JP3848055B2

JP3848055B2 - Method for producing cyclodextrin

Info

Publication number: JP3848055B2
Application number: JP2000151056A
Authority: JP
Inventors: 健山本; 正保高田; 秀幸住吉; 真奈美大石; 貴啓井出; 剛裕海野; 幹男山本
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2020-05-23
Also published as: JP2001327299A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19、以下CGTaseという）を用いるα-、β-及びγ-シクロデキストリン（以下CDという）の混合物の製造方法に関する。
【０００２】
CGTase（ EC 2.4.1.19）は澱粉などのα-1,4-グルカンに作用し、その分子内転移活性により環状α-1,4-グルカンであるシクロデキストリン（CD）を生成させる酵素である。CGTaseにより生成されるCD の重合度は主として6 〜 8 であり、それぞれα-、β-及びγ-CDと呼ばれる。このCD生成反応とは別にCGTase は、分子間転移反応を通して、カップリング反応（CD を開環させ、生じる直鎖オリゴ糖を受容体糖分子に転移させる）や不均化反応（受容体糖分子に直鎖オリゴ糖を転移させる）を触媒する。さらに、CGTaseは微弱ながらα-1,4-グルコシド結合の加水分解反応も触媒する。
【０００３】
CD は多くの分子と包接物を作り、その化学的・物理的諸性質を変化させる事が可能である為、CGTase は食品、医薬、化粧品産業において重要な酵素として位置付けられている。その為、1939 年バチルスマセランス（Bacillus macerans）酵素によるCD 合成反応に始り（E. B. Tilden and S. J. Pirt, J. Am. Chem. Soc., 63, 2900-2902, 1939）、その後、CGTase生産菌の検索や酵素の精製なども含め、多くの研究がなされてきた（Sumio Kitahata, Naoto Tsuyama and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (2), 387-393, 1974 、Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (12), 2413-2417, 1974、Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, J. Jap. Soc. Starch Sci., 29 (1), 13-18, 1982 、Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Katsube, Denpun Kagaku, 38 (2), 141-146, 1991、Lionel J. Bovetto, Daniel P. Backer, Jaques R. Villette, Philippe J. Sicard, and Stephane J-L. Bouquelet, Biotechnology and Applied Biochemstry, 15, 48-58, 1992、Shinske Fujiwara, Hirofumi Kakihara, Kim Myung Woo, Andre Lejeune, Mitsuhide Kanemoto, Keiji Sakaguchi, and Tadayuki Imanaka, Applied and environmental microbiology, 58 (12), 4016-4025, 1992 、Florian Binder, Otto Huber and August Bock, Gene, 47, 269-277, 1986、Keiji Kainuma, Toshiya Takano and Kunio Yamane, Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 149-153, 1987、Takahiro Kaneko, Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi, J. general Microbiology, 134, 97-105, 1988、Murai Makela, Pekka Mattsson, M. Eugenia Schinina, and Timo Korpela, Biotechnology and Applied biochemistry, 10, 414-427, 1988、Ernest K. C. Yu, Hiroyuki Aoki, and Masanaru Misawa, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, 377-379, 1988）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
CGTase はその合成する主CDの種類によってα-、β-CGTase及びγ-CGTaseとして分類される。過去に報告された多くはα-あるいはβ- CGTaseであり、γ-CGTase として報告されている酵素は数少ない（Shigeharu Mori, Susumu Hirose, Takaichi Oya, and Sumio Kitahata, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994、Yoshito Fujita, Hitoshi Tsubouchi, Yukio Inagi, Keiji Tomita, Akira Ozaki, and Kazuhiro Nakanishi, J. Fermentation and Bioengineering, 70 (3), 150-154, 1990、Takashi Kato and Koki Horikoshi, J. Jpn. Soc. Starch Sci., 33 (2), 137-143, 1986）。
【０００５】
γ-CGTaseとして報告されている酵素はあるが、実際には、γ-CGTaseといってもβ-CDとγ-CDとを弊産する酵素が一般的であり、γ-CD生成量が5 %以下であったり、あるいは反応後期にβ-CDの生成速度が加速し、γ-CDと同量若しくはそれ以上のβ-CDが生成するものであった。また、10 %以上の基質濃度では著しくγ-CDの生産量が低下する酵素もあり、その対策として反応液中にエタノールを共存させる必要がある等、工業的な利用が難しい酵素が多い。
【０００６】
また、α-あるいはβ-CGTase の構造遺伝子を改変し、γ-CDの生成量を改善する試みも行われている（Akira Nakamura, Keiko Haga, and Kunio Yamane, Biochemstry, 32, 6624-6631, 1993、Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994）。このような遺伝子組換え酵素は、確かにγ-CD生成量が増強されたものであるが、γ-CD生成量が増加しても元来の活性で生ずるβ-CDを顕著に減少することはできず、生成物はγ-CDとβ-CDとの混合物となる。そのため、γ-CDを製造するためには、さらに、精製工程が必要となり、工業的観点からは、依然として充分な方法とはいえなかった。
【０００７】
それ故、γ-CDは市販はされているが、α-CD及びβ-CDに比べて高価であり、α-CD及びβ-CDが広範に利用されているのに対して、γ-Cの利用分野は極限られているのが現状である。
【０００８】
ところで、CDはその重合度により包接できる物質が異なることが知られている。
例えば、様々な物質の混合物である飲食品へCDを利用する場合、α-、β-またはγ-CDの包接特性を考慮し、そのCDバランスを調整することが好ましい。β-CDは、ワサビの辛味成分であるアリルチオシアネートを良好に包接し安定性や風味のバランスを改良することが可能である。しかし、α-及びγ-CDにはこのような効果はあまり期待できない。また、α-CDは、水と植物油脂分の乳化作用が認められる。しかし、β-及びγ-CDにはこのような効果はあまり期待されない。また、天然色素であるルチンは、良好な黄色を呈する着色料の一つであるが、退色しやすく安定性に欠ける。γ-CDは、ルチンと包接することにより安定性や水溶性を改良することが可能である。ルチン以外にもフラボノイド類、カテキン類、アントシアニン系色素、高度不飽和脂肪酸（例えば、ＥＰＡ、ＤＨＡ等）も、γ-CDにより安定性や水溶性等の物性を改良することが可能である。しかし、α-及びβ-CDにはこれらの効果はあまり期待できない。
【０００９】
このようにα-、β-及びγ-CDはそれぞれ包接特性が異なり、この点を考慮して、それぞれが最も効果的に作用する濃度に調整することで、食品等に好ましい特性を付与することができる。例えば、ワサビ風味のソフトクリームやドレッシングなどは、ワサビ風味と乳化作用の双方の安定化をはかることが可能となる。同様に、ルチンを用いた黄色のソフトクリームなどは色素と乳化作用の双方の安定化をはかることが可能となる。しかしながら、これまでは、γ-CDの大量生産方法が確立されていなかったため、α-、β-及びγ-CDを所望の組成比で含むCD混合物を入手することが困難であった。
【００１０】
CD混合物としてCD含有シラップが広く実用されている。しかし、CD含有シラップは、調製する際に用いるCGTaseがα-、β-あるいはγ-CGTaseのいずれであるかによってそのCD組成が決定されてしまう。上述のように、α-あるいはβ-CDを主成分とするCDシラップは工業的に容易に生産できるが、γ-CDを主成分とするCDシラップは安価に製造ができずなかった。そのため、所望のCDバランスを有する(特にγ-CDがリッチな)CDシラップの調製はこれまで困難であった。
【００１１】
そのため、例えば、β-CD及びγ-CDを含むCDシラップ(γ-CD含有量が少ない)を使用する場合、所定量のγ-CDを添加しようとすると、β-CD量が過剰になってしまう。β-CD量が過剰になると、例えばワサビ風味のソフトクリームではβ-CDの包接が強すぎワサビ風味が減じてしまう。逆に、β-CD過剰を避けようとしてβ-CD量を適量にすると、黄色のルチン入りソフトクリームではγ-CDの含量が少な過ぎてルチンの安定性が弱くなってしまう。このように、各食品に最適なCDバランスを有するCDシラップ等のCD混合物が使用でなきないと、飲食品の嗜好性が減じてしまう。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、α-、β-及びγ-CDのバランスを適宜変更可能なα-、β-及びγ-CDの混合物を製造する方法を提供することにある。加えて本発明の目的は、所望のCDバランス（α-CD、β-CD及びγ-CGの組成比）を有するCDシラップの製造方法を提供することにある。
【００１３】
そこで本発明者らは、これまで見出されていないγ-CDを極めて優先的に生産するCGTaseの生産能を有する微生物を広く自然界に求め探索を試みたところ、バチルスクラーキ種に属するものと認められる菌株の中に、γ-CDを優先的に生成できるCGTase生産能を有する新規な菌株を見出した。そしてこの微生物から生産された新規CGTaseと他の起源のCGTaseを使用して所望のCDバランス（α-、β-及びγ-CDバランス）を有するCDの工業的製造法を確立し、本発明を完成した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下のとおりである。
[請求項１]澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ及びバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを同時に反応させてα-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン及びγ-シクロデキストリンを生成させることを特徴とするα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物の製造方法(第1の製造方法)。
[請求項２]澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反応させ、次いでバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反応させてα-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン及びγ-シクロデキストリンを生成させることを特徴とするα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物の製造方法(第2の製造方法)。
