JP3786462B2

JP3786462B2 - Glycosylated derivatives of taxoid and method for producing the same

Info

Publication number: JP3786462B2
Application number: JP07812796A
Authority: JP
Inventors: 浩司原; 克彦三国; 耕三原; 忠勝萬代; 寛奥本; 博喜浜田
Original assignee: Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Current assignee: Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2006-06-14
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: JPH09241293A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタキソイドの配糖化誘導体およびその製造方法に関し、詳しくは糖供与体由来の糖を糖転移酵素によりタキソイド誘導体に結合させたタキソイドの配糖化誘導体およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
パクリタクセル(Paclitaxel)は、北米産イチイ（Taxus brevifolia) の樹皮から単離されたジテルペン化合物 [M.C.Wani et al.: J.Am.Chem.Soc.,93,2325(1971)]で、従来の化学療法では治癒しない癌に対しても改善効果を持つ強力な抗癌剤として知られている。このパクリタクセルが癌を抑制するメカニズムは特異的であり、他の多くの抗癌剤が有糸分裂装置である紡錘体の主成分の微小管の形成を抑えるのに対し、パクリタクセルは微小管の過剰形成を引き起こして有糸分裂を抑制するものである。
【０００３】
このように、パクリタクセルは有力な抗癌剤であるが、水に対する溶解性が低いため、実際の治療薬としての利用が限られるという課題がある。そのため、従来より可溶化剤の使用や誘導体として溶解性を高めるための研究開発等が活発に行われてるが、未だ十分な解決策は見出されていない。例えば、現在パクリタクセルは可溶化剤「クレモフォア」を用いて患者に投与されているが、２週間毎に６時間かけて１Ｌ投与し、これを４クール実施するという、患者に大きな負担を与えるもの[Eric K.Rowinsky et al.: CANCER RESEARCH 49, 4640 (1989)] である上に、可溶化剤の副作用が問題となっている。また、溶解性が改善されたパクリタクセルの誘導体としてタキソテア（Taxotere) が開発されたが、タキソテアの水に対する溶解度はパクリタクセルの１．３倍にすぎず[I.Ringel et al.: J.Natl.Cancer Inst.,83, 288 (1991)] 、さほど改善されてはいない。
【０００４】
パクリタクセルの溶解性を改善する方法として、パクリタクセルの側鎖や母核に様々な官能基を導入する方法があるが、それらの誘導体のうち、いくつかの化合物には溶解性の改善が認められるものの、生理活性が増強されたものは未だ報告されていない。
また、パクリタクセルの糖誘導体に関する報告はなく、天然にキシロースがエーテル結合している化合物が存在することが報告されているだけである[H.Lataste et al.: Proc.Natl.Acad.Sci. USA,81, 4090 (1984)] 。
【０００５】
本発明者らは、有効な抗癌剤として実用化することができるパクリタクセルやタキソテアの誘導体（以後、両誘導体をまとめてタキソイド誘導体と略記することがある。）の開発に携わっており、パクリタクセルにスペーサーを介したエステル結合により糖を種々の部位に結合した各種のパクリタクセル誘導体を化学合成している（平成８年２月２０日付け提出の特許出願、整理番号Ｐ８００７４６Ｋの明細書参照）。
該誘導体の例として、グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル、グルコシルオキシアセチル−２’−パクリタクセル、ジグルコシルオキシアセチル−２’，７−パクリタクセル、グルコシルオキシアセチル−２’−タキソテア、ジグルコシルオキシアセチル−２’，７−タキソテア等が挙げられる。これらの誘導体は、水に対する溶解性が向上しており、生理活性も損なわれていないことを見出している。
しかし、これらの誘導体は、糖の結合数や糖の結合部位の差異等により性質も異なり、水溶液中では不安定なもの、溶解性が比較的低いもの等があり、実用化には未だ改善の余地がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の事情に鑑み、溶解性と生理活性を共に向上した安定なタキソイドの配糖化誘導体を開発し、効果的な癌治療薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、溶液中での安定性を保持したままタキソイド誘導体の溶解性を高める方法を開発すべく鋭意検討した結果、糖転移酵素の作用によりタキソイド誘導体に糖供与体由来の糖を結合させたタキソイドの配糖化誘導体が、飛躍的に溶解性が向上することを見出し、しかも該誘導体が溶液中でも安定であり、生理活性を保持していることを確認した。
さらに、生体と親和性の高い糖を結合することによって、局部に薬剤を濃縮することが可能であり、例えばガラクトースやマンノースを結合したタキソイド誘導体は肝細胞に親和性があるため、肝臓に濃縮される。つまり、これらの糖類を結合したタキソイド誘導体を抗癌剤として用いれば、肝臓癌に対する薬剤のバイオアベラビリティを高めることができると考え、これらの知見に基づいて本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち本発明は、グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセルにサイクロデキストリン類由来の糖をサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの作用により結合させたタキソイドの配糖化誘導体に関し、さらにグルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセルとサイクロデキストリン類をサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で反応させ、該サイクロデキストリン類由来の糖を該グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセルに結合させることを特徴とするタキソイドの配糖化誘導体の製造方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるタキソイド誘導体としては、パクリタクセルにスペーサーを介して糖を結合させたものがあり、その具体例を以下に示す。
下記の式で表されるグルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル（以下、７−Ｓ−パクリタクセルと略す）、
【００１０】
【化１】

