in which (Ile) is replaced with aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), asparagine (Asn), glutamine (Gln), lysine (Lys), or arginine (Arg).
In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the 144th X_ThreeAnd a heat-resistant DNA polymerase in which (Thr) is replaced with valine (Val).
[0022]
In the present invention, DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleoside bound to deoxyribonucleic acid by covalently binding deoxyribonucleoside 5′-triphosphate α-phosphate to the 3′-hydroxyl group of the oligonucleotide or polynucleotide annealed to the template DNA. It refers to the activity of catalyzing the reaction of introducing 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
[0023]
When the enzyme activity is high, the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer. In the present invention, 25 μl of the following A solution, 5 μl of each of B solution and C solution, and 10 μl of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring. Then, 5 μl of the enzyme solution is added and reacted at 75 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture is ice-cooled, and 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. taking measurement. One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.

[0024]
In the present invention, the 3'-5 'exonuclease activity refers to the activity of excising the 3' terminal region of DNA and releasing 5'-mononucleotide.
The activity was measured using 50 μl of reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl.₂, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg tritium-labeled E. coli DNA) into a 1.5 ml Eppendorf tube and add DNA polymerase. After reacting at 75 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 μl of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 μl of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 μl of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
[0025]
In the present invention, the DNA synthesis rate refers to the number of DNA synthesis per unit time. The measurement method was a DNA polymerase reaction solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 7.5 mM dithiothreitol, 100 μg / ml BSA, 0.1 mM dNTP, 0.2 μCi [α-³²P] dCTP) is reacted at 75 ° C. with M13mp181 single-stranded DNA annealed primers. The reaction is stopped by adding an equal amount of a reaction stop solution (50 mM sodium hydroxide, 10 mM EDTA, 5% Ficoll, 0.05% bromophenol blue). After the DNA synthesized by the above reaction is fractionated by alkaline agarose gel electrophoresis, the gel is dried and autoradiography is performed. Labeled λ / HindIII is used as a DNA size marker. The DNA synthesis rate is obtained by measuring the size of the synthesized DNA using the marker band as an index.
[0026]
In the present invention, heat stability means residual activity after treatment at 95 ° C. for 6 hours at pH 8.8 (measured value at 25 ° C.).
[0027]
As a method for producing these modified enzymes, a mutation is introduced into a gene encoding natural KOD polymerase, and a 3′-5 ′ exonuclease activity is obtained by protein engineering as compared with natural KOD polymerase. There are methods to produce reduced new enzymes.
[0028]
The gene encoding KOD polymerase for introducing the mutation is not particularly limited, but one embodiment of the present invention is Pyrococcous sp. The gene described in the sequence listing and SEQ ID NO: 3 derived from KOD was used.
[0029]
Another embodiment of the present invention is a novel enzyme in which a mutation is introduced into the gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the 3′-5 ′ exonuclease activity is reduced compared to natural KOD polymerase. Manufacturing.
[0030]
Any known method can be used as a method for introducing a mutation into the natural KOD polymerase gene. For example, protein engineering techniques such as PCR and site-specific mutation can be used from a method of contacting a natural KOD polymerase gene DNA with a drug as a mutation source, a method using ultraviolet irradiation, or the like. In addition, since the gene repair mechanism is deficient, it is possible to introduce mutations in vivo using E. coli, which causes frequent mutations in genes.
The chameleon site-directed mutagenesis kit (manufactured by Stratagene) used in the present invention is as follows: (1) A plasmid into which a target gene has been inserted is denatured and the plasmid is annealed with a mutation primer and a selection primer. (2) Next, DNA synthesis is performed with DNA polymerase, and then ligation reaction is performed with ligase. (3) The plasmid is cleaved with a restriction enzyme that is not present in the selection primer but is present in the plasmid serving as a template, and cleaves the DNA in which no mutation is inserted. (4) Next, E. coli is transformed with the remaining plasmid. (5) A method in which a mutant plasmid is prepared from a transformant, and (3) and (4) are repeated to obtain a plasmid into which the target mutation has been inserted.
