JP3795279B2

JP3795279B2 - Reduced odor and non-sensitive natto

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Publication number: JP3795279B2
Application number: JP32025499A
Authority: JP
Inventors: 浩竹村; 記子安藤; 義則塚本
Original assignee: Mizkan Group Corp
Current assignee: Mizkan Group Corp
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: JP2000354493A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、納豆の不快臭のひとつであるムレ臭が低下したないしムレ臭がない、新規納豆であるムレ臭減感ないし非感納豆の製造に関するものである。
【０００２】
特に本発明は、納豆のムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）であることをはじめて見出しただけでなく、その生成メカニズムをはじめて解明してそれに関与する酵素に着目し、該酵素活性を遺伝子操作や突然変異処理などによって低下ないし失活せしめることによりムレ臭の低下ないし消失を確認し、これらの新規知見に基づき更に研究の結果、納豆中の短鎖分岐脂肪酸のより好ましい含有量をつきとめ、それを達成することのできる新規納豆菌の開発、育種にも成功し、ムレ臭が低下したまたはムレ臭のない従来未知の新規納豆を製造する新規なトータルシステムの構築に成功し、本発明の完成に至ったものである。
【０００３】
【従来の技術】
納豆は、大豆を原料に納豆菌による発酵を行って生産され、納豆菌がつくる粘質物と共に、その臭いに特徴のある食品である。納豆中には、ピラジン類、アセトイン、ジアセチル、酢酸、プロピオン酸、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）、アンモニアなどを中心とした種々の揮発性成分が含有されていることが知られているが（日本食品工業学会誌、３１巻、ｐ．５８７−５９５（１９８４））、これらの内のピラジン類、ジアセチルなどは、納豆好きの消費者に好まれるいわゆる納豆臭の主成分であるといわれている。
【０００４】
その一方で、いわゆるアンモニア臭やムレ臭は代表的な不快臭であるといわれており、なるべくこれらの不快臭の原因となる物質の含量の低い納豆を開発することができれば、納豆の品質を向上させることができると期待できる。
【０００５】
このような観点から、不快臭の一つであるアンモニア臭を抑制する方法としては、特開昭６４−８６８５４、特開平１−１９１６５５、特開平４−１７３０６９、特開平６−２６９２８１、特開平８−１５４６１６、特開平８−２７５７７２などに開示の如く、発酵中や保存中にアンモニアをあまり生産しないように改良した納豆菌を開発し、その納豆菌を使用して納豆を生産しようとする試みが多くなされてきている。これらの殆どは、納豆菌が本来保有するプロテアーゼ活性を低下させた納豆菌を開発し、このようなプロテアーゼ活性低下納豆菌を用いて納豆を生産する方法であった。このような方法により、アンモニアの生産がある程度抑えられ、アンモニア臭が低下した納豆を製造できることが期待されている。
【０００６】
しかし、納豆のもう一方の代表的不快臭であるムレ臭を抑えることについては、これまでに全く検討されていなかった。むしろムレ臭の原因物質を特定することも出来ておらず、従ってムレ臭を抑制する方法の開発も大幅に遅れているのが現状であって、ムレ臭低下納豆の製造方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、納豆の有用性、特に嗜好食品としてのみでなく健康保健食品としての面からの有用性にも鑑み、更なる摂取量の増加を図る目的でなされたものであり、その際において、従来未解決のまま残されていたムレ臭の消失という技術課題を解決する目的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、不快なムレ臭が低下したまたはムレ臭のない新規納豆である「ムレ臭減感納豆ないしムレ臭非感納豆」（以下、単にムレ臭減感納豆ということもある）及びその創製システムを開発する目的でなされたものである。そして、この目的を達成するため、本発明者らは、各方面から研究した結果、納豆のムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）であることをはじめてつきとめただけでなく、短鎖分岐脂肪酸の生成が納豆菌によって行われることをはじめてつきとめた。
【０００９】
そして更に納豆菌における短鎖分岐脂肪酸の生成メカニズムについて研究した結果、その生成はロイシンデヒドロゲナーゼ、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼに起因することもはじめてつきとめた。
【００１０】
そこで本発明者らは、これらの有用新知見に基づき、短鎖分岐脂肪酸生産能が低下ないし消失した納豆菌を創製し、この納豆菌を用いて納豆を製造したところ、ムレ臭が大幅に低減していることを確認し、そして更にそのメカニズムを解明するため、ロイシンデヒドロゲナーゼ、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ生成酵素活性を低下、失活させた納豆菌を用いて納豆を製造したところ、得られた納豆にはムレ臭がないこと、つまり該メカニズムのひとつが該酵素活性の低下、失活によるものであることを確認し、本発明に係るムレ臭減感納豆（ムレ臭非感納豆も包含される）を製造する納豆菌の育種方法を確立するのにも成功し、本発明の完成に至ったものである。
【００１１】
更に詳細には、本発明者らは、納豆におけるムレ臭の原因物質を特定すべく各方面から鋭意検討を重ねた結果、上記したように短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）であることをはじめてつきとめた。そして、分岐アミノ酸を出発物質とする短鎖分岐脂肪酸の生合成経路について、図１のような仮説を設定した。そしてこの仮説にしたがってロイシンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させることにより、短鎖分岐脂肪酸の少なくともひとつを生産できないように育種した短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を開発するのにはじめて成功し、その納豆菌を用いて納豆を製造したところ、上記仮説どおり、ムレ臭が著しく低下した納豆であることがはじめて確認できた。
【００１２】
その結果、ムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂肪酸、すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸であることをつきとめることができ、同時に上記仮説の正しいことが確認された。そして、納豆菌においてロイシンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損する手法も確立して、ムレ臭の生産能が低下または消失した納豆菌という従来未知の新規納豆菌を創製するのにはじめて成功し、そして更に、このようにして開発した新規納豆菌を用いることにより、ムレ臭の低下ないし消失した納豆という新規食品の製造が可能であることも確認し、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００１３】
さらに本発明者らは、納豆中の短鎖分岐脂肪酸のより好ましい含有量について官能検査も併用しながら数値の解明につとめた結果、ムレ臭が低下しまたはムレ臭のない納豆であれば本発明の目的は達成されるが、具体的には、短鎖分岐脂肪酸の含有量が２０ｍｇ／１００ｇ納豆未満、より好ましくは１０ｍｇ／１００ｇ納豆以下であれば充分に本発明に係るムレ臭減感納豆が得られることも確認し、これらの新規知見を総合して本発明を完成した。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で育種改良に用いるもとの納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、市販の納豆から分離した納豆菌、およびさらに改良を重ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００１５】
納豆菌は、枯草菌Bacillus subtilisに分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、Bacillus nattoに分類されたり、枯草菌の変種としてBacillus subtilis var. nattoあるいはBacillus subtilis (natto)などと分類する文献もある。納豆菌としては、例えばBacillus natto IFO 3009、Bacillus subtilis IFO 3335、同IFO 3336、同IFO 3936、同IFO 13169などがあるほか、上記した各種納豆菌が広く使用される。
【００１６】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株、市販の納豆菌高橋３号菌（Ｔ₃株、東京農業大学菌株保存室）、宮城野納豆菌（宮城野納豆製造所）等、各種の納豆菌が適宜使用できる。
【００１７】
本発明に係るムレ臭減感納豆を製造するための納豆菌としては、短鎖分岐脂肪酸（short branched chain fatty acids)生産酵素遺伝子であるロイシンデヒドロゲナーゼ(leucine dehydrogenase, EC 1.4.1.9)遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ(branched chain α-keto acid dehydrogenase, EC 1.2,1,25)遺伝子の機能が低下または欠損している納豆菌を育種し、これを使用する。また希望するのであれば、遺伝子組換え技術にしたがって目的遺伝子の機能を低下または欠損させてなる納豆菌を創製し、これを使用してもよい。
【００１８】
前者の場合、すなわち、既に目的遺伝子の機能が低下または欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等による薬剤変異法や、γ線や紫外線等を用いる方法などによってこれらの遺伝子を変異させて機能を低下または欠損させるなどの、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。すなわち、自然界からの分離、突然変異処理等の遺伝子組換え技術を利用しない方法によっても育種が可能である。
このような通常の変異手段によれば、ロイシンデヒドロゲナーゼ及び／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が完全に失活した納豆菌以外にも、これらの酵素活性が中間程度に低下した納豆菌も取得することができる。このような納豆菌を用いて納豆を生産する場合は、ムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量が中間程度に低下した納豆が製造可能となり、これらの方法を組み合わせることによって、育種した納豆菌を用いることにより、短鎖分岐脂肪酸の含有量が２０ｍｇ未満、好ましくは０〜１０ｍｇ／１００ｇ納豆の範囲のムレ臭減感〜非感納豆を適宜製造することができる。
【００１９】
後者の場合、すなわち、遺伝子組換え技術を利用する場合は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を欠損させ、これらの酵素活性を失活させた納豆菌を育種することにより短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸を生産しない納豆菌を取得するものである。育種の方法のひとつとしては、スタールらがBacillus subtilisにおいて開発した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（J. Bacteriol., Vol.158, p.411-418(1984)）を納豆菌用に改変した方法が用いられる。
【００２０】
本方法が納豆菌においても有効であることは本発明者らにより初めて立証されたことである。本方法の利点は狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができることである。また本方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、異種蛋白質が発現されることは全くなく、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの、特に食品として利用する場合に重要な長所を有している。
【００２１】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、本発明者らは、形質転換能の向上した納豆菌を取得することにより、納豆菌の実用的なレベルの形質転換系を開発することも可能としており、この形質転換系を利用してプラスミドベクターを納豆菌に効率良く導入し、目的の遺伝子欠損株を育種することが出来たのである。
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、Appl. Environ. Microbiol., Vol.63., p.4087-4089(1997)に記載のファージベクターを利用した形質導入法(transduction)が既に開発されており、本発明ではこの方法も利用される。
【００２２】
本発明においては、このようにして得た短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつの生産能が低下ないし消失した納豆菌を使用する。このようにして自然界から分離、突然変異処理、遺伝子組換え技術等から選ばれる少なくともひとつの方法で育種、創製された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。このようにして短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用いて製造した納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆とを比較すると、短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌で製造した納豆は、短鎖分岐脂肪酸をほとんど含有しておらず、いわゆるムレ臭がほとんどないことが確認される。
【００２３】
