JP3831784B2 - Novel microorganism having dioxin resolution and dioxin decomposition method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイオキシン分解能を有する新規微生物、ダイオキシン分解方法、及び前記分解方法に用いるのに適した新規廃培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ダイオキシンによる環境汚染が問題になってきている。特に廃棄物などの焼却に関する分野では、その排気ガス中に含まれるダイオキシンが野外に放出されることにより、土壌のダイオキシン汚染の原因となったり、あるいは、焼却灰中に混入しているダイオキシンがそのまま焼却灰の最終処分場に運ばれることにより、周辺の土壌や地下水等のダイオキシン汚染の原因となったりしている。
【０００３】
有機塩素化合物の一種であるダイオキシンは、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素によって結び付けられた骨格構造をもつ化合物（ジベンゾフラン又はジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）の総称であり、この骨格に塩素が置換することによって、理論的にはそれぞれ１３５種類及び７５種類の異性体が存在する［紙パルプ技協誌４５（８），ｐ８８７，１９９１年］。ダイオキシンは、一般に毒性が高く、化学的に安定で、分解されにくいばかりではなく、脂溶性が高いため、生体組織中に蓄積しやすいと言われている。しかし、その毒性は、塩素の置換位置と置換した塩素数により、大きく変化し、毒性が極めて低いダイオキシンも存在する。ダイオキシンの中でも、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）は、最も毒性が高い（ＡＬＰＨＡ，Ｎｏ．５，２，１９９１年）。
【０００４】
このようなダイオキシンを分解除去する公知技術として、完全燃焼法（溶融固化処理法）、熱分解処理法（加熱脱塩素化処理法）、ペレット化焼成法、光分解法、各種化学的分解法、及び超臨界水処理法などが報告されている。しかし、最終処分場周辺及び農地などの汚染土壌中あるいは焼却灰などのダイオキシン処理には、その微量で広範囲に分散しているといった特徴から、前記公知技術の適用は困難であるとされている。
【０００５】
このように、環境中に微量で広範囲に分散しているダイオキシンを分解する方法として、微生物利用技術（バイオレメディエーション技術）が報告されてきている。例えば、Ｖａｌｌｉらは、（１）木材腐朽菌の一種であるファネロカエテ・キリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ：以下、ＰＣ菌と略称する）により、ダイオキシンの１種である２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（以下、２，７−ＤＣＤＤと略称する）を分解除去することができること、及び（２）前記ＰＣ菌が産生するリグニン分解に関与する酵素、すなわち、リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）及びマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）が、２，７−ＤＣＤＤの分解に関係していることを示した［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４（７），ｐ２１３１，１９９２年］。
【０００６】
また、リグニン分解に関与する酵素を産生することができる菌、すなわち、ダイオキシン分解菌が、色素レマゾールブリリアントブルーＲ（Ｒｅｍａｚｏｌ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）を脱色する性質を有することを利用して、野外から３種の菌（５６３菌株、Ｖ１菌株、及びＶ２菌株）を取得し、前記の菌３種と、リグニン分解能を有する木材腐朽菌３種［コリオルス・ベルシコロラ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、及びＰＣ菌］とについて、２，７−ＤＣＤＤ分解能を検討したところ、６種の菌すべてが２，７−ＤＣＤＤ分解能を有することが報告されている［紙パルプ技協誌，５０（１２），ｐ１２２，１９９６年］。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来報告されている前記ダイオキシン分解菌のダイオキシン分解能は、充分なレベルにまで達しているとは言えず、効率的にダイオキシンを分解するためには、従来公知のダイオキシン分解菌よりも、更にダイオキシン分解除去効率が優れている菌が求められていた。また、ダイオキシン分解能を有する微生物を散布した場合に、分解効率が或るレベルより高くならないことがあった。このような場合に、求められている分解効率を達成するには、大量の微生物を添加する必要があった。従って、本発明の課題は、ダイオキシン分解除去効率が優れているダイオキシン分解菌、ダイオキシン分解方法、及びそのダイオキシン分解方法に用いるのに適した廃培地を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記の課題は、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）１（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１８菌株）又はヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）２（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１９菌株）によって解決することができる。
また、本発明は、ダイオキシンの分解能を有し、前記ヒラタケを用いることを特徴とする、ダイオキシンの分解方法にも関する。本発明のダイオキシン分解方法の好ましい態様においては、前記ヒラタケの培養物、前記ヒラタケを担持する担体、又は前記ヒラタケを含む廃培地を用いる。
更にまた、本発明は、ダイオキシンの分解能を有し、前記ヒラタケを含有することを特徴とする、廃培地にも関する。
【０００９】
本明細書において、「ダイオキシン」とは、２個のベンゼン環が２個の酸素を介して縮合した構造を有する３環式化合物であるポリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、及び２個のベンゼン環が１個の酸素を介して縮合した構造を有する３環式化合物であるポリクロロジベンゾフランを意味する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明によるヒラタケ１及びヒラタケ２、並びにヒイロタケ１は、ダイオキシンの分解能を有する。
本発明による前記の各微生物は、例えば、紙パルプ技協誌，５０（１２），ｐ１２２，１９９６年に開示されている以下に示す方法によって、野外から単離することができる。前記単離方法は、リグニン分解に関与する酵素を産生することができる菌、すなわち、ダイオキシン分解菌が、色素レマゾールブリリアントブルーＲ（Ｒｅｍａｚｏｌ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）を脱色する性質を有することを利用したものである。
すなわち、野外より採取した試料を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を更に希釈したものをスクリーニング用の試料とする。色素レマゾールブリリアントブルーＲを含む寒天培地上に、前記スクリーニング用試料を塗布し、適温（例えば、約２５℃）で培養する。前記色素を脱色した菌を、平板塗抹法により分離し、スラントとして保存する。得られた微生物のダイオキシン分解能を、例えば、ダイオキシンの一種である２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（以下、２，７−ＤＣＤＤと略称する）を用いて評価することにより、本発明の微生物を得ることができる。
【００１１】
本発明者は前記の方法を用いて、キノコ栽培施設内の腐朽された広葉樹より本発明によるヒラタケ１を純粋分離し、広葉樹林の立ち枯れ部より本発明によるヒラタケ２を純粋分離した。これらのヒラタケ１菌株及びヒラタケ２菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７５１８、及びＦＥＲＭ Ｐ−１７５１９である。更に、本発明者は前記の方法を用いて、広葉樹の枯れ木上より本発明によるヒイロタケ１を純粋分離した。このヒイロタケ１菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７５２０である。
【００１２】