[0031]
The modified polymerase gene is inserted into a vector and transformed into, for example, E. coli, and then applied to an agar medium containing a drug such as ampicillin to form colonies. The colony is inoculated in a nutrient medium such as LB medium or 2 × YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted.
Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells, and for example, a physical crushing method such as ultrasonic treatment or glass beer crushing or a lytic enzyme such as lysozyme can be used. This crude enzyme is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate the host-derived polymerase, and the DNA polymerase activity is measured. Next, by measuring the 3'-5 'exonuclease activity and comparing the activity ratio of both with natural KOD polymerase, an enzyme having a reduced 3'-5' exonuclease activity can be screened.
[0032]
As a method for obtaining purified DNA polymerase from the strain selected by the above method, any known method may be used, for example, the following method.
After collecting the cells obtained by culturing in a nutrient medium, the crude enzyme solution is obtained by crushing and extraction by enzymatic or physical crushing methods. The obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the KOD polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation. This crude enzyme solution can be desalted by a method such as Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) gel filtration.
After this operation, it can be separated and purified by column chromatography such as Q Sepharose and heparin Sepharose to obtain a purified enzyme preparation. This purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it shows an almost single band.
[0033]
Using the modified heat-resistant DNA polymerase of the present invention, a DNA primer can be reacted with a primer and dNTP, the primer is extended, and a DNA primer extension product can be synthesized. The primer is preferably two oligonucleotides, one being a primer that is complementary to the other DNA extension product. Moreover, heating and cooling are repeated.
In order to maintain the activity of the DNA polymerase of the present invention, it is preferable that divalent ions such as magnesium ions and monovalent ions such as ammonium ions and / or potassium ions coexist. The PCR reaction solution contains a buffer solution and these ions, and BSA, a nonionic surfactant such as Triton X-100 and a buffer solution may be present.
[0034]
The reagent for nucleic acid amplification of the present invention comprises two kinds of primers, one of which is complementary to the DNA extension product of the other primer, dNTP and the above heat-resistant DNA polymerase, divalent ion, monovalent ion and buffer solution. More specifically, two primers in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, dNTP and the thermostable DNA polymerase, magnesium ion and ammonium ion or / and potassium ion, BSA And non-ionic surfactants and buffers.
[0035]
Next, the present invention will be described using examples.
Reference example 1
Cloning of DNA polymerase gene from hyperthermophilic archaeon KOD
After culturing the hyperthermophilic archaeon KOD1 strain isolated at Kohojima, Kagoshima Prefecture at 95 ° C., the cells were collected. Chromosomal DNA of the hyperthermophilic archaeon KOD strain was prepared from the obtained bacterial cells according to a conventional method. Two types of primers (5′-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3 ′ and 5′-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3 ′) were synthesized based on the conserved region amino acid sequence of DNA polymerase (Pfu polymerase) derived from Pyrococcus furiosus. Using these two types of primers, PCR reaction was performed using the prepared DNA as a template.
[0036]
After determining the base sequence of the PCR-amplified DNA fragment and determining the amino acid sequence, the amplified DNA fragment was used as a probe for Southern hybridization to the KOD1 strain chromosomal DNA restriction enzyme treatment product, and the DNA polymerase-encoding fragment The size was determined (about 4-7 Kbp). Furthermore, a DNA fragment of this size was recovered from an agarose gel, inserted into a plasmid pBS (Stratagene), and E. coli JM109 was transformed from these mixtures to prepare a library. Colony hybridization was performed using the probe used for Southern hybridization, and a clonal strain (E. coli JM109 / pSBKOD1) thought to contain a DNA polymerase gene derived from the KOD1 strain was obtained from the above library.
[0037]
