JP3799784B2

JP3799784B2 - Process for producing 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside and 2'-deoxyguanosine

Info

Publication number: JP3799784B2
Application number: JP31320797A
Authority: JP
Inventors: 健三横関; 尚志辻; 邦輔井澤
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2017-11-14
Also published as: US6197552B1; EP0916735B1; DE69840863D1; EP0916735A1; JPH11137289A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ウィルス剤等の医薬原料、特に最近話題になっているアンチセンス医薬の原料として使用される２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドおよび２’−デオキシグアノシンの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
２’−デオキシグアノシンの製造法としては化学合成法の収率が非常に低いため、工業的製造法はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の加水分解物よりの抽出が中心となっている。しかし、従来の抽出法においては、ＤＮＡの加水分解物中に目的の２’−デオキシグアノシン以外に２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、チミジンが含まれており、２’−デオキシグアノシンのみを採取するための抽出工程が煩雑、コスト高の観点から、更に効率の良い方法の開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドおよび２’−デオキシグアノシンを高収率で効率良く製造する方法の提供である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、効率の良い２’−デオキシグアノシンの製造法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、
（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸またはその塩と２，６−ジアミノプリンまたはその塩に微生物を作用させることにより、２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドが効率良く生産できること、
（２）２’−デオキウリジンもしくはチミジンと２，６−ジアミノプリンまたはその塩に無機リン酸もしくはその塩の存在下で微生物を作用させることにより２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドが効率よく生産できること、
（３）上記（１）、（２）の方法で安定安価に生産供給される２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを基質に用い、これにアデノシンデアミナーゼを作用させると高収率で２’ーデオキシグアノシンが生産できること
を見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
即ち本発明は、
（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸またはその塩と２，６−ジアミノプリンから２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生成する能力を有し、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を２’−デオキシリボース−１−リン酸またはその塩と２，６−ジアミノプリンに作用させ、生成される２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを採取することを特徴とする２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドの製造法、
（２）無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキシウリジンもしくはチミジンと２，６−ジアミノプリンから２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生成する能力を有し、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキシウリジンもしくはチミジンと２，６−ジアミノプリンに作用させ、生成される２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを採取することを特徴とする２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドの製造法、および、
（３）上記（１）または（２）に記載の製造法で２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを製造し、次いで、得られた２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドにアデノシンデアミナーゼまたは該酵素含有物を水性媒体中で作用せしめ２’−デオキシグアノシンを生成蓄積させることを特徴とする２’−デオキシグアノシンの製造法、
に関するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドの生産において使用される微生物は、アクロモバクタ−属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バクテリウム属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属し、２’−デオキシリボース−１−リン酸またはその塩と２，６−ジアミノプリンから２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生成する能力または無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキシウリジンもしくはチミジンと２，６−ジアミノプリンから２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生成する能力を有するものであればいずれのもでも良いが、具体的には下記に示す微生物を例示することができる。
【０００７】

上記菌株の内、キサントモナスシトリ (Xanthomonas citri) AJ 2785(FERM P-3396)は、国際寄託当局：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に昭和５１年１月２７日に寄託された受託番号FERM P-3396の菌株であり、クルイヘラシトロフィラ (Kluyvera citrophila) AJ 2626(FERM P-8193)は、同寄託当局に昭和６０年４月２３日に寄託された受託番号FERM P-8193の菌株であり、ザルチナルテア (Sartina lutea) AJ 1218(FERM P-7400)は、同寄託当局に昭和５９年１月２０日に寄託された受託番号FERM P-7400の菌株であり、サルモネラチフミリウム (Salmonella typhimurium) AJ 2636(FERM P-3753)は、同寄託当局に昭和５１年１０月６日に寄託された受託番号FERM P-3753の菌株であり、プラノコッカスユーシナタス (Planococcus eucinatus) AJ 1656(FERM P-9133)は、同寄託当局に昭和６２年１月１９日に寄託された受託番号FERM P-9133の菌株であり、プロテウスレッテゲリ (Proteus rettegeri) AJ 2770(FERM BP-941)は、同寄託当局に昭和６０年４月２５日に寄託され、昭和６０年１１月２８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号FERM BP-941の菌株であり、リゾビウムメィロッティ (Rhizobium melilotti) AJ 2823(FERM P-8197)は、同寄託当局に昭和６０年４月２５日に寄託された受託番号FERM P-8197の菌株である。