また、短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した上記の納豆菌を通常の納豆菌と適当な比率で混合して使用して納豆の発酵をさせることによっても、あるいはまた前記したように、変異をコントロールすることにより短鎖分岐脂肪酸の生産能の低下の程度を調整した納豆菌を使用して納豆を発酵させることによっても、納豆のムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量が２０ｍｇ未満、好ましくは１０ｍｇ／１００ｍｇ納豆以下で且つ所望する含有量の新規納豆である、ムレ臭減感納豆〜ムレ臭非感納豆を適宜自由に製造することができる。
【００２４】
ここに開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損しており、これらの酵素活性がほとんど消失した納豆菌である。このような納豆菌を用いて生産された納豆は、短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸をほとんど含有しておらず、そしてムレ臭が低下した納豆であることが確認されたことから、納豆のムレ臭の原因物質がイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸などの短鎖分岐脂肪酸であることが明白となり、ここに、これらの短鎖分岐脂肪酸は納豆菌においては、図１に示すような代謝経路により生産されることが初めて確認されたのである。
【００２５】
したがって、ムレ臭が低下ないし消失した納豆を生産する目的で短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつ）の生産能が低下または消失した納豆菌を開発するには、図１に示すような代謝経路に係わる酵素群の内の一つもしくはそれ以上の酵素の活性を失活させれば良いことが示されたことになる。そして本発明に係る納豆菌を育種するには、遺伝子組み換えの手法によるだけでなく、通常行われている変異手段によればよく、あるいは、自然界から分離してもよい。
【００２６】
これらの短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した納豆菌を用いて納豆を製造する方法以外にも、通常の納豆菌を用いた納豆の製造における発酵条件を種々工夫するなどして短鎖分岐脂肪酸の生産を抑制したり、さらに通常の納豆の発酵が終了した後に、納豆を吸引−吸着などの物理的手段などによって処理するなどの方法によっても、納豆中のムレ臭原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量を低下または消失させて、ムレ臭が低下したまたはムレ臭がない、ムレ臭減感ないしムレ臭非感納豆を製造することができる。
【００２７】
さらに、納豆中の短鎖分岐脂肪酸の含有量は、２０ｍｇ未満、より好ましくは１０ｍｇ／１００ｇ納豆以下であれば良く、上記の短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した納豆菌を用いて、あるいは発酵条件の改良や納豆を物理的手段などによって処理することなどによって製造することが可能となる。
【００２８】
【実施例】
以下、遺伝子組換え技術及び突然変異処理を利用した本発明の実施例をそれぞれ示す。
【００２９】
【実施例１】
▲１▼使用菌株等
納豆菌Ｏ−２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌である。納豆菌ｒ２２株はＯ−２株の形質転換能を高めた変異株であり、後述の如く、Ｏ−２株をニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した。
大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫおよび大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９９は宝酒造株式会社より購入した。
培地は、納豆試験法（光琳）ｐ．８５−９７（１９９０）記載の肉汁培地、胞子形成培地、ＮＰ再生培地等を用いた。ただし、必要な場合は、テトラサイクリン（２μｇ／ｍｌ）や短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、各０．１ｍＭ）を添加した。
【００３０】
納豆菌ｒ２２株は、以下の方法で取得した。すなわち、市販納豆分離菌Ｏ−２株を、常法に準じ、ＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３０℃・１ｈｒ、生存率７．３％）した。その結果得られた変異処理菌（５×１０⁶個）を、Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111(1979）に記載のBacillus subtilisの方法に準じたプロトプラスト法により枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。この場合、形質転換後のプロトプラストの再生培地はＮＰ再生培地を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十株の形質転換株を得た。これらの株は親株Ｏ−２株に比較して形質転換能が向上していることが期待されたが、これらの株にはベクターｐＨＹ３００ＰＬＫが導入されており、このことが形質転換に利用する際に障害となるのでベクターｐＨＹ３００ＰＬＫを除去する必要があった。
【００３１】
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去は、納豆菌Ｏ−２株が胞子を形成する際にベクターｐＨＹ３００ＰＬＫが欠落しやすい性質を本発明実施の中で見出し、利用することにした。そこで、これらの形質転換株の内３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形成させた。その後、それぞれの形質転換株から得られた胞子各１６個を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの保持の有無を調べた結果、３０株中の２１株についてベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去に成功したことが確認できた。
【００３２】
さらに得られた２１株のベクター除去株について、プロトプラストを作成し、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換能が向上しているかを比較し、１５株で形質転換能が向上していることを確認した。さらに、これら１５株について常法による納豆製造試験を行い、発酵能や品質評価を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造できる株は４株だけであった。さらにこれら４株中２株は納豆の香りで硫黄臭などの不快臭の強い品質の悪いものしか製造できず、また１株は糸引きが極端に悪くなったものであった。残る１株（ｒ２２株と命名）のみが９名のパネラー（Ａ〜Ｉ）による評価の結果、親株Ｏ−２株を用いて製造した納豆よりは少し品質が劣るものの、納豆として許容される範囲の品質のものを製造できた。
【００３３】
ｒ２２株で製造した納豆を親株Ｏ−２株で製造した納豆と比較した品質評価結果を表１、表２に、またｒ２２株の形質転換能を親株Ｏ−２株と比較した結果を表３に示した。なお、表１、表２において、評価点は、対照（Ｏ−２株で製造）を３とした５段階評価の結果で示した。但し、総合評価は、対照（Ｏ−２株で製造）を０とした±５段階評価の結果で示した。
【００３４】

【００３５】

【００３６】
〔表３〕
（形質転換能の比較）
菌株形質転換効率（／μｇＤＮＡ）
Ｏ−２株＜0.01
ｒ２２株 300
（注）大腸菌で調整したｐＨ３００ＰＬＫで形質転換した
【００３７】
▲２▼ ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の分離
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｙｑｉＴ）内部の約０．２４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を以下の方法で脱落させることにより分離した。
【００３８】
ｉ）ベクター構築（図２、図３）
Jpn. J. Genet. Vol.61, p.515-528に記載された、ｐＨＹ３００ＰＬＫの塩基配列を基に、配列表の配列番号１および２に示す、５′−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧ−３′、および、５′−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴ−３′の２種のオリゴＤＮＡを調製し、ｐＨＹ３００ＰＬＫを鋳型に用い、常法どおりＰＣＲを行い、ｐＨＹ３００ＰＬＫ上のテトラサイクリン耐性遺伝子全長を増幅すると共に両末端に、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識サイトを導入した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、プラスミドｐＨＳＧ３９９のＥｃｏＲＩサイトに導入し、プラスミドｐＨＳＧ３９９Ｔを得た。（図３）
【００３９】
アミノ酸配列のデータベースＳＷＩＳＳ−ＰＬＯＴに登録されている（登録番号Ｐ５４５３１）Bacillus subtilisのロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を基に、配列番号３および４に示す、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴ−３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣ−３′の２種のオリゴＤＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の条件でＰＣＲを行い、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム全長（１０９５塩基）を増幅すると共に、両端に制限酵素ＢａｍＨＩの認識サイトを導入した。得られた断片をｐＨＳＧ３９９のＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを得た。（図２）
【００４０】
ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じるバンドのうち、長いほうのバンド（約３．１ｋｂ）をアガロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌を形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴ上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子のほぼ中央部に存在する約０．２４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を脱落させたプラスミドｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを得た。（図２）
【００４１】
ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶをＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．８６ｋｂの断片を回収し（この断片は、中央部の０．２４ｋｂＥｃｏＲＶ断片が脱落したロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子）、ｐＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得られたプラスミドはｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶと命名し、以下の実験に供した。（図３）
【００４２】
ii）形質転換（図４、図５）
プラスミドｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳを宿主にして調製した。本大腸菌はｒｅｃＡ+株であるので、ｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶの２量体が得られる。得られた２量体を用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプラスト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テトラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換体では、染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子とｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶ上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の間で１回又はそれ以上の回数の相同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶが染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子に組み込まれている。
【００４３】
複数の形質転換株より全ＤＮＡを調製し、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用した合成ＤＮＡを用いＰＣＲを行った。増幅された断片のパターンをアガロースゲル電気泳動により解析し、各形質転換株で何回組換えが起こっているか確認した。そして、２回組換えが起こっている株を選択し、ｙｑｉＴ７株と命名した。（図５）
【００４４】
iii）形質導入（図５）
上記の形質転換に用いたｒ２２株よりも、親株であるＯ−２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるため、ｙｑｉＴ７上に挿入されたｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶをAppl. Environ. Microbiol., Vol.63, p.4087-4089(1997）記載の、納豆菌ファージφＢＮ１００を用いた形質導入法（transduction）により、Ｏ−２株に導入した。得られた形質導入株をｙｑｉＴｔ１株と命名した。
【００４５】
iv）脱落株の選択（図５）
