JP3820227B2

JP3820227B2 - Cell isolation method

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Publication number: JP3820227B2
Application number: JP2003014385A
Authority: JP
Inventors: 和雄鷲山; 新一土坂
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2023-01-23
Also published as: JP2003284549A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上の標本の中から解析しようとする特定の細胞又は細胞集団を選別し、分離取得するための細胞又は細胞内の解析対象試料を単離する細胞単離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の機能を解析しようとする研究は、現在最も関心の高いものである。遺伝子機能の解析の研究は、標本中から細胞を取得する。遺伝子機能の解析のための試料は、細胞中から直接採取される。細胞又は試料を採取する装置は、各種開発されて使用されている。
【０００３】
標本の切片から細胞を採取する各種細胞採取方法について説明する。
【０００４】
（１）切片状の標本が薄膜プレート上に固定される。切片状の標本は、例えば遺伝子の機能などを解析するために採取したい細胞を有する。紫外線波長領域のレーザビーム（ＵＶレーザビーム）が細胞の輪郭に沿って薄膜プレート上に照射される。これにより、標本中の採取したい細胞が薄膜プレートと共に切り離される。
【０００５】
次に、薄膜プレートに対してフォーカスのずれたＵＶレーザビームが切り離し部分に照射される。これにより、標本中の切り離し部分が飛ばされる。この結果、採取する細胞が取得される。例えば特許文献１が挙げられる。
【０００６】
（２）転写フィルムを張り付けた採取用の透明キャップが用いられる。透明キャップは、採取したい細胞を有する標本上に載置される。標本中の採取したい細胞を有する部分にＩＲレーザビームが透明キャップを透過して照射される。これにより、転写フィルム面に採取したい細胞部分が付着する。例えば特許文献２、３、４が挙げられる。
【０００７】
（３）標本がフィルム上に張り付けられる。フィルム上で標本を貼り付けた面が下方に向けられる。この状態で、上方からＵＶレーザビームが細胞の輪郭に沿って照射される。これにより、採取する細胞の周囲が切り取られる。
【０００８】
次に、ＵＶレーザビームがフィルムに照射される。これにより採取する細胞は、フィルムから離れて下方にセットされた受皿に落とし込まれる。例えば特許文献５、６が挙げられる。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許５９９８１２９号公報
【００１０】
【特許文献２】
特開２０００−２６６６４９号公報
【００１１】
【特許文献３】
特表２００１−５１９８９８号公報
【００１２】
【特許文献４】
特表２００２−５０３３４５号公報
【００１３】
【特許文献５】
特開２００２−１７４７７８号公報
【００１４】
【特許文献６】
特開２００２−１５６３１６号公報
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、(１)の方法は、採取したい細胞を薄膜プレートと共に切り離した後、フォーカスのずれたＵＶレーザビームを照射して切り離し部分を飛ばす。このため、採取すべき細胞がどこに行ったか分からなくなる。細胞を紛失することが多々ある。又、ＵＶレーザビームによる細胞の変質も予想される。
【００１６】
又、採取した細胞にゴミなどの異物が混入しやすい。標本を事前に薄膜プレート上に固定する必要がある。このため、細胞の採取作業は、手間を必要とし、面倒である。
【００１７】
（２）の方法は、透明キャップを透過してＩＲレーザビームを標本中の採取したい細胞に照射する。このため、採取したい細胞に照射するＩＲレーザビームのスポット径を小さくできない。ＩＲレーザビームのスポット径は、採取したい細胞の大きさよりも大きくなる場合もある。採取したい細胞の大きさよりも大きなスポット径のレーザビームを照射すると、採取したい細胞と共に、その周囲の不必要な細胞も転写フィルム面に付着する。例えば１０ミクロンのスポット径で５ミクロン以下の極小の細胞を採取する場合、周囲の不必要な細胞も転写フィルム面に付着する。
【００１８】
転写フィルム面に採取する細胞を付着させるので、細胞の渇き具合などによっては、細胞を転写フィルム面に具合よく付着できず、細胞の採取ができないこともある。濡れた状態の細胞の採取は不可能である。細胞の転写フィルム面に対する付着は、細胞の渇き具合などの細胞の条件に影響される。換言すれば、細胞を採取可能になるためには、細胞の条件に限定される。
【００１９】
標本に照射するＩＲレーザビームの出力を大きくすると、細胞部分を転写フィルム面に付着させて細胞を採取する効率がよくなる。その反面、ＩＲレーザビームの出力を大きくすると、細胞が焼けてしまう。
【００２０】
（３）の方法は、ＵＶレーザビームの照射により採取する細胞部分を下方にセットされた受皿に落とし込む。このため、採取すべき細胞がどこに行ったか分からなくなる。又、取得した細胞にゴミなどの異物が混入しやすい。ＵＶレーザビームによる細胞の変質も予想される。
【００２１】
以上のような問題点を纏めると、
（ａ）採取したい細胞を採取するのに時間がかかる。そのうえ採取時に細胞が紛失しやすい。
【００２２】
（ｂ）小さな細胞の取得が難しい。標本の乾燥状態などから採取可能な細胞が限定される。
【００２３】
（ｃ）ＵＶレーザビームによる細胞の変質などの原因で十分な品質の細胞が多量に短時間で取得できない。
【００２４】
そこで本発明は、採取したい細胞を確実に、しかも効率よく採取できる細胞単離方法を提供することを目的とする
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、基板上に載置され細胞を有する標本に対してレーザビームを照射して細胞部分以外の不要な標本部分を基板上から取り除き、両端に各開口部を有する筒状体を用い、筒状体における一方の開口部の中に細胞部分を入れて筒状体を前記基板上に設置し、基板と筒状体とにより形成される容器内に剥離剤を注入して細胞部分を基板から剥離し、剥離剤中に浮遊する細胞部分を採取する細胞単離方法である。
【００２６】
本発明は、基板上に載置され細胞を有する標本に対してレーザビームを照射して細胞部分以外の不要な標本部分を基板上から取り除き、両端に各開口部を有する筒状体を用い、筒状体における一方の開口部の中に細胞部分を入れて筒状体を基板上に設置し、基板と筒状体とにより形成される容器内に細胞中に存在する試料を溶出する溶液を注入し、溶液中に溶出した試料を採取する細胞又は細胞内の解析対象試料を単離する細胞単離方法である。
【００２７】
本発明は、基板上に載置され細胞を有する標本に対してレーザビームを照射して細胞部分以外の不要な標本部分を変質し、両端に各開口部を有する筒状体を用い、筒状体における一方の開口部の中に細胞部分を入れて筒状体を基板上に設置し、基板と筒状体とにより形成される容器内に剥離剤を注入して細胞部分を基板から剥離し、剥離剤中に浮遊する細胞部分を採取する細胞単離方法である。
【００２８】
本発明は、基板上に載置され細胞を有する標本に対して紫外光を照射して細胞部分以外の不要な標本部分を変質し、両端に各開口部を有する筒状体を用い、筒状体における一方の開口部の中に細胞部分を入れて筒状体を基板上に設置し、基板と筒状体とにより形成される容器内に剥離剤を注入して細胞部分を基板から剥離し、剥離剤中に浮遊する細胞部分を採取する細胞又は細胞内の解析対象試料を単離する細胞単離方法である。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の第１の実施の形態を図面に従い説明する。
【００３０】
図１は本発明の細胞取得方法に用いる倒立型顕微鏡の構成図である。照明用光源１は、例えばハロゲンランプを用いる。照明用光源１は、可視光線を出力する。視野絞り２、開口絞り３及びダイクロイックミラー４が照明用光源１から出力される可視光線の光路上に設けられている。
【００３１】
視野絞り２及び開口絞り３は、一般的な顕微鏡の光学系を構成する。ダイクロイックミラー４は、可視光線を光軸ｐの下方に向って反射する。
【００３２】
レーザ用対物レンズ５がダイクロイックミラー４の反射光路（光軸ｐ）上に設けられている。レーザ用対物レンズ５は、照明用光源１から出力された可視光線を集光して標本７に照射する。レーザ用対物レンズ５は、コンデンサレンズとして機能する。
【００３３】
ステージ６は、ダイクロイックミラー４の反射光路上に設けられている。ステージ６上に標本７を載せるスライドガラス８が載置されている。ステージ６は、Ｘ方向とＹ方向との各モータ６ａ、６ｂを有する。ステージ６は、Ｘ方向のモータ６ａの駆動によりＸ方向に移動する。ステージ６は、Ｙ方向のモータ６ｂの駆動によりＹ方向に移動する。ステージ駆動部９は、Ｘ方向とＹ方向との各モータ６ａ、６ｂを駆動する。
【００３４】
標本７は、組織切片や培養細胞などで例えば遺伝子機能の解析に用いられる。細胞の核などを蛍光染色して蛍光観察しながら細胞を取得する場合、標本７は、予め蛍光色素を塗布されている。
【００３５】
観察用対物レンズ１０、ダイクロイックミラー１１、ＵＶバリアフィルタ１２、結像レンズ１３及びハーフミラー１４が標本７を透過する光軸ｐ上に設けられている。
【００３６】
ＣＣＤカメラ１５は、ハーフミラー１４の反射光路上に設けられている。ＣＣＤカメラ１５は、ハーフミラー１４を介して結像レンズ１３の結像位置に配置されている。ＣＣＤカメラ１５は、結像レンズ１３により結像された像を撮像して画像信号を出力する。
【００３７】
画像処理及びステージ制御装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から出力された画像信号を入力し、画像信号を画像処理して画像データを取得し、画像データをディスプレイ１７に表示する。
【００３８】
画像処理及びステージ制御装置１６は、キーボート及びマウスなどの操作部１８を接続する。操作部１８は、観察者によるステージ６の移動方向及び移動量の操作を受け、この操作指令を発生する。画像処理及びステージ制御装置１６は、操作部１８からの操作指令を受け、操作指令に従ったステージ６の移動制御信号をステージ駆動部９に送出する。
【００３９】
ミラー１９がハーフミラー１４の透過光路上に設けられている。リレーレンズ２０、ＵＶカットフィルタ２１及び接眼レンズ２２がミラー１９の反射光路上に設けられている。
【００４０】
一方、ＵＶレーザヘッド２３がレーザ用対物レンズ５及びダイクロイックミラー４を通る光軸ｐ上に設けられている。ＵＶレーザヘッド２３とダイクロイックミラー４との間の光軸ｐ上にＵＶ結像レンズ２４が設けられている。
【００４１】
ＵＶレーザヘッド２３は、レーザ光源２３ａを有する。ＵＶレーザヘッド２３は、紫外領域の波長のレーザビームを出力する。ＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームは、標本７中に有する複数の細胞のうち採取したい細胞以外の不必要な細胞をスライドガラス８上から取り除く。
【００４２】
ＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームのエネルギは、スライドガラス８上の不必要な細胞をスライドガラス８上から取り除く程度に設定されている。
【００４３】
ＵＶレーザヘッド２３は、可変スリット２５及びＬＥＤ２６を有する。可変スリット２５は、例えば円形又は四辺形の開口部を有する。可変スリット２５は、開口部の径の大きさを可変可能である。可変スリット２５は、ＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームのスポット径を可変する。
【００４４】
ＬＥＤ２６は、ＬＥＤ光を出力する。ＬＥＤ光は、可視光線の波長の光、例えば赤色の可視光である。
【００４５】
ダイクロイックミラー２７がＬＥＤ光の光路上に設けられている。ダイクロイックミラー２７は、ＬＥＤ２６から出力されたＬＥＤ光をＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームの光軸ｐ上に向けて反射する。
【００４６】
これにより、ＬＥＤ光は、ＬＥＤ光とＵＶレーザビームの波長に対して透過性を持つダイクロイックミラー２７を通過し、標本７におけるレーザビームの照射位置と同一位置に照射される。標本７上に照射された赤色のＬＥＤ光は、標本７上に照射するレーザビームの照射位置を表示する。
【００４７】
蛍光励起用光源２８及びＵＶバンドパスフィルタ２９がダイクロイックミラー１１の反射光路上に設けられている。蛍光励起用光源２８は、ステージ６の下方に設けられている。蛍光励起用光源２８は、紫外光を出力する。蛍光励起用光源２８は、例えば水銀ランプである。
【００４８】
蛍光励起用光源２８から出力される紫外光は、ＵＶバンドパスフィルタ２９を透過し、ダイクロイックミラー１１で反射し、観察用対物レンズ１０を通って標本７に照射される。蛍光励起用光源２８から出力される紫外光は、標本７に予め塗布された蛍光色素を励起する。
【００４９】
エアーブロー３０は、ステージ６の斜め上方に設けられている。エアーブロー３０は、ステージ６上に載置されている標本７に向ってエアーを吹き付ける。標本７における不必要な細胞をスライドガラス８上から取り除く場合、不必要な細胞の破片が発生する。不必要な細胞の破片は、エアーブロー３０により吹き付けられるエアーによってスライドガラス８上から吹き飛ばされる。
【００５０】
エアー吸引機３１は、ステージ６の斜め上方に設けられている。エアー吸引機３１は、例えばステージ６上の標本７を介してエアーブロー３０と対峙する。エアー吸引機３１は、エアーを吸引し、エアーブロー３０のエアー吹き付けによって飛ばされた細胞の破片を吸引する。
【００５１】
次に、標本７中に存在する細胞の採取方法について説明する。
【００５２】
標本７がスライドガラス８上に載置される。スライドガラス８は、ステージ６上に載置される。
【００５３】
照明用光源１は、可視光線を出力する。可視光線は、視野絞り２、開口絞り３を通り、ダイクロイックミラー４で反射し、レーザ用対物レンズ５を通して標本７に照射される。標本７に照射された可視光線の一部は、標本７を透過する。
【００５４】
標本７を透過した光は、観察用対物レンズ１０を通り、ダイクロイックミラー１１、ＵＶバリアフィルタ１２を透過し、結像レンズ１３により結像される。
【００５５】
ＣＣＤカメラ１５は、ハーフミラー１４を介して結像レンズ１３により結像された標本７の拡大像を撮像して画像信号を出力する。
【００５６】
画像処理及びステージ制御装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から出力された画像信号を入力し、画像信号を画像処理して画像データを取得し、画像データをディスプレイ１７に表示する。
【００５７】
これと共に、結像レンズ１３により結像された標本７の像は、ミラー１９で反射し、リレーレンズ２０、ＵＶカットフィルタ２１を通って接眼レンズ２２に入射する。観察者は、接眼レンズ２２を覗くことにより拡大された標本７の像を目視観察する。
【００５８】
観察者は、ディスプレス１７に表示される標本７の拡大像又は接眼レンズ２２を覗いて標本７の拡大像を観察しながら標本７中から採取したい細胞を決定する。
【００５９】
標本７中から細胞ａを採取する場合、図２に示す筒体４０を用いる。筒体４０は、例えばプラスチックや金属、ガラス材料からなる。筒体４０は、円筒形状に形成され、両端に円形の各開口部を形成する。筒体４０の径は、採取する細胞ａよりも大きければよい。筒体４０のサイズは、一例として外径４〜１１ｍｍ、内径３〜１０ｍｍ、長さ５〜１０ｍｍである。筒体４０のサイズは、一例のサイズよりも小さいものもある。
【００６０】
標本７が筒体４０の内径よりも大きければ、採取する細胞ａを有する標本部分ｄをトリミングする。筒体４０の開口部の形状が円形であれば、図３に示すように標本７中の採取した細胞ａを有する標本部分ｄを円形にトリミングする。標本７が筒体４０の内径よりも小さければ、トリミングの必要はない。
【００６１】
筒体４０は、円形の各開口部を有するものに限らず、他の形状の開口部を有するものでもよい。例えば、筒体４０の開口部の形状が四辺形状の場合、トリミングする標本部分ｄの形状は、図４に示すように標本７中の採取する細胞ａを有する四辺形状になる。
【００６２】
採取する細胞ａを有する標本部分ｄのトリミングについて説明する。
【００６３】
ＵＶレーザヘッド２１の可変スリット２２は、例えば円形の開口部を用いる。可変スリット２２は、スリット径を例えば図２に示すように筒体４０の壁の厚さＳ_１と略同等のスポット径ｓ_１になるように設定する。
【００６４】
一方、ＬＥＤ２６から赤色のＬＥＤ光が出力される。ＬＥＤ光は、ダイクロイックミラー２７で反射し、可変スリット２５に入射する。ＬＥＤ光は、可変スリット２５の開口部を通過することにより、スポット径ｓ_１の円形のＬＥＤ光に成形される。
【００６５】
スポット径ｓ_１のＬＥＤ光は、ＵＶ結像レンズ２４、レーザ用対物レンズ５を通して標本７に照射される。このときダイクロイックミラー４を透過したスポット径ｓ_１のＬＥＤ光は、ＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームの光軸ｐ上に進行する。スポット径ｓ_１のＬＥＤ光は、標本７におけるレーザビームの照射位置と同一位置を赤色で照射する。
【００６６】
ＣＣＤカメラ１５は、標本７の拡大像を撮像して画像信号を出力する。画像処理及びステージ制御装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から出力された画像信号を入力し、画像信号を画像処理して画像データを取得し、赤色のスポット径ｓ_１のＬＥＤ光の照射された標本７の画像データをディスプレイ１７に表示する。
【００６７】
観察者は、ディスプレス１５に表示されている標本７を観察しながら標本部分ｄを残し、標本部分ｄの周囲の標本７の部分をスライドガラス８上から取り除くレーザビームの照射ルートＲ_１を決定する。
【００６８】
レーザビームの照射ルートＲ_１は、円形の開口部の筒体４０を用いる場合、図３に示すように円形である。レーザビームの照射ルートＲ_１は、四辺形の開口部の筒体４０を用いる場合、図４に示すように四辺形である。
【００６９】
次に、ＵＶレーザヘッド２３は、例えば１ショット毎にレーザビームを出力する。レーザビームのエネルギは、スライドガラス８上の不必要な標本部分ｄの外周部分をスライドガラス８上から取り除く程度に設定されている。なお、レーザビームのエネルギは、周囲環境に多少の湿気があっても採取したい細胞ａ以外の不要部分を完全に吹き飛ばす程度に設定することが好ましい。
【００７０】
レーザビームは、ＵＶ結像レンズ２４、ダイクロイックミラー４、レーザ用対物レンズ５を通って標本７の照射ルートＲ_１上に照射される。
【００７１】
観察者は、ディスプレス１７に表示される標本７上のＬＥＤ光の照射位置又は接眼レンズ２２を覗いてＬＥＤ光の照射位置を確認する。観察者は、ＬＥＤ光の照射位置を照射ルートＲ_１上になるように確認しながらキーボート及びマウスなどの操作部１８を操作する。
【００７２】
画像処理及びステージ制御装置１６は、操作部１８からのステージ６の移動方向及び移動量の操作に応じた操作指令を受け、操作指令に従ったステージ６の移動制御信号をステージ駆動部９に送出する。
【００７３】
ステージ６は、例えば１ショットのレーザビーム毎に、標本７上のＬＥＤ光の照射位置を照射ルートＲ_１上になるようにＸＹ方向に移動する。ステージ６のＸＹ方向の移動により１ショット毎のレーザビームは、それぞれ標本７上の照射ルートＲ_１上に移動しながら照射される。
【００７４】
レーザビームの照射された照射ルートＲ_１上の標本７の各部分は、それぞれスライドガラス８上から取り除かれる。これにより、図３に示すように採取する細胞ａを有する標本部分ｄが円形にトリミングされる。又、図４に示すように採取する細胞ａを有する標本部分ｄが四辺形にトリミングされる。
【００７５】
なお、各照射ルートＲ_１、Ｒ_２のＸＹ座標位置は、予め画像処理及びステージ制御装置１６に記憶させてもよい。すなわち、レーザビームの各照射ルートＲ_１、Ｒ_２が決定された後、標本７上にＬＥＤ光を照射する。観察者は、操作部１８を操作してステージ６をＸＹ方向に移動し、ＬＥＤ光を照射ルートＲ_１、Ｒ_２に従って移動させる。
【００７６】
このとき、画像処理及びステージ制御装置１６は、操作部１８からのステージ６の移動方向及び移動量を読み取り、これら移動方向及び移動量からステージ６の照射ルートＲ_１、Ｒ_２のＸＹ座標位置を算出する。画像処理及びステージ制御装置１６は、算出した照射ルートＲ_１、Ｒ_２のＸＹ座標位置を内部メモリに記憶する。
【００７７】
画像処理及びステージ制御装置１６は、内部メモリに記憶された各照射ルートＲ_１、Ｒ_２のＸＹ座標位置を読み出し、このＸＹ座標位置に従ってステージ６の移動制御信号をステージ駆動部９に送出する。
【００７８】
ステージ６は、自動的にレーザビームの照射位置を照射ルートＲ_１、Ｒ_２上にするようにＸＹ方向に移動する。これと共にＵＶレーザヘッド２３は、所定期間毎に１ショットのレーザビームを出力する。
【００７９】
レーザビームの照射された照射ルートＲ_１、Ｒ_２上の標本７の部分は、スライドガラス８上から取り除かれる。これにより、図３に示すように採取する細胞ａを有する標本部分ｄが自動的に円形にトリミングされる。又、図４に示すように採取する細胞ａを有する標本部分ｄが自動的に四辺形にトリミングされる。
【００８０】
レーザビームを標本７に照射すると、標本７の破片が切り取られる。切り取られた破片は、例えばスライドガラス８の上方に飛び散る。
【００８１】
エアーブロー３０は、スライドガラス８の上方にエアー吹き付ける。スライドガラス８の上方に飛び散る標本７の破片は、エアーブロー３０から吹き付けられたエアーによってスライドガラス８の上方から飛ばされる。
【００８２】
エアー吸引機３１は、エアーを吸引し、エアーブロー３０のエアー吹き付けによって飛ばされた標本７の破片を吸引する。
【００８３】
これにより、スライドガラス８の上方に飛び散る標本７の破片は、スライドガラス８上から除去される。
【００８４】
標本部分ｄのトリミングは、次の方法で行ってもよい。
【００８５】
予め標本７は、蛍光色素により塗布される。
【００８６】
蛍光励起用光源２８は、紫外光を放射する。蛍光励起用光源２８から放射された紫外光は、ＵＶバンドパスフィルタ２９を透過してダイクロイックミラー１１に入射する。紫外光は、ダイクロイックミラー１１で上方に反射し、観察用対物レンズ１０を通して標本７に照射される。標本７に塗布された蛍光色素は、励起されて発光する。
【００８７】
