JP3807765B2

JP3807765B2 - Block copolymer with polyacrylamide derivative and temperature-responsive polymer micelle

Info

Publication number: JP3807765B2
Application number: JP33194995A
Authority: JP
Inventors: 靖久桜井; 光夫岡野; 一則片岡; 隆夫青柳; 憲鈴木; 明彦菊池
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2006-08-09
Anticipated expiration: 2015-12-20
Also published as: JPH09169850A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルキル置換基を有するアクリルアミド連鎖と比較的疎水性の大きい連鎖とを含むブロック共重合体および該共重合体を含む温度応答性ミセルに関する。本発明のブロック共重合体は、特定の温度を境に低温側では溶解、高温側では不溶化を起こす固有の相転移温度を有するアクリルアミド誘導体連鎖を有しているために、その相転移温度近傍でミセル形成に伴う溶解と凝集に伴う不溶化を可逆的に生起する。そのため、温度に応答してガン組織など目的部位にへ選択的に集積性を高めることができ、さらに薬物の放出を制御できる新規の薬物運搬体として特に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
薬物運搬体としてリポソームに関する研究例が非常に多い。リポソームはその構成単位であるリン脂質が疎水性相互作用により分子集合体として２重層を形成している。リポソームは、その疎水性領域に疎水性薬物が、内水相に親水性薬物が保持され、薬物運搬体として働く。しかし、リポソームは血液中に存在する脂質成分やタンパク質成分との接触によりその膜構造が破壊されやすく、長時間安定であるとは言いがたい。またそのサイズが100nm以上であることから、血液中に投与された場合、脾臓や肝臓に取り込まれやすく、薬物が目的とする部位まで到達するのが困難である。
【０００３】
このような現状から、血液中での安定性の向上を目的としてポリエチレングリコール(PEG)を有するリン脂質を用いたPEG修飾リポソームや、プルランなどで被覆した多糖類修飾リポソームなどが合成されているが、これらのリポソームは依然としてその安定性が不十分である。
【０００４】
一方、薬物を内包した大豆油をレシチンで被覆した微粒子（リピッドマイクロスフィアー）も研究されており、かかるリピッドマイクロスフィアーに各種抗炎症性薬物などを封入した製剤が臨床応用されている。しかし、リピッドマイクロスフィアーは、リポソーム同様、血液中で安定性が低い点や細網内皮系への移行しやすい点で薬物運搬体としての機能が十分に発揮できず、不満足であると言わざるを得ない。
【０００５】
本発明者らは、これまで、親水性連鎖としてポリエチレングリコール、疎水性連鎖としてポリアミノ酸からなるブロック共重合体が、水中またはリン酸緩衝液中でミセル様の安定なナノ会合体を形成し、このナノ会合体中にアドリアマイシン等の抗ガン剤を薬物を安定に、また効率よく内包できる高分子ミセル医薬が得られることを明らかにしてきた（横山昌幸，他“ポリマーミセルを用いた新たなドラッグキャリアシステム”, Drug Delivery System, ６巻２号, 77〜81ページ, 1991年）。更に、この高分子ミセルを静脈内に注射すると、血液中で長期間安定に存在すること、また、その粒子径が数十nmであることからガン部位への集積性が高まり、内包された抗ガン剤の副作用の低減とともにその薬物の高い抗ガン活性を発現させることを明らかにしてきた。
しかしながら、薬物のガンに対する治療効果を高めるためには、さらに高い組織指向性を有し、なおかつ、必要とする期間だけ薬物放出を行うという放出制御までも兼ね備えた薬物運搬体の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、温度変化によって目的部位への集積性を高めることが可能となる新規薬物運搬体、すなわち、特定の温度を境として低温側ではミセル形成、高温側では沈殿生成を可逆的に起こすような新しいブロック共重合体を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意検討を加えた。その結果、アルキル置換基を有するアクリルアミド連鎖と比較的疎水性の大きい連鎖とを含むＡＢ型ブロック共重合体が、温度に応答して可逆的にミセル形成と沈殿生成を生起する化合物であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記一般式 (I)
【０００８】
【化５】

【０００９】
（式中、Ｒ¹およびＲ²は同一または異なってもよく、水素原子またはアルキル基を表し、ｍは５〜500の整数を表す。）
で示されるポリアクリルアミド誘導体の繰り返し単位からなる連鎖と、下記一般式 (II)
【００１０】
【化６】

【００１１】
（式中、Ｒ³は水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を表し、Ｚは無置換もしくは低級アルキル基、ペルフルオロアルキル基、アルキルオキシ基もしくはハロゲン原子で置換されているフェニル基、低級アルキル基、アルキルオキシ基、シアノ基又は−ＣＯＯＲ⁴で表される基（但し、Ｒ⁴は水素原子又は炭化水素基を表す。）を表し、ｎは１〜500の整数を表す。）
で示される繰り返し単位からなる連鎖とを含むブロック共重合体である。
【００１２】
ポリアクリルアミド誘導体としては、例えばポリイソプロピルアクリルアミドが挙げられる。
さらに、本発明は、前記ブロック共重合体を含む温度応答性高分子ミセルである。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のブロック共重合体は、アルキル置換基を有するアクリルアミド連鎖と比較的疎水性の大きい連鎖とを含むＡＢ型のブロック共重合体であり、水中で特定の温度を境に、低温側でミセルを形成して溶解していたものが高温側に移行すると凝集体を生じて沈殿を生成し、再び低温側に戻すとミセルを形成して溶解するという温度応答性を有する。
【００１４】
ここで、特定の温度とは、ミセル形成と沈殿生成の境界となる温度を意味する。そして、ポリアクリルアミド誘導体の置換基を変えることにより、かかる境界の温度を広範囲に設定させることができる。上記温度は、通常５〜75℃であり、例えばポリアクリルアミド誘導体の置換基がノルマルプロピル基、シクロプロピル基、エチル基とすると、その境界温度をそれぞれ21.5℃、45.5℃、72℃とすることができる。また、ポリイソプロピルアクリルアミドとポリスチレンとのブロック共重合体の場合は、境界となる温度は30〜35℃、好ましくは32℃である。
本発明のブロック共重合体の製造方法を以下に示す。
本発明のブロック共重合体は、例えば一般式 (III)
【００１５】
【化７】

【００１６】
（式中、Ａは一般式 (I)
【００１７】
【化８】

【００１８】
（式中、Ｒ¹およびＲ²は同一または異なってもよく、水素原子またはアルキル基を表す）で表されるポリアクリルアミド誘導体の繰り返し単位からなる連鎖を表し、Ｘはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基またはフェニル基を表す。）
で示される片末端に官能基を有するポリマーと、一般式 (IV)
【００１９】
【化９】