[請求項３]澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反応させ、次いでバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反応させてα-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン及びγ-シクロデキストリンを生成させることを特徴とするα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物の製造方法(第3の製造方法)。
[請求項４]バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが下記の酵素化学的性質を有するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
▲１▼作用及び基質特異性：澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用し、主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低い。
▲２▼至適pH：10.5-11.0
▲３▼至適温度：60 ℃付近
▲４▼安定pH：6-11
▲５▼温度安定性：50 ℃、15 分間処理で90 % 以上の残存活性を示す。
[請求項５]バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼはγ-シクロデキストリンの生成量がβ-及びα-シクロデキストリンの生成量に比べて低いシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項６]シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼがバチルス(Bacillus)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、クレブシエラ(klebsiella)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、サーモアナエロバクター(Thremoanaerobactor) 属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項５に記載の製造方法。
[請求項７]γ-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、α-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となり、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となるように、反応条件を設定する請求項１〜６いずれか一項に記載の製造方法。
[請求項８] α-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜1.5の範囲となり、γ-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となるように、反応条件を設定する請求項１〜６いずれか一項に記載の製造方法。
[請求項９]生成したα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物を含有する溶液を精製してシクロデキストリン混合物シラップを得る請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項１０]生成したα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物を含有する溶液を精製してシクロデキストリン混合物シラップを得、得られたシラップを乾燥してシクロデキストリン混合物粉末を得る請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項１１]請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により得られたシクロデキストリン混合物を含有する飲食品の製造方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の第1〜第3のいずれの製造方法においても、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ及びバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを用いる。
[バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTase]
本発明で用いるバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseは、γ-CDをα-及びβ-CDに比べて優先的に生成するCGTaseである。そのようなCGTaseとしては、下記の酵素化学的性質を有するCGTaseを挙げることができる。
▲１▼作用及び基質特異性：澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用し、主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低い。
▲２▼至適pH：10.5-11.0
▲３▼至適温度：60 ℃付近
▲４▼安定pH：6-11
▲５▼温度安定性：50 ℃、15 分間処理で90 % 以上の残存活性を示す。
【００１６】
上記酵素化学的性質を有するCGTaseは、例えば、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-7156として寄託されているバチルスクラーキ7364株を利用して製造することができる。
上記バチルスクラーキ7364株を利用してCGTaseを製造する為には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産する為に必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養素等を含有する合成培地又は天然培地中でこれを培養する。炭素源としては、澱粉またはその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα-澱粉等の炭水化物が利用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロースなどが挙げられる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカーあるいは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。無機塩類としては、リン酸1カリウム、リン酸2カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム塩等のナトリウム塩等が用いられる。培養は振とう培養若しくは通気攪拌培養などの好気的条件下において、培地pH 7以上の範囲、好ましくはpH 8から11の範囲に調整し、温度10〜45℃の範囲、好ましくは30〜42 ℃で実施する事が望ましいが、この条件以外であっても、微生物が生育し、目的とする酵素が生成する条件であれば特に制限されない。
【００１７】
このように培養すると、通常は培養開始48時間前後で培養液中に著量のCGTaseが生産される。次いで、培養液から菌体を除去し、培養濾液を得る。限外濾過膜で脱塩、濃縮して、酵素を回収する。こうして得られた粗精製酵素は、そのままでもCD生成反応に利用可能であるが、必要に応じて、硫安塩析又は有機溶媒沈澱、DEAE-セファデックス、ブチルトヨパール等による吸着溶出、セファデックス、トヨパール等によるカラム分画、γ-CDをリガンドとして誘導したアフィニティークロマトグラフィー等により精製して使用する。
【００１８】
以下に酵素の活性測定法を記した。
（CGTase 活性測定）
CGTase 活性は、50 mM グリシン-NaCl-NaOH (pH 10.0) 緩衝液を用いて40 若しくは50 ℃で行った。
【００１９】
（Blue value 法）
アミロース（林原製EX-III type）50 mg を2 ml の1 N NaOH に一晩かけて溶解したものを1 N HCl で中和し、50 mM グリシン-NaCl-NaOH (pH 10.0) 緩衝液で50 ml にしたものを基質溶液とした。300 μl の基質液を40 ℃で10 分間保温し、適当に希釈した酵素溶液200 μl を添加する事で反応を開始し、同温度で10 分間反応した。4 ml の0.2 N HCl を添加する事で反応を停止した。同反応液に4 ml の水及び0.02 % I2-0.2 % KI 溶液500 μlを加え、700 nm の吸光度を測定した。同様に0.2 N HCl を添加後に酵素溶液を添加したものを対照とした。本条件で700 nm の吸光度を対照に対して1 分間に10 % 減少させる酵素量を1 U と定義した。
【００２０】
（γ-CD 生成活性）
10 %（w/v）になるように25 mM グリシン-NaCl-NaOH (pH 10.0)緩衝液に溶解した可溶性澱粉（nacalai tesque）1 ml を10 分間50 ℃で加温した。適当に希釈した酵素溶液200 μl を添加する事で反応を開始し、同温度で30 分間反応し、3 ml の0.02 N HCl を添加する事で反応を停止した。反応液の20 μl をHPLC に供し、生成したγ-CD 量を測定した。本条件で1 分間に1 μmol/mlのγ-CD を生成する酵素量を1 U と定義した。
【００２１】
本測定に用いたHPLC 条件は以下の通り。
Column YMC-pack AQ-312 (6 × 150 mm)
Solvent 10 % MeOH
Flow rate 1.0 ml/min
Temp. R. T.
Detection RI
ATT 7
濃度既知のCD溶液を上記条件で分析し、CD含量とHPLC 面積の相関を求める事で下式検量線を得た。
(HPLC area) = 3.092 × 106 × （γ-CD w/v %） R2= 0.999
【００２２】
（CD 生成量の分析）
反応液中のCD 含量はHPLC を用いて分析した。その分析条件は以下の通り。
HPLC 法-1
Column Aminex HPX-42A (Bio-Rad Lab. 7.8 × 300 mm)
Solvent H₂O
Flow rate 0.5 ml/min
Temp. 55 ℃
Detection RI
ATT 9
【００２３】
HPLC 法-2 はCD 生成活性を分析するのに用いた方法と同様の方法によって行った。
CD 生成反応はポテト可溶性澱粉（Sigma）を基質として行った。
【００２４】
得られたCGTaseの酵素学的諸性質を以下に示す。
該酵素200 μl （100 μg of protein）とpH 3〜11.9 の各種緩衝液中に溶解した1.0 % (w/v) アミロース（DP 117）を40 ℃で10 分間反応させ、その相対活性（Blue value 法）を求めた。さらに50 μl の酵素溶液（25 μg of protein）と500 μl のpH 3-11.9 の範囲の各種緩衝液を混合し、4 ℃で24時間放置し、2.75 ml の50 mM グリシン-NaOH （pH 10.0）緩衝液を加えたものの残存活性を測定した。その結果、該酵素の至適pH 及びpH 安定性領域はそれぞれ10.5-11.0 及び6-11.0
であった。
【００２５】
該酵素200 μl （100 μg of protein）と50 mM グリシン-NaOH （pH 10.0）緩衝液中に溶解した1.0 % (w/v) アミロース（DP 117）を各種温度で10 分間反応させ、その相対活性（Blue value 法）を求めた。さらに20 μl の酵素溶液と1180 μl の50 mM グリシン-NaOH （pH 10.0）緩衝液を混合し、各種温度で15 分間保持し、その残存活性を測定した（図３）。その結果、該酵素の至適温度及び温度安定性領域はそれぞれ60 ℃ 及び30 ℃以下であった。これらの結果は、γ-CD生成活性においても同様であった。また、該酵素の分子量はSDS-PAGEで66,000、等電点は3.98 （焦点電気泳動法）である。
【００２６】
以上の結果及び該酵素の分子量、等電点の検討結果を合わせて、酵素の諸性質について、他菌株由来CGTase との比較を表1に示した。
【００２７】
【表１】