標本７からの蛍光は、観察用対物レンズ１０からダイクロイックミラー１１、ＵＶバリアフィルタ１２を透過し、結像レンズ１３により結像される。
【００８８】
ＣＣＤカメラ１５は、標本７の拡大像及び蛍光を撮像して画像信号を出力する。画像処理及びステージ制御装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から出力された画像信号を入力し、画像信号を画像処理して画像データを取得し、蛍光を発する標本７の画像データをディスプレイ１７に表示する。
【００８９】
これと同時に、標本７の像及び蛍光は、ミラー１９で反射し、リレーレンズ２０、ＵＶカットフィルタ２１を通って接眼レンズ２２に入射する。これにより、観察者は、接眼レンズ２２を覗くことにより蛍光を発する標本７の拡大像を目視観察する。
【００９０】
観察者は、ディスプレス１７に表示される標本７の拡大像及び蛍光、又は接眼レンズ２２を覗いて標本７の拡大像及び蛍光を観察する。観察者は、標本７の拡大像及び蛍光を観察しながら標本７中から採取したい細胞ａを決定できる。
【００９１】
標本７に塗布された蛍光色素が発光するので、可視光線を用いた場合と比較して採取したい細胞ａは、さらに決定し易い。コンピュータを使った画像認識により、採取したい細胞ａを自動で選択することも可能である。
【００９２】
次に、採取したい細胞ａを有する標本ｄから採取したい細胞ａだけを残し、それ以外の細胞を除去する手順について図８を参照して説明する。
【００９３】
可変スリット２５は、開口部の径の大きさを最大にする。可変スリット２５は、ＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームのスポット径を大きくする。図８に示すように採取したい細胞ａから離れた細胞ａは、大きなスポット径ｓ_２のレーザビームにより照射される。
【００９４】
次に、可変スリット２５は、開口部の径の大きさを小さくする。採取したい細胞ａの周りは、小さなスポット径ｓ_３のレーザビームにより丁寧に、すなわち細胞ａの周り沿って正確に照射する。採取したい細胞ａだけが残る。
【００９５】
次に、図２に示す筒体４０が用意される。接着剤４１が筒体４０の一方の開口部に塗布される。筒体４０とスライドガラス８などの基板との接着は、剥離又は抽出のための溶液によって影響を受けない例えばグリース、パラフィン又は各種接着剤を用いる。予め接着剤を塗布した使い捨ての厚手のシール又は筒体を用いてもよい。
【００９６】
筒体４０は、一方の開口部を下方に向けてスライドガラス８の上面に垂直に立設される。筒体４０をスライドガラス８の上面に立設する場合、細胞ａを有する標本部分ｄが一方の開口部内に入れられる。
【００９７】
次に、筒体４０は、スライドガラス８側に対して軽く押し付けられる。これにより、筒体４０とスライドガラス８との接着は、確実な状態になる。接着剤４１が硬化すると、筒体４０とスライドガラス８とによって液密の容器が形成される。筒体４０及びスライドガラス８は、ステージ６上から取り外される。
【００９８】
次に、剥離剤４２が図５に示すように筒体４０とスライドガラス８とにより形成される容器内に注入される。剥離剤４２は、例えばキシレンなどの有機溶媒又は界面活性剤などである。剥離剤４２は、スライドガラス８からの細胞ａの剥離を促進する。図６はスライドガラス８から剥離された細胞ａを示す。剥離された細胞ａは、剥離剤４２中に浮遊する。
【００９９】
次に、剥離剤４２中に浮遊する細胞ａは、剥離剤４２と共にスポイトなどにより吸引される。スポイトにより吸引された細胞ａは、新しい別の容器などに移し替えられる。この結果、細胞ａの採取が終了する。
【０１００】
このように上記第１の実施の形態であれば、筒体４０の開口部の内径よりも小さい標本部分ｄを開口部内に入れて筒体４０をスライドガラス８上に立設し、筒体４０とスライドガラス８との間を接着剤４１により液密に形成し、筒体４０とスライドガラス８とにより形成される容器内に剥離剤４２を注入し、採取したい細胞ａをスライドガラス８から剥離して剥離剤４２中に浮遊させて採取する。
【０１０１】
従って、標本７に有する採取すべき細胞ａを確実に採取できる。これにより、従来のように細胞ａがどこに行ったか分らなくなることがない。細胞ａを紛失することを皆無にできる。採取した細胞ａにゴミなどの異物が混入するようなことも確実に防止できる。
【０１０２】
上記第１の実施の形態は、最初にスライドガラス８上に標本７を載置するので、従来のように特殊な薄膜プレートやフィルムを一切使用しない。薄膜プレートやフィルムへの標本７の貼り付け作業などを無くすことができる。これにより、上記第１の実施の形態は、細胞ａの採取作業を簡単化できかつ効率よくできる。しかも経済的にも有利である。
【０１０３】
上記第１の実施の形態は、従来における細胞採取用の透明キャップなどを用いないので、レーザビームのスポット径を小さくできる。よって、採取したい細胞ａが極小であっても、採取したい細胞ａを残し、それ以外の細胞にレーザビームを照射することができる。
【０１０４】
上記第１の実施の形態は、転写フィルムなどの特殊なものを使用しない。よって、作業の手間が省け、消耗品の費用も削減できる。
【０１０５】
一般に、細胞や細胞に含まれる遺伝子などの機能を解析する場合は、目的とする細胞以外の細胞又はその遺伝子の混入を減らして試料の純度を高めることが要求される。又、標本切片から必要な細胞を選択して取得するのに時間が掛かるので、細胞取得の効率化が求められている。
【０１０６】
これに対して上記第１の実施の形態によれば、不必要な細胞を除去して必要な細胞のみを一度に多数取得できるので、高純度の試料が効率的に取得できる。
【０１０７】
上記第１の実施の形態は、筒体４０中に剥離剤４２を注入し、採取したい細胞ａをスライドガラス８から剥離させて剥離剤４２中に浮遊させて採取する。この細胞採取方法は、細胞ａの核の形状をできるだけ保持することを必要とする研究、例えばフローサイトメトリーなどの解析に有効である。
【０１０８】
上記第１の実施の形態は、適宜変形して実施できる。
【０１０９】
例えば、筒体４０とスライドガラス８の間は、必ずしも接着剤４１を使用しなくともよい。接着剤４１を使用しない場合は、例えば筒体４０の開口部に薄くグリースを塗ってもよい。これにより、剥離剤４２が筒体４０とスライドガラス８の間から漏れないようにしてもよい。
【０１１０】
筒体４０の材質は、ガラス製に限らず、プラスチック又は金属製のものなど他の材料を用いたものも適用できる。
【０１１１】
又、図９に示すように筒体４０の片側の開口部には、薄い樹脂により形成された透明フィルム６０を貼り付けたものも使用できる。この場合、剥離液／抽出液６１の注入・回収は、例えばスポイト、ピペット、シリンジ６２などを用いる。
【０１１２】
次に、透明フィルム６０を剥がし、剥離液／抽出液６１を筒体４０内に注入する。
【０１１３】
次に、透明フィルム６０により密閉した状態で剥離液／抽出液６１を反応させる。
【０１１４】
この後、透明フィルム６０を剥がし、例えばスポイト、ピペット、シリンジ６２などにより溶液を回収する。
【０１１５】
このようにすると筒体４０内への異物の混入を防止できる。
【０１１６】
上記第１の実施の形態は、例えばフローサイトメトリーなどの解析に有効であることを述べた。これに対して、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白の解析などの研究がある。この研究は、スライドガラス８からの細胞ａの剥離を必要としない。
【０１１７】
すなわち、図２に示すようにスライドガラス８上に筒体４０を接着固定する。次に、スライドガラス８をステージ６から取り外す。
【０１１８】
次に、図５に示すように筒体４０中に剥離剤４２に代えて細胞ａ中から直接採取目的とする試料、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白を抽出する溶液を注入する。この溶液は、例えば核酸抽出キットとして市販されているものなどを利用できる。
【０１１９】
溶液中に例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白などの試料が溶出すると、上記第１の実施の形態と同様に、スポイトなどで溶液中に溶出された試料を吸引し、新しい別の容器などに移し替える。
【０１２０】
このように採取した例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白を用いて、これら例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白の解析ができる。
【０１２１】
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。なお、図１と同一部分には同一部号を付してその詳しい説明は省略する。
【０１２２】
図７は本発明の細胞取得方法に用いる倒立型顕微鏡の構成図である。ＵＶレーザヘッド２３は、紫外領域の波長のレーザビームを出力する。ＵＶレーザヘッド２３から出力されるレーザビームは、標本７中に有する複数の細胞のうち採取したい細胞ａを残し、採取したい細胞ａ以外の不必要な標本部分を変質するエネルギに設定される。不必要な標本部分の変質は、核酸の断片化などにより、核酸又は細胞の基本的特性を変化させることである。
【０１２３】
ステージ６は、測長部５０を有する。測長部５０は、ステージ６のＸＹ方向に移動するＸＹ座標を測定し、ＸＹ座標測定信号を出力する。
【０１２４】
画像処理及びステージ制御装置１６は、測長部５０から出力されたＸＹ座標測定信号を入力し、ＸＹ座標測定信号から標本７に照射されるレーザビームの照射位置を算出する。
【０１２５】
画像処理及びステージ制御装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から出力された画像信号を画像処理して標本７の画像データを取得し、かつ画像データ中にレーザビームの照射位置を示す色付け表示部の画像データを重ね合わせる。色付け表示部は、例えば赤色が好ましい。
【０１２６】
画像処理及びステージ制御装置１６は、標本７の画像データとレーザビームの照射位置を示す色付け表示部の画像データとを重ね合わせてディスプレイ１７に表示する。
【０１２７】
次に、標本７中に存在する細胞ａの採取方法について説明する。
【０１２８】
上記第１の実施の形態と同様に、観察者は、ディスプレス１７に表示される標本７の拡大像又は接眼レンズ２２を覗いて標本７の拡大像を観察しながら例えば図８に示す標本７中から採取したい各細胞ａを決定する。
【０１２９】
次に、標本７中の採取すべき各細胞ａを残し、それ以外の細胞にレーザビームを照射する。
【０１３０】
採取したい細胞ａから離れた細胞は、大きなスポット径ｓ_２でレーザビームを照射する。
【０１３１】
次に、可変スリット２５により小さなスポット径ｓ_３にして、採取したい細胞ａの周りを丁寧に、すなわち細胞ａの周り沿って正確に照射して採取したい細胞ａだけを残す。
【０１３２】
上記第１の実施の形態では、レーザスポット径の大きさを可変スリット２５により調整したが、本第２の実施の形態では、不要な細胞の核酸を断片化するだけのレーザエネルギを有すればよい。核酸を断片化するレーザエネルギは、細胞ごと取り除くエネルギよりも小さい。これにより、レーザヘッド２３に代って水銀ランプなどを用いて不要な細胞の核酸を断片化させ、核酸又は細胞の基本的特性を変化させることが可能である。又、レーザ用対物レンズ５は、低倍率のものに切り換えてレーザスポット径を大きくすることができる。
【０１３３】
レーザ用対物レンズ５は、例えば低倍率の５倍程度に切り換える。
【０１３４】
一方、測長部５０は、ステージ６のＸＹ方向に移動するＸＹ座標を測定し、ＸＹ座標測定信号を出力する。
【０１３５】
画像処理及びステージ制御装置１６は、測長部５０から出力されたＸＹ座標測定信号を入力し、ＸＹ座標測定信号から標本７に照射されるレーザビームの照射位置を算出する。
【０１３６】
画像処理及びステージ制御装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から出力された画像信号を画像処理して標本７の画像データを取得し、この画像データとレーザビームの照射位置を示す例えば赤色の色付け表示部の画像データとを重ね合わせる。
【０１３７】
画像処理及びステージ制御装置１６は、標本７の画像データとレーザビームの照射位置を示す色付け表示部の画像データとを重ね合わせてディスプレイ１７に表示する。
【０１３８】
観察者は、操作部１８を操作し、ディスプレス１７に表示されている標本７の画像とレーザビームの照射位置を示す色付け表示部とを確認しながら、スポット径ｓ_２のレーザビームの照射位置を各細胞ａの周辺部分に１ショット毎に移動させる。
【０１３９】
スポット径ｓ_２のレーザビームの照射は、各細胞ａの周囲の標本７に対して行う。なお、図８においてスポット径ｓ_２のレーザビームの照射位置を全て図示することはしていない。
【０１４０】
スポット径ｓ_２のレーザビームの照射された標本７の部分は、核酸などの断片化により核酸又は細胞の基本特性が変化する。
【０１４１】
次に、ＵＶレーザヘッド２１の可変スリット２２は、円形の開口部の径を例えば図８に示すように細胞ａよりも小さいスリット幅Ｓ_３に設定する。これにより、標本７上に照射されるレーザビームのスポット径はｓ_３になる。
【０１４２】
なお、レーザ用対物レンズ５を高倍率例えば倍率５０倍程度に切り換え、レーザ用対物レンズ５の前方にＮＤフィルタを配置してもよい。
【０１４３】
観察者は、ディスプレス１７に表示されている標本７を観察しながら各細胞ａを残し、各細胞ａに隣接する周囲の標本７を変質させるレーザビームの各照射ルートＲ_３、Ｒ_４を決定する。
【０１４４】
観察者は、ディスプレス１７に表示される標本７の画像とレーザビームの照射位置を示す色付け表示部を確認しながら、レーザビームの照射位置を照射ルートＲ_３又はＲ_４上になるように操作部１８を操作する。
【０１４５】
画像処理及びステージ制御装置１６は、操作部１８からのステージ６の移動方向及び移動量の操作に応じた操作指令を受け、操作指令に従ったステージ６の移動制御信号をステージ駆動部９に送出する。
【０１４６】
これにより、ステージ６は、例えば１ショットのレーザビーム毎に、照射ルートＲ_２又はＲ_３上になるようにＸＹ方向に移動する。
【０１４７】
ＵＶレーザヘッド２３から例えば１ショット毎にレーザビームが出力されると、レーザビームは、ＵＶ結像レンズ２４、ダイクロイックミラー４、レーザ用対物レンズ５を通って照射ルートＲ_３上に照射され、続いて照射ルートＲ_４上に照射される。なお、レーザビームは、照射ルートＲ_４上に照射し、続いて照射ルートＲ_３上に照射してもよい。
【０１４８】
レーザビームのエネルギは、各細胞ａに隣接する周囲の標本７を変質させる程度に設定されている。従って、レーザビームの照射された各照射ルートＲ_３、Ｒ_４上の標本７の部分は、核酸などの断片化により核酸又は細胞の基本特性が変化する。
【０１４９】
なお、各照射ルートＲ_３、Ｒ_４のＸＹ座標位置は、予め画像処理及びステージ制御装置１６に記憶させてもよい。すなわち、レーザビームの各照射ルートＲ_３、Ｒ_４が決定された後、観察者は、操作部１８を操作してステージ６をＸＹ方向に移動し、レーザビームの照射位置を示す色付け表示部を各照射ルートＲ_３、Ｒ_４毎に従ってそれぞれ移動させる。
【０１５０】
このとき、画像処理及びステージ制御装置１６は、操作部１８からのステージ６の移動方向及び移動量を読み取り、これら移動方向及び移動量からステージ６の各照射ルートＲ_３、Ｒ_４毎のＸＹ座標位置をそれぞれ算出する。画像処理及びステージ制御装置１６は、算出した各照射ルートＲ_３、Ｒ_４毎のＸＹ座標位置を内部メモリに記憶する。
【０１５１】
画像処理及びステージ制御装置１６は、内部メモリに記憶された各照射ルートＲ_３、Ｒ_４毎のＸＹ座標位置を読み出し、このＸＹ座標位置に従ってステージ６の移動制御信号をステージ駆動部９に送出する。
【０１５２】
ステージ６は、自動的にレーザビームの照射位置を各照射ルートＲ_３、Ｒ_４毎にそれぞれＸＹ方向に移動する。これと共にＵＶレーザヘッド２３は、所定期間毎に１ショットのレーザビームを出力する。
【０１５３】
これにより、各照射ルートＲ_３、Ｒ_４上の標本７の部分は、自動的にレーザビームの照射を受けて細胞内の核酸などの断片化により、核酸又は細胞の基本的特性が変化する。
【０１５４】
次に、上記第１の実施の形態と同様に、図２に示す筒体４０が用意される。筒体４０は、スライドガラス８上に接着固定される。
【０１５５】
次に、図５に示すように筒体４０中に細胞ａ中から試料、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白を抽出する溶液が注入される。
【０１５６】
溶液中に例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白などの試料が溶出すると、試料は、スポイトなどにより吸引され、新しい別の容器などに移し替えられる。
【０１５７】
一方、細胞ａをスライドガラス８上から剥離する場合、図２に示すように筒体４０は、接着剤４１によりスライドガラス８上に接着固定される。
【０１５８】
次に、剥離剤４２が図５に示すように筒体４０とスライドガラス８とにより形成される容器内に注入される。剥離剤４２は、図６に示すようにスライドガラス８からの細胞ａの剥離を促進する。
【０１５９】
次に、剥離剤４２中に浮遊する細胞ａは、剥離剤４２と共にスポイトなどにより吸引される。スポイトにより吸引された細胞ａは、新しい別の容器などに移し替えられる。この結果、細胞ａの採取が終了する。
【０１６０】
このように上記第２の実施の形態によれば、標本７における採取したい細胞ａ以外の不要な標本部分ｄに対してレーザビームを照射し、不要な標本部分ｄの核酸などを断片化させ、核酸又は細胞の基本特性を変化させる。
【０１６１】
この後、筒体４０中に細胞ａ中から試料、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白を抽出する溶液を注入し、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白などの試料を溶出する。又、筒体４０とスライドガラス８とにより形成される容器内に剥離剤４２を注入し、採取したい細胞ａをスライドガラス８から剥離して剥離剤４２中に浮遊させて採取する。
【０１６２】
このように第２の実施の形態は、レーザビームを照射して不要な標本部分ｄの細胞の核酸などを断片化し、核酸又は細胞の基本特性を変化させるので、主に生の標本７から例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）や蛋白などの試料を抽出する場合に有効である。
【０１６３】
生の標本は、水分を含んでいる。生の標本７にエネルギの大きいレーザビームを照射すると、標本７中の水分の沸騰により標本７がカットできない。
【０１６４】
これに対して第２の実施の形態におけるレーザビームのエネルギは、不要な標本部分ｄの核酸などを断片化させ、核酸又は細胞の基本特性を変化させるのに必要なエネルギである。レーザビームのエネルギは、実験結果として例えばＤＮＡの断片化の場合には、波長２６６ｎｍで、６０μｍ四方の正方形の面積に対して０．０７５ｍＪを得ている。なお、レーザビームのエネルギは、０．０７５ｍＪよりも小さくても核酸などを断片化し、核酸又は細胞の基本特性を変化させることを可能とする。
【０１６５】
採取するに必要な細胞ａ以外の不要な標本部分を変質する場合、先ず、各細胞ａの周りの不要な標本部分ｄに大きなスポット径ｓ_２のレーザビームを照射し、次に、各細胞ａに隣接する周囲の不要な標本部分ｄに小さいスポット径ｓ_３のレーザビームを照射する。これにより、不要な標本部分ｄに照射するレーザビームの回数を少なくできる。広い領域の不要な標本部分ｄの変質が短時間でできる。
【０１６６】
上記第１の実施の形態のように不要な標本部分ｄをスライドガラス８上から飛ばす場合、レーザ用対物レンズ５は、一般的に倍率５０倍程度を用いる。これに対して上記第２の実施の形態は、倍率５倍程度のレーザ用対物レンズ５を用いればよい。これにより、上記第２の実施の形態は、倍率５０倍のレーザ用対物レンズ５を用いた場合と比較して、レーザビームのスポット領域を１００倍に広げることができる。
【０１６７】
不要な標本部分ｄの細胞を変質するので、レーザビームを標本７に照射したときに標本７の破片が飛び散ることはない。これにより、エアーブロー３０及びエアー吸引機３１は、不要になる。
【０１６８】
ディスプレイ１７には、標本７の画像データ中にレーザビームの照射位置を示す例えば赤色の色付け表示部の画像データを重ね合わせて表示する。観察者は、ディスプレイ１７の画像を確認しながら標本７にレーザビームを照射できる。これにより、採取する細胞ａに隣接する周囲及びその他の不要な標本部分ｄを確実に変質できる。
【０１６９】
上記第２の実施の形態では、レーザビームのエネルギを細胞を変質する程度に設定しているが、光源として例えば、水銀ランプ又はキセノンランプを用いてもよい。水銀ランプ又はキセノンランプから放射される光を細胞に照射しても、核酸などを断片化し、核酸又は細胞の基本特性を変化させることは可能である。
【０１７０】
なお、本発明は、上記第１及び第２の実施の形態に限定されるものでなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。
【０１７１】
さらに、上記実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１７２】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明によれば、採取したい細胞を確実に、しかも効率よく採取できる細胞単離方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞単離方法の第１の実施の形態に用いる倒立型顕微鏡の構成図。
【図２】本発明の第１の実施の形態における細胞の採取に用いる筒体を示す図。
【図３】本発明の第１及び第２の実施の形態における細胞のトリミングを示す図。
【図４】本発明の第１及び第２の実施の形態における細胞のトリミングを示す図。
【図５】本発明の第１及び第２の実施の形態における剥離剤の注入を示す図。
【図６】本発明の第１及び第２の実施の形態における細胞の剥離した状態を示す図。
【図７】本発明の細胞取得方法の第２の実施の形態に用いる倒立型顕微鏡の構成図。
【図８】本発明の第１及び第２の実施の形態における不要な細胞へのレーザ照射を示す図。
【図９】本発明の第１及び第２の実施の形態における細胞の採取方法の一例を示す図。
【符号の説明】
