JP3824690B2

JP3824690B2 - Method for stabilizing aqueous alkaline phosphatase solution

Info

Publication number: JP3824690B2
Application number: JP26272095A
Authority: JP
Inventors: 静之許; 正之野沢
Original assignee: 第一化学薬品株式会社
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2015-10-11
Also published as: JPH08168377A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等に基づく臨床検査及び研究試薬に用いられるアルカリホスファターゼ又はその誘導体の水溶液の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、酵素免疫法、化学発光酵素免疫法等が臨床検査に多用されている。このような酵素免疫法において用いられる酵素のうち特に重要なものとして、アルカリホスファターゼ又はその誘導体（以下、「ＡＬＰ等」という）があり、これを安定に保存することは、試薬、製品の性能を保障する上で非常に重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来、これらのＡＬＰ等は、ＨＥＰＥＳ〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〕（pH７．５〜８．２）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）（pH７．６〜８．０）、Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕（pH８．０〜８．５）等の緩衝液中に保存され、またこれらの緩衝液中で反応されているが、これらの系中における高温（２５℃以上）及び長期保存下でのＡＬＰ等の安定性は充分ではなかった。
【０００４】
このため、操作性、再現性等の観点から、ＡＬＰ等は溶液状態での保存、３７℃程度での反応が望まれているにも拘らず、その使用条件は厳しく制限され、低温において操作したり、凍結乾燥状態で保存する必要があり、操作の煩雑、コストの上昇等の問題点が生じている。
【０００５】
これらの問題点を解決すべく、長年にわたって、ＡＬＰ等の安定化技術に工夫が試みられてきた。代表的な方法としては、酵素の化学的な修飾法や、二価金属イオン、例えば、Ｍｇ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｄ²⁺あるいは水溶性スルフィド類の添加が挙げられる。しかしながら、これらの方法による安定化は充分でなく、酵素溶液の安定性の問題を完全にクリアするものではなかった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、比較的高温（２５℃以上）であってもＡＬＰ等を失活させず、長期にわたりＡＬＰ等の水溶液を安定に保存できる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み本発明者らはＡＬＰ等の水溶液の安定化方法について鋭意研究を行った結果、ＡＬＰ等の水溶液に、リン酸アルカリ金属塩及びイノシトールリン酸エステル塩から選ばれる安定化剤を添加すれば、高温下でもＡＬＰ等が長期間安定に保存できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、アルカリホスファターゼ又はその誘導体を含有する水溶液に、リン酸アルカリ金属塩及びイノシトールリン酸エステル塩から選ばれる安定化剤を添加することを特徴とする該水溶液の安定化方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、安定化剤としては、リン酸アルカリ金属塩及びイノシトールリン酸エステル塩が挙げられる。このうち、リン酸アルカリ金属塩としては、リン酸カリウム、例えばＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄等が挙げられる。またイノシトールリン酸エステル塩としては、フィチン酸ナトリウム（イノシトールヘキサリン酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００１１】