【００１１】
上記タキソイド誘導体はパクリタクセルにスペーサーを介して糖を結合してなるものである。
パクリタクセルは、Kingston, D.G.I.: Pharmacol. Ther., 52, 1 (1992)に記載された方法により、北米産イチイ（Taxus brevifolia) の樹皮から単離することにより得られる他、化学合成されたもの（R.A.Holton : Europian Patent-A 400971, 1990)なども用いられる。
【００１２】
パクリタクセルにスペーサーを介して糖を結合する反応は、テトラベンジル酢酸オキシグルコシドを用いて行われる。このテトラベンジル酢酸オキシグルコシドは、グルコースを出発物質として常法により得られるテトラベンジルグルコースにスペーサーとしてエチルグリコレートなどのグリコレートを結合させてエステル化合物とした後、脱エチル化してカルボン酸化合物としたもので、下記の式で表される。
【００１３】
【化２】

【００１４】
次に、テトラベンジル酢酸オキシグルコシドの製造法の１例を以下に示す。
【００１５】
【数１】

【００１６】
常法により得られたテトラベンジルグルコース（１）にエチルグリコレートをｐ−トルエンスルホン酸と共にベンゼン中で０〜１５０℃、好ましくは１１０℃にて０．５〜５０時間、好ましくは８時間反応させてエチルグリコレートを１位に結合させ、エチルエステル（化合物（２）、分子量６２６．７６）を得る。この後、該化合物（２）をアルカリ（例えば６ＮＮａＯＨ）メタノール−ジオキサン溶液中で室温〜１００℃にて０．５〜５０時間、好ましくは３時間処理した後、塩酸（例えば１ＮＨＣｌ）酸性に移して脱エチル化することにより、対応するカルボン酸化合物（３）を得る。この物質が、テトラベンジル酢酸オキシグルコシドである。
なお、グルコースの代わりに他の糖類を用いた場合も同様の反応によって、糖の種類の異なった、対応する糖修飾体を得ることができる。この場合に使用される糖類としては、例えばグルコースの他に、アロース，アルトロース，マンノース，グロース，イドース，ガラクトース，タロース，リボース，アラビノース，キシロース，リキソース，プシコース，フルクトース，ソルボース，タガトース，フコース，マルトース等がある。
【００１７】
スペーサーとしては、エチルグリコレートなどのグリコレートの他に、アルキル鎖長を変えたものを使用することができ、例えば３−ヒドロキシ酪酸等が用いられる。
本発明に用いるタキソイド誘導体は、上述のパクリタクセルとテトラベンジル酢酸オキシグルコシドを反応させることにより得られ、その具体例としては、下記の反応工程（ II ）に示した方法がある。
【００１８】
下記の反応工程（II）に示した方法は、パクリタクセルの２’位をクロロトリエチルシリル基を用いて保護した後にテトラベンジル酢酸オキシグルコシドと反応させ、その後、脱ベンジル化および脱トリエチルシリル化してパクリタクセル誘導体を製造するものである。
【００１９】
【数２】