【００２８】
[バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTase]
本発明において、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseは、γ-CDに比べてα-及び/又はβ-CDを優先的に生成するCGTaseである。このようなバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseは、バチルス(Bacillus)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、クレブシエラ(klebsiella)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、サーモアナエロバクター(Thremoanaerobactor) 属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属由来のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも1種であることができる。そのようなCGTaseとしては、例えば、上記表１に示されたバチルスエスピー(B. sp.) AL-6、バチルスステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、バチルスメガテリウム(B. megaterium)、バチルスサイクランス(B. circulans)、バチルスマセランス(B. macerans)を挙げることができる他、以下の表２に示されたバチルスオーベンシス(B.ohbensis)、クレブシエラニューモニア(Klebsiella pneumoniae)、サーモアナエロバクターエスピー(Thermoana erobactor sp.)、ブレビバクテリウムエスピー(Brevibacterium sp) No. 9605等を挙げることができる。
【００２９】
【表２】

【００３０】
〔シクロデキストリンの製造方法〕
本発明の第1の製造方法では、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液(原料溶液)にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTase及びバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを同時に反応させてα-CD、β-CD及びγ-CDを生成させる。
原料溶液の濃度は、例えば、1〜30%の範囲とし、CGTaseをそれぞれ0.5〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）用い、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行うことで、α-CD、β-CD及びγ-CDの混合物を生成させることができる。
【００３１】
本発明の第2の製造方法では、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する原料溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseを反応させ、次いでバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを反応させてα-CD、β-CD及びγ-CDを生成させる。原料溶液の濃度は、例えば、1〜30%の範囲とし、原料溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseを0.5〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行う。次いで、反応液を加熱してバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseを失活させた後、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTase0.5〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）を反応液に加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行うことで、α-CD、β-CD及びγ-CDの混合物を生成させることができる。
【００３２】
本発明の第３の製造方法では、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する原料溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを反応させ、次いでバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseを反応させてα-CD、β-CD及びγ-CDを生成させる。原料溶液の濃度は、例えば、1〜30%の範囲とし、原料溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを0.5〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行う。次いで、反応液を加熱してバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseを失活させた後、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTase0.5〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）を反応液に加え、4.5〜12のpH範囲、20〜75℃の温度にて１〜96時間酵素反応を行うことで、α-CD、β-CD及びγ-CDの混合物を生成させることができる。
【００３３】
反応条件(酵素の使用量、反応時間、反応温度等)は、例えば、γ-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、α-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となり、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となるように設定することができる。好ましくは、γ-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、α-シクロデキストリンの生成量が0.1〜1の範囲となり、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜0.5の範囲となるように設定する。また、反応条件(酵素の使用量、反応時間、反応温度等)は、例えば、α-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、β-シクロデキストリンの生成量が0.1〜1.5の範囲となり、γ-シクロデキストリンの生成量が0.1〜2の範囲となるように設定することもできる。好ましくは、α-シクロデキストリンの生成量を１としたときに、β-シクロデキストリンの生成量が0.3〜0.9の範囲となり、γ-シクロデキストリンの生成量が0.5〜1の範囲となるように設定する。
【００３４】
例えば、本発明の第1の製造方法では、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseの使用量に対するバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseの使用量の比を変化させること、CGTaseの最適温度がCGTaseの種類により異なる場合、反応温度を、いずれかのCGTaseの最適温度に近づけることで、各CDの生成比を変化させることで、生成量の比を変化させることができる。本発明の第2の製造方法では、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseによるγ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)と、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseによるα-シクロデキストリン及び/又はβ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)とを変化させることで、生成量の比を変化させることができる。
本発明の第3の製造方法では、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種以外の菌株が産生するCGTaseによるα-シクロデキストリン及び/又はβ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)と、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生するCGTaseによるγ-シクロデキストリンを主成分とするCDsの生成条件(酵素の使用量、反応温度、反応時間)とを変化させることで、生成量の比を変化させることができる。
【００３５】
本発明の製造方法により得られるα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物を含有する溶液は、さらに精製してシクロデキストリン混合物シラップとすることもできる。この精製は、通常の水飴やオリゴ糖シラップと同様の常法により行うことができる。例えば、この精製は、固形分を除去するための濾過、活性炭処理による脱色、イオン交換樹脂による脱塩を適宜組み合わせて行うことができる。また、本発明の製造方法により得られるα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物中には、α-，β-およびγ-CDなどの他に、グルコースなどの単糖類、各種オリゴ糖(マルトースなど)或いはデキストリンなども含有している場合があり、これらを常法により適宜分離することもできる。
【００３６】
また、本発明の製造方法により得られるα-、β-及びγ-シクロデキストリンの混合物を含有する溶液を上記のように精製してシクロデキストリン混合物シラップを得たのち、得られたシラップを乾燥してシクロデキストリン混合物粉末を得ることもできる。シラップの乾燥には、スプレードライ法や凍結乾燥法を用いることができる。乾燥法により、結晶状、凍結乾燥状、粉末状、顆粒状などの任意の形態とすることができる。
【００３７】
本発明は、上記本発明の製造方法により得られたシクロデキストリン混合物を含有する飲食品の製造方法を包含する。本発明の製造方法により得られるシクロデキストリン混合物は、所望のCDバランスを有することができるため、各飲食品において要求されるCDバランスを有するシクロデキストリン混合物を適宜選択して使用することができる。そのため、極めて簡便に且つ効果的に飲食品の嗜好性及び機能性を向上させることができる。
本発明が対象とする飲食品は、経口摂取可能な全ての飲食品であり、例えば、茶類、清涼飲料などの飲料類、キャンディー、ゼリー、和菓子などの和洋菓子類、ヨーグルト、アイスクリームなどの乳製品類、ハム、ソーゼージなどの畜肉加工品類、蒲鉾、なると等の水産加工品類や麺類、漬物類、その他調理済加工食品類やインスタント食品類などを挙げることができる。シクロデキストリン混合物の飲食品への添加は、シクロデキストリン混合物が飲食品において果たすべき役割を考慮して、飲食品製造のいずれかの工程において行うことができる。例えば、シクロデキストリン混合物、飲食品素材加工中に添加しても、或いは基礎飲食品加工終了後に添加してもよく、各種食品の製造工程の実状に適した添加方法を用いればよい。
シクロデキストリン混合物の添加量は、飲食品の場合、基礎となる飲食品本来の味質並びに風味を損なわない限り特に限定はないが、一般に20重量％以下の添加量で添加するのが好ましい。
【００３８】
尚、本発明の製造方法で得られるシクロデキストリン混合物は、飲食品以外にも、医薬品や化粧料の有効成分の安定化や乳化作用、賦形剤などとしても利用することが可能である。この場合、シクロデキストリン混合物の添加量には、有効成分の効果効能を損なわない限り特に限定はないが、50重量％以下とすることが望ましい。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度１０重量％、グルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7に調整した後、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）（FERM BP-7156）の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したγ-CGTaseを粗酵素液として２２０単位／ｇ基質添加し、５５℃，４８時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ、７５℃まで冷却後ｐH６に調製し、他のバチルス(Bacillus)属由来のCGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を４０単位／ｇ基質添加し、２４時間反応させた。９０℃まで加熱し酵素を失活させ、脱色、イオン交換などの精製を行い、糖濃度５０重量％のCDを含むシラップを調製した。次いで、得られたシラップをスプレードライヤーにて噴霧乾燥し粉末品を得た。その糖組成を表3に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００４０】
【表３】

【００４１】
実施例２
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度１０重量％、グルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7.5に調整した後、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）（FERM BP-7156）の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したγ-CGTaseを粗酵素液として２２０単位／ｇ基質添加し、６０℃，４８時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ７５℃まで冷却後、ｐH7.5にて他のバチルス(Bacillus)属由来のCGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を２０単位／ｇ基質添加し、６時間反応させた。９０℃まで加熱し酵素を失活させ、α-アミラーゼを用いてヨード反応を消去した後、脱色、イオン交換などの精製を行い、固形分75％のCDを含むシラップを調製した。その糖組成を表4に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００４２】
【表４】

【００４３】
実施例３
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度１０重量％、グルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7に調整した後、実施例１記載の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として２５０単位／ｇ基質、および３０単位／ｇ基質の他のバチルス(Bacillus)属由来CGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を同時に添加し、５５℃，７２時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ、α-アミラーゼを用いてヨード反応を消去した後、脱色、イオン交換などの精製を行い、固形分75％のCDを含むシラップを調製した。その糖組成を表5に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００４４】
【表５】

