JP3795558B2

JP3795558B2 - Novel glycopeptidase and method for producing the same

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Publication number: JP3795558B2
Application number: JP23735795A
Authority: JP
Inventors: 康男井上; 貞子井上; 健北島
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1995-07-24
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2015-09-14
Also published as: JPH0994088A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なグリコペプチダーゼおよびその製造方法に関するものである。詳しくは、中性に至適ｐＨを有する微生物由来の新規酵素および微生物を用いた該酵素の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グリコペプチダーゼ（以下ＰＮＧａｓｅともいう）は、糖タンパク質上の糖鎖結合アスパラギン残基から糖鎖を切り出すアミダーゼである（一般に、ペプチド：N-グリカナーゼとも呼ばれる）。その存在は、発明者らが最近動物細胞中に発見するまでは、植物と微生物に限局され、タンパク質糖鎖の構造と機能の研究における試薬としての有用性が注目されてきた。
【０００３】
現在試薬としては、アーモンド由来のＰＮＧａｓｅ（以下、ＰＮＧａｓｅＡともいう）、微生物（フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム、Flavobacterium meningosepticum）由来のＰＮＧａｓｅ（以下、ＰＮＧａｓｅＦともいう）が市販されている。ＰＮＧａｓｅＡは、酸性に至適ｐＨを有しており、ＰＮＧａｓｅＦはアルカリ性に至適ｐＨを有している。
【０００４】
中性ｐＨ条件下でＰＮＧａｓｅの酵素反応を行う場合、中性に至適ｐＨを有するＰＮＧａｓｅが酵素反応の効率の点から望まれる。中性に至適ｐＨを有するＰＮＧａｓｅとしては、動物細胞由来のＰＮＧａｓｅが報告されている。このＰＮＧａｓｅはマウスの臓器（脳、脾臓、肝臓、腎臓）およびマウス由来の繊維芽細胞（Ｌ−９２９）に存在していることが報告されている。
【０００５】
酵素を工業的に生産する場合、微生物に産生させるのが生産効率の点から望まれる。しかし、微生物由来のＰＮＧａｓｅとしては、唯一上記のＰＮＧａｓｅＦが知られているのみである。しかもＰＮＧａｓｅＦはアルカリ性に至適ｐＨを有しており、中性に至適ｐＨを有する微生物由来のＰＮＧａｓｅは知られていなかった。よって、中性に至適ｐＨを有するＰＮＧａｓｅの獲得量にも限界があり、生産効率の点でも満足できるものではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
糖タンパク質糖鎖や糖ペプチド糖鎖の構造や機能の解析などの研究にとって、中性に至適ｐＨを有するＰＮＧａｓｅは極めて有用であることが期待される。また、中性に至適ｐＨを有するＰＮＧａｓｅを工業的に生産するためには、該酵素を微生物を用いて製造する方法の開発が望まれる。
【０００７】
本発明は上記観点からなされたものであり、中性に至適ｐＨを有する微生物由来のＰＮＧａｓｅおよび微生物を用いた該酵素の製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、中性に至適ｐＨを有するＰＮＧａｓｅを産生する微生物を鋭意検索した結果、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌の一種がＰＮＧａｓｅを産生することを見出し、さらにこのＰＮＧａｓｅは中性ｐＨで高い活性を有することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち本願発明は、下記の理化学的性質を有するＰＮＧａｓｅである。
▲１▼作用：
糖タンパク質または糖ペプチド中のアスパラギン残基とＮ−アセチルグルコサミン残基間のアミド結合を加水分解する。
▲２▼基質特異性：
アスパラギン結合型糖鎖を含有する糖タンパク質または糖ペプチドに作用する。
▲３▼至適反応ｐＨ：
２５℃においてｐＨ７付近
▲４▼安定ｐＨ範囲：
２５℃においてｐＨ５〜９
▲５▼至適反応温度：
ｐＨ７．１において２５℃付近
▲６▼熱安定性：
２５℃で少なくとも４８時間失活しない。
【００１０】
また本願発明は、スフィンゴバクテリウム属に属し、ＰＮＧａｓｅ生産能を有する細菌を培養し、その培養物から前記性質を有するＰＮＧａｓｅを採取することを特徴とするＰＮＧａｓｅの製造方法を提供する。
【００１１】
尚、本発明のＰＮＧａｓｅを、「本発明酵素」または「ＰＮＧａｓｅＳＭ」ということがある。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明のＰＮＧａｓｅ
（１）本発明酵素の取得法
本発明のＰＮＧａｓｅは、上記性質を有する新規酵素である。本発明酵素は、例えば、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌を培養し、その培養物から採取することができる。スフィンゴバクテリウム属に属する細菌としては、スフィンゴバクテリウムマルチボラム（Sphingobacterium multivorum）が挙げられ、具体的にはスフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓが挙げられる。
【００１３】
具体的には、本発明酵素を生産する微生物を適当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体培養のときは培養液）から菌体を遠心分離などによって収集し、菌体を超音波処理などにより破砕して得られる菌体破砕液、または浸透圧ショックによって菌体外に放出される酵素活性を持つ画分や、培養液中の菌体を遠心分離した後に得られる培養上清等を出発物質として、次いでＰＮＧａｓｅ活性を指標として一般的な酵素の分離法を適用することにより、所望の精製度の酵素標品を採取することができる。なお、本発明酵素はペリプラズムおよび培養上清中に活性を有し、特にペリプラズムにおける活性が高いことから、出発物質としてペリプラズム画分を用いることが好ましい。
【００１４】
本発明酵素を産生する微生物の培養は、この微生物が資化可能な炭素源（デアミノノイラミン酸（以下「ＫＤＮ」ともいう）を含むオリゴ糖、グルコースなど）、窒素源（酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕などの有機窒素源；塩酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、無機塩（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）などを含む培地中で、好気的な培養法（振盪培養、通気攪拌培養など）によって生育に適した温度で数時間〜数日間培養することによって行うことができる。
【００１５】
培養物から収集した菌体から、超音波処理などによる破砕、あるいは浸透圧ショック等の適当な方法によって放出された酵素を含む画分や、培養液中の菌体を遠心分離した後に得られる培養上清等から、例えば、硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム等による塩析；透析；限外ろ過法；吸着クロマトグラフィー、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー；疎水性クロマトグラフィー；ゲル濾過法；電気泳動法など公知の酵素精製法、さらには糖タンパク質を結合させたアガロースゲル等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって目的とする精製度の酵素標品を得ることができる。
【００１６】
本発明酵素のＰＮＧａｓｅ活性は、糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミン残基とアスパラギン残基とのアミド結合を介してタンパク質またはペプチド中のアスパラギン残基に結合した糖鎖（本明細書において、アスパラギン結合型糖鎖ともいう）を含有する糖タンパク質または糖ペプチドに本発明酵素を作用させて、アスパラギン残基とＮ−アセチルグルコサミン残基間の結合（N-アセチルグルコサミニルアスパラギンのアミド結合）の加水分解により生成するペプチドまたは遊離する糖鎖を定量することによって測定することができる。具体的には、本発明酵素を糖ペプチド基質に作用させ、Ｎ−アセチルグルコサミニルアスパラギンのアミド結合が酵素的に加水分解され、糖鎖が遊離して生成する単純ペプチド（糖鎖を含有しないペプチド）を定量する方法が挙げられる。
【００１７】
