DE19954181A1 - Use of non-ionic surfactants to carry out enzymatic reactions - Google Patents

Use of non-ionic surfactants to carry out enzymatic reactions

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Eppendorf Netheler Hinz GmbH
Eppendorf Geraetebau Netheler and Hinz GmbH
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Abstract

The invention relates i.a. to the use of non-ionogenic tensides for carrying out enzymatic reactions and to methods for metering enzyme solutions which avoid a loss of enzyme activity. The invention also relates to enzyme solutions containing tensides and to the use thereof.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft u. a. die Verwendung nichtiono­ gener Tenside zur Durchführung enzymatischer Reaktionen sowie Verfahren zur Dosierung von Enzymlösungen, bei denen ein Verlust von Enzymaktivität vermieden wird. Die Erfindung betrifft ferner Tensid-haltige Enzymlösungen und sowie deren Verwendung.The present invention relates u. a. the use of non-iono gener surfactants for performing enzymatic reactions as well Procedure for dosing enzyme solutions in which a loss of enzyme activity is avoided. The invention further relates to Enzyme solutions containing surfactant and their use.

Hersteller biochemischer Reagenzien bieten eine Vielzahl von Enzymen für die unterschiedlichsten Anwendungszwecke an, wobei diese Enzyme allgemein in Form stabilisierter Lösungen vertrieben werden, die von Anbieter zu Anbieter unterschiedliche Mengen an Zusätzen wie z. B. Bovines Serum Albumin (BSA) oder Tenside enthalten können.Manufacturers of biochemical reagents offer a wide range of Enzymes for a wide variety of applications, where these enzymes are generally sold in the form of stabilized solutions be different amounts from provider to provider Additives such as B. Bovine Serum Albumin (BSA) or surfactants can contain.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß die kommerziell erhältlichen Enzymlösungen in manchen Anwendungsbereichen nicht ohne weiteres in dieser Form einsetzbar sind. So wurde zum Beispiel festge­ stellt, daß beim Dosieren von Enzymlösungen zu einem Substrat­ haltigen Reaktionspuffer in hohen Verdünnungen (1 : 500, 1 : 1000 oder mehr) ein beträchtlicher Teil an Enzymaktivität verloren­ geht, was zu einer Verlangsamung der Enzymreaktion führt. Häufig wird das Enzym vollständig inaktiviert, und es erfolgt keine Umsetzung. Ferner können die derzeit erhältlichen Enzymlösungen ebenfalls nicht mit dem Mikrodosiersystem der DE 197 37 173 A1 dosiert werden, da es wegen der hohen Geschwindigkeit des Konzentrationsausgleichs zwischen Enzympuf­ fer und Reaktionspuffer im Enzymmolekül zu teilweise beträcht­ lichen Aktivitätsverlusten bzw. zur Enzym-Denaturierung kommt.It has now been shown that the commercially available Enzyme solutions are not easy in some areas of application can be used in this form. For example, it was fixed represents that when dosing enzyme solutions to a substrate containing reaction buffer in high dilutions (1: 500, 1: 1000  or more) lost a significant amount of enzyme activity goes, which leads to a slowing down of the enzyme reaction. Often the enzyme is completely inactivated and it occurs No reaction. Furthermore, the currently available Enzyme solutions also not with the microdosing system DE 197 37 173 A1 can be dosed because of the high Concentration balance between enzyme pouf fer and reaction buffer in the enzyme molecule to some extent loss of activity or enzyme denaturation.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Dosierung von Enzymen in hohen Verdünnungen oder unter Verwendung des obengenannten Mikrodosiersystems zur Verfügung zu stellen, bei dem Verluste der Enzymaktivität ganz oder zumindest weitgehend vermieden werden.The object of the present invention is therefore a method for dosing enzymes in high dilutions or below Use of the above microdosing system is available to ask at the loss of enzyme activity entirely or at least largely avoided.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Enzyme in Gegenwart einer bestimmten Mindestmenge nichtionoge­ ner Tenside dosiert.The object is achieved in that the Enzymes in the presence of a certain minimum amount of non-ionic dosed surfactants.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bei Dosierung von Enzymen in hohen Verdünnungen (1 : 500 oder mehr) und/oder unter Verwendung des obengenannten Mikrodosiersystems ein bestimmter Mindestgehalt an nichtionogenem Tensid in der Enzymlösung oder in der Reaktionslösung erforderlich ist, um ein Denaturieren des Enzyms und den damit einhergehenden Aktivitätsverlust zu verhindern. Es hat sich gezeigt, daß Enzymlösungen mit mindestens 0,2% (w/v) Tensid, vorzugsweise mindestens 0,4% (w/v) Tensid, die der Erfindung zugrundelie­ gende Aufgabe lösen. Der notwendige Mindestgehalt an Tensid liegt bei (Restriktions-)Enzymlösungen in der Regel über demjenigen kommerziell erhältlicher Enzymlösungen. Lediglich in einigen wenigen Fällen werden von einzelnen Herstellern bereits jetzt Enzymlösungen vertrieben (wie z. B. Dde1, EcoR1, Pvu1, Ssp1 oder Tha1 von Gibco oder Not1 von Stratagene), die für die genannten Zwecke ausreichende Tensidmengen enthalten. Andere Hersteller bieten diese Enzyme jedoch in der Regel mit voneinander abweichenden und für die Dosierung in hohen Verdünnungen oder unter Verwendung des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 unzureichenden Tensidgehalten an. Ein Zusammenhang zwischen einer bestimmten Mindest-Tensidmenge in der Enzymlösung und/oder dem verwendeten Reaktionspuffer und der Vermeidung einer Enzymdenaturierung bzw. eines Aktivitäts­ verlusts des Enzyms wurde im Stand der Technik für die genannten Anwendungen bislang nicht erkannt. Nichtionogene Tenside werden daher bislang in variierenden Mengen bei der kommerziellen Herstellung von Enzymlösungen verwendet und dienen lediglich der Verbesserung der Enzym-Löslichkeit (vgl. Ullmann - Enzyklopädie der Technischen Chemie, Band 10, "Enzyme").The invention is based on the knowledge that when dosing of enzymes in high dilutions (1: 500 or more) and / or using the above microdosing system certain minimum content of nonionic surfactant in the Enzyme solution or in the reaction solution is required to a denaturing of the enzyme and the associated Prevent loss of activity. It has been shown that Enzyme solutions with at least 0.2% (w / v) surfactant, preferably at least 0.4% (w / v) surfactant on which the invention is based solve this task. The minimum level of surfactant required is usually above (restriction) enzyme solutions that of commercially available enzyme solutions. Only in a few cases, by individual manufacturers already sold enzyme solutions (such as Dde1, EcoR1, Pvu1, Ssp1 or Tha1 from Gibco or Not1 from Stratagene), the  contain sufficient amounts of surfactant for the stated purposes. However, other manufacturers usually also offer these enzymes differing from each other and for dosing in high Dilutions or using the microdosing system according to DE 197 37 173 A1 inadequate surfactant contents. On Relationship between a certain minimum amount of surfactant in the enzyme solution and / or the reaction buffer used and avoiding enzyme denaturation or activity Loss of the enzyme has been known in the art for applications mentioned so far not recognized. Non-ionogenic So far, surfactants have been used in varying amounts commercial production of enzyme solutions used and only serve to improve the enzyme solubility (cf. Ullmann - Encyclopedia of Technical Chemistry, Volume 10, "Enzymes").

Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung nichtionogener Tenside (s. o.) zur Durchführung einer enzymati­ schen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert, bei der man vor der Reaktion entweder die Enzymlösung mit nichtionogenem Tensid in einem Anteil von mindestens 0,2% (w/v) (vorzugsweise 0,4% oder mehr) oder den Reaktionspuffer mit nichtionogenem Tensid in einem Anteil von mehr als 0,0001% (w/v), vorzugsweise minde­ stens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), versetzt.The present invention thus relates to the use non-ionic surfactants (see above) for carrying out an enzymat reaction in which enzyme is diluted by 1: 500 or more and / or using the microdosing system according to DE 197 37 173 A1 metered in, before the reaction either the enzyme solution with non-ionic surfactant in one Proportion of at least 0.2% (w / v) (preferably 0.4% or more) or the reaction buffer with nonionic surfactant in a share of more than 0.0001% (w / v), preferably at least at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), offset.

Gemäß einem Teilaspekt der Erfindung wird eine Tensid-haltige Enzymlösung zur Verfügung gestellt, die einen Gehalt von minde­ stens 0,2% (w/v) (vorzugsweise 0,4% oder mehr) nichtionogenem Tensid aufweist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei den Enzymen um Restriktionsenzyme, es kommen aber auch thermostabile Enzyme in Betracht, wie z. B. Polymerasen, insbesondere Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent-DNA- Polymerase. Das nichtionogene Tensid wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenol (Triton® X-100), Benzyltrimethylammoniumhydroxid (Triton® B), Ethylphenol-Polyethylenglykolether (Nonidet® P40) oder Poly­ oxyethylenderivaten von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen (wie zum Beispiel Polysorbat; Tween®) ausgewählt. Erfindungs­ gemäß ausgenommen sind Lösungen von Dde1, EcoR1, Not1, Pvu1, Ssp1 oder Tha1 mit 0,2% (w/v) Triton® X-100 sowie Polymerasen mit 0,5% (w/v) Tween®20, Triton®X-100 oder Nonidet® P40. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Enzymlösungen mit einem Gehalt von mindestens 1% (w/v), insbesondere aber von mindestens 2% (w/v) nichtionogenen Tensiden bevorzugt.According to a partial aspect of the invention, a surfactant-containing Enzyme solution provided that has a content of min at least 0.2% (w / v) (preferably 0.4% or more) non-ionic Has surfactant. According to a special embodiment the enzymes are restriction enzymes, but they do come also thermostable enzymes, such as. B. polymerases, especially Taq polymerase, pfu polymerase and Vent DNA Polymerase. The nonionic surfactant is preferably derived from the  Group consisting of 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenol (Triton® X-100), benzyltrimethylammonium hydroxide (Triton® B), Ethylphenol polyethylene glycol ether (Nonidet® P40) or poly oxyethylene derivatives of fatty acid esters with sugar alcohols (such as polysorbate; Tween®). Invention according to this, solutions from Dde1, EcoR1, Not1, Pvu1, Ssp1 or Tha1 with 0.2% (w / v) Triton® X-100 and polymerases with 0.5% (w / v) Tween®20, Triton®X-100 or Nonidet® P40. in the Within the scope of the present invention are enzyme solutions with a Content of at least 1% (w / v), but especially of at least 2% (w / v) nonionic surfactants preferred.

Die erfindungsgemäßen Enzymlösungen weisen überraschenderweise den Vorteil auf, daß sie in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 oder mehr zu einer Substrat-haltigen Reaktionslösung zudosiert werden können, ohne daß es zu einer Inaktivierung bzw. Denaturierung des Enzyms und damit zu einem Verlust an Enzymaktivität kommt. Die Enzymlösungen können in ebenso vorteilhafter Weise zum Dosieren mit Hilfe des Mikrodosiersy­ stems gemäß DE 197 37 173 A1 verwendet werden.The enzyme solutions according to the invention surprisingly have the advantage of being in a dilution ratio of 1: 500 or more to a substrate-containing reaction solution can be added without inactivation or denaturation of the enzyme and thus to a loss Enzyme activity is coming. The enzyme solutions can be in as well advantageous for dosing with the help of the microdosing system stems according to DE 197 37 173 A1 can be used.