【００４５】
実施例４
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度１０重量％、グルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7.5に調整した後、実施例１記載の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として4００単位／ｇ基質、および４０単位／ｇ基質の他のバチルス(Bacillus)属由来CGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を同時に添加し、５５℃，７２時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ、α-アミラーゼを用いてヨード反応を消去した後、脱色、イオン交換などの精製を行い、固形分75％のCDを含むシラップを調製した。その糖組成を表6に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００４６】
【表６】

【００４７】
実施例５
パインデックス＃１（松谷化学工業株式会社製）を６０℃の温水に濃度１０重量％なるよう溶解調製した。次いでこの溶液をpH 7に調整した後、実施例１記載の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として4００単位／ｇ基質、および４０単位／ｇ基質の他のバチルス(Bacillus)属由来CGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を同時に添加し、６０℃，７２時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ、α-アミラーゼを用いてヨード反応を消去した後、脱色、イオン交換などの精製を行い、固形分75％のCDを含むシラップを調製した。その糖組成を表7に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００４８】
【表７】

【００４９】
実施例６
コーンスターチを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度１０重量％、グルコース当量７の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH ６に調整した後、他のバチルス(Bacillus)属由来のCGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を４０単位／ｇ基質添加し、２４時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ、６０℃まで冷却後ｐH7.5に調製し、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）（FERM BP-7156）の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したγ-CGTaseを粗酵素液として４００単位／ｇ基質添加し、４８時間反応させた。その後９０℃まで加熱し酵素を失活させ、脱色、イオン交換などの精製を行い、糖濃度５０重量％のCDを含むシラップを調製した。次いで、得られたシラップをスプレードライヤーにて噴霧乾燥し粉末品を得た。その糖組成を表8に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００５０】
【表８】

【００５１】
実施例７
馬鈴薯デンプンを常法によりα-アミラーゼを用いて液化させ、濃度５重量％、グルコース当量３の澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH 7.5に調整した後、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）(FERM BP-7156)の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したγ-CGTaseを粗酵素液として４００単位／ｇ基質添加し、６０℃，４８時間反応させた。その後、本反応液を９０℃まで加熱し酵素を失活させ、７５℃まで冷却後ｐH６に調製し、他のバチルス(Bacillus)属由来のCGTase(日本食品化工（株）製ネオCDアミラーゼ)を２０単位／ｇ基質添加し、２４時間反応させた。９０℃まで加熱し酵素を失活させ、α-アミラーゼを用いてヨード反応を消去した後、脱色、イオン交換などの精製を行い、固形分75％のCDを含むシラップを調製した。その糖組成を表9に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００５２】
【表９】

【００５３】
実施例８
腹開きした鯵を表10に示される配合の調味液に２０分間浸せきする。これを６時間天日干しし、鯵の干物を得た。これを冷凍庫内に無包装のまま４週間保存し、経時的に塩のみの調味液をコントロールとして、各種CD入りの調味液に浸せきした干物について、味、臭味を官能検査により、脂質の劣化について過酸化物価を測定することにより評価した。過酸化物価の測定は常法により行った。味、臭味を官能検査の結果を表11に示し、過酸化物価の測定結果を図1に示す。表11に示すように、各種CD入りの調味液を用いた場合には、いずれもコントロールより評価項目について良好な結果が得られたが、α−およびβ−CD入りの調味液では臭味の除去効果はあるものの、脂質の劣化は押さえられず、γ−CD入りの調味液では脂質の劣化は押さえられるものの、臭味の除去効果はあまり見られなかった。これに対して実施例４に記載されるCDシラップは、官能検査により臭味の除去効果が認められ、かつ、図1に示すように脂質の劣化が押さえられた良好な干物が得られた。
【００５４】
【表１０】