本発明によるダイオキシン分解方法においては、ダイオキシンの分解能を有し、ヒラタケ科ヒラタケ属に属する微生物及び／又は夕コウキン科シュタケ属に属する微生物（以下、単にダイオキシン分解微生物と称する）、好ましくはヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ２、及び／又は夕コウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１、より好ましくはヒラタケ１菌株ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１８、ヒラタケ２菌株ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１９及び／又はヒイロタケ１菌株ＦＥＲＭ Ｐ−１７５２０を用いること以外は、微生物を利用する公知のダイオキシン分解方法をそのまま利用することができる。
前記のダイオキシン分解微生物を利用して、ダイオキシン汚染物質（例えば、焼却灰）を無害化することができる。この無害化方法を実施するには、例えば、焼却灰に前記のダイオキシン分解微生物を添加することにより、焼却灰中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１３】
また、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、焼却炉からの排気ガスを無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、排気ガスの流路に前記のダイオキシン分解微生物を担持させた担体などを配置し、排気ガス中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１４】
更に、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、水中のダイオキシン（例えば、浸出水等の中のダイオキシン）を無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、浸出水をカラムに通し、その流路に前記のダイオキシン分解微生物を担持させた担体などを配置し、水中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
更に、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、汚泥やヘドロ中のダイオキシン（例えば、最終処分場の汚泥中のダイオキシン）を無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、汚泥やヘドロをリアクター内で土壌と混合してからダイオキシン分解菌と接触させるか、又は汚泥やヘドロをそのままダイオキシン分解菌と接触させて、汚泥やヘドロ中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１５】
更に、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、ダイオキシン汚染土壌を無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、前記のダイオキシン分解微生物をそのまま、あるいは、前記のダイオキシン分解微生物を担持させた担体を汚染土壌に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１６】
本発明の好ましいダイオキシン分解方法においては、前記のダイオキシン分解微生物の培養物、前記のダイオキシン分解微生物を担持する担体、又は前記のダイオキシン分解微生物を含む廃培地を、ダイオキシンで汚染されている被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に添加することができる。
【００１７】
本明細書において「ダイオキシン分解微生物の培養物」とは、ダイオキシン分解微生物をそのまま含む液体ないし固体の菌体含有培養物、それらの液体ないし固体培養物中のダイオキシン分解微生物を破砕した（例えば、ホモジナイザーで破砕した）菌体破砕培養物、あるいはそれらの液体ないし固体培養物からダイオキシン分解微生物を除去した（例えば、遠心分離で除去した）菌体除去培養物であることができる。液体培養物の調製には、液体培地、例えば、一般的にキノコの菌糸を増殖させる培地として使用されている培地、例えば、麦芽エキス・寒天（ＭＡ）培地、ジャガイモ・ブドウ糖寒天（ＰＤＡ）培地、エビオス・ブドウ糖培地、ＳＹＭ培地、又はＰＣＭＹ培地等を用いることができ、特にはＫｉｒｋの培地を使用するのが好ましい。前記の液体培地を用いて、ダイオキシン分解微生物を大量に培養することができる。
固体培養物の調製には、例えば、前記液体培地に寒天を加えて調製した固体培地を用いることができる。
【００１８】
前記の液体培養基に前記のダイオキシン分解微生物の菌糸を植菌し、こうして得られた前記のダイオキシン分解微生物を含む液体培養物を被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することができる。また、前記の液体培養物を、例えば、ホモジナイザーで処理して菌体を破砕した破砕培養物、あるいは前記の液体培養物を、例えば、遠心処理して菌体を除去した後の液相（菌体除去培養物）を被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することができる。
【００１９】
前記のダイオキシン分解微生物を担持する担体としては、例えば、活性炭や木質物質を用いることができる。木質物質としては、種々の形状の木材（例えば、木粉、又は木材チップ）、又は木質性廃棄物（例えば、藁、又は木くず等）を用いることができる。ダイオキシン分解微生物を担体上に担持させる方法としては、例えば広居らの方法［バイオマス変換計画報告書，Ｎｏ．１，２３−４１（１９８６）］や、Ｙｕｍらの方法［Ｗａｔｅｒ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｒｅｓ．７０（２），２０５−２１３（１９９８）］のように、適切な培地中で、ダイオキシン分解微生物を担体（例えば、木粉や木材チップ等）と共に培養し、前記ダイオキシン分解微生物を前記担体（例えば、木粉や木材チップ等）の上へ担持させた後、それら担体を含む培養液の形で汚染焼却飛灰、汚染土壌又は汚染水中へ添加することができる。
【００２０】
本明細書において「廃培地」とは、前記のダイオキシン分解微生物を培養している培地から発生した子実体の採取を２〜３回程度行った後の培地を意味し、好ましくはキノコの菌床栽培用培地の廃培地を意味する。子実体を採取した後の廃培地には前記のダイオキシン分解菌が繁殖しており、培養物中と同様に高濃度の分解菌を得ることができる。
【００２１】
前記の廃培地は、一般的にキノコ用培地（特に、キノコの菌床栽培用培地）として用いられている培養基から得ることができる。具体的には、例えば、鋸屑（例えば、スギ鋸屑）、米ぬか、及びモミ殻の混合物に、水を加えて含水率５０〜８０％にした培養基を、耐熱性プラスチックフィルム（例えば、ポリプロピレン又はポリエチレンフィルム）の袋に詰める。これを加熱滅菌（例えば、１１５〜１２０℃で２０〜４０分間）する。冷却後、種菌を接種して常温で暗所で２０〜３０日間培養する。菌糸が蔓延した培地を１０〜１５℃の明所におき、キノコ（子実体）を発生させる。ヒラタケの場合、７〜１０日後に収穫することができ、２〜３回程度収穫し終った培地を廃培地として利用することができる。こうして得られた前記のダイオキシン分解微生物を含む廃培地を被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することができる。
【００２２】
一般にヒラタケは菌床栽培され、キノコ（子実体）を収穫した後の培地（すなわち廃培地）の処理に困っている。本発明によればこの廃培地をダイオキシン分解剤として利用することができる。また、この廃培地を用いる本発明方法では、ダイオキシン分解微生物の添加量を自由に調節することが可能であり、土壌に大量の菌糸を接種することもできるので、ダイオキシンの分解時間が大幅に短縮され、ダイオキシン類の分解率を大きく向上させることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ヒラタケ１菌株、ヒラタケ２菌株、及びヒイロタケ１菌株の単離及び同定》
キノコ栽培施設内の腐朽された広葉樹、広葉樹林の立ち枯れ部、及び広葉樹の枯れ木上より採取した試料を、２〜３白金耳の量（すなわち、白金耳に２〜３杯の量）で殺菌蒸留水１０ｍｌに懸濁させた。更に、その懸濁液を１０００倍〜１００００倍の範囲で希釈した希釈液をスクリーニング用試料とした。