基質としては、ウシ胎仔血清フェツインをサーモリシン消化することによって得られる２種類の糖ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基を、Ｎ，Ｎ−ジメチル化（([¹⁴C]CH₃)₂-）することによって標識した糖ペプチドを用いることができる（Journal of Biological Chemistry, 第269巻, 17611-17618ページ (1994年)、Archives of Biochemistry and Biophysics, 第319巻, 393-401ページ (1995年)）。これらの糖ペプチドとして具体的には、[¹⁴C]Leu-Asn(CHO1)-Asp-Ser-Argと[¹⁴C]Leu-Ala-Asn(CHO1)-CmCys-Ser((CHO)はアスパラギンに結合した糖鎖を、CmCysはカルボキシメチル化システインを表す)が挙げられる。糖鎖(CHO1)は、典型的な３本鎖をもつコンプレックス（複合）型糖鎖構造をもつアスパラギン結合型糖鎖である（糖鎖工学、13〜16頁（株）産業調査会、1992年発行）。
【００１８】
さらに、オバルブミン(ovalbumin)由来の糖ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基をＮ，Ｎ−ジメチル化（[¹⁴C]CH₃)₂-）することによって標識した糖ペプチドも、本発明酵素の基質として用いることができる。このような糖ペプチドとして、具体的には[¹⁴C]Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn(CHO2)-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse（(CHO2)は高マンノース型糖鎖構造をもつアスパラギン結合型糖鎖を表す）や[¹⁴C]Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn(CHO3)-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse（(CHO3)はハイブリッド（混成）型糖鎖構造をもつアスパラギン結合型糖鎖を表す）を挙げることができる（Journal of Biological Chemistry，第269巻，17611-17618ページ (1994年)、Archives of Biochemistry and Biophysics，第319巻，393-401ページ (1995年)）。なお本明細書においては特にことわらない限り、単なる「アスパラギン結合型糖鎖」という用語には、「コンプレックス（複合）型のアスパラギン結合型糖鎖」、「高マンノース型のアスパラギン結合型糖鎖」及び「ハイブリッド（混成）型のアスパラギン結合型糖鎖」が包含される。
【００１９】
酵素によって生成するペプチドを、ペーパークロマトグラフィーまたは濾紙電気泳動を行うことによって分離し、生成したペプチドが移動する部位の放射能を測定することによって、酵素活性を測定する。また、酵素反応によって遊離する糖鎖の還元末端残基が持つ還元能を、Park-Johnson法(Journal of Biological Chemistry, 181巻, 149-151ページ, (1949)）によって測定するとともに、遊離糖鎖を糖組成分析で構造確認することによっても、活性測定が可能である（Journal of Biological Chemistry, 266巻, 22110-22114ページ, (1991)）。
【００２０】
（２）本発明酵素の理化学的性質
本発明酵素の理化学的性質を示す。
▲１▼作用：
糖タンパク質または糖ペプチド中のアスパラギン残基とＮ−アセチルグルコサミン残基間のアミド結合を加水分解する。加水分解により、糖鎖の還元末端にジ−Ｎ−アセチルキトビオース構造を保持した遊離の糖鎖を生成するとともに、糖鎖の結合していたアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に変換する。
▲２▼基質特異性：
アスパラギン結合型糖鎖を含有する糖タンパク質または糖ペプチドに作用する。
▲３▼至適反応ｐＨ：
２５℃においてｐＨ７付近であり、具体的にはｐＨ６．５〜８．５、より好ましくはｐＨ７〜８、特に好ましくはｐＨ７である。
▲４▼安定ｐＨ範囲：
２５℃においてｐＨ５〜９
▲５▼至適反応温度：
ｐＨ７．１において２５℃付近
▲６▼熱安定性：
２５℃で少なくとも４８時間失活しない。
【００２１】
＜２＞本発明酵素を産生するスフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓ
本発明酵素を産生する微生物スフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓは、養魚場の汚泥から、デアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）を含有するオリゴ糖アルコールを唯一の炭素源とする集積培地で培養し、菌体破砕液中に４−メチルウンベリフェリルＫＤＮ（４−ＭＵ−ＫＤＮ）を加水分解する活性を有するものとして選択された微生物であり、本発明のＰＮＧａｓｅの他にも、デアミノノイラミニダーゼ（ＫＤＮａｓｅ）を産生することを特徴とする。
【００２２】
尚、本発明酵素を産生するスフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓは、平成６年５月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１４３２５の受託番号で寄託され、平成７年５月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭＢＰ−５１１６の受託番号で寄託されている。
【００２３】
本発明酵素を産生するの微生物の菌学的性状は後記実施例１に示す通りであり、これらの性質からスフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌であると同定された。尚、本菌は、スフィンゴバクテリウムマルチボラム（Sphingobacterium multivorum）である可能性が高い。
【００２４】
【実施例】
つぎに実施例により本発明を更に詳しく説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、これに限定されるものではない。尚、本実施例において、ＰＮＧａｓｅ活性の測定は、下記の方法によって行った。
【００２５】
＜酵素活性測定法＞
基質として、ウシ胎仔血清フェツインをサーモライシン消化することにより得られる２種類の糖ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基を、ナトリウム・シアノボロヒドリド（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）存在下で、H¹⁴CHO(Dupont/NEN, USA製)を用いた還元メチル化反応を行って、N,N-ジメチル化（([¹⁴C]CH₃)₂-）させて放射性標識した糖ペプチドを、シアリダーゼ(Arthrobacter ureafacients由来、Nacalai製）消化してシアル酸を除去したアシアロ体（以下、asialo-[¹⁴C]fetGPともいう。Journal of Biological Chemistry, 第269巻, 17611-17618ページ (1994)； Archive of Biochemistry and Biophysics, 第319巻, 393-401ページ (1995)）を用いた。これらの糖ペプチドは、[¹⁴C]Leu-Asn(CHO1)-Asp-Ser-Argと[¹⁴C]Leu-Ala-Asn(CHO1)-CmCys-Ser（(CHO)は糖鎖を、CmCysはカルボキシルメチル化システインを表す）であり、糖鎖(CHO1)は、典型的な３本鎖をもつコンプレックス（複合）型糖鎖構造をもつアスパラギン結合型糖鎖である。前者はasialo-[¹⁴C]fetGP I、後者はasialo-[¹⁴C]fetGP IIとそれぞれ呼ぶ。100mM ２−モルホリノエタンスルホン酸（MES；シグマ社製）緩衝液(pH 7.0)、0.25M ショ糖、10mM ジチオスレイトール（DTT）を含む10μｌの酵素液に、１μｌの210pmol(15,000 cpm)のasialo-[¹⁴C]fetGPを加えて、ポリプロピレン・チューブ中で25℃、24時間反応を行った。反応産物のペプチドを、ペーパークロマトグラフィーまたは濾紙電気泳動を行うことによって分離し、生成ペプチドが移動する部位の放射能を測定することによって酵素活性を測定する。ペーパークロマトグラフィーおよび濾紙電気泳動は、以下の要領で行った。
【００２６】
ペーパークロマトグラフィー：反応液を Whatman 3MM濾紙にスポットし、１−ブタノール／エタノール／水（4/2/3, v/v/v）の展開溶媒によって１時間展開する。濾紙を風乾後、バイオ・イメージング・アナライザー（Fujix BAS 2000）によって放射能の移動度と量を解析、定量した。
【００２７】
濾紙電気泳動：反応液を Whatman 3MM 濾紙にスポットし、ピリジン／酢酸／水（5/0.2/95, v/v/v、pH 6.5）中で、13 V/cm、３時間の条件で電気泳動を行った。濾紙を風乾後、バイオ・イメージング・アナライザー（Fujix BAS 2000）によって放射能の移動度と量を解析、定量した。
【００２８】
また、本明細書において「１ユニット(U)」とは、25℃でasialo-[¹⁴C]fetGP Iから¹⁴C-ペプチドを、１時間で１μmol生成する酵素量として定義した。