【００５５】
【表１１】

【００５６】
評価はクレーマーの検定法による。
○：ｐ＜0.05の危険率で有意に好まれる又は強い
◎：ｐ＜0.01の危険率で有意に好まれるまたは強い
△：好まれるまたは強い
×：ｐ＜0.05の危険率で有意に好まれないまたは弱い
××：ｐ＜0.01の危険率で有意に好まれないまたは弱い
▽：好まれないまたは弱い
【００５７】
【発明の効果】
本発明はCGTase生産能を有するバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）属に属する微生物が生産する新規CGTaseを用いるCDの製造法である。本発明により安価なCDシラップがその用途に最も適するバランスで含有させたりまた、程よいバランスで含有する事であらゆる用途に利用可能なシラップを製造する事が可能となり、食品分野、飼料分野等への貢献度は大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】脂質の劣化について評価するための過酸化物価の測定結果。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin (hereinafter referred to as CD) using a plurality of cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19, hereinafter referred to as CGTase).
[0002]
CGTase (EC 2.4.1.19) is an enzyme that acts on α-1,4-glucan such as starch and produces cyclodextrin (CD) which is cyclic α-1,4-glucan by its intramolecular transfer activity. The degree of polymerization of CD produced by CGTase is mainly 6-8, and is called α-, β- and γ-CD, respectively. Apart from this CD formation reaction, CGTase is coupled via intermolecular transfer reaction (opening CD and transferring the resulting linear oligosaccharide to receptor sugar molecule) or disproportionation reaction (receptor sugar molecule). To transfer the linear oligosaccharide to the catalyst. Furthermore, although CGTase is weak, it also catalyzes the hydrolysis reaction of α-1,4-glucoside bond.
[0003]
CGTase is positioned as an important enzyme in the food, pharmaceutical and cosmetic industries because CD can make inclusions with many molecules and change its chemical and physical properties. Therefore, it started in 1939 with CD synthesis reaction by Bacillus macerans enzyme (EB Tilden and SJ Pirt, J. Am. Chem. Soc., 63, 2900-2902, 1939), and then CGTase producing bacteria Numerous studies have been conducted, including search for proteins and purification of enzymes (Sumio Kitahata, Naoto Tsuyama and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (2), 387-393, 1974, Sumio Kitahata and Shigetaka Okada , Agr. Biol. Chem., 38 (12), 2413-2417, 1974, Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, J. Jap. Soc. Starch Sci., 29 (1), 13-18, 1982, Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Katsube, Denpun Kagaku, 38 (2), 141-146, 1991, Lionel J. Bovetto, Daniel P. Backer, Jaques R. Villette, Philippe J. Sicard, and Stephane JL. Bouquelet, Biotechnology and Applied Biochemstry, 15, 48-58, 1992, Shinske Fujiwara, Hirofumi Kakihara, Kim Myung Woo, Andre Lejeune, Mitsuhide Kanemoto, Keiji Sakaguchi, and Tadayuki Imanaka, Applied and environmental microbiology, 58 (12), 4016-40 25, 1992, Florian Binder, Otto Huber and August Bock, Gene, 47, 269-277, 1986, Keiji Kainuma, Toshiya Takano and Kunio Yamane, Appl.Microbiol. Biotechnol., 26, 149-153, 1987, Takahiro Kaneko, Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi, J. general Microbiology, 134, 97-105, 1988, Murai Makela, Pekka Mattsson, M. Eugenia Schinina, and Timo Korpela, Biotechnology and Applied biochemistry, 10, 414-427, 1988, Ernest KC Yu , Hiroyuki Aoki, and Masanaru Misawa, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, 377-379, 1988).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
CGTases are classified as α-, β-CGTase and γ-CGTase depending on the type of main CD synthesized. Many of the previously reported genes are α- or β-CGTase, and few enzymes have been reported as γ-CGTase (Shigeharu Mori, Susumu Hirose, Takaichi Oya, and Sumio Kitahata, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994, Yoshito Fujita, Hitoshi Tsubouchi, Yukio Inagi, Keiji Tomita, Akira Ozaki, and Kazuhiro Nakanishi, J. Fermentation and Bioengineering, 70 (3), 150-154, 1990, Takashi Kato and Koki Horikoshi, J. Jpn. Soc. Starch Sci., 33 (2), 137-143, 1986).
[0005]
Although there is an enzyme reported as γ-CGTase, in reality, γ-CGTase is generally an enzyme that produces β-CD and γ-CD, and the amount of γ-CD produced is 5 % Or less, or the rate of β-CD production was accelerated in the late stage of the reaction, and β-CD was produced in the same amount or more than γ-CD. In addition, there are enzymes that significantly reduce the production amount of γ-CD at a substrate concentration of 10% or more, and there are many enzymes that are difficult to use industrially, such as the necessity of coexisting ethanol in the reaction solution.
[0006]
Attempts have also been made to improve the production of γ-CD by modifying the structural gene of α- or β-CGTase (Akira Nakamura, Keiko Haga, and Kunio Yamane, Biochemstry, 32, 6624-6631, 1993). Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994). Such a gene recombination enzyme certainly has an enhanced amount of γ-CD, but even if the amount of γ-CD is increased, β-CD produced by the original activity is remarkably reduced. The product is a mixture of γ-CD and β-CD. For this reason, in order to produce γ-CD, a further purification step is required, which is still not a sufficient method from an industrial viewpoint.
[0007]
Therefore, although γ-CD is commercially available, it is more expensive than α-CD and β-CD, and α-CD and β-CD are widely used. The field of use of is currently limited.
[0008]
By the way, it is known that CD can be included in different materials depending on the degree of polymerization.
For example, when CD is used for a food or drink that is a mixture of various substances, it is preferable to adjust the CD balance in consideration of the inclusion characteristics of α-, β-, or γ-CD. β-CD can satisfactorily include allyl thiocyanate, a pungent component of wasabi, and improve the balance of stability and flavor. However, α- and γ-CD cannot be expected to have such an effect. Α-CD has an emulsifying effect on water and vegetable oils. However, β- and γ-CD are not expected to have such an effect. Moreover, rutin, which is a natural pigment, is one of the colorants exhibiting a good yellow color, but is easy to fade and lacks stability. γ-CD can improve stability and water solubility by inclusion with rutin. In addition to rutin, flavonoids, catechins, anthocyanin dyes, and highly unsaturated fatty acids (for example, EPA, DHA, etc.) can also improve physical properties such as stability and water solubility by γ-CD. However, α- and β-CD cannot be expected to have these effects.
[0009]
In this way, α-, β-, and γ-CD have different inclusion characteristics, and in consideration of this point, by adjusting to the concentration at which each acts most effectively, a favorable characteristic is imparted to foods and the like. be able to. For example, wasabi-flavored soft cream or dressing can stabilize both the wasabi flavor and the emulsifying action. Similarly, yellow soft cream using rutin can stabilize both the pigment and the emulsifying action. However, until now, since a method for mass production of γ-CD has not been established, it has been difficult to obtain a CD mixture containing α-, β-, and γ-CD in a desired composition ratio.
[0010]
CD-containing syrup is widely used as a CD mixture. However, the CD composition of CD-containing syrup is determined depending on whether the CGTase used for preparation is α-, β-, or γ-CGTase. As described above, CD syrup containing α- or β-CD as a main component can be easily produced industrially, but CD syrup containing γ-CD as a main component cannot be manufactured at low cost. Therefore, preparation of CD syrup having a desired CD balance (especially rich in γ-CD) has been difficult.
[0011]
Therefore, for example, when using CD syrup containing β-CD and γ-CD (low γ-CD content), an attempt to add a predetermined amount of γ-CD results in an excessive amount of β-CD. End up. When the amount of β-CD is excessive, for example, wasabi-flavored soft cream has too strong inclusion of β-CD, and the wasabi flavor is reduced. On the other hand, if the amount of β-CD is set to an appropriate amount in order to avoid excessive β-CD, the softness cream containing yellow rutin has too little content of γ-CD and the stability of rutin becomes weak. As described above, if a CD mixture such as CD syrup having an optimal CD balance for each food cannot be used, the palatability of the food and drink is reduced.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a mixture of α-, β-, and γ-CD that can appropriately change the balance of α-, β-, and γ-CD. In addition, an object of the present invention is to provide a method for producing CD syrup having a desired CD balance (composition ratio of α-CD, β-CD and γ-CG).
[0013]
Therefore, the present inventors tried to search for a microorganism having the ability to produce CGTase that produces γ-CD that has not been found so far in the natural world, and found that it belongs to the Bacillus species. Among the recognized strains, a novel strain having CGTase producing ability capable of preferentially producing γ-CD was found. Then, using this new CGTase produced from this microorganism and CGTase of other origin, we established an industrial production method of CD having the desired CD balance (α-, β- and γ-CD balance), and completed.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is as follows.
[Claim 1] A cyclodextrin / glucanotransferase and a Bacillus clarkii produced by a Bacillus clarkii species in a solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose ) Α-, β-, and γ-cyclo, characterized by producing α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin by simultaneously reacting cyclodextrin / glucanotransferase produced by strains other than species A method for producing a mixture of dextrins (first production method).
[Claim 2] A solution containing at least one member selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose is reacted with cyclodextrin / glucanotransferase produced by Bacillus clarkii species, and then reacted with Bacillus sclera. Α-, β-, and β-cyclodextrin produced by reacting cyclodextrin glucanotransferase produced by strains other than Bacillus clarkii species to produce α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin A method for producing a mixture of γ-cyclodextrin (second production method).
[Claim 3] A cyclodextrin / glucanotransferase produced by a strain other than Bacillus clarkii is reacted with a solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose, Next, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin and γ-cyclodextrin are produced by reacting with cyclodextrin glucanotransferase produced by Bacillus clarkii species to produce α-, β- and A method for producing a mixture of γ-cyclodextrin (third production method).