ｙｑｉＴｔ１株上のｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶ挿入は、染色体上で相同組換えが起こると脱落する。そして、脱落した株では、結果として、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子上の０．２４ｋｂＥｃｏＲＶ断片が脱落し、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損株が取得できる。この相同組換えによる脱落株は、テトラサイクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代液体培養する事により、約０．１％の確率で得られる。得られた株をBacillus subtillis B2（以下、Ｂ２株）と命名し、以下の実験に供した。本菌株は、ＦＥＲＭＢＰ−６６０５として、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した。
【００４６】
ｖ）ロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性
納豆菌Ｏ−２株およびＢ２株を１００ｍｌの肉汁培地（各０．１ｍＭのイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸を含む）入りの坂口フラスコ中で３７℃、振とう培養した。定常期初期（ＯＤ６６０が約１）まで菌が生育した時点で、集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．００２％β−メルカプトエタノールを含む）に懸濁後、フレンチプレスにて、菌体を破砕した。菌体破砕液を３．５ｋｒｐｍ、１５分遠心分離し、上清を粗酵素液として用いた。
【００４７】
酵素活性は、J. Ferment. Bioeng., Vol.69, p.199-203(1990)に記載の方法に従って測定した。表４に結果を示す。
【００４８】
〔表４〕
（ロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性）
菌株酵素活性（Ｕ／ｍｇ蛋白）
Ｏ−２株 0.020
Ｂ２株検出されず
【００４９】
Ｏ−２株では、活性が検出されたのに対し、Ｂ２株では、活性が検出されず、Ｂ２株がロイシンデヒドロゲナーゼ失活株となっている事が確認された。
【００５０】
vi）短鎖分岐脂肪酸要求性の確認
ロイシンデヒドロゲナーゼが失活すると、分岐アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪酸の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短鎖分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem., Vol.246, 5264-5272(1971))。
【００５１】
Ｏ−２株およびＢ２株について、短鎖分岐脂肪酸を生育に要求するかどうかを、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、各０．１ｍＭ）を含む最少培地および含まない最少培地上で確認した。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸を生育に要求するため、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加した。Ｏ−２株は短鎖分岐脂肪酸の有無に関係なく生育したのに対し、Ｂ２株は、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、いずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果により、Ｂ２株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖分岐脂肪酸要求株であることが確認された。
【００５２】
vii）納豆製造１（官能検査、短鎖分岐脂肪酸分析１）
Ｂ２株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照としては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
【００５３】
試作した納豆検体約２０ｇをブレンダーで粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテストチューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍのセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣによる短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸）の分析に供した。なお、イソ吉草酸と２−メチル酪酸は、ピークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸として計算した。結果を表５に記す。
【００５４】
〔表５〕
（短鎖分岐脂肪酸の定量）
発酵菌株イソ吉草酸 * イソ酪酸
宮城野菌 79.6mg／100g納豆 72.6mg／100g納豆
Ｂ２株 0.3mg／100g納豆 0.4mg／100g納豆
*: ２−メチル酪酸を含む
【００５５】
Ｂ２株を用いて製造した納豆には、短鎖分岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｂ２株を用いて製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香りに関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００５６】
viii）納豆製造２（官能検査２）
Ｂ２株を用い、常法に従って作成した納豆に、全低級分岐脂肪酸含量が、それぞれ５、１０、２０、３０、５０、１００、１５０ｍｇ／１００ｇ納豆となるよう、必要量の低級分岐脂肪酸を添加し、箸でよくかきまぜて、各種低級分岐脂肪酸濃度の納豆サンプルを調製した。なお、低級分岐脂肪酸の構成は、イソ酪酸：２−メチル酪酸：イソ吉草酸＝１．６：１．４：１に設定した。また、低級分岐脂肪酸が全く存在しない納豆サンプルも調製した。
【００５７】
このようにして調製した、低級分岐脂肪酸を種々の濃度含有する納豆サンプルについて、専門のパネラーによる官能検査を行い、ムレ臭の有無についてテストした。得られた結果を表６に示す。その結果から明らかなように、１００ｇ納豆中の全短鎖分岐脂肪酸濃度が２０ｍｇ以上の場合にムレ臭が感じられることがわかった。したがって、本発明に係るムレ臭が低下したないしムレ臭がないことを特徴とするムレ臭減感ないしムレ臭非感納豆は、納豆中における全短鎖分岐脂肪酸の存在濃度が２０ｍｇ／１００ｇ納豆未満が好適であり、特に１０ｍｇ／１００ｇ納豆以下が更に好適であることが判明した。
【００５８】

【００５９】
【実施例２】
▲１▼使用菌株等
納豆菌Ｏ−２株は、ｒ２２株、大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９９及び培地などは実施例１と同様に実施した。
【００６０】
▲２▼ 分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の分離
分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット遺伝子（ｏｄｂ２）内部の約０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片を以下の方法で脱落させることにより分離した。
【００６１】
ｉ）ベクター構築（図６）
Eur. J. Biochem., Vol.213, p.1091-1099(1993)に報告されているBacillus subtilisの分岐ケト酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット遺伝子（ｏｄｂ２）の塩基配列を基に、配列番号５および６に示す、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣ−３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴ−３′の２種のオリゴＤＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の条件でＰＣＲを行い、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼのＥ２サブユニットのオープンリーディングフレーム全長（１２７５塩基）を増幅すると共に、両端に制限酵素ＢａｍＨＩの認識サイトを導入した。得られた断片をｐＨＳＧ３９９のＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２を得た。
【００６２】
ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２を制限酵素Ｃｆｒ１０Ｉで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じるバンドのうち、長いほうのバンド（約３．０ｋｂ）をアガロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌を形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２上のＥ２サブユニット遺伝子のほぼ中央部に存在する約０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片を脱落させたプラスミドｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを得た。
【００６３】
ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０ＩをＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．７４ｋｂの断片を回収し（この断片は、中央部の０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片が脱落したＥ２サブユニット遺伝子）、ｐＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得られたプラスミドはｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉと命名し、以下の実験に供した。（図７）
【００６４】
ii）形質転換（図８）
プラスミドｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを大腸菌ＪＭ１０９を宿主にして調製した。得られたプラスミドを用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプラスト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テトラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換体では、染色体上のＥ２サブユニット遺伝子とｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉ上のＥ２サブユニット遺伝子の間で１回相同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉが染色体上のＥ２サブユニット遺伝子に組み込まれている。
【００６５】
複数の形質転換株より全ＤＮＡを調製し、Ｅ２サブユニット遺伝子の増幅に使用した合成ＤＮＡおよび、市販のＭ１３用プライマーＭ４、ＲＶを用いＰＣＲを行った。増幅された断片のパターンをアガロースゲル電気泳動により解析することにより、Ｅ２サブユニット遺伝子上のＣｆｒ１０Ｉサイトの上流（５′末端側）で組換えが起こっているのか、下流（３′末端側）で組換えが起こっているのか確認した。Ｅ２サブユニット遺伝子のＣｆｒ１０Ｉサイトの下流で組換えが起こっている株１株を選択し、ｏｄｂ２−１株と命名した。
【００６６】
iii）形質導入（図８）
上記の形質転換に用いたｒ２２株より、親株であるＯ−２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるため、ｏｄｂ２−１株の遺伝子上に挿入されたｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０ＩをAppl. Environ. Microbiol., Vol.63, p.4087-4089(1997）記載の納豆菌ファージφＢＮ１００を用いた形質導入法（transduction）により、Ｏ−２株に導入した。得られた形質導入株をｏｄｂ２ｔ１株と命名した。
【００６７】
iv）脱落株の選択（図８）
ｏｄｂ２ｔ１株上のｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉ挿入は、染色体上で重複しているＥ２サブユニット遺伝子の５′末端からＣｆｒ１０Ｉサイトの間で相同組換えが起こると脱落する。そして、脱落した株では、結果として、Ｅ２サブユニット遺伝子上の０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片が脱落し、Ｅ２サブユニット遺伝子の欠損株が取得できる。相同組換えによる脱落株は、テトラサイクリンを含まない栄養培地中で、約１０世代液体培養する事により、約０．１％の確率で得られる。得られた株をBacillus subtilis B5（以下、Ｂ５株）と命名し、以下の実験に供した。本菌株は、ＦＥＲＭＢＰ−６６０６として、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した。
【００６８】
ｖ）短鎖分岐脂肪酸要求性の確認
分岐ケト酸デヒドロゲナーゼが失損すると、分岐アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪酸の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短鎖分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem., Vol.246, p.5264-5272(1971))。Ｏ−２株およびＢ５株について、短鎖分岐脂肪酸を生育に要求するかどうかを、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、各０．１ｍＭ）を含む最少培地および含まない最少培地上で確認した。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸を生育に要求するため、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加した。
【００６９】
