JP3831155B2 - Ceramidase gene - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。更に詳しくは、セラミドの構造や機能等を解析するための脂質工学用試薬として、およびアトピー性皮膚炎の診断の指標として有用なセラミダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列に関する。また、本発明は、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法に関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチドの検出方法および該ポリペプチドをコードする遺伝子の検出方法に関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチドの検出方法および遺伝子の検出方法を用いるアトピー性皮膚炎の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セラミダーゼは、スフィンゴ脂質の一種であるセラミドをスフィンゴシンと脂肪酸に加水分解する酵素である。セラミドがセラミダーゼにより加水分解されて生成するスフィンゴシンは、プロテインキナーゼＣの阻害、ホスフォリパーゼＤの活性化、カルモジュリン依存性の酵素の阻害等の種々の生理活性を有しており、細胞の増殖や細胞内情報伝達に関与する事により、細胞機能の調節に働いていると考えられている重要な物質である。セラミダーゼはこのスフィンゴシン量の調整という重要な役割を担う酵素である。
【０００３】
セラミダーゼは、その至適ｐＨにより酸性セラミダーゼ、中性・アルカリ性セラミダーゼに分類される。これまで酸性域に至適ｐＨを有するセラミダーゼの存在は、ラット脳［バイオケミストリー（Biochemistry）、第8 巻、第1692〜1698頁（1969）］、モルモット上皮細胞［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第270 巻、第12677 〜12684 頁（1995）］、ヒト腎臓［バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）、第398 巻、第125 〜131 頁（1975）］、脾臓［バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ、第1004巻、第245 〜251 頁（1989）］、繊維芽細胞［バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J. ）、第205 巻、第419 〜425 頁（1982）］、上皮［フェブス・レターズ（FEBS Lett.）、第268 巻、第110 〜112 頁（1990）］等の哺乳動物組織、ヒト尿 [ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第270 巻、第11098 〜11102 頁（1995）] 等において報告されている。
【０００４】
これらのセラミダーゼのうちヒト尿より精製されたセラミダーゼのアミノ酸配列および塩基配列が決定されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第271 巻、第33110 〜33115 頁（1996）］。また、該遺伝子との相同性を利用してマウスのセラミダーゼ遺伝子が得られている［ジェノミックス（Genomics）、第50巻、第267 〜274 頁（1998）］。しかしこれらはいずれも哺乳類由来の酸性セラミダーゼであり、中性・アルカリ性セラミダーゼあるいは微生物由来のセラミダーゼのアミノ酸配列および塩基配列はこれまで明らかとなっていない。
【０００５】
一方、アトピー性皮膚炎患者の病変部表皮にはセラミダーゼを生産する微生物が存在することが明らかにされており、該酵素がアトピー性皮膚炎の原因あるいは憎悪に関与することが示唆されているが、該酵素はアルカリ性域に至適ｐＨを有するセラミダーゼ（以下、アルカリ性セラミダーゼという）である［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第273 巻、第14368 〜14373 頁（1998）］。
【０００６】
セラミダーゼを生産する微生物から天然のセラミダーゼを製造する場合には、酵素の生産を誘導するために培地に高価なスフィンゴ脂質を添加する必要があり、また、精製時には残存するスフィンゴ脂質またはその分解物をセラミダーゼを含有する画分から分離、除去する必要がある。さらに、培養中にスフィンゴミエリナーゼ等のセラミダーゼ以外の酵素が同時に生産されるため、これらの酵素から目的のセラミダーゼのみを分離精製することは困難である。さらに、微生物由来のアルカリ性セラミダーゼのアミノ酸配列や遺伝子構造は全く不明であり、遺伝子工学的なセラミダーゼの生産方法は利用できない。
【０００７】
さらに、セラミダーゼを生産する微生物の存在はアトピー性皮膚炎の診断の指標、治療効果の確認方法として期待されているが、このような微生物を簡便に検出、同定する手段は知られていない。従来は微生物を単離後培養し、セラミダーゼ活性を測定するという非常に煩雑な操作が必要であった。このように、より安価に高純度な微生物由来のセラミダーゼを製造する方法、ならびに簡便かつ短時間の操作でセラミダーゼを生産する微生物を検出する方法が求められている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドを提供することにある。本発明の第２の目的は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を提供することにある。本発明の第３の目的は、前記遺伝子を含有した形質転換体を提供することにある。本発明の第４の目的は、前記形質転換体を利用して高純度のセラミダーゼを容易にかつ大量に製造しうる製造方法を提供することにある。本発明の第５の目的は、本発明の遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを提供することにある。本発明の第６の目的は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を提供することにある。本発明の第７の目的は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いたセラミダーゼ遺伝子の検出方法またはそれに用いるキットを提供することにある。本発明の第８の目的は、本発明の抗体またはその断片を用いたセラミダーゼの検出方法またはそれに用いるキットを提供することにある。さらに、本発明の第９の目的は、本発明のセラミダーゼ遺伝子の検出方法または本発明のセラミダーゼの検出方法を用いたアトピー性皮膚炎の検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を単離するべく鋭意研究を重ねた結果、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の単離とその塩基配列の解明に成功し、さらにこの知見を基に高純度のセラミダーゼを容易にかつ大量に製造しうる方法およびセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの検出方法およびその遺伝子の検出方法を確立し、本発明の完成に至った。また、かかるセラミダーゼとアトピー性皮膚炎との相関関係を見出し、簡便なアトピー性皮膚炎の検出方法を確立することができた。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 配列表の配列番号１７に示された塩基配列からなるプライマー又は配列番号１８に示された塩基配列からなるプライマー、
〔２〕 前記〔１〕記載のプライマーを使用する、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の検出方法、
〔３〕 前記〔１〕記載のプライマーを含有してなる、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の検出に用いるためのキット、並びに
〔４〕 前記〔２〕記載の方法によりセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を検出する、アトピー性皮膚炎の検出方法、
に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（１）セラミダーゼ活性を有するポリペプチド
本発明において「セラミダーゼ」とは、前記のようにセラミドをスフィンゴシンと脂肪酸に加水分解する活性を有する酵素をいう。
【００１２】
セラミダーゼ活性は、例えば、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第273 巻、第14368 〜14373 頁（1998）に記載の方法に従って測定することができる。
【００１３】
本発明においては、セラミダーゼの起源は、特に限定されないが、例えば、細菌類、放線菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のセラミダーゼ、あるいは植物、動物、昆虫等の生物体由来のセラミダーゼが本発明に包含される。具体的には、例えば、アトピー性皮膚炎患者の皮膚より単離されたシュードモナス エルギノーザ ＡＮ−１７（Pseudomonas aeruginosa AN-17）は、本発明のセラミダーゼを取得するための材料に好適であり、該菌株より得られるセラミダーゼのアミノ酸配列は配列表の配列番号：１に示されている。前記ＡＮ−１７株は、平成８年６月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６６））に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５６９９として寄託されている。
【００１４】
なお、本明細書において、「セラミダーゼ活性を有するポリペプチド」（本明細書においては、単にセラミダーゼと記載する場合がある）とは、配列表の配列番号：１に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、さらに天然型のセラミダーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチドのみならず、前記のような活性測定方法で測定することによって、同様のセラミダーゼ活性が認められるものであれば、天然由来のアミノ酸配列である配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。また前記変異は、得られたポリペプチドがセラミダーゼ活性を有する変異であれば、２種以上の変異を有していてもよい。ここで、「変異を有するアミノ酸配列」は、天然由来の変異および人為的な変異を導入されたアミノ酸配列を含む。また、「１個以上」とは、１もしくは複数個、またはそれ以上を含む意味である。
【００１５】
（２）セラミダーゼ遺伝子
本発明のセラミダーゼ遺伝子とは、前記セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、すなわちセラミダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸をいう。本発明のセラミダーゼ遺伝子としては、例えば、上記のシュードモナス エルギノーザ ＡＮ−１７由来のセラミダーゼをコードする遺伝子が挙げられ、その塩基配列は、配列表の配列番号：２に記載されている。また、本発明のセラミダーゼ遺伝子は、上記した天然型のセラミダーゼのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸に、置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつセラミダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子をも包含する。
【００１６】
また、本発明の遺伝子には、配列表の配列番号：２に示された塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠失、付加または挿入を有する塩基配列を有し、かつセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も包含される。
【００１７】
ここで、「置換、欠失、付加または挿入を有する塩基配列」は、天然由来の変異および人為的な変異を導入された塩基配列を含む。また、「１個以上」とは、１もしくは複数個、またはそれ以上を含む意味である。
【００１８】
さらに、本発明の遺伝子は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も包含される。ハイブリダイゼーションは、例えば1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（T. Maniatis ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed. ）に記載の方法により実施することができる。また、ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルト、１００mg／mlニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件があげられる。
【００１９】
本発明によりセラミダーゼの一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子にランダムな変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然のセラミダーゼのアミノ酸配列中に、１個以上のアミノ酸残基に、欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも一つを有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることが可能である。これにより、セラミダーゼ活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ等の性質が少し異なったセラミダーゼをコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれらのセラミダーゼを製造することが可能となる。
【００２０】
ランダムな変異を導入する方法としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換するトランジション変異を起こさせる方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第79巻、第1408〜1412頁（1982）］、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行い、ＤＮＡ合成時のヌクレオチドの取り込みの正確さを低くする方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）、第224 巻、第347 〜353 頁（1995）］等を用いることができる。
【００２１】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド・デュプレックス（gapped duplex ）法、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第12巻、第9441〜9456頁（1984）］、ｄｕｔ（dUTPase ）とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）遺伝子を欠損した宿主を利用する方法［クンケル（Kunkel）法、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第82巻、第488 〜492 頁（1985）］、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法（国際公開98/02535号パンフレット）等を用いることができる。これらの方法で目的の遺伝子に部位特異的な変異を導入するための各種のキットが市販されており、該キットを利用することにより、所望の変異を導入された遺伝子を容易に取得することが可能である。
【００２２】
以下に、ハイブリダイゼーション法を用いて微生物由来のセラミダーゼ遺伝子を取得する方法について説明する。
１）まず、セラミダーゼ遺伝子をクローニングするためのプローブを作成するための情報として、セラミダーゼの部分アミノ酸配列を調べる。精製したセラミダーゼをそのまま常法に従ってエドマン分解法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第256 巻、第7990〜7997頁（1981）］によるアミノ酸配列分析に供するか、あるいはリジルエンドペプチダーゼやＮ−トシル−L −フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等の基質特異性の高い蛋白質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行って得られるペプチド混合物より分離精製された精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行なう。こうして明らかとなった部分アミノ酸配列の情報をもとにハイブリダイゼーション用のプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計し、化学的に合成する。
【００２３】
２）セラミダーゼを生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で完全消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロン膜にブロッティングする。このナイロン膜上のＤＮＡ断片と、上記の合成オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは、一般的な条件で行なう。例えばサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中でナイロン膜をブロッキングした後、32Ｐでラベルした合成オリゴヌクレオチドプローブとともに一晩保温する。このナイロン膜を洗浄した後、オートラジオグラムを作成して合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。
【００２４】
３）オートラジオグラム上のシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出、精製する。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられる方法によってベクター、例えばプラスミドベクターに組み込み、組換えＤＮＡ分子を作製する。ベクターには市販の種々のベクターが使用できる。次いで該組換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば上記のモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクターに応じたものを選んで用いることができる。
【００２５】
４）次にセラミダーゼ遺伝子の断片を有する形質転換体を選択する。選択の方法はベクターの種類に応じてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等を適宜用いる。また、コロニーやプラークをそのまま試料として用いるＰＣＲ法や、セラミダーゼ活性の発現を指標とする方法を用いることもできる。
【００２６】
５）セラミダーゼ遺伝子の断片を含む形質転換体より該断片を組み込まれた組換えＤＮＡ分子を調製し、該断片の塩基配列を解析する。塩基配列の解析は通常の方法、例えばジデオキシ法により決定することができる。決定された塩基配列と、先に得られたセラミダーゼの部分アミノ酸配列やセラミダーゼの分子量等とを比較することによって、得られたＤＮＡ断片が目的のセラミダーゼ遺伝子の全部であるか、またはその一部であるかを決定する。
【００２７】
６）得られたＤＮＡ断片がセラミダーゼ遺伝子の全長を含まない場合は、該断片の一部をプローブとして用い、ゲノムＤＮＡを他の制限酵素で消化したうえで同様にしてハイブリダイゼーション等を行い、欠損している部分を得ることにより目的のセラミダーゼ遺伝子全長を得ることができる。こうして得られたセラミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片からセラミダーゼ遺伝子の構造ならびにセラミダーゼの全アミノ酸配列を決定する。
【００２８】