【００２０】
（式中、Ｂは一般式 (II)
【００２１】
【化１０】

【００２２】
（式中、Ｒ³は水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を表し、Ｚは無置換もしくは低級アルキル基、ペルフルオロアルキル基、低級アルキルオキシ基もしくはハロゲン原子で置換されているフェニル基、低級アルキル基、アルキルオキシ基、シアノ基又は−ＣＯＯＲ⁴で表される基（但し、Ｒ⁴は水素原子又は炭化水素基を表す。）を表す。）で表される繰り返し単位からなる連鎖を表し、Ｙはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基またはフェニル基を表す。）
で示される片末端に官能基を有するポリマーとを、公知の方法で反応させることにより容易に得られる。
ここで、式Ｉにおいて、アルキル基としては炭素数１〜６のものが挙げられ、直鎖でも分岐したものであってもよい。
【００２３】
また、式IIにおいて、Ｒ³のうち低級アルキル基としては炭素数1 〜６、Ｚのうち低級アルキルオキシ基としては炭素数１〜６、低級アルキル基としては炭素数１〜６のものが挙げられ、ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アスタチンが挙げられる。さらに、Ｒ⁴のうち炭化水素基としては炭素数１〜15のアルキル基又は炭素数３〜12のシクロアルキル基が挙げられる。
前記一般式 (I)で示されるポリアクリルアミド誘導体は、例えば一般式 (V)
【００２４】
【化１１】

【００２５】
（式中、Ｒ¹およびＲ²は前記と同様である。）
で示されるモノマーを、一般式（VI)
【００２６】
【化１２】

【００２７】
（式中、Ｘは前記と同様である。）
で示される化合物の存在下、ラジカル重合法により製造できる。
ハロゲン原子、アルキル基の具体例については、前記と同様である。
【００２８】
ラジカル重合法には、バルク重合、溶液重合、乳化重合などの公知の方法を用いることができ、ラジカル開始剤の添加により効率よく開始される。反応に好適に用いられるラジカル開始剤としては、ジラウロイルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシドなどの有機過酸化物、又はα，α−アゾビスイソブチロニトリルやアゾビスシクロヘキサンカルボニトリルのようなアゾ化合物を例示することができる。
【００２９】
この場合のラジカル重合反応に利用できる溶媒としては、例えば水、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、ヘキサノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。反応は通常40℃〜100℃の範囲内で円滑に進行する。
【００３０】
前記一般式(V)で表されるモノマーは公知化合物であり、ここで用いられるモノマーとしては、アクリルアミド、メチルアクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、エチルアクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、メチルエチルアクリルアミド、ｎ−プロピルアクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、ジプロピルアクリルアミド、ジイソプロピルアクリルアミド、メチルプロピルアクリルアミド、メチルイソプロピルアクリルアミド、エチルイソプロピルアクリルアミド、ブチルアクリルアミド、ｓ−ブチルアクリルアミド、ｔ−ブチルアクリルアミド、ジブチルアクリルアミド、メチルブチルアクリルアミド、エチルブチルアクリルアミド、プロピルブチルアクリルアミド、ペンチルアクリルアミド、ヘキシルアクリルアミド等を例示できる。
【００３１】
一般式（VI）で示される化合物は公知であり、ここで用いられる化合物としては、アミノメタンチオール、アミノエタンチオール、アミノエタンチオール塩酸塩、３−アミノプロパンチオール、３−アミノプロパンチオール塩酸塩、２−アミノプロパンチオール、４−アミノブタンチオール、３−アミノブタンチオール、２−アミノブタンチオール、５−アミノペンタンチオール、６−アミノヘキサンチオール、８−アミノオクタンチオール、10−アミノデカンチオール、12−アミノドデカンチオール、18−アミノヘキサデカンチオール、２−アミノチオフェノール、４−アミノチオフェノール、チオグリコール酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、６−メルカプトヘキサノール、10−メルカプトデカノール、12−メルカプトドデカノール、16−メルカプトヘキサデカノール、４−ヒドロキシチオフェノール、２−クロロエタンチオール、２−ブロモエタンチオール、３−クロロプロパンチオール、４−ブロモブタンチオール、チオサリチル酸等を例示できる。
一般式（II）で示されるポリマーは、例えば一般式（VII)
【００３２】
【化１３】

