JP3779048B2

JP3779048B2 - Dry analytical element for the determination of cholinesterase

Info

Publication number: JP3779048B2
Application number: JP28451497A
Authority: JP
Inventors: 貴喜新井; 薫寺島
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: JPH11103889A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリンエステラーゼを定量するための乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液などの生物体液中の活性成分（例、グルコース、各種酵素、蛋白質、免疫成分、および中性脂肪）の定量分析は、医療診断の際に有用な情報を提供するものであり、その分析方法は古くから開発されている。
そして、最近では、その分析方法は大別して、湿式法、すなわち試験管などの容器中で血清などの生物体液試料を適当な試薬と液相にて反応させ、その反応により発生する主として発色などの化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行なう方法、そして乾式法、すなわちシート状透明支持体上に、生物体液試料中の分析対象の成分の特性を考慮して予め決められた反応試薬を含浸させた層状物（反応層）を積層させた多層分析要素を用意し、これに血清などの生物体液試料を点着させ、次いで加温（インキュベーション）することにより発色などの化学変化を発生させ、その化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行う方法の二つの方法に分けられている。これらの湿式法と乾式法とは、それぞれ異なる利点を持つため、分析の目的に応じて適宜使い分けられて利用されている。
【０００３】
なかでも、多層分析要素（通常は、乾式分析要素と同じ意味で用いられる）を用いる乾式法は、その分析操作に熟練を必要とせず、また分析結果を得るまでの操作が簡単で、かつ短時間で終了するため、特に迅速を要する医療診断や、比較的小規模の分析箇所で多用されている。
【０００４】
上記のようにこれまでに多数の生物体液中の活性成分の定量分析方法が湿式、乾式を問わず開発され、確立されてきた。血液に存在し、同じく有用な医療情報を提供する活性成分であるコリンエステラーゼについても同様である。即ち、血液中のコリンエステラーゼの含有量は生体の肝機能の指標になり、従って、その含有量を検知することは、肝疾患の医療診断と治療のために非常に重要である。しかし、湿式法によるコリンエステラーゼの定量方法は、精度は高いが、定量結果の入手までに時間のかかるという問題がある。
【０００５】
たとえば、特開昭５４−１３６８９５号公報には、ｐ−メチルシンナモイルコリン・塩酸塩やｐ−メトキシシンナモイルコリン・塩酸塩などの、置換フェニル基を置換基として有するアルケニルカルボキシコリン誘導体を基質として用いることを特徴とする湿式法によるコリンエステラーゼの活性測定法が記載されている。
【０００６】
また、特開昭５７−２１３１５２号公報には、下記式：
【０００７】
【化２】

【０００８】
［上記式において、Ｒ¹ 及びＲ² は低級アルコキシ基又は水素を表わし、Ｘはハロゲン原子を表わす。］
を基質として用いる湿式法によるコリンエステラーゼ活性測定方法が記載されている。この測定方法では、上記の基質の分解により生成するｐ−ヒドロキシ安息香酸またはその誘導体を酸化剤の存在下に４−アミノアンチピリンと酸化縮合させて着色化合物に導き、その着色を比色定量する方法が利用される。
【０００９】
特開平５−２１１８９４号公報には、乾式によるコリンエステラーゼの定量方法が記載されている。しかし、この方法では、検出に４０５ｎｍの波長の光を用いるため、一般的にピルビン酸の影響をうけやすく、かつアナライザーに厳しい精度が要求されると云う問題がある。また、特開平６−１６６６６２号にも、別のシステムを利用する乾式法の記載があるが、用いている基質の加水分解速度が大きいため、精度の点で問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血液などの生物体液に含まれているコリンエステラーゼを乾式法を利用して高精度に分析するために有利に使用することのできるコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、透明支持体シート上に、下記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾイルコリン誘導体、コリンオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと色素前駆体（発色成分）とからなる呈色性指示薬組成物を含む反応層を備えてなり、該反応層が、該呈色性指示薬組成物を含む支持体側に設けられた発色層、およびその上に積層されたベンゾイルコリン誘導体含有試料展開層とからなるコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子：
【００１２】
【化３】