[Claim 4] The cyclodextrin / glucanotransferase produced by a Bacillus clarkii species is a cyclodextrin / glucanotransferase having the following enzymatic chemistry: The manufacturing method as described.
(1) Action and substrate specificity: Acts on starch, dextrin, amylopectin or amylose to mainly produce γ-cyclodextrin, and the amount of β- and α-cyclodextrin produced is compared with that of γ-cyclodextrin Low.
(2) Optimum pH: 10.5-11.0
(3) Optimal temperature: around 60 ° C
(4) Stable pH: 6-11
(5) Temperature stability: Shows a residual activity of 90% or more after treatment at 50 ° C for 15 minutes.
[Claim 5] Cyclodextrin / glucanotransferase produced by strains other than Bacillus clarkii species has cyclodextrin in which the amount of γ-cyclodextrin produced is lower than the amount of β- and α-cyclodextrin produced -The production method according to any one of claims 1 to 4, which is glucanotransferase.
[Claim 6] The cyclodextrin / glucanotransferase is a cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Bacillus, a cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Klebsiella, or a cyclodextrin derived from the genus Thermoanaerobactor. 6. The production method according to claim 5, wherein the production method is at least one selected from the group consisting of dextrin / glucanotransferase and cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Brevibacterium.
[Claim 7] When the production amount of γ-cyclodextrin is 1, the production amount of α-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2, and the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2. The production method according to any one of claims 1 to 6, wherein reaction conditions are set in the process.
[Claim 8] When the production amount of α-cyclodextrin is 1, the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 1.5, and the production amount of γ-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2. The production method according to any one of claims 1 to 6, wherein reaction conditions are set in the process.
[9] The production method according to any one of [1] to [8], wherein the solution containing the mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin is purified to obtain a cyclodextrin mixture syrup.
[Claim 10] The resulting solution containing a mixture of α-, β- and γ-cyclodextrin is purified to obtain a cyclodextrin mixture syrup, and the resulting syrup is dried to obtain a cyclodextrin mixture powder. The manufacturing method as described in any one of 1-8.
[11] A method for producing a food or drink containing the cyclodextrin mixture obtained by the method according to any one of [1] to [10].
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In any of the first to third production methods of the present invention, cyclodextrin produced by a strain other than the cyclodextrin / glucanotransferase produced by Bacillus clarkii species and the Bacillus clarkii species Use glucanotransferase.
[CGTase produced by Bacillus clarkii species]
The CGTase produced by the Bacillus clarkii species used in the present invention is a CGTase that preferentially produces γ-CD compared to α- and β-CD. Examples of such CGTase include CGTase having the following enzyme chemical properties.
(1) Action and substrate specificity: Acts on starch, dextrin, amylopectin or amylose to mainly produce γ-cyclodextrin, and the amount of β- and α-cyclodextrin produced is compared with that of γ-cyclodextrin Low.
(2) Optimum pH: 10.5-11.0
(3) Optimal temperature: around 60 ° C
(4) Stable pH: 6-11
(5) Temperature stability: Shows a residual activity of 90% or more after treatment at 50 ° C for 15 minutes.
[0016]
CGTase having the above enzyme chemical properties can be produced, for example, using the Bacilscleraki 7364 strain deposited as FERM BP-7156 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
In order to produce CGTase using the above-mentioned Bacillus kuraki strain 7364, the carbon source, nitrogen source, inorganic salt, necessary nutrients, etc. necessary for the microorganism to grow well and produce the enzyme smoothly can be obtained. This is cultured in a synthetic or natural medium containing. As the carbon source, carbohydrates such as starch or a composition fraction thereof, roasted dextrin, modified starch, starch derivative, physically treated starch and α-starch can be used. Specific examples include soluble starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, dextrin, amylopectin, and amylose. Examples of nitrogen sources include polypeptone, casein, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, organic nitrogen source materials such as extracts such as soybean or soybean meal, inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate and ammonium phosphate, and amino acids such as glutamic acid. Is mentioned. Examples of inorganic salts include phosphates such as monopotassium phosphate and dipotassium phosphate, magnesium salts such as magnesium sulfate, calcium salts such as calcium chloride, sodium salts such as sodium carbonate, and the like. The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, and the medium is adjusted to a pH range of 7 or more, preferably pH 8 to 11, and the temperature is in the range of 10 to 45 ° C., preferably 30 to 42. Although it is desirable to carry out at 0 degreeC, even if it is other than this condition, if it is the conditions where microorganisms grow and the target enzyme produces | generates, it will not restrict | limit in particular.
[0017]
When cultured in this manner, a significant amount of CGTase is usually produced in the culture solution around 48 hours after the start of the culture. Next, the cells are removed from the culture solution to obtain a culture filtrate. The enzyme is recovered by desalting and concentrating with an ultrafiltration membrane. The crude enzyme thus obtained can be used for the CD production reaction as it is, but if necessary, ammonium sulfate salting out or organic solvent precipitation, adsorption elution with DEAE-Sephadex, Butyl Toyopearl, Sephadex, It is used after purification by column fractionation by Toyopearl et al., Affinity chromatography derived from γ-CD as a ligand.
[0018]
The enzyme activity measurement method is described below.
(CGTase activity measurement)
CGTase activity was carried out at 40 or 50 ° C. using 50 mM glycine-NaCl-NaOH (pH 10.0) buffer.
[0019]
(Blue value method)
50 mg amylose (Hayashibara EX-III type) dissolved in 2 ml of 1 N NaOH overnight is neutralized with 1 N HCl, and then added with 50 mM glycine-NaCl-NaOH (pH 10.0) buffer. The substrate solution was made into ml. 300 μl of the substrate solution was incubated at 40 ° C. for 10 minutes, and the reaction was started by adding 200 μl of an appropriately diluted enzyme solution, followed by reaction at the same temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 4 ml of 0.2 N HCl. To the reaction mixture, 4 ml of water and 500 μl of 0.02% I2-0.2% KI solution were added, and the absorbance at 700 nm was measured. Similarly, 0.2 N HCl was added and then the enzyme solution was added as a control. Under this condition, 1 U was defined as the amount of enzyme that decreases the absorbance at 700 nm by 10% relative to the control.
[0020]
(Γ-CD production activity)
1 ml of soluble starch (nacalai tesque) dissolved in 25 mM glycine-NaCl-NaOH (pH 10.0) buffer so as to be 10% (w / v) was heated at 50 ° C. for 10 minutes. The reaction was started by adding 200 μl of an appropriately diluted enzyme solution, reacted at the same temperature for 30 minutes, and stopped by adding 3 ml of 0.02 N HCl. 20 μl of the reaction solution was subjected to HPLC, and the amount of γ-CD produced was measured. The amount of enzyme that produces 1 μmol / ml of γ-CD per minute under these conditions was defined as 1 U.
[0021]
The HPLC conditions used for this measurement are as follows.
Column YMC-pack AQ-312 (6 × 150 mm)
Solvent 10% MeOH
Flow rate 1.0 ml / min
Temp. RT
Detection RI
ATT 7
A CD solution with a known concentration was analyzed under the above conditions, and the following calibration curve was obtained by determining the correlation between the CD content and the HPLC area.
(HPLC area) = 3.092 × 106 × (γ-CD w / v%) R2 = 0.999
[0022]
(Analysis of CD production)
The CD content in the reaction solution was analyzed using HPLC. The analysis conditions are as follows.
HPLC method-1
Column Aminex HPX-42A (Bio-Rad Lab.7.8 × 300 mm)
Solvent H ₂ O
Flow rate 0.5 ml / min
Temp. 55 ℃
Detection RI
ATT 9
[0023]
HPLC method-2 was carried out in the same manner as the method used to analyze the CD production activity.
The CD formation reaction was performed using potato soluble starch (Sigma) as a substrate.
[0024]
The enzymological properties of the obtained CGTase are shown below.
200 μl of the enzyme (100 μg of protein) and 1.0% (w / v) amylose (DP 117) dissolved in various buffers at pH 3 to 11.9 were reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and the relative activity (Blue value) Law). Mix 50 μl of the enzyme solution (25 μg of protein) and 500 μl of various buffers in the range of pH 3-11.9, leave at 4 ° C for 24 hours, and then add 2.75 ml of 50 mM glycine-NaOH (pH 10.0). The residual activity of the buffer added was measured. As a result, the optimum pH and pH stability region of the enzyme are 10.5-11.0 and 6-11.0, respectively.
Met.
[0025]
Relative activity of 200 μl (100 μg of protein) of the enzyme and 1.0% (w / v) amylose (DP 117) dissolved in 50 mM glycine-NaOH (pH 10.0) buffer at various temperatures for 10 minutes (Blue value method) was obtained. Further, 20 μl of the enzyme solution and 1180 μl of 50 mM glycine-NaOH (pH 10.0) buffer were mixed, held at various temperatures for 15 minutes, and the residual activity was measured (FIG. 3). As a result, the optimum temperature and temperature stability region of the enzyme were 60 ° C. and 30 ° C. or less, respectively. These results were the same in the γ-CD production activity. The molecular weight of the enzyme is 66,000 as measured by SDS-PAGE, and the isoelectric point is 3.98 (focal electrophoresis).
[0026]
Table 1 shows a comparison of the properties of the enzyme with those of other strains derived from CGTase, together with the above results and the results of studies on the molecular weight and isoelectric point of the enzyme.
[0027]
[Table 1]