【０００８】
これらの微生物を用いて２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生成せしめる方法は、微生物の培養中に基質を添加する培養法を用いても良いし、また培養した菌体あるいはこの処理物を基質に作用させる静止菌体法を用いても良い。
【０００９】
培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、リン源、Ｓ源、無機イオン等、更に必要ならばビタミン、有機窒素源を含有する通常の培地を用いれば良い。
炭素源としては、グルコ−ス等の炭水化物、グリセロ−ル等のアルコ−ル類、酢酸等の有機酸、窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸およびその塩等、リン源としてはリン酸１カリウム等の無機リン酸およびその塩等、Ｓ源としては硫酸マグネシウム等、無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ−ンスティ−プリカ−、カゼイン分解物その他が適宜用いられる。培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下pH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度を適当に制限しつつ12〜72時間程度培養を行なえばよい。
具体的には、（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸から２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生産する場合には、上記基本培地に２’−デオキシリボース−１−リン酸と、２，６−ジアミノプリンを、（２）２’−デオキシウリジンもしくはチミジンから２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生産する場合には、上記基本培地に２’−デオキシウリジンもしくはチミジンと、２，６−ジアミノプリンを適宜添加して微生物の培養を行えば良い。上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない。
【００１０】
静止菌体法を用いる場合の酵素源としては、上記の方法で得られた培養液そのまま、あるいは洗浄菌体が使用できる他、菌体処理物も使用できる。菌体処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の超音波あるいはダイノミルあるいはフレンチプレス等処理物、界面活性剤またはトルエン等に接触せしめた菌体、リゾチーム、プロテアーゼ等の酵素処理した菌体、菌体より抽出した後、透析処理等で分離したタンパク画分、本反応の酵素活性を有する精製酵素、更に上記菌体または処理物の固定化物等何れもが使用できる。
具体的には、（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸から２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生産する場合には、上記基本培地に２’−デオキシリボース−１−リン酸と、２，６−ジアミノプリンを、（２）２’−デオキシウリジンもしくはチミジンから２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを生産する場合には、上記基本培地に２’ーデオキシウリジンもしくはチミジンと、２，６−ジアミノプリンを含む水溶液に前記微生物菌体またはその処理物を添加し適宜添加して反応を行えば良い。
【００１１】
反応は通常、温度２０〜８０℃、望ましくは４０〜７０℃で、ｐＨ３〜１１望ましくはｐＨ４〜１０が好結果を与える。反応には静置あるいは攪拌のいずれの方法も採用し得る。反応時間は使用する酵素の活性、基質濃度などの条件によって異なるが、１０分〜１０日間保持反応させれば良い。
【００１２】
上記により得られた２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドにアデノシンデアミナーゼまたは該酵素含有物を水性媒体中で作用せしめることで、２’−デオキシグアノシンを製造することができる。２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドは、上記反応液から分離をせずにアデノシンデアミナーゼを作用させて２’−デオキシグアノシンに作用させても良いし、反応終了混合物より採取分離した後、作用させても良い。採取分離の方法としては、合成吸着樹脂を用いる方法や、その他通常の採取分離方法が適用可能である。
【００１３】
アデノシンデアミナーゼは、アデノシンをイノシンに変換する能力を有する酵素であるが、本発明者らは、アデノシンデアミナーゼが２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを２’−デオキシグアノシンに変換する能力も有することを見いだした。従って、本発明のアデノシンデアミナーゼの作用による２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドからの２’−デオキシグアノシンの生産において使用されるアデノシンデアミナーゼは、２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを２’−デオキシグアノシンに変換できるものであればその起源を問わずいずれも使用できる。具体的には動物由来としては、ウシ腸由来、脾臓由来のもの等が使用でき、微生物由来としては酵素ハンドブック（１９９３年４月２０日第８刷、第６０５頁、朝倉書店）に記載のものが使用できる。
【００１４】
また、特開平02-291291号公報に記載のもの、すなわち、アシネトバクター属、エアロモナス属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、セルロモナス属、シトロバクター属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、ハフニア属、クレブシェラ属、クルイヘラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ノカルディア属、プラノコッカス属、プロタミノバクター属、プロテウス属、シュードモナス属、リゾビウム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属またはキサントモナス属に属し、２’，３’−ジデオキシアデノシンを２’，３’−ジデオキシイノシンに変換する能力を有する微生物由来のアデノシンデアミナーゼが使用可能であるが、具体的には下記に例示した微生物由来のアデノシンデアミナーゼが使用可能である。
【００１５】
Acinetobacter lwoffii ATCC 9036
Aeromonas salmonicida ATCC 14174
Alcaligenes faecalis FERM BP-940
Arthrobacter citreus ATCC 11624
Bacillus firmus ATCC 8247
Brevibacterium pusillum ATCC 19096
Cellulomonas flavigena ATCC 491
Citrobacter freundii ATCC 8090
Corynebacterium aquaticum ATCC 14665
Escherichia coli FERM P-7404