これらの化合物は、これら自身を緩衝物質として使用しても、またこれらを他の緩衝溶液に添加して使用してもよく、いずれの場合も同等な安定化効果が得られる。
【００１２】
これらの安定化剤の使用量は、用いる安定化剤の種類、安定効果、溶解性等により異なるが、一般にＡＬＰ等を含む水溶液中で１mM以上、特に２．５〜５００mMの濃度となる量であるのが、充分な安定化効果を得る上で好ましい。例えば、リン酸又はその塩の場合、水溶液の濃度が１０〜２５０mMとなる範囲で使用するのが好ましく、フィチン酸ナトリウムのような化合物は１分子内に６個のリン酸基を有するため、他の化合物に比べて低い添加濃度、例えば１mM程度という非常に低い濃度としても、安定化効果が得られる。
【００１３】
本発明の安定化剤を含む水溶液のpHは５．５〜８．５の範囲とすることが好ましく、特に５．５〜７．５の範囲とすることが好ましい。なお、本発明のような安定化剤を用いずにpHを５．５〜８．５の範囲としても本発明の如き安定化効果を得ることはできない。
【００１４】
本発明の安定化方法は、ＡＬＰ又はその誘導体を含有する水溶液に適用できるが、ここでＡＬＰ誘導体としては、特に限定されないが、ＡＬＰと蛋白（抗原、抗体、アビジン等）、ペプチド、ハプテン、補酵素（ビオジン等）、糖類（レクチン等）、核酸（ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ等）などとの結合物が例示される。ここで用いる蛋白、ペプチド等は特に限定されず、被検物の種類等により、種類、濃度等を適宜選択、決定すればよい。また、ＡＬＰ等の水溶液中の濃度は特に限定されないが、０．０５〜５０００μg／ml、特に０．５〜１０００μg／mlが好ましい。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の安定化方法によれば、利用に便利な溶液の状態でＡＬＰ等を長期間安定に保存することができ、そのまま反応に使用することもできる。また、高温においてもＡＬＰ等の安定化が図れるため、免疫反応の速度を速めることができ、測定時間の短縮、測定感度の向上が図れる。更に、酵素免疫測定法等に用いる臨床検査試薬中のＡＬＰ等が活性の低下を起こさないため、良好な測定再現性が得られる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
ＡＬＰの種々の安定化剤による安定化効果：
１．ＡＬＰ溶液の調製
（１）緩衝液の調製；
表１に示した安定化剤を含む緩衝液２種類（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＨＥＰＥＳ／フィチン酸ナトリウム）と従来の緩衝液２種類（ＨＥＰＥＳ、ＴＥＡ）、（すべての濃度は１００mM）の各々１００mlに、塩化ナトリウム（１５０mM）、ＢＳＡ（１％）、塩化マグネシウム（２mM）、塩化亜鉛（０．２mM）、アジ化ナトリウム（０．１％）を加えた。次いで６Ｎ塩酸でpHを次の如く調整した。ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄＝７．０、ＨＥＰＥＳ／フィチン酸ナトリウム＝７．０、ＨＥＰＥＳ＝７．０、ＴＥＡ＝７．６
【００１８】
（２）ＡＬＰ溶液の調製；
既知濃度のＡＬＰ溶液を、（１）で得たそれぞれの緩衝液で希釈し、１０μg／mlとした。
【００１９】
２．アッセイ方法
上記の４種類のＡＬＰ溶液（１０μg／ml濃度）から一定量を取り、温度負荷試験（５０℃／１０分，Ｓｔｒｅｓｓ +）を実施した。同時に、残り液を対照組として４℃（Ｓｔｒｅｓｓ -）に１０分間保存する。負荷試験が終了後、緩衝液をファルマシア社製のＰＤ−１０カラムにてＴＥＡ緩衝液に交換する。対照組も同様に緩衝液交換を行う。緩衝液交換後のサンプルから５００μl を取り、ｐ−ニトロ−フェニル−ホスフェート５０μl を加えて、２分間反応した後、停止液を加え、負荷試験前後の酵素の活性を４０５nmでの吸光度にて測定した。
測定結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】