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 (d. h. in einer Verdünnung von 1 : 500 oder in einer höheren Ver­ dünnung, wie z. B. 1 : 1000) zu einer Substratlösung hinzugibt, indem man eine Enzymlösung verwendet, die mindestens 0,2% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,4% (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, wobei Lösungen von Dde1, EcoR1, Not1, Pvu1, Ssp1 oder Tha1 mit 0,2% (w/v) (Triton® X-100) und Lösungen von Polymerasen mit 0,5% (w/v) Tween®20, Triton®X-100 oder Nonidet® P40 ausgenommen sind.The present invention therefore also relates to a method to carry out an enzymatic reaction in which one Enzyme solution at a dilution of at least 1: 500 (i.e. in a dilution of 1: 500 or in a higher ver thinning, such as B. 1: 1000) to a substrate solution, by using an enzyme solution that is at least 0.2% (w / v), preferably at least 0.4% (w / v) non-ionic Contains surfactant, with solutions of Dde1, EcoR1, Not1, Pvu1, Ssp1 or Tha1 with 0.2% (w / v) (Triton® X-100) and solutions from Polymerases with 0.5% (w / v) Tween®20, Triton®X-100 or Nonidet® P40 are excluded.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Dosieren von Enzymlösungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1, bei dem man die oben genannten Enzymlösungen einsetzt.The invention further relates to a method for dosing Enzyme solutions using the microdosing system according to  DE 197 37 173 A1, in which the above-mentioned enzyme solutions starts.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnene Erkenntnis, daß sich Enzyme beim Dosieren in einem Verdünnungsverhältnis von mindestens 1 : 500 und/oder mit dem o. g. Mikrodosiersystem auch dadurch stabilisieren lassen, daß man dem Reaktionspuffer (anstelle der Enzymlösung), d. h. der Substrat-haltigen Reaktionslösung, nichtionogenes Tensid zugibt (s. o.), ist insofern von großer praktischer Bedeutung, als im Stand der Technik viele Enzymlösungen vertrieben werden ohne Angabe, wie ein Denaturieren oder ein Aktivitätsverlust z. B. beim Dosieren des Enzyms in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 oder mehr vermieden werden kann. Andererseits werden Reaktionspuffern zum Teil Tenside zugesetzt, wobei in diesen Fällen von den lösungsvermittelnden Eigenschaften der Tenside Gebrauch gemacht wird (s. o.). Die Verwendung von Reaktionspuffern mit einem Gehalt von mehr als 0,0001% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), nichtionogenem Tensid (bzw. die Verwendung nichtionogener Tenside als solches) zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zum Reaktionspuffer zudosiert, ist im Stand der Technik weder offenbart noch nahegelegt.The knowledge gained in the context of the present invention, that enzymes are in a dilution ratio when dosing of at least 1: 500 and / or with the above. Microdosing system can also be stabilized in that the reaction buffer (instead of the enzyme solution), d. H. the substrate-containing Reaction solution that adds nonionic surfactant (see above) of great practical importance insofar as in the state of the Technology Many enzyme solutions are sold without specifying how denaturing or loss of activity e.g. B. when dosing of the enzyme in a dilution ratio of 1: 500 or more can be avoided. On the other hand, reaction buffers become Part of surfactants added, in these cases by the solution-mediating properties of the surfactants will (see above). The use of reaction buffers with a Content of more than 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), non-ionic surfactant (or the use of non-ionic Surfactants as such) for carrying out an enzymatic Reaction in which enzyme is diluted 1: 500 or more and / or according to the microdosing system DE 197 37 173 A1 metered to the reaction buffer is in the prior art Technology neither disclosed nor suggested.

