JP3833152B2 - Method for detection and subtype identification of human herpesvirus 6 (HHV-6) DNA - Google Patents

Description

【００２１】
たとえば、上記プライマーセット−１を用いた場合、そのＰＣＲ増幅産物の長さは、ＨＨＶ−６タイプＢ株ではタイプＡ株より１０８ bp 長くなる。また、プライマーセット−２を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株より２２８ bp 長くなる。またプライマーセット−３を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株より３３６ bp 長くなる。何れのプライマーセットを用いた場合でもＨＨＶ−６タイプＢ株とタイプＡ株でのＰＣＲ産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株を識別することが可能である。
【００２２】
従って、本発明は、上記プライマーセット−１の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に掛けて、配列番号１に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、上記プライマーセット−２の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に掛けて、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、上記プライマーセット−３の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に掛けて、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００２５】
ここで、ポリメラーゼ連鎖反応については、公知の技術が適用され、また、サイズ分析においては、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これらの方法は特定のものに限定されない。
【００２６】
既にＨＨＶ−６のタイプが明らかにされている１３株を用いて、上記プライマーセット−２を用いてＰＣＲを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバンドがそれぞれ確認され、本発明によってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが明らかとなった（図２参照）。
【００２７】
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ量が十分な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡを確認できるが、臨床検体等でＨＨＶ−６ ＤＮＡ量が少ない検体においては、ＰＣＲ後でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッティングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によってＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を同定することができる。これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、タイプＡ及びＢの双方に共通な配列であるため、どちらのタイプのＨＨＶ−６ ＤＮＡでも検出することができる。一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとして用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプＡのＨＨＶ−６ ＤＮＡには存在しない配列であるため、タイプＢのＨＨＶ−６ ＤＮＡとのみハイブリダイズする。ここで、プライマーセット−１または−３を用いてＰＣＲを行った場合、タイプＢ特異的なプローブは配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマーセット−２又は−３を用いた場合、タイプＢ特異的なプローブは配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。
【００２８】
従って、プライマーセット−１，−２又は−３を用いてＰＣＲを行った後、これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全部をプローブとしてＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を確認した後、配列番号１又は２に示したポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部をプローブとしてＨＨＶ−６タイプＢを同定することにより、ＨＨＶ−６のタイピングを行うことができる。もちろん、多量のＨＨＶ−６ ＤＮＡが利用できる場合には、ＰＣＲの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド配列をプローブとして組み合わせることにより、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。
【００２９】
あるいは、ＨＨＶ−６タイプＡとＢのＤＮＡ塩基配列の違いを利用して、タイプＡ特異的プローブ及びタイプＢ特異的プローブを設定し、これらのプローブの認識部位を含むＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が可能である。このための有効なプローブの例として、次のものが挙げられる。

【００３０】
従って、本発明は、上記ヌクレオチド配列(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプＡ及びタイプＢに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に少なくとも１つずつプローブとして用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢを識別する方法をも提供する。
【００３１】
本発明によれば、下記のヌクレオチド配列：

若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに配列番号１及び２に示されるヌクレオチド配列若しくはその相補的配列又はその部分配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列をプローブとして用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６ ＤＮＡを検出することも可能であり、従って、本発明はＨＨＶ−６ ＤＮＡの検出方法も提供する。
【００３２】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３３】
実施例１
ａ）ＤＮＡの抽出
ヒト末梢血単核球培養細胞にＨＨＶ−６を感染させ、培養後、感染細胞を遠心により収集する。感染細胞沈渣に細胞溶解用緩衝液（10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 0.4% SDS, 10mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K ）を０．４ml加え、６５℃で一夜（又は５６℃で３時間）インキュベートする。インキュベーション後、フェノール／クロロホルム（１：１）混合液を２００μｌ加え、激しく振盪し、遠心処理によって液を２層に分離し、上部の水層を回収する。同操作を更に２回繰り返し行った後、３００μｌのクロロホルムを加え激しく振盪し、更に遠心処理を行った後上部の水層を回収する。同操作を更にもう一度繰り返す。最終的に回収した水層に１０μｇの酵母ｔＲＮＡと３倍量のエタノールを加え、−７０℃、１時間以上静置する。遠心処理によってＤＮＡを沈殿させた後、沈渣を８０％エタノールで洗浄、風乾し、０．５×ＴＥ（5mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA）に溶解し、ＰＣＲ用サンプルとした。
【００３４】
ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６ ＤＮＡ