【００２０】
まず、パクリタクセル（４）とクロロトリエチルシラン（ＴＥＳＣｌ）等の保護剤、イミダゾール等の塩基、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶剤をアルゴン下、室温で０．５〜５０時間、好ましくは１９．５時間反応してパクリタクセルの２’位をトリエチルシランで保護し、化合物（９）を得る。
次に、得られた化合物とテトラベンジル酢酸オキシグルコシド（３）、ＤＭＡＰ等の塩基、ＤＣＣ等の縮合剤、塩化メチレン等の溶剤をアルゴン下、室温で０．５〜１００時間、好ましくは５時間反応し、配糖体化した化合物（１０）を得る。
その後、化合物（１０）を、パラジウムブラック等の触媒、酢酸等の酸と共に水素下、室温で激しく攪拌しながら０．５〜５０時間、好ましくは５時間反応させ、さらにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の溶剤と水を加え、室温で０．５〜５０時間、好ましくは１５時間反応させて目的とする化合物（１１）を得る。この化合物（１１）が前記式で表される７−Ｓ−パクリタクセルである。
【００２１】
得られたタキソイド誘導体は、ＯＤＳなどのシリカゲルを母体とする担体を用いた液体クロマトグラフィーを適用することにより、容易にアノマーを分離することができ、精製標品が得られる。
【００２２】
次に、本発明に用いる糖供与体としては、サイクロデキストリン類が挙げられる。サイクロデキストリン類としては、α−サイクロデキストリン，β−サイクロデキストリン，γ−サイクロデキストリンおよびそれらの誘導体が挙げられ、特にγ−サイクロデキストリンが好ましい。
糖供与体由来の糖とは、糖供与体からタキソイド誘導体に転移するものを意味し、上記した糖類が該当する。
【００２３】
本発明に用いる糖転移酵素は、上記のタキソイド誘導体と糖供与体を含有する溶液に作用させたとき、該糖供与体からグルコシル基，フルクトシル基，ガラクトシル基，マンノシル基，マルトシル基，マルトオリゴ糖単位等をタキソイド誘導体に結合させる糖転移反応を行い、タキソイドの配糖化誘導体を製造することができるものを意味し、具体的にはサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが挙げられる。
これらの糖転移酵素は自然界に広く分布しており、植物，動物，微生物等に由来するものがあり、本発明には市販品を含め任意の酵素が使用できる。
【００２４】
本発明のタキソイド配糖化誘導体の製造法を以下に例示する。
まず、糖供与体を水，エタノール，アセトニトリルなどの溶媒に溶解して糖供与体溶液を調製するが、該溶液中の糖供与体濃度は５〜８０％、好ましくは１０〜５０％が適当である。
また、タキソイド誘導体に対する糖供与体の比率は、使用する糖供与体の種類等によって異なるが、通常は０．５〜５０倍、好ましくは１〜２０倍の範囲が望ましい。
次に、該糖供与体溶液にタキソイド誘導体を溶解する。この場合、タキソイド誘導体は溶液中の濃度が０．１〜５０％、好ましくは０．５〜３０％となるように加えるのが一般的である。
【００２５】
次に、上記の溶液に糖転移酵素を加えて反応を行う。酵素の使用量は特に限定されないが、通常は反応が０．５〜１００時間、好ましくは１〜５０時間で終了するような酵素量とすればよい。その他の反応条件は、用いる酵素により適宜設定すればよい。例えばサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いる場合は、ｐＨ４〜８、好ましくは５．５〜７で２０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃で行う。
上記反応において、糖転移部位は様々であり、グルコシル基の２位、３位、４位および６位の任意の位置に転移する。
【００２６】
次いで、常法により酵素を失活させた後、反応生成物から目的とする配糖化誘導体を採取する。この方法は、通常の分離、精製手段を適用すればよい。最も一般的な方法は、反応生成物を固液分離して得た上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて分画、精製してタキソイドの配糖化誘導体を分取する方法である。
【００２７】
本発明によれば、目的とするタキソイド配糖化誘導体は通常５〜７０％程度の収率で得ることができる。本発明のタキソイド配糖化誘導体は、水溶液中での安定性や溶解度が向上しており、本来の生理活性も保持している。
【００２８】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
製造例１
常法により得られたテトラベンジルグルコース（１）１．６２ｇ、エチルグリコレート１．５６ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸０．１０ｇ、ベンゼン８０ｍｌを１１０℃でリフラックスさせながら８時間反応させ、化合物（２）（C₃₈H₄₂O₈, 分子量６２６．７４）を得た。
次いで、この化合物１．８８ｇを６ＮＮａＯＨ１０ｍｌ、メタノール１０ｍｌ、ジオキサン１５ｍｌと共に室温〜１００℃で３時間反応させた後、１ＮＨＣｌ８０ｍｌ中に移して脱エチル化することにより、化合物（３）、すなわちカルボン酸化合物（C₃₆H₃₈O₈, 分子量５９８．６９）を得た。
上記の化合物（３）を重クロロホルムに溶解し、¹H-NMRで解析し、それぞれのピークを帰属して構造を決定し、前記の構造式で表されるものであることを確認した。
【００２９】
製造例２
パクリタクセル（４）４２７ｍｇ, クロロトリエチルシラン（ＴＥＳＣｌ）０．１ｍｇ、イミダゾール１０２ｍｇおよびＤＭＦ５ｍｌをアルゴン下、室温で１９．５時間反応し、パクリタクセルの２’位をトリエチルシリル基で保護した化合物（９）（C₅₃H₆₅NO₁₄Si, 分子量９６８．１８）を得た。
この化合物（９）３９２ｍｇ、製造例１で得たテトラベンジル酢酸オキシグルコシド（３）４７９ｍｇ, ＤＭＡＰ９８ｍｇ、ＤＣＣ１６５ｍｇおよび塩化メチレン８ｍｌをアルゴン下、室温で５時間反応し、配糖体化した化合物（１０）（C₈₉H₁₀₁NO₂₁Si,分子量１５４８．８６）を得た。
次に、得られた化合物（１０）５１３ｍｇ、パラジウムブラック１００ｍｇおよび酢酸３ｍｌを水素下、室温で激しく攪拌しながら５時間反応した。さらに、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍｌと水１ｍｌを加え、室温で１５時間反応して７−Ｓ−パクリタクセル（１１） (C₅₅H₆₃NO₂₁, 分子量１０７４．１０）を３５０ｍｇ得た。
【００３０】
次に、シリカゲル（商品名：ＯＤＳ、ワイエムシィ社製) を充填したカラム( φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ) を用い、メタノールを移動相として、７−Ｓ−パクリタクセルをアノマー毎に精製した。また、７−Ｓ−パクリタクセルを重クロロホルムに溶解し、¹H-NMRで解析し、それぞれのピークを帰属して構造を決定し、前記の構造式で表されるものであることを確認した。
【００３１】
実施例１
γ−サイクロデキストリン（商品名：γ−ＣＤ、塩水港精糖株式会社製）２００ｍｇを５０％エタノール溶液２ｍｌおよび１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００μｌに溶解した。
このサイクロデキストリン溶液９００μｌに製造例２で調製した７−Ｓ−パクリタクセル（グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル、以下７−ＧＰと略記する。）１０ｍｇを溶解した後、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（商品名：コンチザイム、天野製薬（株）製、以下ＣＧＴａｓｅと略記する。）７０単位を加え、３７℃にて３時間反応させた。
その後、エタノール３ｍｌを加えて酵素を失活させた後、固液分離して得た上清をメンブランフィルター（０．４５μｍ）にて濾過し、濾液をＨＰＬＣにて分析した。
【００３２】
なお、ＨＰＬＣの分析条件は下記のとおりである。
カラム：MetaChem製 Taxil ５μ（４．６×２５０ｍｍ）
溶媒：MeOH/H2O（６５／３５）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器（２３０ｎｍ）
注入量：２０μｌ
【００３３】
その結果、ＣＧＴａｓｅにより７−ＧＰにマルトオリゴ糖が転移した糖転移反応物（タキソイド配糖化誘導体、これは７−ＧＰを除いた配糖体であり、混合物である。）がタキソイド中６１．５％生成していた。図１にＨＰＬＣのチャートを示した。図中の＊は７−ＧＰを示し、＊＊はパクリタクセルを示す。
【００３４】
実施例２
実施例１で得られた糖転移物を液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）で解析した。なお、液体クロマトグラフィーの条件は実施例１と同様に行った。結果を図２に示す。高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで解析した。なお、マトリックスとしてグリセリンを使用した。得られた結果を第１表に示した。
【００３５】
【表１】
第１表