The plasmid and pSBKOD1 were recovered from the obtained clone strain (E. coli JM109 / pSBKOD1), and the nucleotide sequence was determined according to a conventional method. Further, the amino acid sequence was estimated from the obtained base sequence. The DNA polymerase gene derived from the KOD1 strain consisted of 5010 bases and encoded 1670 amino acids (SEQ ID NO: 1).
[0038]
In order to create a complete polymerase gene, two intervening sequences (1374 to 2453 bp: 2708 to 4316 bp) were removed by the PCR fusion method. In the PCR fusion method, a plasmid recovered from a clonal strain was used as a template, 3 sets of primers were combined, and PCR was performed to amplify 3 fragments excluding intervening sequences. At this time, the primers used for PCR were designed so that the same sequence as the binding partner would be on the side that binds to other fragments. Moreover, it designed so that a separate restriction enzyme site (N terminal side: EcoRV, C terminal side: BamHI) may be created at both ends. Next, among the PCR-amplified fragments, a fragment located in the center of the structure and a fragment located on the N-terminal side were mixed, and PCR was performed using each fragment as a primer. Similarly, a fragment located in the center of the structure and a fragment located on the C-terminal side were mixed, and PCR was performed using each fragment as a primer. PCR was performed again using the two fragments thus obtained, the intervening sequence was removed, and the complete form encoding a DNA polymerase derived from the KOD1 strain having EcoRV at the N-terminus and a BamHI site at the C-terminus. A gene fragment was obtained. Furthermore, an expression vector inducible with the T7 promoter, the NcoI / BamHI site of pET-8c, and the restriction enzyme site created earlier were subcloned to obtain a recombinant expression vector (pET-pol). . In addition, E.I. E. coli BL21 (DE3) / pET-pol has been deposited with the Institute of Biotechnology (FERM BP-5513).
[0039]
Example 1
Subcloning of KOD polymerase gene
In order to modify the thermostable DNA polymerase, the KOD polymerase gene was excised from the plasmid pET-pol and subcloned into pBluescript.
That is, pET-pol was cleaved with restriction enzymes, XbaI and BamHI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to cut out an approximately 2.3 kb KOD polymerase gene. Next, this DNA fragment was ligated with a plasmid pBluescript SK (-) cut with XbaI and BamHI using a ligation kit (Ligation high manufactured by Toyobo). Next, transformation was performed using a commercially available competent cell (Toyobo competent high JM109).
Culture in LB agar medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1.5% agar, Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin for 16 hours. Then, a plasmid was prepared from the obtained colonies. Furthermore, the partial base sequence was confirmed to obtain a plasmid pKOD1 containing the KOD polymerase gene.
[0040]
Example 2
Preparation of modified gene (IN) and purification of modified thermostable DNA polymerase
Using the plasmid pKOD1 obtained in Example 1, X present in the EXO1 region of KOD polymerase₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₂A plasmid having a modified thermostable DNA polymerase gene in which isoleucine was replaced with asparagine was prepared (pKODIN).
The chameleon site-directed mutagenesis kit (Stratagene) was used for the production. The method was performed according to the instruction manual.
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. The primer described in SEQ ID NO: 5 was used as the mutation primer. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid to obtain JM109 (pKODIN).
[0041]
6 L of sterile TB medium (described in Molecular Cloning, p.A.2) containing 100 μg / ml ampicillin was dispensed into a 10 L jar fermenter. This medium was cultured in 50 ml of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, manufactured by Gibco Co.) containing 100 μg / ml ampicillin in advance for 16 hours. Escherichia coli JM109 (pKODIN) (using a 500 ml Sakaguchi flask) was inoculated and cultured with aeration and stirring at 35 ° C. for 12 hours. Bacteria are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 400 ml of disruption buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 80 mM KCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM EDTA), and then treated by sonication. The body was crushed to obtain a cell lysate.
Next, the cell lysate was treated at 85 ° C. for 30 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, denucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate fractionation, heparin sepharose chromatography was performed, and finally storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin) to obtain a modified thermostable DNA polymerase (IN).
The DNA polymerase activity measurement in the purification step was performed by the following operation. When the enzyme activity was high, the sample was diluted with a storage buffer and measured.
[0042]