【００２９】
【実施例１】
スフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓの取得
養魚場の汚泥を、ＫＤＮオリゴ糖アルコール（J. Biol. Chem. 265, 21811-21819 (1990)記載の方法で調製）０．０５％を添加したＭ９液体培地（１Ｌ中に、Na₂HPO₄ 6.0g、KH₂PO₄ 3.0g、NH₄Cl 1.0g、NaCl 0.5g、MgSO₄ 1mM、CaCl₂ 0.1mMを含む）に接種して２５℃で４８時間培養した。培養液を、ＫＤＮオリゴ糖アルコールを含むＭ９寒天培地プレートにストリークして２５℃で４８時間培養し、ＫＤＮオリゴ糖アルコールを唯一の炭素源として生育する微生物として、６６コロニーが得られた。
【００３０】
各々のコロニーを形成する微生物を、ＫＤＮオリゴ糖アルコール０．０５％を含むＭ９液体培地に接種して培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体を超音波処理により破砕し、破砕液中のＫＤＮａｓｅ活性及びシアリダーゼ活性を、４−ＭＵ−ＫＤＮ法により測定した。これらのうち、ＫＤＮａｓｅ活性が認められ、シアリダーゼ活性が認められなかった破砕液が由来する微生物をｍＯＬ１２とし、以下の選択に用いた。
【００３１】
ｍＯＬ１２株のコロニーをＫＤＮオリゴ糖アルコール０．０５％を含むＭ９寒天培地にストリークし、４株のコロニーを分離し、各々ｍＯＬ１２−１、ｍＯＬ１２−２、ｍＯＬ１２−３及びｍＯＬ１２−４とした。各々のコロニーをＬＢ平板培地にストリークし、単一コロニーをＫＤＮオリゴ糖アルコール０．０５％を含むＭ９液体培地に接種して培養し、菌体破砕液のＫＤＮａｓｅ活性及びシアリダーゼ活性を、各々４−ＭＵ−ＫＤＮ法及び塩化セチルピリジニウム法により測定した。４−ＭＵ−ＫＤＮ法及び塩化セチルピリジニウム法について以下に説明する。
【００３２】
（１）４−ＭＵ−ＫＤＮ法
４−メチルウンベリフェリルＫＤＮ(4-MU-KDN)のケトシド結合が酵素的に加水分解される（次の反応）と、蛍光性の４−メチルウンベリフェロンが遊離される。その蛍光を測定する。
【００３３】
4-メチルウンベリフェリルKDN → KDN + 4-メチルウンベリフェロン
具体的には、1.4 nmolの4-MU-KDNを、20μｌの0.1 M トリス酢酸緩衝液 (pH 6.0)/0.1M NaClに溶解した菌体破砕液に加えて、25℃、30分間反応させ、反応後、反応液20μｌをとって、2.5 mlの85 mMグリシン炭酸塩緩衝液 (pH 9.3) と混合して、蛍光強度を測定した（励起波長365 nm、測定波長 450 nm）。蛍光強度測定については、Biochemistry 第18巻、第13号、2783-2787ページを参照した。菌体破砕液を加えずに上記と同様の反応を行ったときの蛍光強度をコントロールとした。
【００３４】
本方法に用いた４−ＭＵ−ＫＤＮは、以下に示すDr. Thomas G. Warnerによって開発された方法によって得られたものであり、Dr. Thomas G. Warnerから恵与されたものを用いた。
【００３５】
ＫＤＮは、酵素的に既知の方法［Auge, C.,ら，Tetrahedron 46, 201-214 (1990)］にしたがって、Ｄ−マンノースとピルビン酸からＮｅｕ５Ａｃアルドラーゼを用いて合成した。ＫＤＮを乾燥後、１０ｍｌの無水酢酸、１０ｍｌのピリジンに懸濁し、室温で一晩反応させた。反応液を氷冷し、メタノールを加えて反応を停止させ、溶媒を除去した。残渣をメタノールに溶かし、Ｄｏｗｅｘ５０（Ｈ⁺）カラム（４×５ｃｍ）にかけて、メタノールで溶出した。溶出物は溶媒除去後、エチルエーテル中で過剰量のジアゾメタンを加えて、メチルエステルとした。生成した完全アセチル化メチルエステル物は、シリシック酸カラム（２．５×１７ｃｍ）にかけて、ヘキサン中で酢酸エチルの濃度勾配をかけて溶出し、メチル２，４，５，７，８，９−ヘキサ−Ｏ−アセチルＫＤＮ（Ｋ１）を得た。次いで、既知の方法［Warnerら，Biochemistry 18, 2783-2787 (1979)］にしたがってＫ１をグリコシルクロリドに変え、４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）のナトリウム塩と反応させて、Ｋ１と４−ＭＵを重合させ、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル４，５，７，８，９−ペンタ−Ｏ−アセチルＫＤＮ（Ｋ２）を得た。
【００３６】
Ｋ２０．５ｇに４ｍｌのメタノール、続いて４ｍｌの０．５Ｎの水酸化ナトリウムを加えて懸濁し、３７℃で１時間置いた。さらに、４ｍｌの水酸化ナトリウムを加え、３７℃で９０分間置いた後、ｐＨをＤｏｗｅｘ５０（Ｈ⁺）樹脂を加えて中和して、ｐＨ６．０とした。濾過して樹脂を除き、溶媒を除去した。残渣に対して、少量の１０ｍＭアンモニア水を加えて、ｐＨ９とした後、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５ゲル濾過によって高純度の４−ＭＵ−ＫＤＮが精製された。
【００３７】
尚、４−ＭＵ−ＫＤＮは、Schreiner, E. and Zbiral, E. (1990) Liebigs Ann. Chem., 581-586に記載の方法によっても得られる。
【００３８】
（２）塩化セチルピリジニウム法
基質として、ニジマス卵巣液由来のＫＤＮ含有糖タンパク質を用いた。酵素反応を上記（１）項に述べた条件と同様に行なった後、反応液に２mlの0.1%塩化セチルピリジニウム（CPC）を加えた。ＫＤＮ含有糖タンパク質は、CPC存在下で複合体を形成して沈殿するが、酵素反応によって遊離するＫＤＮは沈殿しない。反応液を30分放置した後、遠心分離（3000rpm、10分間）し、得られる上清のＫＤＮ量をチオバルビツール酸法（Analytical Biochemistry 第205巻、244-250,(1992)）で定量することによって酵素活性を測定した。
【００３９】
ｍＯＬ１２−４をＬＢ平板培地にストリークした際に形成されたコロニーは、「大」、「中」及び「小」の３種類の大きさに分かれ、それらのうち、「大」コロニー及び「中」コロニーを形成する株には、ＫＤＮａｓｅ活性が認められなかったが、「小」コロニーを形成した株は、ＫＤＮａｓｅ活性を示し、シアリダーゼ活性を示さなかった。これらのＫＤＮａｓｅ活性のみを示した株のうちの１株をｍＯＬ１２−４ｓとした。
【００４０】
上記のようにして分離されたｍＯＬ１２−４ｓの同定を、市販の腸内細菌以外のグラム陰性桿菌同定キット（ビオメリュー社、ＡＰＩ２０ＮＥ）を用いて行った。試験された主な菌学的性状を以下に示す。
【００４１】

【００４２】
以上の結果から、ｍＯＬ１２−４ｓは、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌であると同定され、スフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓと命名された。本菌は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ブダペスト条約に基づく国際寄託としてＦＥＲＭＢＰ−５１１６の受託番号で寄託されている。尚、本菌は、菌学的性状から、スフィンゴバクテリウムマルチボラム（Sphingobacterium multivorum）である可能性が高い。
【００４３】
【実施例２】
ＰＮＧａｓｅＳＭの生産
ミラーのルリア・ブロス（ＬＢ）培地（ギブコ・ＢＲＬ製）を、２リットルの三角フラスコに800ml分注し、オートクレーブした。この培地にスフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓを接種した後、振盪培養機を用いて、２５℃で４８時間培養した。
【００４４】
＜１＞ＰＮＧａｓｅＳＭの抽出
（１）菌体破砕によるＰＮＧａｓｅＳＭの抽出
培養終了後、遠心分離 (15,000×g, 40分間) により、培養液から菌体を集めた。得られた菌体を、氷冷した 0.1M NaClを含む 0.1 M トリス−塩酸緩衝液 (pH 8.0) に懸濁し、再び遠心分離を行うことによって菌体を洗浄した。この洗浄操作を３回行なった後、0.15M NaClを含む50 mM トリス−塩酸緩衝液(pH 7.4)に菌体を懸濁し、超音波処理して菌体を破砕した。
【００４５】
この菌体破砕液を遠心分離（10,000×g, 30分間）して得られる上清を冷却し、この上清に硫酸アンモニウムを90%飽和になるまで加え、４℃で放置した。これを遠心分離（150,000×g、１時間）して沈殿物を得た。この沈澱物を100mM MES緩衝液(pH7.0)、0.25M ショ糖、10mM ジチオスレイトール(DTT)に溶解してＰＮＧａｓｅＳＭの酵素液を得た。
【００４６】
（２）浸透圧ショックによるＰＮＧａｓｅＳＭの抽出