Ｏ−２株は、短鎖分岐脂肪酸の有無に関係なく生育したのに対し、Ｂ５株は、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、いずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果によりＢ５株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖分岐脂肪酸要求株であることが確認された。
【００７０】
vi）納豆製造（官能検査、短鎖分岐脂肪酸分析）
Ｂ５株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照としては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
【００７１】
試作した納豆検体約２０ｇをブレンダーで粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテストチューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍのセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣによる短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸）の分析に供した。
【００７２】
なお、イソ吉草酸と２−メチル酪酸は、ピークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸をスタンダードとして計算した。結果を表７に記す。
【００７３】
〔表７〕
（短鎖分岐脂肪酸の定量）
発酵菌株イソ吉草酸 * イソ酪酸
宮城野菌 79.6mg／100g納豆 72.6mg／100g納豆
Ｂ５株 1.5mg／100g納豆 3.1mg／100g納豆
* ２−メチル酪酸を含む
【００７４】
Ｂ５株を用いて製造した納豆には、短鎖分岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。
Ｂ５株を用いて作製した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香りに関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００７５】
【実施例３】
▲１▼使用菌株等
納豆菌Ｏ−２株及び培地などは実施例１と同様に実施した。
【００７６】
▲２▼ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の分離
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、ＮＴＧ変異処理法によりロイシン脱水素酵素遺伝子に変異を与えることにより、以下の方法で分離した。
【００７７】
ｉ）短鎖分岐脂肪酸要求性変異株の取得
納豆菌Ｏ−２株を親株として選定し、Ｏ−２株を常法に準じ、ＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度８０μｇ／ｍｌ、３０℃・１ｈｒ、生存率２．０％）した。その後、短鎖分岐脂肪酸を含有する肉汁培地（イソ酪酸、イソ吉草酸及び２−メチル酪酸を各々０．１ｍＭ含有）でコロニーを形成させ、その結果得られた変異処理菌のうちの１８，８９６株について、最少培地及び短鎖分岐脂肪酸を含有する最少培地（イソ酪酸、イソ吉草酸及び２−メチル酪酸を各々０．１ｍＭ濃度で含有）の２種類の培地に対してレプリカした。そしてこれら２種類の培地で培養（３０℃、１６ｈｒ）した後、短鎖分岐脂肪酸を含有する最少培地でのみ生育する短鎖分岐脂肪酸要求性変異株１１５株を選択した。
【００７８】
ii）ロイシンデヒドロゲナーゼ活性の測定
得られた短鎖分岐脂肪酸要求性変異株１１５株について、実施例１と同様にして常法により納豆生産性を検査し、このうちの納豆生産性を有していた３２株について、実施例１と同様の方法にてロイシンデヒドロゲナーゼ活性を測定した。その結果、ロイシンデヒドロゲナーゼ活性が全く検出されなくなった３株（それぞれＮ４６株、Ｎ６４株及びＮ１０３株と命名）及びロイシンデヒドロゲナーゼ活性が親株Ｏ−２株に比較して大きく低下した１株（Ｎ７９株と命名）が確認された。このようにして分離、育種された株の内、Ｎ４６株は、Bacillus subtilis N46と命名し、FERM BP-6871として、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した。ロイシンデヒドロゲナーゼ活性の測定結果を表８に示した。
【００７９】
〔表８〕
（ロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性）
菌株酵素活性（Ｕ／ｍｇ蛋白）
Ｏ−２株０．０５２
Ｎ４６株検出されず
Ｎ６４株検出されず
Ｎ７９株０．００７
Ｎ１０３株検出されず
（注）検出限界：約０．００２Ｕ／ｍｇ蛋白
【００８０】
▲３▼納豆製造（短鎖分岐脂肪酸分析）
Ｎ４６株、Ｎ６４株、Ｎ１０３株及びＮ７９株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短鎖分岐脂肪酸含量を測定した。対照としては、親株であるＯ−２株を用いた。短鎖分岐脂肪酸の測定方法は実施例１と同様である。なお、イソ吉草酸と２−メチル酪酸のＨＰＬＣでのピークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸として計算した。結果を表９に記す。
【００８１】
〔表９〕（短鎖分岐脂肪酸の定量）
発酵菌株イソ吉草酸 * イソ酪酸
Ｏ−２株 40.0mg/100g納豆 30.7mg/100g納豆
Ｎ４６株検出されず検出されず
Ｎ６４株 2.0mg/100g納豆 2.0mg/100g納豆
Ｎ７９株 2.9mg/100g納豆 4.8mg/100g納豆
Ｎ１０３株 0.6mg/100g納豆 0.4mg/100g納豆

*:２−メチル酪酸を含む（注）検出限界：約０．５ｍｇ／１００ｇ納豆
【００８２】
Ｎ４６株、Ｎ６４株、Ｎ７９株及びＮ１０３株を用いて製造した納豆には、短鎖分岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｎ４６株、Ｎ６４株、Ｎ７９及びＮ１０３株を用いて製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、味ともに、親株Ｏ−２を用いて製造した対照と同等のものであったが、香りに関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００８３】
【発明の効果】
本発明により、納豆の不快臭のひとつであるムレ臭の原因物質である短鎖分岐脂肪酸を生産しないないしその生産量の非常に低い納豆菌を育種開発する方法が提供され、その方法により開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用いて納豆を生産することにより、短鎖分岐脂肪酸含量の含有量が１００ｇ納豆中２０ｍｇ未満という短鎖分岐脂肪酸含量が非常に低く、ムレ臭が極めて少ない納豆を創製することが可能になっただけでなく、更に、１００ｇ納豆中１０ｍｇ以下という短鎖分岐脂肪酸含量が極めて低く、ムレ臭がないないしほとんどない全く新しいタイプの納豆を創製するのにも成功した。
【００８４】
また本発明によれば、短鎖分岐脂肪酸および／またはロイシン（分岐ケト酸）デヒドロゲナーゼを指標としたムレ臭減感〜非感納豆生産菌をスクリーニング、育種することが可能となり、その結果、遺伝子組換え技術のほか、天然の納豆菌、変異処理した納豆菌の中からも目的とする納豆菌を効率的にスクリーニングすることが可能となり、すぐれたムレ臭減感〜非感納豆を容易に得ることができる。
【００８５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】納豆菌における短鎖分岐脂肪酸の合成経路を示す。
【図２】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（１）を示す。
【図３】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（２）を示す。
【図４】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為の脱落株の構築過程の概略（１）を示す。
【図５】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為の脱落株の構築過程の概略（２）を示す。
【図６】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（１）を示す。
【図７】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為のベクター構築過程の概略（２）を示す。
【図８】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為の脱落株構築過程の概略を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to the production of a new natto deodorant or non-sensitive natto, in which the stuffy odor, which is one of the unpleasant odors of natto, is reduced or absent.
[0002]
In particular, the present invention not only found for the first time that the causative agent of the odor of natto is a short-chain branched fatty acid (isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid), but also elucidated its production mechanism for the first time. Focusing on the enzymes involved, we confirmed the reduction or disappearance of stuffy smell by reducing or deactivating the enzyme activity by genetic manipulation or mutation treatment, etc. Based on these new findings, further research results Newly developed new natto with low stuffy odor or no known odor that has succeeded in the development and breeding of new natto bacteria capable of achieving a more favorable content of short-chain branched fatty acids. As a result, the present invention has been completed.
[0003]
[Prior art]
Natto is a food that is produced by fermenting with natto bacteria using soybean as a raw material and is characterized by its odor along with the sticky material produced by natto bacteria. Natto contains various volatile components such as pyrazines, acetoin, diacetyl, acetic acid, propionic acid, short-chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid), ammonia and the like. Although it is known (Journal of the Japan Food Industry Association, Vol. 31, p. 587-595 (1984)), pyrazines, diacetyl, etc. are so-called natto odors preferred by natto-loving consumers. It is said that it is the main component.
[0004]
On the other hand, so-called ammonia odor and stuffy odor are said to be typical unpleasant odors. If natto with a low content of substances causing these unpleasant odors can be developed as much as possible, the quality of natto will be improved. It can be expected that
[0005]
From this point of view, methods for suppressing ammonia odor, which is one of unpleasant odors, are disclosed in JP-A 64-86854, JP-A 1-191655, JP-A-4-173669, JP-A 6-269281, and JP-A-8. -154616, as disclosed in JP-A-8-275772, etc., an attempt was made to develop an improved natto bacterium that does not produce much ammonia during fermentation or storage, and to produce natto using the natto bacterium. Many have been made. Most of these were methods for developing natto bacteria with reduced protease activity inherent to natto bacteria, and producing natto using such protease activity-reduced natto bacteria. By such a method, it is expected that production of ammonia can be suppressed to some extent and natto with a reduced ammonia odor can be produced.