【００３３】
（式中、Ｒ³は前記と同様である。）
で示されるモノマーを、前記と同様に一般式（VI）で示される化合物の存在下、ラジカル重合することにより容易に得られる。
【００３４】
一般式（VII)で示されるビニル基を有するモノマーとしては、例えばスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、ペンタフルオロスチレンなどのスチレン誘導体、エチレン、プロピレン、ブテン、イソプレンなどのアルケン類、エチルビニルエーテル、プロピルビニルエーテル、ヘキシルビニルエーテル、オクチルビニルエーテルなどのビニルエーテル類、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、ポリフルオロアクリレート、ｐ−フルオロフェニルアクリレート、ｍ−トリフルオルメチルフェニルアクリレートなどのアクリル酸エステル類、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、ペルフルオロアルキルメタクリレートなどのメタクリル酸エステル類、アクリロニトリルなどが挙げられる。
【００３５】
本発明のブロック共重合体はＡＢ型、すなわち、ポリマー中に一種類の単量体のみからなるＡという連鎖と、別の一種類の単量体のみからなるＢという連鎖がブロック状に結合した構造を有しており、一般式（III)で示されるポリマーと、一般式（IV）で示されるポリマーとを反応させることにより得ることができる。この場合、一般式（III)で示されるポリマーと一般式（IV）で示されるポリマーとの組み合わせとしては、それぞれのポリマーの片末端の置換基ＸおよびＹが異なっていることが好ましい。すなわち、一般式（III）または一般式（IV）で示されるポリマーの片末端の置換基Ｘ又はＹがカルボキシル基で置換されたアルキル基またはフェニル基の時は、それぞれ反応させる一般式（IV）または一般式（III）で示されるポリマーの片末端の置換基Ｙ又はＸは、水酸基、アミノ基で置換されたアルキル基またはフェニル基であることが反応の容易さの点で好ましい。
【００３６】
例えば、一般式（III）で示されるポリマーの片末端の置換基Ｘがカルボキシル基である場合は、一般式（IV）で示されるポリマーの片末端の置換基Ｙを水酸基とし、両ポリマー同士を酸性触媒の存在下で容易に反応させてエステル結合を生成し、ブロック共重合体が得られる。
【００３７】
反応に用いられる酸性触媒としては、硫酸、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、無水トリフルオロ酢酸、無水トリフルオロメタンスルホン酸が例示できる。この反応は有機溶媒中で行うことが好ましく、用いられる溶媒としては、ポリマーを溶解するが反応に関係しないものであればいずれのものでもよく、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。反応は通常０℃〜100℃の範囲内で円滑に進行する。
【００３８】
さらに、一般式（III）または一般式（IV）の片末端の置換基Ｘ又はＹをカルボキシル基から酸塩化物に変換することにより、それぞれ片末端の置換基Ｙ又はＸが水酸基、アミノ基である一般式（IV）または一般式（III）のポリマーと容易に反応して、それぞれエステル結合またはアミド結合を生成してブロック共重合体が得られる。酸塩化物への変換は、塩化チオニル、三塩化リン、五酸化リンなどを用いて公知の方法により容易に合成できる。片末端が酸塩化物のポリマーと片末端がアミノ基または水酸基のポリマーとを反応させるときは、有機溶媒中、不活性ガス雰囲気下において好適に進行する。用いられる溶媒としては、ポリマーを溶解するが反応に関係しないものであればいずれのものでもよく、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
この反応は塩基性物質存在下で行うことが好ましく、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムリン酸ナトリウム、水素化ナトリウム、水素化カルシウム、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン等が好適に用いられる。
【００４０】
一般式（III）または一般式（IV）の片末端の置換基Ｘ又はＹがカルボキシル基の場合は、縮合剤を用いることにより片末端の置換基Ｙ又はＸが水酸基、アミノ基であるそれぞれの一般式（IV）または一般式（III）のポリマーと容易に反応して、それぞれエステル結合またはアミド結合を生成してブロック共重合体が得られる。
【００４１】
この反応で用いられる縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物ジフェニルホスホリルアジド等が例示でき、単独で、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等と組み合わせて用いられる。この際、有機溶媒中で行うことが好ましく、用いられる溶媒としてはポリマーを溶解するが反応に関係しないものであればいずれのものでもよく、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。反応は通常０℃〜100℃の範囲内で円滑に進行する。
【００４２】
一般式（III）または一般式（IV）で示されるポリマーの片末端の置換基Ｘ又はＹがハロゲン原子で置換されたアルキル基またはフェニル基の時は、それぞれ一般式（IV）または一般式（III）で示されるポリマーの片末端の置換基Ｙ又はＸはアミノ基、水酸基で置換されたアルキル基またはフェニル基であることが反応の容易さの点で望ましい。
【００４３】
一般式（III）または一般式（IV）で示されるポリマーの片末端のハロゲン原子で置換されたアルキル基またはフェニル基は、一般式（III）または一般式（IV）で示されるポリマーの片末端の置換基のアミノ基と容易に反応して、アミノ結合を介してブロック共重合体が得られる。反応は有機溶媒中で行うことが好ましく、用いる溶媒としては反応に関与しないものであればいずれのものでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ジエチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等を例示できるがこれらに限定されるものではない。
【００４４】
一般式（III）または一般式（IV）で示されるポリマーの片末端のハロゲン原子で置換されたアルキル基またはフェニル基は、一般式（III）または一般式（IV）で示されるポリマーの片末端の置換基の水酸基と容易に反応して、エーテル結合を介してブロック共重合体が得られる。
【００４５】
反応は有機溶媒中、不活性ガス雰囲気下において好適に進行する。用いる溶媒としては反応に関与しないものであればいずれのものでもよく、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等を例示できるがこれらに限定されるものではない。この反応は塩基性物質存在下で行うことが好ましく、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等が好適に用いられる。
【００４６】
本発明の高分子ミセルは、本発明のブロック共重合体を有機溶媒に溶解し、水への透析を行うことにより作成できる。ここで用いられる有機溶媒としては、水と自由に混合するものであればいずれのものでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、ジオキサン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等を挙げることができが、これらに限定されるものではない。また、用いる透析膜はポリマーを溶解させる有機溶媒に対して耐溶剤性があれば特に限定はなく、例えば、セルロース系のような様々なポアサイズを有する市販の多孔膜が好適に用いられる。
【００４７】
また、本発明のブロック共重合体から形成される温度応答性ミセルは、比較的疎水性の大きい連鎖が水中で凝集して核を形成し、その周りをポリアクリルアミド誘導体が取り囲む構造を有している。ポリアクリルアミド誘導体は連鎖固有の温度を境に低温側では溶解し、また高温側では凝集構造を形成して不溶化する。
従って、本発明の高分子ミセルにおいては低温側ではミセル形成に基づいて溶解し、高温側では不溶化して沈殿する。この沈殿物を再び冷却すると、再びミセル構造をとり溶解し、この溶解と沈殿形成は温度変化に対して可逆的である。ポリイソプロピルアクリルアミドとポリスチレンとを含むブロック共重合体が形成する高分子ミセルを一例として、その模式図を図３に示す。
【００４８】
【発明の実施の形態】
以下、製造例、実施例により本発明を更に具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されないことはもちろんである。
【００４９】
〔製造例１〜２〕ポリアクリルアミド誘導体のポリマーの合成
表１記載の量イソプロピルアクリルアミド(IPAAm)、アミノエタンチオール(AESH)、アゾビスイソブトロニトリル(AIBN)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)をガラス製重合管にいれ、常法により脱気、封管した。所定時間、70℃で攪拌した後、大量のジエチルエーテルに沈殿させた。沈殿したポリマーを回収、乾燥した後、N,N-ジメチルホルムアミドに再び溶解させ、大量のジエチルエーテルに沈殿させた。沈殿物を回収、真空乾燥して、表１記載の量の片末端にアミノ基を有するポリマーを得た。末端基定量を行った結果、数平均分子量は製造例１および２で、それぞれ42,000および25,000であり、IPAAmの平均重度ｍはそれぞれ、370および220であった。
【００５０】
【表１】

【００５１】
反応式を以下に示す。
【００５２】
【化１４】

【００５３】
〔製造例３〜４〕片末端にカルボキシル基を有するポリマーの合成
スチレン(St)、メルカプトプロピオン酸(MEPA)、アゾビスイソブトロニトリル(AIBN)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)をガラス製重合管にいれ、常法により脱気、封管した。70℃で所定時間攪拌した後、大量のメタノールに沈殿させた。沈殿したポリマーを回収、乾燥した後、N,N-ジメチルホルムアミドに溶解させ、再び大量のメタノールに沈殿させた。沈殿物を回収、真空乾燥して、表２記載の量の片末端にカルボキシル基を有するポリマーを得た。末端基定量を行った結果、数平均分子量は、製造例３および４でそれぞれ4,600と16,000であり、平均重合度ｎはそれぞれ45と150であった。
【００５４】
【表２】