Gegenstand der Erfindung ist somit ferner die Verwendung eines Reaktionspuffers, der mindestens 0,0001% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym (s. o.) in einer Ver­ dünnung von mindestens 1 : 500 und/oder mit Hilfe des Mikrodo­ siersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert.The invention thus also relates to the use of a Reaction buffer, preferably at least 0.0001% (w / v) at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), contains nonionic surfactant, to carry out a enzymatic reaction, in which one enzyme (see above) in a ver thinning of at least 1: 500 and / or with the help of microdo siersystems according to DE 197 37 173 A1 metered.

Erfindungsgemäß eingeschlossen ist auch ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von 1 : 500 oder in einer höheren Verdünnung (z. B. 1 : 1000) zu einer Substratlösung bzw. einem Reaktionspuffer zugibt, der mehr als 0,0001% (w/v), insbesondere mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), nichtionogenes Tensid (s. o.) enthält. Polyoxyethylenderivate von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen, wie zum Beispiel Polysorbat (Tween®), sind besonders bevorzugt. Die Dosierung des Enzyms kann mit konventionellen Techniken oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 erfolgen. Es ist selbstverständlich auch möglich, eine Tensid­ haltige Enzymlösung zu einer Tensid-haltigen Substratlösung (Reaktionspuffer) zu dosieren.A method for is also included according to the invention Carrying out an enzymatic reaction in which one  Enzyme solution in a dilution of 1: 500 or in a higher dilution (e.g. 1: 1000) to a substrate solution or adding a reaction buffer that is more than 0.0001% (w / v), in particular at least 0.02% (w / v) and particularly preferred contains at least 0.04% (w / v), non-ionic surfactant (see above). Polyoxyethylene derivatives of fatty acid esters with sugar alcohols, such as polysorbate (Tween®) are particularly preferred. The dosage of the enzyme can be done using conventional techniques or with the help of the microdosing system according to DE 197 37 173 A1 respectively. It is of course also possible to use a surfactant containing enzyme solution to a surfactant-containing substrate solution (Reaction buffer) to dose.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen (Substrat­ freien) Reaktionspuffer, der mindestens 0,04% (w/v) nichtiono­ genes Tensid, vorzugsweise Polyoxyethylenderivate von Fett­ säureestern mit Zuckeralkoholen wie zum Beispiel Polysorbat (Tween®), enthält.The present invention further relates to a (substrate free) reaction buffer containing at least 0.04% (w / v) non-ion Genes surfactant, preferably polyoxyethylene derivatives of fat acid esters with sugar alcohols such as polysorbate (Tween®).

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Bei­ spielen beschrieben.The present invention is described below with reference to play described.