Enterobacter cloacae ATCC 13047
Erwinia carotovora FERM P-2766
Flavobacterium aquatile ATCC 8375
Hafnia alvei ATCC 9760
Klebsiella pneumoniae ATCC 8308
Kluyvera citrophila FERM P-8193
Microbacterium imperiable ATCC 8365
Micrococcus luteus ATCC 400
Mycloplana dimorpha ATCC 4279
Nocardia restricta ATCC 14887
Planococcus citreus ATCC 15234
Protaminobacter alboflavus ATCC 8458
Proteus rettgeri FERM BP-941
Pseudomonas oleovorans ATCC 8062
Rhizobium meliloti FERM P-8197
Rhodococcus rhodochrous ATCC 12974
Salmonella typhimurium FERM P-9470
Arthrobacter ureafaciens FERM BP-2472
Serratia grimesii ATCC 14460
Staphyrococcus epidermidis ATCC 155
Streptomyces flavovirens IFO 3197
Vibrio metschnikovii ATCC 7708
Xantomonas citri FERM P-3396
【００１６】
上記菌株の内、Xanthomonas citri FERM P-3396は、国際寄託当局：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に昭和５１年１月２７日に寄託された受託番号FERM P-3396の菌株であり、Kluyvera citrophila FERM P-8193は、同寄託当局に昭和６０年４月２３日に寄託された受託番号FERM P-8193の菌株であり、Arthrobacter ureafaciens FERM BP-2472は、同寄託当局に昭和５８年４月２５日に寄託され、平成元年６月１４日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号FERM BP-2472の菌株であり、Salmonella typhimurium FERM P-9470は、同寄託当局に昭和６２年７月１１日に寄託された受託番号FERM P-9470の菌株であり、Escherichia coli FERM P-7404は、同寄託当局に昭和５９年１月２０日に寄託された受託番号FERM P-7404の菌株であり、Proteus rettegeri FERM BP-941は、同寄託当局に昭和６０年４月２５日に寄託され、昭和６０年１１月２８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号FERM BP-941の菌株であり、Rhizobium melilotti FERM P-8197は、同寄託当局に昭和６０年４月２５日に寄託された受託番号FERM P-8197の菌株であり、Alcaligenes faecalis FERM BP-940は、同寄託当局に昭和５９年１２月２４日に寄託され、昭和６０年１１月２８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号FERM BP-940の菌株であり、Erwinia carotovora FERM P-2766は、同寄託当局に昭和４９年１０月２９日に寄託された受託番号FERM P-2766の菌株である。
【００１７】
一方、該酵素（アデノシンデアミナーゼ）含有物としては、上記の微生物の培養液、培養菌体が使用できる他、菌体処理物である、アセトン処理菌体、菌体の磨砕物、界面活性剤あるいはトルエン等の処理菌体、リゾチーム等の酵素処理菌体、菌体より抽出した後、塩析・カラムクロマト等で分離したタンパク画分、アデノシンデアミナーゼ活性を有するタンパク画分の精製物、更に本菌体および菌体処理物の固定化物等が使用できる。動植物由来の該素含有物としては、該酵素を含有する部分の磨砕物の他、上記微生物由来酵素と同様な処理物、固定化物が使用できる。
【００１８】
アデノシンデアミナーゼを２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドに作用させる方法としては、２、６ージアミノプリンー２’ーデオキシリボシドを含む溶液にアデノシンデアミナーゼを添加し反応させれば良い。２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドにアデノシンデアミナーゼを作用させる反応は、通常、温度５〜５０℃、望ましくは１０〜４０℃で、ｐＨ４〜１０望ましくはｐＨ５〜９が好結果を与える。反応には静置あるいは攪拌のいずれの方法も採用し得る。反応中には、該酵素の作用によりアンモニアが生成し、反応液のｐＨが上昇するので、酵素の至適ｐＨに応じてｐＨを調整すれば好結果が得られる、反応時間は使用する酵素の活性、基質濃度などの条件によって異なるが、１０分〜５日間保持反応させれば良い。
【００１９】
また、２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド、２’−デオキシグアノシンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法で行えば良い。
以下、実施例にて本発明を詳細に説明する。
【００２０】
【実施例】
（実施例１）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン１0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養した第１表に示す微生物をそれぞれ１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM トリス−塩酸バッファー(pH 7.2)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM の２’−デオキシリボース−１−リン酸と 100 mM の２，６−ジアミノプリン・1/2硫酸塩を含む 50 mM のトリス−塩酸バッファー(pH 7.2) 10 ml に上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。反応液中に生成した２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を第１表に示した。
【００２１】
【表１】

【００２２】
（実施例２）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン１0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養した第２表に示す微生物をそれぞれ１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM リン酸バッファー(pH 7.0)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM の２’−デオキシウリジンと 100 mM の２，６−ジアミノプリン・1/2硫酸塩を含む50 mM のリン酸バッファー(pH 7.0) 10 ml に上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。
反応液中に生成した２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を第２表に示した。
【００２３】
【表２】

【００２４】