【００５５】
反応式を以下に示す。
【００５６】
【化１５】

【００５７】
〔実施例１〕
製造例１で得られた片末端にアミノ基を有するポリイソプロピルアクリルアミド0.46g、製造例３で得られた片末端にカルボキシル基を有するポリスチレン0.54g、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.021gを７mlのジオキサンに溶解させた。0.037gのジシクロヘキシルカルボジイミドを２mlのジオキサンに溶解させた溶液を氷冷下、ゆっくり滴下させた。24時間、室温で攪拌した後、析出物を濾別、濾液を濃縮し、40℃に加温したシクロヘキサンに沈殿させることにより、過剰量のポリスチレンを除去した。沈殿物を回収し、乾燥させ、再びジオキサンに溶解、加温したシクロヘキサンに沈殿させて精製した。沈殿したポリマーを回収、真空乾燥させて、イソプロピルアクリルアミドとスチレンからなるブロック共重合体を0.40g得た。得られたブロックコポリマーの赤外吸収スペクトル分析および¹H-NMRスペクトル分析の結果を以下に示す。¹H-NMRスペクトルデータ中、「"H"」で表される記号はそのケミカルシフトに帰属されるプロトンを示すものとする。
【００５８】
IR ν (KBr, cm^-1); 3440, 3300 3080, 2970, 2940, 1650, 1550, 1460, 1390, 1370, 1170, 1130, 700
¹H-NMR δ (ppm, CDCl₃);1.05〜1.25(m, -CH(C"H"₃)₂)、 1.25〜2.40(m, -C"H"₂C"H"-(イソプロピルアクリルアミド連鎖に基づく) および-C"H"₂C"H"-(スチレン連鎖に基づく))、 4.00(m -C"H"(CH₃)₂、5.80〜6.50(m, -CON"H"-)、6.50〜7.30(m, ベンゼン環)
また、得られたイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体中の各連鎖の重合度比ｍ：ｎを元素分析のＣ％とＮ％の比から求めると、
計算値ｍ：ｎ=89：11
観測値（元素分析から）ｍ：ｍ=89：11
となり、目的とするイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体の合成が確認された。
反応式を以下に示す。
【００５９】
【化１６】

【００６０】
〔実施例２〕
製造例４で得られた片末端にカルボキシル基を有するポリスチレン0.31gを含む1.56mlのジオキサン溶液に0.06mlの塩化チオニルを加え、60℃で二日間攪拌した。凍結乾燥により溶媒および過剰量の塩化チオニルを除去した後、0.004gのトリエチルアミンと1.56mlのジオキサンを加えた。製造例２で得られた片末端にアミノ基を有するポリイソプロピルアクリルアミド0.047gを含む３mlのピリジン溶液を加え、45℃で二日間反応させた。反応混合液を減圧濃縮した後、２mlのジオキサンを加え、ジエチルエーテルに沈殿させた。得られた沈殿物を回収、減圧乾燥させて、イソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体を0.078g得た。得られたブロックコポリマーの赤外吸収スペクトル分析を行った結果、スペクトルは実施例１で得られた化合物と同一であった。1H-NMRスペクトル分析結果はピークの強度比が異なるだけで実施例１で得られた化合物と同一であった。また、得られたイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体中の各連鎖の重合度比ｍ：ｎを元素分析のＣ％とＮ％の比から求めると、
計算値ｍ：ｎ=53：47
観測値（元素分析から）ｍ：ｍ=59：41
となり、目的とするイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体の合成が確認された。
反応式を以下に示す。
【００６１】
【化１７】

【００６２】
〔実施例３〜４〕
実施例１で得られたイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体50.0mgを6.0mlのDMFに溶解させ、５℃で一晩攪拌した。この溶液をポアサイズ0.5mmのメンブランフィルターで濾過後、分画分子量12,000のセルロース製の透析チューブに入れ、蒸留水中で25時間透析を行った。蒸留水は45、60、90、120分後に交換した。透析終了後、凍結乾燥により40.5mgの乾燥試料が得られた。
【００６３】
実施例２で得られたブロック共重合体の場合は、20.0mgの試料を3.0mlのDMFの試料から同様の方法で透析を行い、16.0mgの乾燥試料が得られた。得られた試料の100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、10mg/ml、7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/mlの水溶液を調整し、それぞれの水溶液にピレンの4.8×10^-4M のエタノール溶液を加え、全体のピレン濃度を6.0×10^-7M に調整した。
【００６４】
実施例１および２から得られたそれぞれのサンプル溶液の蛍光スペクトルを測定した結果を図１に示す。図１より、実施例１および２で得られたイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体は水溶液中でミセルを形成し、その臨界ミセル濃度は10mg/lであることが確認された。
【００６５】
〔実施例５〜６〕
実施例１および２で得られたイソプロピルアクリルアミドとスチレンとを含むブロック共重合体2.0mgを２mlの蒸留水に溶解させ、動的光散乱測定を行った。測定の結果、実施例１のブロック共重合体から得られたミセルの数平均粒径がそれぞれ98.0nm、重量平均粒径が127.8nmであり、実施例２のブロック共重合体から得られたミセルの数平均粒径がそれぞれ125.1nm、重量平均粒径が147.4nmであったことから、実施例１および２で得られたブロック共重合体は水中で粒径のそろった高分子ミセルを形成することが確認された。
【００６６】
〔実施例７〜８〕
実施例１および２で得られたブロック共重合体0.5％の水溶液を調整し、紫外・可視分光光度計を用いて、500nmの透過度を測定することにより温度応答性を調べた。温度と500nmの可視光の透過度の関係を図２に示す。32.0℃で急激に透過度が減少し、透明な水溶液から濁った水溶液へ変化した。この温度でミセル形成から凝集体へ転移したことを表しており、実施例１および２で得られたブロック共重合体により形成されるミセルは水溶液中で温度応答性を示すことが確認された。
【００６７】
【発明の効果】
本発明により、特定の温度を境として低温側ではミセル形成、高温側では沈殿生成を可逆的に起こすような新しいブロック共重合体が提供される。
本発明のブロック共重合体は、水中で粒径のそろった安定な高分子ミセルを形成し、なおかつ温度応答性を合わせ持つことから、特に、長期投与が必要な薬物、分解し易い薬物の運搬体として注射剤に好適に用いられるが、経口、経鼻、経肺、経膣などの経粘膜吸収を目的とした製剤や経皮吸収へも用いることができる。外部からの加える温度に応答して、患部への薬物の集積性を高めたり、炎症反応などのために上昇した患部へ高分子ミセル自身が自ら集積するなど、これまで集積性の点で問題を有していた従来の薬物運搬体の問題点を解決できる。さらに、化粧用としても使用可能であるなど極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ブロック共重合体の濃度とピレン蛍光スペクトルにおける３７４nmと３８６nmのピーク強度比との関係を示す図。
【図２】ブロック共重合体からなる高分子ミセル水溶液の温度と500nmでの可視光透過度との関係を示す図。
【図３】本発明のブロック共重合体による高分子ミセル形成の摸式図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a block copolymer including an acrylamide chain having an alkyl substituent and a relatively hydrophobic chain, and a temperature-responsive micelle including the copolymer. Since the block copolymer of the present invention has an acrylamide derivative chain having a specific phase transition temperature that dissolves on the low temperature side and insolubilizes on the high temperature side at a specific temperature, it is in the vicinity of the phase transition temperature. It dissolves reversibly with micelle formation and insolubilization with aggregation. Therefore, it is particularly useful as a novel drug carrier that can increase the accumulation property selectively to a target site such as cancer tissue in response to temperature and can control the release of the drug.
[0002]
[Prior art]
There are many examples of research on liposomes as drug carriers. Liposomes, which are the structural units of liposomes, form a bilayer as a molecular assembly by hydrophobic interaction. Liposomes function as a drug carrier by holding a hydrophobic drug in the hydrophobic region and a hydrophilic drug in the inner aqueous phase. However, it is difficult to say that liposomes are stable for a long time because their membrane structure tends to be destroyed by contact with lipid components and protein components present in blood. Moreover, since the size is 100 nm or more, when administered into blood, it is easily taken into the spleen and liver, and it is difficult for the drug to reach the target site.
[0003]
Under such circumstances, PEG-modified liposomes using phospholipids having polyethylene glycol (PEG) and polysaccharide-modified liposomes coated with pullulan and the like have been synthesized for the purpose of improving stability in blood. These liposomes are still insufficiently stable.
[0004]
On the other hand, microparticles (lipid microspheres) coated with soybean oil encapsulating drugs with lecithin have been studied, and preparations in which various anti-inflammatory drugs are encapsulated in such lipid microspheres have been clinically applied. However, lipid microspheres, like liposomes, are unsatisfactory because they do not fully function as drug carriers because of their low stability in blood and their ability to migrate to the reticuloendothelial system. I do not get.
[0005]
The present inventors have heretofore formed a block copolymer composed of polyethylene glycol as a hydrophilic chain and a polyamino acid as a hydrophobic chain to form a stable micelle-like nano-aggregate in water or phosphate buffer, It has been clarified that a polymer micelle medicine that can stably and efficiently encapsulate an anticancer drug such as adriamycin can be obtained in this nano-aggregate (Masayuki Yokoyama, et al. “New drug using polymer micelle” Carrier System ", Drug Delivery System, Vol. 6, No. 2, pp. 77-81, 1991). Furthermore, when this polymeric micelle is injected intravenously, it is stable in the blood for a long period of time, and its particle size is several tens of nanometers. It has been clarified that the high anticancer activity of the drug is developed together with the reduction of side effects of the cancer drug.
However, in order to enhance the therapeutic effect of drugs on cancer, it is desired to develop a drug carrier that has higher tissue directivity and also has release control that releases the drug only for the required period. Yes.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is a novel drug carrier that can enhance the accumulation at a target site by temperature change, that is, micelle formation at a low temperature side and precipitation formation at a high temperature side reversibly at a specific temperature. An object is to provide a novel block copolymer.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors made extensive studies based on the above problems. As a result, the AB block copolymer containing an acrylamide chain having an alkyl substituent and a relatively hydrophobic chain is a compound that reversibly causes micelle formation and precipitation in response to temperature. As a result, the present invention has been completed.
That is, the present invention provides the following general formula (I)
[0008]
[Chemical formula 5]