【００２１】
本発明の方法によれば、温度負荷試験後でもＡＬＰの活性が９６％以上残されていることが判る。これに対して、従来の方法では活性が８２％以下に低下した。
【００２２】
実施例２
α−胎児蛋白（ＡＦＰ）抗体のＡＬＰ標識抗体（ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物）の種々の安定化剤による安定化効果：
Ａ．ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の調製
１．Ｎ−アセチル−ＤＬ−ホモシステインチオラクトン（ＡＨＴＬ）によるＡｎｔｉ−ＡＦＰ抗体のチオール化
（１）４℃で攪拌下、α−ＡＦＰの精製抗体５mg／０．５ml−０．１ＭＮａＨＣＯ₃／０．１５ＭＮａＣｌ／０．２Ｍイミダゾール緩衝液（pH９．０）にＡＨＴＬ０．６mg／０．０１mlを添加して、１時間反応させた。
（２）反応が終了したら抗体サンプルをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムにのせ、ＰＢＳ／１．０mM ＥＤＴＡで脱塩する。ボイドカラムに出てくるチオール化抗体をプールして、蛋白量を測定した。過剰のＡＨＴＬは２番目のピークに溶出された。
【００２３】
２．Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣによるＡＬＰへのマレイミド（ＭＩ）の導入
（１）攪拌下、１４．４mg（１０２．５nmol）ＡＬＰ（０．１ＭＴｒｉｓ／０．１５ＭＮａＣｌ）に対して、１．５mg（約３０nmol）過剰のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液（１０mg／ml）を滴下し、室温にて１時間反応させた。
（２）反応終了後、サンプルをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムにのせ、ＰＢＳ／１．０mM ＥＤＴＡ緩衝液で脱塩した。ボイドカラムに出てくるマレイミド化されたＡＬＰ（ＡＬＰ−ＭＩ）をプールして、蛋白量を測定した。過剰のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは２番目のピークに溶出された。
【００２４】
３．抗体と酵素反応
チオール化抗体液（３６４μg／ml）を攪拌下、ＡＬＰ−ＭＩ液（３０６μg／ml）を滴下した。室温で攪拌しながら２時間反応させる。
【００２５】
４．β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）による活性基の遮断
抗体と酵素結合物溶液１００（体積）にβ−ＭＥ１（体積）（最終濃度１mM）を加え、室温で３０分インキュベーションした。
【００２６】
５．ゲル濾過による結合物中の遊離の抗体及び酵素の分離
上記の複合体溶液をゲルＳＷ−３０００（東ソー社製）カラムにのせ、０．１ＭＴｒｉｓ／０．１５ＭＮａＣｌ（pH７．０）を溶出緩衝液として、結合物と遊離の抗体とＡＬＰが溶出されるまでフラクションした。
【００２７】
Ｂ．ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物溶液の調製
１．緩衝液の調製
実施例１の１（１）と同様に、表１に示した緩衝液４種類を調製する。
【００２８】
２．Ａで調製された高濃度のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物から１μg／mlまでに上記の緩衝液４種類で希釈する。
【００２９】
Ｃ．アッセイ方法
上記のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物溶液４種類の一部について温度負荷試験（５０℃，１０分）を実施する。残りをコントロールとして４℃に１０分間保存する。１０分後、すべてサンプルから５０μl を取り、抗ＡＦＰ抗体結合固相５０μl 及びＡＦＰ抗原サンプル１０μl 、希釈液５０μl を加えて、５分間反応後、洗浄３回を行い、ＡＬＰ基質であるアマダチルメトキシフェニルホスソリルジオキスタン（ＡＭＰＰＤ）を加え、負荷試験した前後のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の活性を測定した。
測定結果を表１にまとめた。
【００３０】
本発明の方法によれば、温度負荷試験後でもＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の活性が９４％以上残されていた。それに対して、従来の方法では７５％以下に低下した。
【００３１】
実施例３
安定化剤を含む緩衝液のpHを変化させたときのＡＬＰの安定性試験：
１．緩衝液の調製；
安定化緩衝液（Ｋ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄，ＨＥＰＥＳ／フィチン酸ナトリウム）と従来用いられる緩衝液（ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＴＥＡ）計緩衝液５種類（すべて濃度は１００mM）１００mlに、塩化ナトリウム（１５０mM）、ＢＳＡ（１％）、塩化マグネシウム（２mM）、塩化亜鉛（０．２mM）、アジ化ナトリウム（０．１％）を加える。６Ｎの塩酸でpHを５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５（Ｋ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄）、７．０、７．５、８．０（ＨＥＰＥＳ／フィチン酸ナトリウム）、５．５、６．０、６．５（ＭＥＳ）、７．０、７．５、８．０、８．５（ＨＥＰＥＳ）、７．６（ＴＥＡ）に調整した。
【００３２】
２．アッセイ方法；
実施例１の１（２）と同様にして、上記の緩衝液で酵素溶液１０μg／mlを調製し、実施例１の２と同様な温度負荷試験を行い、酵素活性を測定した。
その結果を表２及び表３にまとめた。
【００３３】
【表２】