上記のようなハイブリダイゼーション法の他、ＰＣＲ法によって本発明のセラミダーゼ遺伝子を取得することもできる。例えば、セラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列や内部部分アミノ酸配列から設計されたプライマーを使用するＰＣＲ法、あるいはこれらのプライマーに加えてカセットＤＮＡとカセットプライマーとを使用するＰＣＲ法によってセラミダーゼ遺伝子を取得することができる。
【００２９】
次にシュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７由来のセラミダーゼの場合を例にして具体的に説明する。前記セラミダーゼは至適ｐＨをｐＨ８．０〜９．０に持つアルカリ性セラミダーゼである。
【００３０】
まず、シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７の生産するセラミダーゼの部分アミノ酸配列を調べる。前記セラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列は、その対応するコドンの種類が多く、プライマーの配列の組み合わせが膨大なものとなる。また、前記プライマーを用いてＰＣＲを行なった場合、非特異的な増幅産物が多数生じるため、そのなかから、目的とする遺伝子に由来する産物を同定することは困難である。本発明者らは、プライマーの設計に用いるためのアミノ酸配列として、対応するコドンの縮重が少ない配列を得るため、蛋白質加水分解酵素または臭化シアンなどに代表される蛋白質限定分解用の試薬を用いてペプチドマッピングを行ない、ついでプライマーの設計を試みた。しかしながら後述の実施例で述べるように、４種のプライマーの組み合わせによりＰＣＲを試みたが、特異的な増幅産物を得ることができなかった。そこで、本発明者らは、さらに、得られたアミノ酸配列をもとに合成オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、セラミダーゼの部分アミノ酸配列Ｃ−８９（配列番号：３）からデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーＣ−８９−１（配列番号：１３）、部分アミノ酸配列Ｃ−９１（配列番号：４）からデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーＣ−９１−ｃ１（配列番号：１４）をそれぞれ合成した。シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記の２種のプライマーを使用したＰＣＲを行なうことにより、特異的に増幅されるＤＮＡ断片を得ることができた。該断片の塩基配列を調べ、これとセラミダーゼについて得られている上記以外の部分アミノ酸配列とを比較することにより、該断片がセラミダーゼをコードする遺伝子の一部を含むことがわかる。
【００３１】
この増幅ＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーション等を行なうことによってセラミダーゼ全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３２】
以上のようにして得られる、シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７由来のセラミダーゼをコードする遺伝子の全塩基配列を配列表の配列番号：１６に示す。また、該配列より推定されるセラミダーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号：１５に示す。さらに、このアミノ酸配列と、配列表の配列番号：８に示されたシュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７由来のセラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列とを比較することにより、該菌株が生産するセラミダーゼはその翻訳後にＮ末端の２４アミノ酸からなるポリペプチドが除去された成熟型酵素に転換されることがわかる。この成熟型セラミダーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号：１に、また、上記のセラミダーゼ遺伝子の塩基配列のうち、成熟型のセラミダーゼをコードする部分の塩基配列を配列表の配列番号：２にそれぞれ示す。なお、前記シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７由来のセラミダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、公知の酸性セラミダーゼのアミノ酸配列および塩基配列との相同性が観察されなかったため、前記シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７由来の酵素は、新規なファミリーに属するセラミダーゼであることが示唆される。
【００３３】
このようにして全塩基配列が明らかにされたセラミダーゼ遺伝子の全体あるいはその一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることにより、シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７以外の生物体から得たゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのライブラリーから、セラミダーゼ遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができる。ハイブリダイゼーションは、一般的に用いられる条件で行なうことができる。例えば、シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７以外の生物から得たゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのライブラリーを固定化したナイロン膜を作製し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００mg／mlニシン精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングした後、32Ｐでラベルした上記のプローブを加えて６５℃で一晩保温する。このナイロン膜をまず６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、次に０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、さらに０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラムを作製してプローブとハイブリダイズするＤＮＡを検出する。なお、洗浄などの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００３４】
一方、本発明のセラミダーゼ遺伝子の塩基配列からＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲを行なうことによって本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、その遺伝子全体を得ることもでき、さらにはセラミダーゼを生産する生物を検出することが可能である。
【００３５】
上記のハイブリダイゼーション、あるいはＰＣＲによって得られた遺伝子がセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、得られた遺伝子の塩基配列を本発明のセラミダーゼ遺伝子の塩基配列またはアミノ酸配列と比較することにより推定することができる。また、下記に記載の方法を用いて、得られた遺伝子にコードされるポリペプチドを製造し、セラミダーゼ活性を測定することにより、目的の遺伝子であるかどうかを確認することができる。
【００３６】
なお、縮重遺伝子コードを介して前記セラミダーゼ遺伝子の塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明のセラミダーゼ遺伝子に含まれる。
【００３７】
（３）セラミダーゼ遺伝子を含有した形質転換体
本発明の形質転換体は、前記遺伝子を含有したものである。
【００３８】
本発明の遺伝子は、公知のベクター等に連結し、様々な宿主において発現させることができる。なお、本発明の遺伝子を発現させる宿主により、コドン使用頻度が異なり、発現が抑制される場合があるが、この場合、本発明の遺伝子に使用されるコドンを、それぞれの宿主に合わせたコドンにかえて用いてもよい。また、前記発現ベクターは、プラスミド由来のベクターのみに限定されるものではなく、本発明の目的を妨げないものであれば、ファージ、コスミド等由来のベクターを用いてもよい。本発明のポリペプチドを容易にかつ大量に製造する観点から、外来遺伝子を誘導発現させることが可能なベクター、レポーター遺伝子産物との融合蛋白質として発現させることが可能なベクター等が望ましい。
【００３９】
セラミダーゼ遺伝子を保持するベクターで宿主の形質転換を行い、本発明の形質転換体を得ることができる。宿主としては大腸菌をはじめとする微生物の他、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行なうことによってセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
【００４０】
なお、前記シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７由来のセラミダーゼ遺伝子を有する形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＣＤＳ７と命名・表示され、平成１０年８月４日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６６）〕に寄託されている〔受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７２８〕。
【００４１】
セラミダーゼの発現の確認は、セラミダーゼ活性を測定することにより行なうことができる。活性測定は、例えば形質転換体の細胞抽出液を試料としてジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第273 巻、第14368 〜14373 頁（1998）に記載の方法で行なうことができる。また、セラミダーゼに対する抗体を使用することもできるが、セラミダーゼを他のポリペプチドとの融合体として発現させる場合にはそのポリペプチド部分に対する抗体を用いてもよい。抗体を使用する場合には、例えば形質転換体の細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜上に転写し、この膜上で抗体を用いて検出することができる。
【００４２】
（４）セラミダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
本発明のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法は、前記形質転換体を培養し、得られた培養物からセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを採取する工程を含むことを１つの大きな特徴とする。
【００４３】
本発明の製造方法において、該形質転換体が微生物あるいは培養細胞である場合には、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間等についてセラミダーゼの発現の最適な条件を決定することによって、効率よくセラミダーゼを生産させることができる。
【００４４】
形質転換体の培養物からセラミダーゼを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌のように細胞内にセラミダーゼが蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換体細胞を集め、得られた細胞を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法の他、イオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる形質転換体によっては発現産物が細胞外に分泌される場合があるが、このような場合は培養上清から同様に精製を行なえばよい。
【００４５】
形質転換体が生産するセラミダーゼには、それが細胞内に生産されるときは細胞内の諸酵素、タンパク質が共存するが、これらは発現されるセラミダーゼの量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易である。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、セラミダーゼが菌体外に分泌され、セラミダーゼを含む画分には、培地成分などが共存する。しかしながら、これらは通常セラミダーゼの精製の妨げとなるようなタンパク質成分をほとんど含まないため、例えば、シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７の培養物からのセラミダーゼの精製に必要であった煩雑な分離精製操作を必要としない。
【００４６】
また、例えば、宿主が大腸菌の場合、発現産物が不溶性の封入体（inclusion body）として形成されることがある。この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等を行なうことにより封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行なうことにより精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリフォールディング操作を行なうことによってセラミダーゼ活性を保持したポリペプチドを含む標品を得ることができる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００４７】
（５）オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー
本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、前記セラミダーゼ遺伝子、または該遺伝子に相補的な塩基配列を有する遺伝子にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするものであれば、特に限定されるものではない。
【００４８】
前記「ストリンジェントな条件」とは、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、〔Ｔm −２５℃〕の温度で一晩保温する条件などをいう。
【００４９】
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのＴm は、例えば、下記の式により求められる。
【００５０】
Ｔm ＝81.5−16.6 (log10[Na+ ])＋0.41 (%G＋C)−(600/N)
【００５１】
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。）
【００５２】
また、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔm は、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔(A+T) ×2+(G+C) ×4 〕により推定することができる。
【００５３】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、本発明のセラミダーゼ遺伝子の塩基配列をもとに設計し、例えば、常法により化学的に合成し作製することができる。
【００５４】
前記オリゴヌクレオチドプローブの鎖長としては、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、１５塩基以上であることが好ましく、１８塩基以上であることがさらに好ましい。
【００５５】
また、本発明のプライマーにおいても、前記オリゴヌクレオチドプローブと同様の塩基配列を有する核酸が挙げられる。例えば、本発明の遺伝子の塩基配列をもとに設計し、化学的に合成すること等により作製することができる。プライマーの鎖長には、特に限定はないが、例えば、１５〜４０塩基の鎖長のものを使用することができ、特に１７〜３０塩基の鎖長のものを好適に使用することができる。前記プライマーはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法をはじめとする種々の遺伝子増幅法に使用することが可能であり、これによって本発明のセラミダーゼ遺伝子の検出を行なうことができる。
【００５６】
また、前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとして、天然由来のセラミダーゼをコードする核酸を、制限酵素処理、エキソ型ヌクレアーゼ処理等の酵素的処理、超音波等の物理的処理等により断片化し、得られた断片を、アガロースゲル等に代表される各種核酸分離法により分離精製することにより得られた核酸を用いてもよい。前記のようにして得られた核酸は、セラミダーゼに特徴的な配列を有する領域由来であることが望ましい。
【００５７】
前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、公知の方法にしたがって適当な標識を施し、本発明のセラミダーゼ遺伝子の検出に使用することができる。標識には、特に限定するものではないが、放射性同位元素の他、蛍光物質、ビオチンやジゴキシゲニンのようなリガンド等を用いることができる。
【００５８】
（６）遺伝子の検出方法
本発明の遺伝子の検出方法は、前記オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを使用し検出用試料中の遺伝子を検出することを１つの大きな特徴とする。
【００５９】
本発明の検出方法においては、前記オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション法などにより遺伝子の検出を行なってもよく、また、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅方法により遺伝子の検出を行なってもよい。
【００６０】
オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、検出用試料としては、例えば、微生物のコロニーや組織切片のような試料、これらの試料中のＤＮＡやＲＮＡを膜上に固定したもの、これらの試料から抽出されたＤＮＡやＲＮＡなどが挙げられる。なかでも試料の安定性の観点から、膜上に固定されたＤＮＡあるいは抽出されたＤＮＡが好ましい。
【００６１】
オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の公知のハイブリダイゼーション法などにより遺伝子の検出を行なうことができる。
【００６２】
前記ハイブリダイゼーションの条件は、用いるプローブのＴｍ値、標的ＤＮＡのＧＣ含量などにより適宜決定することができる。例えば、前記モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル 第２版に記載の条件などを適用できる。
【００６３】
プライマーを用いる場合、検出用試料としては、例えば、微生物培養液、微生物コロニー、微生物菌体のような微生物試料、皮膚、組織、組織切片のような生体由来試料などが挙げられる。
【００６４】
前記プライマーを用いる場合の検出用試料は、例えば、単離した微生物をそのままの状態で用いてもよく、適切な処置を施した状態で用いてもよい。また組織のような固体試料は浸出液や懸濁液を調製して使用することができる。また、これらの試料の上清またはこれらの試料について界面活性剤処理のような細胞溶解処理が施された試料やその上清も使用することができる。さらに、検出対象である核酸を損なわない範囲で試料中の他の成分を除去する操作が施されていてもよい。
【００６５】
前記プライマーを用いてＰＣＲ法により検出を行なう場合、ＰＣＲ条件は、用いるプライマーのＴｍ値、増幅し検出する対象の領域の長さなどにより、適宜選択することができる。
【００６６】
前記プライマーを用いる場合、ＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅方法により増幅し、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認することにより検出することができる。増幅の有無の確認法には特に限定はないが、例えば核酸増幅反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエチジウムブロマイド、SYBER Green I 等で染色し、紫外線を照射して生じるバンドの有無を検出することにより確認できる。バンドの検出は肉眼で観察してもよいが、例えば蛍光イメージアナライザー等を用いて検出することもできる。