上記と同様にしてスフィンゴバクテリウムｍＯＬ１２−４ｓを培養し、遠心分離（15,000ｘｇ、40分間）により、集菌、洗浄をおこなった。この菌体を、既知の方法［Nossal, N.G. and Heppel, L.A. (1966) J. Biol. Chem. 241, 3055-3062］に従って浸透圧ショック処理し、菌体外に酵素を遊離させた。すなわち、菌体１ｇに対して40mlの蔗糖20％を含む0.1M EDTA／33mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.1)に菌体を懸濁し、25℃で10分間放置した後、菌体を遠心操作（13,000ｘｇ、10分間）して沈殿させた。この菌体を、１mM 酢酸マグネシウムを含む20mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.1)に懸濁して０℃で10分間放置することにより浸透圧ショックを与えた。上記菌体懸濁液に、その１／10量の1M NaCl／1M トリス−塩酸緩衝液(pH7.1)を速やかに加えた後、再び遠心分離（13,000ｘｇ、30分間）し、菌体を除去した。得られた上清に、硫酸アンモニウムを90％飽和となるように加え、４℃で一晩放置した。生じた沈殿を、遠心操作(17,000ｘｇ、30分間）して、本発明酵素を含むペリプラズム画分として集めた。
【００４７】
これらの工程だけではＰＮＧａｓｅＳＭは完全に精製されないが、ＰＮＧａｓｅＳＭの粗酵素として使用することができる。精製は、必要に応じて通常の酵素の精製方法によって行うことができる。その際、ＰＮＧａｓｅ活性およびＰＮＧａｓｅＳＭの理化学的性質を指標とすることができる。
【００４８】
＜２＞ＰＮＧａｓｅＳＭの精製
上記（２）のようにして得られたペリプラズム画分を、10mlの0.1M NaCl／0.1M トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解し、0.25M 蔗糖／0.1M NaCl／20mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に対して透析したものを、DEAE-トヨパール(Toyopearl) 650Mカラム（東ソー株式会社製； 2.2ｘ11cm、42ml；透析溶液と同組成のもので平衡化したもの）にかけ、60mlの同溶液で溶出してくる画分を集めた。この画分は、限外濾過（ＹＭ10膜；アミコン社製）によって13mlまで濃縮し、CM-トヨパール 650M カラム（東ソー株式会社製；2.2ｘ11cm、42ml；0.25M 蔗糖／0.1M NaCl／20mM トリス−酢酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したもの）にかけて、60mlの0.25M 蔗糖／0.1M NaCl／20mM トリス−酢酸緩衝液(pH6.0)によって溶出した。溶出液をプールし、限外濾過（ＹＭ10膜；アミコン社製）によって７mlまで濃縮した。ここで得られた酵素画分は、比活性が26mU／mgタンパク質であった。
【００４９】
【実施例３】
本発明酵素の性質
（１）作用・基質特異性
上記の方法（実施例２の＜１＞の（１））で得られたＰＮＧａｓｅＳＭの酵素液、および基質として[¹⁴C]Leu-Asn(CHO1)-Asp-Ser-Arg（以下、asialo-[¹⁴C]fetGP Ｉともいう）または[¹⁴C]Leu-Ala-Asn(CHO1)-CmCys-Ser（以下、asialo-[¹⁴C]fetGP IIともいう）を用いて、前記の酵素活性測定法に従い、ペーパークロマトグラフィーによって酵素活性を測定した。その結果、糖鎖を含まないペプチドの生成がペーパークロマトグラフィーによって確認された。このことから、本発明酵素であるＰＮＧａｓｅＳＭは、糖タンパク質または糖ペプチド中の、アスパラギン残基とＮ−アセチルグルコサミン残基間のアミド結合を加水分解することが示された。また、上記asialo-[¹⁴C]fetGP ＩおよびIIに含まれる糖鎖((CHO1)で示してある部分)はコンプレックス（複合）型のアスパラギン結合型糖鎖であることから、本発明酵素は少なくともコンプレックス（複合）型のアスパラギン結合型糖鎖を含有する糖タンパク質または糖ペプチドに作用することが示された。
【００５０】
また、オバルブミン(ovalbumin)由来の糖ペプチドで高マンノース型糖鎖をもつもの（Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn(CHO2)-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse（(CHO2)は高マンノース型糖鎖構造をもつアスパラギン結合型糖鎖を表す）；以下、ovGP-highManという）およびハイブリッド（混成）型糖鎖をもつもの（Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn(CHO3)-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse（(CHO3)はハイブリッド（混成）型糖鎖構造をもつアスパラギン結合型糖鎖を表す）；以下、ovGP-hybridという）を基質として、asialo-［¹⁴C］fetGP Iと同様に反応させた結果、これらも基質になることが確認されたことから、本発明酵素は高マンノース型およびハイブリッド（混成）型のアスパラギン結合型糖鎖を含有する糖タンパク質または糖ペプチドにも作用することが示された。
【００５１】
（２）至適ｐＨ・安定ｐＨ範囲
上記の方法で得られたＰＮＧａｓｅＳＭの酵素液を、それぞれ100mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.1）、100mM トリス−酢酸緩衝液（pH5.5）および100mM トリス−酢酸緩衝液（pH8.6）に対して４℃で４時間透析した。それぞれの酵素液10μｌ（それぞれ本発明酵素を0.42mU含む）に基質として[¹⁴C]Leu-Asn(CHO1)-Asp-Ser-Arg（asialo-[¹⁴C]fetGP Ｉ）１μｌまたは[¹⁴C]Leu-Ala-Asn(CHO1)-CmCys-Ser（asialo-[¹⁴C]fetGP II）１μｌを加えて、前記の酵素活性測定法に従い、ペーパークロマトグラフィーによって酵素活性を測定した。それぞれの基質において、pH7.1の条件で反応させた時の活性を100％とした時の各pHにおける相対活性を表１に示す。
【００５２】
【表１】

【００５３】
この結果から本発明酵素の至適反応ｐＨは、２５℃においてｐＨ７付近であることが示された。また本発明酵素はpH5.5およびpH8.5において酵素活性を有していることから、本発明酵素は２５℃において少なくともｐＨ５〜９の範囲で安定であることが示された。
【００５４】
またasialo-[¹⁴C]fetGP Iを基質として用いて、本発明酵素活性に及ぼすpHの影響を更に詳細に調べた。用いた本発明酵素が0.17mUである点以外は、上記の方法と同様に行った。pH7.0の条件で反応させたときの活性を100％とした時の各pHにおける相対活性を表２に示す。なお、表中のＭＥＳは２−モルホリノエタンスルホン酸を、またＣＨＥＳはシクロヘキシルアミノエタンスルホン酸をそれぞれ表す。
【００５５】
【表２】

【００５６】
この結果から、本発明酵素の至適反応ｐＨは、２５℃においてｐＨ７付近であることが示された。また、pH７〜pH８で、pH7.0での活性の９０％以上の活性を有すること、及びpH6.5〜pH8.5の範囲でもpH7.0での活性の約60％の活性を有することが示された。また本発明酵素は２５℃において少なくともｐＨ５〜９の範囲で安定であることが示された。
【００５７】
（３）至適反応温度
本発明酵素は、pH7.1において２５℃付近で高い活性を有することから、本発明の酵素の至適反応温度はpH7.1において２５℃付近であることが示された。
【００５８】
（４）熱安定性
本発明酵素は、ｐＨ７において２５℃で少なくとも４８時間失活しなかった。また、実施例２で精製した本発明酵素を含むサンプルは、４℃で少なくとも２週間安定であった。
【００５９】
（５）分子量
本発明酵素は、セファクリル(Sephacryl) S-200 （ファルマシア社製）クロマトグラフィー（1.8ｘ135cm；20mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)／0.5M NaClで溶出）において分子量20,000〜30,000付近に溶出された。このことから、本発明酵素の分子量は、ゲル濾過法において約20,000〜30,000であると推定される。
【００６０】
【発明の効果】
従来のＰＮＧａｓｅとは異なり、中性に至適ｐＨを有する本発明酵素は、糖タンパク質や糖ペプチドの構造や機能解析などの研究に有用な試薬などへの活用が期待される。また本発明酵素により、糖タンパク質や糖ペプチドの機能を改変できる可能性もあり、機能改変された糖タンパク質や糖ペプチドの新しい生理活性物質としての利用などが期待される。また本発明の方法を用いると、微生物により本発明酵素を製造させることができるので、工業的スケールで大量に本発明酵素を調製することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel glycopeptidase and a method for producing the same. Specifically, the present invention relates to a novel enzyme derived from a microorganism having an optimum pH at neutrality and a method for producing the enzyme using the microorganism.