[0028]
[CGTase produced by strains other than Bacillus clarkii species]
In the present invention, CGTase produced by strains other than Bacillus clarkii species is CGTase that preferentially produces α- and / or β-CD compared to γ-CD. CGTases produced by strains other than Bacillus clarkii species include cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Bacillus, cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Klebsiella, and thermoanaero It can be at least one selected from the group consisting of a cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Thremoanaerobactor and a cyclodextrin / glucanotransferase derived from the genus Brevibacterium. Examples of such CGTase include Bacillus sp. AL-6, Bacillus stearothermophilus, B. megaterium, and Bacillus cycle shown in Table 1 above. In addition to B. circulans and B. macerans, the following Table 2 shows B. ohbensis, Klebsiella pneumoniae, Thermoanaerobacter SP (Thermoana erobactor sp.), Brevibacterium sp (No. 9605), etc. can be mentioned.
[0029]
[Table 2]

[0030]
[Method for producing cyclodextrin]
In the first production method of the present invention, CGTase and Bacillus sclera produced by Bacillus clarkii species in a solution (raw material solution) containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose Α-CD, β-CD and γ-CD are produced by simultaneously reacting with CGTase produced by strains other than the species of Bacillus clarkii.
The concentration of the raw material solution is, for example, in the range of 1 to 30%, and CGTase is used in an amount of 0.5 to 300 U (per 1 g of dry starch), respectively, in the pH range of 4.5 to 12 and at the temperature of 20 to 75 ° C. for 1 to 96 hours. By performing the reaction, a mixture of α-CD, β-CD and γ-CD can be generated.
[0031]
In the second production method of the present invention, CGTase produced by Bacillus clarkii species is reacted with a raw material solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose, and then Bacillus Α-CD, β-CD and γ-CD are produced by reacting CGTase produced by a strain other than the species of Bacillus clarkii. The concentration of the raw material solution is, for example, in the range of 1 to 30%, CGTase produced by Bacillus clarkii species is added to the raw material solution in an amount of 0.5 to 300 U (per gram of dry starch), and a pH range of 4.5 to 12, The enzyme reaction is performed at a temperature of 20 to 75 ° C. for 1 to 96 hours. Next, the reaction solution is heated to inactivate CGTase produced by Bacillus clarkii species, and then CGTase 0.5 to 300 U produced by a strain other than Bacillus clarkii species (1 g of dried starch). Is added to the reaction solution, and a mixture of α-CD, β-CD and γ-CD is formed by performing an enzyme reaction for 1 to 96 hours at a pH range of 4.5 to 12 and a temperature of 20 to 75 ° C. be able to.
[0032]
In the third production method of the present invention, CGTase produced by a strain other than Bacillus clarkii is reacted with a raw material solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose. Subsequently, CGTase produced by Bacillus clarkii species is reacted to produce α-CD, β-CD and γ-CD. The concentration of the raw material solution is, for example, in the range of 1 to 30%, and CGTase produced by a strain other than Bacillus clarkii species is added to the raw material solution in an amount of 0.5 to 300 U (per 1 g of dry starch) The enzyme reaction is carried out for 1 to 96 hours at a pH range of 20 to 75 ° C. Next, the reaction solution is heated to inactivate CGTases produced by strains other than Bacillus clarkii species, and then CGTase 0.5 to 300 U produced by Bacillus clarkii species (1 g of dried starch). Is added to the reaction solution, and a mixture of α-CD, β-CD and γ-CD is formed by performing an enzyme reaction for 1 to 96 hours at a pH range of 4.5 to 12 and a temperature of 20 to 75 ° C. be able to.
[0033]
The reaction conditions (enzyme use amount, reaction time, reaction temperature, etc.) are, for example, when the production amount of γ-cyclodextrin is 1, the production amount of α-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2, and β- It can set so that the production amount of cyclodextrin may be in the range of 0.1-2. Preferably, when the production amount of γ-cyclodextrin is 1, the production amount of α-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 1, and the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 0.5. To do. The reaction conditions (enzyme use amount, reaction time, reaction temperature, etc.) are, for example, when the production amount of α-cyclodextrin is 1, the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 1.5, It can also be set so that the amount of γ-cyclodextrin produced is in the range of 0.1-2. Preferably, when the production amount of α-cyclodextrin is 1, the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.3 to 0.9 and the production amount of γ-cyclodextrin is in the range of 0.5 to 1. To do.
[0034]
For example, in the first production method of the present invention, the ratio of the amount of CGTase produced by strains other than Bacillus clarkii to the amount of CGTase produced by Bacillus clarkii is changed. If the optimum temperature of CGTase differs depending on the type of CGTase, the ratio of the amount of production can be changed by changing the production ratio of each CD by bringing the reaction temperature close to the optimum temperature of any CGTase. Can do. In the second production method of the present invention, the production conditions of CDs mainly composed of γ-cyclodextrin by CGTase produced by Bacillus clarkii species (amount of enzyme used, reaction temperature, reaction time), Conditions for producing CDs mainly composed of α-cyclodextrin and / or β-cyclodextrin by CGTase produced by strains other than Bacillus clarkii species (amount of enzyme used, reaction temperature, reaction time) By changing the ratio, the ratio of the generation amount can be changed.
In the third production method of the present invention, the conditions for producing CDs mainly composed of α-cyclodextrin and / or β-cyclodextrin by CGTase produced by a strain other than Bacillus clarkii species (use of enzyme) Amount, reaction temperature, reaction time) and the production conditions of CDs mainly composed of γ-cyclodextrin by CGTase produced by Bacillus clarkii species (amount of enzyme used, reaction temperature, reaction time) By changing the ratio, the ratio of the generation amount can be changed.
[0035]
The solution containing a mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin obtained by the production method of the present invention can be further purified to a cyclodextrin mixture syrup. This purification can be carried out by a conventional method similar to ordinary chickenpox or oligosaccharide syrup. For example, this purification can be performed by appropriately combining filtration for removing a solid content, decolorization by activated carbon treatment, and desalting by an ion exchange resin. Further, in the mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin obtained by the production method of the present invention, in addition to α-, β-, and γ-CD, monosaccharides such as glucose, various oligosaccharides ( Maltose or the like) or dextrin may be contained, and these can be appropriately separated by a conventional method.
[0036]
Further, after the solution containing a mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin obtained by the production method of the present invention is purified as described above to obtain a cyclodextrin mixture syrup, the obtained syrup is dried. Thus, a cyclodextrin mixture powder can be obtained. For drying syrup, a spray drying method or a freeze drying method can be used. Depending on the drying method, it can be in any form such as crystalline, lyophilized, powdered, granular or the like.
[0037]
This invention includes the manufacturing method of the food / beverage products containing the cyclodextrin mixture obtained by the manufacturing method of the said invention. Since the cyclodextrin mixture obtained by the production method of the present invention can have a desired CD balance, a cyclodextrin mixture having a CD balance required for each food and drink can be appropriately selected and used. Therefore, the preference and functionality of food and drink can be improved very simply and effectively.
The foods and drinks targeted by the present invention are all foods and drinks that can be taken orally, such as beverages such as teas and soft drinks, Japanese and Western sweets such as candy, jelly, and Japanese confectionery, yogurt, ice cream, etc. Examples include dairy products, processed meat products such as ham and sausage, processed fishery products such as rice cake, noodles, pickles, other cooked processed foods and instant foods. Addition of a cyclodextrin mixture to a food or drink can be performed in any step of the production of food or drink in consideration of the role that the cyclodextrin mixture should play in the food or drink. For example, it may be added during the processing of the cyclodextrin mixture or the food or drink material, or may be added after the basic food or drink processing, or an addition method suitable for the actual state of the manufacturing process of various foods may be used.
The amount of the cyclodextrin mixture added is not particularly limited in the case of food and drink, as long as the original taste and flavor of the basic food and drink are not impaired, but generally it is preferably added in an amount of 20% by weight or less.
[0038]
In addition, the cyclodextrin mixture obtained by the production method of the present invention can be used not only for foods and beverages but also for stabilizing active ingredients of pharmaceuticals and cosmetics, emulsifying action, excipients and the like. In this case, the addition amount of the cyclodextrin mixture is not particularly limited as long as the effective efficacy of the active ingredient is not impaired, but is preferably 50% by weight or less.
[0039]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited thereby.
Example 1
Corn starch was liquefied using α-amylase by a conventional method to prepare a starch liquefaction solution having a concentration of 10% by weight and a glucose equivalent of 7. Next, this starch liquefaction solution was adjusted to pH 7, and then the culture supernatant of Bacillus clarkii (FERM BP-7156) was concentrated using a UF concentration membrane (PM-10) to obtain γ-CGTase as a crude enzyme. As a solution, 220 units / g of substrate was added and reacted at 55 ° C. for 48 hours. Thereafter, the reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, cooled to 75 ° C., adjusted to pH 6, and CGTase derived from another genus Bacillus (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) is added. 40 units / g substrate was added and allowed to react for 24 hours. The enzyme was inactivated by heating to 90 ° C., and purification such as decolorization and ion exchange was performed to prepare syrup containing CD having a sugar concentration of 50% by weight. Subsequently, the obtained syrup was spray-dried with a spray dryer to obtain a powder product. The sugar composition is shown in Table 3. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0040]
[Table 3]

[0041]
Example 2
Corn starch was liquefied using α-amylase by a conventional method to prepare a starch liquefaction solution having a concentration of 10% by weight and a glucose equivalent of 7. Next, the starch liquefaction solution was adjusted to pH 7.5, and then the culture supernatant of Bacillus clarkii (FERM BP-7156) was concentrated using a UF concentration membrane (PM-10) to obtain γ-CGTase as a crude enzyme. 220 units / g substrate was added as a liquid and reacted at 60 ° C. for 48 hours. Thereafter, this reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, cooled to 75 ° C., and then CGTase derived from another Bacillus genus (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) at pH 7.5. 20 units / g substrate was added and reacted for 6 hours. The enzyme was inactivated by heating to 90 ° C., and the iodo reaction was eliminated using α-amylase, followed by purification such as decolorization and ion exchange to prepare syrup containing CD with a solid content of 75%. The sugar composition is shown in Table 4. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0042]
[Table 4]

[0043]
Example 3
Corn starch was liquefied using α-amylase by a conventional method to prepare a starch liquefaction solution having a concentration of 10% by weight and a glucose equivalent of 7. Next, the starch liquefaction solution was adjusted to pH 7, and then the culture supernatant described in Example 1 was concentrated using a UF concentration membrane (PM-10) as a crude enzyme solution, 250 units / g substrate, and 30 units. CGTase derived from another Bacillus genus / N substrate (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) was added simultaneously and reacted at 55 ° C. for 72 hours. Thereafter, the reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, and after erasing the iodo reaction using α-amylase, purification such as decolorization and ion exchange is performed to obtain syrup containing 75% solids CD. Prepared. The sugar composition is shown in Table 5. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0044]
[Table 5]

