JP2021136896A - Phospholipase d, and method for quantifying ethanolamine type plasmalogen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はホスホリパーゼＤや、エタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法や、発現ベクターや、前記発現ベクターが導入された形質転換体や、前記形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法に関する。 The present invention includes a method for quantifying phospholipase D and ethanolamine-type plasmalogen, an expression vector, a transformant into which the expression vector has been introduced, and a step of culturing the transformant to produce phospholipase D. , A method for producing phospholipase D.
プラズマローゲンは抗酸化作用、イオン輸送、コレステロール排出等の機能を持ったリン脂質の一種である。かかるプラズマローゲンは哺乳動物の全ての組織に存在し、人体のリン脂質の約１８％を占めているといわれており、特に脳神経細胞、心筋、リンパ球、マクロファージ等に多く含まれている。 Plasmalogen is a type of phospholipid that has functions such as antioxidant action, ion transport, and cholesterol excretion. Such plasmalogens are present in all tissues of mammals and are said to occupy about 18% of phospholipids in the human body, and are particularly abundant in brain nerve cells, myocardium, lymphocytes, macrophages and the like.
近年、プラズマローゲンがアルツハイマー型認知症や軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：ＭＣＩ）の患者の脳において有意に減少していることや（非特許文献１、２参照）、アルツハイマー型認知症患者の血液中のプラズマローゲン濃度が低下していること（非特許文献３、４参照）が開示され、アルツハイマー型認知症とプラズマローゲンとの関係が注目されている。
In recent years, plasmalogens have been significantly reduced in the brains of patients with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment (MCI) (see Non-Patent
こうした中、プラズマローゲンの測定に関する研究も進んできた。たとえば、（Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定する工程、及び（Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程を含む、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法（特許文献１参照）が提案されている。 Under these circumstances, research on plasmalogen measurement has also progressed. For example, (A) the step of measuring the amount of plasmalogen contained in the erythrocytes contained in the test blood sample using high-speed liquid chromatography, and (B) (i) the plasma contained in the erythrocytes contained in the test blood sample. The test blood sample was derived from a dementia mammal, including the step of comparing the amount of plasmalogen with (ii) the amount of plasmalogen contained in erythrocytes derived from a healthy mammal of the same species as the mammal from which the test blood sample was collected. An inspection method for determining the presence (see Patent Document 1) has been proposed.
また、エタノールアミン型プラズマローゲンを検出・定量する方法としては、サンプル中のエタノールアミン型プラズマローゲンをホスホリパーゼＡ１で加水分解処理してエタノールアミン型リゾプラズマローゲンを生成し、その後、ホスホリパーゼＤで処理する工程を含むプラズマローゲンの検出・定量方法（特許文献２−４、非特許文献５参照）も提案されている。 As a method for detecting and quantifying ethanolamine-type plasmalogen, ethanolamine-type plasmalogen in a sample is hydrolyzed with phospholipase A1 to produce ethanolamine-type lysoplasmalogen, and then treated with phospholipase D. A method for detecting and quantifying plasmalogen including a step (see Patent Document 2-4 and Non-Patent Document 5) has also been proposed.
従来のプラズマローゲンの測定方法では、高速液体クロマトグラフィーを用いるなど、測定のための設備が大型かつ高額であった。また、アルツハイマー型認知症の指標としては、エタノールアミン型プラズマローゲンが用いられる。このエタノールアミン型プラズマローゲンの測定には、まずホスホリパーゼＡ１で加水分解する方法が行われていたが、反応が二段階で複雑・煩雑であると共に高コストとなるという問題や、大腸菌を用いた組換え体によるホスホリパーゼＡ１の生産が難しいという問題があった。また、これまで知られているホスホリパーゼは基質特異性、特にエタノールアミン型プラズマローゲンに対する基質特異性が低く、アルツハイマー型認知症のバイオマーカーとなるプラズマローゲン以外のリン脂質も加水分解するという問題があった。そこで本発明の課題は、エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤを提供すること、及び、かかるホスホリパーゼＤを用いたエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法を提供することにある。 In the conventional plasmalogen measurement method, the equipment for measurement is large and expensive, such as using high performance liquid chromatography. In addition, ethanolamine-type plasmalogen is used as an index of Alzheimer-type dementia. In the measurement of this ethanolamine-type plasmalogen, the method of hydrolyzing with phospholipase A1 was first performed, but the reaction is complicated and complicated in two steps and the cost is high, and the group using Escherichia coli is used. There was a problem that it was difficult to produce phospholipase A1 by the substitute. In addition, phospholipases known so far have low substrate specificity, particularly substrate specificity for ethanolamine-type plasmalogen, and have a problem of hydrolyzing phospholipids other than plasmalogen, which is a biomarker for Alzheimer-type dementia. rice field. Therefore, an object of the present invention is to provide phospholipase D having high substrate specificity for ethanolamine-type plasmalogen, and to provide a method for quantifying ethanolamine-type plasmalogen using such phospholipase D.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）に近縁のストレプトマイセス属ＡＫ４６１株由来のホスホリパーゼＤがエタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いことを見いだした。さらに、かかるホスホリパーゼＤを用いれば、エタノールアミン型プラズマローゲンを検出若しくは定量でき、さらに選択的に定量でき得ることを見いだし、本発明を完成した。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have made a phospholipase derived from the Streptomyces racemochromogenes strain AK461, which is closely related to Streptomyces polychromogenes or Streptomyces racemochromogenes. It was found that D has high substrate specificity for ethanolamine-type plasmalogen. Furthermore, they have found that ethanolamine-type plasmalogen can be detected or quantified by using such phospholipase D, and can be quantified more selectively, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
〔１〕以下の（１−１）〜（１−３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ。
（１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
〔２〕エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであって、以下の（２−１）〜（２−５）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２−１）エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有する；
（２−２）分子量 ５０，０００〜６０，０００である；
（２−３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０〜６０℃である；
（２−４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５〜７．５である；
（２−５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
〔３〕ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）に近縁の微生物由来であることを特徴とする、上記〔２〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔４〕エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が５以下、ホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下であることを特徴とする上記〔２〕又は〔３〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔５〕試料と上記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法。
〔６〕上記〔１〕記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔７〕上記〔６〕記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔８〕上記〔７〕記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] Phospholipase D comprising the polypeptide according to any one of (1-1) to (1-3) below.
(1-1) A polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(1-2) A polypeptide having at least 85% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having a hydrolyzing action on a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule;
(1-3) A polypeptide in which one or several amino acids are added, substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and is a phosphate in an ethanolamine-type plasmalogen molecule. Polypeptide having a hydrolyzing effect on ester bonds;
[2] A phospholipase D having a hydrolyzing action on a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule, which has the following properties (2-1) to (2-5).
(2-1) Has an action of hydrolyzing a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule;
(2-2) The molecular weight is 50,000 to 60,000;
(2-3) Optimal temperature pH 7.0, 40-60 ° C. under the conditions of reaction for 30 minutes;
(2-4) Optimal pH 37 ° C., pH 5.5-7.5 under the conditions of reaction for 30 minutes;
(2-5) Derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces;
[3] The phospholipase D according to the above [2], which is derived from a microorganism closely related to Streptomyces polychromogenes or Streptomyces racemochromogenes.
[4] When the hydrolysis activity to the phosphate ester bond when ethanolamine-type plasmalogen is used as a substrate is 100, the relative activity value when ethanolamine-type lysoplasmalogen is used as a substrate is 5 or less, and phosphatidyl. The above [2] or [3], wherein the relative activity value when ethanolamine is used as a substrate is 5 or less, and / or the relative activity value when lysophosphatidylethanolamine is used as a substrate is 5 or less. Phosphorlipase D.
[5] A method for quantifying ethanolamine-type plasmalogen in a sample, which comprises a step of allowing the sample to act on the phospholipase D according to any one of the above [1] to [4].
[6] An expression vector containing a polynucleotide encoding the phospholipase D according to the above [1].
[7] A transformant into which the expression vector described in [6] above has been introduced.
[8] A method for producing phospholipase D, which comprises a step of culturing the transformant according to the above [7] to produce phospholipase D.
本発明のホスホリパーゼＤによりエタノールアミン型プラズマローゲンを加水分解することが可能となる。したがって、本発明のホスホリパーゼＤにより、エタノールアミン型プラズマローゲンを容易かつ迅速に検出若しくは定量することが可能となる。 The phospholipase D of the present invention makes it possible to hydrolyze ethanolamine-type plasmalogen. Therefore, the phospholipase D of the present invention makes it possible to easily and quickly detect or quantify ethanolamine-type plasmalogen.
［ホスホリパーゼＤ］
本発明のホスホリパーゼＤ−（１）は、
（１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
の（１−１）〜（１−３）のいずれか記載のポリペプチドを含むホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ−（１）」ともいう。なお、後述のように配列番号１におけるＮ末端側２６アミノ酸、つまり配列番号１における１〜２６番目のアミノ酸はＳｅｃ分泌シグナルであると考えられる。そのため、配列番号１における１〜２６番目のアミノ酸等のＳｅｃ分泌シグナルと考えられるアミノ酸を除いた配列、たとえば配列番号１における２７番目〜５２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドや、配列番号１における２７番目〜５２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端側に他の分泌シグナル配列を結合したポリペプチドをホスホリパーゼＤとしてもよい。
[Phospholipase D]
The phospholipase D- (1) of the present invention is
(1-1) A polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(1-2) A polypeptide having at least 85% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having a hydrolyzing action on a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule;
(1-3) A polypeptide in which one or several amino acids are added, substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and is a phosphate in an ethanolamine-type plasmalogen molecule. Polypeptide having a hydrolyzing effect on ester bonds;
Phospholipase D containing the polypeptide according to any one of (1-1) to (1-3), hereinafter also referred to as "Phospholipase D- (1)". As will be described later, the N-terminal 26 amino acids in SEQ ID NO: 1, that is, the 1st to 26th amino acids in SEQ ID NO: 1 are considered to be Sec secretion signals. Therefore, a sequence excluding amino acids considered to be a Sec secretion signal such as the 1st to 26th amino acids in SEQ ID NO: 1, for example, a polypeptide having the 27th to 528th amino acid sequence in SEQ ID NO: 1 and 27 in SEQ ID NO: 1. A polypeptide in which another secretory signal sequence is bound to the N-terminal side of the polypeptide having the amino acid-th to 528th amino acid sequence may be designated as phosphoripase D.