（実施例３）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン１0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養したクレブシエラニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae) IFO 3321 を１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM リン酸バッファー(pH 7.0)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM のチミジンと、100 mM の２，６−ジアミノプリン・1/2硫酸塩を含む50 mM のリン酸バッファー(pH 7.0) 10 ml に上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。
反応液中に生成した２，６−ジアミノプリンー２’ーデオキシリボシドの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、15.2 g/lの２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドが生成していた。
【００２５】
（実施例４）
２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを 20.0 g/l 含む 50 mM リン酸バッファー溶液および実施例２で得られたクレブシエラニューモニアエ(Klebsiellapneumoniae) IFO 3321 を用いた反応終了液（２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド 16.9 g/l 含有）5 ml (pH 7.0)にBoehringer 社製アデノシンデアミナーゼ（50% グリセロール溶液、仔ウシ腸由来、約 200 U/mg) をそれぞれ 50 μl 添加し、pH を 7.0に調製しながら 25℃にて１時間反応させた。
反応液中に生成した２’−デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、それぞれ 19.8 g/l（変換モル収率 99 %）、16.8 g/l（変換モル収率 99 %）であった。
【００２６】
（実施例５）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン１0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養したアースロバクターウレアファシエンス (Arthrobacter ureafaciens) (FERM BP-2472) を１白金耳接種し、30℃にて 16 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM トリスー塩酸バッファー(pH 7.2)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 20.0 g/l の２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドを含む 50 mM トリスー塩酸バッファー溶液(pH 7.2) に 5 g/l になるように添加し、pH を 7.2 に保持しながら 30℃、３時間反応させた。反応液中に生成した２’−デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、それぞれ 19.8 g/l（変換モル収率 99 %）であった。
【００２７】
【発明の効果】
上記のように、本発明によれば、高収率で容易かつ安価に２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドおよび２’−デオキシグアノシンを製造することが可能となる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and 2′-deoxyguanosine used as a raw material for pharmaceuticals such as antiviral agents, particularly antisense pharmaceuticals that have recently become a hot topic. Is.
[0002]
[Prior art]
As the production method of 2′-deoxyguanosine, the yield of chemical synthesis is very low, and therefore, the industrial production method is centered on extraction from a hydrolyzate of DNA (deoxyribonucleic acid). However, in the conventional extraction method, 2′-deoxyadenosine, 2′-deoxycytidine and thymidine are contained in the hydrolyzate of DNA in addition to the target 2′-deoxyguanosine, and only 2′-deoxyguanosine is contained. From the viewpoint of the complicated extraction process for collecting and the high cost, development of a more efficient method has been desired.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and 2′-deoxyguanosine in a high yield.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventor has conducted extensive studies to establish an efficient method for producing 2′-deoxyguanosine,
(1) Efficient production of 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside by allowing microorganisms to act on 2'-deoxyribose-1-phosphate or its salt and 2,6-diaminopurine or its salt What you can do,
(2) 2'-deoxyuridine or thymidine and 2,6-diaminopurine or a salt thereof are allowed to react with microorganisms in the presence of inorganic phosphoric acid or a salt thereof, whereby 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside is made efficient Be able to produce well,
(3) Using 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside, which is produced and supplied stably and inexpensively by the methods of (1) and (2) above, as a substrate, and adenosine deaminase is allowed to act on it, the yield is high. It was found that 2′-deoxyguanosine can be produced, and the present invention has been completed.