【００３４】
【表３】

【００３５】
実施例４
安定化剤を含む緩衝液のpHを変化させたときのＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の安定性試験：
１．ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の調製；
実施例２のＡと同様にして調製した。
【００３６】
２．緩衝液の調製；
安定化緩衝液（Ｋ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄，ＨＥＰＥＳ／フィチン酸ナトリウム）と従来用いられる緩衝液（ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＴＥＡ）計緩衝液５種類（すべて濃度は１００mM）１００mlに、塩化ナトリウム（１５０mM）、ＢＳＡ（１％）、塩化マグネシウム（２mM）、塩化亜鉛（０．２mM）、アジ化ナトリウム（０．１％）を加える。６Ｎの塩酸でそれぞれのpHを５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５（Ｋ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄）、７．０、７．５、８．０（ＨＥＰＥＳ／フィチン酸ナトリウム）、５．５、６．０、６．５（ＭＥＳ）、７．０、７．５、８．０、８．５（ＨＥＰＥＳ）、７．６（ＴＥＡ）に調製した。
【００３７】
３．アッセイ方法；
上記の緩衝液を用いて、１で調製された高濃度のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物から１μg／mlの溶液を調製して、実施例２のＣと同様にして、温度負荷試験を行い、該結合物の活性を測定した。
その結果を表４及び表５にまとめた。
【００３８】
【表４】

【００３９】
【表５】

【００４０】
安定化剤を含む緩衝液２種類についてpH５．５〜８．５いずれのpHにおいても酵素、又は酵素標識抗体の安定性向上効果が得られた。より好ましくはpH５．５〜７．５の範囲である。
それに対して、安定化剤を含まない緩衝液は、いずれのpHにおいても安定化を向上させる効果が認められなかった。
【００４１】
実施例５
ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物に対する安定化剤であるフィチン酸ナトリウム及びリン酸塩濃度の影響の試験
１．ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の調製；
実施例２のＡと同様にして調製した。
【００４２】
２．緩衝溶液の調製；
表４に示した緩衝液３種類：１）．トリス１３０mM、塩化ナトリウム１５０mM、ＢＳＡ１％、塩化マグネシウム２mM、塩化亜鉛０．２mM、アジ化ナトリウム０．１％としたトリス緩衝液、２）．トリス緩衝液に安定化剤フィチン酸ナトリウム１、２．５、５．０、１０．０、４０．０mMを添加したトリス／フィチン酸ナトリウム緩衝液、３）．ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄ １０〜２５０mM、塩化ナトリウム１５０mM、ＢＳＡ１％、塩化マグネシウム２mM、塩化亜鉛０．２mM、アジ化ナトリウム０．１％としたＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄緩衝液。これらはすべてpH７．４に調整した。
【００４３】
３．アッセイ方法；
高濃度のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物溶液から上記１１種類の緩衝溶液でそれぞれの１μg／ml濃度の結合物溶液を調製する。結合物の温度負荷試験（３７℃，２週間）を実施すると同時に、対照組を−８０℃に保存する。温度負荷試験が終了後、実施例２と同様にして残存活性を測定した。
結果を表６にまとめた。
【００４４】
【表６】