１：照明用光源、２：視野絞り、３：開口絞り、４：ダイクロイックミラー、５：レーザ用対物レンズ、６：ステージ、７：標本、８：スライドガラス、６ａ，６ｂ：モータ、９：ステージ駆動部、１０：観察用対物レンズ、１１：ダイクロイックミラー、１２：ＵＶバリアフィルタ、１３：結像レンズ、１４：ハーフミラー、１５：ＣＣＤカメラ、１６：画像処理及びステージ制御装置、１７：ディスプレイ、１８：操作部、１９：ミラー、２０：リレーレンズ、２１：ＵＶカットフィルタ、２２：接眼レンズ、２３：ＵＶレーザヘッド、２４：ＵＶ結像レンズ、２３ａ：レーザ光源、２５：可変スリット、２６：ＬＥＤ、２７：ダイクロイックミラー、２８：蛍光励起用光源、２９：ＵＶバンドパスフィルタ、３０：エアーブロー、３１：エアー吸引機、４０：筒体、４１：接着剤、４２：剥離剤、５０：測長部、６０：透明フィルム、６１：剥離液／抽出液、６２：スポイト，ピペット，シリンジ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell isolation method for selecting a specific cell or cell population to be analyzed from a specimen on a substrate and isolating a cell or a sample to be analyzed in the cell for separation and acquisition.
[0002]
[Prior art]
Research to analyze the function of genes is currently the most interesting. In the study of gene function analysis, cells are obtained from specimens. Samples for analysis of gene function are taken directly from the cells. Various devices for collecting cells or samples have been developed and used.
[0003]
Various cell collection methods for collecting cells from specimen sections will be described.
[0004]
(1) A sliced specimen is fixed on a thin film plate. The sliced specimen has cells that are desired to be collected in order to analyze the function of the gene, for example. A laser beam (UV laser beam) in the ultraviolet wavelength region is irradiated onto the thin film plate along the outline of the cell. Thereby, the cells to be collected in the specimen are separated together with the thin film plate.
[0005]
Next, a UV laser beam out of focus with respect to the thin film plate is irradiated to the cut-off portion. Thereby, the separation part in a sample is skipped. As a result, the cells to be collected are obtained. For example, patent document 1 is mentioned.
[0006]
(2) A transparent cap for collection with a transfer film attached thereto is used. The transparent cap is placed on the specimen having the cells to be collected. An IR laser beam passes through the transparent cap and irradiates a portion of the specimen having cells to be collected. Thereby, the cell part to be collected adheres to the transfer film surface. For example, Patent Documents 2, 3, and 4 are cited.
[0007]
(3) The specimen is stuck on the film. The surface on which the specimen is pasted on the film is directed downward. In this state, a UV laser beam is irradiated along the outline of the cell from above. Thereby, the circumference | surroundings of the cell to extract | collect are cut off.
[0008]
Next, the film is irradiated with a UV laser beam. As a result, the cells to be collected are dropped from the film into a tray set downward. For example, Patent Documents 5 and 6 are cited.
[0009]
[Patent Document 1]
US Pat. No. 5,998,129
[0010]
[Patent Document 2]
JP 2000-266649 A
[0011]
[Patent Document 3]
Special table 2001-519898 gazette
[0012]
[Patent Document 4]
JP-T-2002-503345
[0013]
[Patent Document 5]
JP 2002-174778 A
[0014]
[Patent Document 6]
JP 2002-156316 A
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the method (1), after the cells to be collected are cut off together with the thin film plate, the cut-off portion is skipped by irradiating a UV laser beam out of focus. This makes it difficult to know where the cells to be collected have gone. Often cells are lost. In addition, alteration of cells by a UV laser beam is also expected.
[0016]
Moreover, foreign substances such as dust are likely to be mixed into the collected cells. It is necessary to fix the specimen on the thin film plate in advance. For this reason, the work of collecting cells requires labor and is troublesome.
[0017]
In the method (2), the cells to be collected in the specimen are irradiated with the IR laser beam through the transparent cap. For this reason, the spot diameter of the IR laser beam applied to the cells to be collected cannot be reduced. The spot diameter of the IR laser beam may be larger than the size of the cell to be collected. When a laser beam having a spot diameter larger than the size of the cells to be collected is irradiated, unnecessary cells around the cells to be collected also adhere to the transfer film surface. For example, when collecting extremely small cells of 5 microns or less with a spot diameter of 10 microns, surrounding unnecessary cells also adhere to the transfer film surface.
[0018]
Since the cells to be collected are attached to the transfer film surface, depending on how the cells are thirsty, the cells cannot be attached well to the transfer film surface, and the cells may not be collected. It is impossible to collect wet cells. Adhesion of cells to the transfer film surface is affected by cell conditions such as cell thirst. In other words, in order to be able to collect cells, it is limited to cell conditions.
[0019]
When the output of the IR laser beam applied to the specimen is increased, the efficiency of collecting the cells by attaching the cell portion to the transfer film surface is improved. On the other hand, if the output of the IR laser beam is increased, the cells are burnt.
[0020]
In the method (3), a cell portion collected by irradiation with a UV laser beam is dropped into a tray set below. This makes it difficult to know where the cells to be collected have gone. Moreover, foreign substances such as dust are likely to be mixed into the acquired cells. Cell alteration by UV laser beam is also expected.
[0021]
Summarizing the above problems,
(A) It takes time to collect cells to be collected. In addition, cells are easily lost during collection.
[0022]
(B) It is difficult to obtain small cells. The cells that can be collected are limited from the dry state of the specimen.
[0023]
(C) A sufficient amount of cells cannot be obtained in a short time due to deterioration of the cells caused by the UV laser beam.
[0024]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a cell isolation method capable of reliably and efficiently collecting cells to be collected.
[0025]
[Means for Solving the Problems]
The present invention irradiates a specimen having cells placed on a substrate with a laser beam to remove unnecessary specimen parts other than the cell parts from the substrate, and uses a cylindrical body having openings at both ends. A cell portion is placed in one opening of the tubular body, the tubular body is placed on the substrate, and a release agent is injected into a container formed by the substrate and the tubular body to place the cell portion on the substrate. This is a cell isolation method in which a cell portion that is detached from the cell and floats in the release agent is collected.
[0026]
The present invention irradiates a specimen having cells placed on a substrate with a laser beam to remove unnecessary specimen parts other than the cell parts from the substrate, and uses a cylindrical body having openings at both ends. A cell part is placed in one opening of the cylindrical body, the cylindrical body is placed on the substrate, and a solution that elutes the sample present in the cells in a container formed by the substrate and the cylindrical body. This is a cell isolation method for isolating a cell from which a sample to be injected and eluted in a solution is collected or a sample to be analyzed in the cell.
[0027]
The present invention uses a cylindrical body that has an opening at each end by irradiating a specimen having cells placed on a substrate with a laser beam to alter unnecessary specimen parts other than the cellular part. Place the cell part in one opening in the body, place the cylindrical body on the substrate, and inject the release agent into the container formed by the substrate and the cylindrical body to peel the cell part from the substrate This is a cell isolation method for collecting a cell part floating in a release agent.
[0028]
The present invention uses a cylindrical body having an opening at each end by irradiating a specimen having cells placed on a substrate with ultraviolet light to alter unnecessary specimen parts other than the cellular part. Place the cell part in one opening in the body, place the cylindrical body on the substrate, and inject the release agent into the container formed by the substrate and the cylindrical body to peel the cell part from the substrate A cell isolation method for isolating a cell from which a cell part floating in a release agent is collected or a sample to be analyzed in the cell.
[0029]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A first embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
[0030]
FIG. 1 is a configuration diagram of an inverted microscope used in the cell acquisition method of the present invention. For example, a halogen lamp is used as the illumination light source 1. The illumination light source 1 outputs visible light. A field stop 2, an aperture stop 3, and a dichroic mirror 4 are provided on the optical path of visible light output from the illumination light source 1.
[0031]
The field stop 2 and the aperture stop 3 constitute an optical system of a general microscope. The dichroic mirror 4 reflects visible light toward the lower side of the optical axis p.
[0032]
A laser objective lens 5 is provided on the reflected light path (optical axis p) of the dichroic mirror 4. The laser objective lens 5 condenses the visible light output from the illumination light source 1 and irradiates the sample 7. The laser objective lens 5 functions as a condenser lens.
[0033]
The stage 6 is provided on the reflected light path of the dichroic mirror 4. A slide glass 8 on which the specimen 7 is placed is placed on the stage 6. The stage 6 has motors 6a and 6b in the X direction and the Y direction. The stage 6 moves in the X direction by driving the motor 6a in the X direction. The stage 6 moves in the Y direction by driving the motor 6b in the Y direction. The stage drive unit 9 drives the motors 6a and 6b in the X direction and the Y direction.
[0034]
The specimen 7 is a tissue section, a cultured cell, or the like, and is used, for example, for gene function analysis. In the case of obtaining cells while fluorescently observing the nucleus of the cells by fluorescent staining, the specimen 7 is preliminarily coated with a fluorescent dye.
[0035]
An observation objective lens 10, a dichroic mirror 11, a UV barrier filter 12, an imaging lens 13, and a half mirror 14 are provided on the optical axis p that transmits the sample 7.