上記サンプルを用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲに関しては、例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(1985)参照）。ＨＨＶ−６としてはＨＳＴ株とＵ１１０２株を用いて行った。また、プライマーとしては以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３５】

ＰＣＲを行うに当っては、上記プライマーの組み合わせとしてＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ及びＢとＤの組み合わせでそれぞれ行った。
【００３６】
ＰＣＲの反応条件は、サンプル１〜１０μｌを用い、終濃度が10mM Tris-HCl (pH8.3), 1.5mM MgCl2 , 0.01％ゼラチン，dNTP 200μＭ，各プライマー５０ｐＭ，Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組成を加え、最終５０μｌとして９０℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分のサイクルを２５サイクル繰り返しＰＣＲを行った（図３）。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に掛けてサイズにより分析した。
【００３７】
図３に示すように、４組のプライマー何れの組み合わせにおいてもＵ１１０２株のＰＣＲ産物はＨＳＴ株のＰＣＲ産物に比較してその長さが明らかに短く、両株を容易に判別することができた。
【００３８】
実施例２
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ１１０２株及びＧＳ株（1986, Science, 234, 596-601 ）、タイプＢであることが知られているＨＳＴ株（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）、Ｚ２９株（1988, J. Infect. Dis, 157, 1271-1273）及びＥｎｄｅｒｓ株とタイプＡに特異的なモノクローナル抗体とタイプＢに特異的なモノクローナル抗体の両方に反応することからタイプＡとタイプＢの中間型と考えられているＤＡ株を用いてＰＣＲによって各タイプを識別できるかどうか検討を行った。又その他、臨床検体として国内の突発性発疹急性期患者の末梢血から分離されたＯＫＣ株、ＮＫＴ株、１０３株、１０１株、Ｉｎｏｕｅ株及びＫｉｔａｈａｒａ株とＨＨＶ−６と一部相同性があるといわれているＨＨＶ−７（1990, Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 748-752）についても検討した。ＤＮＡの抽出は、実施例１に述べた方法に準拠して行った。
【００３９】
ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６のタイピング
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行い、またプライマーとしては実施例１で示したプライマーのＡとＣの組合わせを用いて行った。結果を図２に示した。
【００４０】
プライマーＡとＣの組み合わせでは、タイプＢのＨＳＴ株は５５４ bp のＰＣＲ産物を生じ、タイプＡのＵ１１０２株では３２６ bp のＰＣＲ産物を生じる。図２から明らかなようにタイプＢに属するＺ２９株、及びＥｎｄｅｒｓ株は何れも同じタイプＢのＨＳＴ株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプＡに属するＧＳ株は同じタイプＡのＵ１１０２株と同じ泳動位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることによってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが検証された。又両タイプの中間型と考えられていたＤＡ株では３２６ bp のバンド以外に５５４ bp 付近に弱いバンドが検出され、このことから、ＤＡ株は中間型ではなく両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられた。
【００４１】
また、国内の突発性発疹患者からの分離株は全てＨＳＴ株と同じタイプＢであった。ＨＨＶ−７は本法では検出されなかった。
【００４２】
実施例３
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ１１０２株とタイプＢであることが知られているＨＳＴ株を用い、それぞれ実施例１で述べた方法に準拠してＤＮＡの抽出を行った。
【００４３】
ｂ）プローブの調製
配列番号１に示される配列を利用したプローブは、その配列内に、５’−ＧＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧ−３’及び５’−ＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＧ−３’の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ標識することによって調製した。
【００４４】
配列番号２に示される配列を利用したプローブは、その配列内に、５’−ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣ−３’及び５’−ＧＡＴＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣ−３’の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ標識することによって調製した。
【００４５】
ｃ）ＰＣＲ及びサザンブロットハイブリダイゼーション
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとしてＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号１に示される配列を含む領域の増幅には５’−ＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−３’及び５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’の組み合わせを用いた。又配列番号２に示される配列を含む領域の増幅には、実施例１で示したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行った。
【００４６】
ＰＣＲによって増幅した産物は、１％アガロースゲル内で電気泳動した後、ＤＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に転写した。転写した膜を２％ＳＤＳ、３％スキムミルクを含む６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４））中６５℃、６時間行った後、同液中に32Ｐ標識したプローブを加えた液と交換し、更に６５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、膜を２×ＳＳＰＥで室温２０分洗浄し、更に２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回、０．２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回行った。洗浄後の膜をＸ線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させることによってプローブのハイブリダイゼーションの有無を確認した。
【００４７】
図４には、配列番号１に示される配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示した。
【００４８】
図５には、配列番号２に示される配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示した。
【００４９】
何れの場合においても、配列番号１及び２に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タイプＢに属するＨＳＴ株のＤＮＡとのみハイブリダイズし、タイプＡであるＵ１１０２株のＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。従って、これら配列番号１及び２に示されるＤＮＡ配列をプローブとして利用することにより、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。
【００５０】
実施例４