[0005]
That is, the present invention
(1) Ability to produce 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside from 2'-deoxyribose-1-phosphate or a salt thereof and 2,6-diaminopurine, Bacteria, Acinetobacter, Alkagenes, Arthrobacter, Aeromonas, Escherichia, Enterobacter, Erbinia, Xanthomonas, Klebsiella, Kurthia, Kluihera, Corynebacterium, Sartina, Salmonella Citrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Sporosartina, Staphylococcus, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Hafnia, Vibrio, Flavobacterium, Planococcus, Brevi Bacteria, Pro Cultures of microorganisms belonging to the genus Minobacter, Proteus, Haemophilus, Micrococcus, Mycoplana, Microbacteria, Rhizobium or Rhodococcus, microorganisms isolated from the culture, or processed microorganisms 2'-deoxyribose-1-phosphate or a salt thereof and 2,6-diaminopurine, and the produced 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside is collected. A process for producing 6-diaminopurine-2′-deoxyriboside,
(2) having the ability to produce 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside from 2'-deoxyuridine or thymidine and 2,6-diaminopurine in the presence of inorganic phosphoric acid or a salt thereof; Bacter spp., Agrobacterium spp. Genus, Salmonella, Citrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Sporosartina, Staphylococcus, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Hafnia, Vibrio, Flavobacterium, Plano Coccus A culture of a microorganism belonging to the genus Bibacteria, Protaminobacter, Proteus, Hemophilus, Micrococcus, Mycoplana, Microbacteria, Rhizobium or Rhodococcus, or a microbial cell isolated from the culture or 2,6-Diaminopurine-2′-deoxyriboribonucleic acid produced by reacting the treated microbial cells with 2′-deoxyuridine or thymidine and 2,6-diaminopurine in the presence of inorganic phosphoric acid or a salt thereof A process for producing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside, characterized by collecting the side, and
(3) 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside is produced by the production method described in (1) or (2) above, and then obtained 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside A method for producing 2′-deoxyguanosine, characterized in that adenosine deaminase or the enzyme-containing substance is allowed to act on an aqueous medium to produce and accumulate 2′-deoxyguanosine,
It is about.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Microorganisms used in the production of 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside of the present invention include Achromobacter genus, Agrobacterium genus, Acinetobacter genus, Alkaligenes genus, Aerobacter genus, Aeromonas genus, Escherichia genus, Enterobacter, Erbinia, Xanthomonas, Klebsiella, Kurthia, Kluhera, Corynebacterium, Sartina, Salmonella, Citrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Sporosartina, Staphylococcus, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacteria, Bacillus, Hafnia, Vibrio, Flavobacterium, Planococcus, Brevibacterium, Protaminobacter, Proteus, Hemophilus Belonging to the genus, Micrococcus, Mycoplana, Microbacteria, Rhizobium or Rhodococcus, 2'-deoxyribose-1-phosphate or a salt thereof and 2,6-diaminopurine to 2,6-diaminopurine- Ability to generate 2'-deoxyriboside or 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside from 2'-deoxyuridine or thymidine and 2,6-diaminopurine in the presence of inorganic phosphate or salt thereof Any of these may be used as long as they have the ability, but specific examples thereof include the following microorganisms.
[0007]

Among the above strains, Xanthomonas citri AJ 2785 (FERM P-3396) is an international depositary authority: Research Institute of Microbial Technology, Ministry of International Trade and Industry. ) Is the strain of deposit number FERM P-3396 deposited on January 27, 1976, and Kluyvera citrophila AJ 2626 (FERM P-8193) was registered with the depository authority in April 1985. It is a strain with the deposit number FERM P-8193 deposited on the 23rd, and Sartina lutea AJ 1218 (FERM P-7400) is deposited with the depositary authority on January 20, 1984. FERM P-7400 strain, Salmonella typhimurium AJ 2636 (FERM P-3753) is a strain of deposit number FERM P-3753 deposited on October 6, 1976 to the same depositary authority , Planococcus eucinatus AJ 1656 (FERM P-9133) , The strain of deposit number FERM P-9133 deposited on January 19, 1987, and Proteus rettegeri AJ 2770 (FERM BP-941) It is a strain of accession number FERM BP-941 deposited on April 25 and transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on November 28, 1985, and Rhizobium melilotti AJ 2823 (FERM P-8197 ) Is a strain having the deposit number FERM P-8197 deposited on April 25, 1985 with the same depositing authority.
[0008]
As a method for producing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside using these microorganisms, a culture method in which a substrate is added during the culture of the microorganisms may be used. A stationary cell method in which a substance acts on a substrate may be used.
[0009]
When the culture method is used, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, an S source, inorganic ions, etc., and if necessary, a vitamin and an organic nitrogen source may be used.
Examples of carbon sources include carbohydrates such as glucose, alcohols such as glycerol, organic acids such as acetic acid, and nitrogen sources such as ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, nitric acid and salts thereof, and phosphorus sources. Inorganic phosphoric acid and its salts such as monopotassium phosphate, magnesium sulfate as the S source, magnesium ions, potassium ions, iron ions, manganese ions, etc. are used as needed as inorganic ions . As organic nutrient sources, vitamins, amino acids and the like, and yeast extract, peptone, meat extract, cone-prica, casein degradation products and the like containing these are suitably used. The culture conditions are not particularly limited. For example, the culture may be performed for about 12 to 72 hours while appropriately limiting the pH and temperature within the range of pH 5 to 8 and temperature 25 to 40 ° C under aerobic conditions.