[0036]
The CCD camera 15 is provided on the reflected light path of the half mirror 14. The CCD camera 15 is disposed at the imaging position of the imaging lens 13 via the half mirror 14. The CCD camera 15 captures an image formed by the imaging lens 13 and outputs an image signal.
[0037]
The image processing and stage control device 16 receives the image signal output from the CCD camera 15, performs image processing on the image signal, acquires image data, and displays the image data on the display 17.
[0038]
The image processing and stage control device 16 connects an operation unit 18 such as a keyboard and a mouse. The operation unit 18 receives the operation of the moving direction and moving amount of the stage 6 by the observer and generates this operation command. The image processing and stage control device 16 receives an operation command from the operation unit 18 and sends a movement control signal for the stage 6 in accordance with the operation command to the stage drive unit 9.
[0039]
A mirror 19 is provided on the transmitted light path of the half mirror 14. A relay lens 20, a UV cut filter 21, and an eyepiece lens 22 are provided on the reflected light path of the mirror 19.
[0040]
On the other hand, a UV laser head 23 is provided on the optical axis p passing through the laser objective lens 5 and the dichroic mirror 4. A UV imaging lens 24 is provided on the optical axis p between the UV laser head 23 and the dichroic mirror 4.
[0041]
The UV laser head 23 has a laser light source 23a. The UV laser head 23 outputs a laser beam having a wavelength in the ultraviolet region. The laser beam output from the UV laser head 23 removes unnecessary cells other than the cells to be collected from the slide glass 8 among the plurality of cells in the sample 7.
[0042]
The energy of the laser beam output from the UV laser head 23 is set such that unnecessary cells on the slide glass 8 are removed from the slide glass 8.
[0043]
The UV laser head 23 has a variable slit 25 and an LED 26. The variable slit 25 has, for example, a circular or quadrangular opening. The variable slit 25 can change the size of the diameter of the opening. The variable slit 25 varies the spot diameter of the laser beam output from the UV laser head 23.
[0044]
The LED 26 outputs LED light. The LED light is light having a wavelength of visible light, for example, red visible light.
[0045]
A dichroic mirror 27 is provided on the optical path of the LED light. The dichroic mirror 27 reflects the LED light output from the LED 26 toward the optical axis p of the laser beam output from the UV laser head 23.
[0046]
As a result, the LED light passes through the dichroic mirror 27 that is transparent to the wavelengths of the LED light and the UV laser beam, and is irradiated to the same position as the laser beam irradiation position on the specimen 7. The red LED light irradiated on the sample 7 displays the irradiation position of the laser beam irradiated on the sample 7.
[0047]
A fluorescence excitation light source 28 and a UV band pass filter 29 are provided on the reflected light path of the dichroic mirror 11. The fluorescence excitation light source 28 is provided below the stage 6. The fluorescence excitation light source 28 outputs ultraviolet light. The fluorescence excitation light source 28 is, for example, a mercury lamp.
[0048]
The ultraviolet light output from the fluorescence excitation light source 28 passes through the UV band-pass filter 29, is reflected by the dichroic mirror 11, and irradiates the specimen 7 through the observation objective lens 10. The ultraviolet light output from the fluorescence excitation light source 28 excites the fluorescent dye previously applied to the specimen 7.
[0049]
The air blow 30 is provided obliquely above the stage 6. The air blow 30 blows air toward the specimen 7 placed on the stage 6. When unnecessary cells in the specimen 7 are removed from the slide glass 8, unnecessary cell fragments are generated. Unnecessary cell fragments are blown off from the slide glass 8 by the air blown by the air blow 30.
[0050]
The air suction device 31 is provided obliquely above the stage 6. The air suction machine 31 faces the air blow 30 via the specimen 7 on the stage 6, for example. The air suction device 31 sucks air and sucks the cell debris blown by the air blowing of the air blow 30.
[0051]
Next, a method for collecting cells present in the specimen 7 will be described.
[0052]
The specimen 7 is placed on the slide glass 8. The slide glass 8 is placed on the stage 6.
[0053]
The illumination light source 1 outputs visible light. Visible light passes through the field stop 2 and the aperture stop 3, is reflected by the dichroic mirror 4, and irradiates the sample 7 through the laser objective lens 5. Part of the visible light irradiated on the specimen 7 passes through the specimen 7.
[0054]
The light transmitted through the specimen 7 passes through the observation objective lens 10, passes through the dichroic mirror 11 and the UV barrier filter 12, and is imaged by the imaging lens 13.
[0055]
The CCD camera 15 captures an enlarged image of the specimen 7 imaged by the imaging lens 13 via the half mirror 14 and outputs an image signal.
[0056]
The image processing and stage control device 16 receives the image signal output from the CCD camera 15, performs image processing on the image signal, acquires image data, and displays the image data on the display 17.
[0057]
At the same time, the image of the specimen 7 imaged by the imaging lens 13 is reflected by the mirror 19 and enters the eyepiece 22 through the relay lens 20 and the UV cut filter 21. The observer visually observes the enlarged image of the specimen 7 by looking through the eyepiece 22.
[0058]
The observer determines a cell to be collected from the specimen 7 while observing the magnified image of the specimen 7 displayed on the display 17 or the eyepiece 22 and observing the magnified image of the specimen 7.
[0059]
When the cell a is collected from the sample 7, the cylinder 40 shown in FIG. 2 is used. The cylinder 40 is made of, for example, plastic, metal, or glass material. The cylinder 40 is formed in a cylindrical shape, and circular openings are formed at both ends. The diameter of the cylinder 40 should just be larger than the cell a to extract | collect. As an example, the cylinder 40 has an outer diameter of 4 to 11 mm, an inner diameter of 3 to 10 mm, and a length of 5 to 10 mm. The size of the cylinder 40 may be smaller than an example size.
[0060]
If the specimen 7 is larger than the inner diameter of the cylinder 40, the specimen portion d having the cells a to be collected is trimmed. If the shape of the opening of the cylindrical body 40 is circular, the specimen portion d having the collected cells a in the specimen 7 is trimmed into a circle as shown in FIG. If the sample 7 is smaller than the inner diameter of the cylinder 40, trimming is not necessary.
[0061]
The cylindrical body 40 is not limited to having circular openings, but may have openings having other shapes. For example, when the shape of the opening of the cylinder 40 is a quadrilateral shape, the shape of the specimen portion d to be trimmed is a quadrilateral shape having cells a to be collected in the specimen 7 as shown in FIG.
[0062]
The trimming of the specimen part d having the cells a to be collected will be described.
[0063]
The variable slit 22 of the UV laser head 21 uses, for example, a circular opening. The variable slit 22 has a slit diameter that is, for example, as shown in FIG. ₁ Is approximately equivalent to the spot diameter s ₁ Set to be.
[0064]
On the other hand, red LED light is output from the LED 26. The LED light is reflected by the dichroic mirror 27 and enters the variable slit 25. The LED light passes through the opening of the variable slit 25, thereby causing a spot diameter s. ₁ It is formed into a circular LED light.
[0065]
Spot diameter s ₁ The sample 7 is irradiated to the specimen 7 through the UV imaging lens 24 and the laser objective lens 5. The spot diameter s transmitted through the dichroic mirror 4 at this time ₁ LED light travels on the optical axis p of the laser beam output from the UV laser head 23. Spot diameter s ₁ The LED light irradiates the same position as the laser beam irradiation position on the specimen 7 in red.
[0066]
The CCD camera 15 captures an enlarged image of the sample 7 and outputs an image signal. The image processing and stage control device 16 receives the image signal output from the CCD camera 15 and performs image processing on the image signal to obtain image data, and the red spot diameter s ₁ The image data of the specimen 7 irradiated with the LED light is displayed on the display 17.
[0067]
An observer observes the specimen 7 displayed on the display 15, leaves the specimen portion d, and removes the portion of the specimen 7 around the specimen portion d from the slide glass 8. ₁ To decide.
[0068]
Laser beam irradiation route R ₁ When the cylindrical body 40 having a circular opening is used, it is circular as shown in FIG. Laser beam irradiation route R ₁ Is a quadrilateral as shown in FIG. 4 when a cylinder 40 with a quadrilateral opening is used.
[0069]
Next, the UV laser head 23 outputs a laser beam for each shot, for example. The energy of the laser beam is set to such an extent that an unnecessary outer peripheral portion of the specimen portion d on the slide glass 8 is removed from the slide glass 8. Note that the energy of the laser beam is preferably set so that unnecessary portions other than the cells a to be collected are completely blown out even if there is some moisture in the surrounding environment.
[0070]
The laser beam passes through the UV imaging lens 24, the dichroic mirror 4, and the laser objective lens 5, and the irradiation route R of the specimen 7. ₁ Irradiated on top.
[0071]
The observer looks at the irradiation position of the LED light on the specimen 7 displayed on the display 17 or the eyepiece 22 and confirms the irradiation position of the LED light. The observer sets the irradiation position of the LED light to the irradiation route R. ₁ The operation unit 18 such as a keyboard and a mouse is operated while confirming that it is on the top.