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ１１０２株およびタイプＢであることが知られているＨＳＴ株、またタイプ不明の臨床分離株１及び２の感染ヒト末梢血単核球培養細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は実施例１に述べた方法に準拠して行った。
【００５１】
ｂ）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅及びドットブロット
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行い、またプライマーとしては実施例１で示したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。これらのＰＣＲ産物をナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋）に０．５μｌずつ載せ、０．４Ｎ ＮａＣｌで２０分間処理した後、６×ＳＳＰＥで中和した。
【００５２】
ｃ）アルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプローブの調製
ＨＨＶ−６タイプ特異的酵素標識プローブとしては、５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイプＡに特異的なプローブ、５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイプＢに特異的なプローブとして用いるため、これらをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（３８１Ａ）を用いて合成し、アミノリンクIIを用いてその５’末端にアミノ基を付加した。アミノ基を付加したＤＮＡをＥＭＣＳ［Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］を用いてマレイミド化し、一方アルカリフォスファターゼは２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅを用いてＳＨ基を付加した。両者を混合反応させることによりアルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプローブを作製した。
【００５３】
ｄ）ハイブリダイゼーション
ｂ）で作製したメンブレンフィルターを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで室温で５分間洗浄、更に２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて４０℃、５分間の洗浄を３回行った。ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１％Ｃａｓｅｉｎ）を用いて５０℃、３０分間ブロッキングを行い、次にｃ）で調製した酵素標識プローブ２種のうち１種を加え（アルカリフォスファターゼの最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）、５０℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣを用いて室温で５分間の洗浄を２回行った。アルカリフォスファターゼ基質反応液（0.3M Tris−HCl 、0.1M NaCl、50mM MgCl2 （pH 9.8））を加え、室温で５分間インキュベートした後、ＮＴＢ溶液［７０％ Ｎ’Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＮＴＢ（Ｎｉｔｒｏ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｌｕｅ）を７５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したもの］を３３μｌ／７．５ｍｌ、ＢＣＩＰ溶液［100 ％Ｎ’Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅを５０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したもの］を２５μｌ／７．５ｍｌ加え、３７℃で２時間反応させた。
【００５４】
結果を図６に示した。図６のＡではタイプＡに特異的なプローブをＢではタイプＢに特異的なプローブを用いた。またＰＣＲ産物の１はＵ１１０２株、２はＨＳＴ株、３は臨床分離株１、４は臨床分離株２を示している。図に示す通り、タイプＡ特異的プローブはＵ１１０２株のＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、ＨＳＴ株とはハイブリダイズせず、またタイプＢ特異的プローブはＨＳＴ株とハイブリダイズするがＵ１１０２株とはハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用いることにより、ＰＣＲ産物をサザンブロットすることなく、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速にタイプを識別することが可能である。また、この方法により、臨床分離株１はタイプＡ、臨床分離株２はタイプＢであることが判明した。
【００５５】
【発明の効果】
ＨＨＶ−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いものと考えられるが、これまでそのタイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本発明によって臨床検体からＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在の有無を判定することができるばかりか、そのタイピングを簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたものと考えられる。
【００５６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＨＶ−６ Ｕ１１０２株と比較される、ＨＳＴ株ゲノム上の新規１０８ bp 及び２２８ bp ヌクレオチド配列部位を示す。
【図２】タイプＡ及びＢのいずれかに属する１３種類のＨＨＶ−６株と２種類のＨＨＶ−７株について、各ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。
【図３】４種類のプライマーセットを用いてＨＳＴ株とＵ１１０２株のＤＮＡの各ＰＣＲを実施した後、アガロースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。
【図４】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにして作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示す写真である。
【図５】配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにして作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示す写真である。
【図６】タイプＡに特異的なプローブ（Ａ）又はタイプＢに特異的なプローブ（Ｂ）を用いるハイブリダイゼーションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すドットブロット写真である。
【符号の説明】
１ Ｕ１１０２株、
２ ＨＳＴ株、
３ 臨床分離株
４ 臨床分離株[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting human herpesvirus 6 (HHV-6) DNA and identifying subtypes of HHV-6.
[0002]
[Prior art]
Human herpesvirus type 6 (hereinafter referred to as HHV-6) was isolated as the sixth herpesvirus in 1986 by Saluhuddin et al. From patients with acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and lymphocytes from patients with lymphoid diseases. (1986, Science,234, 596-601), and in 1988, it was revealed by Yamanishi et al. (1988, Lancet, 1065-1067) that it was the causative virus for sudden rashes.