BEISPIELEEXAMPLES

Mit Hilfe des Restriktionsenzyms EcoR1 wurden anhand einer Dosierung im Verdünnungsverhältnis 1 : 500 enzymatische Reak­ tionen mit λDNA durchgeführt, wobei EcoR1 in der Lage ist, die λDNA in fünf Fragmente zu zerlegen, die gelelektrophoretisch aufgetrennt und mit herkömmlichen Methoden nachgewiesen werden können.With the help of the restriction enzyme EcoR1, a Dosage in a dilution ratio of 1: 500 enzymatic reac tions performed with λDNA, EcoR1 is able to Disassemble λDNA into five fragments that are gel electrophoretically separated and detected using conventional methods can.

Die mit verschiedenen Anteilen an nichtionogenen Tensiden (entweder als Zusatz zur Enzymlösung oder als Zusatz zum Reaktionspuffer) erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend anhand der Fig. 1 bis 9 dargestellt, wobei die Reaktionsbedingungen jeweils in der Legende zu den Figuren angegeben sind. The results obtained with different proportions of nonionic surfactants (either as an additive to the enzyme solution or as an additive to the reaction buffer) are shown below with reference to FIGS . 1 to 9, the reaction conditions being given in the legend to the figures.

Fig. 1 1 µl Enzymlösung EcoR1 (10 U/µl) in 499 µl Reak­ tionspuffer (Tris-HCl 50 mM, MgCl2, 10 mM, NaCl 100 mM, Dithioerythritol 1 mM, pH 7,5 bei 37°C), enthaltend 10 µg λ-DNA.
Das Enzym wird nahezu vollständig zerstört.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion:
Bahn 1-10 = 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 Minuten Fig. 1 1 ul enzyme solution EcoR1 (10 U / ul) in 499 ul reaction buffer (Tris-HCl 50 mM, MgCl 2 , 10 mM, NaCl 100 mM, dithioerythritol 1 mM, pH 7.5 at 37 ° C) containing 10 µg λ DNA.
The enzyme is almost completely destroyed.
Time of termination of the reaction:
Lane 1-10 = 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 minutes

Fig. 2 1 µl Enzymlösung EcoR1 + 9 µl Verdünnungslösung (Tris-HCl 20 mM, KCl 500 mM, EDTA 1 mM, Dithioery­ thritol 1 mM, Thesit 0,05%, Glycerin 50%) in 490 µl Reaktionspuffer (s. o.), enthaltend 10 µg λ- DNA.
Das Substrat wird in zu erwartender Geschwindig­ keit abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion:
Bahn 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 Minuten Fig. 2 1 µl enzyme solution EcoR1 + 9 µl dilution solution (Tris-HCl 20 mM, KCl 500 mM, EDTA 1 mM, dithioery thritol 1 mM, thesite 0.05%, glycerol 50%) in 490 µl reaction buffer (see above) 10 µg λ DNA.
The substrate is broken down at the expected speed.
Time of termination of the reaction:
Lane 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutes

Fig. 3 1 µl Enzymlösung + Gemisch aus 490 µl Reaktions­ puffer + 9 µl Verdünnungslösung, Gemisch enthält 10 µg λ-DNA.
Das Substrat wird in befriedigender Geschwindig­ keit, jedoch langsamer abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion:
Bahn 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 Minuten Fig. 3 1 ul enzyme solution + mixture of 490 ul reaction buffer + 9 ul dilution solution, mixture contains 10 ug λ DNA.
The substrate is degraded at a satisfactory speed, but more slowly.
Time of termination of the reaction:
Lane 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutes

Fig. 4 1 µl EcoR1 mit 10% Tween® 20 + Gemisch aus 490 µl Reaktionspuffer + 9 µl Verdünnungslösung, Gemisch enthält 10 µg λ-DNA.
Das Substrat wird noch schneller als in Versuch 2 (Fig. 2) abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion:
Bahn 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 Minuten Fig. 4 1 µl EcoR1 with 10% Tween® 20 + mixture of 490 µl reaction buffer + 9 µl dilution solution, mixture contains 10 µg λ-DNA.
The substrate is broken down even faster than in experiment 2 ( FIG. 2).
Time of termination of the reaction:
Lane 1-10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutes

Fig. 5 1 µl EcoR1 mit 10% Tween® 20 + und 499 µl Reak­ tionspuffer, enthaltend 10 µg λ-DNA (ähnlich dem in Fig. 4 dargestellten Versuch, jedoch ohne Verdünnungspuffer).
Das Substrat wird in zu erwartender Geschwindig­ keit abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion:
Bahn 1-10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 Minuten Fig. 5 1 ul EcoR1 with 10% Tween® 20 + and 499 ul reaction buffer, containing 10 ug λ-DNA (similar to the experiment shown in Fig. 4, but without dilution buffer).
The substrate is broken down at the expected speed.
Time of termination of the reaction:
Lane 1-10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 minutes