[0009]
(Wherein R ¹ And R ² May be the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkyl group, and m represents an integer of 5 to 500. )
A chain composed of repeating units of a polyacrylamide derivative represented by the following general formula (II)
[0010]
[Chemical 6]

[0011]
(Wherein R ^Three Represents a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group, and Z is an unsubstituted or lower alkyl group, a perfluoroalkyl group, an alkyloxy group or a phenyl group substituted with a halogen atom, a lower alkyl group, an alkyloxy group, a cyano group. Or -COOR ^Four A group represented by (provided that R ^Four Represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group. N represents an integer of 1 to 500. )
A block copolymer containing a chain of repeating units represented by
[0012]
An example of the polyacrylamide derivative is polyisopropylacrylamide.
Furthermore, the present invention is a temperature-responsive polymer micelle containing the block copolymer.
[0013]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The block copolymer of the present invention is an AB type block copolymer containing an acrylamide chain having an alkyl substituent and a relatively hydrophobic chain, and is micelle on the low temperature side at a specific temperature in water. When the material that has been dissolved in the solution is transferred to the high temperature side, aggregates are formed and precipitates are formed. When the solution is returned to the low temperature side, micelles are formed and dissolved.
[0014]
Here, the specific temperature means a temperature that becomes a boundary between micelle formation and precipitation generation. And the temperature of this boundary can be set in a wide range by changing the substituent of the polyacrylamide derivative. The above temperature is usually 5 to 75 ° C. For example, when the substituent of the polyacrylamide derivative is a normal propyl group, a cyclopropyl group, or an ethyl group, the boundary temperatures may be 21.5 ° C, 45.5 ° C, and 72 ° C, respectively. it can. In the case of a block copolymer of polyisopropylacrylamide and polystyrene, the boundary temperature is 30 to 35 ° C, preferably 32 ° C.
The manufacturing method of the block copolymer of this invention is shown below.
The block copolymer of the present invention has, for example, the general formula (III)
[0015]
[Chemical 7]

[0016]
(In the formula, A represents the general formula (I)
[0017]
[Chemical 8]

[0018]
(Wherein R ¹ And R ² Are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkyl group, and represents a chain composed of repeating units of a polyacrylamide derivative represented by: X represents an alkyl group substituted with an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group or a halogen atom Or represents a phenyl group. )
A polymer having a functional group at one end represented by formula (IV)
[0019]
[Chemical 9]

[0020]
(In the formula, B represents the general formula (II)
[0021]
[Chemical Formula 10]

[0022]
(Wherein R ^Three Represents a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group, and Z represents an unsubstituted or lower alkyl group, a perfluoroalkyl group, a lower alkyloxy group or a phenyl group substituted with a halogen atom, a lower alkyl group, an alkyloxy group, a cyano group. Group or -COOR ^Four A group represented by (provided that R ^Four Represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group. ). ), And Y represents an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group. )
It can be easily obtained by reacting a polymer having a functional group at one end with a known method.
Here, in the formula I, examples of the alkyl group include those having 1 to 6 carbon atoms, which may be linear or branched.
[0023]
In Formula II, R ^Three Among them, the lower alkyl group includes 1 to 6 carbon atoms, the lower alkyloxy group among Z includes 1 to 6 carbon atoms, the lower alkyl group includes 1 to 6 carbon atoms, the halogen atom includes fluorine, Examples include chlorine, bromine, iodine, and astatine. In addition, R ^Four Among them, examples of the hydrocarbon group include an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms and a cycloalkyl group having 3 to 12 carbon atoms.
The polyacrylamide derivative represented by the general formula (I) is, for example, the general formula (V)
[0024]
Embedded image

[0025]
(Wherein R ¹ And R ² Is the same as described above. )
A monomer represented by general formula (VI)
[0026]
Embedded image