[0006]
However, it has not been studied at all so far to suppress the stuffy smell, which is another typical unpleasant odor of natto. Rather, it has not been possible to identify the causative substance of stuffy odor, and therefore development of a method for suppressing stuffy odor has been greatly delayed, and development of a method for producing natto with reduced stuffy odor is desired. It was.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention was made for the purpose of further increasing the intake, in view of the usefulness of natto, particularly in terms of usefulness as a health food as well as a favorite food, It was made for the purpose of solving the technical problem of disappearance of the stuffy odor that had been left unsolved in the past.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is a novel natto with reduced or unpleasant stuffy odor, "Mule odor reduced natto or odorless natto" (hereinafter sometimes referred to simply as odor reduced natto) and its creation It was made for the purpose of developing a system. And in order to achieve this object, the present inventors have studied from various directions, and as a result, the causative substance of natto odor is short-chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid). Not only for the first time, but also for the first time that the production of short-chain branched fatty acids is performed by Bacillus natto.
[0009]
As a result of further studies on the production mechanism of short-chain branched fatty acids in Bacillus natto, it was found for the first time that the production was caused by leucine dehydrogenase and branched keto acid dehydrogenase.
[0010]
Therefore, the present inventors created a natto bacterium in which the ability to produce short-chain branched fatty acids was reduced or disappeared based on these useful new findings, and produced natto using this natto bacterium, resulting in a drastic reduction in odor In order to further confirm the mechanism and further elucidate the mechanism, natto was produced using natto bacteria with reduced and inactivated leucine dehydrogenase and branched keto acid dehydrogenase producing enzyme activities. Confirms that there is no stuffy odor, that is, one of the mechanisms is due to a decrease or deactivation of the enzyme activity, and stuffy odor reduced natto (including stuffy odor non-sensitive natto) according to the present invention. As a result, the present invention has been completed.
[0011]
More specifically, as a result of intensive studies from various directions to identify the causative substance of stuffy odor in natto, the present inventors have found that short-chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid, 2- For the first time. Then, a hypothesis as shown in FIG. 1 was set for the biosynthetic pathway of short-chain branched fatty acids starting from branched amino acids. According to this hypothesis, we succeeded in developing a natto bacillus that does not produce short-chain branched fatty acids that have been bred so that at least one of the short-chain branched fatty acids cannot be produced by deleting the leucine dehydrogenase and / or branched keto acid dehydrogenase genes. And when natto was manufactured using the natto bacteria, it was confirmed for the first time that it was a natto with a drastic reduction in odor as per the above hypothesis.
[0012]
As a result, it was confirmed that the causative substance of the stuffy odor was a short-chain branched fatty acid, that is, isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid, and at the same time, the above hypothesis was confirmed to be correct. In addition, a method for reducing or eliminating the function of the leucine dehydrogenase and / or branched keto acid dehydrogenase genes in Bacillus natto is also established to create a novel, previously unknown Bacillus natto, an natto bacillus that has reduced or disappeared the ability to produce odors. It was also confirmed that it was possible for the first time to produce a new food product of natto, which was successfully developed for the first time. Has been reached.
[0013]
Furthermore, the present inventors have clarified numerical values while using sensory tests for more preferable content of short-chain branched fatty acids in natto. As a result, the present invention is applicable to natto with reduced odor or no odor. Specifically, when the content of the short-chain branched fatty acid is less than 20 mg / 100 g natto, more preferably 10 mg / 100 g natto or less, the odor-depleted natto according to the present invention is sufficiently obtained. It was also confirmed that it was obtained, and these new findings were combined to complete the present invention.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
There is no particular limitation on the original natto bacteria used for breeding improvement in the present invention, but from natto bacteria with excellent fermentation ability normally used in natto industry, natto bacteria isolated and obtained from nature, and commercially available natto It is desirable to use isolated natto bacteria and excellent natto bacteria with further improvements.
[0015]
Bacillus natto is classified as Bacillus subtilis, but it can produce the characteristics of natto such as mucilage (thread-drawing substance). There are also literatures that are classified as Bacillus natto because they have required characteristics, and that are classified as Bacillus subtilis var. Natto or Bacillus subtilis (natto) as a variant of Bacillus subtilis. Examples of Bacillus natto include Bacillus natto IFO 3009, Bacillus subtilis IFO 3335, IFO 3336, IFO 3936, and IFO 13169, and various other Bacillus natto are widely used.
[0016]
Specifically, O-2 strain isolated from commercial natto, commercially available natto bacteria Takahashi No. 3 (T_ThreeVarious Bacillus natto bacteria can be used as appropriate, such as strains, Tokyo Agricultural University strain storage room), and Miyagino natto bacteria (Miyagino natto factory).
[0017]
As the Bacillus natto for producing the odor-depleted natto according to the present invention, a leucine dehydrogenase (EC 1.4.1.9) gene which is a short branched chain fatty acids producing enzyme gene and / or Breeding Bacillus natto with reduced or deficient function of the branched chain α-keto acid dehydrogenase (EC 1.2,1,25) gene and using it. If desired, a Bacillus natto having a reduced or deficient function of a target gene may be created according to a gene recombination technique and used.
[0018]
In the case of the former, that is, a so-called screening method for selecting natto bacteria whose function of the target gene has already been reduced or deleted from the natural world, a drug mutation method using nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS), etc., Breeding is also possible by other methods such as those conventionally performed, such as mutating these genes by a method using gamma rays, ultraviolet rays, or the like to reduce or eliminate the function. That is, breeding is also possible by methods that do not use genetic recombination techniques such as separation from nature and mutation treatment.
According to such normal mutation means, in addition to Bacillus natto in which the enzyme activity of leucine dehydrogenase and / or branched keto acid dehydrogenase is completely inactivated, Bacillus natto having an intermediate decrease in these enzyme activities is also obtained. be able to. When producing natto using such natto bacteria, it became possible to produce natto with a short-chain branched fatty acid content that is a causative agent of odor, which was bred by combining these methods. By using Bacillus natto, the content of short-chain branched fatty acids is less than 20 mg, preferably 0 to 10 mg / 100 g Natto odor desensitized to non-sensitive natto can be produced as appropriate.
[0019]
In the latter case, that is, when genetic recombination technology is used, the leucine dehydrogenase gene and / or branched keto acid dehydrogenase gene is deleted, and a short chain is bred by breeding natto bacteria that have deactivated these enzyme activities. A natto bacterium that does not produce branched fatty acids, that is, isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid is obtained. As one of the breeding methods, the gene inactivation method (J. Bacteriol., Vol.158, p.411-418 (1984)) using the homologous recombination capability developed by Stahl et al. In Bacillus subtilis is used for Bacillus natto. A modified method is used.
[0020]
It is the first time that the present inventors have proved that this method is also effective for Bacillus natto. The advantage of this method is that it is possible to specifically delete only the targeted gene. Therefore, in industrially used microorganisms such as Bacillus natto, other excellent characteristics are not destroyed, It can be improved by causing mutations only in the genes involved in the properties. In addition, since this method can finally remove the heterologous gene introduced into Bacillus natto for the purpose of gene disruption for breeding, the heterologous protein is never expressed at all. The bacterium that has been bred does not become a genetically modified bacterium, and has an important advantage particularly when used as a food.
[0021]
In addition, in order to use such a genetic recombination method in Bacillus natto, a transformation system for gene introduction into Bacillus natto is required. The present inventors have introduced Bacillus natto with improved transformation ability. It is also possible to develop a practical level transformation system for Bacillus natto, using this transformation system to efficiently introduce a plasmid vector into Bacillus natto, Was able to breed.
In addition, as one of the gene recombination systems of Bacillus natto, there is a transduction method using a phage vector described in Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63., p. 4087-4089 (1997). This method is also used in the present invention.
[0022]
In the present invention, the Bacillus natto in which at least one of the ability to produce at least one of the short-chain branched fatty acids, that is, isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid is reduced or eliminated is used. The use of the short chain branched fatty acid non-producing Bacillus natto produced in this way by at least one method selected from nature separation, mutation treatment, gene recombination technology, etc. has been carried out in the past. There is no limit. In this way, when comparing natto produced using natto bacteria that does not produce short-chain branched fatty acids and natto using conventional natto bacteria that were conventionally used, it was produced using natto bacteria that did not produce short-chain branched fatty acids. It is confirmed that natto contains almost no short-chain branched fatty acid and has almost no so-called stuffy odor.
[0023]
In addition, by mixing the above-mentioned natto bacteria in which the ability to produce short-chain branched fatty acids has been reduced or eliminated with normal natto bacteria in an appropriate ratio to ferment natto, or as described above, By fermenting natto using natto bacteria that has been adjusted for the degree of decrease in the ability to produce short-chain branched fatty acids by controlling the mutation, the content of short-chain branched fatty acids, the causative agent of natto, can also be reduced. A fresh natto with a desired content of less than 20 mg, preferably 10 mg / 100 mg natto or less, and a odor-reduced natto to a sensation-free natto can be produced as appropriate.
[0024]
The short-chain branched fatty acid non-producing Bacillus natto developed here is a Bacillus natto in which the leucine dehydrogenase gene and / or the branched keto acid dehydrogenase gene is deleted and these enzyme activities are almost lost. It is confirmed that natto produced using such natto bacteria is a natto with a short chain branched fatty acid, that is, isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, and a reduced odor. As a result, it became clear that the causative substances of the odor of natto were short-chain branched fatty acids such as isobutyric acid, isovaleric acid and 2-methylbutyric acid. Was first confirmed to be produced by a metabolic pathway as shown in FIG.
