JP3853136B2 - μ3B gene deficient non-human animals - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、これを用いた強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞が正常に機能するためには、個々の構成タンパク質がその最終目的地である細胞内小器官に正しく輸送される必要があり、そのことは神経細胞においても例外ではなく、したがって、細胞内タンパク輸送の研究はさまざまな脳神経機能の発現メカニズムの解明や、神経疾患の病態を理解する上で重要と考えられている。細胞内で新たに合成された分泌タンパク質及び膜タンパク質は、小胞体、ゴルジ体を経てトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）へと運ばれ、ＴＧＮに到達したタンパク質は、そこで形質膜、エンドソーム、リソソームなどの最終目的地に振り分けられる。ＴＧＮから形質膜への輸送は恒常的かつ大量であり特にシグナルを必要としないデフォールトパスウェイであるのに対して、エンドソームやリソソームへの輸送は、この大きな流れにうち勝って選択的に行われるためのシグナルを必要とする。
【０００３】
各細胞内小器官を結ぶタンパク輸送は輸送小胞を介して行われると考えられており、形質膜及びＴＧＮの細胞質側にはクラスリン及びアダプタータンパク質（ＡＰ）複合体で覆われた領域があり、そこから輸送小胞の１種であるクラスリン被覆小胞が出芽する。上記ＡＰ複合体は４つのサブユニットから構成され、その１つであるμ鎖が膜タンパク質の細胞質側に存在するチロシン輸送シグナルに結合することにより、シグナルをもつ膜タンパク質の選択的輸送を行っている。近年同定されたＡＰ-３複合体には、全身性に発現するサブユニットβ３Ａ及びμ３Ａと、脳神経細胞特異的に発現するサブユニットβ３Ｂ及びμ３Ｂが存在し（J.Cell Biol. 145:923-926,1999）、これらβ３Ｂ及びμ３Ｂを含むＡＰ-３Ｂはインビトロの実験から何らかの重要な高次神経機能に関わっている可能性が示唆された（Cell 93:423-432,1998）が、その詳細は明らかでなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、μ３Ｂノックアウトマウス等のμ３Ｂ遺伝子が欠損した、体位転換や音刺激に反応して重積性の強直間代痙攣やてんかん発作症状を呈する非ヒト動物や、これを用いた強直間代痙攣抑制剤や抗てんかんのスクリーニング方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＡＰ-３Ｂの個体レベルでの機能を解析するために、そのサブユニットであるμ３Ｂノックアウトマウスを作製し、その性状について種々調べたところ、そのメカニズムは明らかではないが、かかるμ３Ｂノックアウトマウスが体位転換や音刺激に反応して重積性の強直間代痙攣やてんかん発作症状を呈することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の、体位転換に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈するモデル動物としての使用方法（請求項１）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の、音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈するモデル動物としての使用方法（請求項２）や、非ヒト動物が、標識物質遺伝子の発現能を有することを特徴とする請求項１又は２記載の使用方法（請求項３）や、非ヒト動物が、相同組み換え体のスクリーニングの際に用いた薬剤耐性遺伝子が除去されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の使用方法（請求項４）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の使用方法（請求項５）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項５記載の使用方法（請求項６）に関する。
【０００７】
また本発明は、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物における強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項７）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物及び野生型非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物と野生型非ヒト動物とにおける強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・比較評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項８）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項９）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物及び野生型非ヒト動物から得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・比較評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項１０）や、野生型の非ヒト動物が、μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同腹の野生型の非ヒト動物であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項１１）に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明におけるμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物としては、μ３Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化され、μ３Ｂを発現する機能を失った非ヒト動物であれば特に制限されるものではないが、蛍光標識物質遺伝子の発現能を有する非ヒト動物や、相同組み換え体のスクリーニングの際に用いた薬剤耐性遺伝子が除去されている非ヒト動物が好ましい。また本発明における遺伝子欠損非ヒト動物としては、μ３Ｂ遺伝子等の神経系特異的ＡＰ複合体サブユニットを構成する遺伝子などの非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により人為的に不活性化され、体位転換や音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈する非ヒト動物であれば特に制限されるものではない。
【０００９】