[0002]
[Prior art]
Glycopeptidase (hereinafter also referred to as PNGase) is an amidase that cleaves a sugar chain from a sugar chain-bound asparagine residue on a glycoprotein (generally also referred to as a peptide: N-glycanase). Its existence has been limited to plants and microorganisms until the inventors have recently discovered it in animal cells, and its usefulness as a reagent in the study of the structure and function of protein sugar chains has attracted attention.
[0003]
Currently, commercially available reagents include almond-derived PNGase (hereinafter also referred to as PNGase A) and microorganisms (Flavobacterium meningosepticum) and PNGase (hereinafter also referred to as PNGase F). PNGase A has an optimum pH for acidity, and PNGase F has an optimum pH for alkalinity.
[0004]
When performing an enzyme reaction of PNGase under neutral pH conditions, PNGase having an optimum pH neutral is desired from the viewpoint of the efficiency of the enzyme reaction. Animal PNG-derived PNGase has been reported as a neutral PNGase having an optimum pH. It has been reported that PNGase is present in mouse organs (brain, spleen, liver, kidney) and mouse-derived fibroblasts (L-929).
[0005]
When an enzyme is produced industrially, it is desired from the viewpoint of production efficiency that it is produced by a microorganism. However, the above PNGase F is the only known microorganism-derived PNGase. Moreover, PNGase F has an alkaline optimum pH, and a microorganism-derived PNGase having an optimum pH neutral has not been known. Therefore, there is a limit to the amount of PNGase that has an optimum pH for neutrality, and the production efficiency is not satisfactory.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
For research such as analysis of the structure and function of glycoprotein sugar chains and glycopeptide sugar chains, PNGase having neutral pH is expected to be extremely useful. In addition, in order to industrially produce PNGase having an optimum pH for neutrality, development of a method for producing the enzyme using a microorganism is desired.
[0007]
This invention is made | formed from the said viewpoint, and makes it a subject to provide the manufacturing method of this enzyme using microorganism-derived PNGase and microorganisms which have neutral pH.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have intensively searched for a microorganism that produces PNGase having a neutral optimum pH, and as a result, one kind of bacteria belonging to the genus Sphingobacterium produces PNGase. Further, this PNGase was found to have a high activity at a neutral pH, leading to the present invention.
[0009]
That is, the present invention is PNGase having the following physicochemical properties.
(1) Action:
Hydrolyzes the amide bond between asparagine and N-acetylglucosamine residues in glycoproteins or glycopeptides.
(2) Substrate specificity:
It acts on glycoproteins or glycopeptides containing asparagine-linked sugar chains.
(3) Optimum reaction pH:
Around pH 7 at 25 ° C
(4) Stable pH range:
PH 5-9 at 25 ° C
(5) Optimum reaction temperature:
Around 25 ° C at pH 7.1
(6) Thermal stability:
Does not inactivate at 25 ° C for at least 48 hours.
[0010]
The present invention also provides a method for producing PNGase, comprising culturing bacteria belonging to the genus Sphingobacteria and capable of producing PNGase, and collecting PNGase having the above properties from the culture.
[0011]
The PNGase of the present invention is sometimes referred to as “the enzyme of the present invention” or “PNGase SM”.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
<1> PNGase of the present invention
(1) Method for obtaining the enzyme of the present invention
PNGase of the present invention is a novel enzyme having the above properties. The enzyme of the present invention can be collected from, for example, a cultivated bacterium belonging to the genus Sphingobacterium. Examples of the bacterium belonging to the genus Sphingobacterium include Sphingobacterium multivorum, and specifically, sphingobacteria mOL12-4s.
[0013]
Specifically, the microorganism producing the enzyme of the present invention is inoculated into an appropriate medium and cultured, and the cells are collected from the cultured product (culture solution in the case of liquid culture) by centrifugation or the like. Cell disruption solution obtained by crushing the cells by sonication or the like, or a fraction obtained by centrifuging cells in the culture solution or a fraction having enzyme activity released to the outside of the cell body by osmotic shock By applying a general enzyme separation method using the supernatant or the like as a starting material and then using PNGase activity as an indicator, an enzyme preparation having a desired degree of purification can be collected. In addition, since the enzyme of the present invention has activity in the periplasm and culture supernatant, and particularly has high activity in the periplasm, it is preferable to use a periplasm fraction as a starting material.
[0014]
Cultivation of a microorganism that produces the enzyme of the present invention involves carbon sources (deaminoneuraminic acid (hereinafter also referred to as “KDN”) that can be assimilated by the microorganism, nitrogen sources (yeast extract, peptone, etc.). Organic nitrogen sources such as meat extract, corn steep liquor, soybean meal; inorganic nitrogen sources such as ammonium hydrochloride, ammonium sulfate, urea, ammonium nitrate), inorganic salts (sulfates such as calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphates, In a medium containing a hydrochloride, etc.) by culturing at a temperature suitable for growth for several hours to several days by an aerobic culture method (shaking culture, aeration stirring culture, etc.).
[0015]
Cultivation obtained by centrifuging microbial cells in a culture solution or a fraction containing an enzyme released from the microbial cells collected from the culture by an appropriate method such as disruption by sonication or osmotic shock. From the supernatant, for example, salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate), sodium sulfate, etc .; dialysis; ultrafiltration method; adsorption chromatography, anion and cation exchange chromatography; hydrophobic chromatography; gel filtration method; An enzyme preparation having a desired degree of purification can be obtained by a known enzyme purification method such as a method, or affinity chromatography using an agarose gel to which a glycoprotein is bound.
[0016]
The PNGase activity of the enzyme of the present invention is a sugar chain (in the present specification, bound to an asparagine residue in a protein or peptide via an amide bond between an N-acetylglucosamine residue and an asparagine residue at the reducing end of the sugar chain. Binding between an asparagine residue and an N-acetylglucosamine residue by causing the enzyme of the present invention to act on a glycoprotein or glycopeptide containing an asparagine-linked sugar chain) (amide bond of N-acetylglucosaminyl asparagine) It can be measured by quantifying the peptide or free sugar chain produced by hydrolysis. Specifically, a simple peptide (containing no sugar chain) is produced by allowing the enzyme of the present invention to act on a glycopeptide substrate and enzymatically hydrolyzing the amide bond of N-acetylglucosaminyl asparagine to release the sugar chain. Peptide)).
[0017]
As a substrate, N-terminal amino acid residues of two types of glycopeptides obtained by thermolysin digestion of fetal calf serum fetuin were N, N-dimethylated (([[ ¹⁴ C] CH _Three ) ₂ -) Can be used (Journal of Biological Chemistry, 269, 17611-17618 (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 319, 393-401 (1995) )). Specifically, as these glycopeptides, [ ¹⁴ C] Leu-Asn (CHO1) -Asp-Ser-Arg and [ ¹⁴ C] Leu-Ala-Asn (CHO1) -CmCys-Ser ((CHO) represents a sugar chain bound to asparagine, and CmCys represents carboxymethylated cysteine). The sugar chain (CHO1) is an asparagine-linked sugar chain having a complex type sugar chain structure with three typical chains (Glycoengineering, pages 13-16, Industrial Research Council, Inc., 1992) Issue).