【００１３】
［上記一般式（Ｉ）において、Ｒ¹ とＲ² とは、それぞれ独立に、水素原子もしくは炭素数１〜６のアルコキシ基を表わし、Ｘはハロゲン原子を表わす。］
【００１４】
一般式（Ｉ）のベンゾイルコリン誘導体としては、ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンのハロゲン化物が好ましい。また、本発明の乾式分析素子に於いては、反応層が、ペルオキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む支持体側に設けられた発色層、およびその上に積層されたベンゾイルコリン誘導体含有試料展開層とからなることが好ましい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の構造は、これまでに多数の形態で知られている乾式分析素子（乾式分析要素或は乾式分析材料とも呼ばれている）と同様である。すなわち、乾式分析素子の構造は、透明なシート状支持体と、この支持体上に設けられている反応層とからなるものである。
【００１６】
透明なシート状支持体としては、たとえばポリエチレンテレフタレートシートなどのような無色で透明性の高いポリマー製シートが用いられる。
支持体の上に、次に反応層が設けられる。この反応層は、所望により、支持体上にゼラチンあるいは水溶性ポリマーからなる下塗り層を設けたのち、その上に設けてもよい。
【００１７】
反応層は、コリンエステラーゼと接触して反応を起こし、ついで呈色反応を示すまでに必要な反応試薬が含まれる発色層（試薬層）と、所望によって設けられる別の機能層とからなる。発色層は、ポリマーマトリックスに反応に関与する試薬の少なくとも一部が溶解もしくは分散されている層である。
【００１８】
試薬層に付設することのできる別の機能層の代表例としては、試料展開層（展開層：表面に点着された液体試料を単位面積当り均一な量に分配して、下層の試薬層に供給する機能を有する多孔性の層）及び光反射層を挙げることができる。試料展開層および光反射層のいずれも、試薬層の上側（支持体側とは反対の側）に設けられる。試薬層の上に光反射層と試料展開層とをこの順に重ねて設けてもよい。また、光反射層と試薬層、試料展開層と試薬層、光反射層と試料展開層の間に、所望により、ゼラチンや水溶性ポリマーなどからなる接着層を設けてもよい。なお、反応に関与する試薬を任意の割合で試薬層と試料展開層とに分けて含有させることもできる。
【００１９】
本発明の分析素子においてコリンエステラーゼの検出に用いる検出試薬系は、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾイルコリン誘導体、コリンオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む。これらの試薬成分のそれぞれは、すでに各種の乾式分析素子の反応系において知られているものである。従って、これらの試薬成分について、次に簡単に記載する。
【００２０】
（１）前記一般式（Ｉ）で表わされるベンゾイルコリン誘導体は、前述の特開昭５７−２１３５２号公報に記載されている。好ましいベンゾイルコリン誘導体としては、ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンのハロゲン化物、特にヨウ化物を挙げることができる。
【００２１】
（２）コリンオキシダーゼについては、前述の特開昭５４−１３６８９５号公報に記載がある。
【００２２】
（３）ペルオキシダーゼと色素前駆体（呈色性指示薬組成物）