【００６７】
本発明の検出方法においては、検出感度を上昇させるために、前記プローブおよびプライマーを併用してもよい。例えば、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ法により、試料中に微量に存在するセラミダーゼ遺伝子を増幅し、ついで、プローブを用いて該遺伝子とハイブリダイズさせることによって、高感度かつ正確に検出することができる。
【００６８】
本発明の検出方法によりセラミダーゼ遺伝子の検出を行ない、さらに該遺伝子の発現量を決定する場合には、ハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルの強度、プライマーを用いて増幅された産物に由来するバンドの蛍光強度などを定量することにより行なうことができる。
【００６９】
（７）本発明の遺伝子の検出に用いるためのキット
本発明の遺伝子の検出に用いるためのキットは、前記オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプローブを含有することを１つの特徴とする。
【００７０】
本発明のキットには、さらに、核酸を固定するための膜やハイブリダイゼーション緩衝液などに代表されるハイブリダイゼーション用の各種試薬、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用緩衝液などに代表されるＰＣＲ用試薬、プローブや増幅されたＤＮＡを検出するための試薬や微生物増殖用の培地、試料より核酸を抽出するための試薬などを含有してもよい。
【００７１】
（８）セラミダーゼ活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片は、該ポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばヒト化抗体、Ｆabフラグメント、単鎖抗体等を使用することもできる。本発明の抗体は、例えば、1992年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（John Weily & Sons, Inc）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（John E. Coligan ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Current Protocols in Immunology ）に記載の方法により、本発明のポリペプチドの全部または一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。また、ポリペプチドのある部分断片に特異的に結合しうる抗体またはその断片も含まれる。
【００７２】
さらに、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。得られた抗体またはその断片の用途としては、セラミダーゼ生産菌の検出、アフィニティークロマトグラフィー、各種ライブラリー（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）のスクリーニング、医薬、診断薬、研究用試薬等への応用が考えられる。
【００７３】
さらに、本発明の抗体またはその断片は、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法などによる検出を容易にするために、各種修飾をしてもよい。
【００７４】
（９）ポリペプチドの検出方法
本発明のポリペプチドの検出方法は、前記抗体またはその断片を使用し、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドを検出することに１つの大きな特徴がある。
【００７５】
本発明においては、検出用試料として、例えば、微生物の細胞破砕物、皮膚等の組織の抽出液あるいは洗浄液、組織や微生物由来のタンパク質が固定された膜などのタンパク質試料を用いることができる。
【００７６】
抗体またはその断片の前記ポリペプチドへの特異的な結合の検出は、公知の方法が利用できるが、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法などが挙げられる。
【００７７】
（１０）本発明のポリペプチドの検出方法に用いるためのキット
本発明のポリペプチドの検出方法に用いるためのキットは、前記抗体またはその断片を含有することを１つの特徴とする。
【００７８】
本発明のキットには、さらに、反応用緩衝液、標識二次抗体、発色試薬などを含有してもよい。
【００７９】
（１１）アトピー性皮膚炎の検出方法
前記のように、セラミダーゼを生産する微生物は、アトピー性皮膚炎の原因となる、もしくはその憎悪に関与すると考えられている。
【００８０】
本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法によれば、皮膚由来の試料についてセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを検出すること、あるいは該ポリペプチドをコードする遺伝子を検出することにより、アトピー性皮膚炎を検出することができる。
【００８１】
本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法に使用される皮膚由来の試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、被検者の皮膚の落屑、皮膚を綿棒やガーゼ等で拭ったもの、皮膚を洗浄して得られる洗浄液等が挙げられる。これらの試料の採取方法にも特に限定はなく、被検者の皮膚からの落屑をそのまま採取する方法、被検者の皮膚を綿棒やガーゼ等で拭う方法、被検者の皮膚に適当な大きさの円筒を密着させ、その中に生理食塩水やリン酸緩衝液のような適当な洗浄液を入れて皮膚面を洗浄することにより洗浄液を採取する方法などを利用することができる。
【００８２】
これらの試料はそのまま前記ポリペプチドの検出または該ポリペプチドをコードする遺伝子の検出に用いることができる。さらに、該試料中の微生物を適当な培地で培養して得られる培養物を試料として検出を行なうことにより、検出感度を向上させることができる。微生物の培養に使用される培地は、皮膚由来の試料中の微生物が増殖でき、かつ、セラミダーゼが効率よく生産される培地であれば特に限定はない。例えば、炭素源および／または窒素源として、グリセロール、グルコース、スクロース、糖蜜、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が含まれる培地が適当である。このほか、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、リン酸塩等の無機質または金属塩を加えてもよい。また、培地にスフィンゴミエリン、セラミド等の脂質、あるいはタウロデオキシコール酸塩等の界面活性剤を０．００１〜１％の範囲で添加し、セラミダーゼの発現量を高めて検出感度を上げることができる。微生物の培養条件には特に限定はないが、２５〜３７℃で１〜７日培養することが好ましい。培養終了後、培養物をそのまま検出操作に使用してもよいが、ポリペプチドの検出には培養物を遠心分離して得られる培養液上清を試料に用いてもよい。
【００８３】
本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法は、上記のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用してセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を検出することにより実施することができ、また、上記のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を使用してセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを検出することにより実施することもできる。また、簡便にアトピー性皮膚炎の検出を行なうために、上記のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を検出するためのキット、または上記のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを検出するためのキットを使用することができる。また、前記キットに加え、後述の試料を採取するための道具、例えば、綿棒、培養用培地などを、さらに含有したキットを使用することができる。
【００８４】
本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法において、オリゴヌクレオチドプローブを使用してセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を検出する場合には、例えば、被検者の皮膚由来の試料より公知方法により調製した核酸と、セラミダーゼ遺伝子の塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプローブとを適切なハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドを検出することにより実施することができる。例えば、皮膚由来の試料より調製した核酸をニトロセルロース膜などに固定して行なうドットブロットハイブリダイゼーション法などにより、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を検出することができる。また、試料を直接ニトロセルロース膜などに固定し、適切な溶解処理を行なって、試料中の核酸を露出させ、ハイブリダイゼーションを行なうことにより生じたハイブリッドを検出することができる。
【００８５】
本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法において、遺伝子増幅法によりセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の検出を行なう場合には、被検者の皮膚由来の試料、もしくは該試料より調製した核酸と、セラミダーゼ遺伝子の塩基配列をもとに設計されたプライマーとを含有する反応液を調製し、遺伝子増幅反応を行なう。遺伝子増幅反応としてＰＣＲ法を用いる場合には、前記（６）に記載の操作などによりＤＮＡの増幅を行い、また、増幅されたＤＮＡの検出を行えばよい。例えば、セラミダーゼ遺伝子の塩基配列をもとに作成された１対のプライマーと皮膚由来の試料と、さらにＤＮＡポリメラーゼやｄＮＴＰ等とを含有する反応液を調製し、プライマーの配列や増幅が期待される領域の鎖長に応じた適切な条件で増幅反応を実施する。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動等により分析し、目的の遺伝子に由来するＤＮＡ断片の増幅の有無を調べればよい。
【００８６】
上記の方法により、皮膚由来の試料からセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が検出されれば、当該試料が採取された部位の皮膚はアトピー性皮膚炎に罹患していると判断される。
【００８７】
本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法において、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドを検出する場合には、セラミダーゼ活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を使用し、被検者の皮膚由来の試料中に上記抗体またはその断片と結合するポリペプチドが存在するかどうかを調べる。このようなポリペプチドの検出は、公知の免疫学的実験手法、例えば、免疫拡散法、ラテックス凝集法、酵素免疫法等により行うことができる。検出感度、簡便さの点からは、酵素免疫法が最も実用的である。
【００８８】
上記の方法により、皮膚由来の試料からセラミダーゼ活性を有するポリペプチドが検出されれば、当該試料が採取された部位の皮膚はアトピー性皮膚炎に罹患していると判断される。
【００８９】
（１２）アトピー性皮膚炎の検出用キット
前記アトピー性皮膚炎の検出をより簡便に行なうために、上記のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を検出するためのキット、または上記のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの検出するためのキットに加え、さらに試料を採取するための道具、例えば、綿棒、培養用培地などを含有することができる。
【００９０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
実施例１ セラミダーゼ構造遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの抽出精製
セラミダーゼの生産菌であるシュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５６９９）をＰＹ培地（０．５％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）２００ｍｌに接種し、２５℃で２３時間培養した。培養終了後、得られた培養液を遠心分離して菌体を集め、１０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した後、さらに５０ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム溶液０．２ｍｌを加えて３０℃で１５分間反応させた。ついで、反応終了後に得られた溶液に２ｍｌの１０％ＳＤＳを加えて穏やかに撹拌し、溶液が粘性を持つようになってから即座に１０ｍｌのＴＥ緩衝液飽和フェノールと１．５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを加えて室温で１時間緩やかに撹拌した。攪拌後に得られた溶液を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層を回収した。得られた溶液に等量のクロロホルムを加えて１０分間撹拌したのち、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収した上層に、さらにもう一度等量のクロロホルムを加えて攪拌後、遠心分離して上層を回収した（以下、この一連の操作をフェノール−クロロホルム処理と記載する）。回収した溶液に等量のイソプロパノールをゆっくりと加えて界面に析出するＤＮＡをパスツールピペットで巻きとり、１０ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解した。得られた溶液に２０μｌのＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌに１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、１００℃で１５分間加熱処理したもの）を加えて５０℃で１時間保温した。さらに保温後に得られた溶液に１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ溶液、２００μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、４００μｌの１０％ ＳＤＳを加えて３７℃で１時間保温することにより、反応させた。反応後に得られた溶液を室温に戻し、フェノール−クロロホルム処理を行った。これを２回繰り返し、得られた水層に等量のイソプロパノールと１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウムを加えて−２０℃で１時間冷却した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた沈殿を７０％エタノールでリンスしてＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ溶液とした。この操作により１．１ｍｇのゲノムＤＮＡが得られた。
【００９２】
（２）セラミダーゼの部分アミノ酸配列の決定
シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５６９９）の生産するセラミダーゼをジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第273 巻、第23号、第14368 〜14373 頁（1998）に記載の方法に従って精製した。得られたセラミダーゼ約５μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、電気泳動を行なった。次いでエレクトロブロッティング法によりゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Immobilon-P 、ミリポア社製）に転写した。この膜のセラミダーゼのバンドに対応する部分（約５０ｐｍｏｌ）を切り出し、０．２ｍｇのリジルエンドペプチダーゼ（０．９ユニット）、８％アセトニトリルを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液１００μｌ中で振とうしながら３７℃、１６時間保温することにより、酵素消化を行なった。この酵素消化液を逆相クロマトグラフィーに供し、ペプチド断片の精製を行なった。得られたペプチド断片をモデル４７７気相式ペプチドシークエンサー（アプライド・バイオシステム社製）を用いたエドマン分解法により分析することにより、セラミダーゼの内部部分アミノ酸配列Ｃ−８９（配列表の配列番号：３) 、Ｃ−９１（配列表の配列番号：４）、Ｓ−９０（配列表の配列番号：５）、Ｃ−８６（配列表の配列番号：６）、Ｃ−１２１（配列表の配列番号：７）を決定した。
【００９３】
また、これとは別に上記のＰＶＤＦ膜をリジルエンドペプチダーゼ処理することなくペプチドシークエンサーに供し、Ｎ末端アミノ酸配列Ｎ−Ｔｅｒｍ（配列表の配列番号：８）を決定した。
【００９４】
（３）セラミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅
実施例１−（２）で決定したセラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列、および内部部分アミノ酸配列より、配列表の配列番号：９〜１１でそれぞれ表わされるプライマーをデザインし、ＤＮＡ合成機で合成した。
【００９５】
すなわち、配列番号：５で表わされるＳ−９０に対応して、配列番号：９で表わされるセンスミックスプライマーＳ９０−１および配列番号：１０で表わされるセンスミックスプライマーＳ９０−２を、配列番号：３で表わされるＣ−８９に対応して、配列番号：１１で表わされるアンチセンスミックスプライマーＣ８９−ｃ１、配列番号：１２で表わされるアンチセンスミックスプライマーＣ８９−ｃ２および配列番号：１３で表わされるセンスミックスプライマーＣ８９−１を、配列番号：4 で表わされるＣ−９１に対応し、配列番号：１４で表わされるアンチセンスミックスプライマーＣ９１−ｃ１をそれぞれ合成した。
【００９６】
これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲはパーキン−エルマー・シータス・インスツルメント社製、ジーンアンプ・リエージェントキット（Gene Amp Reagent Kit）を用いて行なった。反応は９４℃：０．５分、５１℃：０．５分、７２℃：１分を１サイクルとした反応サイクルを４０サイクル行なった。
【００９７】
実施例１−（１）で得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＣ８９−１とプライマーＣ９１−ｃ１の組み合わせによるＰＣＲ反応では、約３５０bpに相当する特異的なバンドの増幅が検出された。Ｓ９０−１とＣ８９−ｃ１、Ｓ９０−１とＣ８９−ｃ２、Ｓ９０−２とＣ８９−ｃ１、Ｓ９０−２とＣ８９−ｃ２のプライマーの組み合わせでは特異的なバンドは増幅しなかった。
【００９８】
上記の約３５０bpの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、これをpGEM-T easy ベクター（プロメガ社製）に連結した組換えプラスミドを作製した。該プラスミドを鋳型とし、ジデオキシ法で上記の増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、得られた塩基配列中にセラミダーゼの部分アミノ酸配列Ｃ−８９、Ｃ−８６、Ｃ−１２１およびＣ−９１のそれぞれをコードする塩基配列が見出され、この増幅ＤＮＡ断片が目的のセラミダーゼをコードする遺伝子の一部であることが明らかとなった。
【００９９】