[0043]
(Method)
Add 25 μl of solution A, 5 μl each of solution B and C, and 10 μl of sterilized water to the Eppendorf tube, stir and mix, add 5 μl of the heat treatment solution, and react at 75 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture is ice-cooled, and 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. It was measured.
One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that incorporated 10 nmol of nucleotide per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
[0044]
Example 3
Production of mutant (IE) gene and purification of modified thermostable DNA polymerase
In the same manner as in Example 2, X present in the EXO1 region of KOD polymerase₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₂A heat-resistant DNA polymerase gene in which isoleucine was replaced with glutamic acid was prepared (pKODIE).
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. The primer described in SEQ ID NO: 6 was used as the mutation primer. Furthermore, modified heat-resistant DNA polymerase (IE) was obtained by the same purification method as in Example 2.
[0045]
Example 4
Production of mutant (IQ) gene and purification of modified thermostable DNA polymerase
In the same manner as in Example 2, X present in the EXO1 region of KOD polymerase₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₂A heat-resistant DNA polymerase gene was prepared by substituting glutamine for isoleucine (pKODIQ).
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. As the mutation primer, the primer described in SEQ ID NO: 7 was used. Furthermore, modified heat-resistant DNA polymerase (IQ) was obtained by the same purification method as in Example 2.
[0046]
Example 5
Production of mutant (ID) gene and purification of modified thermostable DNA polymerase
In the same manner as in Example 2, X present in the EXO1 region of KOD polymerase₁DX₂EX_ThreeX out of motifs₂A heat-resistant DNA polymerase gene in which isoleucine was replaced with aspartic acid was prepared (pKODID).
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. As the mutation primer, the primer described in SEQ ID NO: 8 was used. Furthermore, modified heat-resistant DNA polymerase (ID) was obtained by the same purification method as in Example 2.
[0047]
Example 6
Production of mutant (TV) gene and purification of modified thermostable DNA polymerase
X existing in the EX01 region in the same manner as in Example 2₁DX₂EX_ThreeX out of motifs_ThreeA heat-resistant DNA polymerase gene in which the tyrosine was replaced with valine was prepared (pKODTV).
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. The primer described in SEQ ID NO: 9 was used as the mutation primer. Furthermore, modified heat-resistant DNA polymerase (TV) was obtained by the same purification method as in Example 2.
[0048]
Example 7
Production of mutant (IK) gene and purification of modified thermostable DNA polymerase
X existing in the EXO1 region in the same manner as in Example 2₁DX₂EX_ThreeOf the motif X, X₂A heat-resistant DNA polymerase gene in which isoleucine was replaced with lysine was prepared (pKODIK).
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. The primer described in SEQ ID NO: 9 was used as the mutation primer. Furthermore, modified heat-resistant DNA polymerase (IK) was obtained by the same purification method as in Example 2.
[0049]
Example 8
Production of mutant (IR) gene and purification of modified thermostable DNA polymerase
X existing in the EXO1 region in the same manner as in Example 2₁DX₂EX_ThreeOf the motif X, X₂A heat-resistant DNA polymerase gene in which isoleucine was replaced with arginine was prepared (pKODIR)).
As the selection primer, the primer described in SEQ ID NO: 4 was used. The primer described in SEQ ID NO: 9 was used as the mutation primer. Further, modified heat-resistant DNA polymerase (IR) was obtained by the same purification method as in Example 2.
[0050]
Example 9
Confirmation of exonuclease activity of modified thermostable DNA polymerase
The exonuclease activity of the modified thermostable DNA polymerase obtained in Examples 2 to 8 was measured by the following method. As a control, a natural type KOD polymerase (manufactured by Toyobo) was used. 50 μl of reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg tritium-labeled E. coli DNA) into 1.5 ml Eppendorf tubes, and 0.5 units, 1 unit, and 1.5 units of the above DNA polymerase, respectively. In addition, the mixture was reacted at 75 ° C. for 10 minutes. The reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 ml of 0.1% BSA was added as a carrier, and 100 μl of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate was separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 μl of the supernatant was measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction was measured.
FIG. 2 shows the polymerase activity and DNA degradation rate of each DNA polymerase. Further, the ratio of exonuclease activity to natural KOD polymerase is shown in FIG. Thus, according to the present invention, it has been shown that thermostable DNA polymerases having various strengths of 3'-5 'exonuclease activity can be obtained.
About 95%, IE is about 76%, IQ is about 64%, ID is about 52%, TV is about 48%, and IK is about 3'-5 'exonuclease activity of natural KOD polymerase. About 30%, IR had the same activity of about 0%.
[0051]
Example 10
PCR using modified DNA polymerase
PCR reaction was performed using natural KOD polymerase or modified thermostable DNA polymerase IN, IE, IQ, ID, TV, IK, IR. 50 ml reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25 ° C), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, plasmid pBR322 linearized with 1 ng of restriction enzyme ScaI, 10 pmoles of primers described in Sequence Listings 12 and 13), 2.5 units of each enzyme In addition, a PCR reaction was performed. As the thermal cycler, model PJ2000 manufactured by PerkinElmer was used. The reaction conditions were 94 ° C., 30 seconds → 68 ° C., 2 minutes 30 seconds, 25 cycles.
Further, Taq polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was similarly subjected to PCR reaction. However, the composition of the reaction solution is (10 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.1% Triton X-100, plasmid pBR322 linearized with 1 ng of restriction enzyme ScaI, 10 pmol of primers described in Sequence Listings 12 and 13). After completion of the reaction, 5 ml of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and amplification of a target of about 4.3 kb was confirmed.
FIG. 4 shows the results of agarose gel electrophoresis. As a result, when PCR was performed using modified DNA polymerases IN, IE, IQ, ID, TV, IK, and IR, amplification was better than when natural KOD polymerase was used.
[0052]
Example 11
Measuring the accuracy of DNA synthesis by PCR of modified DNA polymerases
For natural KOD polymerase, modified thermostable DNA polymerase IE, ID, IK, IR and Taq polymerase, the accuracy of DNA synthesis by PCR was measured by the following method.
Plasmid pUR288 (described in Current Protocols in Molecular Biology 1.5.6) was digested with the restriction enzyme ScaI. PCR was performed in the same manner as described in Example 10 using 1 ng of this plasmid. After completion of the reaction, 5 μl of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and amplification of a target of about 5.3 kb was confirmed. The remaining reaction solution was treated with phenol / chloroform, followed by ethanol precipitation. After drying the precipitate, 50 μl of High buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT). Furthermore, 10 units of restriction enzyme ScaI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. The target amplification product was separated by agarose gel electrophoresis, and the agarose in that portion was cut out. DNA was purified from this agarose using Gene Clean 2 (manufactured by BIO101). 10 ng of the purified DNA is diluted with TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) to 10 μl, and 10 μl of the reaction solution of the ligation kit (Toyobo Ligation high) is added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. did. Next, transformation was performed using a commercially available competent cell (Toyobo competent high JM109).
[0053]
100 μg / ml ampicillin, 1 mM isopropylthio-β-galactoside (IPTG, manufactured by Nacalai Tesque), 0.7% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal ( LB agar medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1.5% agar, manufactured by Gibco Co., Ltd.) for 16 hours at 35 ° C. Cultures and colonies were counted. pUR288 has a lacZ gene (β-galactosidase). Therefore, when DNA synthesis during PCR is performed accurately, blue colonies are formed on the agar medium. Conversely, when an error occurs during DNA synthesis and the β-galactosidase activity encoded by the lacZ gene is reduced or deleted, a light blue or white colony is formed. Table 1 shows the mutation rate (%) when each enzyme was used with the pale blue colony and white colony as mutant colonies.
[0054]
[Table 1]