【００４５】
フィチン酸ナトリウム、リン酸塩とも試験したすべての濃度で本発明の効果が得られた。
【００４６】
実施例６
室温放置時のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の安定性に対する安定化剤の効果
１．ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の調製；
実施例２のＡと同様にして調製した。
【００４７】
２．緩衝液の調製；
１３０mM トリス緩衝液（塩化ナトリウム１５０mM，ＢＳＡ１％，塩化マグネシウム２mM，塩化亜鉛０．２mM，アジ化ナトリウム０．１％）に、安定化剤（フィチン酸ナトリウム１０．０mM，ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄）を加えたものと、安定化剤無添加のものをコントロールとするトリスの計３種類の緩衝液のpHをいずれも７．０に調製した。
【００４８】
３．アッセイ方法；
１で調製された高濃度のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物を上記３種類の緩衝溶液で１μg／mlになるように希釈する。この３種類の結合物溶液を室温２５℃で放置する。０から各週にサンプリングして、その後、実施例２のＣと同様にして残存活性を測定する。
測定結果を図１に示した。
【００４９】
フィチン酸ナトリウム、ＫＨ₂ＰＯ₄を用いることにより、いずれも室温での安定性向上効果が得られた。
【００５０】
実施例７
温度によるＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の安定性に対しての安定化剤の効果
１．ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の調製；
実施例２のＡと同様にして調製した。
２．緩衝液の調製；
実施例６の２と同様にして調製した。
【００５１】
３．アッセイ方法；
１で調製された高濃度のＡＬＰ−ＡＦＰ結合物を上記３種類の緩衝溶液で１μg／mlになるように希釈する。
結合物を１０、２０、２５、３０、４０℃、１０分間で放置した後、それぞれ５０μl をサンプリングし、実施例１のＣと同様にして残存活性を測定する。測定結果を図２に示した。
【００５２】
酵素の緩衝液に安定化剤未添加に比べ、本発明の安定化剤を添加した後温度に対する耐性が向上したことが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６において、ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の安定化剤による効果を示す図である。
【図２】実施例７において、ＡＬＰ−ＡＦＰ結合物の安定化剤と温度による影響を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for stabilizing an aqueous solution of alkaline phosphatase or a derivative thereof used in clinical tests and research reagents based on enzyme immunoassay (EIA) and the like.
[0002]
[Prior art]
In recent years, enzyme immunization, chemiluminescence enzyme immunization, and the like have been frequently used for clinical examinations. Among the enzymes used in such enzyme immunization methods, alkaline phosphatase or a derivative thereof (hereinafter referred to as “ALP etc.”) is particularly important. It is very important in ensuring.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, these ALPs and the like are HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid] (pH 7.5 to 8.2), TEA (triethanolamine) (pH 7.6 to 8.0). ), Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] (pH 8.0 to 8.5) and the like, and reacted in these buffers, but the high temperature ( The stability of ALP and the like under long-term storage was not sufficient.
[0004]
For this reason, from the viewpoints of operability and reproducibility, ALP and the like are stored in a solution state and a reaction at about 37 ° C. is desired. Or stored in a lyophilized state, causing problems such as complicated operations and increased costs.
[0005]
In order to solve these problems, attempts have been made for stabilization techniques such as ALP for many years. Typical methods include chemical modification of enzymes and addition of divalent metal ions such as Mg ²⁺ , Zn ²⁺ , Mn ²⁺ , Cd ²⁺ or water-soluble sulfides. However, stabilization by these methods is not sufficient, and the problem of stability of the enzyme solution has not been completely cleared.
[0006]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method capable of stably storing an aqueous solution of ALP or the like for a long period of time without inactivating ALP or the like even at a relatively high temperature (25 ° C. or higher).
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In view of such circumstances, the present inventors have conducted extensive studies on a method for stabilizing an aqueous solution such as ALP. As a result, a stabilizer selected from an alkali metal phosphate and an inositol phosphate ester salt is added to an aqueous solution such as ALP. When added, it was found that ALP and the like can be stably stored for a long period of time even at high temperatures, and the present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention provides a method for stabilizing an aqueous solution, which comprises adding a stabilizer selected from an alkali metal phosphate and an inositol phosphate salt to an aqueous solution containing alkaline phosphatase or a derivative thereof. To do.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, examples of the stabilizer include alkali metal phosphates and inositol phosphates . Among these, examples of the alkali metal phosphate include potassium phosphate such as KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ . As the inositol phosphate salt, such as sodium phytate (sodium inositol hexaphosphate) and the like.