（４）セラミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の検出
実施例１−（３）で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブに用い、セラミダーゼ遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片のスクリーニングを行なった。
【０１００】
まず、実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを、それぞれ制限酵素ＳｐｈＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｃII、ＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩＩ各１００ユニットを用い、３７℃で２２時間消化した後、得られた制限酵素消化ＤＮＡを１% アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、サザンブロット法により、ナイロン膜［ハイボンド−N+（Hybond-N+ ）、アマシャム社製］にＤＮＡを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例１−（３）で得たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片０．１μｇをＤＮＡラベリングキット［レディー・トゥー・ゴー（ReadyTo Go）、ファルマシア社製］を用いて、同キットのプロトコールに従って32Ｐで標識したものを用いた。
【０１０１】
上記のナイロン膜を０．５Ｍチャーチ（Church）法リン酸緩衝液［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第81巻、第1991〜1995頁（1984）］ｐＨ７．０、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、６５℃で１時間以上プレハイブリダイゼーションを行なった後、上記の標識プローブを６ｆｍｏｌ／ｍｌとなるように加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。次に６５℃に加温しておいた洗浄液（組成：１％ ＳＤＳ、４０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液）中、６５℃で１５分間の洗浄を３回繰り返した。ナイロン膜より余分な水分を除いた後、これを富士フィルム社製イメージングプレート（富士フィルム社製）に２０分間接触させて感光させた。感光後のイメージングプレートをＢＡＳ１０００イメージングアナライザー（富士フィルム社製）で分析し、ナイロン膜上のプローブを検出した。その結果、ＳｐｈＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｃII、ＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩおよびＳａｃIIの各消化物でそれぞれ約７．1 ｋｂ 、約２．８ｋｂ、約１２．６ｋｂ、約５．８ｋｂ、約１．８ｋｂ、約１．８ｋｂ、約１３．７ｋｂ、約１２．６ｋｂ、約９ｋｂ、約６ｋｂ、約３．５ｋｂ、約６．７ｋｂ、約１１．８ｋｂ、約１．５ｋｂの位置にハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルが認められた。
【０１０２】
（５）セラミダーゼ遺伝子のクローニング
実施例１−（４）の結果に基づき、約２．８ｋｂのＡｐａＩ断片のクローニングを行なった。ＡｐａＩ消化したゲノムＤＮＡ１０ｍｇを１％アガロースゲル電気泳動で分離し、約２．８ｋｂのサイズに対応する位置のアガロースゲルを切り出した。ゲルからセファグラス・バンドプレップ・キット（Sephaglas BandPrep Kit、アマシャムファルマシア社製）によりＤＮＡ断片を抽出精製し、該ＤＮＡ断片をpBluescript II SK （東洋紡社製) のＡｐａＩサイトに挿入した組換えプラスミドを作製した。前記プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ寒天培地（組成：１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）プレート上で一晩培養して出現したコロニーより３００コロニーを選択し、同じ培地プレート上においたナイロン膜［ハイボンド−N （Hybond-N）、アマシャム社製］上に接種した。３７℃で１６時間培養した後、このナイロン膜をアルカリ変性溶液（組成：０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸したろ紙上で５分間（変性）、中和溶液（組成：０．５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、３Ｍ ＮａＣｌ）に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でリンスした。
【０１０３】
このナイロン膜について実施例１−（３）で得たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブに用い、上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行なったところ、２個のコロニーに対してシグナルが得られた。このうちの一つのコロニーよりプラスミドを調製してｐＳＣＡ５９と命名し、該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行なった。その結果、実施例１−（２）で得られたアミノ酸配列Ｃ−８９、Ｃ−８６、Ｃ−１２１およびＣ−９１のそれぞれに対応する配列およびそれらの配列と同じフレームに停止コドンが見いだされたが、Ｎ末端アミノ酸配列Ｎ−Ｔｅｒｍ及びＳ−９０に対応する塩基配列は見いだされなかった。すなわちこのプラスミドはセラミダーゼ遺伝子の停止コドンを含む３’末端部分（Ｃ末端領域）を含むが、５’末端部分（Ｎ末端領域）を欠如していることが明らかとなった。
【０１０４】
ついで、セラミダーゼ遺伝子の全長をカバーするために、ｐＳＣＡ５９では欠損していたＮ末端付近をコードするＤＮＡ断片をさらに上記と同様にしてサザンハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。プローブにはセラミダーゼ遺伝子の５’末端部分に近い配列を含む、約５６０bpのｐＳＣＡ５９のＫｐｎＩ、ＳａｃII消化断片を用いた。アガロースゲル電気泳動によって単離した約５６０bpのＫｐｎＩ、ＳａｃII断片を上記と同様の方法で32Ｐ標識した後、上記と同様の方法でサザンハイブリダイゼージョンを行なった。その結果、用いたプローブに対して、ＳｐｈＩ消化物で約７．１ｋｂ、ＡｐａＩ消化物で約２．８ｋｂ、ＸｈｏＩ消化物で約５．８ｋｂ、ＥｃｏＲＩ消化物で約９ｋｂ、ＰｓｔＩ消化物で約６ｋｂ、ＳｍａＩ消化物で約３．５ｋｂ、ＢａｍＨＩ消化物で約２．１ｋｂ、ＳａｃII消化物で約２．５ｋｂの位置に、それぞれプローブがハイブリダイズすることが示された。
【０１０５】
以上の結果より約２．１ｋｂのＢａｍＨＩ断片のクローニングを行なった。ＢａｍＨＩ消化したゲノムＤＮＡ１０ｍｇを１％アガロースゲル電気泳動で分離し、約２．１ｋｂのサイズに対応する位置のアガロースゲルを切り出し、ゲルからセファグラス・バンドプレップ・キットにより抽出精製したＤＮＡ断片をpGEM-3Zf(+) （プロメガ社製）のＢａｍＨＩサイトに挿入した。このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して上記と同様の方法によりコロニーハイブリダイゼーションを行なった結果、９個の陽性コロニーを得た。このうちの一つからプラスミドを調製してこれをｐＧＣＢ３８と命名し、その挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行なった。まず、このプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化し、さらに定法に従ってエキソヌクレアーゼIII （Exonuclease III 、ニッポンジーン社製）、及びマングビーン・ヌクレアーゼ（Mung Bean Nuclease、ニッポンジーン社製）を用いて種々の欠失変異体を作製した。ジデオキシ法によってこれらの変異体及びｐＧＣＢ３８の塩基配列を解析し、ｐＧＣＢ３８に挿入されたセラミダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、セラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列Ｎ−Ｔｅｒｍ、およびＳ−９０に対応する塩基配列がみいだされ、ｐＧＣＢ３８はセラミダーゼ遺伝子のＮ末端部分をコードする部分を含むことが明らかとなった。
【０１０６】
プラスミドｐＳＣＡ５９、ｐＧＣＢ３８の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示す。この両プラスミドの塩基配列の解析結果より、セラミダーゼ遺伝子の全塩基配列及びセラミダーゼのアミノ酸配列が決定された。シュードモナス・エルギノーザ ＡＮ−１７の生産するセラミダーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列を配列表の配列番号：１６に、また、このＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号：１５にそれぞれ示す。また、実施例１−（２）で得られたセラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列Ｎ−Ｔｅｒｍ（配列表の配列番号：８）から明らかとなった、成熟型セラミダーゼをコードする塩基配列を配列表の配列番号：２に、この塩基配列がコードする成熟型セラミダーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号：１にそれぞれ示す。
【０１０７】
実施例２ セラミダーゼポリペプチドを発現するプラスミドの構築
セラミダーゼを発現するプラスミドを以下の操作にしたがって構築した。
実施例１−（５）で作成されたプラスミドｐＧＣＢ３８の欠失変異体、ｐＧＣＢ３８−Ｄ１３にはセラミダーゼをコードするＯＲＦの開始コドンの上流１５塩基までが挿入されている。該プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化して生じる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により単離、精製してこれをＤＮＡ断片−１とした。一方、プラスミドｐＳＣＡ５９を制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化して生じる約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により単離、精製してこれをＤＮＡ断片−２とした。次に、ＨｉｎｄIII 消化したプラスミドｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）と上記のＤＮＡ断片−１、ＤＮＡ断片−２とを混合してライゲーションを行い、挿入断片がｐＴＶ１１９Ｎのｌａｃプロモーターの下流にＤＮＡ断片−１、ＤＮＡ断片−２の順に正しく挿入されている組換えプラスミドを選択し、これをｐＴＣＤ１１とした。さらに、ｐＴＣＤ１１を制限酵素ＳｍａＩで消化することにより、５００bpのＳｍａＩフラグメントを欠失させたプラスミドｐＴＣＤＳ７を作成した。このプラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９はEscherichia coli JM109/pTCDS7 と命名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６７２８として寄託されている。
【０１０８】
実施例３ セラミダーゼの形質転換大腸菌における発現
実施例２で得られたEscherichia coli JM109/pTCDS7 を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬ培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、その１ｍｌを２００ｍｌの同培地に接種した。３７℃で培養し、濁度（６００nmの吸光度）がおよそ０．６に達した段階で、終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに３７℃で８時間振とう培養を行なった。培養終了後、培養液を遠心分離し、菌体を集め、０．５ｍＭ フッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル塩酸塩を含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに懸濁して超音波処理を行い菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して上清を採取し、これを粗酵素液とした。
【０１０９】
この粗酵素液のセラミダーゼ活性をジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第273 巻、第14368 〜14373 頁（1998）に記載の方法に従い、Ｃ１２−ＮＢＤ−セラミドを基質とし測定した。すなわち、２０μｌの２５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中に５５０ｐｍｏｌのＣ１２−ＮＢＤ−セラミド、２．５ｍＭ塩化カルシウム、０．２５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００（Triton X-100）および適当量の粗酵素液を溶解した反応液を調製し、３７℃にて２０分間インキュベートした。反応液を沸騰水浴で５分インキュベートして反応を停止し、反応液は更に減圧乾固した。乾固物をクロロホルム／メタノール＝２／１（重量比）に溶解した後、シリカゲル薄層クロマトグラフィ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／２５％アンモニア水＝９０／２０／０．５（体積比）で展開した後、ＣＳ−９３００クロマトスキャナー（島津製作所製）を用い、励起波長４７５nm、蛍光波長５２５nmでＣ１２−ＮＢＤ−セラミド、ならびにその分解物であるＣ１２−ＮＢＤ−脂肪酸の量を測定した。本酵素の１ユニットは、上記の条件下で１分間当たり１μｍｏｌのＣ１２−ＮＢＤ−脂肪酸が生成されるのに要する酵素量と定義した。その結果、本発明のセラミダーゼ遺伝子を有するEscherichia coli JM109/pTCDS7 は培養液１リットル当たりに約３２ユニットのセラミダーゼを生産することが示された。
【０１１０】
実施例４ アトピー性皮膚炎の検出
セラミダーゼ遺伝子を検出するためのプライマーとして、上記のセラミダーゼ遺伝子の塩基配列より、上流プライマーであるプライマー３８２Ｕ、下流プライマーであるプライマー８８４Ｌを設計、合成した。配列表の配列番号１７、１８にそれぞれプライマー３８２Ｕ、プライマー８８４Ｌの塩基配列を示す。この２種のプライマーを使用し、配列表の配列番号２に示す塩基配列のセラミダーゼ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合には５２３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【０１１１】
２４名のアトピー性皮膚炎患者、及び８名の健常者の皮膚より、以下の操作で皮膚由来の試料を採取した。被検者の皮膚を滅菌綿棒で拭い、この綿棒を２００μｌの滅菌蒸留水中に浸して激しく撹拌したのち液を回収した。なお、アトピー性皮膚炎患者については患部の皮膚を綿棒で拭い試料を採取した。回収された液を１００℃、５分間加熱してＰＣＲ用の試料液とした。
【０１１２】
ＰＣＲはＥＸＴａｑ（宝酒造社製）を使用して実施した。５μｌの試料液、それぞれ０．２μＭのプライマー３８２Ｕおよびプライマー８８４Ｌ、それぞれ２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．５ＵのＥＸＴａｑを含む１００μｌのＰＣＲ反応液をＥＸＴａｑに添付の反応緩衝液を使用して調製し、９４℃：１分、６０℃：１分、７２℃：１分を１サイクルとした反応を４０サイクル行った。この反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色してＤＮＡ断片の増幅の有無を調べた。
【０１１３】
この結果、アトピー性皮膚炎患者２４名中、１５名の試料について、セラミダーゼ遺伝子の存在を示す約５００ｂｐのＤＮＡ断片の特異的な増幅が認められた。一方、健常人由来の８つの試料ではこのような断片の増幅は認められなかった。
【０１１４】
配列表フリーテキスト
配列番号：９
デザインされたオリゴヌクレオチドは、配列番号：５に示されたアミノ酸配列に基づく。
【０１１５】
配列番号：１０
デザインされたオリゴヌクレオチドは、配列番号：５に示されたアミノ酸配列に基づく。
【０１１６】
配列番号：１１
デザインされたオリゴヌクレオチドは、配列番号：３に示されたアミノ酸配列に基づく。
【０１１７】
配列番号：１２
デザインされたオリゴヌクレオチドは、配列番号：３に示されたアミノ酸配列に基づく。
【０１１８】
配列番号：１３
デザインされたオリゴヌクレオチドは、配列番号：３に示されたアミノ酸配列に基づく。
【０１１９】
配列番号：１４
デザインされたオリゴヌクレオチドは、配列番号：４に示されたアミノ酸配列に基づく。
【０１２０】
【発明の効果】
本発明によりアルカリ性セラミダーゼのアミノ酸配列ならびにそれをコードする塩基配列が初めて提供され、それにより、該遺伝子を用いるセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法、該セラミダーゼの検出方法、さらには、アトピー性皮膚炎の検出方法が提供される。本発明のセラミダーゼ製造方法においては、セラミダーゼの発現を誘導するために培地にスフィンゴ脂質を添加する必要がなく、同時に誘導されるスフィンゴミエリナーゼなどの酵素や、培地に加えたスフィンゴ脂質あるいはその分解物の混在もなく、目的のセラミダーゼを容易に精製することが可能である。また、本発明のセラミダーゼ遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブおよびプライマー、本発明のセラミダーゼ活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片が提供される。かかるプローブ、プライマー、ならびに抗体またはその断片により、簡便、かつ高感度にセラミダーゼを検出することができる。また、前記プローブ、プライマー、ならびに抗体またはその断片を用いることにより、アトピー性皮膚炎を簡便に検出することが可能になるという優れた効果を奏する。
【０１２１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＣＡ５９およびｐＧＣＢ３８のそれぞれの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a polypeptide having ceramidase activity and a gene encoding the polypeptide. More specifically, the present invention relates to an amino acid sequence of ceramidase useful as a lipid engineering reagent for analyzing the structure, function, etc. of ceramide, and as an index for diagnosis of atopic dermatitis, and a base sequence encoding the same. The present invention also relates to a genetic engineering method for producing a polypeptide having ceramidase activity. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting the polypeptide and a method for detecting a gene encoding the polypeptide. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting atopic dermatitis using the polypeptide detection method and gene detection method.