Specifically, (1) When 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside is produced from 2'-deoxyribose-1-phosphate, 2'-deoxyribose-1- When producing 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside from phosphoric acid and 2,6-diaminopurine and (2) 2'-deoxyuridine or thymidine, 2'-deoxy is added to the basic medium. Microorganisms may be cultured by appropriately adding uridine or thymidine and 2,6-diaminopurine. The substrate may be added at the beginning of the culture or during the culture.
[0010]
As an enzyme source in the case of using the static cell method, the culture solution obtained by the above method can be used as it is, or a washed cell can be used, and a cell-treated product can also be used. Examples of the treated cells include acetone-dried cells, ground cells, treated cells such as ultrasonic waves or dynomill or French press, and cells such as lysozyme and protease that have been brought into contact with a surfactant or toluene. Any of the treated cells, the protein fraction extracted from the cells, and then separated by dialysis treatment, a purified enzyme having the enzyme activity of this reaction, and the immobilized cells or the treated product can be used.
Specifically, (1) When 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside is produced from 2'-deoxyribose-1-phosphate, 2'-deoxyribose-1- When producing 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside from phosphoric acid and 2,6-diaminopurine (2) 2'-deoxyuridine or thymidine, 2'-deoxy is added to the basic medium. What is necessary is just to react by adding the said microbial cell or its processed material to the aqueous solution containing uridine or thymidine and 2, 6- diaminopurine, and adding suitably.
[0011]
The reaction is usually at a temperature of 20 to 80 ° C., preferably 40 to 70 ° C., and a pH of 3 to 11 and preferably a pH of 4 to 10 gives good results. Either a stationary method or a stirring method can be employed for the reaction. The reaction time varies depending on conditions such as the activity of the enzyme used and the substrate concentration, but it may be held for 10 minutes to 10 days.
[0012]
2'-deoxyguanosine can be produced by allowing the 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside obtained as described above to react with adenosine deaminase or the enzyme-containing substance in an aqueous medium. 2,6-Diaminopurine-2'-deoxyriboside may be reacted with 2'-deoxyguanosine by acting adenosine deaminase without being separated from the reaction solution, or after being collected and separated from the reaction mixture. , You may act. As a method for collecting and separating, a method using a synthetic adsorption resin and other ordinary collecting and separating methods can be applied.
[0013]
Adenosine deaminase is an enzyme that has the ability to convert adenosine to inosine, but we also have the ability for adenosine deaminase to convert 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside to 2'-deoxyguanosine. Found to have. Accordingly, the adenosine deaminase used in the production of 2′-deoxyguanosine from 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside by the action of the adenosine deaminase of the present invention is 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside. Any one can be used regardless of its origin as long as the side can be converted to 2'-deoxyguanosine. Specifically, those derived from bovine intestine and spleen can be used as animal origin, and those derived from microorganisms are those described in the Enzyme Handbook (April 20, 1993, 8th printing, page 605, Asakura Shoten). Can be used.
[0014]
Further, those described in JP-A-02-291291, namely, Acinetobacter genus, Aeromonas genus, Alcaligenes genus, Arthrobacter genus, Bacillus genus, Brevibacterium genus, Cellulomonas genus, Citrobacter genus, Corynebacterium genus, Escherichia, Enterobacter, Erbinia, Flavobacterium, Hafnia, Klebsiella, Kluyhera, Microbacterium, Micrococcus, Mycoplana, Nocardia, Planococcus, Protaminobacter, It belongs to the genus Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Serratia, Staphylococcus, Streptomyces, Vibrio or Xanthomonas, 2 ', 3'-dideoxyadenosine 2', 3 ' -Dideoxyinosine Adenosine deaminase derived from a microorganism having the ability to convert to a microorganism can be used. Specifically, adenosine deaminase derived from a microorganism exemplified below can be used.