また、本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物が好ましい。そして、μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、μ３Ｂ欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。これら非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。以下、非ヒト動物がマウスの場合、すなわちμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物がμ３Ｂノックアウトマウスの場合を例にとってその作製法を説明する。
【００１０】
μ３Ｂノックアウトマウスの作製法としては、μ３Ｂを発現する機能を失ったノックアウトマウスを作製することができる方法であればどのような作製法でもよい。例えば、ラットμ３ＢのｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、μ３ＢのゲノムＤＮＡの遺伝子を単離し、エキソン部分とその周囲のイントロンを、選択マーカー遺伝子に置換してターゲッティングベクターを作製し、作製されたターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞クローンを選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。このＥＳ細胞クローンを用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するμ３Ｂノックアウトマウス及び同腹の野生型マウスを作製することができる。
【００１１】
上記ターゲットベクターにおける選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性（ＮＥＯR）遺伝子、ハイグロマイシンＢ遺伝子等各種薬剤耐性遺伝子、マウス体内におけるμ３Ｂ遺伝子の発現及びその場所がわかるＧＦＰ (Green Fluorescence Protein）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等の蛍光あるいは発色による標識物質遺伝子、所定の位置ではないランダムな組み換え体を排除するための単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を例示することができる。また、その両側にlox P配列が付加されたＮＥＯR遺伝子等を用いて作製したノックアウトマウスを、卵母細胞特異的にcre遺伝子を発現するトランスジェニックマウスと交配することにより、ＮＥＯR遺伝子がゲノム上より除去されたノックアウトマウスを作製することができる。さらに、これら作製したノックアウトマウスと、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子等が導入されたトランスジェニックマウスと交配することにより、μ３Ｂ遺伝子欠損不死化細胞株が得られるノックアウトマウスを作製することもできる。
【００１２】
本発明の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法としては、上記のμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したμ３Ｂノックアウトマウス等の非ヒト動物や、体位転換や音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈する非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物又はにおける強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、分析・評価に際しては対照としての野生型非ヒト動物の分析結果と比較評価することが好ましい。上記投与方法としては、経口投与、静脈注射等を具体的に例示することができる。また、強直間代痙攣又はてんかん症状の程度の分析は、被検非ヒト動物や対照としての被検野生型非ヒト動物の痙攣や発作の状況を目視により観察することにより、あるいはこれら非ヒト動物の脳波を測定することにより行うことができる。
【００１３】
また、本発明の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤の他のスクリーニング方法としては、上記のμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したμ３Ｂノックアウトマウス等の非ヒト動物や、体位転換や音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈する非ヒト動物の海馬、大脳皮質、小脳、嗅球等から常法により単離して得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、脳神経細胞として不死化した樹立細胞を用いることが好ましい。また、分析・評価に際しては対照としての野生型非ヒト動物の脳神経細胞における分析結果と比較評価することが好ましい。上記インビトロでの接触は、脳神経細胞の液相培養条件下等で通常行うことができる。また、上記該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度の分析は、該脳神経細胞における神経伝達物質の放出量を電気生理学的に計測することにより行うことができる。
【００１４】
上記スクリーニング方法により得られる強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤は、強直間代痙攣やてんかん発症のメカニズムを解明する上で重要であるばかりでなく、強直間代痙攣やてんかんを発症した患者の治療薬、症状改善薬剤又は予防薬としての使用の可能性が十分期待できる。
【００１５】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［マウスμ３Ｂ遺伝子の調製］
ラットμ３Ｂ遺伝子ｃＤＮＡ（米スタンフォード大R. Scheller博士より供与）をプローブとして、マウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社）およびマウスゲノムＤＮＡライブラリー（Stratagene社）から単離したマウスμ３ＢｃＤＮＡ及びマウスμ３ＢゲノムＤＮＡを以下のμ３Ｂノックアウトマウスの作製に用いた。配列表の配列番号１にマウスｃＤＮＡの塩基配列を、また配列番号２にそのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
［ターゲッティングベクターの構築］