[0027]
(In the formula, X is the same as described above.)
In the presence of a compound represented by the formula:
Specific examples of the halogen atom and the alkyl group are the same as described above.
[0028]
For the radical polymerization method, known methods such as bulk polymerization, solution polymerization, and emulsion polymerization can be used, and the polymerization is efficiently started by adding a radical initiator. As the radical initiator suitably used for the reaction, organic peroxides such as dilauroyl peroxide, benzoyl peroxide, di-t-butyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, cumene hydroperoxide, or α, α-azobisiso Examples include azo compounds such as butyronitrile and azobiscyclohexanecarbonitrile.
[0029]
Examples of the solvent that can be used for the radical polymerization reaction in this case include water, methanol, ethanol, normal propanol, isopropanol, 1-butanol, isobutanol, hexanol, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, Acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and the like can be used, but are not limited thereto. The reaction normally proceeds smoothly within a range of 40 ° C to 100 ° C.
[0030]
The monomer represented by the general formula (V) is a known compound, and examples of the monomer used here include acrylamide, methylacrylamide, dimethylacrylamide, ethylacrylamide, diethylacrylamide, methylethylacrylamide, n-propylacrylamide, and isopropylacrylamide. , Dipropylacrylamide, diisopropylacrylamide, methylpropylacrylamide, methylisopropylacrylamide, ethylisopropylacrylamide, butylacrylamide, s-butylacrylamide, t-butylacrylamide, dibutylacrylamide, methylbutylacrylamide, ethylbutylacrylamide, propylbutylacrylamide, pentylacrylamide For example, hexylacrylamide It can be.
[0031]
The compound represented by the general formula (VI) is known, and examples of the compound used here include aminomethanethiol, aminoethanethiol, aminoethanethiol hydrochloride, 3-aminopropanethiol, 3-aminopropanethiol hydrochloride, 2-aminopropanethiol, 4-aminobutanethiol, 3-aminobutanethiol, 2-aminobutanethiol, 5-aminopentanethiol, 6-aminohexanethiol, 8-aminooctanethiol, 10-aminodecanethiol, 12- Aminododecanethiol, 18-aminohexadecanethiol, 2-aminothiophenol, 4-aminothiophenol, thioglycolic acid, 2-mercaptopropionic acid, 3-mercaptopropionic acid, 2-mercaptoethanol, 3-mercaptoethanol, 3- Me Captopropanol, 4-mercaptobutanol, 6-mercaptohexanol, 10-mercaptodecanol, 12-mercaptododecanol, 16-mercaptohexadecanol, 4-hydroxythiophenol, 2-chloroethanethiol, 2-bromoethanethiol, 3 -Chloropropanethiol, 4-bromobutanethiol, thiosalicylic acid and the like can be exemplified.
The polymer represented by the general formula (II) is, for example, the general formula (VII)
[0032]
Embedded image

[0033]
(Wherein R ^Three Is the same as described above. )
The monomer represented by can be easily obtained by radical polymerization in the presence of the compound represented by the general formula (VI) as described above.
[0034]
Examples of the monomer having a vinyl group represented by the general formula (VII) include styrene derivatives such as styrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene and pentafluorostyrene, alkenes such as ethylene, propylene, butene and isoprene, ethyl Vinyl ethers such as vinyl ether, propyl vinyl ether, hexyl vinyl ether, octyl vinyl ether, acrylic acid esters such as methyl acrylate, ethyl acrylate, butyl acrylate, polyfluoro acrylate, p-fluorophenyl acrylate, m-trifluoromethyl phenyl acrylate, methyl methacrylate , Ethyl methacrylate, propyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, benzyl methacrylate, perfluoroalkyl methacrylate Examples include methacrylic esters such as relate, acrylonitrile, and the like.
[0035]
The block copolymer of the present invention is AB type, that is, a chain of A consisting of only one type of monomer and a chain of B consisting of only one type of monomer are combined in a block form. It has a structure and can be obtained by reacting a polymer represented by general formula (III) with a polymer represented by general formula (IV). In this case, as a combination of the polymer represented by the general formula (III) and the polymer represented by the general formula (IV), the substituents X and Y at one terminal of each polymer are preferably different. That is, when the substituent X or Y at one terminal of the polymer represented by the general formula (III) or the general formula (IV) is an alkyl group or a phenyl group substituted with a carboxyl group, the general formula (IV) to be reacted respectively. Alternatively, the substituent Y or X at one terminal of the polymer represented by the general formula (III) is preferably a hydroxyl group, an alkyl group substituted with an amino group, or a phenyl group from the viewpoint of easy reaction.
[0036]
For example, when the substituent X at one end of the polymer represented by the general formula (III) is a carboxyl group, the substituent Y at one end of the polymer represented by the general formula (IV) is a hydroxyl group, A block copolymer is obtained by easily reacting in the presence of an acidic catalyst to form an ester bond.
[0037]
Examples of the acidic catalyst used in the reaction include sulfuric acid, hydrochloric acid, p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, trifluoroacetic anhydride, and trifluoromethanesulfonic anhydride. This reaction is preferably carried out in an organic solvent, and any solvent may be used as long as it dissolves the polymer but is not related to the reaction. For example, chloroform, dichloromethane, dichloroethane, benzene, toluene, xylene , Acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and the like, but are not limited thereto. The reaction normally proceeds smoothly within the range of 0 ° C to 100 ° C.
[0038]
Furthermore, by converting the substituent X or Y at one end of the general formula (III) or general formula (IV) from a carboxyl group to an acid chloride, the substituent Y or X at one end is a hydroxyl group or an amino group, respectively. A block copolymer is obtained by easily reacting with a polymer of general formula (IV) or general formula (III) to form an ester bond or an amide bond, respectively. Conversion to an acid chloride can be easily synthesized by a known method using thionyl chloride, phosphorus trichloride, phosphorus pentoxide or the like. When a polymer having an acid chloride at one end and a polymer having an amino group or a hydroxyl group at one end are reacted, the reaction proceeds suitably in an inert gas atmosphere in an organic solvent. The solvent used may be any solvent that dissolves the polymer but is not related to the reaction, such as chloroform, dichloromethane, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, ethyl acetate, Acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and the like can be used, but are not limited thereto.
[0039]
This reaction is preferably carried out in the presence of a basic substance. Lithium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydroxide, aluminum hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, potassium acetate, sodium acetate sodium phosphate, sodium hydride, hydrogen Calcium chloride, pyridine, triethylamine, N, N-dimethylaniline and the like are preferably used.
[0040]
When the substituent X or Y at one end of the general formula (III) or general formula (IV) is a carboxyl group, each of the substituent Y or X at one end is a hydroxyl group or an amino group by using a condensing agent. It reacts easily with the polymer of the general formula (IV) or the general formula (III) to form an ester bond or an amide bond, respectively, thereby obtaining a block copolymer.
[0041]
As the condensing agent used in this reaction, dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N′-3-dimethylaminopropylcarbodiimide, benzotriazol-1-yl-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphide diphenylphosphoryl azide And can be used alone or in combination with N-hydroxysuccinimide, 1-hydroxybenzotriazole and the like. In this case, it is preferably carried out in an organic solvent, and any solvent can be used as long as it dissolves the polymer but is not related to the reaction. For example, chloroform, dichloromethane, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, acetone , Methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, ethyl acetate, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and the like can be used, but are not limited thereto. The reaction normally proceeds smoothly within the range of 0 ° C to 100 ° C.
[0042]
When the substituent X or Y at one end of the polymer represented by the general formula (III) or the general formula (IV) is an alkyl group or a phenyl group substituted with a halogen atom, the general formula (IV) or the general formula ( The substituent Y or X at one end of the polymer represented by III) is preferably an amino group, an alkyl group substituted with a hydroxyl group, or a phenyl group from the viewpoint of ease of reaction.
[0043]
The alkyl group or phenyl group substituted with the halogen atom at one end of the polymer represented by the general formula (III) or general formula (IV) is one end of the polymer represented by the general formula (III) or general formula (IV). It easily reacts with the amino group of the substituent, and a block copolymer is obtained through an amino bond. The reaction is preferably carried out in an organic solvent, and any solvent may be used as long as it does not participate in the reaction. Methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, diethyl ether, propyl ether, isopropyl ether, chloroform, Examples include, but are not limited to, dichloromethane, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, ethyl acetate, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and the like. is not.
[0044]
The alkyl group or phenyl group substituted with the halogen atom at one end of the polymer represented by the general formula (III) or general formula (IV) is one end of the polymer represented by the general formula (III) or general formula (IV). It easily reacts with the hydroxyl group of the substituent in order to obtain a block copolymer via an ether bond.
[0045]
The reaction suitably proceeds in an organic solvent under an inert gas atmosphere. Any solvent may be used as long as it does not participate in the reaction. Benzene, toluene, xylene, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide However, the present invention is not limited to these examples. This reaction is preferably performed in the presence of a basic substance, such as lithium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydroxide, aluminum hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, potassium acetate, sodium acetate, sodium phosphate, sodium hydride, Calcium hydride and the like are preferably used.
[0046]
The polymer micelle of the present invention can be prepared by dissolving the block copolymer of the present invention in an organic solvent and dialysis against water. Any organic solvent can be used as long as it can be freely mixed with water. Methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetone, methyl ethyl ketone, dioxane, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide and the like can be mentioned, but are not limited thereto. The dialysis membrane to be used is not particularly limited as long as the dialysis membrane has solvent resistance to the organic solvent in which the polymer is dissolved. For example, commercially available porous membranes having various pore sizes such as cellulose-based membranes are preferably used.
[0047]
In addition, the temperature-responsive micelle formed from the block copolymer of the present invention has a structure in which relatively hydrophobic chains aggregate in water to form nuclei and are surrounded by a polyacrylamide derivative. Yes. The polyacrylamide derivative dissolves on the low temperature side at the temperature inherent to the chain, and forms an aggregated structure on the high temperature side and becomes insoluble.
Therefore, in the polymer micelle of the present invention, it dissolves based on micelle formation on the low temperature side and becomes insoluble and precipitates on the high temperature side. When this precipitate is cooled again, it takes a micellar structure and dissolves again, and this dissolution and precipitation are reversible with respect to temperature changes. FIG. 3 shows a schematic diagram of a polymeric micelle formed by a block copolymer containing polyisopropylacrylamide and polystyrene as an example.
[0048]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to production examples and examples. However, it goes without saying that the present invention is not limited to these examples.
[0049]
[Production Examples 1-2] Synthesis of polymer of polyacrylamide derivative
Amounts listed in Table 1 Isopropylacrylamide (IPAAm), aminoethanethiol (AESH), azobisisobutronitrile (AIBN), N, N-dimethylformamide (DMF) are placed in a glass polymerization tube and degassed by conventional methods , Sealed. After stirring for a predetermined time at 70 ° C., the mixture was precipitated in a large amount of diethyl ether. The precipitated polymer was collected and dried, then redissolved in N, N-dimethylformamide and precipitated in a large amount of diethyl ether. The precipitate was collected and dried under vacuum to obtain a polymer having an amino group at one end in the amount shown in Table 1. As a result of terminal group determination, the number average molecular weights were 42,000 and 25,000 in Production Examples 1 and 2, respectively, and the average severity m of IPAAm was 370 and 220, respectively.
[0050]
[Table 1]