[0002]
[Prior art]
Ceramidase is an enzyme that hydrolyzes ceramide, a kind of sphingolipid, into sphingosine and fatty acid. Sphingosine produced by hydrolysis of ceramide by ceramidase has various physiological activities such as inhibition of protein kinase C, activation of phospholipase D, inhibition of calmodulin-dependent enzyme, etc. It is an important substance thought to be involved in the regulation of cell functions by being involved in intracellular signal transduction. Ceramidase is an enzyme that plays an important role in regulating the amount of sphingosine.
[0003]
Ceramidase is classified into acid ceramidase and neutral / alkaline ceramidase according to the optimum pH. The presence of ceramidase having an optimum pH in the acidic region has been reported in rat brain [Biochemistry, Vol. 8, pp. 1692–1698 (1969)], guinea pig epithelial cells [Journal of Biological Chemistry. (J. Biol. Chem.), 270, 12677-12684 (1995)], human kidney [Biochim. Biophys. Acta, 398, 125-131. (1975)], spleen [Biokimica e Biophysica Actor, Vol. 1004, pp. 245-251 (1989)], fibroblast [Biochemical Journal (Biochem. J.), Vol. 205, 419-425 (1982)], epithelium [FEBS Lett., 268, 110-112 (1990)], and other mammalian tissues, human urine [Journal of Biological. Chemistry, Volume 270, pages 11098-11102 (1 995)]].
[0004]
Among these ceramidases, the amino acid sequence and base sequence of ceramidase purified from human urine have been determined [Journal of Biological Chemistry, Vol.271, 33110-33115 (1996)]. In addition, a mouse ceramidase gene has been obtained using the homology with the gene [Genomics, Vol. 50, pp. 267-274 (1998)]. However, these are all acidic ceramidases derived from mammals, and the amino acid sequence and base sequence of neutral / alkaline ceramidase or microbial ceramidase have not been clarified so far.
[0005]
On the other hand, it has been clarified that microorganisms that produce ceramidase exist in the lesional epidermis of patients with atopic dermatitis, and it is suggested that the enzyme is involved in the cause or aversion of atopic dermatitis. The enzyme is a ceramidase having an optimum pH in the alkaline region (hereinafter referred to as alkaline ceramidase) [Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, pages 14368-14373 (1998)].
[0006]
When natural ceramidase is produced from a microorganism that produces ceramidase, it is necessary to add expensive sphingolipid to the medium in order to induce the production of the enzyme. It is necessary to separate and remove from the fraction containing ceramidase. Furthermore, since enzymes other than ceramidase such as sphingomyelinase are simultaneously produced during culture, it is difficult to separate and purify only the target ceramidase from these enzymes. Furthermore, the amino acid sequence and gene structure of alkaline ceramidase derived from microorganisms are completely unknown, and genetic engineering ceramidase production methods cannot be used.
[0007]
Furthermore, although the presence of microorganisms producing ceramidase is expected as a diagnostic index for atopic dermatitis and a method for confirming therapeutic effects, no means for easily detecting and identifying such microorganisms is known. Conventionally, a very complicated operation of culturing microorganisms after isolation and measuring ceramidase activity was necessary. Thus, there is a need for a method for producing a ceramidase derived from a highly pure microorganism at a lower cost and a method for detecting a microorganism that produces ceramidase in a simple and short-time operation.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The first object of the present invention is to provide a polypeptide having ceramidase activity. A second object of the present invention is to provide a gene encoding the polypeptide. A third object of the present invention is to provide a transformant containing the gene. A fourth object of the present invention is to provide a production method capable of easily and mass-producing high-purity ceramidase using the transformant. A fifth object of the present invention is to provide an oligonucleotide probe or primer that specifically hybridizes to the gene of the present invention. The sixth object of the present invention is to provide an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the polypeptide of the present invention. The seventh object of the present invention is to provide a method for detecting a ceramidase gene using the oligonucleotide probe or primer of the present invention or a kit used therefor. An eighth object of the present invention is to provide a method for detecting ceramidase using the antibody of the present invention or a fragment thereof, or a kit used therefor. Furthermore, the ninth object of the present invention is to provide a method for detecting atopic dermatitis using the method for detecting a ceramidase gene of the present invention or the method for detecting ceramidase of the present invention.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to isolate a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity, the present inventors have succeeded in isolating a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity and elucidating its base sequence. Furthermore, based on this knowledge, a method for easily and mass-producing high-purity ceramidase, a method for detecting a polypeptide having ceramidase activity, and a method for detecting the gene thereof were established, and the present invention was completed. Moreover, a correlation between such ceramidase and atopic dermatitis was found, and a simple method for detecting atopic dermatitis could be established.
[0010]
That is, the gist of the present invention is as follows.
[1] SEQ ID NO: 17 in the sequence listingInPrimer consisting of the indicated base sequenceOr a primer comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 18,
[2] A method for detecting a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity, using the primer according to [1],
[3] A kit for detecting a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity, comprising the primer according to [1], and
[4] A method for detecting atopic dermatitis, wherein a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity is detected by the method described in [2] above,
About.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(1) Polypeptide having ceramidase activity
In the present invention, “ceramidase” refers to an enzyme having an activity of hydrolyzing ceramide into sphingosine and fatty acid as described above.
[0012]
The ceramidase activity can be measured, for example, according to the method described in Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, pages 14368-14373 (1998).
[0013]
In the present invention, the origin of ceramidase is not particularly limited. For example, ceramidase derived from microorganisms such as bacteria, actinomycetes, yeasts, filamentous fungi, ascomycetes, basidiomycetes, plants, animals, insects, etc. A ceramidase derived from an organism is included in the present invention. Specifically, for example, Pseudomonas aeruginosa AN-17 (Pseudomonas aeruginosa AN-17) isolated from the skin of a patient with atopic dermatitis is suitable as a material for obtaining the ceramidase of the present invention. The amino acid sequence of ceramidase obtained is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The AN-17 strain was established on June 26, 1996 from the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Biotechnology Institute of Technology (Address: 1-3-3 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan (zip code: 305-8586). ) Under the deposit number: FERM P-15699.
[0014]
In the present specification, the “polypeptide having ceramidase activity” (in this specification, sometimes simply referred to as ceramidase) is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. As long as it is a peptide and has the same ceramidase activity as measured by the above activity measurement method as well as a polypeptide having the amino acid sequence of natural ceramidase, a naturally occurring amino acid sequence A polypeptide having an amino acid sequence having a mutation such as substitution, deletion, addition, insertion or the like of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is included. Further, the mutation may have two or more mutations as long as the obtained polypeptide has a ceramidase activity. Here, the “amino acid sequence having mutation” includes an amino acid sequence into which a naturally occurring mutation and an artificial mutation have been introduced. Further, “one or more” means that one or more or more are included.
[0015]
(2) Ceramidase gene
The ceramidase gene of the present invention is a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity, that is, a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having ceramidase activity. Examples of the ceramidase gene of the present invention include a gene encoding ceramidase derived from the aforementioned Pseudomonas aeruginosa AN-17, and its base sequence is described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Further, the ceramidase gene of the present invention is a polypeptide having an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion at one or more amino acids in the amino acid sequence of the natural ceramidase described above, and having ceramidase activity. The gene which codes the amino acid sequence of is also included.
[0016]
Further, the gene of the present invention has a base sequence having substitution, deletion, addition or insertion at one or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and has ceramidase activity. Also included are genes having a base sequence encoding a polypeptide having.
[0017]
Here, the “base sequence having substitution, deletion, addition or insertion” includes a base sequence into which a naturally occurring mutation and an artificial mutation are introduced. Further, “one or more” means that one or more or more are included.
[0018]
Furthermore, the gene of the present invention also includes a gene that hybridizes to the above gene under stringent conditions and encodes a polypeptide having ceramidase activity. Hybridization is described in, for example, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, T.A. Edited by T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.) As hybridization conditions, for example, 6 × SSC (composition of 1 × SSC: 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 100 mg / ml A condition is that the solution is kept overnight at 65 ° C. together with the probe in a solution containing herring sperm DNA.
[0019]
Since the primary structure and gene structure of the ceramidase were clarified by the present invention, random mutations or site-specific mutations were introduced into the gene of the present invention, and one or more amino acid residues were left in the amino acid sequence of natural ceramidase. Based on this, it is possible to obtain a gene encoding a polypeptide having at least one of deletion, addition, insertion or substitution. As a result, it is possible to obtain genes encoding ceramidase having ceramidase activity, but having slightly different properties such as optimum temperature, stable temperature, optimum pH, and stable pH, and these ceramidases are genetically engineered. It can be manufactured.
[0020]
As a method for introducing a random mutation, for example, a method of causing a transition mutation in which a cytosine base is replaced with a uracil base by chemical treatment with sodium bisulfite [Proceedings of the National Academy of・ Sciences of the USA, Vol. 79, pp. 1408-1412 (1982)], a method of reducing the accuracy of nucleotide incorporation during DNA synthesis by performing PCR in a reaction solution containing manganese [ Analytical Biochemistry (Anal. Biochem.), Vol. 224, pp. 347-353 (1995)] and the like can be used.
[0021]
As a method for introducing site-specific mutation, for example, a method using amber mutation [gapped duplex method, Nucleic Acids Research, Vol. 12, pages 9441-9456 ( 1984)], a method using a host deficient in dut (dUTPase) and ung (uracil-DNA glycosylase) genes [Kunkel method, proceedings of the National Academy of Sciences of Science The USA, Vol. 82, pp. 488-492 (1985)], a PCR method utilizing amber mutation (International Publication No. 98/02535 pamphlet) and the like can be used. Various kits for introducing site-specific mutations into the target gene by these methods are commercially available, and it is possible to easily obtain a gene into which a desired mutation has been introduced by using the kit. Is possible.
[0022]
Hereinafter, a method for obtaining a ceramidase gene derived from a microorganism using a hybridization method will be described.
1) First, a partial amino acid sequence of ceramidase is examined as information for preparing a probe for cloning a ceramidase gene. The purified ceramidase is directly subjected to amino acid sequence analysis by Edman degradation method [Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, pages 7990-7997 (1981)] according to conventional methods, or lysyl endopeptidase or N-tosyl. Amino acid sequence of a purified peptide fragment separated and purified from a peptide mixture obtained by performing limited hydrolysis with the action of a protein hydrolase with high substrate specificity such as -L-phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) -trypsin Perform analysis. Based on the partial amino acid sequence information thus revealed, an oligonucleotide for use as a probe for hybridization is designed and chemically synthesized.
[0023]
2) A genomic DNA of a microorganism producing ceramidase is prepared, completely digested with an appropriate restriction enzyme, separated by agarose gel electrophoresis, and then blotted on a nylon membrane according to a conventional method. Hybridization of the DNA fragment on the nylon membrane and the synthetic oligonucleotide probe is performed under general conditions. For example, after blocking the nylon membrane in a prehybridization solution containing salmon sperm DNA,32Incubate overnight with synthetic oligonucleotide probe labeled with P. After washing the nylon membrane, an autoradiogram is prepared to detect DNA fragments that hybridize with the synthetic oligonucleotide probe.
[0024]
3) A DNA fragment corresponding to the signal on the autoradiogram is extracted from an agarose gel and purified. The DNA fragment thus obtained is incorporated into a vector such as a plasmid vector by a commonly used method to prepare a recombinant DNA molecule. Various commercially available vectors can be used as the vector. Next, the recombinant DNA molecule is introduced into an appropriate host, for example, E. coli to obtain a transformant. As a method for transformation, a method according to a vector to be used can be selected from methods usually used, for example, the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition.
[0025]
4) Next, a transformant having a ceramidase gene fragment is selected. As a selection method, colony hybridization, plaque hybridization, or the like is appropriately used according to the type of vector. Alternatively, a PCR method using colonies or plaques as samples as they are, or a method using the expression of ceramidase activity as an index can also be used.
[0026]
5) A recombinant DNA molecule incorporating the fragment is prepared from a transformant containing the ceramidase gene fragment, and the base sequence of the fragment is analyzed. The analysis of the base sequence can be determined by an ordinary method such as the dideoxy method. By comparing the determined base sequence with the partial amino acid sequence of ceramidase obtained earlier, the molecular weight of ceramidase, etc., the obtained DNA fragment is the whole of the target ceramidase gene or a part of it. Decide if there is.
[0027]
6) When the obtained DNA fragment does not contain the full length of the ceramidase gene, a part of the fragment is used as a probe, and genomic DNA is digested with other restriction enzymes, followed by hybridization, etc. The desired full length of ceramidase gene can be obtained by obtaining the portion that is present. From the thus obtained DNA fragment containing the ceramidase gene, the structure of the ceramidase gene and the entire amino acid sequence of ceramidase are determined.
[0028]
In addition to the hybridization method as described above, the ceramidase gene of the present invention can also be obtained by the PCR method. For example, a ceramidase gene can be obtained by a PCR method using primers designed from the N-terminal amino acid sequence or internal partial amino acid sequence of ceramidase, or a PCR method using cassette DNA and a cassette primer in addition to these primers. it can.
[0029]
Next, the case of ceramidase derived from Pseudomonas aeruginosa AN-17 will be described in detail. The ceramidase is an alkaline ceramidase having an optimum pH of pH 8.0 to 9.0.