[0015]
Acinetobacter lwoffii ATCC 9036
Aeromonas salmonicida ATCC 14174
Alcaligenes faecalis FERM BP-940
Arthrobacter citreus ATCC 11624
Bacillus firmus ATCC 8247
Brevibacterium pusillum ATCC 19096
Cellulomonas flavigena ATCC 491
Citrobacter freundii ATCC 8090
Corynebacterium aquaticum ATCC 14665
Escherichia coli FERM P-7404
Enterobacter cloacae ATCC 13047
Erwinia carotovora FERM P-2766
Flavobacterium aquatile ATCC 8375
Hafnia alvei ATCC 9760
Klebsiella pneumoniae ATCC 8308
Kluyvera citrophila FERM P-8193
Microbacterium imperiable ATCC 8365
Micrococcus luteus ATCC 400
Mycloplana dimorpha ATCC 4279
Nocardia restricta ATCC 14887
Planococcus citreus ATCC 15234
Protaminobacter alboflavus ATCC 8458
Proteus rettgeri FERM BP-941
Pseudomonas oleovorans ATCC 8062
Rhizobium meliloti FERM P-8197
Rhodococcus rhodochrous ATCC 12974
Salmonella typhimurium FERM P-9470
Arthrobacter ureafaciens FERM BP-2472
Serratia grimesii ATCC 14460
Staphyrococcus epidermidis ATCC 155
Streptomyces flavovirens IFO 3197
Vibrio metschnikovii ATCC 7708
Xantomonas citri FERM P-3396
[0016]
Among the above strains, Xanthomonas citri FERM P-3396 was established by the international depositary authority: Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science, Ministry of International Trade and Industry (currently Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry) It is a strain of deposit number FERM P-3396 deposited on the 27th, and Kluyvera citrophila FERM P-8193 is a strain of deposit number FERM P-8193 deposited on April 23, 1985 to the depository authority , Arthrobacter ureafaciens FERM BP-2472 is a strain of accession number FERM BP-2472 deposited with the depository authority on April 25, 1983 and transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on June 14, 1989 Salmonella typhimurium FERM P-9470 is a strain with the deposit number FERM P-9470 deposited on July 11, 1987, and the Escherichia coli FERM P-7404 is The strain of deposit number FERM P-7404 deposited on January 20, 59, Prote us rettegeri FERM BP-941 is a strain with accession number FERM BP-941 deposited on April 25, 1985 and transferred to the international deposit under the Budapest Treaty on November 28, 1985. Yes, Rhizobium melilotti FERM P-8197 is a strain of deposit number FERM P-8197 deposited on April 25, 1985, and Alcaligenes faecalis FERM BP-940 Is a strain of accession number FERM BP-940 deposited on December 24, 1985 and transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on November 28, 1985. Erwinia carotovora FERM P-2766 This strain has the deposit number FERM P-2766 deposited on October 29, 1974.
[0017]
On the other hand, as the enzyme (adenosine deaminase) -containing material, the above-mentioned microorganism culture solution and cultured cells can be used, as well as cells treated with acetone, acetone-treated cells, ground cells, surfactants or Treated cells such as toluene, enzyme-treated cells such as lysozyme, protein fractions extracted from the cells, separated by salting-out, column chromatography, etc., purified products of protein fractions having adenosine deaminase activity, and the bacteria Immobilized products of cells and treated cells can be used. As the element-containing material derived from animals and plants, in addition to the ground product containing the enzyme, treated products and immobilized products similar to the microorganism-derived enzyme can be used.
[0018]
As a method for allowing adenosine deaminase to act on 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside, adenosine deaminase may be added to a solution containing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and reacted. The reaction in which adenosine deaminase is allowed to act on 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside usually has a temperature of 5 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C., and pH 4 to 10 and preferably pH 5 to 9 give good results. . Either a stationary method or a stirring method can be employed for the reaction. During the reaction, ammonia is generated by the action of the enzyme, and the pH of the reaction solution rises. Therefore, good results can be obtained by adjusting the pH according to the optimum pH of the enzyme. The reaction time depends on the enzyme used. The holding reaction may be carried out for 10 minutes to 5 days, depending on conditions such as activity and substrate concentration.
[0019]
Further, 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and 2′-deoxyguanosine may be quantified by a method using high performance liquid chromatography.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
[0020]
【Example】
(Example 1)
50 ml of nutrient medium (pH 7.0) containing 5 g / l of yeast extract, 10 g / l of meat extract, 10 g / l of peptone and 5 g / l of NaCl is placed in a Sakaguchi flask (500 ml) at 120 ° C. Sterilized by heating for 20 minutes. Each of the microorganisms shown in Table 1 was cultivated on a bouillon agar medium at 30 ° C. for 16 hours and inoculated with one platinum loop, and cultured at 30 ° C. for 18 hours with shaking. Bacterial cells were separated from the obtained culture broth by centrifugation, washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2), and further centrifuged to prepare washed cells.
The washed cells were added to 10 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) containing 100 mM 2'-deoxyribose-1-phosphate and 100 mM 2,6-diaminopurine 1/2 sulfate. The washed cells were added at 50 g / l and reacted at 60 ° C. for 2 hours. The concentration of 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside produced in the reaction solution was measured using high performance liquid chromatography, and the results are shown in Table 1.