[0025]
Therefore, in order to develop natto bacteria in which the ability to produce short-chain branched fatty acids (at least one of isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid) has been reduced or eliminated for the purpose of producing natto with reduced or disappeared odor This indicates that the activity of one or more enzymes in the group of enzymes involved in the metabolic pathway as shown in FIG. 1 may be deactivated. In order to breed the Bacillus natto according to the present invention, not only a genetic recombination technique but also a usual mutation means may be used, or it may be separated from the natural world.
[0026]
In addition to the method of producing natto using natto bacteria in which the ability to produce these short-chain branched fatty acids has been reduced or eliminated, the short chain can be prepared by variously adjusting the fermentation conditions in the production of natto using ordinary natto bacteria. Even if the production of branched fatty acids is suppressed or the fermentation of normal natto is completed, natto is treated by physical means such as suction-adsorption, etc. By reducing or eliminating the content of chain-branched fatty acids, it is possible to produce a stuffy odor desensitized or stuffy smell-insensitive natto with reduced or no stuffy odor.
[0027]
Furthermore, the content of the short-chain branched fatty acid in natto may be less than 20 mg, more preferably 10 mg / 100 g or less, and using the Bacillus natto in which the production ability of the short-chain branched fatty acid is reduced or eliminated, Alternatively, it can be produced by improving fermentation conditions or treating natto with physical means.
[0028]
【Example】
Examples of the present invention using gene recombination technology and mutation treatment are shown below, respectively.
[0029]
[Example 1]
(1) Strain used
The Bacillus natto O-2 strain is Bacillus natto isolated from commercial natto by a conventional method. The Bacillus natto r22 strain is a mutant strain having enhanced transformation ability of the O-2 strain, and was obtained by subjecting the O-2 strain to chemical mutation treatment using nitrosoguanidine (NTG) as described later.
E. coli BMH71-18mutS, Bacillus subtilis vector pHY300PLK and E. coli vector pHSG399 were purchased from Takara Shuzo.
The culture medium is natto test method (Koji) p. The broth medium, spore formation medium, NP regeneration medium, etc. described in 85-97 (1990) were used. However, when necessary, tetracycline (2 μg / ml) and short-chain branched fatty acids (isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, isobutyric acid, 0.1 mM each) were added.
[0030]
The Bacillus natto r22 strain was obtained by the following method. That is, commercially available natto isolate O-2 strain was subjected to NTG mutation treatment (NTG concentration 160 μg / ml, 30 ° C./1 hr, survival rate 7.3%) according to a conventional method. The resulting mutation-treated bacteria (5 × 10⁶Were transformed with the Bacillus subtilis vector pHY300PLK by the protoplast method according to the method of Bacillus subtilis described in Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111 (1979). In this case, the protoplast regeneration medium after transformation was NP regeneration medium, and several tens of transformants were obtained using tetracycline resistance as an index. These strains were expected to have improved transformation ability compared to the parent strain O-2, but these strains were introduced with the vector pHY300PLK, which was used for transformation. It was necessary to remove the vector pHY300PLK.
[0031]
The removal of the vector pHY300PLK was found in the practice of the present invention and utilized in the practice of the present invention, when the Bacillus natto O-2 strain formed spores. Therefore, 30 of these transformants were selected and cultured in a sporulation medium to form spores. Thereafter, after culturing each of 16 spores obtained from each transformant, the presence or absence of retention of the vector pHY300PLK was examined. As a result, it was confirmed that the vector pHY300PLK was successfully removed from 21 of the 30 strains.
[0032]
Further, for the 21 vector-removed strains obtained, protoplasts were prepared, transformed again with the vector pHY300PLK, and compared with the parent strain O-2 to see if the transformation ability was improved. Confirmed that it has improved. Furthermore, as a result of conducting a natto production test by a conventional method for these 15 strains and comparing the fermentability and quality evaluation, only 4 strains were able to produce natto in appearance. Furthermore, 2 of these 4 strains could only produce bad quality natto odors and strong unpleasant odors such as sulfur odor, and one strain had extremely poor stringing. Only one remaining strain (named r22 strain) was evaluated as a result of evaluation by 9 panelists (A to I), but its quality was slightly inferior to that of natto produced using the parent strain O-2. We were able to manufacture a quality product.
[0033]
Tables 1 and 2 show the quality evaluation results comparing natto produced with the r22 strain with natto produced with the parent strain O-2, and Table 3 shows the results of comparing the transformation ability of the r22 strain with the parent strain O-2. It was shown to. In Tables 1 and 2, the evaluation points are shown as the results of a five-step evaluation with the control (manufactured by O-2 strain) as 3. However, the overall evaluation was shown as the result of ± 5 grade evaluation with the control (manufactured by O-2 strain) as 0.
[0034]

[0035]

[0036]
[Table 3]
(Comparison of transformation ability)
Bacterial strain Transformation efficiency (/ μg DNA)
O-2 stock <0.01
r22 stock 300
(Note) Transformed with pH300PLK adjusted with E. coli
[0037]
(2) Isolation of leucine dehydrogenase gene-deficient strain
The leucine dehydrogenase gene-deficient strain was isolated by removing the approximately 0.24 kb EcoRV fragment inside the leucine dehydrogenase gene (yqiT) by the following method.
[0038]
i) Vector construction (Figs. 2 and 3)
Based on the base sequence of pHY300PLK described in Jpn. J. Genet. Vol. 61, p.515-528, 5′-AAAAGAATTCCCTGTTAAAAAAAAG-3 ′ shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 and 5 Two oligo DNAs, '-AAAAGAATTCTATTATTGCAATGTGGT-3', were prepared, PCR was performed using pHY300PLK as a template, and the full length of tetracycline resistance gene on pHY300PLK was amplified. Was introduced. The obtained DNA fragment was cleaved with the restriction enzyme EcoRI and then introduced into the EcoRI site of plasmid pHSG399 to obtain plasmid pHSG399T. (Figure 3)
[0039]
Based on the nucleotide sequence of the leucine dehydrogenase gene of Bacillus subtilis registered in the amino acid sequence database SWISS-PLOT (registration number P54531), 5′-GCCGGATCCATGAGAACTTTTTAAATADAT-3 ′ and 5 ′ shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 -Synthesize two types of oligo DNA, GCCGGATCCTTAACGTCCTGCTTAATACAC-3 ', perform PCR under normal conditions using the total DNA of O-2 strain as a template, and amplify the full length of open reading frame (1095 bases) of leucine dehydrogenase gene A recognition site for the restriction enzyme BamHI was introduced at both ends. The obtained fragment was introduced into the BamHI site of pHSG399 to obtain pHSG399yqiT. (Figure 2)
[0040]
pHSG399yqiT was cleaved with the restriction enzyme EcoRV and then subjected to agarose electrophoresis. Of the two bands produced, the longer band (about 3.1 kb) was recovered from agarose, self-ligated, and transformed into E. coli to transform about 0. 0 of the leucine dehydrogenase gene on pHSG399yqiT. Plasmid pHSG399yqiTΔEcoRV from which the 24 kb EcoRV fragment had been removed was obtained. (Figure 2)
[0041]
pHSG399yqiTΔEcoRV was cleaved with BamHI, and after electrophoresis, an approximately 0.86 kb fragment was recovered (this fragment is a leucine dehydrogenase gene from which the central 0.24 kb EcoRV fragment has been removed) and introduced into the BamHI site of pHSG399T. The obtained plasmid was named pHSG399TyqiTΔEcoRV and used for the following experiment. (Figure 3)
[0042]
ii) Transformation (Figs. 4 and 5)
Plasmid pHSG399TyqiTΔEcoRV was prepared using E. coli BMH71-18mutS as a host. Since this Escherichia coli is a recA + strain, a dimer of pHSG399TyqiTΔEcoRV can be obtained. Using the obtained dimer, Bacillus natto r22 strain was transformed by a protoplast method as usual. Transformants were selected using tetracycline resistance as an index. In the resulting transformant, homologous recombination occurs one or more times between the leucine dehydrogenase gene on the chromosome and the leucine dehydrogenase gene on pHSG399TyqiTΔEcoRV, and pHSG399TyqiTΔEcoRV is incorporated into the leucine dehydrogenase gene on the chromosome. Yes.
[0043]
Total DNA was prepared from a plurality of transformants, and PCR was performed using the synthetic DNA used for amplification of the leucine dehydrogenase gene. The pattern of the amplified fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis, and it was confirmed how many times recombination occurred in each transformant. Then, a strain in which recombination occurred twice was selected and named yqiT7 strain. (Fig. 5)
[0044]
iii) Transduction (Figure 5)
Since the parent strain O-2 is more capable of producing high quality natto than the r22 strain used for the above transformation, pHSG399TyqiTΔEcoRV inserted on yqiT7 is applied to Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63, p. 4087-4089 (1997), and introduced into strain O-2 by transduction using Bacillus natto phage φBN100. The resulting transduced strain was designated as yqiTt1 strain.