また、本発明のホスホリパーゼＤ−（２）は、
（２−１）エタノールアミン型プラズマローゲンにおけるリン酸エステルの加水分解作用を有する；
（２−２）分子量 ５０，０００〜６０，０００である；
（２−３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０〜６０℃である；
（２−４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下で５．５〜７．５である；
（２−５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
の（２−１）〜（２−５）の性質を有し、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ−（２）」ともいう。また、上記本件ホスホリパーゼＤ−（１）及び本件ホスホリパーゼＤ−（２）を総称して、以下、「本件ホスホリパーゼＤ」又は「本件ＰＬＤ」ともいう。
Further, the phospholipase D- (2) of the present invention can be used.
(2-1) Has a hydrolyzing action of phosphate ester in ethanolamine type plasmalogen;
(2-2) The molecular weight is 50,000 to 60,000;
(2-3) Optimal temperature pH 7.0, 40-60 ° C. under the conditions of reaction for 30 minutes;
(2-4) The optimum pH is 5.5 to 7.5 under the conditions of reaction at 37 ° C. for 30 minutes;
(2-5) Derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces;
Phospholipase D having the properties of (2-1) to (2-5) and having a hydrolyzing action on the phosphate ester bond in the ethanolamine-type plasmalogen molecule. 2) ”. In addition, the above-mentioned Phospholipase D- (1) and Phospholipase D- (2) are collectively referred to hereinafter as "Phospholipase D" or "PLD".
本明細書におけるエタノールアミン型プラズマローゲン（以下、「ＰｌｓＥｔｎ」ともいう）は、グリセロリン脂質のサブクラスの一つで、グリセロリン脂質のＣ１（ｓｎ−１）位にアルケニル（ビニル）エーテル結合した炭化水素鎖、Ｃ２（ｓｎ−２）位に脂肪酸エステル結合を持つアルケニルエーテル型グリセロリン脂質であって、塩基がエタノールアミンであるものであればよく、以下の式（I）にその構造を示す。 The ethanolamine-type plasmalogen (hereinafter, also referred to as “PlsEtn”) in the present specification is one of the subclasses of glycerophospholipids, and is a hydrocarbon chain in which an alkenyl (vinyl) ether is bonded to the C1 (sn-1) position of the glycerophospholipid. , An alkenyl ether type glycerophospholipid having a fatty acid ester bond at the C2 (sn-2) position, and the base may be ethanolamine, and its structure is shown in the following formula (I).
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、脂肪族炭化水素基である。Ｒ１は、通常、炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素基で、例えば、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基等が挙げられる。Ｒ２は、通常、脂肪酸残基由来の脂肪族炭化水素基で、例えば、オクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサレトラエノイル基２０:４、イコサペンタエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基２２:６などが挙げられる。 In the formula, R 1 and R 2 are independently aliphatic hydrocarbon groups. R 1 is usually an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, and examples thereof include a dodecyl group, a tetradecyl group, a hexadecyl group, an octadecyl group, and an icosanyl group. R 2 is usually an aliphatic hydrocarbon group derived from a fatty acid residue, for example, octadecadienoil group, octadecaterienoyl group, icosaletraenoyl group 20: 4, icosapentaenoyl group, docosatetra. Examples thereof include an enoyl group, a docosapentaenoyl group, and a docosahexaenoyl group 22: 6.
本件ホスホリパーゼＤは、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用、具体的には以下の式（II）に示すようにエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のｓｎ−３位リン酸エステルを加水分解してプラズメニルホスファチジン酸とエタノールアミンを遊離させる作用を有する酵素である。 The Phospholipase D has a hydrolyzing action on the phosphate ester bond in the ethanolamine-type plasmalogen molecule, specifically, sn-3 position phosphorus in the ethanolamine-type plasmalogen molecule as shown in the following formula (II). It is an enzyme that hydrolyzes an acid ester to liberate plasmalogenylphosphatidic acid and ethanolamine.
エタノールアミン型プラズマローゲンにおいてリン酸エステルへの加水分解作用を有するか否かは、たとえばエタノールアミン型プラズマローゲンにホスホリパーゼＤを作用させて、加水分解により遊離されるエタノールアミンを定量することによって行うことができる。エタノールアミンの定量は、例えば、エタノールアミンにエタノールアミンオキシダーゼ（ＥＡＯ：特開２０１４−２３３２１９号公報）を作用させて発生した過酸化水素を定量する方法によって行うことができる。 Whether or not an ethanolamine-type plasmalogen has a hydrolysis effect on a phosphate ester is determined, for example, by allowing phospholipase D to act on the ethanolamine-type plasmalogen and quantifying the ethanolamine released by hydrolysis. Can be done. The quantification of ethanolamine can be carried out, for example, by a method of quantifying hydrogen peroxide generated by allowing ethanolamine oxidase (EAO: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-233219) to act on ethanolamine.
上記エタノールアミンオキシダーゼは、エタノールアミンを過酸化水素とアンモニアとグリコールアルデヒドに酸化する作用を触媒する酵素であればよく、モノエタノールアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．８）、モノアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．４）、及び一級アミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２１）等を用いることができる。 The ethanolamine oxidase may be any enzyme that catalyzes the action of oxidizing ethanolamine to hydrogen peroxide, ammonia and glycolaldehyde, and may be monoethanolamine oxidase (EC1.4.3.8) or monoamine oxidase (EC1.4). .3.4), primary amine oxidase (EC 1.4.3.21) and the like can be used.
上記過酸化水素を定量する方法としては、分光光度法、過酸化水素電極を用いる方法等を挙げることができる。具体的には、例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（４−ＡＡ）とＮ，Ｎ−ビス(４−ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ)−３−ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ， ｄｉｓｏｄｉｕｍ （ＴＯＤＢ）とを定量的に酸化縮合させて生成した青紫色の色素であるキノン色素に基づく吸光度（５５０ｎｍ）を測定する方法を挙げることができる。なお、キノン色素量は遊離したエタノールアミン量と１：１の関係となるため、キノン色素の量を測定することでエタノールアミン量を測定することとなる。なお、本明細書中、１分間に１μmolのエタノールアミンを遊離する酵素量を１Ｕと定義した。 Examples of the method for quantifying hydrogen peroxide include a spectrophotometric method and a method using a hydrogen peroxide electrode. Specifically, for example, by the action of peroxidase (POD), 4-Aminoantipyrine (4-AA) and N, N-bis (4-sulfovutyl) -3-methylaniline, disodium (TODB) are quantitatively oxidatively condensed. A method of measuring the absorbance (550 nm) based on the produced quinone dye, which is a bluish-purple dye, can be mentioned. Since the amount of quinone dye has a 1: 1 relationship with the amount of liberated ethanolamine, the amount of ethanolamine is measured by measuring the amount of quinone dye. In the present specification, the amount of enzyme that liberates 1 μmol of ethanolamine per minute is defined as 1U.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（１）の（１−２）のポリペプチドにおける「配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド」としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％以上、９３％以上、９５％以上、又は９８％以上の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチドを挙げることができる。 The phosphate ester in the polypeptide (1-2) of the Phosphorlipase D- (1), which has at least 85% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and in the ethanolamine-type plasmalogen molecule. The "polypeptide having a hydrolyzing action on binding" has at least 85%, 90% or more, 93% or more, 95% or more, or 98% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Moreover, a polypeptide having a hydrolyzing action on a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule can be mentioned.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（１）の（１−３）のポリペプチドにおける「１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチド」とは、例えば１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は１個の任意の数のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドを挙げることができる。なお、上記「１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチド」は、配列番号１における１９２番目及び４６２番目のＨ、１９４番目及び４６４番目のＫ、１９９番目及び４６９番目のＤ以外、好ましくは１９２番目〜１９９番目のＨＳＫＬＶＶＶＤ、及び４６２番目〜４６９番目のＨＨＫＬＶＳＶＤのＨｘＫｘｘｘｘＤモチーフ（Ｈはヒスチジン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、ｘは任意のアミノ酸：ＨＳＫモチーフ）以外における１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであることが好ましい。なお、上記ＨＳＫモチーフは、ホスホリパーゼＤにおいて触媒反応に寄与するアミノ酸配列である。 The "polypeptide to which one or several amino acids have been added, substituted, deleted and / or inserted" in the polypeptide of (1-3) of the present phospholipase D- (1) is, for example, 1 to 10. Polypeptides in which 1 to 5, 1-3, 1-2, or any number of amino acids have been added, substituted, deleted and / or inserted can be mentioned. The above-mentioned "polypeptide to which one or several amino acids have been added, substituted, deleted and / or inserted" is the 192nd and 462th H, 194th and 464th K, 199th in SEQ ID NO: 1. And 469th D, preferably 192nd to 199th HSKLVVV, and 462th to 469th HHKLVVSVD HxKxxxxxxD motifs (H is histidine, K is lysine, D is aspartic acid, S is serine, L is leucine, It is preferable that V is a polypeptide in which one or several amino acids other than valine and x are arbitrary amino acids: HSK motif) are added, substituted, deleted and / or inserted. The HSK motif is an amino acid sequence that contributes to a catalytic reaction in phospholipase D.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（１）の（１−２）のポリペプチド又は（１−３）のポリペプチドとしては、エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステルへの加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下であるポリペプチドを好適に挙げることができる。 As the above-mentioned phospholipase D- (1) (1-2) polypeptide or (1-3) polypeptide, the hydrolysis activity to a phosphate ester when ethanolamine-type plasmalogen is used as a substrate is 100. The relative activity value when ethanolamine-type lysoplasmalogen (LyPlsEtn) is used as a substrate is 5 or less, preferably 3 or less, and the relative activity value when phosphatidylethanolamine (PE) is used as a substrate is 5 or less. , And / or a polypeptide having a relative activity value of 5 or less, preferably 3 or less when lysophosphatidylethanolamine is used as a substrate can be preferably mentioned.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（２）は、電気泳動条件等により若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が５０，０００〜６０，０００（Ｄａ）、好ましくは５２，０００〜５４，０００（Ｄａ）を挙げることができる。また、等電点(Genetyxによる計算値)としては６〜６．５を挙げることができる。本等電点は実測値とは異なる可能性がある。 The above-mentioned phospholipase D- (2) may change slightly depending on the electrophoresis conditions and the like, but the molecular weight in SDS-PAGE is 50,000 to 60,000 (Da), preferably 52,000 to 54,000 (Da). Can be mentioned. Further, as the isoelectric point (calculated value by Genetyx), 6 to 6.5 can be mentioned. This isoelectric point may differ from the measured value.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（２）は、ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下において、至適温度が４０〜６０℃、好ましくは４５℃〜５５℃を挙げることができる。 The phospholipase D- (2) has an optimum temperature of 40 to 60 ° C., preferably 45 ° C. to 55 ° C. under the conditions of pH 7.0 and reaction for 30 minutes.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（２）は、３７℃、３０分間反応の条件下において、至適ｐＨが５．５〜７．５、好ましくは６．０〜７．０を挙げることができる。 The above-mentioned Phospholipase D- (2) has an optimum pH of 5.5 to 7.5, preferably 6.0 to 7.0 under the conditions of reaction at 37 ° C. for 30 minutes.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（２）は、ストレプトマイセス属に属する微生物由来であり、ストレプトマイセス属に属する微生物としては、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）若しくはストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）、又はこれらに近縁の微生物のほか、ストレプトマイセス カトラエ（Streptomyces katrae）、ストレプトマイセス フラボトリチニ（Streptomyces flavotricini）、ストレプトマイセス トキシトリチニ（Streptomyces toxytricini）、ストレプトマイセス ヤングプエンシス（Streptomyces yangpuensis）、ストレプトマイセス アムリトサレンシス（Streptomyces amritsarensis）、ストレプトマイセス シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）、ストレプトマイセス バージニアエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス シラツス（Streptomyces cirratus）、ストレプトマイセス ノジリエンシス（Streptomyces nojiriensis）、ストレプトマイセス コロンビエンシス（Streptomyces colombiensis）、ストレプトマイセス ナシュビレンシス（Streptomyces nashvillensis）、ストレプトマイセス セロスタティカス（Streptomyces cellostaticus）、ストレプトマイセス ベトナメンシス（Streptomyces vietnamensis）を挙げることができる。なお、近縁の微生物か否かは、例えば近隣結合法等により系統樹を推定し、分子系統解析を行うことによって判断することができる。 The above-mentioned Phosphorlipase D- (2) is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces, and examples of the microorganism belonging to the genus Streptomyces include Streptomyces polychromogenes or Streptomyces racemochromogenes. ), Or related microorganisms, Streptomyces katrae, Streptomyces flavotricini, Streptomyces toxytricini, Streptomyces yangpuensis, Streptomyces amritsarensis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces virginiae, Streptomyces cirratus, Streptomyces cirratus, Streptomyces cirratus, Streptomyces cirratus Examples include Streptomyces colombiensis, Streptomyces nashvillensis, Streptomyces cellostaticus, and Streptomyces vietnamensis. Whether or not it is a closely related microorganism can be determined by estimating the phylogenetic tree by, for example, the neighbor-joining method and performing molecular phylogenetic analysis.