マウスμ３Ｂ遺伝子のエキソン１の翻訳開始コドンから上流約５００塩基のところにあるEco RI部位までを、配列番号３で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号４で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。次に、ＧＦＰ遺伝子（Clontech社）を配列番号５で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号６で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。上記配列番号４で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーの３′側と、配列番号５で示される塩基配列よりなるセンスプライマーの５′側とは相補的配列となっていることから、上記２つの増幅産物（ＤＮＡ断片）を鋳型とし、上記配列番号３で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号６で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅することにより、μ３ＢとＧＦＰとの読み枠があった状態の融合ＤＮＡ断片を得た。
【００１７】
人為的にSal I部位を除去したpBluescript II SK（Stratagene社）のEco RI-Hind III部位に上記融合ＤＮＡ断片を挿入した。得られたコンストラクトのEco RI部位にエキソン１の５′上流の約３ｋｂのEco RI断片を挿入した。次いで、このコンストラクトにおけるＧＦＰ配列の３′側に位置するSph IとHind III部位に、pl2-neo（米国立衛生局 H. Gu博士より供与）からSph IとHind IIIで切り出した、lox P-ＮＥＯR-lox P遺伝子断片を挿入した。こうして得られたコンストラクトをlox P-ＮＥＯR-lox P遺伝子断片下流のSal IおよびCla I部位で切断し、その部位に以下のようにして調製した２つのＤＮＡ断片、すなわち、エキソン１の下流の約１．５ｋｂのEco RI断片及びＨＳＶ-ｔｋ遺伝子を同時に挿入することによりターゲッティングベクターを構築した。上記エキソン１の下流の約１．５ｋｂのEco RI断片は、pBluescript II SKのEco RIにサブクローンし、Eco RIの両側のSal IとSpe Iで切ることによりSal I−Spe I断片として調製した。また、ＨＳＶ-ｔｋ遺伝子は、plC19R-MC1-TK（ユタ大学K. Thomas博士より供与）からEco RIとHind IIIでＨＳＶ-ｔｋ遺伝子を切り出し、pBluescript II SKのEco RIとHind III部位に挿入後、さらに同じEco RI部位にpMC1 neo (Stratagen社）のMC1プロモーター領域を含むEco RI断片を挿入して得られたインサート全体をSpe I-Cla I断片として調製した。
【００１８】
［相同組換え体のスクリーニング］
このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞株Ｅ１４に導入し、ネオマイシン耐性ＥＳクローンをＧ４１８及びＧＡＮＣ(ガンシクロビア)によって選択し、２つのプローブ（Ｌ、Ｓ）を用いてサザンブロット法によりスクリーニングし、相同組換えによりμ３Ｂ遺伝子の片方に変異が導入されたＥＳ細胞クローンを得た。上記プローブＬとしては、図１に示すμ３ＢゲノムＤＮＡの約５００ｂｐのEcoR I-Ssp I断片を用いた。またプローブＳとしては、μ３ＢゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号８で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーにより得られるＰＣＲ増幅産物を用いた。サザンブロットの結果を図２に示す。
【００１９】
［ノックアウトマウスの作製］
得られたＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に顕微注入し、処置後の胚盤胞を偽妊娠状態にしたメスＢＤＦ１マウスの子宮に移植することにより、キメラマウスを得た。このキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配して、μ３Ｂ遺伝子変異をヘテロにもつマウスを得、それらを交配することによりμ３Ｂ遺伝子変異をホモにもつμ３Ｂ欠損マウスを得た。このμ３Ｂノックアウトマウスにμ３Ｂの発現がないことは、配列番号９で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号１０で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより確認した。また、ＲＴ−ＰＣＲのコントロールのアクチン（actin）プライマーとして、配列番号１１で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号１２で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いた。結果を図３に示す。得られたμ３Ｂノックアウトマウスと、卵母細胞特異的にcre遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（大阪大学宮崎純一博士から供与）と交配することにより、ＮＥＯR遺伝子がゲノム上より除去されたノックアウトマウスを樹立した。このノックアウトマウスの脳におけるＧＦＰの発現を解析し、海馬、大脳皮質、小脳、嗅球等における特定の細胞群に発現を確認した。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のμ３Ｂノックアウトマウス等のμ３Ｂ遺伝子欠損非ヒト動物は、体位転換や音刺激に反応して重積性の強直間代痙攣又はてんかん症状を呈することから、本発明のμ３Ｂ遺伝子欠損非ヒト動物を用いると、強直間代痙攣やてんかん発症のメカニズムを解明することが期待できる。また、本発明のμ３Ｂ遺伝子欠損非ヒト動物を用いるスクリーニング方法により得られる強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤は、強直間代痙攣やてんかんを発症した患者の治療薬、症状改善薬剤又は予防薬としての使用の可能性が十分期待できる。
【００２１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のμ３Ｂノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。
【図２】相同組換え体のスクリーニングにおけるサザンブロットの結果を示す図である。
【図３】本発明のμ３Ｂノックアウトマウスがμ３Ｂを発現しないことを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a non-human animal deficient in μ3B gene function on the chromosome, and a screening method for tonic clonic spasm inhibitors or antiepileptic agents using the same.