コリンオキシダーゼによるコリンの酸化によって発生する過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在下で、色素前駆体に発色をもたらす。このような発色を示す色素前駆体（過酸化水素検出呈色指示薬成分）としては、４−アミノアンチピリンなどのＮ，Ｎ−ジ置換アニリン、及びロイコ色素が知られている。
【００２３】
反応層は通常、ゼラチンなどの親水性ポリマーあるいはラテックスを構造形成マトリックスとして構成される。
【００２４】
また、試料展開層には、セルロース誘導体のような親水性ポリマーを導入することが好ましい。この親水性ポリマーは、試料展開層に点着された液体試料の展開を制御し、微量の反応を均等かる高感度にするために、有用である。
【００２５】
本発明の乾式分析素子は、支持体シートの上（或は、その表面に設けた下塗り層の上）に、試薬層形成材料の水溶液を均一に塗布し、乾燥させることにより形成する。試薬層は一層のみでもよく、所望により二層以上とすることもできる。試料展開層は、一旦乾燥した試薬層の表面を濡らした状態にして、その表面に織物あるいは編物を押しつけるなどして接合して形成する。必要により、接着層や光反射層などの補助層を介在させてもよい。この試料展開層に任意に、試薬の一部を溶解した水溶液を含浸させるて試薬含有展開層とすることもできる。また、試料展開層は、親水性樹脂中に微粒子が分散されて多孔性層であってもよい。
【００２６】
本発明の乾式分析素子は通常、長尺状の透明プラスチックシートの上に、試薬層と、試料展開層を順に形成させ、ついで、これを所定のサイズに切断する方法を利用して工業的に製造する。この所定のサイズに切断された乾式分析素子は通常、プラスチック材料製のマウントに収容されて、医療診断にてコリンエステラーゼの定量分析に使用される。
【００２７】
本発明の乾式分析素子を利用してのコリンエステラーゼの定量分析は、乾式分析素子を利用する、グルコース、中性脂肪、トランスアミナーゼ、蛋白質などの生体内活性成分の分析方法と同様にして行なわれる。具体的には、反応層（通常は、その最上層にある試料展開層）の表面に、血清などの試料溶液をピペットなどを用いて点着し、その後、３７℃附近の温度で一定時間保存し（インクベーション）、次いでそのインクベーションにより生成した発色を比色法により測定する方法が用いられる。そして、この測定値を、別に標準試料（コリンエステラーゼ含有量が予め確認されている試料）を用いて作製した検量線と照合させることにより、測定試料中のコリンエステラーゼ含有量を高精度で定量することができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いることにより、湿式法では必須の分析操作の実施時における試薬液の調整などが不必要になり、特に熟練を必要とすることなく、短時間のうちに、湿式法と同様な高精度で、かつ広いダイナミックレンジでのコリンエステラーゼの定量が可能となる。
【００２９】
【実施例】
［実施例１］コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
下記の方法により、支持体表面に試薬層（発色層）と試料展開層（試薬の一部を含有するもの）とが積層された本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した。
【００３０】
（１）支持体表面への試薬層の形成
下記組成の試薬を水溶液（水溶液のｐＨ：７．６）とし、ゼラリン下塗りが施されていて、表面が平滑で厚さが１８０μｍの無色透明なポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの表面に、各試薬成分が下記塗布量になるように塗布乾燥させた。
【００３１】
【表１】