[0051]
The reaction formula is shown below.
[0052]
Embedded image

[0053]
[Production Examples 3 to 4] Synthesis of a polymer having a carboxyl group at one end
Styrene (St), mercaptopropionic acid (MEPA), azobisisobutronitrile (AIBN), and N, N-dimethylformamide (DMF) were placed in a glass polymerization tube and degassed and sealed by a conventional method. After stirring at 70 ° C. for a predetermined time, it was precipitated in a large amount of methanol. The precipitated polymer was collected and dried, then dissolved in N, N-dimethylformamide and precipitated again in a large amount of methanol. The precipitate was collected and dried under vacuum to obtain a polymer having a carboxyl group at one end in the amount shown in Table 2. As a result of terminal group determination, the number average molecular weights in Production Examples 3 and 4 were 4,600 and 16,000, respectively, and the average degree of polymerization n was 45 and 150, respectively.
[0054]
[Table 2]

[0055]
The reaction formula is shown below.
[0056]
Embedded image

[0057]
[Example 1]
0.46 g of polyisopropylacrylamide having an amino group at one end obtained in Production Example 1, 0.54 g of polystyrene having a carboxyl group at one end obtained in Production Example 3, and 0.021 g of N-hydroxysuccinimide in 7 ml of dioxane. Dissolved. A solution prepared by dissolving 0.037 g of dicyclohexylcarbodiimide in 2 ml of dioxane was slowly added dropwise under ice cooling. After stirring for 24 hours at room temperature, the precipitate was separated by filtration, and the filtrate was concentrated and precipitated in cyclohexane heated to 40 ° C. to remove excess polystyrene. The precipitate was collected, dried, purified again by dissolving in dioxane and precipitating in warm cyclohexane. The precipitated polymer was collected and vacuum dried to obtain 0.40 g of a block copolymer composed of isopropylacrylamide and styrene. Infrared absorption spectrum analysis of the resulting block copolymer and ¹ The results of H-NMR spectrum analysis are shown below. ¹ In the H-NMR spectrum data, the symbol represented by ““ H ”” represents a proton attributed to the chemical shift.
[0058]
IR ν (KBr, cm ^-1 ); 3440, 3300 3080, 2970, 2940, 1650, 1550, 1460, 1390, 1370, 1170, 1130, 700
¹ H-NMR δ (ppm, CDCl _Three ); 1.05-1.25 (m, -CH (C "H" _Three ) ₂ ), 1.25-2.40 (m, -C "H" ₂ C "H"-(based on isopropylacrylamide linkage) and -C "H" ₂ C "H"-(based on styrene chain)), 4.00 (m -C "H" (CH _Three ) ₂ , 5.80-6.50 (m, -CON "H"-), 6.50-7.30 (m, benzene ring)
Further, when the degree of polymerization m: n of each chain in the obtained block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene is determined from the ratio of C% and N% of elemental analysis,
Calculated value m: n = 89: 11
Observed value (from elemental analysis) m: m = 89: 11
Thus, the synthesis of the target block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene was confirmed.
The reaction formula is shown below.
[0059]
Embedded image