【００３６】
ピーク１，２のペンタグルコシル−グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル（Ｃ₈₅Ｈ₁₁₃ ＮＯ₄₆，分子量１８８４．８０，ＲＴ＝１７．５，１９．１７）の推定構造式を下記に示す。
【化３】

【００３７】
ピーク３のトリグルコシル−グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル（Ｃ₇₃Ｈ₉₃ＮＯ₃₆，分子量１５６０．５２，ＲＴ＝２２．１７）の推定構造式を下記に示す。
【化４】

【００３８】
ピーク４のジグルコシル−グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル（Ｃ₆₇Ｈ₈₃ＮＯ₃₁，分子量１３９８．３８，Ｒ＝２５．１７）の推定構造式を下記に示す。
【化５】

【００３９】
ピーク５のグルコシル−グルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル（Ｃ₆₁Ｈ₇₃ＮＯ₂₆，分子量１２３６．２４，ＲＴ＝２９．５）の推定構造式を下記に示す。
【化６】

【００４０】
ピーク６，７のグルコシルオキシアセチル−７−パクリタクセル（Ｃ₅₅Ｈ₆₃ＮＯ₂₁，分子量１０７４．１０，ＲＴ＝３４．３３，３６．８３）の構造式を下記に示す。
【化７】

【００４１】
実施例３
パクリタクセル、７−ＧＰおよび実施例１で調製した糖転移反応物をそれぞれ１０ｍｇ秤取し、各々に水５ｍｌを加えて１８時間攪拌した。攪拌終了後、上清をメンブランフィルター（０．４５μｍ) にて濾過し、濾液をＨＰＬＣにて分析した。その結果、各化合物の水に対する溶解度は第２表に示す通りであった。
【００４２】
なお、ＨＰＬＣの分析条件は下記のとおりである。
カラム：MetaChem製 Taxil ５μ（４．６×２５０ｍｍ）
溶媒：MeOH/H2O（８０／２０）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器（２３０ｎｍ）
注入量：２０μｌ
【００４３】
【表２】
第２表

【００４４】
表から明らかなように、本発明のタキソイド配糖化誘導体である糖転移反応物の溶解度は飛躍的に向上している。しかも、この糖転移反応物は水溶液中でも安定であることが認められた。
【００４５】
試験例
パクリタクセル、７−ＧＰおよび実施例１で得られた糖転移反応物をそれぞれＤＭＳＯに溶解し、反応液中の濃度がそれぞれ５μＭになるように調製した。
次に、上記の各サンプルをチューブリン（微小管の主要構成タンパク質）と混合し、３７℃で１５分間反応した。反応後２分、５分、１０分および１５分に反応溶液の３５０ｎｍの吸光度を測定した。また、反応終了後に塩化カルシウムを添加し、その５分後に再度３５０ｎｍの吸光度を測定した。各測定値から、パクリタクセルの重合促進活性および脱重合阻害活性を１００とした場合の各サンプルの相対活性を求めた。結果を第３表に示した。
【００４６】
【表３】
第３表