[0011]
These compounds may be used as buffer substances themselves or may be used by adding them to other buffer solutions. In any case, an equivalent stabilizing effect can be obtained.
[0012]
The amount of these stabilizers to be used varies depending on the kind of stabilizer used, the stabilizing effect, solubility, etc., but is generally 1 mM or more, particularly 2.5 to 500 mM in an aqueous solution containing ALP or the like. It is preferable to obtain a sufficient stabilizing effect. For example, in the case of phosphoric acid or a salt thereof, it is preferable to use it in a range where the concentration of the aqueous solution is 10 to 250 mM. Since a compound such as sodium phytate has 6 phosphate groups in one molecule, Even if the addition concentration is lower than that of the above compound, for example, a very low concentration of about 1 mM, the stabilizing effect can be obtained.
[0013]
The pH of the aqueous solution containing the stabilizer of the present invention is preferably in the range of 5.5 to 8.5, particularly preferably in the range of 5.5 to 7.5. Even if the pH is in the range of 5.5 to 8.5 without using the stabilizer as in the present invention, the stabilizing effect as in the present invention cannot be obtained.
[0014]
The stabilization method of the present invention can be applied to an aqueous solution containing ALP or a derivative thereof. Here, the ALP derivative is not particularly limited, but ALP and protein (antigen, antibody, avidin, etc.), peptide, hapten, complement Examples include conjugates with enzymes (such as biodin), sugars (such as lectins), and nucleic acids (such as DNA probes and RNA probes). The protein, peptide, etc. used here are not particularly limited, and the type, concentration, etc. may be appropriately selected and determined according to the type of the test object. The concentration of ALP in the aqueous solution is not particularly limited, but is preferably 0.05 to 5000 μg / ml, particularly preferably 0.5 to 1000 μg / ml.
[0015]
【The invention's effect】
According to the stabilization method of the present invention, ALP and the like can be stably stored for a long period of time in a solution convenient for use, and can also be used in the reaction as it is. Further, since ALP and the like can be stabilized even at high temperatures, the speed of the immune reaction can be increased, and the measurement time can be shortened and the measurement sensitivity can be improved. Furthermore, since ALP or the like in a clinical test reagent used for enzyme immunoassay or the like does not cause a decrease in activity, good measurement reproducibility can be obtained.
[0016]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.
[0017]
Example 1
Stabilizing effects of various stabilizers of ALP:
1. Preparation of ALP solution (1) Preparation of buffer solution;
Two types of buffer solutions (KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ , HEPES / sodium phytate) containing the stabilizers shown in Table 1 and _two conventional buffer solutions (HEPES, TEA) (all concentrations are 100 mM) ) Were added to each 100 ml of sodium chloride (150 mM), BSA (1%), magnesium chloride (2 mM), zinc chloride (0.2 mM), sodium azide (0.1%). Next, the pH was adjusted with 6N hydrochloric acid as follows. KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ = 7.0, HEPES / sodium phytate = 7.0, HEPES = 7.0, TEA = 7.6
[0018]
(2) Preparation of ALP solution;
ALP solution of known concentration was diluted with each buffer solution obtained in (1) to 10 μg / ml.
[0019]
2. Assay Method A predetermined amount was taken from the above four types of ALP solutions (10 μg / ml concentration), and a temperature load test (50 ° C./10 minutes, Stress +) was performed. At the same time, the remaining solution is stored as a control group at 4 ° C. (Stress −) for 10 minutes. After the load test is completed, the buffer solution is exchanged with a TEA buffer solution using a PD-10 column manufactured by Pharmacia. In the control group, buffer exchange is performed in the same manner. Take 500 μl from the sample after buffer exchange, add 50 μl of p-nitro-phenyl-phosphate, react for 2 minutes, add stop solution, and measure the activity of the enzyme before and after the loading test by absorbance at 405 nm. .
The measurement results are shown in Table 1.
[0020]
[Table 1]