[0072]
The image processing and stage control device 16 receives an operation command corresponding to the operation of the moving direction and moving amount of the stage 6 from the operation unit 18 and sends a movement control signal for the stage 6 according to the operation command to the stage driving unit 9. To do.
[0073]
The stage 6 irradiates the irradiation position of the LED light on the sample 7 for each laser beam of one shot, for example, an irradiation route R. ₁ Move in the XY direction so that it goes up. Due to the movement of the stage 6 in the X and Y directions, the laser beam for each shot is applied to the irradiation route R on the specimen 7, respectively. ₁ Irradiated while moving up.
[0074]
Irradiation route R irradiated with laser beam ₁ Each part of the upper specimen 7 is removed from the glass slide 8. Thereby, as shown in FIG. 3, the specimen portion d having the cells a to be collected is trimmed into a circle. Further, as shown in FIG. 4, the specimen portion d having the cells a to be collected is trimmed into a quadrilateral.
[0075]
Each irradiation route R ₁ , R ₂ These XY coordinate positions may be stored in advance in the image processing and stage control device 16. That is, each irradiation route R of the laser beam ₁ , R ₂ Is determined, the sample 7 is irradiated with LED light. The observer operates the operation unit 18 to move the stage 6 in the XY directions, and irradiates the LED light with the irradiation route R. ₁ , R ₂ Move according to.
[0076]
At this time, the image processing and stage control device 16 reads the moving direction and moving amount of the stage 6 from the operation unit 18, and the irradiation route R of the stage 6 from these moving direction and moving amount. ₁ , R ₂ XY coordinate position is calculated. The image processing and stage control device 16 calculates the calculated irradiation route R ₁ , R ₂ Are stored in the internal memory.
[0077]
The image processing and stage control device 16 has each irradiation route R stored in the internal memory. ₁ , R ₂ XY coordinate position is read out, and a movement control signal for the stage 6 is sent to the stage drive unit 9 in accordance with the XY coordinate position.
[0078]
Stage 6 automatically sets the irradiation position of the laser beam to the irradiation route R. ₁ , R ₂ Move in the XY direction so that it goes up. At the same time, the UV laser head 23 outputs one shot of the laser beam every predetermined period.
[0079]
Irradiation route R irradiated with laser beam ₁ , R ₂ The portion of the upper specimen 7 is removed from the slide glass 8. Thereby, as shown in FIG. 3, the specimen portion d having the cells a to be collected is automatically trimmed into a circle. Further, as shown in FIG. 4, the specimen portion d having the cells a to be collected is automatically trimmed into a quadrilateral.
[0080]
When the sample 7 is irradiated with the laser beam, a piece of the sample 7 is cut out. The cut pieces are scattered, for example, above the slide glass 8.
[0081]
The air blow 30 blows air above the slide glass 8. The broken pieces of the specimen 7 scattered above the slide glass 8 are blown from above the slide glass 8 by the air blown from the air blow 30.
[0082]
The air suction device 31 sucks air and sucks the broken pieces of the specimen 7 blown by the air blow 30.
[0083]
Thereby, the fragments of the specimen 7 scattered above the slide glass 8 are removed from the slide glass 8.
[0084]
The trimming of the specimen portion d may be performed by the following method.
[0085]
The specimen 7 is previously applied with a fluorescent dye.
[0086]
The fluorescence excitation light source 28 emits ultraviolet light. The ultraviolet light emitted from the fluorescence excitation light source 28 passes through the UV band-pass filter 29 and enters the dichroic mirror 11. The ultraviolet light is reflected upward by the dichroic mirror 11 and applied to the specimen 7 through the observation objective lens 10. The fluorescent dye applied to the specimen 7 is excited to emit light.
[0087]
The fluorescence from the specimen 7 passes through the observation objective lens 10 through the dichroic mirror 11 and the UV barrier filter 12 and is imaged by the imaging lens 13.
[0088]
The CCD camera 15 captures an enlarged image and fluorescence of the specimen 7 and outputs an image signal. The image processing and stage control device 16 receives the image signal output from the CCD camera 15, performs image processing on the image signal to acquire image data, and displays the image data of the sample 7 that emits fluorescence on the display 17.
[0089]
At the same time, the image and fluorescence of the sample 7 are reflected by the mirror 19 and enter the eyepiece 22 through the relay lens 20 and the UV cut filter 21. Thereby, the observer visually observes an enlarged image of the specimen 7 that emits fluorescence by looking into the eyepiece lens 22.
[0090]
The observer looks at the magnified image and fluorescence of the specimen 7 displayed on the display 17 or the magnified image and fluorescence of the specimen 7 by looking through the eyepiece 22. The observer can determine the cell a to be collected from the sample 7 while observing the magnified image and fluorescence of the sample 7.
[0091]
Since the fluorescent dye applied to the specimen 7 emits light, it is easier to determine the cell a to be collected as compared with the case where visible light is used. It is also possible to automatically select a cell a to be collected by image recognition using a computer.
[0092]
Next, a procedure for leaving only the cell a to be collected from the sample d having the cell a to be collected and removing other cells will be described with reference to FIG.
[0093]
The variable slit 25 maximizes the diameter of the opening. The variable slit 25 increases the spot diameter of the laser beam output from the UV laser head 23. As shown in FIG. 8, the cell a away from the cell a to be collected has a large spot diameter s. ₂ The laser beam is irradiated.
[0094]
Next, the variable slit 25 reduces the size of the diameter of the opening. Around the cell a to be collected, a small spot diameter s ₃ The laser beam is carefully irradiated, that is, accurately irradiated around the cell a. Only the cells a to be collected remain.
[0095]
Next, the cylinder 40 shown in FIG. 2 is prepared. An adhesive 41 is applied to one opening of the cylindrical body 40. Adhesion between the cylindrical body 40 and the substrate such as the slide glass 8 uses, for example, grease, paraffin, or various adhesives that are not affected by the solution for peeling or extraction. You may use the disposable thick seal | sticker or cylinder which apply | coated the adhesive agent previously.
[0096]
The cylindrical body 40 is erected vertically on the upper surface of the slide glass 8 with one opening directed downward. When the cylindrical body 40 is erected on the upper surface of the slide glass 8, the specimen portion d having the cells a is placed in one opening.
[0097]
Next, the cylinder 40 is lightly pressed against the slide glass 8 side. Thereby, adhesion with the cylinder 40 and the slide glass 8 will be in a reliable state. When the adhesive 41 is cured, a liquid-tight container is formed by the cylindrical body 40 and the slide glass 8. The cylindrical body 40 and the slide glass 8 are removed from the stage 6.
[0098]
Next, as shown in FIG. 5, the release agent 42 is injected into a container formed by the cylindrical body 40 and the slide glass 8. The release agent 42 is, for example, an organic solvent such as xylene or a surfactant. The release agent 42 promotes the release of the cells a from the slide glass 8. FIG. 6 shows the cells a detached from the slide glass 8. The detached cells a float in the release agent 42.
[0099]
Next, the cells a floating in the release agent 42 are sucked together with the release agent 42 by a dropper or the like. The cells a sucked by the dropper are transferred to another new container or the like. As a result, the collection of the cells a is completed.
[0100]
As described above, in the first embodiment, the sample portion d smaller than the inner diameter of the opening of the cylinder 40 is placed in the opening, and the cylinder 40 is erected on the slide glass 8. And the slide glass 8 are formed in a liquid-tight manner by an adhesive 41, a release agent 42 is injected into a container formed by the cylindrical body 40 and the slide glass 8, and the cells a to be collected are peeled from the slide glass 8. Then, the sample is suspended in the release agent 42 and collected.
[0101]
Therefore, the cell a to be collected in the sample 7 can be reliably collected. As a result, the location where the cell a has gone is not lost as in the prior art. It is possible to eliminate the loss of the cells a. It is possible to reliably prevent foreign substances such as dust from entering the collected cells a.
[0102]
In the first embodiment, since the specimen 7 is first placed on the slide glass 8, no special thin film plate or film is used as in the prior art. The work of attaching the specimen 7 to a thin film plate or film can be eliminated. Thereby, the said 1st Embodiment can simplify the collection | recovery operation | work of the cell a, and can be performed efficiently. Moreover, it is economically advantageous.
[0103]
In the first embodiment, since the conventional transparent cap for collecting cells is not used, the spot diameter of the laser beam can be reduced. Therefore, even if the cell a to be collected is extremely small, the cell a to be collected can be left and the other cells can be irradiated with the laser beam.
[0104]
The first embodiment does not use a special material such as a transfer film. Therefore, the work is saved and the cost of consumables can be reduced.
[0105]
Generally, when analyzing the function of a cell or a gene contained in the cell, it is required to increase the purity of the sample by reducing contamination of cells other than the target cell or the gene thereof. In addition, since it takes time to select and acquire the necessary cells from the specimen section, there is a need for efficient cell acquisition.