【００４７】
表から明らかなように、タキソイド配糖化誘導体である糖転移物は脱重合阻害活性がパクリタクセルより高いものであり、非常に有効な抗癌剤であることが確認された。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、水に対する溶解度が向上し、かつ安定性も改善されたタキソイド配糖化誘導体およびその製造法が提供される。該配糖化誘導体は、患者に投与するにあたり、患者の負担を軽減することができる上に効果的な癌治療薬としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた反応生成物のＨＰＬＣのチャートを示した図である。
【図２】実施例１で得られた反応生成物のＬＣ−ＭＳのチャートを示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a glycosylated derivative of taxoid and a method for producing the same, and more particularly to a glycosylated derivative of taxoid in which a sugar derived from a sugar donor is bound to a taxoid derivative by glycosyltransferase and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Paclitaxel is a diterpene compound [MCWani et al .: J.Am.Chem.Soc., 93,2325 (1971)] isolated from the bark of North American yew (Taxus brevifolia). Therefore, it is known as a powerful anticancer agent that has an improvement effect on cancer that has not been cured. The mechanism by which paclitaxel suppresses cancer is specific, and many other anticancer drugs suppress the formation of microtubules, the main component of the mitotic spindle, whereas paclitaxel suppresses the formation of excessive microtubules. Causes mitosis to be suppressed.
[0003]
Thus, paclitaxel is a potent anticancer agent, but has a problem that its use as an actual therapeutic agent is limited because of its low solubility in water. For this reason, research and development for increasing the solubility as a solubilizing agent or a derivative has been actively conducted, but no sufficient solution has been found yet. For example, although paclitaxel is currently administered to patients using the solubilizing agent “Cremophor”, 1 L is administered over 6 hours every 2 weeks, and this is performed 4 courses. Eric K. Rowinsky et al .: CANCER RESEARCH 49, 4640 (1989)] In addition to the side effects of solubilizers. Taxotere has also been developed as a derivative of paclitaxel with improved solubility, but its solubility in water is only 1.3 times that of paclitaxel [I. Ringel et al .: J. Natl. Cancer Inst., 83, 288 (1991)], not much improved.
[0004]
As a method for improving the solubility of paclitaxel, there is a method of introducing various functional groups into the side chain or mother nucleus of paclitaxel, but among these derivatives, some compounds have improved solubility. Nothing with enhanced physiological activity has been reported yet.
In addition, there is no report on a sugar derivative of paclitaxel, and there is only a report that there is a compound in which xylose is naturally ether-linked [H. Lataste et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81, 4090 (1984)].
[0005]
The present inventors have been involved in the development of paclitaxel and taxotere derivatives (hereinafter, both derivatives may be abbreviated as taxoid derivatives) that can be put to practical use as effective anticancer agents. Various paclitaxel derivatives in which sugars are bonded to various sites by an ester bond via a chemical compound have been chemically synthesized (see patent application filed on Feb. 20, 1996, specification No. P80046K).
Examples of the derivatives include glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel, glucosyloxyacetyl-2′-paclitaxel, diglucosyloxyacetyl-2 ′, 7-paclitaxel, glucosyloxyacetyl-2′-taxotere, diglucosyloxyacetyl-2 ', 7-taxotea and the like. It has been found that these derivatives have improved solubility in water and the physiological activity is not impaired.
However, these derivatives have different properties due to differences in the number of sugar linkages and sugar binding sites, etc., and some of them are unstable in aqueous solution and have relatively low solubility. There is room.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above circumstances, an object of the present invention is to develop a stable glycosylated derivative of taxoid with improved solubility and physiological activity, and to provide an effective cancer therapeutic agent.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to develop a method for enhancing the solubility of taxoid derivatives while maintaining stability in solution, the present inventors have linked sugar donor-derived sugars to taxoid derivatives by the action of glycosyltransferases. It was found that the glycosylated derivative of taxoid improved dramatically in solubility, and that the derivative was stable even in solution and retained physiological activity.
Furthermore, it is possible to concentrate the drug locally by binding a sugar with high affinity to the living body.For example, taxoid derivatives bound with galactose or mannose have an affinity for hepatocytes and are concentrated in the liver. The In other words, the use of a taxoid derivative bound to these saccharides as an anticancer agent is considered to improve the bioavailability of a drug against liver cancer, and the present invention has been completed based on these findings.
[0008]
That is, the present invention relates to a glycosylated derivative of taxoid in which a sugar derived from cyclodextrins is bound to glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel by the action of cyclodextrin glucanotransferase , and further glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel and cyclodextrins. The present invention relates to a method for producing a glycosylated derivative of taxoid, which comprises reacting a cyclodextrin glucanotransferase in the presence of cyclodextrin and binding a sugar derived from the cyclodextrin to the glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel .
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Taxoid derivatives used in the present invention include paclitaxel in which a sugar is bound via a spacer, and specific examples thereof are shown below.
Glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel represented by the following formula (hereinafter abbreviated as 7-S-paclitaxel),
[0010]
[Chemical 1]