スクリーニング用の寒天培地プレートとして、下層にＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地（１０ｍｌ）を、上層に１％色素（Ｒｅｍａｚｏｌ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）と５ｐｐｍベノミールとを含む麦芽−寒天培地（８ｍｌ）を重層することにより調製した寒天培地プレートを使用した。なお、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地の組成は、例えば、［西山隆造著「図解応用微生物の基礎知識」（１９９２年）オーム社，ｐ１５３］に記載されており、具体的には、スクロース（１０ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（１ｇ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．５ｇ）、ＫＣｌ（０．５ｇ）、ＮａＮＯ3（２．０ｇ）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０１ｇ）、及び寒天（１５ｇ）を蒸留水（１０００ｍｌ）に加えた後に、ｐＨを５．６に調整し、オートクレーブ滅菌したものである。
前記の寒天培地プレート上に、前記スクリーニング用試料（１ｍｌ）を塗布し、暗所で２５℃で培養した。前記色素を脱色した菌を平板塗抹法により分離し、スラントとして保存した。後述する「分解能の評価」に記載の方法に従って、スラントとして保存した各種菌について２，７−ＤＣＤＤ分解能を評価したところ、２，７−ＤＣＤＤ分解能の優れた菌株３種を得ることができた。キノコ栽培施設内の腐朽された広葉樹から採取した菌株をヒラタケ１菌株と命名し、広葉樹林の立ち枯れ部から採取した菌株をヒラタケ２菌株と命名し、そして広葉樹の枯れ木上より採取したヒイロタケ１菌株と命名した。
【００２４】
前記のヒラタケ１及びヒラタケ２の子実体及び胞子の形態的特徽は以下のとおりである。
子実体は叢生し、カサは直径５〜１５ｃｍ程度であり、まんじゅう形から開いて貝殻形ないし半円形となり、時にじょうご形になる。ヒラタケ１は子実体が小型でかなり硬く、ヒラタケ２は小型で色が薄いという特徴を持つ。表面は始めほぼ黒色ないし灰青色であるが、後にねずみ色、灰褐色、灰白色、又はほとんど白色になる。ひだは柄に長く垂生し、白ないし灰色を呈する。柄の長さは１〜８ｃｍ程度であり、しばしば基部に白毛を密生するが、時にはほとんど無柄である。柄の傘に対する付き方は側生、偏心生、又は中心生などがある。胞子紋は淡ピンクないし淡柴灰色である。胞子は７．５〜１１μｍ×３〜４μｍで円柱形である。
以上の特徴より、ヒラタケ１とヒラタケ２は「Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ」であることが明瞭である。
なお、これらのヒラタケ１菌株及びヒラタケ２菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７５１８、及びＦＥＲＭ Ｐ−１７５１９である。
【００２５】
前記のヒイロタケ１の子実体及び胞子の形態的特徽は以下のとおりである。
傘は半円形で、鮮やかな朱紅色を呈するが、雨風にさらされると色が褪せる。表面は無毛及び平滑であり、環紋は不明瞭である。肉はコルク質ないし革質であり、断面は濃淡の縞模様をあらわす。傘の下面は濃赤紅色であり、管孔は長さ１〜２ｍｍ程度であり、孔ロは微細で、１ｍｍに６〜８個でやや超肉眼的である。胞子は超楕円形で、無色及び平滑であり、４〜５μｍ×２μｍ程度である。
以上の特徴より、ヒイロタケ１は「Ｐｙｃｎｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ」であることが明瞭である。
なお、これらの株はヒイロタケ１と表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７５２０である。
【００２６】
《分解能の評価》
（１）色素脱色能による評価〔その１〕
前記実施例１に記載のスクリーニング用寒天培地プレートを用いて、色素（Ｒｅｍａｚｏｌ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）を脱色する能力に関し、以下の表１に記載の各微生物を評価した。評価は、脱色能及び脱色速度に関して以下のとおり３段階で行った。
脱色能：
＋＋＋：強，＋＋：中，＋：弱。
脱色速度：
Ａ：速い，Ｂ：中程度，Ｃ：遅い。
（２）色素脱色能による評価〔その２〕
前記実施例１に記載のスクリーニング用寒天培地プレートを用いて、色素（Ｒｅｍａｚｏｌ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）を脱色する能力に関し、本発明によるヒラタケ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１８）及びヒラタケ２（ＦＥＲＭＰ−１７５１９）と市販のヒラタケ〔ＫＨ−３，千曲化成（株）〕を評価した。結果を以下の表２に示す。
（３）ダイオキシン（２，７−ＤＣＤＤ）の分解能の評価
（イ）２，７−ＤＣＤＤの合成
ダイオキシンの分解能評価に用いるダイオキシンの一種である２，７−ＤＣＤＤを、Ａｄｖａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．，１２０，ｐ１２６，１９７３年に記載の方法に従って、下記の手順で合成した。
すなわち、２−ブロモ−４−クロロフェノール（５．１９ｇ）に１Ｎメタノール性ＫＯＨ（２９．５ｍｌ）を加えて溶解した後に、そのまま２時間放置した。その後、前記溶液を減圧濃縮することにより得られた濃縮物に、ベンゼン（２．５ｍｌ）及びヘキサン（５ｍｌ）を加えた。上層を除去した後、減圧乾燥することにより、２−ブロモ−４−クロロフェノールのカリウム塩（６．１４ｇ）を得た。
一方、硫酸銅（５水塩）（７３ｇ）を蒸留水（２８０ｍｌ）に溶かした溶液に、窒素を吹き込みながら、撹拌下に亜鉛末（２３．０ｇ）を０．５ｇずつ加えた。前記混合物を７０℃に加温した後に、吸引ろ過した。残さを５％塩酸で洗浄した後に、蒸留水で中性まで洗浄することにより、銅触媒（１５．８４ｇ）を得た。調製した触媒は、使用前まで冷蔵庫で保存した。
前記のとおりに調製した２−ブロモ−４−クロロフェノールのカリウム塩（３．６６ｇ）に、ビス（２−エトキシエチル）エーテル（５ｍｌ）、エチレンジアセテート（０．０５ｍｌ）、及び前記のとおりに調製した銅触媒（２０ｍｇ）を加え、２００℃で１５時間加熱還流した。冷却した後に、生成物をクロロホルムで抽出した。クロロホルム抽出液を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で抽出し、アルカリ可溶部を除去した後に、硫酸ナトリウム（無水）で乾燥した。その後、減圧濃縮して、反応生成物（４．４５ｇ）を得た。この生成物を１７０℃（２５ｍｍＨｇ下に）で３時間昇華し、白色結晶（３．１８ｇ）を得た。この結晶をメタノールより再結晶することにより、白色結晶として２，７−ＤＣＤＤ（２．９５ｇ）を得た（融点＝２０９〜２１１℃；収率＝３９．２％）。
【００２９】
（ロ）液体培養における分解能の評価方法
本発明のダイオキシン分解菌３種のダイオキシン分解除去効率の評価は、液体中にて実施した。なお、比較用のダイオキシン分解菌としては、前記の市販ヒラタケ〔ＫＨ−３，千曲化成（株）〕、並びにＰＣ菌及びＶ２菌株を用いた。前記Ｖ２菌株は、本発明者の一人である橘らが過去に野外より単離したダイオキシン分解菌３種（５６３菌株、Ｖ１菌株、及びＶ２菌株）の中で、最も２，７−ＤＣＤＤ分解除去効率が高かった菌株である［紙パルプ技協誌，５０（１２），ｐ１２２，１９９６年］。
【００３０】
Ｋｉｒｋら（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１１７，ｐ２７７，１９７８年）のＢａｓａｌ溶液に、２０ｍＭコハク酸ナトリウム、２％グルコース、及び窒素源として１．２ｍＭ酒石酸アンモニウムを加えた後に、ｐＨを４．５に調整した培地を、培養用の液体培地とした。前記液体培地をオートクレーブで滅菌した後に、１００ｍｌの三角フラスコ毎に液体培地（２０ｍｌ）を分注し、この中に供試菌を１白金耳植菌し、フラスコにダブルキャップをして２５℃で静置培養した。なお、毎日１回の頻度で、各培養フラスコに酸素を吹き込んだ。
６日間培養した後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）に溶解した２，７−ＤＣＤＤ（１．２６ｍｇ）（２，７−ＤＣＤＤ添加濃度＝０．２５ｍＭ）を添加した。２，７−ＤＣＤＤを添加した後に、更に、１５日間又は３０日間培養処理した（比較用のＰＣ菌及びＶ２菌株については３０日間培養のみ）。培養期間中は、毎日１回の頻度で、酸素を吹き込んだ。実験は、各菌株、及び各培養期間について２組ずつ行い、これを２回繰り返して、その平均値をデータとした。
【００３１】
ダイオキシン分解効率は、以下の方法で評価した。すなわち、前記条件にて培養した後に、培養液を希塩酸でｐＨを２．０に調整し、これに酢酸エチル（４０ｍｌ）を加え、激しく撹拌した。その後、吸引ろ過し、培養ろ液を取り、酢酸エチル層と水層とを分離した。水層は、更に、酢酸エチルで２回抽出（各４０ｍｌ）した。この抽出液と前記酢酸エチル層とを合併し、飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄後、硫酸ナトリウム（無水）で乾燥し、その後、減圧濃縮により代謝物を得た。この代謝物（１．０ｍｇ）にＮ，Ｏ−ビス−トリメチルシリルアセトアミド（４０μｌ）、トリメチルクロロシラン（２０μｌ）、及びピリジン（４０μｌ）を加え、加温（８０℃、１０分間）することにより、トリメチルシリル（ＴＭＳ）化したものをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）用試料とした。