さらに、上記本件ホスホリパーゼＤ−（２）は、エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステルへの加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、及び／又はリゾホファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下であるホスホリパーゼＤを好適に挙げることができる。 Further, the above-mentioned phospholipase D- (2) uses ethanolamine-type lysoplasmalogen (LyPlsEtn) as a substrate when the hydrolysis activity to a phosphate ester when ethanolamine-type plasmalogen is used as a substrate is 100. The relative activity value is 5 or less, preferably 3 or less, and the relative activity value when phosphatidylethanolamine (PE) is used as a substrate is 5 or less, preferably 3 or less, and / or lysophofatidylethanolamine is used as a substrate. Phospholipase D having a relative activity value of 5 or less, preferably 3 or less can be preferably mentioned.
上記本件ホスホリパーゼＤ−（２）をストレプトマイセス属に属する微生物から調製する場合には、ストレプトマイセス属に属する微生物を培養し、培養上清を回収した後、公知の酵素精製方法、例えば、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことにより精製して調製することができる。 When the above phosphorlipase D- (2) is prepared from a microorganism belonging to the genus Streptomyces, a known enzyme purification method, for example, is used after culturing the microorganism belonging to the genus Streptomyces and collecting the culture supernatant. It can be purified and prepared by performing ammonium sulfate precipitation, further anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, cation exchange chromatography, gel filtration chromatography, and / or affinity chromatography as appropriate.
［エタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法］
本発明の試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法は、試料と上記ホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含む、試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法（以下、「本ＰｌｓＥｔｎの定量方法」ともいう）であればよく、本ホスホリパーゼＤの基質特異性からエタノールアミン型プラズマローゲンを精度よく定量することが可能となる。具体的には以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を行う方法を挙げることができる。
１）試料を、本件ホスホリパーゼＤを用いて加水分解処理する工程（Ａ）；
２）前記工程（Ａ）で得られた処理液を、エタノールアミンオキシダーゼで処理する工程（Ｂ）；
３）前記工程（Ｂ）で得られた処理液を、ペルオキシダーゼ及び発色剤若しくは蛍光試薬で処理をする工程（Ｃ）；
４）前記工程（Ｃ）で得られた処理液を、分光光度計又は蛍光光度計による測定に付する工程（Ｄ）；
[Method for quantifying ethanolamine-type plasmalogen]
The method for quantifying ethanolamine-type plasmalogen in a sample of the present invention includes a method for quantifying ethanolamine-type plasmalogen in a sample, which comprises a step of allowing the sample to act on the phospholipase D (hereinafter, "method for quantifying PlsEtn"). The ethanolamine-type plasmalogen can be accurately quantified from the substrate specificity of this phospholipase D. Specifically, a method of performing the following steps (A) to (D) can be mentioned.
1) Step (A) of hydrolyzing a sample with the present phospholipase D;
2) The step (B) of treating the treatment liquid obtained in the step (A) with ethanolamine oxidase;
3) The step (C) of treating the treatment liquid obtained in the step (B) with peroxidase and a color former or a fluorescent reagent.
4) The step (D) of subjecting the treatment liquid obtained in the step (C) to measurement with a spectrophotometer or a fluorometer;
上記試料としては、被験体から採取された血漿、血清、血液、唾液、髄液、尿、リンパ液、汗等の体液を挙げることができる。血清及び血漿は、被験体から通常の採血方法（例えば、シリンジ採血又は真空採血）で得られる血液を、遠心（例えば、１０００×ｇ，５分間）して、上清を回収する等の公知の方法により処理することによって得ることができる。採血をする際には、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤を用いることもできる。 Examples of the sample include body fluids such as plasma, serum, blood, saliva, cerebrospinal fluid, urine, lymph, and sweat collected from the subject. As for serum and plasma, known blood obtained from a subject by a usual blood sampling method (for example, syringe blood sampling or vacuum blood sampling) is centrifuged (for example, 1000 × g, 5 minutes) to collect a supernatant. It can be obtained by processing by the method. When collecting blood, anticoagulants such as EDTA, sodium fluoride, sodium citrate, sodium heparin, and monoiodoacetic acid and anti-glycation agents can also be used.
上記被験体としては、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物の他、鳥類、魚類、両生類、ホタテ等の海洋生物、なまこ等の軟体生物、乳酸菌やカビ・酵母に至る各種微生物を挙げることができる。 The subjects include mammals such as humans, dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, mice, rats, hamsters, and rabbits, as well as marine organisms such as birds, fish, amphibians, and scallops. Examples include mollusks such as cats, and various microorganisms such as lactic acid bacteria, molds, and yeasts.
上記発色剤としては、フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体と４−アミノアンチピリンとの組み合わせや、ロイコ色素や、ジフェニルアミン誘導体や、トリアリルイミダゾール誘導体等を挙げることができ、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−トルイジン（ＴＯＯＳ）やＮ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）等のトリンダー試薬との組み合わせを好適に挙げることができる。 Examples of the color former include a combination of phenol or a derivative thereof or an aniline derivative and 4-aminoantipyrine, a leuco dye, a diphenylamine derivative, a triallylimidazole derivative, and the like, and 4-aminoantipyrine (4-AA). ) And N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -toluidine (TOOS) and N, N-bis (4-sulfobutyl) -3-methylaniline (TODB) in combination with Trinder reagents. It can be preferably mentioned.
上記蛍光試薬としては、アンプレックスレッドを挙げることができる。 Examples of the fluorescent reagent include Amplex Red.
発色剤を用いる場合におけるエタノールアミン型プラズマローゲンの定量の原理は以下の通りである。まず、前記工程（Ａ）でエタノールアミンが産生する。工程（Ａ）で得られた処理液に対して、エタノールアミンオキシダーゼで処理すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が産生する。さらに、ペルオキシダーゼで処理すると、産生した過酸化水素と蛍光試薬がペルオキシダーゼによってキノン色素に変化し、分光光度計でエタノールアミンの定量が可能となる。こうして、エタノールアミン型プラズマローゲンの定量が可能となる。 The principle of quantification of ethanolamine-type plasmalogen when a color former is used is as follows. First, ethanolamine is produced in the step (A). When the treatment liquid obtained in the step (A) is treated with ethanolamine oxidase, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) is produced. Furthermore, when treated with peroxidase, the produced hydrogen peroxide and fluorescent reagent are converted into quinone dyes by peroxidase, and ethanolamine can be quantified with a spectrophotometer. In this way, ethanolamine-type plasmalogen can be quantified.
上記工程(Ａ)〜工程（Ｃ）は適切な緩衝液中で行うことができ、例えば工程（Ａ）は０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、３７℃）、工程（Ｂ）は０．２Ｍビストリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、４５℃）を挙げることができる。また、上記工程(Ａ)ではエタノールアミン型プラズマローゲンの溶解性を高めるため、上記工程（Ｃ）では発色液の濁りを抑制するために界面活性剤の存在下で行ってもよい。かかる界面活性剤としては、好ましくは非イオン系界面活性剤、より好ましくはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、さらに好ましくはトリトンＸ−１００を挙げることができる。また、界面活性剤の使用量については、例えば、０．００１〜１０質量％を挙げることができる。 The above steps (A) to (C) can be carried out in an appropriate buffer, for example, step (A) is 0.2 M Tris hydrochloric acid buffer (pH 7.0, 37 ° C.), and step (B) is 0. .2M Bistris hydrochloric acid buffer (pH 7.5, 45 ° C.) can be mentioned. Further, in the step (A), the solubility of the ethanolamine-type plasmalogen is enhanced, and in the step (C), the turbidity of the color-developing liquid may be suppressed in the presence of a surfactant. Examples of such a surfactant include preferably nonionic surfactants, more preferably polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, and even more preferably Triton X-100. Further, as for the amount of the surfactant used, for example, 0.001 to 10% by mass can be mentioned.
なお、工程（Ａ）で得られた処理液に対して、エタノールアミンオキシダーゼで処理することによって産生した過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を、上記の他、電極法、吸光法、発光法、ＫＭｎＯ４を利用した酸化還元法等の公知の方法を用いて定量しても良い。 In addition to the above, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) produced by treating the treatment liquid obtained in step (A) with ethanolamine oxidase can be added to the electrode method, absorption method, luminescence method, and the like. Quantification may be performed using a known method such as an oxidation-reduction method using KMnO 4.
エタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法は、試料として既知濃度のエタノールアミン型プラズマローゲンを用いて上記工程（Ａ）〜（Ｄ）により検量線を作成し、測定対象の試料を用いて上記工程（Ａ）〜（Ｄ）により得られた測定値を比較してエタノールアミンプラズマローゲン量を算出することが可能となる。 As a method for quantifying ethanolamine-type plasmalogen, a calibration curve is prepared by the above steps (A) to (D) using ethanolamine-type plasmalogen having a known concentration as a sample, and the above step (A) is used using the sample to be measured. )-(D), it is possible to calculate the amount of ethanolamine plasmalogen by comparing the measured values.