[0030]
First, the partial amino acid sequence of ceramidase produced by Pseudomonas aeruginosa AN-17 is examined. The N-terminal amino acid sequence of the ceramidase has a large number of codons corresponding to it, and the combination of primer sequences is enormous. In addition, when PCR is performed using the primers, many non-specific amplification products are generated, and therefore it is difficult to identify a product derived from the target gene. In order to obtain a sequence with less degeneracy of the corresponding codon as an amino acid sequence to be used for designing a primer, the present inventors used a reagent for limited protein degradation represented by protein hydrolase or cyanogen bromide. The peptide mapping was performed, and then primer design was attempted. However, as described in Examples below, PCR was attempted with a combination of four types of primers, but a specific amplification product could not be obtained. Therefore, the present inventors further synthesized oligonucleotide primer C-89 designed from the partial amino acid sequence C-89 of ceramidase (SEQ ID NO: 3) based on the obtained amino acid sequence. -1 (SEQ ID NO: 13) and oligonucleotide primer C-91-c1 (SEQ ID NO: 14) designed from partial amino acid sequence C-91 (SEQ ID NO: 4) were synthesized. By carrying out PCR using Pseudomonas aeruginosa AN-17 strain genomic DNA as a template and using the above-mentioned two kinds of primers, a specifically amplified DNA fragment could be obtained. By examining the base sequence of the fragment and comparing it with a partial amino acid sequence other than the above obtained for ceramidase, it can be seen that the fragment contains part of the gene encoding ceramidase.
[0031]
By performing hybridization or the like using this amplified DNA fragment as a probe, a gene encoding the full length of ceramidase can be cloned.
[0032]
The entire base sequence of the gene encoding Ceramidase derived from Pseudomonas aeruginosa AN-17 obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing. The amino acid sequence of ceramidase deduced from the sequence is shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing. Further, by comparing this amino acid sequence with the N-terminal amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa AN-17-derived ceramidase shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, the ceramidase produced by the strain is It can be seen that it is converted to a mature enzyme from which the polypeptide consisting of the terminal 24 amino acids has been removed. The amino acid sequence of this mature ceramidase is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the base sequence of the portion encoding the mature ceramidase in the base sequence of the ceramidase gene is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Show. In addition, since the homology with the amino acid sequence and base sequence of a known acid ceramidase was not observed in the amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa AN-17-derived ceramidase and the base sequence encoding it, the Pseudomonas aeruginosa AN- It is suggested that the 17-derived enzyme is a ceramidase belonging to a novel family.
[0033]
A genomic DNA or cDNA library obtained from an organism other than Pseudomonas aeruginosa AN-17 by using the whole or part of the ceramidase gene whose entire nucleotide sequence has been clarified in this way as a probe for hybridization. Therefore, DNA having high homology with the ceramidase gene can be selected. Hybridization can be carried out under generally used conditions. For example, a nylon membrane on which a genomic DNA or cDNA library obtained from an organism other than Pseudomonas aeruginosa AN-17 is immobilized is prepared, and 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 100 mg / ml herring sperm After blocking the nylon membrane at 65 ° C. in a prehybridization solution containing DNA,32Add the above probe labeled with P and incubate overnight at 65 ° C. The nylon membrane was first placed in 6 × SSC for 10 minutes at room temperature, then in 2 × SSC containing 0.1% SDS, for 10 minutes at room temperature, and further in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS, 45 After washing at 30 ° C. for 30 minutes, an autoradiogram is prepared to detect DNA that hybridizes with the probe. It should be noted that genes having various homologies can be obtained by changing conditions such as washing.
[0034]
On the other hand, primers for PCR can be designed from the base sequence of the ceramidase gene of the present invention. By performing PCR using this primer, a gene fragment highly homologous to the gene of the present invention can be detected, the entire gene can be obtained, and further, an organism producing ceramidase can be detected. .
[0035]
In order to confirm whether or not the gene obtained by the above hybridization or PCR is a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity, the base sequence of the obtained gene is the base sequence of the ceramidase gene of the present invention or It can be estimated by comparing with the amino acid sequence. In addition, by using the method described below, a polypeptide encoded by the obtained gene can be produced, and ceramidase activity can be measured to confirm whether the gene is the target gene.
[0036]
A gene having a base sequence different from the base sequence of the ceramidase gene via the degenerate gene code is also included in the ceramidase gene of the present invention.
[0037]
(3) Transformant containing ceramidase gene
The transformant of the present invention contains the gene.
[0038]
The gene of the present invention can be linked to a known vector or the like and expressed in various hosts. The codon usage frequency varies depending on the host in which the gene of the present invention is expressed, and the expression may be suppressed. In this case, the codon used for the gene of the present invention is changed to a codon suitable for each host. It may be used instead. The expression vector is not limited to a plasmid-derived vector, and a phage, cosmid, or other vector may be used as long as it does not interfere with the object of the present invention. From the viewpoint of easily and mass-producing the polypeptide of the present invention, a vector capable of inducing and expressing a foreign gene, a vector capable of expressing as a fusion protein with a reporter gene product, and the like are desirable.
[0039]
A transformant of the present invention can be obtained by transforming a host with a vector carrying a ceramidase gene. In addition to microorganisms such as E. coli, animal cells and plant cells can be used as the host. Subsequently, a polypeptide having ceramidase activity can be produced by culturing the transformant under conditions usually used.
[0040]
The transformant having the ceramidase gene derived from Pseudomonas aeruginosa AN-17 was named and displayed as Escherichia coli JM109 / pTCDS7. It is deposited with the Biotechnology Institute of Industrial Technology [Address: 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan (Postal code: 305-8656)] [Accession number: FERM BP-6728].
[0041]
Confirmation of ceramidase expression can be performed by measuring ceramidase activity. The activity can be measured, for example, by the method described in Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, pages 14368-14373 (1998) using a cell extract of the transformant as a sample. An antibody against ceramidase can also be used. When ceramidase is expressed as a fusion with another polypeptide, an antibody against the polypeptide portion may be used. When using an antibody, for example, a cell extract of a transformant is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, then transferred onto a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, and the antibody is detected on this membrane. be able to.
[0042]
(4) Method for producing a polypeptide having ceramidase activity
One major feature of the method for producing a polypeptide having ceramidase activity according to the present invention is that the method comprises culturing the transformant and collecting a polypeptide having ceramidase activity from the obtained culture.
[0043]
In the production method of the present invention, when the transformant is a microorganism or a cultured cell, the expression of ceramidase with respect to the medium composition, the pH of the medium, the culture temperature, the culture time, the use amount of the inducer, the use time, etc. By determining the optimal conditions, ceramidase can be produced efficiently.
[0044]
Conventional methods are used to purify ceramidase from transformant cultures. When ceramidase accumulates in the cells as in the case of E. coli, collect the transformant cells by centrifugation after culturing, crush the obtained cells by sonication, etc., and centrifuge To obtain a cell-free extract. Using this as a starting material, in addition to the salting-out method, it can be purified by general protein purification methods such as ion exchange, gel filtration, hydrophobicity, various chromatography such as affinity. Depending on the transformant used, the expression product may be secreted to the outside of the cell. In such a case, purification may be similarly performed from the culture supernatant.
[0045]
When the ceramidase produced by the transformant is produced intracellularly, various intracellular enzymes and proteins coexist, but these are only a small amount compared to the amount of ceramidase expressed. Purification is very easy. In addition, when a cell exocrine type vector is used as the vector, ceramidase is secreted outside the cell, and medium components and the like coexist in the fraction containing ceramidase. However, since these usually contain almost no protein components that would impede purification of ceramidase, for example, the complicated separation and purification operations required for purification of ceramidase from the culture of Pseudomonas aeruginosa AN-17 are required. And not.
[0046]
For example, when the host is E. coli, the expression product may be formed as an insoluble inclusion body. In this case, after culturing, the cells are collected by centrifugation, disrupted by sonication or the like, and then centrifuged to collect an insoluble fraction containing inclusion bodies. After the inclusion body is washed, it is solubilized with a commonly used protein solubilizer such as urea or guanidine hydrochloride, and this is subjected to various chromatography such as ion exchange, gel filtration, hydrophobicity, affinity, etc. as necessary. After purification, a refolding operation using a dialysis method or a dilution method can be performed to obtain a preparation containing a polypeptide retaining ceramidase activity. If necessary, the preparation can be further purified by various chromatographies to obtain a highly pure polypeptide having ceramidase activity.
[0047]
(5) Oligonucleotide probe or primer
The oligonucleotide probe or primer of the present invention is not particularly limited as long as it hybridizes under stringent conditions to the ceramidase gene or a gene having a base sequence complementary to the gene.
[0048]
The “stringent conditions” are not particularly limited. For example, in a solution containing 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 100 mg / ml herring sperm DNA, [TmThe temperature is kept overnight at a temperature of −25 ° C.].
[0049]
Oligonucleotide probe or primer TmIs obtained, for example, by the following equation.
[0050]
Tm= 81.5−16.6 (logTen[Na+]) + 0.41 (% G + C)-(600 / N)
[0051]
(Where N is the chain length of the oligonucleotide probe or primer and% G + C is the content of guanine and cytosine residues in the oligonucleotide probe or primer.)
[0052]
In addition, when the chain length of the oligonucleotide probe or primer is shorter than 18 bases, TmFor example, the sum of the product of the content of A + T (adenine + thymine) and 2 ° C. and the product of the content of G + C residue and 4 ° C. [(A + T) × 2 + (G + C) × 4].
[0053]
The oligonucleotide probe is designed on the basis of the base sequence of the ceramidase gene of the present invention, and can be prepared, for example, chemically synthesized by a conventional method.
[0054]
The chain length of the oligonucleotide probe is not particularly limited, but is preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more, from the viewpoint of preventing non-specific hybridization.
[0055]
The primer of the present invention also includes a nucleic acid having the same base sequence as that of the oligonucleotide probe. For example, it can be produced by designing and chemically synthesizing based on the base sequence of the gene of the present invention. There is no particular limitation on the primer chain length, but for example, a chain length of 15 to 40 bases can be used, and a chain length of 17 to 30 bases can be preferably used. The primer can be used in various gene amplification methods including the polymerase chain reaction (PCR) method, whereby the ceramidase gene of the present invention can be detected.
[0056]
Further, a fragment obtained by fragmenting a nucleic acid encoding naturally-occurring ceramidase as an oligonucleotide probe or primer by enzymatic treatment such as restriction enzyme treatment or exo-type nuclease treatment, physical treatment such as ultrasound, etc. A nucleic acid obtained by separating and purifying the product by various nucleic acid separation methods represented by agarose gel or the like may be used. The nucleic acid obtained as described above is desirably derived from a region having a sequence characteristic of ceramidase.
[0057]
The oligonucleotide probe or primer can be used for the detection of the ceramidase gene of the present invention by applying an appropriate label according to a known method. The label is not particularly limited, but a radioisotope, a fluorescent substance, a ligand such as biotin and digoxigenin, and the like can be used.
[0058]
(6) Gene detection method
One major feature of the gene detection method of the present invention is to detect a gene in a detection sample using the oligonucleotide probe and / or primer.
[0059]
In the detection method of the present invention, a gene may be detected by a hybridization method using the oligonucleotide probe, or a gene may be detected by a DNA amplification method such as a PCR method using the primer. May be.
[0060]
When using an oligonucleotide probe, the detection sample includes, for example, a sample such as a microbial colony or a tissue section, DNA or RNA immobilized on these samples, or DNA extracted from these samples. And RNA. Of these, DNA fixed on the membrane or extracted DNA is preferred from the viewpoint of sample stability.
[0061]
When an oligonucleotide probe is used, the gene can be detected by a known hybridization method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition.
[0062]
The hybridization conditions can be appropriately determined depending on the Tm value of the probe used, the GC content of the target DNA, and the like. For example, the conditions described in the Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition can be applied.
[0063]
In the case of using a primer, examples of the sample for detection include a microorganism culture solution, a microorganism colony, a microorganism sample such as a microorganism cell, a biological sample such as skin, tissue, and tissue section.
[0064]
For the detection sample in the case of using the primer, for example, an isolated microorganism may be used as it is, or may be used after an appropriate treatment has been performed. In addition, a solid sample such as tissue can be used by preparing a leachate or suspension. In addition, supernatants of these samples, samples obtained by subjecting these samples to cell lysis treatment such as surfactant treatment, and supernatants thereof can also be used. Furthermore, an operation for removing other components in the sample may be performed within a range not damaging the nucleic acid to be detected.
[0065]
When detection is performed by the PCR method using the primer, the PCR conditions can be appropriately selected depending on the Tm value of the primer used, the length of the region to be amplified and detected, and the like.
[0066]
When the primer is used, it can be detected by performing amplification by a DNA amplification method such as PCR method and confirming the presence or absence of a PCR amplification product. The method for confirming the presence or absence of amplification is not particularly limited. For example, after subjecting the nucleic acid amplification reaction solution to agarose gel electrophoresis, the gel is stained with an appropriate nucleic acid staining reagent such as ethidium bromide, SYBER Green I, etc. Can be confirmed by detecting the presence or absence of a band generated by irradiation. The band may be detected with the naked eye, but it can also be detected using, for example, a fluorescence image analyzer.
[0067]
In the detection method of the present invention, the probe and primer may be used in combination in order to increase detection sensitivity. For example, a high-sensitivity and accurate detection can be achieved by amplifying a ceramidase gene present in a trace amount in a sample by PCR using the primer and then hybridizing with the gene using a probe. .
[0068]
When the ceramidase gene is detected by the detection method of the present invention and the expression level of the gene is further determined, the intensity of the signal derived from the hybridized probe, the band derived from the product amplified using the primer, This can be done by quantifying the fluorescence intensity.
[0069]
(7) Kit for use in detecting the gene of the present invention
One feature of the kit for use in detecting the gene of the present invention is that it contains the oligonucleotide probe and / or probe.