[0045]
iv) Selection of strains to be eliminated (Figure 5)
The pHSG399 TyqiTΔEcoRV insertion on the yqiTt1 strain is lost when homologous recombination occurs on the chromosome. As a result, the 0.24 kb EcoRV fragment on the leucine dehydrogenase gene is lost in the dropped strain, and a leucine dehydrogenase gene-deficient strain can be obtained. The strain eliminated by homologous recombination can be obtained with a probability of about 0.1% by performing liquid culture for about 10 generations on a nutrient medium not containing tetracycline. The obtained strain was named Bacillus subtillis B2 (hereinafter referred to as B2 strain) and subjected to the following experiment. This strain was deposited as FERM BP-6605 at the National Institute of Biotechnology, National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0046]
v) Enzymatic activity of leucine dehydrogenase
The Bacillus natto O-2 and B2 strains were cultured with shaking at 37 ° C. in a Sakaguchi flask containing 100 ml of a broth medium (each containing 0.1 mM isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid). At the time when the bacteria grew to the early stationary phase (OD660 is about 1), the cells were collected, suspended in 10 mM phosphate buffer (pH 7.2, containing 0.002% β-mercaptoethanol), and then put into a French press. The cells were crushed. The cell disruption solution was centrifuged at 3.5 krpm for 15 minutes, and the supernatant was used as a crude enzyme solution.
[0047]
Enzyme activity was measured according to the method described in J. Ferment. Bioeng., Vol.69, p.199-203 (1990). Table 4 shows the results.
[0048]
[Table 4]
(Enzyme activity of leucine dehydrogenase)
Bacterial strain Enzyme activity (U / mg protein)
O-2 stock 0.020
B2 strain not detected
[0049]
In the O-2 strain, the activity was detected, whereas in the B2 strain, the activity was not detected, and it was confirmed that the B2 strain was a leucine dehydrogenase inactivated strain.
[0050]
vi) Confirmation of short-chain branched fatty acid requirements
When leucine dehydrogenase is inactivated, it becomes impossible to synthesize branched fatty acids from branched amino acids (leucine, isoleucine, valine). Therefore, short-chain branched fatty acids are required for growth on a minimal medium (J. Biol. Chem). , Vol.246, 5264-5272 (1971)).
[0051]
For the O-2 and B2 strains, a minimum medium containing short-chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, 0.1 mM each) is included to determine whether short-chain branched fatty acids are required for growth. Not confirmed on minimal medium. In addition, since the O-2 strain requires glutamic acid for growth, 10 mg / l sodium glutamate was added to the minimal medium. The O-2 strain grew regardless of the presence or absence of short-chain branched fatty acids, whereas the B2 strain was any one of the three short-chain branched fatty acids, isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid. It grew only on the medium supplemented with the above. This result confirmed that the B2 strain was a short-chain branched fatty acid-requiring strain that lost its ability to synthesize short-chain branched fatty acids.
[0052]
vii) Natto Production 1 (Sensory Test, Short-Chain Branched Fatty Acid Analysis 1)
Using the B2 strain, natto was produced according to a conventional method, and the content of short-chain branched fatty acids in natto was measured as follows. As a control, commercially available Miyagino natto bacteria was used.
[0053]
About 20 g of the prototype natto specimen was pulverized with a blender. Four times the amount of distilled water was added to about 2 g of the pulverized natto to fully disperse the natto, and then left at 4 ° C. for about 2 hours to elute the short-chain branched fatty acid. It was transferred to a 1.5 ml test tube and centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. The obtained supernatant was filtered through a 0.20 μm cellulose acetate filter and subjected to analysis of short chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid) by HPLC. Since isovaleric acid and 2-methylbutyric acid have overlapping peaks, the sum of both substances was calculated as isovaleric acid. The results are shown in Table 5.
[0054]
[Table 5]
(Quantification of short-chain branched fatty acids)
Fermentation strain Isovaleric acid * Isobutyric acid
Miyagino fungus 79.6mg / 100g natto 72.6mg / 100g natto
B2 stock 0.3mg / 100g natto 0.4mg / 100g natto
*: Contains 2-methylbutyric acid
[0055]
Natto produced using the B2 strain contained almost no short-chain branched fatty acids. The quality of the natto produced using the B2 strain was the same as the control prepared using the Miyagino natto bacteria, as a result of a sensory test by a specialized panelist, in terms of appearance, stringiness, and taste. As for the scent, the unique odor was suppressed.
[0056]
viii) Natto production 2 (Sensory test 2)
Add the necessary amount of lower branched fatty acid to natto prepared according to the conventional method using B2 strain so that the total lower branched fatty acid content will be 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150 mg / 100g natto, respectively. The natto samples with various lower branched fatty acid concentrations were prepared by thoroughly stirring with chopsticks. In addition, the structure of the lower branched fatty acid was set to isobutyric acid: 2-methylbutyric acid: isovaleric acid = 1.6: 1.4: 1. A natto sample in which no lower branched fatty acid was present was also prepared.
[0057]
The thus prepared natto samples containing various concentrations of lower branched fatty acids were subjected to a sensory test by a specialized panelist to test for the presence of a stuffy odor. The results obtained are shown in Table 6. As is clear from the results, it was found that a stuffy odor was felt when the concentration of all short-chain branched fatty acids in 100 g natto was 20 mg or more. Therefore, the odor desensitization or odor-insensitive natto characterized by having a reduced odor or no odor according to the present invention is less than 20 mg / 100 g natto in the presence of all short chain branched fatty acids in natto. It was found that 10 mg / 100 g natto or less was particularly preferable.
[0058]

[0059]
[Example 2]
(1) Strain used
The Bacillus natto O-2 strain, the r22 strain, Escherichia coli BMH71-18mutS, the Bacillus subtilis vector pHY300PLK, the Escherichia coli vector pHSG399, and the medium were the same as in Example 1.
[0060]
(2) Isolation of a branched keto acid dehydrogenase gene deficient strain
The branched keto acid dehydrogenase gene-deficient strain was isolated by removing the approximately 0.53 kb Cfr10I fragment within the E2 subunit gene (odb2) on the branched keto acid dehydrogenase operon by the following method.
[0061]
i) Vector construction (Figure 6)
Based on the nucleotide sequence of the E2 subunit gene (odb2) on the branched keto acid dehydrogenase operon of Bacillus subtilis reported in Eur. J. Biochem., Vol.213, p.1091-1099 (1993) 5'-GCCGGATCCATGGCAATTGAACAAAATGAC-3 'and 5'-GCCGGATCCTTAGTAAACAGAGTGTCTCT-3' shown in 5 and 6 were synthesized, and PCR was performed under the usual conditions using the whole DNA of O-2 strain as a template. This was performed to amplify the full length (1275 bases) of the open reading frame of the E2 subunit of the branched keto acid dehydrogenase, and introduce restriction enzyme BamHI recognition sites at both ends. The obtained fragment was introduced into the BamHI site of pHSG399 to obtain pHSG399odb2.
[0062]
pHSG399odb2 was cleaved with the restriction enzyme Cfr10I and then subjected to agarose electrophoresis. Of the two bands generated, the longer band (about 3.0 kb) is recovered from agarose, self-ligated, and transformed into E. coli to give about 0 which is present in the approximate center of the E2 subunit gene on pHSG399odb2. The plasmid pHSG399odb2ΔCfr10I from which the .53 kb Cfr10I fragment had been removed was obtained.
[0063]
pHSG399odb2ΔCfr10I was cleaved with BamHI, and after electrophoresis, an approximately 0.74 kb fragment was recovered (this fragment was the E2 subunit gene from which the central 0.53 kb Cfr10I fragment had been dropped) and introduced into the BamHI site of pHSG399T. . The obtained plasmid was designated as pHSG399Todb2ΔCfr10I and used for the following experiment. (Fig. 7)
[0064]
ii) Transformation (Figure 8)
Plasmid pHSG399Todb2ΔCfr10I was prepared using E. coli JM109 as a host. Using the resulting plasmid, the Bacillus natto r22 strain was transformed by the protoplast method as usual. Transformants were selected using tetracycline resistance as an index. In the obtained transformant, homologous recombination occurs once between the E2 subunit gene on the chromosome and the E2 subunit gene on pHSG399Todb2ΔCfr10I, and pHSG399Todb2ΔCfr10I is integrated into the E2 subunit gene on the chromosome.
[0065]
Total DNA was prepared from a plurality of transformants, and PCR was performed using the synthetic DNA used for amplification of the E2 subunit gene and commercially available primers M4 and RV for M13. By analyzing the pattern of the amplified fragment by agarose gel electrophoresis, whether recombination is occurring upstream (5 ′ end side) of the Cfr10I site on the E2 subunit gene or downstream (3 ′ end side). It was confirmed whether recombination occurred. One strain that had undergone recombination downstream of the Cfr10I site of the E2 subunit gene was selected and designated as odb2-1 strain.
[0066]
iii) Transduction (Figure 8)
Since the parent strain O-2 is more capable of producing high quality natto than the r22 strain used in the above transformation, pHSG399Todb2ΔCfr10I inserted on the gene of the odb2-1 strain is applied to Appl. Environ Microbiol., Vol. 63, p. 4087-4089 (1997), and introduced into the O-2 strain by transduction using Bacillus natto phage φBN100. The resulting transduced strain was named odb2t1 strain.