[0021]
[Table 1]

[0022]
(Example 2)
50 ml of nutrient medium (pH 7.0) containing 5 g / l of yeast extract, 10 g / l of meat extract, 10 g / l of peptone and 5 g / l of NaCl is placed in a Sakaguchi flask (500 ml) at 120 ° C. Sterilized by heating for 20 minutes. To this, one platinum loop of each of the microorganisms shown in Table 2 was cultivated on a bouillon agar medium at 30 ° C. for 16 hours, and cultured with shaking at 30 ° C. for 18 hours. The bacterial cells were separated from the obtained culture broth by centrifugation, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and further centrifuged to prepare washed bacterial cells.
50 ml of the washed cells were added to 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 100 mM 2′-deoxyuridine and 100 mM 2,6-diaminopurine 1/2 sulfate. g / l was added, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 2 hours.
The concentration of 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside produced in the reaction solution was measured using high performance liquid chromatography, and the results are shown in Table 2.
[0023]
[Table 2]

[0024]
(Example 3)
50 ml of nutrient medium (pH 7.0) containing 5 g / l of yeast extract, 10 g / l of meat extract, 10 g / l of peptone and 5 g / l of NaCl is placed in a Sakaguchi flask (500 ml) at 120 ° C. Sterilized by heating for 20 minutes. This was inoculated with 1 platinum ear of Klebsiella pneumoniae IFO 3321 cultured at 30 ° C. for 16 hours on a bouillon agar medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 18 hours. The bacterial cells were separated from the obtained culture broth by centrifugation, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and further centrifuged to prepare washed bacterial cells.
The washed cells were added to 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 100 mM thymidine and 100 mM 2,6-diaminopurine 1/2 sulfate. And reacted at 60 ° C. for 2 hours.
As a result of measuring the concentration of 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside produced in the reaction solution using high performance liquid chromatography, 15.2 g / l 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside was found to be It was generated.
[0025]
(Example 4)
A 50 mM phosphate buffer solution containing 20.0 g / l of 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and a reaction completion solution (2,6-) using Klebsiellapneumoniae IFO 3321 obtained in Example 2 Add 50 μl each of Boehringer's adenosine deaminase (50% glycerol solution, calf intestine, approximately 200 U / mg) to 5 ml (pH 7.0) containing 16.9 g / l diaminopurine-2'-deoxyriboside The reaction was performed at 25 ° C. for 1 hour while adjusting the pH to 7.0.
The concentration of 2′-deoxyguanosine produced in the reaction solution was measured using high performance liquid chromatography. As a result, 19.8 g / l (conversion molar yield 99%) and 16.8 g / l (conversion molar yield 99%), respectively. )Met.
[0026]
(Example 5)
50 ml of nutrient medium (pH 7.0) containing 5 g / l of yeast extract, 10 g / l of meat extract, 10 g / l of peptone and 5 g / l of NaCl is placed in a Sakaguchi flask (500 ml) at 120 ° C. Sterilized by heating for 20 minutes. One platinum loop of Arthrobacter ureafaciens (FERM BP-2472) cultured on a bouillon agar medium at 30 ° C. for 16 hours was inoculated and shake-cultured at 30 ° C. for 16 hours. Bacterial cells were separated from the obtained culture broth by centrifugation, washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2), and further centrifuged to prepare washed cells.
The above washed cells were added to 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.2) containing 20.0 g / l 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside to a pH of 7.2. The reaction was carried out at 30 ° C. for 3 hours while maintaining. The concentration of 2′-deoxyguanosine produced in the reaction solution was measured using high performance liquid chromatography. As a result, it was 19.8 g / l (conversion molar yield 99%), respectively.
[0027]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and 2′-deoxyguanosine can be produced easily and inexpensively with a high yield.

Claims

Having the ability to produce 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside from 2,6-diaminopurine from 2'-deoxyribose-1 phosphate or a salt thereof and 2,6-diaminopurine, and Achromobacter Genus, Agrobacterium, Acinetobacter, Alkagenes, Arthrobacter, Aeromonas, Escherichia, Enterobacter, Erbinia, Xanthomonas, Klebsiella, Kurthia, Kluyhera, Corynebacterium, Sartina , Salmonella, Citrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Sporosartina, Staphylococcus, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Hafnia, Vibrio, Flavobacterium, Planococcus Genus, Breviva Culture of microorganisms belonging to the genus Thelium, Protaminobacter, Proteus, Hemophilus, Micrococcus, Mycoplana, Microbacteria, Rhizobium or Rhodococcus, microbial cells isolated from the culture or the 2. Treating a treated microbial cell with 2′-deoxyribose-1-phosphate or a salt thereof and 2,6-diaminopurine, and collecting the produced 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside. A process for producing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside, characterized in that