[0018]
Furthermore, the N-terminal amino acid residue of the glycopeptide derived from ovalbumin is N, N-dimethylated ([ ¹⁴ C] CH _Three ) ₂ The glycopeptide labeled by-) can also be used as a substrate for the enzyme of the present invention. As such a glycopeptide, specifically, [ ¹⁴ C] Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn (CHO2) -Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse ((CHO2) represents an asparagine-linked sugar chain with a high mannose sugar chain structure) ¹⁴ C] Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn (CHO3) -Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse ((CHO3) represents an asparagine-linked sugar chain with a hybrid sugar chain structure) (Journal of Biological Chemistry, 269, 17611-17618 (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 319, 393-401 (1995)). In the present specification, unless otherwise specified, the term “asparagine-linked sugar chain” includes “complex-type asparagine-linked sugar chain” and “high mannose-type asparagine-linked sugar chain”. And “hybrid (hybrid) type asparagine-linked sugar chains” are included.
[0019]
Peptides produced by the enzyme are separated by paper chromatography or filter paper electrophoresis, and the enzyme activity is measured by measuring the radioactivity of the site to which the produced peptide moves. In addition, the reducing ability of the reducing terminal residue of a sugar chain released by an enzymatic reaction is measured by the Park-Johnson method (Journal of Biological Chemistry, Vol.181, pp.149-151, (1949)), and free sugar chain The activity can also be measured by confirming the structure by sugar composition analysis (Journal of Biological Chemistry, 266, 22110-22114, (1991)).
[0020]
(2) Physicochemical properties of the enzyme of the present invention
The physicochemical properties of the enzyme of the present invention are shown.
(1) Action:
Hydrolyzes the amide bond between asparagine and N-acetylglucosamine residues in glycoproteins or glycopeptides. By hydrolysis, a free sugar chain that retains the di-N-acetylchitobiose structure at the reducing end of the sugar chain is generated, and the asparagine residue to which the sugar chain is bonded is converted to an aspartic acid residue.
(2) Substrate specificity:
It acts on glycoproteins or glycopeptides containing asparagine-linked sugar chains.
(3) Optimum reaction pH:
The pH is around 7 at 25 ° C., specifically pH 6.5 to 8.5, more preferably pH 7 to 8, and particularly preferably pH 7.
(4) Stable pH range:
PH 5-9 at 25 ° C
(5) Optimum reaction temperature:
Around 25 ° C at pH 7.1
(6) Thermal stability:
Does not inactivate at 25 ° C for at least 48 hours.
[0021]
<2> Sphingobacterium mOL12-4s producing the enzyme of the present invention
The microorganism sphingobacteria mOL12-4s producing the enzyme of the present invention is cultured in an accumulation medium containing oligosaccharide alcohol containing deaminoneuraminic acid (KDN) as a sole carbon source from sludge in a fish farm. It is a microorganism selected as having an activity to hydrolyze 4-methylumbelliferyl KDN (4-MU-KDN) in the crushed liquid. In addition to PNGase of the present invention, deaminoneuraminidase (KDNase) It is characterized by producing.
[0022]
Sphingobacterium mOL12-4s that produces the enzyme of the present invention was deposited with the FERMP-14325 accession number at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on May 24, 1994. It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on May 26, 2000, and deposited with a deposit number of FERM BP-5116.
[0023]
The bacteriological properties of the microorganism producing the enzyme of the present invention are as shown in Example 1 described later, and from these properties, it was identified as a bacterium belonging to the genus Sphingobacterium. In addition, this bacterium is highly likely to be a sphingobacterium multivorum.
[0024]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further in detail, this Example shows an example of this invention and is not limited to this. In this example, the PNGase activity was measured by the following method.
[0025]
<Method for measuring enzyme activity>
As substrates, N-terminal amino acid residues of two kinds of glycopeptides obtained by digesting fetal calf serum fetuin with thermolysin are converted to H in the presence of sodium cyanoborohydride (sodium cyanoborohydride). ¹⁴ A reductive methylation reaction using CHO (Dupont / NEN, USA) was performed to produce N, N-dimethylation (([[ ¹⁴ C] CH _Three ) ₂ -) Radiolabeled glycopeptide was digested with sialidase (from Arthrobacter ureafacients, manufactured by Nacalai) to remove sialic acid (hereinafter referred to as asialo- [ ¹⁴ Also called C] fetGP. Journal of Biological Chemistry, 269, 17611-17618 (1994); Archive of Biochemistry and Biophysics, 319, 393-401 (1995)). These glycopeptides are [ ¹⁴ C] Leu-Asn (CHO1) -Asp-Ser-Arg and [ ¹⁴ C] Leu-Ala-Asn (CHO1) -CmCys-Ser ((CHO) represents sugar chain, CmCys represents carboxylmethylated cysteine), and sugar chain (CHO1) has typical three chains It is an asparagine-linked sugar chain having a complex type sugar chain structure. The former is asialo- [ ¹⁴ C] fetGP I, the latter asialo- [ ¹⁴ Called C] fetGP II respectively. 1 μl of 210 pmol (15,000 cpm) asialo in 10 μl of enzyme solution containing 100 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES; manufactured by Sigma) buffer (pH 7.0), 0.25 M sucrose, 10 mM dithiothreitol (DTT) -[ ¹⁴ C] fetGP was added and the reaction was performed in a polypropylene tube at 25 ° C. for 24 hours. The peptide of the reaction product is separated by paper chromatography or filter paper electrophoresis, and the enzyme activity is measured by measuring the radioactivity at the site where the product peptide moves. Paper chromatography and filter paper electrophoresis were performed as follows.
[0026]
Paper Chromatography: The reaction is spotted on Whatman 3MM filter paper and developed for 1 hour with 1-butanol / ethanol / water (4/2/3, v / v / v) developing solvent. After air-drying the filter paper, the mobility and amount of radioactivity were analyzed and quantified using a bio-imaging analyzer (Fujix BAS 2000).
[0027]
Filter paper electrophoresis: The reaction solution was spotted on Whatman 3MM filter paper and electrophoresed in pyridine / acetic acid / water (5 / 0.2 / 95, v / v / v, pH 6.5) at 13 V / cm for 3 hours. Went. After air-drying the filter paper, the mobility and amount of radioactivity were analyzed and quantified using a bio-imaging analyzer (Fujix BAS 2000).
[0028]
In this specification, “1 unit (U)” means asialo- [ ¹⁴ From C] fetGP I ¹⁴ C-peptide was defined as the amount of enzyme that produced 1 μmol in 1 hour.
[0029]
[Example 1]
Acquisition of sphingobacterium mOL12-4s
The sludge from the fish farm was added to M9 liquid medium (Na in 1 L) supplemented with 0.05% KDN oligosaccharide alcohol (prepared by the method described in J. Biol. Chem. 265, 21811-21819 (1990)). ₂ HPO _Four 6.0g, KH ₂ PO _Four 3.0g, NH _Four Cl 1.0g, NaCl 0.5g, MgSO _Four 1 mM, CaCl ₂ (Containing 0.1 mM) and cultured at 25 ° C. for 48 hours. The culture was streaked on an M9 agar plate containing KDN oligosaccharide alcohol and cultured at 25 ° C. for 48 hours, and 66 colonies were obtained as microorganisms that grew using KDN oligosaccharide alcohol as the sole carbon source.
[0030]
The microorganisms forming each colony were inoculated and cultured in an M9 liquid medium containing 0.05% KDN oligosaccharide alcohol, and collected by centrifugation. The obtained bacterial cells were disrupted by ultrasonic treatment, and the KDNase activity and sialidase activity in the disrupted solution were measured by the 4-MU-KDN method. Among these, the microorganism from which the crushed liquid in which KDNase activity was observed but sialidase activity was not derived was designated as mOL12 and used for the following selection.