Fig. 6 1 µl EcoR1 und 499 µl Reaktionspuffer, enthaltend 0,02% Tween® und 10 µg λ-DNA.
Das Substrat wird mindestens ebenso schnell wie bei dem Versuch gemäß Fig. 5 abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion:
Bahn 1-10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 Minuten Fig. 6 1 ul EcoR1 and 499 ul reaction buffer containing 0.02% Tween® and 10 ug λ DNA.
The substrate is broken down at least as quickly as in the experiment according to FIG. 5.
Time of termination of the reaction:
Lane 1-10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 minutes

Fig. 7 EcoR1, gemischt mit verschiedenen Mengen Tween® 20, so daß Enzymlösungen mit folgendem Tween®-Gehalt entstehen. Je 1 µl dieser Verdünnun­ gen in 499 µl Reaktionspuffer enthaltend 10 µg λ- DNA.
Bahn 1 + 2: EcoR1 mit 10% Tween® 20 (wie oben). Abbruch nach 20 und 60 Mi­ nuten.
Bahn 3 + 4: EcoR1 mit 2% Tween® 20 (wie oben). Abbruch nach 20 und 60 Mi­ nuten.
Bahn 5 + 6: EcoR1 mit 0,5% Tween® 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 7 + 8: EcoR1 mit 0,1% Tween® 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 9 + 10: EcoR1 ohne Tween® 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Deutlich ist zu erkennen, daß noch geringe Mengen Tween® 20 (0,1%) in der Enzymlösung die Reaktion ermöglichen. Fig. 7 EcoR1, mixed with different amounts of Tween® 20, so that enzyme solutions with the following Tween® content are formed. 1 µl each of these dilutions in 499 µl reaction buffer containing 10 µg λ-DNA.
Lane 1 + 2: EcoR1 with 10% Tween® 20 (as above). Termination after 20 and 60 minutes.
Lane 3 + 4: EcoR1 with 2% Tween® 20 (as above). Termination after 20 and 60 minutes.
Lane 5 + 6: EcoR1 with 0.5% Tween® 20. Termination after 20 and 60 minutes.
Lane 7 + 8: EcoR1 with 0.1% Tween® 20. Termination after 20 and 60 minutes.
Lane 9 + 10: EcoR1 without Tween® 20. Termination after 20 and 60 minutes.
It can be clearly seen that small amounts of Tween® 20 (0.1%) in the enzyme solution enable the reaction.

Fig. 8 EcoR1, gemischt mit verschiedenen Mengen Tri­ ton® X-100, so daß Enzymlösungen mit folgendem Triton®-Gehalt entstehen. Je 1 µl dieser Ver­ dünnungen in 499 µl Reaktionspuffer enthaltend 10 µg λ-DNA.
Bahn 1 + 2: EcoR1 mit 10% Triton® X-100. Ab­ bruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 3 + 4: EcoR1 mit 2% Triton® X-100. Ab­ bruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 5 + 6: EcoR1 mit 0,5% Triton® X-100. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 7 + 8: EcoR1 mit 0,1% Triton® X-100. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 9 + 10: EcoR1 ohne Triton® X-100. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Deutlich ist zu erkennen, daß Triton® X-100 die Reaktion zwar auch ermöglicht, jedoch in höherer Konzentration angewendet werden muß als Tween®. Fig. 8 EcoR1, mixed with different amounts of Tri ton® X-100, so that enzyme solutions with the following Triton® content are formed. 1 µl each of these dilutions in 499 µl reaction buffer containing 10 µg λ-DNA.
Lane 1 + 2: EcoR1 with 10% Triton® X-100. Abort after 20 and 60 minutes.
Lane 3 + 4: EcoR1 with 2% Triton® X-100. Abort after 20 and 60 minutes.
Lane 5 + 6: EcoR1 with 0.5% Triton® X-100. Termination after 20 and 60 minutes.
Lane 7 + 8: EcoR1 with 0.1% Triton® X-100. Termination after 20 and 60 minutes.
Lane 9 + 10: EcoR1 without Triton® X-100. Termination after 20 and 60 minutes.
It can be clearly seen that Triton® X-100 also enables the reaction, but must be used in a higher concentration than Tween®.