[0106]
On the other hand, according to the first embodiment, since unnecessary cells can be removed and a large number of necessary cells can be acquired at a time, a high-purity sample can be acquired efficiently.
[0107]
In the first embodiment, the release agent 42 is injected into the cylinder 40, and the cells a to be collected are detached from the slide glass 8 and suspended in the release agent 42 and collected. This cell collection method is effective for studies requiring the retention of the shape of the nucleus of the cell a as much as possible, for example, analysis such as flow cytometry.
[0108]
The first embodiment can be implemented with appropriate modifications.
[0109]
For example, the adhesive 41 is not necessarily used between the cylinder 40 and the slide glass 8. When the adhesive 41 is not used, for example, a thin grease may be applied to the opening of the cylindrical body 40. Thereby, the release agent 42 may be prevented from leaking between the cylindrical body 40 and the slide glass 8.
[0110]
The material of the cylindrical body 40 is not limited to glass, and other materials such as plastic or metal can be used.
[0111]
Moreover, as shown in FIG. 9, what attached the transparent film 60 formed with the thin resin to the opening part of the one side of the cylinder 40 can also be used. In this case, for example, a dropper, a pipette, or a syringe 62 is used for injection / recovery of the stripping solution / extraction solution 61.
[0112]
Next, the transparent film 60 is peeled off, and the peeling liquid / extract liquid 61 is injected into the cylindrical body 40.
[0113]
Next, the stripper / extract 61 is reacted in a state of being sealed with the transparent film 60.
[0114]
Thereafter, the transparent film 60 is peeled off, and the solution is recovered, for example, with a dropper, pipette, syringe 62 or the like.
[0115]
If it does in this way, mixing of the foreign material in the cylinder 40 can be prevented.
[0116]
It has been described that the first embodiment is effective for analysis such as flow cytometry. On the other hand, there are studies such as analysis of nucleic acids (DNA, RNA) and proteins. This study does not require detachment of the cells a from the glass slide 8.
[0117]
That is, as shown in FIG. 2, the cylindrical body 40 is bonded and fixed on the slide glass 8. Next, the slide glass 8 is removed from the stage 6.
[0118]
Next, as shown in FIG. 5, instead of the release agent 42, a sample to be collected, for example, a solution for extracting nucleic acid (DNA, RNA) or protein, is directly injected into the tube 40 from the cell a. As this solution, for example, a commercially available nucleic acid extraction kit can be used.
[0119]
When a sample such as nucleic acid (DNA, RNA) or protein elutes in the solution, as in the first embodiment, the sample eluted in the solution is aspirated with a dropper or the like and put into a new separate container. Transfer.
[0120]
Using, for example, nucleic acids (DNA, RNA) and proteins collected in this way, these nucleic acids (DNA, RNA) and proteins can be analyzed.
[0121]
Next, a second embodiment of the present invention will be described. The same parts as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.
[0122]
FIG. 7 is a block diagram of an inverted microscope used in the cell acquisition method of the present invention. The UV laser head 23 outputs a laser beam having a wavelength in the ultraviolet region. The laser beam output from the UV laser head 23 is set to energy that leaves a cell a to be collected among a plurality of cells in the sample 7 and alters an unnecessary sample portion other than the cell a to be collected. Unnecessary alteration of the sample part is to change the basic characteristics of the nucleic acid or cell, such as by fragmenting the nucleic acid.
[0123]
The stage 6 has a length measuring unit 50. The length measuring unit 50 measures the XY coordinates moving in the XY directions of the stage 6 and outputs an XY coordinate measurement signal.
[0124]
The image processing and stage control device 16 inputs the XY coordinate measurement signal output from the length measuring unit 50, and calculates the irradiation position of the laser beam irradiated on the specimen 7 from the XY coordinate measurement signal.
[0125]
The image processing and stage control device 16 performs image processing on the image signal output from the CCD camera 15 to obtain the image data of the specimen 7, and the image data of the coloring display unit indicating the irradiation position of the laser beam in the image data. Are superimposed. The coloring display section is preferably red, for example.
[0126]
The image processing and stage control device 16 superimposes the image data of the specimen 7 and the image data of the coloring display unit indicating the irradiation position of the laser beam on the display 17.
[0127]
Next, a method for collecting the cells a present in the specimen 7 will be described.
[0128]
As in the first embodiment, the observer looks at the magnified image of the specimen 7 displayed on the display 17 or the magnified image of the specimen 7 while looking through the eyepiece lens 22, for example, the specimen 7 shown in FIG. Each cell a to be collected is determined.
[0129]
Next, each cell a to be collected in the specimen 7 is left, and the other cells are irradiated with a laser beam.
[0130]
A cell away from the cell a to be collected has a large spot diameter s. ₂ The laser beam is irradiated with.
[0131]
Next, a small spot diameter s is obtained by the variable slit 25. ₃ Then, carefully irradiate around the cell a to be collected, that is, precisely around the cell a, to leave only the cell a to be collected.
[0132]
In the first embodiment, the size of the laser spot diameter is adjusted by the variable slit 25. However, in the second embodiment, if the laser energy is sufficient to fragment unnecessary cell nucleic acids. Good. The laser energy for fragmenting the nucleic acid is smaller than the energy for removing the whole cell. Thereby, it is possible to fragment the nucleic acid of unnecessary cells by using a mercury lamp or the like instead of the laser head 23 to change the basic characteristics of the nucleic acid or the cells. Further, the laser objective lens 5 can be switched to one with a low magnification to increase the laser spot diameter.
[0133]
The laser objective lens 5 is switched to, for example, about 5 times the low magnification.
[0134]
On the other hand, the length measuring unit 50 measures the XY coordinates moving in the XY direction of the stage 6 and outputs an XY coordinate measurement signal.
[0135]
The image processing and stage control device 16 inputs the XY coordinate measurement signal output from the length measuring unit 50, and calculates the irradiation position of the laser beam irradiated on the specimen 7 from the XY coordinate measurement signal.
[0136]
The image processing and stage control device 16 performs image processing on the image signal output from the CCD camera 15 to obtain the image data of the sample 7, and displays, for example, a red coloring display unit indicating the irradiation position of the image data and the laser beam. Overlay with image data.
[0137]
The image processing and stage control device 16 superimposes the image data of the specimen 7 and the image data of the coloring display unit indicating the irradiation position of the laser beam on the display 17.
[0138]
The observer operates the operation unit 18 to check the spot diameter s while confirming the image of the sample 7 displayed on the display 17 and the coloring display unit indicating the irradiation position of the laser beam. ₂ The laser beam irradiation position is moved to the peripheral portion of each cell a for each shot.
[0139]
Spot diameter s ₂ The laser beam is irradiated to the specimen 7 around each cell a. In FIG. 8, the spot diameter s ₂ All the laser beam irradiation positions are not shown.
[0140]
Spot diameter s ₂ In the portion of the specimen 7 irradiated with the laser beam, the basic characteristics of the nucleic acid or cell change due to fragmentation of the nucleic acid or the like.
[0141]
Next, the variable slit 22 of the UV laser head 21 has a slit width S that is smaller than the cell a as shown in FIG. ₃ Set to. Thereby, the spot diameter of the laser beam irradiated on the specimen 7 is s. ₃ become.
[0142]
The laser objective lens 5 may be switched to a high magnification, for example, about 50 times, and an ND filter may be disposed in front of the laser objective lens 5.
[0143]
The observer leaves each cell a while observing the specimen 7 displayed on the display 17, and each irradiation route R of the laser beam that alters the surrounding specimen 7 adjacent to each cell a. ₃ , R ₄ To decide.
[0144]
The observer confirms the irradiation position of the laser beam while confirming the image of the specimen 7 displayed on the display 17 and the coloring display portion indicating the irradiation position of the laser beam. ₃ Or R ₄ The operation unit 18 is operated so as to face up.
[0145]
The image processing and stage control device 16 receives an operation command corresponding to the operation of the moving direction and moving amount of the stage 6 from the operation unit 18 and sends a movement control signal for the stage 6 according to the operation command to the stage driving unit 9. To do.
[0146]
Thereby, for example, the stage 6 performs irradiation route R for each laser beam of one shot. ₂ Or R ₃ Move in the XY direction so that it goes up.
[0147]
For example, when a laser beam is output from the UV laser head 23 for each shot, the laser beam passes through the UV imaging lens 24, the dichroic mirror 4, and the laser objective lens 5, and the irradiation route R. ₃ Irradiated on, followed by irradiation route R ₄ Irradiated on top. The laser beam is applied to the irradiation route R. ₄ Irradiate up, then irradiation route R ₃ The top may be irradiated.
[0148]