[0045]
Example 4
Corn starch was liquefied using α-amylase by a conventional method to prepare a starch liquefaction solution having a concentration of 10% by weight and a glucose equivalent of 7. Next, this starch liquefaction solution was adjusted to pH 7.5, and then the culture supernatant described in Example 1 was concentrated using a UF concentration membrane (PM-10) to obtain a crude enzyme solution of 400 units / g substrate and 40 units. CGTase derived from another Bacillus genus / N substrate (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) was added simultaneously and reacted at 55 ° C. for 72 hours. Thereafter, the reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, and after erasing the iodo reaction using α-amylase, purification such as decolorization and ion exchange is performed to obtain syrup containing 75% solids CD. Prepared. The sugar composition is shown in Table 6. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0046]
[Table 6]

[0047]
Example 5
Paindex # 1 (manufactured by Matsutani Chemical Co., Ltd.) was dissolved and prepared in hot water at 60 ° C. to a concentration of 10% by weight. Next, this solution was adjusted to pH 7, and then the culture supernatant described in Example 1 was concentrated using a UF concentration membrane (PM-10) to obtain a crude enzyme solution of 400 units / g substrate and 40 units / g. Another substrate, CGTase derived from the genus Bacillus (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) was simultaneously added and reacted at 60 ° C. for 72 hours. Thereafter, the reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, and after erasing the iodo reaction using α-amylase, purification such as decolorization and ion exchange is performed to obtain syrup containing 75% solids CD. Prepared. The sugar composition is shown in Table 7. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0048]
[Table 7]

[0049]
Example 6
Corn starch was liquefied using α-amylase by a conventional method to prepare a starch liquefaction solution having a concentration of 10% by weight and a glucose equivalent of 7. Next, after this starch liquefaction solution was adjusted to pH 6, 40 units / g substrate of CGTase derived from another genus Bacillus (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) was added and reacted for 24 hours. Thereafter, the reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, cooled to 60 ° C., adjusted to pH 7.5, and the culture supernatant of Bacillus clarkii (FERM BP-7156) is added to the UF concentration membrane. Γ-CGTase concentrated using (PM-10) was added as a crude enzyme solution at 400 units / g substrate and reacted for 48 hours. Thereafter, the enzyme was inactivated by heating to 90 ° C., and purification such as decolorization and ion exchange was performed to prepare syrup containing CD having a sugar concentration of 50% by weight. Subsequently, the obtained syrup was spray-dried with a spray dryer to obtain a powder product. The sugar composition is shown in Table 8. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0050]
[Table 8]

[0051]
Example 7
Potato starch was liquefied using α-amylase by a conventional method to prepare a starch liquefaction solution having a concentration of 5% by weight and a glucose equivalent of 3. Next, the starch liquefaction solution was adjusted to pH 7.5, and then the culture supernatant of Bacillus clarkii (FERM BP-7156) was concentrated using a UF concentration membrane (PM-10) to prepare γ-CGTase as a crude enzyme. 400 units / g substrate was added as a liquid and reacted at 60 ° C. for 48 hours. Thereafter, the reaction solution is heated to 90 ° C. to inactivate the enzyme, cooled to 75 ° C., adjusted to pH 6, and CGTase derived from another genus Bacillus (Neo-CD amylase manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.) is added. 20 units / g substrate was added and allowed to react for 24 hours. The enzyme was inactivated by heating to 90 ° C., and the iodo reaction was eliminated using α-amylase, followed by purification such as decolorization and ion exchange to prepare syrup containing CD with a solid content of 75%. The sugar composition is shown in Table 9. The content of CD was determined by HPLC methods-1 and 2.
[0052]
[Table 9]

[0053]
Example 8
Immerse the spear that has been opened in a seasoning liquid having the composition shown in Table 10 for 20 minutes. This was sun-dried for 6 hours to obtain dried fish. This was stored in the freezer for 4 weeks without packaging, and with the salt-only seasoning as a control over time, the taste and odor of the dried fish soaked in various seasonings containing CDs were subjected to a sensory test to determine the deterioration of lipids. Was evaluated by measuring the peroxide value. The peroxide value was measured by a conventional method. The results of sensory test for taste and odor are shown in Table 11, and the measurement results of peroxide value are shown in FIG. As shown in Table 11, when various kinds of seasoning liquids containing CDs were used, good results were obtained for the evaluation items from the controls. However, in the seasoning liquids containing α- and β-CDs, Although there was a removal effect, the deterioration of lipid was not suppressed, and in the seasoning solution containing γ-CD, the deterioration of lipid was suppressed, but the effect of removing the odor was not so much seen. On the other hand, the CD syrup described in Example 4 was found to have a good odor removal effect by sensory test, and a good dried product in which the degradation of lipid was suppressed as shown in FIG.
[0054]
[Table 10]

[0055]
[Table 11]

[0056]
Evaluation is based on Kramer's test method.
○: Significantly preferred or strong with a risk factor of p <0.05
A: Significantly preferred or strong with a risk factor of p <0.01
Δ: preferred or strong
X: Significantly unfavorable or weak with a risk factor of p <0.05
XX: Significantly unfavorable or weak with a risk factor of p <0.01
▽: Unfavorable or weak
[0057]
【The invention's effect】
The present invention is a method for producing a CD using a novel CGTase produced by a microorganism belonging to the genus Bacillus clarkii having CGTase-producing ability. According to the present invention, inexpensive CD syrup can be contained in a balance that is most suitable for the application, and it can be produced in a suitable balance to produce a syrup that can be used for any application. The contribution is great.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a measurement result of a peroxide value for evaluating the deterioration of lipids.

Claims

Strains other than cyclodextrin / glucanotransferase and Bacillus clarkii produced by Bacillus clarkii species in a solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose Of α-, β-, and γ-cyclodextrins, characterized in that α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin are produced by simultaneously reacting cyclodextrin / glucanotransferase produced by Method.

A solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose is reacted with a cyclodextrin / glucanotransferase produced by Bacillus clarkii species, and then Bacillus clarkii Α-, β-, and γ-cyclodextrin, characterized by reacting cyclodextrin glucanotransferase produced by strains other than the species to produce α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin A method for producing a mixture.

A solution containing at least one selected from the group consisting of starch, dextrin, amylopectin and amylose is reacted with a cyclodextrin / glucanotransferase produced by a strain other than a Bacillus clarkii species, Α-, β-, and γ-cyclodextrins characterized by reacting with cyclodextrin glucanotransferase produced by Bacillus clarkii) to produce α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin A method for producing a mixture.

The production method according to any one of claims 1 to 3, wherein the cyclodextrin / glucanotransferase produced by a Bacillus clarkii species is a cyclodextrin / glucanotransferase having the following enzymatic chemical properties.
(1) Action and substrate specificity: Acts on starch, dextrin, amylopectin or amylose to mainly produce γ-cyclodextrin, and the amount of β- and α-cyclodextrin produced is compared with that of γ-cyclodextrin Low.
(2) Optimum pH: 10.5-11.0
(3) Optimum temperature: around 60 ° C (4) Stable pH: 6-11
(5) Temperature stability: Shows a residual activity of 90% or more after treatment at 50 ° C for 15 minutes.

Cyclodextrin / glucanotransferase produced by strains other than Bacillus clarkii is a cyclodextrin / glucanotransferase that produces less γ-cyclodextrin than β- and α-cyclodextrin. The manufacturing method as described in any one of Claims 1-4.

Cyclodextrin-glucanotransferase is a cyclodextrin-glucanotransferase from the genus Bacillus, cyclodextrin-glucanotransferase from the genus Klebsiella, cyclodextrin-glucanotransferase from the genus Thermoanaerobactor And at least one selected from the group consisting of cyclodextrin and glucanotransferase derived from the genus Brevibacterium.

The reaction conditions are set so that the production amount of α-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2 and the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2 when the production amount of γ-cyclodextrin is 1. The manufacturing method as described in any one of Claims 1-6 to set.

The reaction conditions are set so that the production amount of β-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 1.5 and the production amount of γ-cyclodextrin is in the range of 0.1 to 2 when the production amount of α-cyclodextrin is 1. The manufacturing method as described in any one of Claims 1-6 to set.

The production method according to any one of claims 1 to 8, wherein the solution containing the mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin is purified to obtain a cyclodextrin mixture syrup.

9. The solution containing a mixture of α-, β-, and γ-cyclodextrin formed is purified to obtain a cyclodextrin mixture syrup, and the resulting syrup is dried to obtain a cyclodextrin mixture powder. The manufacturing method according to claim 1.

The manufacturing method of the food-drinks containing the cyclodextrin mixture obtained by the method as described in any one of Claims 1-10.