［発現ベクター］
本発明の発現ベクターは、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、本件発現ベクターともいう）であればよく、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、配列番号２に記載の塩基配列のうち、１〜７８番目の塩基（配列番号１における１〜２６番目のアミノ酸に対応）は分泌シグナルをコードする塩基配列であると考えられることから、本発明のベクターを用いて形質転換し、本件ホスホリパーゼＤを細胞外に分泌させる場合には、上記１〜７８番目等の分泌シグナルと予想される塩基の全部又は一部を削除して用いてもよく、また上記１〜７８番目等の分泌シグナルと予想される塩基の全部又は一部を他の分泌シグナルをコードする塩基配列に置き換えて用いてもよい。
[Expression vector]
The expression vector of the present invention may be an expression vector containing a polynucleotide encoding the present phosphorlipase D (hereinafter, also referred to as the present expression vector), and the polynucleotide encoding the present phosphorlipase D is, for example, SEQ ID NO: 1. As a polynucleotide encoding a polypeptide having the described amino acid sequence, a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be mentioned. Of the base sequences shown in SEQ ID NO: 2, the
発現ベクターの種類としては環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、使用する宿主細胞に応じて適宜選択でき、プラスミドべクター、ウイルスベクター、ファージを挙げることができ、市販の発現ベクターを用いることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＥＴ２４ａ、ｐＥＴ２２ｂ等のｐＥＴベクター、ｐＭＡＬ−ｐ５ｘ等のｐＭＡＬベクター、ｐＧＥＸベクター，ｐＣｏｌｄベクター、ｐＦＮ１８、ｐＰＡＬ７、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５等のｐＢＲベクター、ｐＡＣＹＣ１８４ベクター、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８等のｐＵＣベクター、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクター等を挙げることができ、放線菌を宿主とする場合にはｐＵＣ７０２ベクター、ｐＩＪ６８０ベクター、ｐＩＪ７０２ベクター、ｐＴＯＮａ５ベクター、ｐＴＯＮａｓｈｏｒｔベクター、ｐＴｉｐベクター、ｐＮｉｔベクター等を挙げることができる。さらに、グラム陽性菌を宿主とする場合にはｐＢＩＣベクター、ｐＷＨ １５２０ベクター、ｐＭＭ１５２２ベクター、ｐＨＩＳ１５２２ベクター等を挙げることができる。酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７ベクター、ｐＹＣ１ベクター、ＹＥｐ１３ベクター等を挙げることができる。 The type of expression vector may be any form such as cyclic or linear. Further, it can be appropriately selected according to the host cell to be used, and examples thereof include a plasmid vector, a viral vector, and a phage, and a commercially available expression vector can be used. Examples of the plasmid vector include pET vectors such as pET24a and pET22b, pMAL vectors such as pMAL-p5x, pGEX vectors, pCold vectors, pFN18, pPAL7, pBR322 and pBR325, etc. pUCYC184 vector, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118 and other pUC vectors, BluescriptKS + vector, etc. can be mentioned. Examples thereof include a pTip vector and a pNit vector. Furthermore, when a Gram-positive bacterium is used as a host, pBIC vector, pWH 1520 vector, pMM1522 vector, pHIS1522 vector and the like can be mentioned. When yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae, is used as a host, YRp7 vector, pYC1 vector, YEp13 vector and the like can be mentioned.
また、かかる発現ベクターには、プロモーターやターミネーター等の制御配列や、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカー配列を含有していてもよい。さらに、宿主細胞外に分泌しやすくするために分泌シグナル配列を含有してもよい。分泌シグナルとしては、ＯｍｐＡシグナル（ペリプラズム移行シグナルとして機能）、ｐｅｌＢシグナル（ペリプラズム移行シグナルとして機能）、アフィニティー及び可溶性タグとしてはＭＢＰタグ（ペリプラズム移行シグナルとしても機能）、ＧＳＴタグ、ＴＦタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｈｉｓタグ、ＳＫＩＫタグ（Kato et al., J. Biosci. Bioeng. 10.1016/j.jbiosc.2016.12.004 (2017)）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔ ｆｕｓｉｏｎタグ等を挙げることができる。 In addition, such an expression vector may contain a control sequence such as a promoter or a terminator, or a selectable marker sequence such as a drug resistance gene or a reporter gene. In addition, a secretory signal sequence may be included to facilitate secretion outside the host cell. Secreted signals include OpA signal (functions as periplasmic transition signal), pelB signal (functions as periplasmic transition signal), affinity and soluble tags include MBP tag (also functions as periplasmic transition signal), GST tag, TF tag, and Halo tag. , His tag, SKIK tag (Kato et al., J. Biosci. Bioeng. 10.1016 / j.jbiosc.2016.12.004 (2017)), Profinity eXact fusion tag and the like.
上記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス属に属する微生物等の天然由来のポリヌクレオチドでも人工合成のポリヌクレオチドでもよく、本件発現ベクターを導入する微生物の種類に応じて適宜選択でき、配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。上記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの塩基配列の情報に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするために選択されるコドンは、用いる宿主細胞の種類に応じて、発現を最適化してもよい。 The above-mentioned polynucleotide may be a naturally-derived polynucleotide such as a microorganism belonging to the genus Streptomyces or an artificially synthesized polynucleotide, and may be appropriately selected depending on the type of microorganism into which the expression vector is introduced, and the sequence information is known. It can be obtained as appropriate by searching the literature and databases such as NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). The above polynucleotide can be produced by a known technique such as a method of chemically synthesizing or a method of amplifying by PCR based on the information of the base sequence of the polynucleotide. The expression of the codon selected to encode the amino acid may be optimized according to the type of host cell used.
［形質転換体］
本発明の形質転換体は、上記本件発現ベクターを宿主に導入した形質転換体（以下、「本件形質転換体」ともいう）であればよく、宿主としては、用いる発現ベクターに応じて適宜選択でき、ＢＬ２１、ＳＨｕｆｆｌｅ等の大腸菌、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトマイセス属に属する放線菌、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｌ８８等の放線菌、バチラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバチルス（Brevibacillus:Bacillus brevis）、コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）等のグラム陽性菌，シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）等のグラム陰性菌、サッカロマイセス・セレビジアエ、ピキア・パストリス等の酵母、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）等のアスペルギルス(Aspergillus)属の糸状菌を挙げることができる。
[Transformant]
The transformant of the present invention may be any transformant into which the present expression vector has been introduced into a host (hereinafter, also referred to as “the present transformant”), and the host can be appropriately selected depending on the expression vector used. , BL21, Escherichia coli such as SHuffle, actinomycetes belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces lividans, actinomycetes such as Rhodococcus erythropolis L88, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis Gram-positive bacteria such as Bacillus megaterium, Brevibacillus (Bacillus brevis), Corynebacterium glutamicum, Gram-negative bacteria such as Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae, Piquias cerevisiae, Examples include yeast, filamentous fungi of the genus Aspergillus such as Aspergillus oryzae and Aspergillus nigar.
本件発現ベクターを宿主に導入する方法としては、公知の方法を用いることができ、コンピテントセル法、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法等の化学的方法；ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法等の生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法等の物理的方法；等の公知の方法を例示することができる。 As a method for introducing the expression vector into the host, a known method can be used, and chemical methods such as competent cell method, lipofection method, calcium phosphate co-precipitation method, and liposome method; a method using a viral vector, peculiarity Examples of known methods such as methods utilizing target receptors, biological methods such as cell fusion method; physical methods such as electroporation method, microinjection method, gene gun method, and ultrasonic gene transfer method; be able to.
［ホスホリパーゼＤの製造方法］
本発明のホスホリパーゼＤの製造方法は、上記本件形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法であればよく、かかる方法により、本件ホスホリパーゼＤを効率よく産生することができる。培養方法としては宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、宿主が大腸菌又は放線菌の場合は、温度条件が１０〜４５℃、好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは２５〜３７℃、ｐＨ条件がｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６．２〜７．５、培養時間が１０〜８０時間、好ましくは１０〜４８時間で、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下若しくは嫌気的条件下で培養することができる。本件ホスホリパーゼＤは培養液又は破砕した本件形質転換体から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティ等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
[Method for producing phospholipase D]
The method for producing phospholipase D of the present invention may be any method for producing phospholipase D, which comprises the step of culturing the above-mentioned transformant to produce phospholipase D, and the present phospholipase D can be efficiently produced by such a method. can do. The culturing method can be carried out according to the usual method used for culturing host cells. For example, when the host is Escherichia coli or actinomycetes, the temperature condition is 10 to 45 ° C., preferably 20 to 42 ° C., more preferably 25 to 37 ° C., and the pH condition is pH 5.5 to 8.5, preferably
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
（エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤを産生する微生物の探索）
本発明者らは、エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤ（ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ）を産生する微生物としてこれまでの経験に基づいて放線菌に着目して以下の工程により探索を行った。
１）グリセロールストック（−８０℃保存）した放線菌株を寒天培地に白金耳で塗抹し、２８℃で培養した。
２）生育したコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．７５％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．７５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：ｐＨ７．０）若しくはＩＳＰ２培地（１％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．４％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース：ｐＨ７．２）５ｍＬに植菌した。その後、２８℃、１６０ｓｐｍ（strokes per minute）で７２時間振とう培養を行った。培養液１ｍＬをＭＰＤ培地に１００ｍＬに接種し、２８℃、１６０ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。
(Search for microorganisms that produce phospholipase D, which has high substrate specificity for ethanolamine-type plasmalogen)
Based on our experience as a microorganism that produces phospholipase D (PlsEtn-PLD), which has high substrate specificity for ethanolamine-type plasmalogen, we focused on actinomycetes and searched for them by the following steps. went.
1) The actinomycete strain stored in glycerol stock (stored at -80 ° C) was smeared on an agar medium with a platinum loop and cultured at 28 ° C.
2) The grown colonies were taken with platinum ears and MPD medium (1% (w / v) glucose, 0.75% (w / v) malt extract, 0.75% (w / v) peptone, 0.3%. (w / v) NaCl, 0.1 % (w / v)
次に、以下の方法でホスホリパーゼＤの加水分解作用（ホスホリパーゼＤ活性）を測定した。
１）培養液を遠心分離(２１，６００×ｇ、１０分、４℃)し、得られた上清を酵素サンプルとした。
２）以下の酵素反応液を３７℃で３０分保温した。基質としてはＰｌｓＥｔｎ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ：ＡＶＴ社）及びホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）を用いた。
３）以下の呈色反応液を加え、４５℃で１０分保温した。
４）反応後、遠心分離(２１，６００×ｇ、５分、４℃)した。遠心上清２００μＬを９６穴マイクロウェルプレート(９６ＭＰ)に移し、マイクロプレートリーダー(Thermo Fisher社)を用いて、５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定した。
Next, the hydrolyzing action of phospholipase D (phospholipase D activity) was measured by the following method.