【００３２】
（２）試薬層上への試料展開層の形成
上記の試薬層を乾燥させた後、３０ｇ／ｍ² の割合でｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール（グリシドールサーファクタント１０Ｇ）水溶液を全面に供給して湿潤させた後、その上に、別に用意した編布（ゲージ数４０）を載せ、圧力を均一にかけてラミネートし、乾燥させた。次いで、その編布層に、下記組成物の水溶液（水溶液のｐＨ：７．６）を、各成分の塗布量がそれぞれ下記の量となるように、均一に塗布浸透させたのち、乾燥して試料展開層を形成して、本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した。
【００３３】
【表２】

【００３４】
［比較例１］コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨウ化物（基質）０．３ｇをヨウ化ベンゾイルコリン１．２６ｇに変えた以外は、実施例１と同様な操作を行ない、比較用のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した
【００３５】
［実施例２］コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−ジメチルアミノフェニル）−５−（２−フェニルエチル）イミダゾール・酢酸塩（発色試薬）０．３ｇを、４−メトキシ−１−ナフトール０．４２ｇに変えた以外は、実施例１と同様な操作を行ない、本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した。
【００３６】
［比較例２］コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨウ化物（基質）０．３ｇをヨウ化ベンゾイルコリン１．２６ｇに変えた以外は、実施例２と同様な操作を行ない、比較用のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した
【００３７】
［実施例３］コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いての測定例
コリンエステラーゼ濃度がそれぞれ、１Ｕ／Ｌ、６４Ｕ／Ｌ、１５４Ｕ／Ｌ、２４５Ｕ／Ｌそして３３５Ｕ／Ｌの５レベルのコリンエステラーゼ活性（ＣｈＥ活性）を有するヒト血清を用意し、それぞれを１０μＬ採り、実施例１〜２と比較例１〜２のそれぞれで製造したコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子に点着し、３７℃にてインキュベートし、２分後そして５分後に、乾式分析素子に発生した発色の反射光学濃度（ＯＤｒ）を、６００ｎｍの波長で支持体側から反射濃度測定法により測定した。それぞれの測定データにおけるコリンエステラーゼ濃度（検定値）と反射光学濃度（ＯＤｒ）との関係を調べた。その結果を下記の第１表と第２表に示す。
【００３８】
【表３】

【００３９】
【表４】

【００４０】
上記の第１表と第２表に示した結果から、実施例１と実施例２で得られた本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いた場合には、被検液（ヒト血清）中のコリンエステラーゼ濃度が３３５Ｕ／Ｌと高濃度の場合でも充分な感度で測定でき、その測定のダイナミックレンジが広いことが分る。一方、比較例１と比較例２で得られたコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いた場合には、被検液中のコリンエステラーゼ濃度が２４５Ｕ／Ｌ以上の高濃度となった場合には、極端な感度の低下や測定値の逆転が発生することから、その測定のダイナミックレンジが狭いことが分る。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a dry analytical element for quantifying cholinesterase.
[0002]
[Prior art]
Quantitative analysis of active components (eg, glucose, various enzymes, proteins, immune components, and neutral fat) in biological fluids such as blood provides useful information for medical diagnosis, and its analysis method Has been developed since ancient times.
Recently, the analysis method is roughly divided into wet methods, that is, a biological fluid sample such as serum is reacted with an appropriate reagent in a liquid phase in a container such as a test tube, and mainly color development generated by the reaction is performed. The chemical change is read using a method such as a colorimetric method, the target component is quantitatively analyzed, and the dry method, that is, the characteristics of the component to be analyzed in the biological fluid sample are measured on a sheet-like transparent support Prepare a multi-layer analytical element in which a layered material (reaction layer) impregnated with a reaction reagent determined in advance in consideration is prepared, and a biological fluid sample such as serum is spotted on this, and then heated (incubation) Thus, a chemical change such as color development is generated, the chemical change is read using a method such as a colorimetric method, and a quantitative analysis of the target component is performed. Since these wet methods and dry methods have different advantages, they are appropriately used according to the purpose of analysis.
[0003]
Among them, the dry method using a multilayer analysis element (usually used in the same meaning as the dry analysis element) does not require skill in the analysis operation, and the operation until obtaining an analysis result is simple and short. Since it is completed in time, it is frequently used in medical diagnoses that require a rapid response and comparatively small analysis locations.
[0004]
As described above, quantitative analysis methods for active ingredients in a large number of biological fluids have been developed and established so far, regardless of whether they are wet or dry. The same is true for cholinesterase, which is an active ingredient that is present in blood and also provides useful medical information. That is, the content of cholinesterase in the blood serves as an index of the liver function of the living body, and thus detection of the content is very important for medical diagnosis and treatment of liver diseases. However, the method for quantifying cholinesterase by the wet method has high accuracy, but has a problem that it takes time to obtain the quantification result.
[0005]
For example, JP-A No. 54-136895 discloses an alkenylcarboxycholine derivative having a substituted phenyl group as a substituent, such as p-methylcinnamoylcholine / hydrochloride and p-methoxycinnamoylcholine / hydrochloride as a substrate. A method for measuring the activity of cholinesterase by a wet method characterized in that it is used is described.
[0006]
JP-A-57-213152 discloses the following formula:
[0007]
[Chemical 2]