The energy of the laser beam is set so as to alter the surrounding specimen 7 adjacent to each cell a. Therefore, each irradiation route R irradiated with the laser beam ₃ , R ₄ In the upper part of the sample 7, the basic characteristics of the nucleic acid or cell change due to fragmentation of the nucleic acid or the like.
[0149]
Each irradiation route R ₃ , R ₄ These XY coordinate positions may be stored in advance in the image processing and stage control device 16. That is, each irradiation route R of the laser beam ₃ , R ₄ Is determined, the observer operates the operation unit 18 to move the stage 6 in the XY directions, and displays a coloring display unit indicating the irradiation position of the laser beam for each irradiation route R. ₃ , R ₄ Move according to each.
[0150]
At this time, the image processing and stage control device 16 reads the moving direction and moving amount of the stage 6 from the operation unit 18, and each irradiation route R of the stage 6 from these moving direction and moving amount. ₃ , R ₄ Each XY coordinate position is calculated. The image processing and stage control device 16 calculates the calculated irradiation routes R ₃ , R ₄ Each XY coordinate position is stored in the internal memory.
[0151]
The image processing and stage control device 16 has each irradiation route R stored in the internal memory. ₃ , R ₄ Each XY coordinate position is read, and a movement control signal for the stage 6 is sent to the stage drive unit 9 in accordance with the XY coordinate position.
[0152]
The stage 6 automatically sets the irradiation position of the laser beam to each irradiation route R. ₃ , R ₄ Each moves in the XY direction. At the same time, the UV laser head 23 outputs one shot of the laser beam every predetermined period.
[0153]
As a result, each irradiation route R ₃ , R ₄ The upper part of the specimen 7 is automatically irradiated with a laser beam, and the basic characteristics of the nucleic acid or cell change due to fragmentation of the nucleic acid in the cell.
[0154]
Next, similarly to the first embodiment, a cylinder 40 shown in FIG. 2 is prepared. The cylindrical body 40 is bonded and fixed on the slide glass 8.
[0155]
Next, as shown in FIG. 5, a sample, for example, a solution for extracting nucleic acid (DNA, RNA) or protein is injected from the cell a into the cylinder 40.
[0156]
When a sample such as nucleic acid (DNA, RNA) or protein elutes in the solution, the sample is sucked with a dropper or the like and transferred to another new container or the like.
[0157]
On the other hand, when the cells a are peeled off from the slide glass 8, the cylindrical body 40 is bonded and fixed on the slide glass 8 with an adhesive 41 as shown in FIG. 2.
[0158]
Next, as shown in FIG. 5, the release agent 42 is injected into a container formed by the cylindrical body 40 and the slide glass 8. The release agent 42 promotes the release of the cells a from the slide glass 8 as shown in FIG.
[0159]
Next, the cells a floating in the release agent 42 are sucked together with the release agent 42 by a dropper or the like. The cells a sucked by the dropper are transferred to another new container or the like. As a result, the collection of the cells a is completed.
[0160]
As described above, according to the second embodiment, the unnecessary specimen portion d other than the cell a to be collected in the specimen 7 is irradiated with the laser beam, and the nucleic acid or the like of the unnecessary specimen portion d is fragmented. Alter the basic properties of nucleic acids or cells.
[0161]
Thereafter, a sample, for example, a solution for extracting nucleic acid (DNA, RNA) or protein is injected from the cell a into the cylinder 40, and for example, a sample such as nucleic acid (DNA, RNA) or protein is eluted. Further, a release agent 42 is injected into a container formed by the cylindrical body 40 and the slide glass 8, and the cells a to be collected are detached from the slide glass 8 and suspended in the release agent 42 and collected.
[0162]
As described above, the second embodiment fragments the nucleic acid of the cell of the unnecessary specimen portion d by irradiating the laser beam and changes the basic characteristics of the nucleic acid or the cell. This is effective when extracting samples such as nucleic acids (DNA, RNA) and proteins.
[0163]
Raw specimens contain moisture. When the raw specimen 7 is irradiated with a laser beam having a large energy, the specimen 7 cannot be cut due to the boiling of water in the specimen 7.
[0164]
On the other hand, the energy of the laser beam in the second embodiment is energy required for fragmenting unnecessary nucleic acid of the specimen portion d and changing the basic characteristics of the nucleic acid or cell. As an experimental result, for example, in the case of DNA fragmentation, the laser beam energy is 0.075 mJ with respect to a square area of 60 μm square at a wavelength of 266 nm. Even if the energy of the laser beam is smaller than 0.075 mJ, the nucleic acid or the like is fragmented, and the basic characteristics of the nucleic acid or cell can be changed.
[0165]
When the unnecessary specimen portion other than the cells a necessary for collection is altered, first, a large spot diameter s is formed on the unnecessary specimen portion d around each cell a. ₂ Next, a small spot diameter s is applied to an unnecessary specimen portion d adjacent to each cell a. ₃ The laser beam is irradiated. As a result, the number of laser beams applied to the unnecessary specimen portion d can be reduced. Alteration of an unnecessary specimen portion d over a wide area can be performed in a short time.
[0166]
When the unnecessary specimen portion d is skipped from the slide glass 8 as in the first embodiment, the laser objective lens 5 generally uses a magnification of about 50 times. On the other hand, the second embodiment may use the laser objective lens 5 with a magnification of about 5 times. Thereby, in the second embodiment, the spot area of the laser beam can be expanded 100 times as compared with the case where the laser objective lens 5 having a magnification of 50 times is used.
[0167]
Since the cells of the unnecessary specimen portion d are altered, fragments of the specimen 7 are not scattered when the specimen 7 is irradiated with the laser beam. Thereby, the air blow 30 and the air suction device 31 become unnecessary.
[0168]
On the display 17, for example, image data of a red coloring display portion indicating the irradiation position of the laser beam is superimposed on the image data of the specimen 7 and displayed. The observer can irradiate the sample 7 with the laser beam while checking the image on the display 17. Thereby, the circumference | surroundings adjacent to the cell a to extract | collect and other unnecessary sample parts d can be changed in quality reliably.
[0169]
In the second embodiment, the energy of the laser beam is set so as to alter the cell, but a mercury lamp or a xenon lamp may be used as the light source. Even if light emitted from a mercury lamp or a xenon lamp is irradiated to a cell, it is possible to fragment nucleic acid or the like and change the basic characteristics of the nucleic acid or cell.
[0170]
In addition, this invention is not limited to the said 1st and 2nd embodiment, In the implementation stage, it can change variously in the range which does not deviate from the summary.
[0171]
Furthermore, the above embodiments include inventions at various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent requirements. For example, even if some constituent elements are deleted from all the constituent elements shown in the embodiment, the problem described in the column of the problem to be solved by the invention can be solved, and is described in the column of the effect of the invention. If the effect is obtained, a configuration from which this configuration requirement is deleted can be extracted as an invention.
[0172]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, it is possible to provide a cell isolation method capable of reliably and efficiently collecting cells to be collected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a configuration diagram of an inverted microscope used in a first embodiment of a cell isolation method of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a cylinder used for collecting cells in the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing cell trimming in the first and second embodiments of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing cell trimming in the first and second embodiments of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing injection of a release agent in the first and second embodiments of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing a state where cells are detached in the first and second embodiments of the present invention.
FIG. 7 is a configuration diagram of an inverted microscope used in the second embodiment of the cell acquisition method of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing laser irradiation to unnecessary cells in the first and second embodiments of the present invention.
FIG. 9 is a diagram showing an example of a cell collection method in the first and second embodiments of the present invention.
[Explanation of symbols]
1: illumination light source, 2: field stop, 3: aperture stop, 4: dichroic mirror, 5: objective lens for laser, 6: stage, 7: specimen, 8: slide glass, 6a, 6b: motor, 9: stage Drive unit, 10: objective lens for observation, 11: dichroic mirror, 12: UV barrier filter, 13: imaging lens, 14: half mirror, 15: CCD camera, 16: image processing and stage control device, 17: display, 18: operation unit, 19: mirror, 20: relay lens, 21: UV cut filter, 22: eyepiece lens, 23: UV laser head, 24: UV imaging lens, 23a: laser light source, 25: variable slit, 26: LED, 27: Dichroic mirror, 28: Light source for fluorescence excitation, 29: UV band pass filter, 30: Air blow, 31 Air suction device, 40: cylindrical body, 41: adhesive, 42: release agent, 50: measurement section, 60: transparent film, 61: peeling liquid / extract, 62: dropper, pipette, syringe.