1) The culture solution was centrifuged (21,600 × g, 10 minutes, 4 ° C.), and the obtained supernatant was used as an enzyme sample.
2) The following enzyme reaction solution was kept warm at 37 ° C. for 30 minutes. As the substrate, PlsEtn (Avanti Polar Lipids: AVT) and Scallop-derived PlsEtn (Leology Functional Food Research Institute) were used.
3) The following color reaction solution was added, and the mixture was kept warm at 45 ° C. for 10 minutes.
4) After the reaction, the mixture was centrifuged (21,600 × g, 5 minutes, 4 ° C.). 200 μL of the centrifugation supernatant was transferred to a 96-well microwell plate (96MP), and the absorbance (A550) at 550 nm was measured using a microplate reader (Thermo Fisher).
（酵素反応液）
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０、３７℃） ２５μＬ
０．０１Ｍ ＣａＣｌ２ ５μＬ
１％基質／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １０μＬ
酵素サンプル １０μＬ
(Enzyme reaction solution)
0.2M Tris-HCl (pH 7.0, 37 ° C) 25 μL
0.01M CaCl 2 5μL
1% Substrate / 0.1% Triton X-100 10 μL
（呈色反応液）
０．２Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、４５℃） １００μＬ
５０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） ２０μＬ
０．２％（ｗ／ｖ）ＴＯＤＢ ２０μＬ
０．３％（ｗ／ｖ）４−ＡＡ ２０μＬ
２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １０μＬ
０．０６Ｕ／ｍＬ エタノールアミンオキシダーゼ ２０μＬ
超純水（ＵＰＷ） １０μＬ
(Color reaction solution)
0.2M BisTris-HCl (pH 7.5, 45 ° C) 100 μL
50 U / mL Peroxidase (POD) 20 μL
0.2% (w / v) TODB 20 μL
0.3% (w / v) 4-
2% Triton X-100 10 μL
0.06 U /
Ultrapure water (UPW) 10 μL
上記によりＰｌｓＥｔｎに対するホスホリパーゼＤ活性が確認された菌株のうち、活性が高い菌株を対象に基質特異性試験を行った。基質特異性試験では、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）、ＰｌｓＥｔｎ２２：６（ＡＶＴ社）、ＰｌｓＥｔｎ２０：４（ＡＶＴ社）、ＰｌｓＥｔｎ１８：１（ＡＶＴ社）、ＰＥ（1-Hexadecanoyl-2-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（ＡＶＴ社）、ＬＰＥ（L-α-Lysophosphatidylethanolamine）（ＳＲＬ社）、ＬｙＰｌｓＥｔｎ（1-O-1'-(Z)-Octadecenyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（ＡＶＴ社）の７種類の脂質へのホスホリパーゼＤ活性を測定した。ホスホリパーゼＤ活性の活性測定は上記と同様に行った。そのなかで、ＰｌｓＥｔｎに対して最も高いホスホリパーゼＤ活性を示す株としてＡＫ４６１株をＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ産生菌として選抜した。 Among the strains in which the phospholipase D activity against PlsEtn was confirmed as described above, a substrate specificity test was conducted on the strains having high activity. In the substrate specificity test, scallop-derived PlsEtn (Leologic Functional Food Research Institute), PlsEtn22: 6 (AVT), PlsEtn20: 4 (AVT), PlsEtn18: 1 (AVT), PE (1-Hexadecanoyl-2-) (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphoethanolamine) (AVT), LPE (L-α-Lysophosphatidylethanolamine) (SRL), LyPlsEtn (1-O-1'-(Z) -Octadecenyl-2-hydroxy) -Sn-glycero-3-phosphoethanolamine) (AVT) was measured for phospholipase D activity on 7 lipids. The activity of phospholipase D activity was measured in the same manner as described above. Among them, the AK461 strain was selected as a PlsEtn-PLD-producing bacterium as a strain showing the highest phospholipase D activity with respect to PlsEtn.
（ＡＫ４６１株の分類学上の同定）
実施例１で選抜したＡＫ４６１株の分類学上の同定をした。まず、ＡＫ４６１株をＩＳＰ２培地（日本製薬社）で３０℃、７２時間培養した。培養後、アクロモペプチダーゼ（和光純薬工業社）を用いてＤＮＡを抽出した。かかる抽出したＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、文献（中川恭好、川崎浩子 日本放線菌学会編 東京：日本学会事務センター ８８−１１７（２００１））に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡを約１５００ｂｐ増幅した。
(Taxonomic identification of AK461 strain)
The AK461 strain selected in Example 1 was taxonomically identified. First, the AK461 strain was cultured in ISP2 medium (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, DNA was extracted using achromopeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Using the extracted DNA as a template for the PCR method, PCR was performed using the primers described in the literature (Yasuyoshi Nakagawa, Hiroko Kawasaki, edited by The Society for Actinomycetes, Tokyo: Japan Society Office 88-117 (2001)), and 16SrDNA was used. Was amplified by about 1500 bp.
増幅した１６ＳｒＤＮＡの塩基配列をＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ ２．１（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ社）により決定した。増幅した前記１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴ相同検索を用い、国際塩基配列データベースＤＤＢＪ、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）、ＧｅｎＢａｎｋからから得た既知の微生物のｒＤＮＡ塩基配列と比較して、既知の微生物とのＤＮＡ相同性の一致の程度を比較した。近隣結合法として知られている文献（Saitou&Nei，1987；Mol．Biol．Evol．4406-425）に記載のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ プログラムを用いて、系統樹を作成した。その系統樹を図１に示す。左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株(Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ)をそれぞれ示す。 The nucleotide sequence of the amplified 16S rDNA was determined by ChromasPro 2.1 (Technellisim). The amplified base sequence of the 16S rDNA is compared with the rDNA base sequence of a known microorganism obtained from the international base sequence databases DDBJ, ENA (EMBL), and GenBank using a BLAST homology search, and DNA homology with a known microorganism. The degree of gender matching was compared. A phylogenetic tree was created using the Clustal W program described in the literature known as neighbor-joining (Saitou & Nei, 1987; Mol. Biol. Evol. 4406-425). The phylogenetic tree is shown in FIG. The upper left line is the scale bar, the number located at the branch of the lineage is the bootstrap value, and the T at the end of the strain name is the reference strain of that type.
ＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、ＡＫ４６１株の１６ＳｒＤＮＡ部分配列は、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）の基準株（ＮＢＲＣ１３０７２）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）の基準株（ＮＢＲＣ１２９０６）に対して相同率９９．８％の相同性を示した。 As a result of the BLAST homology search, the 16SrDNA partial sequence of the AK461 strain was found against the reference strain of Streptomyces polychromogenes (NBRC13072) or the reference strain of Streptomyces racemochromogenes (NBRC12906). The homology rate was 99.8%.
さらに、簡易形態観察を行ったところ、しわ状のコロニーを示し、色調は表面・裏面共に淡黄色を呈した。また、微視的観察の結果からは、気菌糸及び連鎖胞子の形成が見られた。 Furthermore, a simple morphological observation revealed wrinkled colonies, and the color tone was pale yellow on both the front and back surfaces. In addition, from the results of microscopic observation, the formation of hyphae and chain spores was observed.
図１の系統樹及び簡易形態観察結果から、ＡＫ４６１株はストレプトマイセス（Streptomyces）に属し、もっとも近縁の微生物はストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）であることが確認された。 From the phylogenetic tree and the simple morphological observation results shown in FIG. 1, the AK461 strain belongs to Streptomyces, and the most closely related microorganism is Streptomyces polychromogenes or Streptomyces racemochromogenes. It was confirmed that.
（ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの精製）
ＡＫ４６１株が生成するＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを、以下の方法で精製した。
（１）ＭＰＤプレート上のコロニー生育したＡＫ４６１株のコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ試験管培地５ｍＬに植菌した。２８℃、１６０ｓｐｍで２〜３日間振とう培養を行った（前培養）。前培養液１ｍＬを、ＭＰＤフラスコ培地 １００ｍＬに植菌した。２８℃、１６０ｒｐｍで３〜４日間振とう培養を行った(本培養)。なお、特に記載しない限り、以下のＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの精製の工程はすべて氷中又は４℃で行った。
（２）上記で得られたＡＫ４６１株の培養液を遠心分離機（１８，８００×ｇ、３０分）を用いて、この培養液から培養上清（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐ．）を回収した。
（３）回収した培養上清に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を終濃度２０ｍＭになるように加えた後、氷上で６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１８，８００×ｇ、３０分）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し粗酵素液(６０％ＡＳ)を得た。
（４）（３）で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍになるよう粉末硫酸アンモニウムを氷中で加え、スタ−ラーで撹拌しながら、完全に溶解させて以下の条件でカラムクロマトグラフィーを行った。
(Purification of PlsEtn-PLD)
The PlsEtn-PLD produced by the AK461 strain was purified by the following method.
(1) Colony on MPD plate The colony of the grown AK461 strain was taken with a platinum loop and inoculated into 5 mL of MPD test tube medium. Shaking culture was performed at 28 ° C. and 160 spm for 2 to 3 days (preculture). 1 mL of preculture was inoculated into 100 mL of MPD flask medium. Shaking culture was performed at 28 ° C. and 160 rpm for 3 to 4 days (main culture). Unless otherwise specified, the following steps for purifying PlsEttn-PLD were all carried out in ice or at 4 ° C.
(2) The culture broth of the AK461 strain obtained above was collected from the culture broth using a centrifuge (18,800 × g, 30 minutes).
(3) 1M Tris-HCl (pH 8.0) was added to the collected culture supernatant to a final concentration of 20 mM, and then powdered ammonium sulfate was added so as to be 60% (w / v) saturated on ice. The resulting precipitate was recovered by centrifugation (18,800 xg, 30 minutes). This precipitate was suspended in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) to obtain a crude enzyme solution (60% AS).
(4) To the crude enzyme solution obtained in (3), powdered ammonium sulfate was added in ice to a final concentration of 1 M, and the mixture was completely dissolved while stirring with a stirrer, and column chromatography was performed under the following conditions. rice field.
（５）（４）で得られた粗酵素液を、１Ｍ 硫酸アンモニウム／２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）−Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、２０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５）に緩衝液を変更し、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（Ｐｈｅｎｙｌ）を得た。 (5) Apply the crude enzyme solution obtained in (4) to a Toyopearl®-Phenyl-650M column (Tosoh) pre-equilibrium with 1M ammonium sulfate / 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0). bottom. After washing the column with the same buffer, the buffer was changed to 20 mM MES-NaOH (pH 5.5) and eluted with a linear gradient of ammonium sulfate (1M to 0M) to obtain an active fraction (Phenyl).