【００３２】
この試料をＧＣに注入し、予め作成しておいた検量線より、２，７−ＤＣＤＤを定量した。ＧＣの条件は、以下のとおりである。
（１）カラム：ＴＣ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
（２）温度：１００℃で１分間保持した後に１０℃／分で２９５℃まで昇温し、２９５℃で２０分間保持
（３）検出器：ＦＩＤ
（４）注入口温度：２５０℃
（５）検出器温度：２５０℃
（６）キャリアーガス：ヘリウム（３ｋｇ／ｃｍ2）、エアー（１．１ｋｇ／ｃｍ2）、スプリット比：１：３０
【００３３】
２，７−ＤＣＤＤの分解除去率は、培養開始時の２，７−ＤＣＤＤの添加量と培養後の代謝物中の２，７−ＤＣＤＤの量とから求めた。実験の結果を表３に示す。
【００３４】
（４）ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）分解能の評価
本発明のダイオキシン分解菌ヒラタケ１のダイオキシン分解除去効率の評価を、液体中に溶解した２，３，７，８−ＴＣＤＤを用いて実施した。なお、比較用のダイオキシン分解菌としては、前記の市販ヒラタケ〔ＫＨ−３、千曲化成（株）〕を用いた。
前記のＢａｓａｌ溶液を培養用の液体培地として、オートクレーブ滅菌した後に、１００ｍｌの三角フラスコ毎に液体培地（２０ｍｌ）を分注し、この中に供試菌を１白金耳植菌し、フラスコにダブルキャップをして２５℃暗所で静置培養した。なお、毎日１回の頻度で、各培養フラスコに酸素を吹き込んだ。
６日間培養した後に、酢酸エチル（１００μｌ）に溶解した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１ｎｇ）を添加した。２，３，７，８−ＴＣＤＤを添加した後に、更に１５日間又は３０日間培養処理した。培養期間中は、毎日１回の頻度で、酸素を吹き込んだ。
【００３６】
ダイオキシン分解効率は、以下の方法で評価した。すなわち前記条件にて培養した後に、培養液を分液ロートに移し、フラスコの洗浄液も同様に分液ロートに加えた。これに、Ｃ13でラベル化した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１０ｎｇ）を加えた。その後、濃硫酸（２０ｍｌ）を添加して菌体を完全に溶解してから抽出した。すなわち、ｎ−ヘキサン１５ｍｌで抽出した後、再び２０ｍｌのｎ−ヘキサンで抽出した（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，６２，ｐ４３２３，１９９６年）。フラスコの壁面に付着していて分液ロートに洗い込めなかった試料は、フラスコにアセトン１０ｍｌを加えて、超音波処理にかけて抽出した。その後、アセトン５ｍｌとヘキサン５ｍｌとの混合液をヘキサン１０ｍｌで抽出し、これらの抽出液と分液ロートで抽出したヘキサン溶液を一緒にしてから濃縮した。濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して分析試料とした。
この、試料をＧＣ−ＭＳ（ＳＩＭ法）によって分析し、予め作成しておいた検量線より、２，３，７，８−ＴＣＤＤを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は以下の通りである。
（１）カラム：ＨＰ−１（０．３２μｍ×３０ｍ）
（２）温度：７０℃で１分間保持した後、１８０℃まで１０℃／分で昇温し、その後１８０℃から２５２℃まで４℃／分で昇温した。
（３）注入口温度：２５０℃、スプリットレス
２，３，７，８−ＴＣＤＤの分解除去率は、培養開始時の２，３，７，８−ＴＣＤＤの添加量と培養後の代謝物中の２，３，７，８−ＴＣＤＤの量とから求めた。実験結果を表４に示す。
【００３７】
《廃培地を用いたバイオレメディエーション》
本発明のダイオキシン分解菌の廃培地を用いて、土壌中ダイオキシンのバイオレメディエーションを実施した。
（１）廃培地の作成
ナラのチップに栄養剤としてＮ源を添加した培養基を含水率６５％に調整した後、１２０℃で４５分間のオートクレーブ処理を行って滅菌した。その後、予めナラのチップに蔓延させた種菌〔ヒラタケ１菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１８）〕を接種し、２５℃で静置した。その後、１５日間から２０日間培養させると、菌糸が全体に蔓延した。子実体の採取を２回実施した後の培地を、以下の実験で廃培地として使用した。
【００３９】
（２）模擬汚染土壌中の２，３，７，８−ＴＣＤＤのバイオレメディエーション通常の非汚染土壌に、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．１％を含む蒸留水５０ｍｌに溶解した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１ｎｇ）を添加し、模擬汚染土壌を作製した。この模擬汚染土壌に、前記（１）で調製した廃培地を乾燥重量比（土壌：廃培地）３：１で混合した。１０日間２５℃の条件で暗所で前培養した後に、更に１５日間又は３０日間培養処理した。
前記の培養期間の終了後に、土壌３０ｇ（乾燥重量）を秤量し、５００ｍｌのコニカルビーカーに入れ、２Ｎエタノール性ＫＯＨ（２００ｍｌ）を加え５分間撹拌混合してから一晩室温の条件で暗所で放置し、菌体を溶解させた。
その後、前記コニカルビーカーの内容物をブフナーロートでろ過し、残渣とろ液に分けた。残渣を少量のエタノールで４〜５回洗浄した後、すべての残渣についてスツクスレー抽出を行った。抽出液は濃縮後にｎ−ヘキサンで転溶した。一方、ろ液はｎ−ヘキサンで抽出し、ｎ−ヘキサンで転溶した溶液と合併した。
上記のｎ−ヘキサン溶液に、Ｃ13でラベル化した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１０ｎｇ）を加えた。その後、濃硫酸（３０ｍｌ）を添加してから濃縮した。濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。回収した試料はアルミナカラムクロマトグラフィーで再度精製し、回収した溶液を分析試料とした。
この試料をＧＣ−ＭＳ（ＳＩＭ法）によって分析し、予め作成しておいた検量線より、２，３，７，８−ＴＣＤＤを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は、前記の「ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）の分解能の評価」で記載した条件と同じである。
２，３，７，８−ＴＣＤＤの分解除去率は、処理開始時の２，３，７，８−ＴＣＤＤの添加量と処理後の土壌中の２，３，７，８−ＴＣＤＤの量とから求めた。実験結果を表５に示す。
【００４０】
（３）ダイオキシン汚染土壌中のダイオキシンのバイオレメディエーション
水田から採取したダイオキシン汚染土壌に前記（１）で調製した廃培地を乾燥重量比（土壌：廃培地）３：１で混合した。１０日間２５℃の条件下で暗所で前培養した後に、更に１５日間又は３０日間培養処理した。
前記の培養期間の終了後に、土壌３０ｇ（乾燥重量）を秤量し、５００ｍｌのコニカルビーカーに入れ、２Ｎエタノール性ＫＯＨ（２００ｍｌ）を加え５分間撹拌混合してから一晩室温の条件下で暗所で放置し、菌体を溶解させた。その後、前記コニカルビーカーの内容物をブフナーロートでろ過し、残渣とろ液に分けた。残渣を少量のエタノールで４〜５回洗浄した後、すべての残渣についてスックスレー抽出を行った。抽出液は濃縮後ｎ−ヘキサンで転溶した。一方、ろ液はｎ−ヘキサンで抽出し、ｎ−ヘキサンで転溶した溶液と合併した。
濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー並びにアルミナカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣ−ＭＳによってダイオキシンを定量した。
ダイオキシンの分解除去能は、各異性体の濃度に毒性等価係数（ＴＥＦ）をかけた毒性等量（ＴＥＱ）で比較し、処理開始時のＴＥＱと処理後の土壌中のＴＥＱとから求めた。実験結果を表６に示す。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の微生物は、ダイオキシンを高効率に分解除去することができるので、例えば、ダイオキシンにより汚染された最終処分場周辺及び農地などの土壌及び焼却灰のなどの浄化に利用することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel microorganism having a dioxin decomposing ability, a dioxin decomposition method, and a novel waste medium suitable for use in the decomposition method.