[0070]
The kit of the present invention is further typified by various hybridization reagents such as a membrane for immobilizing nucleic acids and a hybridization buffer, a heat-resistant DNA polymerase, a dNTP mixture, and a PCR buffer. PCR reagents, reagents for detecting probes and amplified DNA, culture media for microbial growth, reagents for extracting nucleic acids from samples, and the like may be contained.
[0071]
(8) An antibody or a fragment thereof that specifically binds to a polypeptide having ceramidase activity
The antibody or fragment thereof that specifically binds to the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to specifically bind to the polypeptide, and may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Furthermore, antibodies or antibody derivatives modified by known techniques such as humanized antibodies, Fab fragments, single chain antibodies, and the like can also be used. The antibody of the present invention is, for example, published by John Weily & Sons, Inc. in 1992, edited by John E. Coligan, Current Protocols in Immunology (Current). Protocols in Immunology) can be easily prepared by immunizing rabbits, mice, etc. using all or part of the polypeptide of the present invention. In addition, antibodies can be produced by genetic engineering. Also included are antibodies or fragments thereof that can specifically bind to a partial fragment of a polypeptide.
[0072]
Further, the obtained antibody is purified and then treated with a peptidase or the like to obtain an antibody fragment. Possible uses of the obtained antibody or fragment thereof include detection of ceramidase-producing bacteria, affinity chromatography, screening of various libraries (genomic DNA or cDNA), pharmaceuticals, diagnostic agents, research reagents, and the like.
[0073]
Furthermore, the antibody of the present invention or a fragment thereof may be variously modified in order to facilitate detection by enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, luminescence immunoassay and the like.
[0074]
(9) Polypeptide detection method
The method for detecting a polypeptide of the present invention has one major feature in detecting a polypeptide having ceramidase activity using the antibody or a fragment thereof.
[0075]
In the present invention, as a sample for detection, for example, a microbial cell disruption product, an extract or washing solution of a tissue such as skin, or a protein sample such as a membrane on which a tissue or microbial protein is immobilized can be used.
[0076]
A known method can be used to detect the specific binding of the antibody or fragment thereof to the polypeptide, and examples thereof include enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, and luminescence immunoassay.
[0077]
(10) Kit for use in the method for detecting a polypeptide of the present invention
One feature of a kit for use in the method for detecting a polypeptide of the present invention is that it contains the antibody or a fragment thereof.
[0078]
The kit of the present invention may further contain a reaction buffer, a labeled secondary antibody, a coloring reagent, and the like.
[0079]
(11) Detection method of atopic dermatitis
As described above, ceramidase-producing microorganisms are thought to cause atopic dermatitis or participate in its aversion.
[0080]
According to the method for detecting atopic dermatitis of the present invention, atopic dermatitis is detected by detecting a polypeptide having ceramidase activity in a sample derived from skin or by detecting a gene encoding the polypeptide. can do.
[0081]
The sample derived from the skin used in the method for detecting atopic dermatitis according to the present invention is not particularly limited. For example, the subject's skin is desquamated, and the skin is wiped with a cotton swab or gauze. And a washing solution obtained by washing the skin. There are no particular limitations on the method of collecting these samples, a method of collecting desquamation from the subject's skin as it is, a method of wiping the subject's skin with a cotton swab or gauze, etc., and a size suitable for the subject's skin. It is possible to use a method of collecting the washing liquid by bringing the cylinder into close contact and putting an appropriate washing liquid such as physiological saline or phosphate buffer into the cylinder and washing the skin surface.
[0082]
These samples can be used as they are for detecting the polypeptide or detecting a gene encoding the polypeptide. Furthermore, detection sensitivity can be improved by performing detection using a culture obtained by culturing microorganisms in the sample in an appropriate medium. The medium used for culturing the microorganism is not particularly limited as long as the microorganism in the sample derived from the skin can grow and the ceramidase is efficiently produced. For example, a medium containing glycerol, glucose, sucrose, molasses, yeast extract, peptone, corn steep liquor, meat extract, defatted soybean, ammonium sulfate, ammonium nitrate and the like as the carbon source and / or nitrogen source is suitable. In addition, inorganic or metal salts such as sodium salt, potassium salt, magnesium salt, zinc salt, and phosphate may be added. In addition, lipids such as sphingomyelin and ceramide or surfactants such as taurodeoxycholate may be added to the medium in a range of 0.001 to 1% to increase the expression level of ceramidase and increase detection sensitivity. . There are no particular limitations on the culture conditions of the microorganism, but it is preferable to culture at 25 to 37 ° C. for 1 to 7 days. After completion of the culture, the culture may be used as it is for the detection operation. For detection of the polypeptide, a culture supernatant obtained by centrifuging the culture may be used as a sample.
[0083]
The method for detecting atopic dermatitis of the present invention can be carried out by detecting a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity using the above-mentioned oligonucleotide probe or primer, and the ceramidase activity described above. It can also be carried out by detecting a polypeptide having ceramidase activity using an antibody or a fragment thereof that specifically binds to a polypeptide having the above. In addition, in order to easily detect atopic dermatitis, a kit for detecting a gene encoding a polypeptide having the above-mentioned ceramidase activity or a kit for detecting a polypeptide having the above-mentioned ceramidase activity Can be used. In addition to the kit, a kit further containing a tool for collecting a sample described later, for example, a cotton swab, a culture medium, etc. can be used.
[0084]
In the method for detecting atopic dermatitis of the present invention, when a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity is detected using an oligonucleotide probe, for example, by a known method from a sample derived from the skin of a subject. It can be carried out by hybridizing the prepared nucleic acid and an oligonucleotide probe designed based on the base sequence of the ceramidase gene under appropriate hybridization conditions and detecting the resulting hybrid. For example, a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity can be detected by a dot blot hybridization method in which a nucleic acid prepared from a skin-derived sample is immobilized on a nitrocellulose membrane or the like. Further, it is possible to detect a hybrid produced by directly immobilizing a sample on a nitrocellulose membrane and performing an appropriate lysis treatment to expose nucleic acids in the sample and perform hybridization.
[0085]
In the method for detecting atopic dermatitis of the present invention, when a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity is detected by a gene amplification method, a sample derived from the skin of a subject, or a nucleic acid prepared from the sample Then, a reaction solution containing a primer designed based on the base sequence of the ceramidase gene is prepared, and a gene amplification reaction is performed. When the PCR method is used as the gene amplification reaction, DNA may be amplified by the operation described in (6) above, and the amplified DNA may be detected. For example, a reaction solution containing a pair of primers prepared based on the base sequence of the ceramidase gene, a skin-derived sample, and DNA polymerase, dNTP, etc. is prepared, and the primer sequence and amplification are expected. The amplification reaction is performed under appropriate conditions according to the region chain length. After completion of the reaction, the reaction solution may be analyzed by agarose gel electrophoresis or the like to determine the presence or absence of amplification of a DNA fragment derived from the target gene.
[0086]
If a gene encoding a polypeptide having ceramidase activity is detected from a skin-derived sample by the above method, it is determined that the skin at the site from which the sample is collected suffers from atopic dermatitis.
[0087]
In the method for detecting atopic dermatitis of the present invention, when a polypeptide having ceramidase activity is detected, an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the polypeptide having ceramidase activity is used, and the subject's skin It is examined whether or not a polypeptide that binds to the antibody or fragment thereof is present in a sample derived from the sample. Such a polypeptide can be detected by a known immunological experimental method such as an immunodiffusion method, a latex agglutination method, an enzyme immunization method, and the like. From the viewpoint of detection sensitivity and simplicity, enzyme immunoassay is the most practical.
[0088]
If a polypeptide having ceramidase activity is detected from a sample derived from the skin by the above method, it is determined that the skin at the site from which the sample is collected suffers from atopic dermatitis.
[0089]
(12) Atopic dermatitis detection kit
In order to more easily detect the atopic dermatitis, a kit for detecting a gene encoding a polypeptide having the above ceramidase activity or a kit for detecting a polypeptide having the above ceramidase activity In addition, it can further contain tools for collecting samples, such as cotton swabs, culture media, and the like.
[0090]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is shown concretely, this invention is not limited to a following example.
[0091]
Example 1 Cloning of ceramidase structural gene
(1) Extraction and purification of genomic DNA
Pseudomonas aeruginosa AN-17 (FERM P-15699), a ceramidase-producing bacterium, was inoculated into 200 ml of PY medium (0.5% polypeptone, 0.1% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.2). And cultured at 25 ° C. for 23 hours. After completion of the culture, the obtained culture broth was centrifuged to collect microbial cells, suspended in 10 ml TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), and then 50 mg / ml egg white lysozyme. 0.2 ml of the solution was added and reacted at 30 ° C. for 15 minutes. Next, 2 ml of 10% SDS was added to the solution obtained after the reaction was completed, and the mixture was gently stirred. As soon as the solution became viscous, 10 ml of TE buffer saturated phenol, 1.5 ml of 5M NaCl and And gently stirred at room temperature for 1 hour. The solution obtained after stirring was centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes, and then the upper layer was recovered. Add equal amount of chloroform to the resulting solution and stir for 10 minutes, then centrifuge at 1500 rpm for 10 minutes and collect the same amount of chloroform again and stir, then centrifuge and collect the upper layer (Hereinafter, this series of operations is described as phenol-chloroform treatment). An equal amount of isopropanol was slowly added to the collected solution, and DNA precipitated at the interface was wound with a Pasteur pipette and dissolved in 10 ml of TE buffer. 20 μl of RNase A (10 mM Tris-hydrochloric acid, pH 7.5, dissolved in 15 mM NaCl at 10 mg / ml and heat-treated at 100 ° C. for 15 minutes) was added to the resulting solution and added at 50 ° C. for 1 hour. Keep warm. Furthermore, 10 μl of 20 mg / ml protease K solution, 200 μl of 5M NaCl, and 400 μl of 10% SDS were added to the solution obtained after the incubation, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour for reaction. The solution obtained after the reaction was returned to room temperature and treated with phenol-chloroform. This was repeated twice, and an equal amount of isopropanol and 1/10 volume of 3M sodium acetate were added to the resulting aqueous layer, cooled at −20 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. Was rinsed with 70% ethanol and dissolved in TE buffer to obtain a genomic DNA solution. By this operation, 1.1 mg of genomic DNA was obtained.
[0092]
(2) Determination of partial amino acid sequence of ceramidase
Ceramidase produced by Pseudomonas aeruginosa AN-17 (FERM P-15699) was purified according to the method described in Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, No. 23, pages 14368-14373 (1998). About 5 μg of the obtained ceramidase was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and subjected to electrophoresis. Next, the protein on the gel was transferred to a PVDF membrane (Immobilon-P, manufactured by Millipore) by electroblotting. A portion of the membrane corresponding to the ceramidase band (about 50 pmol) was cut out and shaken in 100 μl of 20 mM Tris-HCl buffer containing 0.2 mg of lysyl endopeptidase (0.9 units) and 8% acetonitrile. Enzymatic digestion was performed by incubating at 16 ° C. for 16 hours. This enzyme digested solution was subjected to reverse phase chromatography to purify the peptide fragment. The obtained peptide fragment was analyzed by Edman degradation method using a model 477 gas phase type peptide sequencer (Applied Biosystems), whereby an internal partial amino acid sequence C-89 of ceramidase (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing). ), C-91 (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), S-90 (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing), C-86 (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing), C-121 (SEQ ID NO: in the sequence listing) : 7) was determined.
[0093]
Separately, the PVDF membrane was subjected to a peptide sequencer without being treated with lysyl endopeptidase, and the N-terminal amino acid sequence N-Term (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) was determined.
[0094]
(3) Amplification of DNA fragment containing ceramidase gene by PCR method
From the N-terminal amino acid sequence of ceramidase determined in Example 1- (2) and the internal partial amino acid sequence, primers represented by SEQ ID NOs: 9 to 11 in the sequence listing were designed and synthesized with a DNA synthesizer.
[0095]
That is, corresponding to S-90 represented by SEQ ID NO: 5, sense mix primer S90-1 represented by SEQ ID NO: 9 and sense mix primer S90-2 represented by SEQ ID NO: 10 are represented by SEQ ID NO: 3. The antisense mix primer C89-c1 represented by SEQ ID NO: 11, the antisense mix primer C89-c2 represented by SEQ ID NO: 12, and the sense mix represented by SEQ ID NO: 13 corresponding to C-89 represented by Primer C89-1 corresponds to C-91 represented by SEQ ID NO: 4, and antisense mix primer C91-c1 represented by SEQ ID NO: 14 was synthesized.
[0096]
PCR reaction was performed using these primers. PCR was performed using Gene Amp Reagent Kit, manufactured by Perkin-Elmer Citas Instruments. The reaction was performed at 40 cycles of 94 ° C .: 0.5 minutes, 51 ° C .: 0.5 minutes, and 72 ° C .: 1 minute.
[0097]
In the PCR reaction using the genomic DNA obtained in Example 1- (1) as a template and the combination of primer C89-1 and primer C91-c1, amplification of a specific band corresponding to about 350 bp was detected. No specific band was amplified by the combination of primers S90-1 and C89-c1, S90-1 and C89-c2, S90-2 and C89-c1, and S90-2 and C89-c2.
[0098]
The above amplified DNA fragment of about 350 bp was recovered from the gel after agarose gel electrophoresis, and a recombinant plasmid was prepared by ligating it with the pGEM-T easy vector (Promega). Using the plasmid as a template, the base sequence of the amplified DNA fragment was determined by the dideoxy method. As a result, a base sequence encoding each of the partial amino acid sequences C-89, C-86, C-121 and C-91 of ceramidase was found in the obtained base sequence, and this amplified DNA fragment was the target ceramidase. It became clear that it is a part of the gene encoding.