Fig. 9 Denaturierungshemmende Wirkung von Tween® 20.
Daß Tween® in erster Linie die Denaturierung des Enzyms verhindert, zeigen folgende Versuche:
Bahn 1-5: EcoR1 in Reaktionspuffer dosiert, der 0,02% Tween® 20 enthält, nor­ maler Verdau von λ-DNA. Abbruch nach 20, 30, 40, 60 Minuten.
Bahn 6-10: EcoR1 in Reaktionspuffer dosiert, dem 0,02% Tween® 20 erst 20 Se­ kunden danach zugegeben wurde. Zeiten wie Bahn 1-5. Die Aktivi­ tät des Enzyms ist bereits deut­ lich vermindert.
Bahn 11-15: Zugabe von Tween® 20 20 Minuten später, Aktivität von EcoR1 nahezu Null.
Bahn 16-20: Ohne Zugabe von Tween® 20.
Nach diesem Versuch verbessert Tween® 20 nicht die Wirkung des Enzyms, sondern verhindert ein Denatu­ rieren. Fig. 9 Denaturation-inhibiting effect of Tween® 20.
The following tests show that Tween® primarily prevents the denaturation of the enzyme:
Lane 1-5: EcoR1 dosed in reaction buffer containing 0.02% Tween® 20, normal digestion of λ-DNA. Termination after 20, 30, 40, 60 minutes.
Lane 6-10: EcoR1 dosed in reaction buffer to which 0.02% Tween® 20 was added only 20 seconds after. Times like lanes 1-5. The activity of the enzyme is already significantly reduced.
Lane 11-15: addition of Tween® 20 20 minutes later, activity of EcoR1 almost zero.
Lane 16-20: without adding Tween® 20.
After this experiment, Tween® 20 does not improve the effect of the enzyme, but prevents denaturation.

Claims (26)