（６）（５）で得られた活性画分（Ｐｈｅｎｙｌ）を、２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に緩衝液を変更し、塩化ナトリウム（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（Ｍｘ−Ｔｒｐ）を得た。
（７）（６）で得られた活性画分（ＭＸ−Ｔｒｐ）を、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから２Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（ＤＥＡＥ）を得た。
(6) The active fraction (Phenyl) obtained in (5) was applied to a Toyopearl-MX-Trp-650M column (Tosoh Corporation) pre-equilibrium with 20 mM MES-NaOH (pH 5.5). After washing the column with the same buffer, the buffer was changed to 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), eluted with a linear gradient of sodium chloride (0M to 0.5M), and the active fraction (Mx-). Trp) was obtained.
(7) The active fraction (MX-Trp) obtained in (6) was applied to a Toyopearl DEAE-650M column (Tosoh) pre-equilibrium with 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 9.0). The column was washed with the same buffer and then eluted with a linear gradient of sodium chloride (0M to 2M) to give an active fraction (DEAE).
各精製工程における収量、収率、ホスホリパーゼＤ活性等を表１に示す。ホスホリパーゼＤ活性は実施例１と同様の方法で測定した。上記工程により、精製度（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ）及び比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が９２５倍向上した精製ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを得た。また、精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ（ＤＥＡＥ画分）をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した結果を図２に示す。左レーン（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ）は分子量マーカーであり、右レーンは、活性化区分（ＤＥＡＥ）のバンドを示す。その結果、約６６ｋＤａ、約５３ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約３２ｋＤａの４つのバンドが観察された。 Table 1 shows the yield, yield, phospholipase D activity, etc. in each purification step. Phospholipase D activity was measured in the same manner as in Example 1. By the above steps, a purified PlsEtn-PLD having a 925-fold improvement in purification fold and specific activity was obtained. The results of analysis of purified PlsEttn-PLD (DEAE fraction) by SDS-PAGE (12% (w / v) polyacrylamide gel) are shown in FIG. The left lane (M: Marker) is a molecular weight marker and the right lane shows a band of activation division (DEAE). As a result, four bands of about 66 kDa, about 53 kDa, about 45 kDa, and about 32 kDa were observed.
（精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの内部アミノ酸配列の解析）
図２に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける４つの矢印で示すバンドのゲルを切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。そして、得られたペプチドサンプルについて液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。その結果、５３ｋＤａのバンドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる内部アミノ酸配列解析で表２に示す７つのペプチド配列がデータベース中のタンパク質のアミノ酸配列の一部と相同性があった。一方、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、３２ｋＤａのバンドはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析で相同性があるタンパク質が見出されなかった。
(Analysis of internal amino acid sequence of purified PlsEtn-PLD)
The gel of the band indicated by the four arrows in SDS-PAGE shown in FIG. 2 was cut out, and in-gel digestion was performed using trypsin. Then, the internal amino acid sequence of the obtained peptide sample was analyzed by a liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS). As a result, in the internal amino acid sequence analysis by LC-MS / MS of the band of 53 kDa, the seven peptide sequences shown in Table 2 were homologous to a part of the amino acid sequences of the proteins in the database. On the other hand, in the 66 kDa, 45 kDa, and 32 kDa bands, no homologous protein was found by LC-MS / MS analysis.
５３ｋＤａのバンドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる内部アミノ酸配列解析でヒットした７つのペプチド配列をプロテオミクス支援システム "ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ サーバー（ＰＬＧＳ）"によって解析した。その結果、表３に示すようにＰＬＧＳ Ｓｃｏｒｅにおいてストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）のホスホリパーゼＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｎｏ． Ｅ０Ｄ７Ｉ２：配列番号３）が６８８と最も高いことが明らかとなった。したがって、５３ｋＤａのバンドのタンパク質がＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの可能性が高いと考えられた。 Seven peptide sequences hit by internal amino acid sequence analysis by LC-MS / MS in the band of 53 kDa were analyzed by the proteomics support system "ProteinLynx Global Server (PLGS)". As a result, as shown in Table 3, it was clarified that the phospholipase D (Uniprot entry No. E0D7I2: SEQ ID NO: 3) of Streptomyces racemochromogenes was the highest in PLGS Score at 688. Therefore, it was considered that the protein in the band of 53 kDa is likely to be PlsEtn-PLD.
（精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの性質）
精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの基質特異性、至適温度、至適ｐＨを調べた。
◆ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの基質特異性
上記で精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを用いて実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定し、基質特異性を調べた。基質としてはＰｌｓＥｔｎ２２：６、ＰｌｓＥｔｎ２０：４、ＰｌｓＥｔｎ１８：１、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、及びエタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を用いた。ＰｌｓＥｔｎ２２：６、ＰｌｓＥｔｎ２０：４、ＰｌｓＥｔｎ１８：１を式（III）〜式(V）に示す。
(Characteristics of purified PlsEtn-PLD)
The substrate specificity, optimum temperature, and optimum pH of the purified PlsEtn-PLD were examined.
◆ Substrate specificity of PlsEtn-PLD Phospholipase D activity was measured using the above-purified PlsEtn-PLD in the same manner as in Example 1, and the substrate specificity was examined. As substrates, PlsEtn22: 6, PlsEtn20: 4, PlsEtn18: 1, phosphatidylethanolamine (PE), lysophosphatidylethanolamine (LPE), and ethanolamine-type lysoplasmalogen (LyPlsEtn) were used. PlsEtn22: 6, PlsEtn20: 4, and PlsEtn18: 1 are shown in Equations (III) to (V).
（１）PlsEtn22:6
1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:206059-98-5
(1) PlsEtn 22: 6
1- (1Z-octadecenyl) -2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number: 206059-98-5
（２）PlsEtn20:4
1-(1Z-octadecenyl)-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:144371-69-7
(2) PlsEtn 20: 4
1- (1Z-octadecenyl) -2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number: 144371-69-7
（３）PlsEtn18:1
1-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:144371-68-6
(3) PlsEtn 18: 1
1- (1Z-octadecenyl) -2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number: 144371-68-6
ＰｌｓＥｔｎ ２２：６を基質とした場合のホスホリパーゼＤ活性を１００とした場合の相対活性を図３に示す。図３から明らかなように、ＰｌｓＥｔｎ ２０：４を基質とした場合の相対活性は約１５、ＰｌｓＥｔｎ １８：１を基質とした場合の相対活性は約８であった。一方、基質としてホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、及びエタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を用いて実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定したところ、ホスホリパーゼＤ活性を１００とした場合の相対活性はいずれもほぼ０であった。このように、精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤは、エタノールアミン型プラズマローゲンに対する基質特異性が極めて高いことが明らかとなった。 FIG. 3 shows the relative activity when the phospholipase D activity when PlsEtn 22: 6 is used as a substrate is 100. As is clear from FIG. 3, the relative activity when PlsEtn 20: 4 was used as a substrate was about 15, and the relative activity when PlsEtn 18: 1 was used as a substrate was about 8. On the other hand, when phospholipase D activity was measured in the same manner as in Example 1 using phosphatidylethanolamine (PE), lysophosphatidylethanolamine (LPE), and ethanolamine-type lysoplasmalogen (LyPlsEtn) as substrates, phospholipase D activity was measured. When the activity was set to 100, the relative activity was almost 0. As described above, it was revealed that the purified PlsEtn-PLD has extremely high substrate specificity for ethanolamine-type plasmalogen.
◆ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの至適温度
基質となる０．２％ ＰｌｓＥｔｎ ２２：６と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０、各温度）５０ｍＭとの溶液に精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを１０あるいは２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を３７℃にて３０分間反応させた。その後、加水分解作用を測定した。結果を図４に示す。図４中、横軸が温度、縦軸がΔＡ５５０（試料の５５０ｎｍの吸光度と盲検液の吸光度の差、以下同じ）である。図４から明らかなように、精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤは、３０℃〜７０℃で加水分解作用を有し、特に４０℃〜６０℃で加水分解作用が高いことが明らかとなった。
◆ Optimal temperature of PlsEtn-
◆ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの至適ｐＨ
基質となる０．２％ ＰｌｓＥｔｎ ２２：６と、酢酸−酢酸Ｎａ（グラフ中酢酸Ｎａ：ｐＨ４．５〜６）、ＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ（グラフ中Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：ｐＨ６〜７）、又は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（グラフ中Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：ｐＨ７〜９）から選ばれる緩衝液（ｐＨ４．５、５、６、６．５、７、７．５、８、又は９、温度３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを１０あるいは２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて３０分間、酵素反応させた。その後の呈色反応は実施例１と同様の方法で行い、酵素活性を測定した。結果を図５に示す。図５中、横軸がｐＨ、縦軸がΔＡ５５０である。図５に基づき、精製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤは、ｐＨ５〜８．５、特にｐＨ６〜７で処理しても加水分解作用を有していた。
◆ Optimal pH of PlsEtn-PLD
0.2% PlsEtn 22: 6, which is a substrate, acetic acid-Na acetate (Na acetate in the graph: pH 4.5 to 6), BisTris-HCl (Biz Tris HCl in the graph:
（ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤのクローニング）
ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤのクローニングを以下の方法により行った。
(Cloning PlsEtn-PLD)
Cloning of PlsEtn-PLD derived from AK461 strain was performed by the following method.
（ゲノムＤＮＡの調製）
ＡＫ４６１株を、実施例１と同様の方法でＭＰＤ培地を用いて２８℃で２日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、ＳＥＴ ｂｕｆｆｅｒ５ｍＬとリゾチーム１０ｍｇ(終濃度２ｍｇ／ｍＬ)を加えて転倒混和し、３７℃で２時間保温した。次に、これに１０％ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ）６７０μＬ（終濃度１％）、３ｍｇ／ｍＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ １ｍＬ（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ハイブリダイザ−でゆっくりと回しながら５５℃で２時間保温した。この溶液に５Ｍ Ｎａｃｌ ４ｍＬ及びクロロホルム１０ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後に上清を別チューブに回収し、上清体積の０．６倍量の２−プロパノールを加え、遠心分離(４，０００×ｇ、５分、４℃)した。沈殿したゲノムＤＮＡを回収し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。これに、ＲＮａｓｅ Ａを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０分処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μＬ加え攪拌し、遠心分離した。上清を除去し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）５００μＬに沈殿を溶解した後、フェノール／クロロホルム(１：１、ｖ／ｖ)混合液５００μＬを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を分取した。この水相に体積の０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２倍量のエタノールを添加混合し、ＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに浸漬した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液に溶解してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）溶液を調製した。
(Preparation of genomic DNA)
The AK461 strain was cultured at 28 ° C. for 2 days using MPD medium in the same manner as in Example 1 and collected. Next, 5 mL of SET buffer and 10 mg of lysozyme (final concentration 2 mg / mL) were added to the cells, mixed by inversion, and kept warm at 37 ° C. for 2 hours. Next, add 670 μL (
（ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの部分塩基配列のクローニング）
１．ＰＣＲ増幅
上記で調製したＡＫ４６１株ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。その後ＰＣＲ増幅産物のサブクローニングとシークエンスを行い、ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ遺伝子の部分塩基配列を解析した。
(Cloning of partial base sequence of PlsEtn-PLD derived from AK461 strain)
1. 1. PCR amplification PCR was performed using the AK461 strain genomic DNA prepared above as a template. After that, the PCR amplification product was subcloned and sequenced, and the partial base sequence of the PlsEttn-PLD gene was analyzed.