[0099]
(4) Detection of DNA fragment containing ceramidase gene
Using the PCR-amplified DNA fragment obtained in Example 1- (3) as a probe, a genomic DNA fragment containing the ceramidase gene was screened.
[0100]
First, 5 μg of genomic DNA prepared in Example 1- (1) was added with 100 units of restriction enzymes SphI, ApaI, KpnI, XhoI, SalI, HincII, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, NotI and SacII, respectively. After digestion at 37 ° C. for 22 hours, the obtained restriction enzyme digested DNA was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, DNA was transferred to a nylon membrane [High Bond-N + (Hybond-N +), Amersham) by Southern blotting. As a hybridization probe, 0.1 μg of the PCR-amplified DNA fragment obtained in Example 1- (3) was used with a DNA labeling kit [ReadyTo Go, Pharmacia]. According to the protocol32Those labeled with P were used.
[0101]
The above nylon membrane is coated with 0.5 M Church method phosphate buffer [Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, Vol. 81, 1991-1995 ( 1984)] After prehybridization at 65 ° C. for 1 hour or more in a hybridization solution containing pH 7.0, 7% SDS and 1 mM EDTA, the above labeled probe was added so as to be 6 fmol / ml. Hybridization was performed overnight. Next, washing at 65 ° C. for 15 minutes was repeated three times in a washing solution (composition: 1% SDS, 40 mM sodium phosphate buffer) heated to 65 ° C. After removing excess moisture from the nylon membrane, it was exposed to an imaging plate (Fuji Film) manufactured by Fuji Film for 20 minutes for exposure. The imaging plate after exposure was analyzed with a BAS1000 imaging analyzer (Fuji Film) to detect the probe on the nylon membrane. As a result, the digests of SphI, ApaI, KpnI, XhoI, SalI, HincII, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, NotI and SacII were about 7.1 kb, about 2.8 kb, about 12. 6 kb, about 5.8 kb, about 1.8 kb, about 1.8 kb, about 13.7 kb, about 12.6 kb, about 9 kb, about 6 kb, about 3.5 kb, about 6.7 kb, about 11.8 kb, about 1 A signal derived from the probe hybridized at a position of .5 kb was observed.
[0102]
(5) Cloning of ceramidase gene
Based on the result of Example 1- (4), an ApaI fragment of about 2.8 kb was cloned. 10 mg of ApaI digested genomic DNA was separated by 1% agarose gel electrophoresis, and an agarose gel at a position corresponding to a size of about 2.8 kb was cut out. A DNA fragment was extracted and purified from the gel using a Sephaglas BandPrep Kit (Amersham Pharmacia), and a recombinant plasmid was prepared by inserting the DNA fragment into the ApaI site of pBluescript II SK (Toyobo). . Escherichia coli JM109 was transformed with the above plasmid, and appeared after overnight culture on L agar medium (composition: 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, pH 7.2) containing ampicillin 100 μg / ml. From these colonies, 300 colonies were selected and inoculated on a nylon membrane [Hybond-N, manufactured by Amersham] placed on the same medium plate. After culturing at 37 ° C. for 16 hours, the nylon membrane was immersed in an alkali-denaturing solution (composition: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) on a filter paper for 5 minutes (denaturation) and neutralized solution (composition: 0.5 M). After 5 minutes (neutralization) treatment on filter paper soaked in Tris-HCl (pH 7.5), 3M NaCl), 2 × SSC (1 × SSC composition: 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, Rinse at pH 7.0).
[0103]
When this nylon membrane was hybridized under the same conditions as described above using the PCR amplified DNA fragment obtained in Example 1- (3) as a probe, signals were obtained for two colonies. A plasmid was prepared from one of these colonies, named pSCA59, and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of the plasmid was determined. As a result, sequences corresponding to amino acid sequences C-89, C-86, C-121 and C-91 obtained in Example 1- (2) and stop codons were found in the same frame as those sequences. However, no nucleotide sequence corresponding to the N-terminal amino acid sequences N-Term and S-90 was found. That is, it was revealed that this plasmid contains a 3 'terminal portion (C-terminal region) containing a ceramidase gene stop codon but lacks a 5' terminal portion (N-terminal region).
[0104]
Subsequently, in order to cover the entire length of the ceramidase gene, a DNA fragment encoding the vicinity of the N-terminus that was deleted in pSCA59 was further screened by Southern hybridization in the same manner as described above. The probe used was an about 560 bp KpnI and SacII digested fragment of pSCA59 containing a sequence close to the 5 'end of the ceramidase gene. About 560 bp of KpnI and SacII fragments isolated by agarose gel electrophoresis were obtained in the same manner as above.32After P labeling, Southern hybridization was performed in the same manner as described above. As a result, for the probe used, about 7.1 kb for the SphI digest, about 2.8 kb for the ApaI digest, about 5.8 kb for the XhoI digest, about 9 kb for the EcoRI digest, and about 6 kb for the PstI digest. It was shown that the probe hybridizes at a position of about 3.5 kb for the SmaI digest, about 2.1 kb for the BamHI digest, and about 2.5 kb for the SacII digest.
[0105]
Based on the above results, the BamHI fragment of about 2.1 kb was cloned. 10 mg of BamHI-digested genomic DNA was separated by 1% agarose gel electrophoresis, an agarose gel at a position corresponding to a size of about 2.1 kb was excised, and a DNA fragment extracted and purified from the gel by the Sephagrass bandprep kit was pGEM-3Zf (+) It was inserted into the BamHI site (manufactured by Promega). Escherichia coli JM109 was transformed with this plasmid and colony hybridization was performed in the same manner as described above. As a result, 9 positive colonies were obtained. A plasmid was prepared from one of these, named pGCB38, and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined. First, this plasmid was digested with restriction enzymes PstI and XbaI, and various deletion mutations were performed using exonuclease III (Exonuclease III, Nippon Gene) and mangbean nuclease (Mung Bean Nuclease, Nippon Gene) according to a standard method. The body was made. The base sequences of these mutants and pGCB38 were analyzed by the dideoxy method, and the base sequence of the ceramidase gene inserted into pGCB38 was determined. As a result, the N-terminal amino acid sequence N-Term of ceramidase and a base sequence corresponding to S-90 were found, and it was revealed that pGCB38 contains a portion encoding the N-terminal portion of the ceramidase gene.
[0106]
A restriction map of the inserted DNA fragments of plasmids pSCA59 and pGCB38 is shown in FIG. From the analysis results of the base sequences of both plasmids, the entire base sequence of the ceramidase gene and the amino acid sequence of ceramidase were determined. The nucleotide sequence of the open reading frame (ORF) encoding ceramidase produced by Pseudomonas aeruginosa AN-17 is shown in SEQ ID NO: 16 of the Sequence Listing, and the amino acid sequence encoded by this ORF is shown in SEQ ID NO: 15 of the Sequence Listing. Each is shown. Further, the base sequence encoding the mature ceramidase, which was clarified from the N-terminal amino acid sequence N-Term of the ceramidase obtained in Example 1- (2) (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing), The amino acid sequence of mature ceramidase encoded by this base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
[0107]
Example 2 Construction of a plasmid expressing ceramidase polypeptide
A plasmid expressing ceramidase was constructed according to the following procedure.
Up to 15 bases upstream of the start codon of the ORF encoding ceramidase are inserted into the deletion mutant pGCB38-D13 of the plasmid pGCB38 prepared in Example 1- (5). A DNA fragment of about 1.3 kb generated by digesting the plasmid with restriction enzymes HindIII and BamHI was isolated and purified by 1% agarose gel electrophoresis to obtain DNA fragment-1. On the other hand, a DNA fragment of about 1.6 kb generated by digesting plasmid pSCA59 with restriction enzymes HindIII and BamHI was isolated and purified by 1% agarose gel electrophoresis to obtain DNA fragment-2. Next, HindIII digested plasmid pTV119N (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and the above DNA fragment-1 and DNA fragment-2 were mixed and ligated, and the inserted fragment was DNA fragment-1, DNA downstream of the lac promoter of pTV119N. A recombinant plasmid inserted correctly in the order of fragment-2 was selected and designated pTCD11. Furthermore, pTCD11 was digested with the restriction enzyme SmaI to create a plasmid pTCDS7 from which the 500 bp SmaI fragment had been deleted. E. coli JM109 transformed with this plasmid is named and displayed as Escherichia coli JM109 / pTCDS7, and is deposited as FERM BP-6728 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
[0108]
Example 3 Expression of ceramidase in transformed E. coli
Escherichia coli JM109 / pTCDS7 obtained in Example 2 was inoculated into 5 ml of L medium containing 100 μg / ml ampicillin and cultured overnight at 37 ° C., and 1 ml thereof was inoculated into 200 ml of the same medium. When the turbidity (absorbance at 600 nm) reached approximately 0.6 after culturing at 37 ° C., a final concentration of 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) was added, and further at 37 ° C. for 8 hours. Shaking culture was performed. After completion of the culture, the culture solution is centrifuged, and the cells are collected and suspended in 3 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.5 mM 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl hydrochloride. The cells were turbid and sonicated to disrupt the cells. The obtained crushed liquid was centrifuged and the supernatant was collected and used as a crude enzyme solution.
[0109]
The ceramidase activity of this crude enzyme solution was measured using C12-NBD-ceramide as a substrate according to the method described in Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, pages 14368-14373 (1998). That is, 550 pmol of C12-NBD-ceramide, 2.5 mM calcium chloride, 0.25% (w / v) Triton X-100 (Triton X-100) in 20 μl of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) A reaction solution in which an appropriate amount of the crude enzyme solution was dissolved was prepared and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. The reaction was incubated for 5 minutes in a boiling water bath to stop the reaction, and the reaction was further dried under reduced pressure. The dried product was dissolved in chloroform / methanol = 2/1 (weight ratio) and then developed with silica gel thin layer chromatography (developing solvent: chloroform / methanol / 25% aqueous ammonia = 90/20 / 0.5 (volume ratio)). Then, using CS-9300 chromatographic scanner (manufactured by Shimadzu Corporation), the amount of C12-NBD-ceramide and its decomposition product, C12-NBD-fatty acid, were measured at an excitation wavelength of 475 nm and a fluorescence wavelength of 525 nm. One unit was defined as the amount of enzyme required to produce 1 μmol of C12-NBD-fatty acid per minute under the above conditions, so that Escherichia coli JM109 / pTCDS7 having the ceramidase gene of the present invention It has been shown to produce about 32 units of ceramidase per liter.
[0110]
Example 4 Detection of Atopic Dermatitis
As primers for detecting the ceramidase gene, a primer 382U as an upstream primer and a primer 884L as a downstream primer were designed and synthesized from the base sequence of the ceramidase gene. Sequence numbers 17 and 18 in the sequence listing show the base sequences of primer 382U and primer 884L, respectively. When PCR is performed using these two types of primers and the ceramidase gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as a template, a 523 bp DNA fragment is amplified.
[0111]
Skin-derived samples were collected from the skins of 24 atopic dermatitis patients and 8 healthy subjects by the following operation. The skin of the subject was wiped with a sterilized cotton swab, and the swab was immersed in 200 μl of sterilized distilled water and stirred vigorously, and then the liquid was collected. For patients with atopic dermatitis, the affected skin was wiped with a cotton swab and a sample was collected. The collected solution was heated at 100 ° C. for 5 minutes to obtain a sample solution for PCR.
[0112]
PCR was performed using EXTaq (Takara Shuzo). Using 5 μl of sample solution, 100 μl of PCR reaction solution each containing 0.2 μM primer 382U and primer 884L, 2 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 2.5 U EXTaq, respectively, using the reaction buffer attached to EXTaq. The reaction was carried out 40 cycles of 94 ° C: 1 minute, 60 ° C: 1 minute, 72 ° C: 1 minute. A part of this reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the gel after electrophoresis was stained with ethidium bromide to examine the presence or absence of DNA fragment amplification.
[0113]
As a result, specific amplification of a DNA fragment of about 500 bp indicating the presence of the ceramidase gene was observed in 15 samples out of 24 patients with atopic dermatitis. On the other hand, amplification of such a fragment was not recognized in eight samples derived from healthy persons.
[0114]
Sequence listing free text
SEQ ID NO: 9
The designed oligonucleotide is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
[0115]
SEQ ID NO: 10
The designed oligonucleotide is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
[0116]
SEQ ID NO: 11
The designed oligonucleotide is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
[0117]
SEQ ID NO: 12
The designed oligonucleotide is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
[0118]
SEQ ID NO: 13
The designed oligonucleotide is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
[0119]
SEQ ID NO: 14
The designed oligonucleotide is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
[0120]
【The invention's effect】
According to the present invention, an amino acid sequence of alkaline ceramidase and a base sequence encoding the same are provided for the first time, whereby a genetic engineering method for producing a polypeptide having ceramidase activity using the gene, a method for detecting the ceramidase, A method for detecting atopic dermatitis is provided. In the method for producing ceramidase of the present invention, it is not necessary to add sphingolipid to the medium in order to induce the expression of ceramidase. Enzymes such as sphingomyelinase induced at the same time, sphingolipid added to the medium or a degradation product thereof Therefore, the target ceramidase can be easily purified. Also provided are probes and primers that specifically hybridize to the ceramidase gene of the present invention, and antibodies or fragments thereof that specifically bind to the polypeptide having ceramidase activity of the present invention. With such probes, primers, and antibodies or fragments thereof, ceramidase can be detected easily and with high sensitivity. Further, by using the probe, primer, antibody or fragment thereof, there is an excellent effect that it becomes possible to easily detect atopic dermatitis.
[0121]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows restriction enzyme maps of inserted DNA fragments of plasmids pSCA59 and pGCB38, respectively.
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