[0003]
HHV-6 was originally isolated from human immunodeficiency virus (HIV) positive lymphoma and lymphadenitis, and HIV negative lymphoma, and HHV-6 DNA was found in B lymphoma. It has been suggested that In addition, after renal transplantation, the HHV-6 antibody titer rose prominently, and HHV-6 was isolated from patient lymphocytes in which rejection occurred, suggesting a relationship with rejection after organ transplantation ( 1990, Transplantation,49, 519-522).
[0004]
In the majority of people, HHV-6 infection is established within the first year of life, as evidenced by studies on antibody retention (1989 J. Clin. Microbiol.27651-653), the route of infection of the virus is still unclear. There are reports that HHV-6 has been separated from saliva.
[0005]
Recently, HHV-6 has been divided into two subtypes due to DNA polymorphism (1991 J. Clin. Microbiol29, 367-372), and attention is being paid to the difference in biological properties such as pathogenicity difference, cell affinity difference, and proliferation difference between types. So far, type A HHV-6 has been mainly isolated from AIDS patients and patients with lymphocytic diseases, whereas Prksannonda et al. Have isolated HHV from a child who is believed to have developed fever due to the initial infection with HHV-6. -6 all reported type B (1992, The New England Journal of Medicine,326, 1445-1550).
[0006]
Thus, typing of HHV-6, i.e. type determination, is considered interesting in the context of various diseases. However, the conventional method used for typing HHV-6 is to extract and purify DNA from the isolated virus, digest the virus DNA with a restriction enzyme, and then perform electrophoresis, and examine the polymorphism by the electrophoresis pattern. Have been identified by staining virus-infected cells with a fluorescent antibody method using monoclonal antibodies specific for each of type A and type B. However, all of these methods involve operations such as virus isolation and culture, which not only requires a lot of time and effort, but also could not be identified without virus isolation. .
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, typing of HHV-6 is considered to be interesting in relation to various diseases, but all of the conventional techniques involve virus separation by cell culture and are very complicated.
[0008]
An object of the present invention is to provide an HHV-6 type-specific DNA for solving the above problems, and to provide a simple method for HHV-6 typing.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have determined the nucleotide sequence of one of the immediate early genes of the HST strain (K. Takahashi et al., J. Virol., 316-13163, 1989) belonging to HHV-6 type B. Was compared with the nucleotide sequence (1991, J. Virol 65, 5381-5390) of the same region of the U1102 strain belonging to the previously reported HHV-6 type A. As a result, a characteristic difference was found between the base sequences of the HST strain and the U1102 strain, and the present invention was completed. That is, in the HST strain that the inventors of the present invention have analyzed its base sequence and the previous early genes of the previously reported U1102 strain, two new polynucleotide insertions not found in the U1102 strain are found in the HST strain. Was observed (see FIG. 1). One site was 108 bp and the other site was 228 bp. The respective base sequences are shown in the sequence listing below as SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively.
[0010]
The new 108 bp and 228 bp polynucleotide sequences are considered to be characteristic sequences of the HHV-6 strain belonging to type B, as is clear from the results of the HHV-6 typing shown in FIG.
[0011]
Accordingly, the present invention provides a nucleotide sequence derived from human herpesvirus 6 shown in SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a partial sequence thereof. The present invention also provides a nucleotide sequence derived from human herpesvirus 6 shown in SEQ ID NO: 2, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a partial sequence thereof.
[0012]
In this specification, the term “HHV-6 (sub) type B” is used to refer to a type of HHV-6 that contains the polynucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, in viral DNA. The term “HHV-6 (sub) type A” is also used to refer to a type of HHV-6 that does not contain both such polynucleotide sequences.
[0013]
Therefore, by taking advantage of the above differences between type A and type B of HHV-6, for example, by DNA hybridization using a DNA sequence characteristic of type B as a probe, subtypes of HHV-6 (A and B ) Can be identified.
[0014]
Thus, the present invention relates to human herpesvirus type 6 by DNA hybridization using the nucleotide sequence derived from HHV-6 shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence or a partial sequence thereof as a probe. A method for identifying subtypes A and B is provided.
[0015]
The present invention also provides subtype A of human herpesvirus 6 by DNA hybridization using the nucleotide sequence derived from HHV-6 shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence or a partial sequence thereof as a probe. And B are provided.
[0016]
The present invention further provides human herpesvirus type 6 by DNA hybridization using the nucleotide sequence derived from HHV-6 shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence or a partial sequence thereof as a probe. Provides a method for identifying subtypes A and B.