[0055]
As shown in Table 1, the modified thermostable DNA polymerases IE, ID, IK and IR obtained in the present invention are inferior to the natural type KOD polymerase, but have a lower mutation rate than Taq polymerase, that is, DNA synthesis. The accuracy of was high.
[0056]
【The invention's effect】
In the present invention, for example, Pyrococcus sp. While maintaining the DNA synthesis rate and thermal stability of the DNA polymerase derived from KOD1, a modified thermostable enzyme having reduced 3′-5 ′ exonuclease activity compared to the enzyme before modification could be created. .
In addition, the DNA synthesis rate is at least 20 bases / second, and heat-resistant DNA that can maintain a residual activity of 10% or more after treatment at 95 ° C. for 6 hours at pH 8.8 (measured value at 25 ° C.) By using an enzyme that is a polymerase and has a 3′-5 ′ exonuclease activity reduced as compared with the enzyme before modification, the amplification efficiency is increased as compared with the enzyme before modification.
[0057]
[Sequence Listing]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]

[0069]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of the exo (EXO) region of a thermostable DNA polymerase.
FIG. 2 is a graph showing the polymerase activity and DNA degradation rate of a modified DNA polymerase.
FIG. 3 is a graph showing the ratio of exonuclease activity to natural KOD.
FIG. 4 is a photograph of electrophoresis showing the results of PCR using a modified DNA polymerase.