[0002]
[Prior art]
In recent years, environmental pollution by dioxins has become a problem. Especially in the field of incineration of waste, etc., dioxins contained in the exhaust gas are released into the field, causing dioxin contamination of the soil or dioxins mixed in the incineration ash as it is. By being transported to the final disposal site for incineration ash, it may cause dioxin contamination of surrounding soil and groundwater.
[0003]
Dioxin, a kind of organic chlorine compound, is a general term for compounds having a skeleton structure in which two benzene rings are linked by one or two oxygens (dibenzofuran or dibenzo-p-dioxin). In theory, there are 135 and 75 isomers, respectively [Paper and Pulp Technical Journal 45 (8), p887, 1991]. Dioxins are generally said to be highly toxic, chemically stable, not easily decomposed, and highly fat-soluble, so that they easily accumulate in living tissues. However, its toxicity varies greatly depending on the position of chlorine substitution and the number of substituted chlorines, and there are dioxins with extremely low toxicity. Among dioxins, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) is the most toxic (ALPHA, No. 5, 2, 1991).
[0004]
Known technologies for decomposing and removing such dioxins include complete combustion method (melt solidification treatment method), thermal decomposition treatment method (heat dechlorination treatment method), pelletization firing method, photolysis method, various chemical decomposition methods, And supercritical water treatment methods have been reported. However, it is said that it is difficult to apply the above-mentioned known technology to the dioxin treatment of contaminated soil such as around the final disposal site, agricultural land, or incinerated ash, because it is dispersed in a small amount over a wide range.
[0005]
Thus, microorganism utilization technology (bioremediation technology) has been reported as a method for decomposing dioxins dispersed in a small amount in the environment over a wide range. For example, Valli et al. (1) Phanerochaete chrysosporium (hereinafter abbreviated as PC fungus), which is a kind of wood-destroying fungus, uses 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin (a kind of dioxin). (Hereinafter abbreviated as 2,7-DCDD) and (2) enzymes involved in lignin degradation produced by the PC bacteria, ie, lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) , 2,7-DCDD has been shown to be related to the degradation [J. Bacteriology, 174 (7), p2131, 1992].
[0006]
Further, by utilizing the fact that a bacterium capable of producing an enzyme involved in lignin degradation, that is, a dioxin-degrading bacterium, has a property of decolorizing the pigment Remazol brilliant blue R (remazol brilliant blue R). Acquired fungi (563 strain, V1 strain, and V2 strain), 3 types of the above-mentioned strains, and 3 types of wood-rotting fungi having lignin-degrading ability (Coriolis versicolor, Fusarium solani) , And PC fungi], the resolution of 2,7-DCDD was examined, and it was reported that all 6 types of fungi had 2,7-DCDD resolution [Paper and Pulp Technology Association, 50 (12) , P122, 1996].
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the dioxin-degrading ability of the dioxin-decomposing bacteria reported heretofore cannot be said to have reached a sufficient level, and in order to efficiently decompose dioxins, it is more than the conventionally known dioxin-degrading bacteria. There has been a demand for bacteria having excellent dioxin decomposition and removal efficiency. In addition, when microorganisms having dioxin decomposing ability are sprayed, the decomposition efficiency may not be higher than a certain level. In such a case, in order to achieve the required decomposition efficiency, it was necessary to add a large amount of microorganisms. Accordingly, an object of the present invention is to provide a dioxin degrading bacterium having excellent dioxin decomposing and removing efficiency, a dioxin decomposing method, and a waste medium suitable for use in the dioxin decomposing method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The above-mentioned problem is that oyster mushroom (Pleurotus osteretus) 1 belonging to the genus Oleander genus(FERM P-17518 strain)Or oyster mushroom (Pleurotus osteoreas) 2(FERM P-17519 strain)Can be solved by.
In addition, the present invention has dioxin resolution,Oyster mushroomIt also relates to a method for decomposing dioxins, characterized in that. BookIn a preferred embodiment of the dioxin decomposition method of the invention,Oyster mushroomA culture of saidOyster mushroomA carrier carryingOyster mushroomA waste medium containing is used.
Furthermore, the present invention has dioxin resolution,Oyster mushroomAlso relating to a waste medium, characterized in that it contains.
[0009]
In the present specification, “dioxin” means polychlorodibenzo-p-dioxin, which is a tricyclic compound having a structure in which two benzene rings are condensed via two oxygens, And polychlorodibenzofuran which is a tricyclic compound having a structure in which two benzene rings are condensed via one oxygen.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The oyster mushroom 1 and oyster mushroom 2 and hilotake 1 according to the present invention have a dioxin resolution.
Each of the microorganisms according to the present invention can be isolated from the field by the following method disclosed in, for example, Paper and Pulp Technical Journal, 50 (12), p122, 1996. The isolation method utilizes the fact that a bacterium capable of producing an enzyme involved in lignin degradation, that is, a dioxin-degrading bacterium has a property of decolorizing the dye Remazol brilliant blue R (Remazol brilliant blue R) It is.
That is, a sample collected from the field is suspended in distilled water, and a further diluted suspension is used as a screening sample. The screening sample is applied onto an agar medium containing the dye Remazol Brilliant Blue R and cultured at an appropriate temperature (for example, about 25 ° C.). Bacteria from which the pigment has been decolored are separated by flat plate smearing and stored as slants. The microorganism of the present invention is evaluated by evaluating the dioxin resolution of the obtained microorganism using, for example, 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin (hereinafter abbreviated as 2,7-DCDD) which is a kind of dioxin. Can be obtained.
[0011]
The inventor of the present invention purely separated the oyster mushroom 1 according to the present invention from the decayed broad-leaved tree in the mushroom cultivation facility and purely separated the oyster mushroom 2 according to the present invention from the withered portion of the broad-leaved forest. These oyster mushroom 1 strains and oyster mushroom 2 strains were deposited with the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute from August 18, 1999, and the accession numbers are FERM P-17518 and FERM P-17519, respectively. Furthermore, the inventor of the present invention purely isolated the bamboo shoot 1 according to the present invention from the dead tree of the hardwood using the above-mentioned method. This irotake 1 strain has been deposited with the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute from August 18, 1999, and the accession number is FERM P-17520.
[0012]
In the method for decomposing dioxins according to the present invention, microorganisms belonging to the genus Oleander and / or microorganisms belonging to the genus Stamenaceae (hereinafter simply referred to as dioxin-decomposing microorganisms) having a resolution of dioxins, preferably oyster mushrooms are preferable. Oyster mushrooms 1 belonging to the genus, Oyster mushrooms 2 belonging to the genus Oyster mushrooms, and / or Oyster mushrooms 1 belonging to the genus Stamenaceae, more preferably Oyster mushrooms 1 strain FERM P-17518, Oyster mushrooms 2 strain FERM P-17519 and / or Hilotake Except for using one strain FERM P-17520, a known dioxin decomposition method using a microorganism can be used as it is.
Dioxin pollutants (for example, incineration ash) can be detoxified using the dioxin-decomposing microorganism. In order to carry out this detoxification method, for example, it may be possible to decompose the dioxin in the incineration ash by adding the dioxin decomposing microorganism to the incineration ash.