まず、実施例４で明らかになった内部アミノ酸配列に対応するコドンのうち、Streptomyces属においてコドン使用頻度が１０％以上であるコドンを選び、配列番号４に記載のフォワードプライマー(ＰｌｓＥｔｎ−ＦＷ１)及び配列番号５に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ−ＲＶ１）を設計した。 First, among the codons corresponding to the internal amino acid sequence clarified in Example 4, a codon having a codon usage frequency of 10% or more in the genus Streptomyces was selected, and the forward primer (PlsEtn-FW1) and the forward primer (PlsEtn-FW1) shown in SEQ ID NO: 4 and The reverse primer (PlsEtn-RV1) shown in SEQ ID NO: 5 was designed.
上記ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。 A PCR reaction was carried out using the above PCR primers. The composition of the PCR reaction solution is as follows.
２×Ｇｆｌｅｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １２．５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ−ＦＷ１ ０．７５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ−ＲＶ１ ０．７５μＬ
３３．２７ｎｇ／μＬ ＡＫ４６１ ｇＤＮＡ ２μＬ
１．２５Ｕ／μＬ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
超純水（ＵＰＷ） ８．５μＬ
2 × Gflex PCR buffer 12.5 μL
10 μM PlsEtn-FW1 0.75 μL
10 μM PlsEtn-RV1 0.75 μL
33.27 ng / μL AK461 gDNA 2 μL
1.25 U / μL Gflex DNA polymerase 0.5 μL
Ultrapure water (UPW) 8.5 μL
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６５℃、３０秒；
ステップ４；６８℃、２分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５；６８℃、２分；
The PCR reaction conditions are as follows.
Step 1: 94 ° C, 2 minutes;
Step 2; 98 ° C., 10 seconds;
Step 3; 65 ° C., 30 seconds;
Repeat steps 2 through 4 for 30 cycles;
Step 5; 68 ° C, 2 minutes;
２．ＰＣＲ増幅産物のサブクローニング及びシークエンス
上記で得られた１４００ｂｐのＰＣＲ増幅産物をＤＮＡシークエンスするため、以下の方法によりＭｉｇｈｔｙ ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＥＴ ｆｏｒ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）を用いて、ｐＭＤ２０−Ｔベクターにサブクローニングを行った。次に、大腸菌（ＨＳＴ０８）に形質転換して培養し、ブルー・ホワイトコロニーセレクションにより白色コロニーを選択し、コロニーＰＣＲにより目的サイズのバンドが確認できたコロニーを培養し、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドを配列番号６に記載のフォワードプライマー（Ｍ１３Ｒ−ｐＵＣ）及び配列番号７に記載のリバースプライマー（Ｍ１３Ｍ４）を用いてシークエンスを行った。
2. Subcloning and Sequence of PCR Amplification Product In order to DNA sequence the 1400bp PCR amplification product obtained above, subcloning into a pMD20-T vector using Mighty TA-cloning Reagent SET for PrimeSTAR® by the following method. went. Next, the cells were transformed into Escherichia coli (HST08) and cultured, white colonies were selected by blue-white colony selection, and colonies whose target size band was confirmed by colony PCR were cultured, and the High Pure plasmid Isolation kit (Roche) was used. -The plasmid was purified using (Diagnostics). The purified plasmid was sequenced using the forward primer (M13R-pUC) set forth in SEQ ID NO: 6 and the reverse primer (M13M4) set forth in SEQ ID NO: 7.
（ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの未知領域の解析）
ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの未知領域を解析するために、制限酵素消化したＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを鋳型にＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲを行い、クローニングとシークエンスを行った。
(Analysis of unknown region of PlsEttn-PLD)
In order to analyze the unknown region of PlsEttn-PLD, Invers PCR was performed using the genomic DNA of the AK461 strain digested with restriction enzymes as a template, and cloning and sequencing were performed.
まず、上記「２．ＰＣＲ増幅産物のサブクローニング及びシークエンス」で得られた部分塩基配列を参考に、Ｉｎｖｅｒｓ ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号８に記載のフォワードプライマー（ＰｌｓＥｔｎ−ＦＷ２）及び配列番号９に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ−ＲＶ２）を設計した。次に、ＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを６種類の制限酵素(ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ)で消化した。その後、アガロース電気泳動で消化を確認し、フェノール・クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を行い、制限酵素とＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを除去した。その後セルフライゲーション、フェノール・クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を行い、Ｉｎｖｅｒｓ ＰＣＲの鋳型ＤＮＡを作製した。 First, the forward primer (PlsEtn-FW2) shown in SEQ ID NO: 8 and the forward primer set forth in SEQ ID NO: 9 are described as primers for Invers PCR with reference to the partial base sequence obtained in the above "2. Subcloning and sequencing of PCR amplification product". Reverse primer (PlsEtn-RV2) was designed. Next, the genomic DNA of the AK461 strain was digested with 6 types of restriction enzymes (BamHI, EcoRI, KpnI, NdeI, PstI, SmaI). Then, digestion was confirmed by agarose gel electrophoresis, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were performed, and restriction enzymes and genomic DNA of the AK461 strain were removed. After that, self-ligation, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were performed to prepare a template DNA for Invers PCR.
上記で得られたＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ、及びＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲ用のプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。 Invers PCR was performed using the Invers PCR template DNA obtained above and the primers for Invers PCR. The composition of the PCR reaction solution is as follows.
２×Ｇｆｌｅｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １２．５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ−ＦＷ２ ０．７５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ−ＲＶ２ ０．７５μＬ
ライゲーション反応液 ２μＬ
１．２５Ｕ／μＬ Ｇｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
超純水（ＵＰＷ） ８．５μＬ
2 × Gflex PCR buffer 12.5 μL
10 μM PlsEtn-FW2 0.75 μL
10 μM PlsEtn-RV2 0.75 μL
Ligation reaction solution 2 μL
1.25U / μL Glex DNA polymerase 0.5μL
Ultrapure water (UPW) 8.5 μL
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６５℃、３０秒；
ステップ４；６８℃、２分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５；６８℃、２分；
The PCR reaction conditions are as follows.
Step 1: 94 ° C, 2 minutes;
Step 2; 98 ° C., 10 seconds;
Step 3; 65 ° C., 30 seconds;
Repeat steps 2 through 4 for 30 cycles;
Step 5; 68 ° C, 2 minutes;
その後、上記「ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの部分塩基配列のクローニング」と同様の方法でＰＣＲ増幅産物をクローニングし、シークエンスを行った。 Then, the PCR amplification product was cloned and sequenced in the same manner as in the above-mentioned "Cloning of partial base sequence of PlsEtn-PLD derived from AK461 strain".
上記シークエンス解析により、ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤのアミノ酸配列は、配列番号１に記載された５２８アミノ酸からなる配列であり、Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラムによる予測によりＮ末端側２６アミノ酸はＳｅｃ分泌シグナルであると考えられる。また、ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号２に記載された塩基配列であることが確認された。なお、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣプログラムによる推定分子量は５２，９６３Ｄａ、推定の等電点は６．１６であった。この等電点は推定値であり、実測値とは異なる可能性がある。さらに、ＨＫＤモチーフを２カ所（配列番号１における１９２番目〜１９９番目、４６２番目〜４６９番目）有していた。 According to the above sequence analysis, the amino acid sequence of PlsEtn-PLD is a sequence consisting of 528 amino acids shown in SEQ ID NO: 1, and it is considered that the 26 amino acids on the N-terminal side are Sec secretion signals as predicted by the Signal P program. Further, it was confirmed that the base sequence encoding the amino acid sequence of PlsEtn-PLD is the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The estimated molecular weight by the GENETYX-MAC program was 52,963 Da, and the estimated isoelectric point was 6.16. This isoelectric point is an estimated value and may differ from the measured value. Furthermore, it had two HKD motifs (192nd to 199th and 462th to 469th in SEQ ID NO: 1).
（大腸菌によるＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤの発現及び調製）
配列番号１０に記載のフォワードプライマー（ＰｌｓＥｔｎ−ＦＷ３）及び配列番号１１に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ−ＲＶ３）を用いてＰＣＲを行い、配列番号２に記載の塩基配列からなるＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ遺伝子のＳｅｃシグナル配列と考えられる配列を除いた配列（配列番号１２に示す塩基配列）において、５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加するように増幅した。ＰＣＲ副産物をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２４ａ（＋）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII部位に挿入して、組換えプラスミドを得た。次に、得られた組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ社）で、３０℃又は３７℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁した後、超音波破砕し、遠心上清を生酵素とした（約０．０４Ｕ／ｍＬ）。
(Expression and preparation of PlsEtn-PLD by E. coli)
PCR was performed using the forward primer (PlsEtn-FW3) set forth in SEQ ID NO: 10 and the reverse primer (PlsEtn-RV3) set forth in SEQ ID NO: 11, and the Sec of the PlsEttn-PLD gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 was performed. In the sequence excluding the sequence considered to be the signal sequence (the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12), the NdeI site was amplified at the 5'end and the HindIII site was added at the 3'end. The PCR by-product was digested with NdeI and HindIII and inserted into the NdeI-HindIII site of the expression vector pET24a (+) to obtain a recombinant plasmid. Next, the obtained recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) to obtain recombinant Escherichia coli. The obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 100 mL of Overnight Express TB medium (Novagen) containing 30 μg / mL kanamycin at 30 ° C. or 37 ° C. for 24 hours. The obtained culture solution was centrifuged to collect the cells. The cells were suspended in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0), crushed by ultrasonic waves, and the centrifugal supernatant was used as a live enzyme (about 0.04 U / mL).