Claims

A thermostable DNA polymerase in which the 142nd X ₂ (Ile) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with aspartic acid (Asp).

A thermostable DNA polymerase in which the 142nd X ₂ (Ile) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamic acid (Glu).

A thermostable DNA polymerase in which the 142nd X ₂ (Ile) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with asparagine (Asn).

A thermostable DNA polymerase in which the 142nd X ₂ (Ile) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamine (Gln).

A thermostable DNA polymerase in which the 142nd X ₂ (Ile) is substituted with lysine (Lys) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

A thermostable DNA polymerase in which the 144th X ₃ (Thr) is substituted with valine (Val) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

A gene encoding the thermostable DNA polymerase according to any one of claims 1 to 6.

A gene recombination vector in which the gene according to claim 7 is inserted into a vector.

The gene recombination vector according to claim 8, wherein the vector is a vector derived from pLED-M1 or pBluescript.

A recombinant host cell obtained by transforming a host cell with a recombinant vector in which the gene according to claim 7 is inserted into the vector.

The host cell is E. coli E. coli. The recombinant host cell according to claim 10, which is E. coli.

A heat-resistant DNA polymerase is obtained by culturing a recombinant host cell obtained by transforming a host cell with a gene recombinant vector in which the gene according to claim 7 is inserted into the vector, and collecting a heat-resistant DNA polymerase from the culture. A method for producing a DNA polymerase.

A DNA primer extension product is synthesized by reacting a primer, dNTP, and the heat-resistant DNA polymerase described in any one of claims 1 to 6 with DNA as a template, and extending the primer. Nucleic acid amplification method.

The nucleic acid amplification method according to claim 13, wherein the primer is two kinds of oligonucleotides, one of which is complementary to the other DNA extension product.

The nucleic acid amplification method according to claim 13, wherein heating and cooling are repeated.

7. Two primers, dNTP, wherein one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, thermostable DNA polymerase according to any one of claims 1-6, divalent ion, monovalent ion and buffer A reagent for nucleic acid amplification containing a liquid.

7. Two primers, dNTP, wherein one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, the thermostable DNA polymerase according to any one of claims 1 to 6, magnesium ion and ammonium ion or / and potassium A nucleic acid amplification reagent comprising an ion, BSA, a nonionic surfactant and a buffer.