[0067]
iv) Selection of occluded strains (Figure 8)
The pHSG399Todb2ΔCfr10I insertion on the odb2t1 strain is lost when homologous recombination occurs between the Cfr10I site from the 5 ′ end of the E2 subunit gene overlapping on the chromosome. As a result, in the lost strain, the 0.53 kb Cfr10I fragment on the E2 subunit gene is lost, and the E2 subunit gene-deficient strain can be obtained. Dropped strains by homologous recombination can be obtained with a probability of about 0.1% by liquid culture for about 10 generations in a nutrient medium not containing tetracycline. The obtained strain was named Bacillus subtilis B5 (hereinafter referred to as B5 strain) and subjected to the following experiment. This strain was deposited as FERM BP-6606 at the National Institute of Biotechnology, National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0068]
v) Confirmation of short-chain branched fatty acid requirements
When a branched keto acid dehydrogenase is lost, it becomes impossible to synthesize branched fatty acids from branched amino acids (leucine, isoleucine, valine), and thus short-chain branched fatty acids are required for growth on a minimal medium (J. Biol Chem., Vol. 246, p. 5264-5272 (1971)). For the O-2 and B5 strains, a minimum medium containing short-chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, 0.1 mM each) is included to determine whether short-chain branched fatty acids are required for growth. Not confirmed on minimal medium. In addition, since the O-2 strain requires glutamic acid for growth, 10 mg / l sodium glutamate was added to the minimal medium.
[0069]
The O-2 strain grew regardless of the presence or absence of short-chain branched fatty acids, whereas the B5 strain was any one of the three short-chain branched fatty acids of isobutyric acid, isovaleric acid, and 2-methylbutyric acid. Grows only on medium supplemented with one or more. This result confirmed that the B5 strain was a short-chain branched fatty acid-requiring strain that lost its ability to synthesize short-chain branched fatty acids.
[0070]
vi) Natto production (sensory test, analysis of short-chain branched fatty acids)
Using the B5 strain, natto was produced according to a conventional method, and the content of short-chain branched fatty acids in natto was measured as follows. As a control, commercially available Miyagino natto bacteria was used.
[0071]
About 20 g of the prototype natto specimen was pulverized with a blender. Four times the amount of distilled water was added to about 2 g of the pulverized natto to fully disperse the natto, and then left at 4 ° C. for about 2 hours to elute the short-chain branched fatty acid. It was transferred to a 1.5 ml test tube and centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. The obtained supernatant was filtered through a 0.20 μm cellulose acetate filter and subjected to analysis of short chain branched fatty acids (isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, isobutyric acid) by HPLC.
[0072]
Since isovaleric acid and 2-methylbutyric acid have overlapping peaks, the sum of both substances was calculated using isovaleric acid as a standard. The results are shown in Table 7.
[0073]
[Table 7]
(Quantification of short-chain branched fatty acids)
Fermentation strain Isovaleric acid * Isobutyric acid
Miyagino fungus 79.6mg / 100g natto 72.6mg / 100g natto
B5 strain 1.5mg / 100g natto 3.1mg / 100g natto
* Contains 2-methylbutyric acid
[0074]
The natto produced using the B5 strain contained almost no short-chain branched fatty acids.
The quality of the natto produced using the B5 strain was the same as the control produced using the natto bacterium in Miyagino, as a result of sensory inspection by a specialized panelist, appearance, stringing strength, and taste. As for the scent, the unique odor was suppressed.
[0075]
[Example 3]
(1) Strain used
The Bacillus natto O-2 strain and the medium were the same as in Example 1.
[0076]
(2) Isolation of leucine dehydrogenase gene-deficient strain
The leucine dehydrogenase gene-deficient strain was isolated by the following method by mutating the leucine dehydrogenase gene by the NTG mutation treatment method.
[0077]
i) Acquisition of mutants requiring short-chain branched fatty acids
The Bacillus natto O-2 strain was selected as a parent strain, and the O-2 strain was subjected to NTG mutation treatment (NTG concentration 80 μg / ml, 30 ° C./1 hr, survival rate 2.0%) according to a conventional method. Thereafter, colonies were formed in a broth medium containing short-chain branched fatty acids (containing 0.1 mM each of isobutyric acid, isovaleric acid and 2-methylbutyric acid), and 18,896 of the mutation-treated bacteria obtained as a result. The strains were replicated against two mediums: a minimal medium and a minimal medium containing short-chain branched fatty acids (isobutyric acid, isovaleric acid and 2-methylbutyric acid each contained at a concentration of 0.1 mM). And after culture | cultivating (30 degreeC, 16 hours) with these two types of culture media, 115 short-chain branched fatty acid requirement mutants which grow only on the minimum culture medium containing a short-chain branched fatty acid were selected.
[0078]
ii) Measurement of leucine dehydrogenase activity
The 115 short-chain branched fatty acid auxotrophic mutants obtained were tested for natto productivity in the same manner as in Example 1, and of these 32 strains having natto productivity, Example 1 The leucine dehydrogenase activity was measured by the same method. As a result, 3 strains (named N46 strain, N64 strain and N103 strain, respectively) in which leucine dehydrogenase activity was not detected at all, and 1 strain (N79 strain and N79 strain) in which leucine dehydrogenase activity was greatly reduced compared to the parent strain O-2 strain, respectively. Naming) was confirmed. Of the strains isolated and bred in this way, the N46 strain was named Bacillus subtilis N46 and deposited as FERM BP-6871 at the National Institute for Biotechnology, National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. The measurement results of leucine dehydrogenase activity are shown in Table 8.
[0079]
[Table 8]
(Enzyme activity of leucine dehydrogenase)
Bacterial strain Enzyme activity (U / mg protein)
O-2 strain 0.052
N46 strain not detected
N64 strain not detected
N79 stock 0.007
N103 strain not detected
(Note) Detection limit: About 0.002 U / mg protein
[0080]
(3) Natto production (short-chain branched fatty acid analysis)
Using the N46 strain, N64 strain, N103 strain and N79 strain, natto was produced according to a conventional method, and the content of short-chain branched fatty acids in natto was measured. As a control, the parent strain O-2 was used. The method for measuring the short-chain branched fatty acid is the same as in Example 1. In addition, since the peak in HPLC of isovaleric acid and 2-methylbutyric acid overlapped, the sum total of both substances was calculated as isovaleric acid. The results are shown in Table 9.
[0081]
[Table 9](Quantification of short-chain branched fatty acids)
Fermentation strain Isovaleric acid * Isobutyric acid
O-2 stock 40.0mg / 100g natto 30.7mg / 100g natto
N46 strain not detected Not detected
N64 stock 2.0mg / 100g natto 2.0mg / 100g natto
N79 strain 2.9mg / 100g natto 4.8mg / 100g natto
N103 stock 0.6mg / 100g natto 0.4mg / 100g natto

*: Contains 2-methylbutyric acid (Note) Detection limit: about 0.5mg / 100g natto
[0082]
Natto produced using the N46, N64, N79 and N103 strains contained almost no short-chain branched fatty acids. The quality of natto produced using the N46, N64, N79 and N103 strains was determined using the parent strain O-2 in terms of appearance, stringiness, and taste as a result of a sensory test by a specialized panelist. As for the fragrance, the unique stuffy odor was suppressed.
[0083]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a method for breeding and developing a natto bacterium that does not produce a short-chain branched fatty acid that is a causative substance of stuffy odor, which is one of the unpleasant odors of natto, and is developed by that method. By producing natto using non-short chain branched fatty acid producing natto, the content of short chain branched fatty acid is less than 20 mg in 100 g natto and the content of short chain branched fatty acid is very low. In addition, it has succeeded in creating a completely new type of natto that has a very low short-chain branched fatty acid content of 10 mg or less in 100 g natto and has little or no stuffy odor. .
[0084]
Further, according to the present invention, it is possible to screen and breed stuffy odor desensitized to non-sensitive natto producing bacteria using short-chain branched fatty acids and / or leucine (branched keto acid) dehydrogenase as an index. In addition to replacement technology, it becomes possible to efficiently screen the desired natto bacteria from natural natto bacteria and mutated natto bacteria, and to easily obtain excellent odor reduction and non-sensitive natto Can do.
[0085]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a synthetic pathway for short-chain branched fatty acids in Bacillus natto.
FIG. 2 shows an outline (1) of a vector construction process for obtaining a leucine dehydrogenase-deficient mutant.
FIG. 3 shows an outline (2) of a vector construction process for obtaining a leucine dehydrogenase-deficient mutant.
FIG. 4 shows an outline (1) of the construction process of a dropout strain for obtaining a leucine dehydrogenase-deficient mutant.
FIG. 5 shows an outline (2) of the construction process of a dropped strain for obtaining a leucine dehydrogenase-deficient mutant.
FIG. 6 shows an outline (1) of a vector construction process for obtaining a branched keto acid dehydrogenase-deficient mutant.
FIG. 7 shows an outline (2) of a vector construction process for obtaining a branched keto acid dehydrogenase-deficient mutant.
FIG. 8 shows an outline of a process for constructing a dropped strain for obtaining a branched keto acid dehydrogenase-deficient mutant.

Claims

A natto strain producing odorless sensation-free natto having no odor of odor, characterized in that the enzyme activity of leucine dehydrogenase is reduced or inactivated by mutation treatment.

Bacillus subtilis N46 (FERM BP-6871), characterized in that the Bacillus subtilis O-2 strain was used as a parent strain and the enzyme activity of leucine dehydrogenase was inactivated by mutation treatment.