[0017]
For DNA hybridization, the technique described in Molecular Cloning, 1989, etc. is applied. At this time, an enzyme (for example, alkaline phosphatase), a radioisotope (for example, 32P) or the like is used as a labeling substance for the labeled DNA.
[0018]
When the HHV-6 content in a human sample such as blood is low, for example, in the early stage of infection, a primer set having a sequence common to types A and B is sandwiched between the 108 bp and 228 bp insertion regions. If DNA is amplified by performing polymerase chain reaction (PCR), it is possible to distinguish both types from the difference in PCR product length.
[0019]
Preferred examples of primer sets that can be used for the above purpose are listed below. These primer sets were specifically selected from consensus sequences of HHV-6 type A and type B DNA in the vicinity of the novel 108 bp and 228 bp nucleotide sequences present on HHV-6 type B DNA. The sequence actually used as a primer is a partial sequence or a full sequence of the nucleotide sequence shown in the sequence of the primer set. In addition to the nucleotide sequences listed below, it is also possible to select various possible sequences based on the determined sequences and apply them to the identification method of the present invention.
[0020]

[0021]
For example, when the above primer set-1 is used, the length of the PCR amplification product is 108 bp longer in the HHV-6 type B strain than in the type A strain. When Primer Set-2 is used, the Type B strain is 228 bp longer than the Type A strain. When Primer Set-3 is used, the Type B strain is 336 bp longer than the Type A strain. Regardless of which primer set is used, the length of the PCR product between the HHV-6 type B strain and type A strain differs greatly, so that both strains can be easily separated by size analysis such as normal agarose gel electrophoresis. It is possible to identify.
[0022]
Therefore, the present invention uses the combination of primers I and II selected one by one from the primer set-1 to perform polymerase chain reaction of human herpesvirus 6 (HHV-6) DNA in a sample. And amplifying the HHV-6 DNA, and then subjecting the amplified product to size analysis, containing the nucleotide sequence derived from HHV-6 shown in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a partial sequence thereof And a method for discriminating between subtypes A and B of HHV-6 by separating HHV-6 DNA that does not contain the sequence and HHV-6 DNA that does not contain the sequence.
[0023]
The present invention also performs a polymerase chain reaction of human herpesvirus type 6 (HHV-6) DNA in a specimen using a combination of primers I and II selected one by one from the primer set-2. After the HHV-6 DNA is amplified, the amplified product is subjected to size analysis, and the nucleotide sequence derived from HHV-6 shown in SEQ ID NO: 2, or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence or a partial sequence thereof is contained. Separation into HHV-6 DNA and HHV-6 DNA that does not contain the sequence provides a method for distinguishing between subtypes A and B of HHV-6.
[0024]
The present invention further performs a polymerase chain reaction of human herpesvirus type 6 (HHV-6) DNA in a specimen using a combination of primers I and II selected one by one from the primer set-3. After amplifying the HHV-6 DNA, the amplified product was subjected to size analysis, and the nucleotide sequence derived from HHV-6 shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence or a partial sequence thereof was obtained. Separation into HHV-6 DNA containing and HHV-6 DNA not containing the sequence provides a method for distinguishing subtypes A and B of HHV-6.
[0025]
Here, a known technique is applied to the polymerase chain reaction, and a technique such as agarose gel electrophoresis is used in the size analysis, and these methods are not limited to specific ones.
[0026]
When PCR was performed using the above primer set-2 using 13 strains for which the type of HHV-6 was already clarified, bands with characteristic lengths for each type were confirmed, respectively. It became clear that HHV-6 typing is possible (see FIG. 2).
[0027]
If the amount of DNA amplified by PCR is sufficient, it can be confirmed by staining with ethidium bromide after agarose gel electrophoresis. However, in clinical specimens and other specimens with low HHV-6 DNA content, ethidium bromide is still present after PCR. A specific band may not be confirmed by staining. In such a case, after Southern blotting, the presence of HHV-6 DNA can be identified by a hybridization method using the polynucleotide in the primer set as a probe. Since the polynucleotide sequences in these primer sets are sequences common to both types A and B, both types of HHV-6 DNA can be detected. On the other hand, when a part or all of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence is used as a probe, this polynucleotide sequence is a sequence that does not exist in type A HHV-6 DNA. It hybridizes only with B HHV-6 DNA. Here, when PCR is performed using the primer set-1 or -3, a part or all of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence is used as the type B specific probe. When primer set-2 or -3 is used, the type B-specific probe uses a part or all of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence.