[0002]
[Prior art]
In order for cells to function properly, individual constituent proteins must be correctly transported to their final destination, the organelle, which is no exception in neurons, and therefore Transport studies are thought to be important for elucidating the mechanism of expression of various cranial nerve functions and understanding the pathology of neurological diseases. Secreted proteins and membrane proteins newly synthesized in the cell are transported to the trans-Golgi network (TGN) via the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus, and the proteins that have reached the TGN are the final ones such as the plasma membrane, endosome, and lysosome. Sorted to the destination. Transport from the TGN to the plasma membrane is a constant pathway that is constant and massive, and does not require a signal in particular. On the other hand, transport to endosomes and lysosomes is performed selectively overcoming this large flow. Need a signal.
[0003]
It is thought that protein transport linking each organelle is performed via transport vesicles, and there are regions covered with clathrin and adapter protein (AP) complexes on the cytoplasmic side of plasma membrane and TGN. From there, the clathrin-coated vesicle, which is one of the transport vesicles, buds. The AP complex is composed of four subunits, one of which is a μ chain that binds to a tyrosine transport signal present on the cytoplasmic side of the membrane protein, thereby selectively transporting the membrane protein with the signal. Yes. Recently identified AP-3 complexes include subunits β3A and μ3A expressed systemically and subunits β3B and μ3B expressed specifically in brain neurons (J. Cell Biol. 145: 923-926). , 1999), it was suggested that AP-3B containing β3B and μ3B may be involved in some important higher-order nerve functions from in vitro experiments (Cell 93: 423-432, 1998). It was not clear.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a non-human animal that exhibits a cumulative tonic-clonic convulsions or epileptic seizure symptoms in response to position change or sound stimulation, such as a μ3B knockout mouse, or a tonicity using the same. The purpose is to provide screening methods for clonic spasms and antiepileptic drugs.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to analyze the function of AP-3B at the individual level, the present inventors have produced a subunit, μ3B knockout mouse, and investigated various properties thereof. The present inventors have found that μ3B knockout mice exhibit accumulative tonic-clonic convulsions and epileptic seizure symptoms in response to position change and sound stimulation, and have completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention relates to a method of using a non- human animal deficient in the chromosomal function of μ3B gene as a model animal that exhibits tonic clonic convulsions or epilepsy in response to a change of position (claim 1), or a μ3B gene. A method for using a non-human animal deficient in function on a chromosome as a model animal that exhibits tonic-clonic convulsions or epilepsy symptoms in response to sound stimulation (claim 2), or a non-human animal that expresses a marker gene The use method according to
[0007]
The present invention also provides a tonicity characterized by administering a test substance to a non-human animal deficient in the chromosome of the μ3B gene function and analyzing and evaluating the degree of tonic clonic convulsions or epilepsy symptoms in the non-human animal. A screening method for a clonic anticonvulsant or an antiepileptic agent (Claim 7 ), a test substance administered to a non-human animal and a wild-type non-human animal deficient in the chromosome of the μ3B gene function , and the non-human animal A screening method for tonic-clonic convulsions or anti-epileptic drugs characterized by analyzing and comparing the degree of tonic-clonic convulsions or epilepsy symptoms in wild-type non-human animals (claim 8 ), and μ3B gene function There contacting the nerve cells and the test material obtained from non-human animals deficient on its chromosome in vitro secretion systems and / or endocytosis in the brain neurons Selective protein screening methods tonic-clonic convulsions inhibitors or antiepileptics degree of transportability, characterized in that the analysis and evaluation (Claim 9) and a non-human animal μ3B gene function is deficient on its chromosome definitive And in vitro contact between a brain neuron obtained from a wild-type non-human animal and a test substance, and analyzing and comparing and evaluating the degree of selective protein transport ability in the secretory system and / or endocytosis in the brain neuron. A screening method for a tonic-clonic spasm suppressant or antiepileptic agent characterized by claim 10 or a wild-type non-human animal is a wild-type non-human animal that is the same as a non-human animal deficient in the μ3B gene function. A method for screening an ankylosing clonic spasm inhibitor or antiepileptic agent according to any one of claims 7 to 10 (claim 11), The
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As a non-human animal in which the μ3B gene function in the present invention is deficient on the chromosome, the endogenous gene of the non-human animal encoding μ3B is inactivated by destruction, deletion, replacement, etc., and loses the function to express μ3B. It is not particularly limited as long as it is a non-human animal, but a non-human animal having the ability to express a fluorescent labeling substance gene or a non-human animal from which the drug resistance gene used in the screening for homologous recombinants has been removed Is preferred. In addition, the gene-deficient non-human animal in the present invention is artificially unintentionally caused by disruption, deletion, or replacement of endogenous genes of non-human animals such as a gene constituting a nervous system-specific AP complex subunit such as μ3B gene. It is not particularly limited as long as it is a non-human animal that is activated and exhibits tonic clonic convulsions or epilepsy symptoms in response to body position change or sound stimulation.