[0060]
[Example 2]
0.06 ml of thionyl chloride was added to 1.56 ml of dioxane solution containing 0.31 g of polystyrene having a carboxyl group at one end obtained in Production Example 4, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 days. After removing the solvent and excess thionyl chloride by lyophilization, 0.004 g triethylamine and 1.56 ml dioxane were added. 3 ml of a pyridine solution containing 0.047 g of polyisopropylacrylamide having an amino group at one end obtained in Production Example 2 was added and reacted at 45 ° C. for 2 days. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, 2 ml of dioxane was added, and the mixture was precipitated in diethyl ether. The obtained precipitate was collected and dried under reduced pressure to obtain 0.078 g of a block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene. As a result of infrared absorption spectrum analysis of the obtained block copolymer, the spectrum was the same as that of the compound obtained in Example 1. The result of 1H-NMR spectrum analysis was the same as that of the compound obtained in Example 1 except that the intensity ratio of the peaks was different. Further, when the degree of polymerization m: n of each chain in the obtained block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene is determined from the ratio of C% and N% of elemental analysis,
Calculated value m: n = 53: 47
Observed value (from elemental analysis) m: m = 59: 41
Thus, the synthesis of the target block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene was confirmed.
The reaction formula is shown below.
[0061]
Embedded image

[0062]
[Examples 3 to 4]
50.0 mg of the block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene obtained in Example 1 was dissolved in 6.0 ml of DMF and stirred overnight at 5 ° C. This solution was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.5 mm, placed in a cellulose dialysis tube having a molecular weight cut off of 12,000, and dialyzed in distilled water for 25 hours. Distilled water was changed after 45, 60, 90 and 120 minutes. After completion of dialysis, 40.5 mg of dry sample was obtained by freeze-drying.
[0063]
In the case of the block copolymer obtained in Example 2, a 20.0 mg sample was dialyzed from a 3.0 ml DMF sample in the same manner to obtain a 16.0 mg dry sample. Prepare 100 mg / ml, 50 mg / ml, 25 mg / ml, 10 mg / ml, 7.5 mg / ml, 5 mg / ml, 2.5 mg / ml aqueous solutions of the obtained samples, and add 4.8 × 10 6 of pyrene to each aqueous solution. ^-Four Add ethanol solution of M to bring the total pyrene concentration to 6.0 × 10 ^-7 Adjusted to M.
[0064]
The result of measuring the fluorescence spectrum of each sample solution obtained from Examples 1 and 2 is shown in FIG. From FIG. 1, it was confirmed that the block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene obtained in Examples 1 and 2 formed micelles in an aqueous solution, and the critical micelle concentration was 10 mg / l.
[0065]
[Examples 5 to 6]
2.0 mg of the block copolymer containing isopropylacrylamide and styrene obtained in Examples 1 and 2 was dissolved in 2 ml of distilled water, and dynamic light scattering measurement was performed. As a result of the measurement, the micelles obtained from the block copolymer of Example 1 had a number average particle size of 98.0 nm and a weight average particle size of 127.8 nm, respectively, and were obtained from the block copolymer of Example 2. Since the number average particle diameter of each of these was 125.1 nm and the weight average particle diameter was 147.4 nm, the block copolymers obtained in Examples 1 and 2 formed polymer micelles having a uniform particle diameter in water. It was confirmed.
[0066]
[Examples 7 to 8]
The aqueous solution of the block copolymer 0.5% obtained in Examples 1 and 2 was prepared, and the temperature responsiveness was examined by measuring the transmittance at 500 nm using an ultraviolet / visible spectrophotometer. FIG. 2 shows the relationship between the temperature and the transmittance of visible light at 500 nm. The permeability decreased rapidly at 32.0 ° C and changed from a clear aqueous solution to a cloudy aqueous solution. This shows that the micelle formation was changed to the aggregate at this temperature, and it was confirmed that the micelle formed by the block copolymers obtained in Examples 1 and 2 showed temperature responsiveness in an aqueous solution.
[0067]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a new block copolymer that reversibly causes micelle formation on the low temperature side and precipitation formation on the high temperature side at a specific temperature.
The block copolymer of the present invention forms stable polymer micelles having a uniform particle size in water, and also has temperature responsiveness. Therefore, in particular, it transports drugs that require long-term administration and drugs that are easily decomposed. Although it is suitably used as an injection for the body, it can also be used for preparations for transmucosal absorption such as oral, nasal, transpulmonary, and vaginal or for transdermal absorption. In response to the temperature applied from the outside, the accumulation of drugs in the affected area is increased, or polymer micelles themselves accumulate in the affected area that has risen due to an inflammatory reaction etc. It is possible to solve the problems of the conventional drug carrier. Furthermore, it is extremely useful because it can be used for cosmetic purposes.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the concentration of a block copolymer and the peak intensity ratio of 374 nm and 386 nm in a pyrene fluorescence spectrum.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the temperature of a polymer micelle aqueous solution made of a block copolymer and the visible light transmittance at 500 nm.
FIG. 3 is a schematic diagram of polymer micelle formation by the block copolymer of the present invention.

Claims

The following general formula (I)

(Wherein R ¹ and R ² may be the same or different, R ¹ represents a hydrogen atom or an isopropyl group, a normal propyl group, a cyclopropyl group, or an ethyl group ; R ² represents an isopropyl group, a normal propyl group, a cyclo A propyl group or an ethyl group, m represents an integer of 5 to 500) and a chain composed of repeating units of a polyacrylamide derivative represented by the following general formula (II)

(Wherein R ³ represents a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group, Z represents an unsubstituted or lower alkyl group, a perfluoroalkyl group, an alkyloxy group or a phenyl group substituted with a halogen atom, a lower alkyl group, An AB type block copolymer containing a chain composed of repeating units represented by an alkyloxy group or a cyano group, and n represents an integer of 1 to 500.

The block copolymer according to claim 1, wherein the polyacrylamide derivative is polyisopropylacrylamide.

A chain composed of a repeating unit of a polyacrylamide derivative represented by general formula (I) having a functional group at one end and a chain composed of a repeating unit represented by general formula (II) having a functional group at one end are reacted. The block copolymer according to claim 1 or 2, wherein the block copolymer is obtained.

The following general formula (I)

(Wherein R ³ represents a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group, Z represents an unsubstituted or lower alkyl group, a perfluoroalkyl group, an alkyloxy group or a phenyl group substituted with a halogen atom, a lower alkyl group, A repeating unit represented by an alkyloxy group, a cyano group or a group represented by —COOR ⁴ (wherein R ⁴ represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group, and n represents an integer of 1 to 500). A temperature-responsive polymer micelle comprising an AB type block copolymer comprising a chain comprising:

The temperature-responsive polymer micelle according to claim 3, wherein the polyacrylamide derivative is polyisopropylacrylamide.

The AB type block copolymer has a chain composed of a repeating unit of a polyacrylamide derivative represented by the general formula (I) having a functional group at one end, and a repeat represented by the general formula (II) having a functional group at one end. The temperature-responsive polymer micelle according to claim 4 or 5, which is obtained by reacting a chain comprising units.