[0031]
The mOL12 strain colonies were streaked on an M9 agar medium containing 0.05% of KDN oligosaccharide alcohol, and the 4 colonies were separated and designated mOL12-1, mOL12-2, mOL12-3 and mOL12-4, respectively. Each colony is streaked on an LB plate medium, and a single colony is inoculated and cultured in an M9 liquid medium containing 0.05% KDN oligosaccharide alcohol, and the KDNase activity and the sialidase activity of the cell disruption solution are each 4- Measured by MU-KDN method and cetylpyridinium chloride method. The 4-MU-KDN method and the cetylpyridinium chloride method will be described below.
[0032]
(1) 4-MU-KDN method
When the ketoside bond of 4-methylumbelliferyl KDN (4-MU-KDN) is enzymatically hydrolyzed (the next reaction), fluorescent 4-methylumbelliferone is released. The fluorescence is measured.
[0033]
4-methylumbelliferyl KDN → KDN + 4-methylumbelliferone
Specifically, 1.4 nmol of 4-MU-KDN was added to a cell disruption solution dissolved in 20 μl of 0.1 M Tris acetate buffer (pH 6.0) /0.1 M NaCl, and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 20 μl of the reaction solution was taken and mixed with 2.5 ml of 85 mM glycine carbonate buffer (pH 9.3), and the fluorescence intensity was measured (excitation wavelength 365 nm, measurement wavelength 450 nm). For fluorescence intensity measurement, Biochemistry Vol. 18, No. 13, pages 2783-2787 were referred. The fluorescence intensity when a reaction similar to the above was performed without adding the cell disruption solution was used as a control.
[0034]
The 4-MU-KDN used in this method was obtained by the method developed by Dr. Thomas G. Warner shown below, and the one provided by Dr. Thomas G. Warner was used.
[0035]
KDN is enzymatically known [Auge, C., et al., Tetrahedron. 46 , 201-214 (1990)] and was synthesized from D-mannose and pyruvate using Neu5Ac aldolase. KDN was dried, suspended in 10 ml of acetic anhydride and 10 ml of pyridine, and reacted at room temperature overnight. The reaction solution was ice-cooled, methanol was added to stop the reaction, and the solvent was removed. The residue was dissolved in methanol and Dowex 50 (H ⁺ ) Elution with methanol over a column (4 × 5 cm). After removing the solvent from the eluate, an excess amount of diazomethane was added in ethyl ether to obtain a methyl ester. The resulting fully acetylated methyl ester product was applied to a silicic acid column (2.5 × 17 cm) and eluted with a gradient of ethyl acetate in hexane, and methyl 2,4,5,7,8,9-hexa -O-acetyl KDN (K1) was obtained. The known method [Warner et al., Biochemistry 18 , 2783-2787 (1979)], K1 is converted to glycosyl chloride and reacted with the sodium salt of 4-methylumbelliferone (4-MU) to polymerize K1 and 4-MU to give 4-methyl-2 -Oxo-2H-1-benzopyran-7-yl 4,5,7,8,9-penta-O-acetyl KDN (K2) was obtained.
[0036]
4 ml of methanol was added to 0.5 g of K2, followed by 4 ml of 0.5N sodium hydroxide, and the mixture was suspended at 37 ° C. for 1 hour. Further, 4 ml of sodium hydroxide was added and left at 37 ° C. for 90 minutes, and then the pH was adjusted to Dowex 50 (H ⁺ ) The resin was added to neutralize to pH 6.0. The resin was removed by filtration and the solvent was removed. A small amount of 10 mM aqueous ammonia was added to the residue to adjust the pH to 9, and then high purity 4-MU-KDN was purified by Sephadex G-25 gel filtration.
[0037]
4-MU-KDN can also be obtained by the method described in Schreiner, E. and Zbiral, E. (1990) Liebigs Ann. Chem., 581-586.
[0038]
(2) Cetylpyridinium chloride method
As a substrate, a rainbow trout ovarian fluid-derived KDN-containing glycoprotein was used. After carrying out the enzyme reaction under the same conditions as described in the above section (1), 2 ml of 0.1% cetylpyridinium chloride (CPC) was added to the reaction solution. KDN-containing glycoprotein forms a complex in the presence of CPC and precipitates, but KDN released by the enzymatic reaction does not precipitate. The reaction solution is allowed to stand for 30 minutes, then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes), and the amount of KDN in the resulting supernatant is determined by the thiobarbituric acid method (Analytical Biochemistry Vol. 205, 244-250, (1992)). The enzyme activity was measured.
[0039]
The colonies formed when mOL12-4 is streaked on the LB plate medium are divided into three sizes, “large”, “medium” and “small”, among which “large” colonies and “medium” The strains that formed colonies did not show KDNase activity, whereas the strains that formed “small” colonies showed KDNase activity and no sialidase activity. One of these strains showing only KDNase activity was designated as mOL12-4s.
[0040]
Identification of mOL12-4s isolated as described above was performed using a commercially available Gram-negative bacilli identification kit (Biomelieu, API 20NE) other than enteric bacteria. The main bacteriological properties tested are shown below.
[0041]

[0042]
From the above results, mOL12-4s was identified as a bacterium belonging to the genus Sphingobacterium and named sphingobacterium mOL12-4s. This bacterium is deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry as an international deposit based on the Budapest Treaty under the deposit number FERM BP-5116. In addition, this microbe is highly likely to be Sphingobacterium multivorum from mycological characteristics.
[0043]
[Example 2]
Production of PNGase SM
Miller's Luria Broth (LB) medium (Gibco BRL) was dispensed in an amount of 800 ml into a 2-liter Erlenmeyer flask and autoclaved. This medium was inoculated with sphingobacterium mOL12-4s and then cultured at 25 ° C. for 48 hours using a shaking incubator.
[0044]
<1> Extraction of PNGase SM
(1) Extraction of PNGase SM by cell disruption
After completion of the culture, the cells were collected from the culture solution by centrifugation (15,000 × g, 40 minutes). The obtained cells were suspended in ice-cooled 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.1 M NaCl, and centrifuged again to wash the cells. After performing this washing operation three times, the cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.15 M NaCl, and sonicated to disrupt the cells.
[0045]
The supernatant obtained by centrifuging this cell disruption solution (10,000 × g, 30 minutes) was cooled, and ammonium sulfate was added to the supernatant until 90% saturation, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. This was centrifuged (150,000 × g, 1 hour) to obtain a precipitate. This precipitate was dissolved in 100 mM MES buffer (pH 7.0), 0.25 M sucrose, and 10 mM dithiothreitol (DTT) to obtain an enzyme solution of PNGase SM.
[0046]
(2) Extraction of PNGase SM by osmotic pressure shock
Sphingobacterium mOL12-4s was cultured in the same manner as described above, and collected and washed by centrifugation (15,000 × g, 40 minutes). The cells were subjected to osmotic shock treatment according to a known method [Nossal, NG and Heppel, LA (1966) J. Biol. Chem. 241, 3055-3062] to release the enzyme outside the cells. That is, the cells were suspended in 0.1 M EDTA / 33 mM Tris-HCl buffer (pH 7.1) containing 40 ml of sucrose 20% per 1 g of cells, left at 25 ° C. for 10 minutes, and then centrifuged. Precipitation was performed by operation (13,000 × g, 10 minutes). The cells were suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.1) containing 1 mM magnesium acetate and left at 0 ° C. for 10 minutes to give an osmotic shock. 1/10 volume of 1M NaCl / 1M Tris-HCl buffer (pH 7.1) was quickly added to the above cell suspension, and then centrifuged again (13,000 × g, 30 minutes). Removed. To the obtained supernatant, ammonium sulfate was added so as to be 90% saturated, and left at 4 ° C. overnight. The resulting precipitate was centrifuged (17,000 × g, 30 minutes) and collected as a periplasm fraction containing the enzyme of the present invention.
[0047]
Although these steps alone do not completely purify PNGase SM, they can be used as a crude enzyme for PNGase SM. Purification can be carried out by an ordinary enzyme purification method as necessary. At that time, PNGase activity and physicochemical properties of PNGase SM can be used as indices.