[0028]
Therefore, after performing PCR using primer set-1, -2 or -3, the presence of HHV-6 DNA was confirmed using any one or all of the polynucleotide sequences in these primer sets as probes. Then, HHV-6 typing can be performed by identifying HHV-6 type B using a part or all of any one of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 or its complementary sequence as a probe. it can. Of course, when a large amount of HHV-6 DNA is available, it is possible to type HHV-6 by omitting the PCR process and directly combining the polynucleotide sequence as a probe.
[0029]
Alternatively, a type A specific probe and a type B specific probe are set using the difference in the DNA base sequence of HHV-6 type A and B, and the PCR product of HHV-6 DNA containing the recognition sites of these probes is used. If hybridization is performed, the type can be determined. Examples of effective probes for this purpose include the following.

[0030]
Accordingly, the present invention independently provides each nucleotide sequence specific to type A and type B, which consists of the above nucleotide sequences (1) and (2), a nucleotide sequence complementary to these sequences, or a partial sequence thereof, respectively. There is also provided a method of distinguishing human herpesvirus 6 subtypes A and B by hybridizing with human herpesvirus 6 DNA in a sample using at least one probe.
[0031]
According to the invention, the following nucleotide sequence:

Alternatively, DNA hybridization using as a probe a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence and at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 or a complementary sequence thereof or a partial sequence thereof Thus, it is possible to detect HHV-6 DNA, and therefore the present invention also provides a method for detecting HHV-6 DNA.
[0032]
【Example】
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
[0033]
Example 1
a) DNA extraction
Human peripheral blood mononuclear cell culture cells are infected with HHV-6, and after culturing, the infected cells are collected by centrifugation. Add 0.4 ml of cell lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.4% SDS, 10 mM EDTA, 1 mg / ml Proteinase K) to the infected cell sediment, and overnight at 65 ° C (or 56 ° C) Incubate for 3 hours). After incubation, 200 μl of a phenol / chloroform (1: 1) mixture is added, shaken vigorously, the solution is separated into two layers by centrifugation, and the upper aqueous layer is collected. After repeating this operation two more times, 300 μl of chloroform is added and shaken vigorously, and after further centrifugation, the upper aqueous layer is recovered. Repeat the same operation once more. To the finally recovered aqueous layer, 10 μg of yeast tRNA and 3 times the amount of ethanol are added and left at −70 ° C. for 1 hour or longer. After DNA was precipitated by centrifugation, the precipitate was washed with 80% ethanol, air-dried, dissolved in 0.5 × TE (5 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA), and used as a PCR sample. .
[0034]
b) HHV-6 DNA by PCR
PCR was performed using the above samples (for example, R. K. Saiki et al., Science,230, 1350 (1985)). As HHV-6, HST strain and U1102 strain were used. The following oligonucleotides were used as primers.
[0035]

In performing PCR, the combinations of the above primers were A and C, A and D, B and C, and B and D, respectively.
[0036]
PCR reaction conditions were 1 to 10 μl of sample, and the final concentrations were 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2, 0.01% gelatin, dNTP 200 μM, each primer 50 pM, and Taq polymerase 2.5 units. The composition was added, and PCR was performed by repeating a cycle of 90 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3 minutes for 25 cycles (FIG. 3). Amplified products were subjected to agarose gel electrophoresis and analyzed by size.
[0037]
As shown in FIG. 3, the PCR product of the U1102 strain was clearly shorter than the PCR product of the HST strain in any combination of the four primers, and both strains could be easily discriminated. .
[0038]
Example 2
a) DNA extraction
U1102 strain and GS strain known to be type A as HHV-6 (1986, Science, 234, 596-601), HST strain known to be type B (K. Takahashi et al., J Virol., 3161-3163, 1989), Z29 strain (1988, J. Infect. Dis, 157, 1271-1273) and Enders strain, type A specific monoclonal antibody and type B specific monoclonal antibody. Whether or not each type can be identified by PCR was examined using a DA strain considered to be an intermediate type between type A and type B because it reacts with both. In addition, as a clinical sample, it is partially homologous to HHV-6 with OKC strain, NKT strain, 103 strain, 101 strain, Inoue strain and Kitahara strain isolated from the peripheral blood of acute rash patients in Japan. The so-called HHV-7 (1990, Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 748-752) was also examined. DNA extraction was performed according to the method described in Example 1.
[0039]
b) HHV-6 typing by PCR
PCR was performed using DNA extracted from each of the above HHV-6 as a sample. PCR was performed according to the method shown in Example 1, and the primer was used in combination with the primers A and C shown in Example 1. The results are shown in FIG.