Claims

Irradiating a laser beam on a specimen placed on a substrate with a laser beam to remove unnecessary specimen parts other than the cell part from the substrate, and using a cylindrical body having openings at both ends, The cell part is placed in one of the openings in the cylindrical body, the cylindrical body is placed on the substrate, and a release agent is injected into a container formed by the substrate and the cylindrical body. Separating the cell part from the substrate, and collecting the cell part floating in the release agent.

Irradiating a laser beam on a specimen placed on a substrate with a laser beam to remove unnecessary specimen parts other than the cell part from the substrate, and using a cylindrical body having openings at both ends, The cell part is placed in one of the openings in the cylindrical body, and the cylindrical body is placed on the substrate, and is present in the cell in a container formed by the substrate and the cylindrical body A cell isolation method comprising injecting a solution that elutes a sample to be collected and collecting the sample eluted in the solution.

Irradiating a laser beam on a specimen placed on a substrate with a laser beam to alter the unnecessary specimen part other than the cell part, and using a cylindrical body having openings at both ends, the cylindrical body The cell portion is placed in one of the openings in the tube, the cylindrical body is placed on the substrate, a release agent is injected into a container formed by the substrate and the cylindrical body, and the cell A method for isolating cells, comprising separating a part from the substrate and collecting the cell part floating in the release agent.

Irradiating a laser beam on a specimen placed on a substrate with a laser beam to alter the unnecessary specimen part other than the cell part, and using a cylindrical body having openings at both ends, the cylindrical body The cell portion is placed in one of the openings in the tube, the cylindrical body is placed on the substrate, and a sample existing in the cell is formed in a container formed by the substrate and the cylindrical body. A cell isolation method comprising injecting a solution to be eluted and collecting the sample eluted in the solution.

2. The energy of the laser beam that irradiates the unnecessary specimen portion and removes the specimen portion from the substrate is set such that the unnecessary specimen portion is completely blown off the substrate. Alternatively, the method for isolating cells according to 2.

When removing the sample portion from the substrate by irradiating the unnecessary sample portion with the laser beam, air is blown toward the sample to blow off the fragments scattered from the sample, and the fragments blown from the sample are removed. The cell isolation method according to claim 1 or 2, wherein aspiration is performed.

The cell isolation method according to claim 1 or 3, wherein the release agent is an organic solvent .

The cells floating in the release agent are collected by sucking the cells in the release agent with a dropper, pipette or syringe , and in a container different from the container formed by the substrate and the cylindrical body. The cell isolation method according to claim 1 or 3, wherein the cells in the dropper, the pipette or the syringe are transferred.

Taking of the sample eluted in the solution, the dropper said sample of said solution dropper, aspirated by the pipette or syringe, into a separate container and container formed by said tubular body and said substrate The cell isolation method according to claim 2 or 4 , wherein the sample in the pipette or the syringe is transferred.

5. The cell isolation method according to claim 2 , wherein at least DNA, RNA or protein is extracted from the cell as the sample by the solution.

The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the wavelength of the laser beam is set in an ultraviolet region.

The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cylindrical body is made of glass, metal, or plastic.

The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cylindrical body has a thin film formed of a resin attached to one of the openings.

The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cylindrical body is erected in a liquid-tight manner on the substrate.

The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cylindrical body is fixed on the substrate with an adhesive.

The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cylindrical body is closed between the substrate and the substrate by grease applied to the opening of the cylindrical body .

The specimen is coated with a fluorescent dye to stain the cells, the specimen is irradiated with ultraviolet light to emit the fluorescent dye of the stained cells, and the emitted cells are observed and collected. The cell isolation method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cell is determined.

The microscope for enlarging the specimen image and the laser head for outputting the laser beam are provided so that the optical axis of the microscope and the optical axis of the laser beam output from the laser head coincide with each other and output from the laser head. The index light is output from the index light source coaxially with the optical axis of the laser beam, and the sample image magnified by the microscope and the index light irradiated on the sample are captured by the imaging device The sample image and the indicator light are displayed on a display device, and the laser beam is scanned on the sample while observing the sample image and the indicator light displayed on the display device. 5. The unnecessary specimen part other than the cell part desired to be removed is removed from the substrate, or the unnecessary specimen part other than the cell part desired to be collected is altered. Among cell isolation method according to any one.

5. The cell according to claim 3, wherein the energy of the laser beam for altering the unnecessary specimen portion is set lower than the energy of the laser beam for removing the unnecessary specimen portion from the substrate. Isolation method.

The laser beam diameter can be changed, and when removing the unnecessary specimen portion, the laser beam diameter for irradiating the unnecessary specimen portion adjacent to the cell portion is smaller than the size of the cell portion. set, according to claim 1, characterized in that set in the laser beam diameter larger second diameter than the first diameter of irradiating the unnecessary the specimen portion from said cell parts separated by a predetermined distance or 3. The cell isolation method according to 2.

The laser beam diameter can be changed, and when the unnecessary specimen portion is altered, the laser beam diameter for irradiating the unnecessary specimen portion adjacent to the cell portion is smaller than the size of the cell portion. The diameter of the laser beam for irradiating the unnecessary specimen part separated from the cell part by a predetermined distance is set to a second diameter larger than the first diameter. 5. The cell isolation method according to 3 or 4 .

Irradiating ultraviolet light to a specimen having cells placed on a substrate to alter unnecessary specimen parts other than the cell part, and using a cylindrical body having openings at both ends, the cylindrical body The cell portion is placed in one of the openings in the tube, the cylindrical body is placed on the substrate, a release agent is injected into a container formed by the substrate and the cylindrical body, and the cell A method for isolating cells, comprising separating a part from the substrate and collecting the cell part floating in the release agent.

Irradiating ultraviolet light to a specimen having cells placed on a substrate to alter unnecessary specimen parts other than the cell part, and using a cylindrical body having openings at both ends, the cylindrical body The cell portion is placed in one of the openings in the tube, the cylindrical body is placed on the substrate, and a sample existing in the cell is formed in a container formed by the substrate and the cylindrical body. A cell isolation method comprising injecting a solution to be eluted and collecting the sample eluted in the solution.