[0048]
<2> Purification of PNGase SM
The periplasm fraction obtained as described in (2) above was dissolved in 10 ml of 0.1 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and 0.25 M sucrose / 0.1 M NaCl / 20 mM Tris-HCl was dissolved. Dialyzed against buffer solution (pH 8.0), applied to DEAE-Toyopearl 650M column (manufactured by Tosoh Corporation; 2.2 × 11 cm, 42 ml; equilibrated with the same composition as the dialysis solution), 60 ml Fractions eluted with the same solution were collected. This fraction was concentrated to 13 ml by ultrafiltration (YM10 membrane; manufactured by Amicon), and CM-Toyopearl 650M column (manufactured by Tosoh Corporation; 2.2 × 11 cm, 42 ml; 0.25 M sucrose / 0.1 M NaCl / 20 mM Tris-acetic acid) Elution was performed with 60 ml of 0.25 M sucrose / 0.1 M NaCl / 20 mM Tris-acetate buffer (pH 6.0). The eluate was pooled and concentrated to 7 ml by ultrafiltration (YM10 membrane; Amicon). The enzyme fraction obtained here had a specific activity of 26 mU / mg protein.
[0049]
[Example 3]
Properties of the enzyme of the present invention
(1) Action / Substrate specificity
The enzyme solution of PNGase SM obtained by the above method (<1> (1) of Example 2), and the substrate [ ¹⁴ C] Leu-Asn (CHO1) -Asp-Ser-Arg (hereinafter referred to as asialo- [ ¹⁴ C] fetGP I) or [ ¹⁴ C] Leu-Ala-Asn (CHO1) -CmCys-Ser (hereinafter referred to as asialo- [ ¹⁴ C] fetGP II), and the enzyme activity was measured by paper chromatography according to the above enzyme activity measurement method. As a result, the production of a peptide containing no sugar chain was confirmed by paper chromatography. From this, it was shown that PNGase SM which is an enzyme of the present invention hydrolyzes an amide bond between an asparagine residue and an N-acetylglucosamine residue in a glycoprotein or glycopeptide. In addition, asialo- [ ¹⁴ Since the sugar chain (part indicated by (CHO1)) contained in C] fetGP I and II is a complex (complex) asparagine-linked sugar chain, the enzyme of the present invention is at least a complex (complex) asparagine. It has been shown to act on glycoproteins or glycopeptides containing conjugated sugar chains.
[0050]
In addition, a glycopeptide derived from ovalbumin with a high mannose sugar chain (Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn (CHO2) -Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Hse ((CHO2) is high Represents an asparagine-linked sugar chain having a mannose-type sugar chain structure; hereinafter referred to as ovGP-highMan) and a hybrid (hybrid) sugar chain (Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn (CHO3) -Leu- Using asrlo- [Thr-Ser-Val-Leu-Hse ((CHO3) represents an asparagine-linked sugar chain with a hybrid sugar chain structure; hereinafter referred to as ovGP-hybrid) ¹⁴ C] As a result of reacting in the same manner as fetGP I, it was confirmed that these also serve as substrates. Therefore, the enzyme of the present invention is a glycoprotein containing high mannose-type and hybrid (hybrid) -type asparagine-linked sugar chains or It has also been shown to act on glycopeptides.
[0051]
(2) Optimum pH / stable pH range
The enzyme solutions of PNGase SM obtained by the above method were respectively added to 100 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.1), 100 mM Tris-acetic acid buffer (pH 5.5), and 100 mM Tris-acetic acid buffer (pH 8.6). Was dialyzed at 4 ° C. for 4 hours. 10 μl of each enzyme solution (each containing 0.42 mU of the enzyme of the present invention) as a substrate [ ¹⁴ C] Leu-Asn (CHO1) -Asp-Ser-Arg (asialo- [ ¹⁴ C] fetGP I) 1 μl or [ ¹⁴ C] Leu-Ala-Asn (CHO1) -CmCys-Ser (asialo- [ ¹⁴ C] fetGP II) 1 μl was added, and the enzyme activity was measured by paper chromatography according to the enzyme activity measurement method described above. Table 1 shows the relative activity at each pH when the activity when reacted under the condition of pH 7.1 is 100% for each substrate.
[0052]
[Table 1]

[0053]
From this result, it was shown that the optimum reaction pH of the enzyme of the present invention is around pH 7 at 25 ° C. Further, since the enzyme of the present invention has enzyme activity at pH 5.5 and pH 8.5, it was shown that the enzyme of the present invention is stable at 25 ° C. in the range of at least pH 5-9.
[0054]
Also asialo- [ ¹⁴ Using C] fetGP I as a substrate, the effect of pH on the enzyme activity of the present invention was examined in more detail. The same procedure as described above was performed except that the enzyme of the present invention used was 0.17 mU. Table 2 shows the relative activity at each pH when the activity when reacted under the condition of pH 7.0 is 100%. In the table, MES represents 2-morpholinoethanesulfonic acid, and CHES represents cyclohexylaminoethanesulfonic acid.
[0055]
[Table 2]

[0056]
From this result, it was shown that the optimum reaction pH of the enzyme of the present invention is around pH 7 at 25 ° C. In addition, it has an activity of 90% or more of the activity at pH 7.0 at pH 7 to pH 8, and about 60% of the activity at pH 7.0 even in the range of pH 6.5 to pH 8.5. Indicated. It was also shown that the enzyme of the present invention is stable at 25 ° C. at least in the range of pH 5-9.
[0057]
(3) Optimal reaction temperature
Since the enzyme of the present invention has a high activity around 25 ° C. at pH 7.1, it was shown that the optimum reaction temperature of the enzyme of the present invention is around 25 ° C. at pH 7.1.
[0058]
(4) Thermal stability
The enzyme of the present invention was not inactivated at pH 7 at 25 ° C. for at least 48 hours. The sample containing the enzyme of the present invention purified in Example 2 was stable at 4 ° C. for at least 2 weeks.
[0059]
(5) Molecular weight
The enzyme of the present invention is eluted at a molecular weight of about 20,000 to 30,000 in Sephacryl S-200 (Pharmacia) chromatography (1.8 × 135 cm; eluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) /0.5 M NaCl). It was. From this, the molecular weight of the enzyme of the present invention is estimated to be about 20,000 to 30,000 in the gel filtration method.
[0060]
【The invention's effect】
Unlike conventional PNGase, the enzyme of the present invention having an optimum pH neutral is expected to be used as a reagent useful for studies such as glycoprotein and glycopeptide structure and function analysis. In addition, there is a possibility that the functions of glycoproteins and glycopeptides can be modified by the enzyme of the present invention, and utilization of glycoproteins and glycopeptides whose functions are modified as new physiologically active substances is expected. In addition, when the method of the present invention is used, the enzyme of the present invention can be produced by microorganisms, so that the enzyme of the present invention can be prepared in large quantities on an industrial scale.

Claims

A glycopeptidase having the following physicochemical properties:
(1) Action: Hydrolyzes an amide bond between an asparagine residue and an N-acetylglucosamine residue in a glycoprotein or glycopeptide.
(2) Substrate specificity: Acts on glycoproteins or glycopeptides containing asparagine-linked glycans that are complex glycan structures, high mannose glycan structures, and hybrid (hybrid) glycan structures. .
(3) Optimal reaction pH: around pH 7 at 25 ° C. (4) Stable pH range: pH 5-9 at 25 ° C.
(5) Optimal reaction temperature: around 25 ° C. at pH 7.1 (6) Thermal stability: Does not deactivate at 25 ° C. for at least 48 hours.
(7) Molecular weight measured by gel filtration method: 20,000 to 30,000.

2. The glycopeptidase according to claim 1, which is produced by a microorganism belonging to the genus Sphingobacterium.

The glycopeptidase according to claim 2, wherein the microorganism belonging to the genus Sphingobacterium is sphingobacteria mOL12-4s (FERM BP-5116) .

A method for producing glycopeptidase, comprising culturing a microorganism belonging to the genus Sphingobacterium and capable of producing glycopeptidase, and collecting the glycopeptidase according to claim 1 from the culture.