[0040]
With the combination of primers A and C, the Type B HST strain yields a 554 bp PCR product, and the Type A U1102 strain yields a 326 bp PCR product. As is clear from FIG. 2, bands of Z29 strain and Enders strain belonging to type B are detected at the same migration position as HST strain of the same type B, while GS strain belonging to type A is U1102 strain of the same type A. A band was detected at the same migration position, and it was verified that HHV-6 typing was possible by using the method of the present invention. In addition, a weak band was detected in the vicinity of 554 bp in addition to the 326 bp band in the DA strain that was considered as an intermediate type of both types, and this indicates that the DA strain is not an intermediate type but a mixture of both types of viruses. The possibility was considered.
[0041]
In addition, all isolates from patients with sudden rash in Japan were the same type B as the HST strain. HHV-7 was not detected by this method.
[0042]
Example 3
a) DNA extraction
Using the U1102 strain known to be type A as HHV-6 and the HST strain known to be type B, DNA was extracted in accordance with the method described in Example 1, respectively. .
[0043]
b) Probe preparation
In the probe using the sequence shown in SEQ ID NO: 1, a set of 5′-GTAGATAATTTAAAATACATGAGA-3 ′ and 5′-GTTTGATATTTTGTTCTTGTTGGG-3 ′ primers were set in the sequence, and the PCR method shown in Example 1 was used. Amplified DNA was prepared by labeling the amplified product with 32P using a random primer DNA labeling kit (Takara Shuzo).
[0044]
In the probe using the sequence shown in SEQ ID NO: 2, a set of primers of 5′-ACAACAGACAATTTTGCTTTACAGCC-3 ′ and 5′-GATCTACTAGACTTTCTACAGCTCC-3 ′ is set in the sequence, and the PCR method shown in Example 1 Amplified DNA was prepared by labeling the amplified product with 32P using a random primer DNA labeling kit (Takara Shuzo).
[0045]
c) PCR and Southern blot hybridization
PCR was performed using DNA extracted from each of the above HHV-6 as a sample. As a primer, a combination of 5'-GAGGAATCTTCTATCGAATCTATCC-3 'and 5'-TTCCCTGGCACATCTGGGAAGAGAG-3' was used for amplification of the region containing the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Amplification of the region containing the sequence shown in SEQ ID NO: 2 was performed using the combination of primers A and C shown in Example 1. PCR was performed according to the method shown in Example 1.
[0046]
The product amplified by PCR was electrophoresed in a 1% agarose gel, and then the DNA was transferred to a nylon membrane (Hybond N +; manufactured by Amersham). The transferred membrane was subjected to 6 × SSPE (0.9 M NaCl, 6 mM EDTA, 0.06 M sodium phosphate buffer (pH 7.4)) containing 2% SDS and 3% skim milk at 65 ° C. for 6 hours, and then the same. The solution was replaced with a solution in which a probe labeled with 32P was added, and hybridization was further performed at 65 ° C. for 16 hours. After completion of hybridization, the membrane was washed with 2 × SSPE for 20 minutes at room temperature, and further washed twice with 2 × SSPE at 65 ° C. for 20 minutes and twice with 0.2 × SSPE at 65 ° C. for 20 minutes. The washed membrane was contacted with an X-ray film, and the film was exposed to light to confirm the presence or absence of probe hybridization.
[0047]
FIG. 4 shows an ethidium bromide staining (A) after agarose gel electrophoresis of the PCR product in the region containing the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the results of hybridization with a DNA probe prepared based on the sequence ( B).
[0048]
FIG. 5 shows an ethidium bromide-stained diagram after agarose gel electrophoresis of the PCR product in the region containing the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the result of hybridization with a DNA probe prepared based on the sequence ( B).
[0049]
In any case, both probes prepared based on the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 hybridize only with the DNA of the HST strain belonging to type B, and what is the DNA of U1102 strain that is type A? It did not hybridize. Therefore, by using these DNA sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 as probes, HHV-6 typing is possible.
[0050]
Example 4
a) DNA extraction
Infected human peripheral blood mononuclear cell culture cells of U110 strain known to be type A as HHV-6 and HST strain known to be type B, and clinical isolates 1 and 2 of unknown type More DNA was extracted. DNA extraction was performed according to the method described in Example 1.
[0051]
b) Amplification of DNA by PCR and dot blot
PCR was performed using DNA extracted from each of the above HHV-6 as a sample. PCR was performed according to the method shown in Example 1, and the primer was used in combination with the primer A and C shown in Example 1. Each of these PCR products was placed on a nylon membrane filter (Amersham Hybond N +) at 0.5 μl, treated with 0.4 N NaCl for 20 minutes, and then neutralized with 6 × SSPE.