1. Tensid-haltige Enzymlösung, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid aus der Gruppe nichtionogener Tenside ausgewählt ist und die Lösung einen Gehalt von minde­ stens 0,2% (w/v) Tensid aufweist, wobei eine Lösung von Dde1, EcoR1, Not1, Pvu1, Ssp1 oder Tha1 mit 0,2% (w/v) (Triton® X-100) und eine Lösung einer Polymerase mit 0,5% (w/v) Tween®20, Triton®X-100 oder Nonidet® P40 ausgenommen ist.1. surfactant-containing enzyme solution, characterized in that the surfactant is selected from the group of nonionic surfactants and the solution has a content of at least 0.2% (w / v) surfactant, a solution of Dde1, EcoR1, Not1, Pvu1, Ssp1 or Tha1 with 0.2% (w / v) (Triton® X-100) and a solution of a polymerase with 0.5% (w / v) Tween®20, Triton®X-100 or Nonidet® P40 is excluded. 2. Enzymlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 1% (w/v) nichtionogenes Tensid enthält.2. Enzyme solution according to claim 1, characterized in that that they have at least 1% (w / v) nonionic surfactant contains. 3. Enzymlösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 2% nichtionogenes Tensid enthält.3. Enzyme solution according to claim 2, characterized in that that it contains at least 2% non-ionic surfactant. 4. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Restriktionsenzym ist.4. enzyme solution according to claims 1 to 3, characterized characterized in that the enzyme is a restriction enzyme is. 5. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein thermostabiles Enzym ist.5. Enzyme solution according to claims 1 to 3, characterized characterized in that the enzyme is a thermostable enzyme is. 6. Enzymlösung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine DNA-Polymerase aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent- DNA-Polymerase ausgewählt ist.6. enzyme solution according to claim 5, characterized in that the enzyme is a DNA polymerase from the group consisting of Taq polymerase, pfu polymerase and Vent DNA polymerase is selected. 7. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe bestehend aus Triton®-X-100, Tween® und Noni­ det®P40 ausgewählt ist. 7. enzyme solution according to claims 1 to 6, characterized characterized in that the nonionic surfactant from the Group consisting of Triton®-X-100, Tween® and Noni det®P40 is selected.   8. Verwendung einer Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zudosiert.8. Use of an enzyme solution according to claims 1 to 7 to carry out an enzymatic reaction at the enzyme in a dilution of at least 1: 500 metered. 9. Verwendung einer Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert.9. Use of an enzyme solution according to claims 1 to 7 to carry out an enzymatic reaction at the enzyme using the microdosing system according to DE 197 37 173 A1 added. 10. Reaktionspuffer zur Durchführung enzymatischer Reaktio­ nen, bei denen man Enzym in einer Verdünnung von minde­ stens 1 : 500 und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersy­ stems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er mindestens 0,0001% (w/v), vorzugs­ weise mindestens 0,02% (w/v), nichtionogenes Tensid enthält.10. Reaction buffer for carrying out enzymatic reaction in which enzyme is diluted at least at least 1: 500 and / or using the microdosing system Stems metered in according to DE 197 37 173 A1, characterized records that it has at least 0.0001% (w / v), preferred wise at least 0.02% (w / v) nonionic surfactant contains. 11. Reaktionspuffer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich­ net, daß er mindestens 0,04% (w/v) nichtionogenes Tensid enthält.11. Reaction buffer according to claim 10, characterized in net that he has at least 0.04% (w / v) non-ionic Contains surfactant. 12. Reaktionspuffer nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe bestehend aus Triton®-X-100, Tween® und Noni­ det®P40 ausgewählt ist.12. Reaction buffer according to claim 10 or 11, characterized characterized in that the nonionic surfactant from the Group consisting of Triton®-X-100, Tween® and Noni det®P40 is selected. 13. Verwendung eines Reaktionspuffers, der mindestens 0,0001% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), nicht­ ionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Ver­ dünnung von mindestens 1 : 500 zudosiert.13. Use a reaction buffer that is at least 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), not contains ionic surfactant to carry out a enzymatic reaction in which one enzyme in a ver added at least 1: 500 thinning. 14. Verwendung eines Reaktionspuffers, der mindestens 0,0001% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), nich­ tionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 A1 zudosiert.14. Use a reaction buffer that is at least 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v)  and particularly preferably at least 0.04% (w / v), not contains ionic surfactant to carry out a enzymatic reaction, in which one enzyme with the help of Microdosing system according to DE 197 37 173 A1 metered. 15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe bestehend aus Triton®-X-100, Tween® und Nonidet®P40 ausgewählt ist.15. Use according to claim 13 or 14, characterized records that the nonionic surfactant from the group consisting of Triton®-X-100, Tween® and Nonidet®P40 is selected. 16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym für die enzymatische Reaktion ein Re­ striktionsenzym ist.16. Use according to claim 15, characterized in that that the enzyme for the enzymatic reaction is a Re is a restriction enzyme. 17. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein thermostabiles Enzym ist.17. Use according to claim 15, characterized in that that the enzyme is a thermostable enzyme. 18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine DNA-Polymerase aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent- DNA-Polymerase ausgewählt ist.18. Use according to claim 17, characterized in that that the enzyme is a DNA polymerase from the group consisting of Taq polymerase, pfu polymerase and Vent DNA polymerase is selected. 19. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reak­ tion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zu einer Substratlösung hin­ zugibt, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung eine Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 ist.19. Procedure for performing an enzymatic reac tion, in which one dilutes an enzyme solution of at least 1: 500 towards a substrate solution admits, characterized in that the enzyme solution is an enzyme solution according to claims 1 to 7. 20. Verfahren zum Dosieren von Enzymlösungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 137 A1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung eine Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 ist.20. Method for dosing enzyme solutions using the Microdosing system according to DE 197 37 137 A1, thereby characterized in that the enzyme solution is an enzyme solution according to claims 1 to 7. 21. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reak­ tion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zu einem Substrat-haltigen Reaktionspuffer hinzugibt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Reaktionspuffer verwendet, der mindestens 0,0001% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04% (w/v), nicht­ ionogenes Tensid enthält.21. Method for performing an enzymatic reac tion, in which one dilutes an enzyme solution of at least 1: 500 to a substrate-containing  Add reaction buffer, characterized in that one uses a reaction buffer that at least 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), not contains ionic surfactant. 22. Verfahren zum Dosieren von Enzymlösungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 137 A1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Reaktionspuffer ver­ wendet, der mindestens 0,0001% (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02% (w/v) und besonders bevorzugt minde­ stens 0,04% (w/v), nichtionogenes Tensid enthält.22. Method for dosing enzyme solutions using the Microdosing system according to DE 197 37 137 A1, thereby characterized in that a reaction buffer ver applies at least 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least contains at least 0.04% (w / v), non-ionic surfactant. 23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe bestehend aus Triton®-X-100, Tween® und Nonidet®P40 ausgewählt ist.23. The method according to claim 21 or 22, characterized records that the nonionic surfactant from the group consisting of Triton®-X-100, Tween® and Nonidet®P40 is selected. 24. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Restriktionsenzym ist.24. The method according to claims 19 to 23, characterized characterized in that the enzyme is a restriction enzyme is. 25. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein thermostabiles Enzym ist.25. The method according to claims 19 to 23, characterized characterized in that the enzyme is a thermostable enzyme is. 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent-DNA-Polymerase ausgewählt ist.26. The method according to claim 25, characterized in that the enzyme from the group consisting of Taq polymerase, pfu polymerase and Vent DNA polymerase is selected.
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