[0011]
The taxoid derivative is formed by binding a sugar to paclitaxel via a spacer.
Paclitaxel is obtained by isolation from bark of North American yew (Taxus brevifolia) according to the method described in Kingston, DGI: Pharmacol. Ther., 52, 1 (1992). RAHolton: Europian Patent-A 400971, 1990) is also used.
[0012]
The reaction of binding sugar to paclitaxel through a spacer is performed using tetrabenzyl acetate oxyglucoside. This tetrabenzylacetic acid oxyglucoside is obtained by binding glycolate such as ethyl glycolate as a spacer to tetrabenzylglucose obtained by a conventional method using glucose as a starting material, and then deethylating it into a carboxylic acid compound. It is represented by the following formula.
[0013]
[Chemical 2]

[0014]
Next, an example of a method for producing tetrabenzyl acetate oxyglucoside is shown below.
[0015]
[Expression 1]

[0016]
Tetrabenzyl glucose (1) obtained by a conventional method is reacted with ethyl glycolate together with p-toluenesulfonic acid in benzene at 0 to 150 ° C., preferably at 110 ° C. for 0.5 to 50 hours, preferably 8 hours. Then, ethyl glycolate is bonded to the 1-position to obtain an ethyl ester (compound (2), molecular weight 626.76). Thereafter, the compound (2) is treated in an alkali (eg 6N NaOH) methanol-dioxane solution at room temperature to 100 ° C. for 0.5 to 50 hours, preferably 3 hours, and then acidified with hydrochloric acid (eg 1N HCl). By transferring and deethylating, the corresponding carboxylic acid compound (3) is obtained. This material is tetrabenzyl acetate oxyglucoside.
In addition, also when other saccharides are used instead of glucose, the corresponding sugar modification body from which the kind of sugar differed by the same reaction can be obtained. Examples of saccharides used in this case include allose, altrose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, psicose, fructose, sorbose, tagatose, fucose, maltose. Etc.
[0017]
As the spacer, in addition to glycolate such as ethyl glycolate, those having a different alkyl chain length can be used. For example, 3-hydroxybutyric acid or the like is used.
The taxoid derivative used in the present invention is obtained by reacting the above-mentioned paclitaxel and tetrabenzylacetic acid oxyglucoside, and specific examples thereof include the method shown in the following reaction step ( II ).
[0018]
In the method shown in the following reaction step (II), the 2′-position of paclitaxel is protected with a chlorotriethylsilyl group and then reacted with tetrabenzylacetic acid oxyglucoside, and then debenzylated and detriethylsilylated to form paclitaxel. A derivative is produced.
[0019]
[Expression 2]