[0052]
c) Preparation of alkaline phosphatase labeled DNA probe
As an HHV-6 type-specific enzyme-labeled probe, an oligonucleotide having 5′-GAACTCCATCAGCGGCCTCCCAG-3 ′ is a probe specific for type A, and an oligonucleotide having 5′-TAAATCCATTACACTGCCCTTGAA-3 ′ is specific for type B In order to use them as probes, they were synthesized using a DNA synthesizer (381A) manufactured by Applied Biosystems, and an amino group was added to the 5 ′ end using aminolink II. The DNA to which the amino group was added was maleimidized using EMCS [N- (ε-Maleimidocaproyloxy) succinimide], while the alkaline phosphatase was added with an SH group using 2-Iminothiolane. An alkaline phosphatase-labeled DNA probe was prepared by mixing the two.
[0053]
d) Hybridization
The membrane filter prepared in b) was washed with 2 × SSPE and 0.1% SDS at room temperature for 5 minutes, and further washed twice with 2 × SSPE and 0.1% SDS at 40 ° C. for 5 minutes. Blocking was performed using a hybridization solution (5 × SSPE, 5 × Denhardt's, 0.5% SDS, 1% Casein) at 50 ° C. for 30 minutes, and then among the two enzyme-labeled probes prepared in c) One species was added (final concentration of alkaline phosphatase 0.1 μg / ml), and hybridization was performed at 50 ° C. for 1 hour. After completion of hybridization, 1 × SSC, 1% SDS was used for 2 times of washing at 40 ° C. for 5 minutes, 1 × SSC, 1% Triton X-100 was used for 2 times of washing for 5 minutes at 40 ° C., 1 X Washing was performed twice for 5 minutes at room temperature using SSC. Alkaline phosphatase substrate reaction solution (0.3 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl2 (pH 9.8)) was added and incubated at room temperature for 5 minutes, and then NTB solution [NTB (Nitro Tetazolium Blue in 70% N'N-dimethylformamide) was used. ) In a concentration of 75 mg / ml], 33 μl / 7.5 ml, BCIP solution [100% N′N-dimethylformamide in BCIP (5-bromo-4-chloro-3-Indoylphosphate) to a concentration of 50 mg / ml 25 μl / 7.5 ml was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
[0054]
The results are shown in FIG. In FIG. 6A, a probe specific to type A was used, and in B, a probe specific to type B was used. PCR product 1 is U1102 strain, 2 is HST strain, 3 is clinical isolate 1 and 4 is clinical isolate 2. As shown in the figure, the type A specific probe hybridizes with the PCR product of the U1102 strain, but does not hybridize with the HST strain, and the type B specific probe hybridizes with the HST strain but does not hybridize with the U1102 strain. It did not soy. By using these probes, it is possible to easily and quickly identify the type by performing dot blotting without Southern blotting of PCR products. This method also revealed that clinical isolate 1 was type A and clinical isolate 2 was type B.
[0055]
【The invention's effect】
Although HHV-6 typing is considered interesting in the context of various diseases, until now it has required more than a few weeks of typing. According to the present invention, it is possible not only to determine the presence or absence of HHV-6 DNA from clinical specimens, but also to be able to easily and quickly perform typing, which is an extremely effective research tool in the fields of clinical medicine and basic medicine. Is considered to have been provided.
[0056]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows novel 108 bp and 228 bp nucleotide sequence sites on the HST strain genome compared to HHV-6 U1102 strain.
FIG. 2 shows the sizes of 13 types of HHV-6 strains and 2 types of HHV-7 strains belonging to either type A or B, obtained by subjecting each viral DNA to PCR amplification and agarose gel electrophoresis. It is a migration photograph which shows that subtype identification is possible by.
FIG. 3 shows that subtypes can be identified by size obtained by performing agarose gel electrophoresis after each PCR of DNA of HST strain and U1102 strain using 4 types of primer sets. It is the electrophoresis photograph shown.
FIG. 4 is an ethidium bromide-stained diagram after agarose gel electrophoresis of the PCR product in the region containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and hybridization with a DNA probe prepared based on the sequence. It is a photograph which shows the result (B).
FIG. 5 is an ethidium bromide staining diagram after agarose gel electrophoresis of a PCR product in the region containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and hybridization with a DNA probe prepared based on the sequence. It is a photograph which shows the result (B).
FIG. 6 is a dot blot photograph showing the result of subtype identification by hybridization using a probe specific to type A (A) or a probe specific to type B (B).
[Explanation of symbols]
1 U1102 shares,
2 HST strain,
3 clinical isolates
4 clinical isolates

Claims (1)

Human herpesvirus 6 by DNA hybridization using as a probe a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a partial sequence thereof having a length of at least 15 base pairs Method for detecting type subtype B.

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