[0009]
Moreover, the wild-type non-human animal in the present invention means an animal of the same species as the above-mentioned non-human animal deficient in the μ3B gene function. And, as non-human animals deficient in μ3B gene function, those born according to Mendel's law can obtain wild type that is the same as μ3B deficient type, and use these to conduct accurate comparative experiments. It is preferable at the point which can do. Specific examples of these non-human animals include, but are not limited to, rodents such as mice and rats. Hereinafter, the production method will be described by taking as an example the case where the non-human animal is a mouse, that is, the case where the non-human animal deficient in μ3B gene function on the chromosome is a μ3B knockout mouse.
[0010]
As a method for producing a μ3B knockout mouse, any method can be used as long as it is a method capable of producing a knockout mouse that has lost the function of expressing μ3B. For example, mouse genomic DNA library is screened using rat μ3B cDNA as a probe, gene of μ3B genomic DNA is isolated, and exon part and surrounding intron are replaced with selectable marker gene to produce a targeting vector Then, the prepared targeting vector is introduced into ES cells by electroporation or the like, and ES cell clones that have undergone homologous recombination are selected. It is preferable to confirm whether or not the selected ES cell is the target recombinant by Southern blotting or the like. Using this ES cell clone, a germline chimeric mouse is produced and crossed with a heterozygous mouse (F1: hybrid first generation) obtained by mating with a wild-type mouse to produce according to Mendel's law. Μ3B knockout mice and littermate wild type mice can be produced.
[0011]
As the selection marker gene in the above target vector, various drug resistance genes such as neomycin resistance (NEO R ) gene, hygromycin B gene, GFP (Green Fluorescence Protein) gene which can express the expression and location of μ3B gene in the mouse body, β- Illustrative examples include a labeling substance gene such as a galactosidase gene by fluorescence or color development, a herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene for eliminating a random recombinant that is not in a predetermined position, and a diphtheria toxin A fragment gene. . In addition, by crossing a knockout mouse prepared using the NEO R gene or the like with lox P sequences added on both sides thereof with a transgenic mouse that expresses the cre gene specifically in the oocyte, the NEO R gene is Knockout mice removed from above can be prepared. Furthermore, by knocking these prepared knockout mice with a transgenic mouse into which the SV40 large T antigen gene or the like has been introduced, a knockout mouse from which a μ3B gene-deficient immortalized cell line can be obtained can also be prepared.
[0012]
As a screening method for the tonic-clonic spasm inhibitor or antiepileptic agent of the present invention, the above-mentioned μ3B gene function is non-human animal such as μ3B knockout mouse deficient on the chromosome, or tonicity in response to body position change or sound stimulation. The screening method is not particularly limited as long as it is a screening method in which a test substance is administered to a non-human animal exhibiting clonic convulsions or epilepsy symptoms, and the degree of tonic clonic convulsions or epilepsy symptoms in the non-human animals or is analyzed and evaluated. However, in the analysis / evaluation, it is preferable to compare and evaluate with the analysis result of the wild-type non-human animal as a control. Specific examples of the administration method include oral administration and intravenous injection. In addition, analysis of the degree of tonic-clonic convulsions or epilepsy symptoms can be done by visually observing the state of convulsions or seizures in test non-human animals or test wild-type non-human animals as controls, or in these non-human animals. This can be done by measuring the electroencephalogram.