[0021]
According to the method of the present invention, it can be seen that 96% or more of ALP activity remains even after the temperature load test. In contrast, in the conventional method, the activity decreased to 82% or less.
[0022]
Example 2
Stabilizing effect of α-fetal protein (AFP) antibody on ALP-labeled antibody (ALP-AFP conjugate) by various stabilizers:
A. Preparation of ALP-AFP conjugate Thiolation of Anti-AFP antibody with N-acetyl-DL-homocysteine thiolactone (AHTL) (1) Purified antibody of α-AFP under stirring at 4 ° C. 5 mg / 0.5 ml-0.1 M NaHCO ₃ /0.15 M AHTL 0.6 mg / 0.01 ml was added to NaCl / 0.2 M imidazole buffer (pH 9.0) and reacted for 1 hour.
(2) When the reaction is completed, the antibody sample is placed on a Sephadex G-50 column and desalted with PBS / 1.0 mM EDTA. The thiolated antibodies that appeared on the void column were pooled and the amount of protein was measured. Excess AHTL was eluted in the second peak.
[0023]
2. Introduction of maleimide (MI) into ALP by Sulfo-SMCC (1) 1.5 mg (about 30 nmol) against 14.4 mg (102.5 nmol) ALP (0.1 M Tris / 0.15 M NaCl) under stirring Excess Sulfo-SMCC solution (10 mg / ml) was added dropwise and reacted at room temperature for 1 hour.
(2) After completion of the reaction, the sample was placed on a Sephadex G-50 column and desalted with PBS / 1.0 mM EDTA buffer. Maleimidated ALP (ALP-MI) coming out of the void column was pooled and the amount of protein was measured. Excess Sulfo-SMCC was eluted in the second peak.
[0024]
3. The ALP-MI solution (306 μg / ml) was added dropwise while stirring the antibody and the enzyme-reaction thiolated antibody solution (364 μg / ml). The reaction is allowed to proceed for 2 hours at room temperature with stirring.
[0025]
4). Blocking the active group with β-mercaptoethanol (β-ME) and enzyme conjugate solution 100 (volume) were added β-ME 1 (volume) (final concentration 1 mM) and incubated at room temperature for 30 minutes.
[0026]
5). Separation of Free Antibody and Enzyme in Conjugate by Gel Filtration Place the above complex solution on a gel SW-3000 (manufactured by Tosoh Corp.) column and elute 0.1M Tris / 0.15M NaCl (pH 7.0) The solution was fractionated until the bound product, free antibody and ALP were eluted.
[0027]
B. Preparation of ALP-AFP conjugate solution Preparation of buffer solutions As in 1 (1) of Example 1, four types of buffer solutions shown in Table 1 are prepared.
[0028]
2. Dilute from the high concentration ALP-AFP conjugate prepared in A to 1 μg / ml with the four buffers described above.
[0029]
C. Assay Method A temperature load test (50 ° C., 10 minutes) is performed on some of the four types of ALP-AFP conjugate solutions described above. Store the rest as a control at 4 ° C. for 10 minutes. After 10 minutes, take 50 μl from all samples, add 50 μl of anti-AFP antibody-bound solid phase and 10 μl of AFP antigen sample, and 50 μl of diluted solution. Phossolyldioxtan (AMPPD) was added, and the activity of the ALP-AFP conjugate before and after the load test was measured.
The measurement results are summarized in Table 1.
[0030]
According to the method of the present invention, 94% or more of the activity of the ALP-AFP conjugate remained even after the temperature load test. In contrast, the conventional method decreased to 75% or less.
[0031]
Example 3
ALP stability test when the pH of the buffer containing the stabilizer is changed:
1. Buffer preparation;
Stabilization buffer (K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ , HEPES / sodium phytate) and conventional buffer solutions (MES, HEPES, TEA) 5 types of buffer solutions (all concentrations are 100 mM) in 100 ml sodium chloride (150 mM), BSA (1%), magnesium chloride (2 mM), zinc chloride (0.2 mM), sodium azide (0.1%) are added. PH of 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 (K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ ), 7.0, 7 with 6N hydrochloric acid .5, 8.0 (HEPES / sodium phytate), 5.5, 6.0, 6.5 (MES), 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 (HEPES), 7. Adjusted to 6 (TEA).
[0032]
2. Assay method;
In the same manner as 1 (2) of Example 1, an enzyme solution of 10 μg / ml was prepared with the above buffer solution, and a temperature load test similar to 2 of Example 1 was performed to measure the enzyme activity.
The results are summarized in Tables 2 and 3.
[0033]
[Table 2]