次に、基質としてＰｌｓＥｔｎ、ＬｙＰｌｓＥｔｎ、ＰＯＰＥ、及びＬＰＥを用い、上記生酵素又は熱失活Ｃｔｒｌを１０μＬ加えてホスホリパーゼＤ活性を測定した。同時に、酵素なしのコントロール（酵素なし（Ｃｔｒｌ））も行った。ホスホリパーゼＤ活性の測定は実施例１と同様の方法で行った。表４に示すように、ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤはＰｌｓＥｔｎに対して高い特異性を有することが確認された。
ＰＯＰＥ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（Avanti Polar Lipids社）
ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン（L-α-Lysophosphatidylethanolamine、Egg）（DOOSAN Serdary Research Laboratories 社）
Next, using PlsEtn, LyPlsEtn, POPE, and LPE as substrates, 10 μL of the above-mentioned bioenzyme or heat-inactivated Ctrl was added to measure phospholipase D activity. At the same time, enzyme-free control (without enzyme (Ctrl)) was also performed. The phospholipase D activity was measured in the same manner as in Example 1. As shown in Table 4, it was confirmed that PlsEtn-PLD has high specificity for PlsEtn.
POPE: 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Avanti Polar Lipids)
LPE: L-α-Lysophosphatidylethanolamine (Egg) (DOOSAN Serdary Research Laboratories)
（ホタテ分取エタノールアミン型プラズマローゲンの検量線の作成）
実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを用いて、ホタテから分取したエタノールアミン型プラズマローゲン（ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ）の検出を行った。なお、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの定量は、実施例１に記載のようにＰｌｓＥｔｎが加水分解されて得られるエタノールアミンを定量することで行った。
(Preparation of calibration curve for scallop preparative ethanolamine type plasmalogen)
Using the PlsEtn-PLD prepared in Example 7, ethanolamine-type plasmalogen (scallop-derived PlsEton) collected from scallops was detected. The scallop-derived PlsEtn was quantified by quantifying ethanolamine obtained by hydrolyzing PlsEtn as described in Example 1.
１．ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの調製
ホタテ類の食用部位から分取したホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ １ｍｇ（レオロジー機能食品研究所社）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬに加えて超音波でエマルションにして調製した。
２．ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ溶液の調製
実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ １５ｍＬを凍結乾燥後、１．５ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒに溶解した(１０倍に濃縮)。
３．ホスホリパーゼＤ活性の測定
以下の方法で蛍光強度を測定することでホスホリパーゼＤ活性を測定した。
１）ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤ（０．０４２Ｕ／ｍＬ）を１０倍に濃縮したものを０．４２Ｕ／ｍＬ酵素サンプルとした。
２）ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）及び大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（シグマアルドリッチ社）、血漿を９６穴ウェルプレートに分注した。
３）以下の蛍光法酵素反応液と酵素サンプルを加え、１分間振とうした。
［蛍光法酵素反応液］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．７５ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
２．５Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
１Ｕ／ｍＬ チラミンオキシダーゼ
５０μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ
上記総量 １００μＬ
０．４２Ｕ／ｍＬ 酵素サンプル １０μＬ
４）３７℃で１０分間保温した。
５）反応後、プレートリーダー (BECKMAN COULTER社)を用いて、蛍光光度（ＥＸ５３５ｎｍ、ＥＭ５９５ｎｍ）を測定した。
1. 1. Preparation of Scallop-Derived
2. Preparation of PlsEtn-
3. 3. Measurement of phospholipase D activity Phospholipase D activity was measured by measuring the fluorescence intensity by the following method.
1) A 10-fold concentrated PlsEttn-PLD (0.042 U / mL) was used as a 0.42 U / mL enzyme sample.
2) Scallop-derived PlsEtn (Leology Functional Food Research Institute), soybean-derived phosphatidylethanolamine (Sigma-Aldrich), and plasma were dispensed into a 96-well well plate.
3) The following fluorescent enzyme reaction solution and enzyme sample were added and shaken for 1 minute.
[Fluorescent enzyme reaction solution]
50 mM Tris-HCl (pH 7.4)
50 mM NaCl
0.75 mM CaCl 2
0.2% Triton X-100
2.5 U / mL Peroxidase (POD)
1 U /
0.42 U /
4) The temperature was kept at 37 ° C. for 10 minutes.
5) After the reaction, the fluorescence intensity (EX535 nm, EM595 nm) was measured using a plate reader (BECKMAN COULTER).
なお、基質としては、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ １０、１５、２０、２５、又は５０μｇを用いた。結果を図６に示す。
As the substrate, scallop-derived
図６に示すように、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを用いればホタテ由来ｐｌｓＥｔｎの検出ができること、及びホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの濃度依存的に蛍光強度が増加していることが確認された。 As shown in FIG. 6, it was confirmed that the scallop-derived plsEtn could be detected by using the PlsEtn-PLD prepared in Example 7, and that the fluorescence intensity increased depending on the concentration of the scallop-derived PlsEtn.
［比較例］
大豆にはプラズマローゲンが含まれていないことが知られている。そこで、比較例として大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を用いて測定を行った。
[Comparison example]
It is known that soybeans do not contain plasmalogen. Therefore, as a comparative example, measurement was carried out using phosphatidylethanolamine (PE) derived from soybean.
１．大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の調製
大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）１ｍｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）１ｍＬに加えて超音波でエマルションにして調製した。
２．蛍光光度計による分析
ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの代わりに大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を１０、１５、２０、２５又は５０μｇ用いた以外は上記実施例８と同様の方法で反応させた。結果を図７に示す。
1. 1. Preparation of phosphatidylethanolamine (PE) derived from
2. Analysis by Fluorometer The reaction was carried out in the same manner as in Example 8 above, except that 10, 15, 20, 25 or 50 μg of soybean-derived phosphatidylethanolamine (PE) was used instead of scallop-derived PlsEtn. The results are shown in FIG.
図７に示すように、大豆由来のＰＥ量が増加しても蛍光強度はほとんど増加しておらず、蛍光強度はほぼ一定であった。したがって、ＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）には活性を示さないことが明らかとなった。 As shown in FIG. 7, even if the amount of PE derived from soybean increased, the fluorescence intensity hardly increased, and the fluorescence intensity was almost constant. Therefore, it was revealed that PlsEtn-PLD shows no activity on phosphatidylethanolamine (PE).
以上のとおり、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを用いれば、ＰｌｓＥｔｎを特異的に定量できることが確認された。 As described above, it was confirmed that PlsEtn can be specifically quantified by using the PlsEtn-PLD prepared in Example 7.
（血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量）
１．血漿の調製
血清及び血漿は細胞膜ではないため、赤血球や白血球と比べて、これらに含まれるプラズマローゲンは極めて少ない。したがって、血清や血漿中のプラズマローゲン量を測定することはこれまでの技術では困難であった。一方、近年、プラズマローゲンはアルツハイマー型認知症のバイオマーカーとなると考えられており、血清又は血漿中のプラズマローゲンを定量することはアルツハイマー型認知症等の疾患の発症リスクの判定に重要である。そこで、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを用いて血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量が可能かどうかを調べた。
(Quantification of ethanolamine-type plasmalogen in plasma)
1. 1. Preparation of plasma Since serum and plasma are not cell membranes, they contain extremely little plasmalogen compared to red blood cells and white blood cells. Therefore, it has been difficult to measure the amount of plasmalogen in serum or plasma by conventional techniques. On the other hand, in recent years, plasmalogen is considered to be a biomarker for Alzheimer-type dementia, and quantification of plasmalogen in serum or plasma is important for determining the risk of developing diseases such as Alzheimer-type dementia. Therefore, it was investigated whether or not the ethanolamine-type plasmalogen in plasma could be quantified using the PlsEtn-PLD prepared in Example 7.
血漿の準備は、特開２０１６−１１１９２９号公報に記載の方法に準じて行った。簡潔に説明すると、ヘパリン入り採血管（テルモ社）を用いて静脈血を採取し、１０００×ｇ，５分間遠心して、上清（すなわち血漿）を回収した。
２．血漿サンプルの調製
上記で回収した血漿を冷凍保存し、測定前に解凍し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒで調整した。
３．蛍光光度計による分析
ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの代わりに上記血漿サンプルを２０、３０、４０又は５０μＬ用いた以外は実施例８と同様の方法で反応させた。結果を図８に示す。
Plasma was prepared according to the method described in JP-A-2016-111929. Briefly, venous blood was collected using a heparin-containing blood collection tube (Terumo Corporation), centrifuged at 1000 × g for 5 minutes, and the supernatant (that is, plasma) was collected.
2. Preparation of plasma sample The plasma collected above was stored frozen, thawed before measurement, and prepared with 50 mM Tris-HCl Buffer.
3. 3. Analysis by Fluorometer The reaction was carried out in the same manner as in Example 8 except that 20, 30, 40 or 50 μL of the above plasma sample was used instead of the scallop-derived PlsEtn. The results are shown in FIG.
図８に示すように血漿サンプルの量に比例して蛍光強度が増加していることが確認された。実施例８の結果と合わせると、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ−ＰＬＤを用いれば血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンを定量できることが確認された。 As shown in FIG. 8, it was confirmed that the fluorescence intensity increased in proportion to the amount of the plasma sample. Combined with the results of Example 8, it was confirmed that ethanolamine-type plasmalogen in plasma can be quantified by using PlsEtn-PLD prepared in Example 7.
本発明のホスホリパーゼＤを用いれば、血漿等に含まれるエタノールアミン型プラズマローゲンを安価で検出又は定量可能とするものであり、産業上の有用性は高い。 By using the phospholipase D of the present invention, ethanolamine-type plasmalogen contained in plasma or the like can be detected or quantified at low cost, and is highly industrially useful.
Claims (8)
（１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド； Phospholipase D comprising the polypeptide according to any one of (1-1) to (1-3) below.
(1-1) A polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(1-2) A polypeptide having at least 85% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having a hydrolyzing action on a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule;
(1-3) A polypeptide in which one or several amino acids are added, substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and is a phosphate in an ethanolamine-type plasmalogen molecule. Polypeptide having a hydrolyzing effect on ester bonds;
（２−１）エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有する；
（２−２）分子量 ５０，０００〜６０，０００である；
（２−３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０〜６０℃である；
（２−４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５〜７．５である；
（２−５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である； Phospholipase D having a hydrolyzing action on a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule and having the following properties (2-1) to (2-5).
(2-1) Has an action of hydrolyzing a phosphate ester bond in an ethanolamine-type plasmalogen molecule;
(2-2) The molecular weight is 50,000 to 60,000;
(2-3) Optimal temperature pH 7.0, 40-60 ° C. under the conditions of reaction for 30 minutes;
(2-4) Optimal pH 37 ° C., pH 5.5-7.5 under the conditions of reaction for 30 minutes;
(2-5) Derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces;
A method for producing phospholipase D, which comprises a step of culturing the transformant according to claim 7 to produce phospholipase D.
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-
2020
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| CN113637654B (en) * | 2021-09-28 | 2023-08-08 | 江南大学 | Recombinant phospholipase D mutant and application thereof in synthesis of phosphatidylserine |
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