[0013]
Further, the exhaust gas from the incinerator can be made harmless by using the dioxin decomposing microorganism. In order to carry out this detoxification method, for example, it is conceivable to dispose dioxins in the exhaust gas by arranging a carrier or the like carrying the dioxin-decomposing microorganisms in the exhaust gas flow path.
[0014]
Furthermore, dioxins in water (for example, dioxins in leachate) can be rendered harmless by using the dioxin-decomposing microorganism. In order to carry out this detoxification method, for example, it is conceivable that leachate is passed through a column, a carrier carrying the dioxin-decomposing microorganism is placed in the flow path, and the dioxin in water is decomposed.
Furthermore, dioxins in sludge and sludge (for example, dioxins in sludge at the final disposal site) can be detoxified using the dioxin-decomposing microorganism. In order to carry out this detoxification method, for example, sludge or sludge is mixed with soil in a reactor and then contacted with dioxin-degrading bacteria, or sludge or sludge is directly contacted with dioxin-degrading bacteria, and sludge or sludge is contacted. It may be possible to decompose the dioxin in it.
[0015]
Furthermore, the dioxin-degrading microorganism can be used to detoxify dioxin-contaminated soil. In order to carry out this detoxification method, for example, the dioxin-decomposing microorganism can be used as it is, or a carrier carrying the dioxin-decomposing microorganism can be sprayed on contaminated soil to decompose the dioxin in the soil. It is done.
[0016]
In a preferred dioxin decomposing method of the present invention, the culture product of the dioxin decomposing microorganism, the carrier supporting the dioxin decomposing microorganism, or the waste medium containing the dioxin decomposing microorganism is treated with dioxin. (For example, contaminated soil or incinerated ash).
[0017]
In the present specification, the “culture of dioxin-decomposing microorganism” means a liquid or solid cell-containing culture containing the dioxin-decomposing microorganism as it is, and the dioxin-degrading microorganism in the liquid or solid culture being crushed (for example, a homogenizer). Cell disrupted cultures, or cell cultures from which dioxin-degrading microorganisms have been removed (for example, removed by centrifugation) from liquid or solid cultures thereof. For the preparation of a liquid culture, a liquid medium, for example, a medium generally used as a medium for growing mushroom hyphae, such as malt extract / agar (MA) medium, potato / glucose agar (PDA) medium, Ebiose / glucose medium, SYM medium, PCMY medium, or the like can be used, and Kirk's medium is particularly preferable. Dioxin degrading microorganisms can be cultured in large quantities using the liquid medium.
For the preparation of the solid culture, for example, a solid medium prepared by adding agar to the liquid medium can be used.
[0018]
The liquid culture medium is inoculated with the mycelium of the dioxin-decomposing microorganism, and the liquid culture containing the dioxin-decomposing microorganism obtained in this manner is sprayed on an object to be treated (for example, contaminated soil or incinerated ash). Dioxins in it can be decomposed. In addition, the liquid culture is treated with a homogenizer, for example, and a crushed culture obtained by crushing microbial cells, or the liquid culture is subjected to, for example, centrifugation to remove the microbial cells (bacteria). A body-removed culture) can be sprayed on an object to be treated (for example, contaminated soil or incinerated ash) to decompose dioxins in the soil.
[0019]
As the carrier for supporting the dioxin-decomposing microorganism, for example, activated carbon or woody material can be used. As the woody material, various shapes of wood (for example, wood flour or wood chips) or woody waste (for example, firewood or wood waste) can be used. As a method for supporting dioxin-degrading microorganisms on a carrier, for example, the method of Hiroi et al. 1, 23-41 (1986)] and the method of Yum et al. [Water. Environ. Res. 70 (2), 205-213 (1998)], a dioxin-decomposing microorganism is cultured with a carrier (for example, wood flour or wood chip) in an appropriate medium, and the dioxin-degrading microorganism is , Wood flour, wood chips, etc.) and then added to contaminated incineration fly ash, contaminated soil or contaminated water in the form of a culture solution containing these carriers.
[0020]
In the present specification, the “waste medium” means a medium after the fruiting body generated from the medium in which the dioxin-degrading microorganism is cultured is collected about 2 to 3 times, preferably a fungus bed of mushrooms It means a waste culture medium for cultivation. The dioxin-degrading bacteria are propagated in the waste medium after the fruiting body is collected, and high-concentration degrading bacteria can be obtained as in the culture.
[0021]
The waste medium can be obtained from a culture medium generally used as a mushroom medium (in particular, a mushroom fungus cultivation medium). Specifically, for example, a culture medium obtained by adding water to a mixture of sawdust (for example, cedar sawdust), rice bran, and fir shells to have a water content of 50 to 80% is used as a heat resistant plastic film (for example, polypropylene or polyethylene film). ). This is heat sterilized (for example, at 115 to 120 ° C. for 20 to 40 minutes). After cooling, inoculate the inoculum and incubate at room temperature in the dark for 20-30 days. The medium in which the mycelium has spread is placed in a light place at 10 to 15 ° C. to generate mushrooms (fruit bodies). In the case of oyster mushrooms, it can be harvested after 7 to 10 days, and a medium that has been harvested about 2 to 3 times can be used as a waste medium. The waste medium containing the dioxin-decomposing microorganisms thus obtained can be sprayed on an object to be treated (for example, contaminated soil or incinerated ash) to decompose dioxins in the soil.
[0022]
In general, oyster mushrooms are cultivated in a fungus bed and are in trouble with the treatment of the medium (that is, the waste medium) after harvesting mushrooms (fruit bodies). According to the present invention, this waste medium can be used as a dioxin decomposing agent. In addition, in the method of the present invention using this waste medium, the amount of dioxin-decomposing microorganisms can be freely adjusted, and a large amount of mycelia can be inoculated on the soil, so the decomposition time of dioxins is greatly reduced. Therefore, the decomposition rate of dioxins can be greatly improved.
[0023]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[Example 1]
<< Isolation and identification of oyster mushroom 1 strain, oyster mushroom 2 strain, and oyster mushroom 1 strain >>
Samples collected from decayed broad-leaved trees in the mushroom cultivation facility, the broad-leaved forest stand, and the broad-leaved dead trees were sterilized and distilled in amounts of 2-3 platinum ears (ie, 2-3 cups per platinum ear) It was suspended in 10 ml of water. Further, a diluted solution obtained by diluting the suspension in the range of 1000 times to 10000 times was used as a screening sample.
As an agar plate for screening, a Czapek-Dox medium (10 ml) was prepared as a lower layer, and a malt-agar medium (8 ml) containing 1% dye (Remazol brilliant blue R) and 5 ppm benomile was layered as an upper layer. Agar plates were used. The composition of the Czapek-Dox medium is described, for example, in [Nakayama Takazo, “Basic Knowledge of Illustrated Applied Microorganisms” (1992) Ohmsha, p153]. Specifically, sucrose (10 g), KH2POFour(1 g), MgSOFour・ 7H2O (0.5 g), KCl (0.5 g), NaNOThree(2.0 g), FeSOFour・ 7H2O (0.01 g) and agar (15 g) were added to distilled water (1000 ml), the pH was adjusted to 5.6, and autoclaved.
On the agar plate, the screening sample (1 ml) was applied and cultured at 25 ° C. in the dark. Bacteria from which the pigment was decolored were separated by a plate smearing method and stored as a slant. When 2,7-DCDD resolution was evaluated for various bacteria stored as slants according to the method described in “Evaluation of resolution” described later, three strains having excellent 2,7-DCDD resolution could be obtained. A strain collected from a decayed broadleaf tree in a mushroom cultivation facility is designated as a oyster mushroom strain, a strain collected from the dead part of a broadleaf forest is designated as a oyster mushroom 2 strain, Named.