[0020]
First, a protective agent such as paclitaxel (4) and chlorotriethylsilane (TESCl), a base such as imidazole, and a solvent such as dimethylformamide (DMF) at room temperature for 0.5 to 50 hours, preferably 19.5 hours under argon. The 2'-position of paclitaxel is protected by reaction with triethylsilane to obtain compound (9).
Next, the obtained compound and a base such as tetrabenzylacetic acid oxyglucoside (3), DMAP, a condensing agent such as DCC, and a solvent such as methylene chloride are used at room temperature for 0.5 to 100 hours, preferably 5 hours under argon. Reaction to obtain glycosylated compound (10).
Thereafter, the compound (10) is reacted with a catalyst such as palladium black and an acid such as acetic acid under hydrogen and vigorously stirring at room temperature for 0.5 to 50 hours, preferably 5 hours, and a solvent such as tetrahydrofuran (THF). And water are added and reacted at room temperature for 0.5 to 50 hours, preferably 15 hours to obtain the desired compound (11). This compound (11) is 7-S-paclitaxel represented by the above formula.
[0021]
The obtained taxoid derivative can be easily separated into anomers by applying a liquid chromatography using a carrier based on silica gel such as ODS, and a purified sample can be obtained.
[0022]
Next, examples of the sugar donor used in the present invention include cyclodextrins . Examples of the cyclodextrins include α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, and derivatives thereof, and γ-cyclodextrin is particularly preferable.
The sugar derived from a sugar donor means a sugar that is transferred from a sugar donor to a taxoid derivative, and the above-mentioned sugars are applicable.
[0023]
The glycosyltransferase used in the present invention is a glucosyl group, fructosyl group, galactosyl group, mannosyl group, maltosyl group, malto-oligosaccharide unit from the sugar donor when allowed to act on a solution containing the taxoid derivative and a sugar donor. Is capable of producing a glycosylated derivative of taxoid, and specifically includes cyclodextrin glucanotransferase .
These glycosyltransferases are widely distributed in nature, and are derived from plants, animals, microorganisms, etc., and any enzyme including commercial products can be used in the present invention.
[0024]
The production method of the taxoid glycosylated derivative of the present invention is exemplified below.
First, a sugar donor solution is prepared by dissolving a sugar donor in a solvent such as water, ethanol, and acetonitrile. The sugar donor concentration in the solution is 5 to 80%, preferably 10 to 50%. is there.
In addition, the ratio of the sugar donor to the taxoid derivative varies depending on the type of sugar donor to be used, but it is usually 0.5 to 50 times, preferably 1 to 20 times.
Next, the taxoid derivative is dissolved in the sugar donor solution. In this case, the taxoid derivative is generally added so that the concentration in the solution is 0.1 to 50%, preferably 0.5 to 30%.
[0025]
Next, the reaction is performed by adding glycosyltransferase to the above solution. The amount of the enzyme to be used is not particularly limited, but the amount of the enzyme is usually such that the reaction is completed in 0.5 to 100 hours, preferably 1 to 50 hours. Other reaction conditions may be appropriately set depending on the enzyme used. For example, when cyclodextrin glucanotransferase is used, the pH is 4 to 8, preferably 5.5 to 7, and 20 to 70 ° C, preferably 40 to 60 ° C.
In the above reaction, the sugar transfer site varies and transfers to any positions of the 2-position, 3-position, 4-position and 6-position of the glucosyl group.
[0026]
Next, the enzyme is inactivated by a conventional method, and then the target glycosylated derivative is collected from the reaction product. For this method, ordinary separation and purification means may be applied. The most common method is a method in which a supernatant obtained by solid-liquid separation of a reaction product is subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) to fractionate and purify to fractionate a glycosylated derivative of taxoid.
[0027]
According to the present invention, the target taxoid glycosylated derivative can be usually obtained in a yield of about 5 to 70%. The taxoid glycosylated derivative of the present invention has improved stability and solubility in an aqueous solution, and retains its original physiological activity.
[0028]
【Example】
Next, the present invention will be described in detail with reference to examples.
Production Example 1
1.62 g of tetrabenzyl glucose (1) obtained by a conventional method, 1.56 g of ethyl glycolate, 0.10 g of p-toluenesulfonic acid, and 80 ml of benzene were reacted at 110 ° C. for 8 hours while reacting with compound (2 ) (C ₃₈ H ₄₂ O ₈ , molecular weight 626.74).
Next, 1.88 g of this compound was reacted with 10 ml of 6N NaOH, 10 ml of methanol, and 15 ml of dioxane at room temperature to 100 ° C. for 3 hours, and then transferred into 80 ml of 1N HCl to effect deethylation, whereby compound (3), A carboxylic acid compound (C ₃₆ H ₃₈ O ₈ , molecular weight 598.69) was obtained.
The above compound (3) was dissolved in deuterated chloroform, analyzed by ¹ H-NMR, the structure was determined by assigning each peak, and it was confirmed that the compound was represented by the above structural formula.
[0029]
Production Example 2
Paclitaxel (4) 427 mg, chlorotriethylsilane (TESCl) 0.1 mg, imidazole 102 mg, and DMF 5 ml were reacted at room temperature for 19.5 hours under argon, and the paclitaxel 2′-position was protected with a triethylsilyl group (9) ( C ₅₃ H ₆₅ NO ₁₄ Si, molecular weight 968.18).
392 mg of this compound (9), 479 mg of tetrabenzyl acetate oxyglucoside (3) obtained in Production Example 1, 98 mg of DMAP, 165 mg of DCC and 8 ml of methylene chloride were reacted at room temperature for 5 hours under argon to give a glycoside compound (10) _{_{_{(C 89 H 101 NO 21 Si}}} , molecular weight 1548.86) was obtained.
Next, 513 mg of the obtained compound (10), 100 mg of palladium black, and 3 ml of acetic acid were reacted under hydrogen at room temperature with vigorous stirring for 5 hours. Furthermore, 1 ml of tetrahydrofuran (THF) and 1 ml of water were added and reacted at room temperature for 15 hours to obtain 350 mg of 7-S-paclitaxel (11) (C ₅₅ H ₆₃ NO ₂₁ , molecular weight 1074.10).
[0030]
Next, using a column (φ20 mm × 250 mm) packed with silica gel (trade name: ODS, manufactured by YMC), 7-S-paclitaxel was purified for each anomer using methanol as a mobile phase. In addition, 7-S-paclitaxel was dissolved in deuterated chloroform, analyzed by ¹ H-NMR, the structure was determined by assigning each peak, and it was confirmed that the structure was represented by the above structural formula.
[0031]
Example 1
200 mg of γ-cyclodextrin (trade name: γ-CD, produced by Shimizu Minato Sugar Co., Ltd.) was dissolved in 2 ml of 50% ethanol solution and 100 μl of 1M acetate buffer (pH 6.0).
After dissolving 10 mg of 7-S-paclitaxel (glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel, hereinafter abbreviated as 7-GP) prepared in Production Example 2 in 900 μl of this cyclodextrin solution, cyclodextrin glucanotransferase (trade name: 70 units of Contizyme, Amano Pharmaceutical Co., Ltd. (hereinafter abbreviated as CGTase) were added and reacted at 37 ° C. for 3 hours.
Thereafter, 3 ml of ethanol was added to inactivate the enzyme, and the supernatant obtained by solid-liquid separation was filtered through a membrane filter (0.45 μm), and the filtrate was analyzed by HPLC.
[0032]
The HPLC analysis conditions are as follows.
Column: Taxil 5μ (4.6 × 250 mm) manufactured by MetaChem
Solvent: MeOH / H2O (65/35)
Flow rate: 0.5ml / min
Detector: Photodiode array detector (230 nm)
Injection volume: 20 μl
[0033]
As a result, a glycosyltransferase reaction product (taxoid glycosylated derivative, which is a glycoside excluding 7-GP and a mixture) in which malto-oligosaccharide is transferred to 7-GP by CGTase is 61.5% in taxoid. It was generated. FIG. 1 shows an HPLC chart. In the figure, * indicates 7-GP, and ** indicates paclitaxel.
[0034]
Example 2
The glycosylated product obtained in Example 1 was analyzed by liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS). The liquid chromatography conditions were the same as in Example 1. The results are shown in FIG. Analysis was performed in the negative ion mode of fast atom bombardment mass spectrometry (FAB-MS). Glycerin was used as a matrix. The obtained results are shown in Table 1.
[0035]
[Table 1]
Table 1