[0034]
[Table 3]

[0035]
Example 4
Stability test of ALP-AFP conjugate when the pH of the buffer containing the stabilizer is changed:
1. Preparation of ALP-AFP conjugates;
Prepared in the same manner as A in Example 2.
[0036]
2. Buffer preparation;
Stabilization buffer (K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ , HEPES / sodium phytate) and conventional buffer solutions (MES, HEPES, TEA) 5 types of buffer solutions (all concentrations are 100 mM) in 100 ml sodium chloride (150 mM), BSA (1%), magnesium chloride (2 mM), zinc chloride (0.2 mM), sodium azide (0.1%) are added. With 6N hydrochloric acid, the pH was adjusted to 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 (K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ ), 7.0. 7.5, 8.0 (HEPES / sodium phytate), 5.5, 6.0, 6.5 (MES), 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 (HEPES), Prepared to 7.6 (TEA).
[0037]
3. Assay method;
A 1 μg / ml solution was prepared from the high-concentration ALP-AFP conjugate prepared in 1 using the above buffer, and a temperature load test was conducted in the same manner as in Example 2C. The activity of the product was measured.
The results are summarized in Tables 4 and 5.
[0038]
[Table 4]

[0039]
[Table 5]

[0040]
The stability improvement effect of the enzyme or the enzyme-labeled antibody was obtained at any pH of 5.5 to 8.5 for two types of buffers containing the stabilizer. More preferably, the pH is in the range of 5.5 to 7.5.
On the other hand, the buffer solution containing no stabilizer did not show the effect of improving the stabilization at any pH.
[0041]
Example 5
Testing the effect of sodium phytate and phosphate concentrations as stabilizers on ALP-AFP conjugates. Preparation of ALP-AFP conjugates;
Prepared in the same manner as A in Example 2.
[0042]
2. Preparation of a buffer solution;
Three types of buffer solutions shown in Table 4: 1). Tris buffer with Tris 130 mM, sodium chloride 150 mM, BSA 1%, magnesium chloride 2 mM, zinc chloride 0.2 mM, sodium azide 0.1%, 2). Tris / sodium phytate buffer added with the stabilizer sodium phytate 1, 2.5, 5.0, 10.0, 40.0 mM in Tris buffer, 3). _{_{_{KH 2 PO 4 / K 2 HPO}}} 4 10~250mM, sodium chloride 150mM, BSA 1%, magnesium chloride 2 mM, zinc chloride 0.2 mM, 0.1% sodium azide and the _{_{_{KH 2 PO 4 / K 2 HPO}}} 4 buffer liquid. These were all adjusted to pH 7.4.
[0043]
3. Assay method;
Prepare a 1 μg / ml binding solution for each of the above 11 buffer solutions from a high concentration ALP-AFP binding solution. The control set is stored at −80 ° C. while performing a temperature load test (37 ° C., 2 weeks) of the conjugate. After the temperature load test was completed, the residual activity was measured in the same manner as in Example 2.
The results are summarized in Table 6.
[0044]
[Table 6]

[0045]
The effects of the present invention were obtained at all concentrations tested for sodium phytate and phosphate.
[0046]
Example 6
1. Effect of stabilizer on stability of ALP-AFP conjugate upon standing at room temperature Preparation of ALP-AFP conjugates;
Prepared in the same manner as A in Example 2.
[0047]
2. Buffer preparation;
130 mM Tris buffer (150 mM sodium chloride, 1% BSA, 2 mM magnesium chloride, 0.2 mM zinc chloride, 0.1% sodium azide) and stabilizer (sodium phytate 10.0 mM, KH ₂ PO ₄ / K ₍₂ HPO ₄ ) and Tris without any stabilizer were used as controls to adjust the pH of all three buffer solutions to 7.0.
[0048]
3. Assay method;
Dilute the high concentration ALP-AFP conjugate prepared in step 1 to 1 μg / ml with the above three buffer solutions. The three kinds of binder solutions are left at room temperature of 25 ° C. Sampling from 0 to each week, and then measuring the residual activity in the same manner as C in Example 2.
The measurement results are shown in FIG.
[0049]
By using sodium phytate and KH ₂ PO ₄ , the effect of improving the stability at room temperature was obtained.
[0050]
Example 7
Effect of stabilizers on the stability of ALP-AFP conjugates with temperature Preparation of ALP-AFP conjugates;
Prepared in the same manner as A in Example 2.
2. Buffer preparation;
Prepared in the same manner as in Example 6, 2.
[0051]
3. Assay method;
Dilute the high concentration ALP-AFP conjugate prepared in step 1 to 1 μg / ml with the above three buffer solutions.
The bound product is allowed to stand at 10, 20, 25, 30, 40 ° C. for 10 minutes, then 50 μl is sampled and the residual activity is measured in the same manner as in Example 1C. The measurement results are shown in FIG.
[0052]
It was shown that the resistance to temperature was improved after the addition of the stabilizer of the present invention compared to the case where no stabilizer was added to the enzyme buffer.
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the effect of a stabilizer of an ALP-AFP conjugate in Example 6. FIG.
FIG. 2 is a diagram showing the influence of an ALP-AFP conjugate stabilizer and temperature in Example 7.

Claims

A method for stabilizing an aqueous solution, comprising adding a stabilizer selected from an alkali metal phosphate and an inositol phosphate salt to an aqueous solution containing alkaline phosphatase or a derivative thereof .

2. The stabilization method according to claim 1 , wherein the alkaline phosphatase or a derivative thereof is alkaline phosphatase or a conjugate of the alkaline phosphatase and an antigen, antibody, avidin, peptide, hapten, coenzyme, saccharide or nucleic acid.