[0024]
Morphological characteristics of the fruit bodies and spores of the above-mentioned oyster mushroom 1 and oyster mushroom 2 are as follows.
The fruiting bodies are crowded and the cocoons are about 5 to 15 cm in diameter. They open from the bun shape to form a shell or semi-circle, and sometimes a funnel. Oyster mushrooms 1 are small and quite hard, and Oyster mushrooms 2 are small and light in color. The surface is initially almost black to grayish blue, but later becomes gray, grayish brown, grayish white, or almost white. The folds are long on the handle and appear white or gray. The length of the handle is about 1 to 8 cm, and white hair is often densely grown at the base, but sometimes it is almost unpatterned. There are side, eccentric, and central students who attach the handle to the umbrella. The spores are light pink or light shiba gray. The spores are 7.5 to 11 μm × 3 to 4 μm and are cylindrical.
From the above characteristics, it is clear that oyster mushroom 1 and oyster mushroom 2 are “Pleurotus ostereatus”.
In addition, these oyster mushroom 1 strain and oyster mushroom 2 strain were deposited to the Industrial Technology Research Institute from 18 August 1999, and the accession numbers are FERM P-17518 and FERM P-17519, respectively. .
[0025]
Morphological characteristics of the fruit bodies and spores of the above-mentioned Hilotake 1 are as follows.
The umbrella is semi-circular and has a bright vermilion color but fades when exposed to rain and wind. The surface is hairless and smooth, and the ring pattern is unclear. The meat is cork or leather, and the cross section shows light and shade stripes. The lower surface of the umbrella is dark red and red, the tube hole is about 1 to 2 mm in length, the hole B is fine, and 6 to 8 per 1 mm is slightly ultra-visual. The spore is super-elliptical, colorless and smooth, and is about 4 to 5 μm × 2 μm.
From the above characteristics, it is clear that Hilotake 1 is “Pycnporus coccineus”.
These strains are designated as Hirotake 1 and have been deposited with the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute from August 18, 1999. The deposit numbers are FERM P-17520, respectively.
[0026]
<< Evaluation of resolution >>
(1) Evaluation by dye decolorization ability [Part 1]
Using the agar plate for screening described in Example 1 above, each microorganism listed in Table 1 below was evaluated with respect to the ability to decolorize the dye (Remazol brilliant blue R). Evaluation was performed in three steps as follows with respect to the decolorization ability and the decolorization speed.
Decolorization ability:
++++: Strong, ++: Medium, +: Weak.
Decolorization speed:
A: Fast, B: Medium, C: Slow.
(2) Evaluation by dye decolorization ability [2]
Regarding the ability to decolorize the pigment (Remazol brilliant blue R) using the screening agar plate described in Example 1, the oyster mushroom 1 (FERM P-17518) and oyster mushroom 2 (FERMP-17519) according to the present invention are commercially available. Oyster mushroom [KH-3, Chikuma Kasei Co., Ltd.] was evaluated. The results are shown in Table 2 below.
(3) Evaluation of the resolution of dioxin (2,7-DCDD)
(B) Synthesis of 2,7-DCDD
2,7-DCDD, which is a kind of dioxin used for evaluating the resolution of dioxin, was obtained from Advan. Chem. Ser. , 120, p126, 1973, and was synthesized according to the following procedure.
That is, 1N methanolic KOH (29.5 ml) was added to 2-bromo-4-chlorophenol (5.19 g) and dissolved, and the mixture was allowed to stand for 2 hours. Thereafter, benzene (2.5 ml) and hexane (5 ml) were added to the concentrate obtained by concentrating the solution under reduced pressure. After removing the upper layer, it was dried under reduced pressure to obtain potassium salt of 2-bromo-4-chlorophenol (6.14 g).
On the other hand, 0.5 g of zinc dust (23.0 g) was added to a solution of copper sulfate (pentahydrate) (73 g) in distilled water (280 ml) with stirring while blowing nitrogen. The mixture was warmed to 70 ° C. and suction filtered. The residue was washed with 5% hydrochloric acid and then neutralized with distilled water to obtain a copper catalyst (15.84 g). The prepared catalyst was stored in a refrigerator until use.
To the potassium salt of 2-bromo-4-chlorophenol (3.66 g) prepared as above, bis (2-ethoxyethyl) ether (5 ml), ethylene diacetate (0.05 ml), and as above. The prepared copper catalyst (20 mg) was added, and the mixture was heated to reflux at 200 ° C. for 15 hours. After cooling, the product was extracted with chloroform. The chloroform extract was extracted with a 1N aqueous sodium hydroxide solution to remove the alkali-soluble part, and then dried over sodium sulfate (anhydrous). Then, it concentrated under reduced pressure and obtained the reaction product (4.45g). The product was sublimed at 170 ° C. (under 25 mmHg) for 3 hours to obtain white crystals (3.18 g). By recrystallizing this crystal from methanol, 2,7-DCDD (2.95 g) was obtained as white crystals (melting point = 209-211 ° C .; yield = 39.2%).
[0029]
(B) Evaluation method of resolution in liquid culture
Evaluation of the dioxin decomposing / removing efficiency of the three dioxin degrading bacteria of the present invention was carried out in a liquid. In addition, as a dioxin decomposing bacterium for comparison, the above-mentioned commercially available oyster mushroom [KH-3, Chikuma Kasei Co., Ltd.], PC bacterium and V2 bacterium were used. Among the three dioxin-degrading bacteria (563, V1, and V2 strains) previously isolated from the field by Tachibana et al., One of the present inventors, the V2 strain is the most 2,7-DCDD degradation removed. It is a strain with high efficiency [Paper and Pulp Technology Journal, 50 (12), p122, 1996].
[0030]
After adding 20 mM sodium succinate, 2% glucose, and 1.2 mM ammonium tartrate as a nitrogen source to the Basal solution of Kirk et al. (Arch. Microbiol, 117, p277, 1978), the pH was adjusted to 4.5. The medium was a liquid medium for culture. After sterilizing the liquid medium in an autoclave, dispense a liquid medium (20 ml) into every 100 ml Erlenmeyer flask, inoculate one platinum loop of the test bacteria into this, double cap the flask at 25 ° C. The culture was stationary. In addition, oxygen was blown into each culture flask once a day.
After culturing for 6 days, 2,7-DCDD (1.26 mg) (2,7-DCDD addition concentration = 0.25 mM) dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) (100 μl) was added. After 2,7-DCDD was added, the cells were further cultured for 15 days or 30 days (only 30 days for comparative PC bacteria and V2 strains). During the culture period, oxygen was blown once daily. The experiment was performed twice for each strain and each culture period, and this was repeated twice, and the average value was used as data.
[0031]
Dioxin decomposition efficiency was evaluated by the following method. That is, after culturing under the above conditions, the culture solution was adjusted to pH 2.0 with dilute hydrochloric acid, ethyl acetate (40 ml) was added thereto, and the mixture was vigorously stirred. Then, it filtered by suction, the culture filtrate was taken, and the ethyl acetate layer and the water layer were isolate | separated. The aqueous layer was further extracted twice with ethyl acetate (40 ml each). The extract and the ethyl acetate layer were combined, washed with saturated brine (50 ml), dried over sodium sulfate (anhydrous), and then concentrated under reduced pressure to obtain a metabolite. N, O-bis-trimethylsilylacetamide (40 μl), trimethylchlorosilane (20 μl), and pyridine (40 μl) were added to this metabolite (1.0 mg) and heated (80 ° C., 10 minutes) to obtain trimethylsilyl ( What was converted to TMS) was used as a sample for gas chromatography (GC).