[0036]
The estimated structural formulas of pentaglucosyl-glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel (C ₈₅ H ₁₁₃ NO ₄₆ , molecular weight 1884.80, RT = 17.5, 19.17) having

peaks

1 and 2 are shown below.
[Chemical 3]

[0037]
The estimated structural formula of peak 3 triglucosyl-glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel (C ₇₃ H ₉₃ NO ₃₆ , molecular weight 1560.52, RT = 22.17) is shown below.
[Formula 4]

[0038]
The estimated structural formula of diglucosyl-glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel of peak 4 (C ₆₇ H ₈₃ NO ₃₁ , molecular weight 1398.38, R = 25.17) is shown below.
[Chemical formula 5]

[0039]
The estimated structural formula of peak 5 of glucosyl-glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel (C ₆₁ H ₇₃ NO ₂₆ , molecular weight 1236.34, RT = 29.5) is shown below.
[Chemical 6]

[0040]
The structural formula of glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel (C ₅₅ H ₆₃ NO ₂₁ , molecular weight 1074.10, RT = 34.33, 36.83) having peaks 6 and 7 is shown below.
[Chemical 7]

[0041]
Example 3
10 mg of each of the transglycosylation reaction products prepared in paclitaxel, 7-GP, and Example 1 was weighed, and 5 ml of water was added to each and stirred for 18 hours. After stirring, the supernatant was filtered through a membrane filter (0.45 μm), and the filtrate was analyzed by HPLC. As a result, the solubility of each compound in water was as shown in Table 2.
[0042]
The HPLC analysis conditions are as follows.
Column: Taxil 5μ (4.6 × 250 mm) manufactured by MetaChem
Solvent: MeOH / H2O (80/20)
Flow rate: 0.5ml / min
Detector: Photodiode array detector (230 nm)
Injection volume: 20 μl
[0043]
[Table 2]
Table 2

[0044]
As is apparent from the table, the solubility of the transglycosylation product, which is the taxoid glycosylated derivative of the present invention, has been dramatically improved. In addition, it was confirmed that this glycosyl transfer product was stable even in an aqueous solution.
[0045]
Test Example Paclitaxel, 7-GP and the glycosyltransferase reaction product obtained in Example 1 were each dissolved in DMSO and prepared so that the concentration in the reaction solution was 5 μM.
Next, each of the above samples was mixed with tubulin (a main constituent protein of microtubules) and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. The absorbance at 350 nm of the reaction solution was measured at 2, 5, 10 and 15 minutes after the reaction. Moreover, calcium chloride was added after completion | finish of reaction, and the light absorbency of 350 nm was measured again 5 minutes after that. From each measured value, the relative activity of each sample when the polymerization promoting activity and the depolymerization inhibiting activity of paclitaxel were taken as 100 was determined. The results are shown in Table 3.
[0046]
[Table 3]
Table 3

[0047]
As is apparent from the table, the glycosylated product that is a taxoid glycosylated derivative has a higher depolymerization inhibitory activity than paclitaxel, and was confirmed to be a very effective anticancer agent.
[0048]
【The invention's effect】
The present invention provides a taxoid glycosylated derivative having improved water solubility and improved stability, and a method for producing the same. The glycosylated derivative is expected to be used as an effective cancer therapeutic agent while reducing the burden on the patient when administered to the patient.
[Brief description of the drawings]
1 is a chart showing an HPLC chart of a reaction product obtained in Example 1. FIG.
2 is a chart showing an LC-MS chart of the reaction product obtained in Example 1. FIG.

Claims

A glycosylated derivative of taxoid in which a sugar derived from cyclodextrins is bound to glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel by the action of cyclodextrin glucanotransferase .

A taxoid characterized by reacting glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel with cyclodextrins in the presence of cyclodextrin glucanotransferase and binding a sugar derived from the cyclodextrins to the glucosyloxyacetyl-7-paclitaxel . A method for producing a glycosylated derivative.