[0013]
In addition, other screening methods for the tonic-clonic spasm suppressor or antiepileptic agent of the present invention include non-human animals such as μ3B knockout mice in which the above-mentioned μ3B gene function is deficient on the chromosome, or posture change and sound stimulation. In vitro contact between a cranial nerve cell obtained by isolation from the hippocampus, cerebral cortex, cerebellum, olfactory bulb, etc. of a non-human animal that exhibits ankylosing clonic convulsions or epilepsy symptoms, and the test substance Although it is not particularly limited as long as it is a screening method that analyzes and evaluates the degree of selective protein transport ability in the secretory system and / or endocytosis, it is preferable to use immortalized established cells as brain neurons. Further, in the analysis / evaluation, it is preferable to make a comparative evaluation with the analysis result in the brain neurons of a wild type non-human animal as a control. The contact in vitro can be usually performed under conditions of liquid phase culture of brain neurons. Further, the analysis of the degree of selective protein transport ability in the secretory system and / or endocytosis in the brain neuron can be performed by electrophysiologically measuring the amount of neurotransmitter released in the brain neuron. .
[0014]
The tonic-clonic seizure inhibitor or antiepileptic agent obtained by the above screening method is not only important for elucidating the mechanism of tonic-clonic convulsions and epileptic onset, but also for patients with tonic-clonic convulsions and epilepsy. The possibility of use as a therapeutic agent, a symptom improving agent or a prophylactic agent can be sufficiently expected.
[0015]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Preparation of mouse μ3B gene]
Mouse μ3B cDNA and mouse μ3B genomic DNA isolated from mouse brain cDNA library (Stratagene) and mouse genomic DNA library (Stratagene) were probed with rat μ3B gene cDNA (provided by Dr. R. Scheller, Stanford University). It used for preparation of the following μ3B knockout mice. The nucleotide sequence of mouse cDNA is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
[0016]
[Construction of targeting vector]
From the translation start codon of
[0017]
The fusion DNA fragment was inserted into the Eco RI-Hind III site of pBluescript II SK (Stratagene) from which the Sal I site was artificially removed. An approximately 3 kb Eco RI fragment 5 'upstream of
[0018]
[Screening of homologous recombinants]
This targeting vector was introduced into the ES cell line E14 by electroporation, neomycin resistant ES clones were selected by G418 and GANC (ganciclovir), screened by Southern blotting using two probes (L, S), An ES cell clone having a mutation introduced into one of the μ3B genes by homologous recombination was obtained. As the probe L, an approximately 500 bp EcoR I-Ssp I fragment of μ3B genomic DNA shown in FIG. 1 was used. As the probe S, a PCR amplification product obtained using a sense primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and an antisense primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 using μ3B genomic DNA as a template. The result of Southern blot is shown in FIG.
[0019]
[Production of knockout mice]
The obtained ES cell clone was microinjected into a blastocyst of a C57BL / 6 mouse, and the treated blastocyst was transplanted into the uterus of a female BDF1 mouse in a pseudopregnant state to obtain a chimeric mouse. This chimeric mouse was crossed with a C57BL / 6 mouse to obtain a mouse having a μ3B gene mutation heterozygously, and by crossing them, a μ3B-deficient mouse having a μ3B gene mutation homozygous was obtained. The absence of expression of μ3B in this μ3B knockout mouse was confirmed by RT-PCR using a sense primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and an antisense primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. Further, as a RT-PCR control actin primer, a sense primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and an antisense primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 were used. The results are shown in FIG. By crossing the obtained μ3B knockout mouse with a transgenic mouse (provided by Dr. Junichi Miyazaki, Osaka University) that expresses the cre gene in an oocyte-specific manner, a knockout mouse from which the NEO R gene has been removed from the genome is obtained. Established. The expression of GFP in the brain of this knockout mouse was analyzed, and the expression was confirmed in specific cell groups in the hippocampus, cerebral cortex, cerebellum, olfactory bulb and the like.
[0020]
【The invention's effect】
Since the μ3B gene-deficient non-human animal such as the μ3B knockout mouse of the present invention exhibits an accumulative tonic-clonic convulsions or epilepsy symptoms in response to position change or sound stimulation, the μ3B gene-deficient non-human animal of the present invention Can be expected to elucidate the mechanisms of tonic-clonic convulsions and epilepsy. In addition, the tonic-clonic spasm suppressant or antiepileptic agent obtained by the screening method using the μ3B gene-deficient non-human animal of the present invention is a therapeutic agent, symptom-improving drug or preventive drug for patients who developed tonic-clonic spasm or epilepsy. The possibility of use as is fully expected.
[0021]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a gene map of a μ3B knockout mouse and a wild type mouse of the present invention.
FIG. 2 shows the results of Southern blotting in screening for homologous recombinants.
FIG. 3 shows that μ3B knockout mice of the present invention do not express μ3B.
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