[0032]
This sample was injected into the GC, and 2,7-DCDD was quantified from a calibration curve prepared in advance. The GC conditions are as follows.
(1) Column: TC-1 (0.25 mm × 30 m)
(2) Temperature: Hold at 100 ° C. for 1 minute, then increase the temperature to 295 ° C. at 10 ° C./min and hold at 295 ° C. for 20 minutes
(3) Detector: FID
(4) Inlet temperature: 250 ° C
(5) Detector temperature: 250 ° C
(6) Carrier gas: helium (3 kg / cm2), Air (1.1kg / cm2), Split ratio: 1:30
[0033]
The degradation removal rate of 2,7-DCDD was determined from the amount of 2,7-DCDD added at the start of culture and the amount of 2,7-DCDD in the metabolite after culture. The results of the experiment are shown in Table 3.
[0034]
(4) Dioxin (2, 3, 7, 8-TCDD) resolution evaluation
Evaluation of the dioxin decomposition removal efficiency of the dioxin-degrading bacterium Hiratake 1 of the present invention was carried out using 2,3,7,8-TCDD dissolved in a liquid. The commercially available oyster mushroom [KH-3, Chikuma Kasei Co., Ltd.] was used as a comparative dioxin degrading bacterium.
After autoclaving the above-mentioned Basal solution as a liquid medium for culture, dispense a liquid medium (20 ml) into every 100 ml Erlenmeyer flask. The cap was capped and the cells were statically cultured in the dark at 25 ° C. In addition, oxygen was blown into each culture flask once a day.
After culturing for 6 days, 2,3,7,8-TCDD (1 ng) dissolved in ethyl acetate (100 μl) was added. After 2,3,7,8-TCDD was added, the cells were further cultured for 15 days or 30 days. During the culture period, oxygen was blown once daily.
[0036]
Dioxin decomposition efficiency was evaluated by the following method. That is, after culturing under the above conditions, the culture solution was transferred to a separating funnel, and the washing solution for the flask was similarly added to the separating funnel. In addition, C132,3,7,8-TCDD (10 ng) labeled with. Thereafter, concentrated sulfuric acid (20 ml) was added to completely dissolve the microbial cells, followed by extraction. That is, after extracting with 15 ml of n-hexane, it was extracted again with 20 ml of n-hexane (Appl. Environ. Microbial., 62, p4323, 1996). A sample that adhered to the wall of the flask and could not be washed into the separatory funnel was extracted by adding 10 ml of acetone to the flask and subjecting it to ultrasonic treatment. Thereafter, a mixed solution of 5 ml of acetone and 5 ml of hexane was extracted with 10 ml of hexane, and these extracts and the hexane solution extracted with a separatory funnel were combined and concentrated. The concentrate was purified by silica gel column chromatography to obtain an analytical sample.
This sample was analyzed by GC-MS (SIM method), and 2,3,7,8-TCDD was quantified from a calibration curve prepared in advance. The conditions of GC-MS are as follows.
(1) Column: HP-1 (0.32 μm × 30 m)
(2) Temperature: After holding at 70 ° C. for 1 minute, the temperature was raised to 180 ° C. at 10 ° C./minute, and then the temperature was raised from 180 ° C. to 252 ° C. at 4 ° C./minute.
(3) Inlet temperature: 250 ° C, splitless
The degradation removal rate of 2,3,7,8-TCDD is the amount of 2,3,7,8-TCDD added at the start of culture and the amount of 2,3,7,8-TCDD in the metabolite after culture. I asked for it. The experimental results are shown in Table 4.
[0037]
《Bioremediation using waste medium》
Dioxin bioremediation in soil was carried out using the dioxin decomposing bacteria waste medium of the present invention.
(1) Preparation of waste medium
A culture medium in which N source was added as a nutrient to oak chips was adjusted to a moisture content of 65%, and then sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 45 minutes. Thereafter, an inoculum [Florus mushroom 1 (FERM P-17518)] previously spread on oak chips was inoculated and allowed to stand at 25 ° C. Thereafter, when the cells were cultured for 15 to 20 days, the mycelium spread throughout. The medium after the fruit body was collected twice was used as a waste medium in the following experiment.
[0039]
(2) Bioremediation of 2,3,7,8-TCDD in simulated contaminated soil 2,3,7,8-TCDD dissolved in 50 ml of distilled water containing 0.1% Tween 80 in ordinary non-contaminated soil ( 1 ng) was added to produce simulated contaminated soil. The waste medium prepared in the above (1) was mixed with the simulated contaminated soil at a dry weight ratio (soil: waste medium) 3: 1. After pre-culturing in the dark at 25 ° C. for 10 days, the cells were further cultured for 15 or 30 days.
At the end of the incubation period, weigh 30 g (dry weight) of the soil, put it in a 500 ml conical beaker, add 2N ethanolic KOH (200 ml), stir and mix for 5 minutes, then overnight at room temperature in the dark. The cells were left to dissolve.
Thereafter, the contents of the conical beaker were filtered with a Buchner funnel to separate the residue and the filtrate. The residue was washed 4-5 times with a small amount of ethanol, and then all the residues were subjected to a Stuxley extraction. The extract was concentrated with n-hexane after concentration. On the other hand, the filtrate was extracted with n-hexane and merged with a solution obtained by dissolving with n-hexane.
In the above n-hexane solution, C132,3,7,8-TCDD (10 ng) labeled with. Thereafter, concentrated sulfuric acid (30 ml) was added, followed by concentration. The concentrate was purified by silica gel column chromatography. The collected sample was purified again by alumina column chromatography, and the collected solution was used as an analysis sample.
This sample was analyzed by GC-MS (SIM method), and 2,3,7,8-TCDD was quantified from a calibration curve prepared in advance. The conditions of GC-MS are the same as the conditions described in “Evaluation of resolution of dioxin (2, 3, 7, 8-TCDD)”.
The decomposition removal rate of 2,3,7,8-TCDD is the amount of 2,3,7,8-TCDD added at the start of treatment and the amount of 2,3,7,8-TCDD in the soil after treatment. I asked for it. The experimental results are shown in Table 5.
[0040]
(3) Bioremediation of dioxins in dioxin contaminated soil
The waste medium prepared in (1) above was mixed at a dry weight ratio (soil: waste medium) 3: 1 to dioxin-contaminated soil collected from paddy fields. After pre-culturing in the dark at 25 ° C. for 10 days, the cells were further cultured for 15 or 30 days.
At the end of the incubation period, weigh 30 g (dry weight) of the soil, put it in a 500 ml conical beaker, add 2N ethanolic KOH (200 ml), stir and mix for 5 minutes, and then overnight at room temperature in the dark. And allowed to dissolve the cells. Thereafter, the contents of the conical beaker were filtered with a Buchner funnel to separate the residue and the filtrate. After the residue was washed 4-5 times with a small amount of ethanol, Soxhlet extraction was performed on all the residues. The extract was concentrated and then dissolved in n-hexane. On the other hand, the filtrate was extracted with n-hexane and merged with a solution obtained by dissolving with n-hexane.
The concentrate was purified by silica gel column chromatography and alumina column chromatography, and then dioxin was quantified by GC-MS.
The ability to decompose and remove dioxins was compared with the toxic equivalent (TEQ) obtained by multiplying the concentration of each isomer by a toxic equivalent coefficient (TEF), and determined from the TEQ at the start of treatment and the TEQ in the soil after treatment. Table 6 shows the experimental results.
[0042]
【The invention's effect】
Since the microorganism of the present invention can decompose and remove dioxins with high efficiency, it can be used, for example, for purification of soil around the final disposal site contaminated with dioxins, soil such as farmland, and incinerated ash.
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