[0008]
[In the above formula, R ¹ and R ² represent a lower alkoxy group or hydrogen, and X represents a halogen atom. ]
A method for measuring cholinesterase activity by a wet method using as a substrate is described. In this measurement method, p-hydroxybenzoic acid or a derivative thereof generated by the decomposition of the substrate is oxidatively condensed with 4-aminoantipyrine in the presence of an oxidizing agent to lead to a colored compound, and the coloration is determined colorimetrically. Is used.
[0009]
Japanese Patent Laid-Open No. 5-21894 describes a method for quantifying cholinesterase by a dry method. However, in this method, since light having a wavelength of 405 nm is used for detection, there is a problem that it is generally easily affected by pyruvic acid and that the analyzer requires strict accuracy. Japanese Patent Laid-Open No. 6-166662 also describes a dry method using another system, but there is a problem in accuracy because the hydrolysis rate of the substrate used is high.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a dry analytical element for quantifying cholinesterase, which can be advantageously used to analyze cholinesterase contained in a biological fluid such as blood with high accuracy using a dry method. .
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a reaction layer comprising a benzoylcholine derivative represented by the following general formula (I), a choline oxidase, and a color developable indicator composition comprising a peroxidase and a dye precursor (color developing component) on a transparent support sheet. Ri Na includes a reaction layer,該呈color-indicator composition coloring layer provided on the support side containing, and cholinesterase quantification for dry consisting of benzoyl choline derivatives containing sample developing layer laminated thereon Analytical element:
[0012]
[Chemical 3]

[0013]
[In the general formula (I), R ¹ and R ² each independently represents a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and X represents a halogen atom. ]
[0014]
As the benzoylcholine derivative of the general formula (I), a halide of p-hydroxybenzoylcholine is preferable. Further, in the dry analytical element of the present invention, the reaction layer has a color-forming layer provided on the support side containing a color developable indicator composition composed of peroxidase and a dye precursor, and benzoyl laminated thereon. It preferably comprises a sample development layer containing a choline derivative.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The structure of the dry analytical element for quantifying cholinesterase of the present invention is the same as that of dry analytical elements (also called dry analytical elements or dry analytical materials) that have been known in many forms so far. That is, the structure of the dry analytical element is composed of a transparent sheet-like support and a reaction layer provided on the support.
[0016]
As the transparent sheet-like support, for example, a colorless and highly transparent polymer sheet such as a polyethylene terephthalate sheet is used.
A reaction layer is then provided on the support. If desired, this reaction layer may be provided on an undercoat layer made of gelatin or a water-soluble polymer on a support.
[0017]
The reaction layer is composed of a coloring layer (reagent layer) containing a reaction reagent necessary for causing a reaction upon contact with cholinesterase and then showing a color reaction, and another functional layer provided as desired. The coloring layer is a layer in which at least a part of the reagent involved in the reaction is dissolved or dispersed in the polymer matrix.
[0018]
As a representative example of another functional layer that can be attached to the reagent layer, a sample development layer (development layer: a liquid sample spotted on the surface is distributed in a uniform amount per unit area and is applied to the lower reagent layer. And a light reflecting layer). Both the sample development layer and the light reflection layer are provided on the upper side of the reagent layer (the side opposite to the support side). A light reflection layer and a sample development layer may be provided in this order on the reagent layer. In addition, an adhesive layer made of gelatin or a water-soluble polymer may be provided between the light reflecting layer and the reagent layer, the sample developing layer and the reagent layer, or between the light reflecting layer and the sample developing layer, if desired. In addition, the reagent involved in the reaction can be separately contained in the reagent layer and the sample development layer at an arbitrary ratio.
[0019]
The detection reagent system used for the detection of cholinesterase in the analytical element of the present invention is a color indicator composition comprising a benzoylcholine derivative represented by the above general formula (I), choline oxidase, and peroxidase and a dye precursor. Including things. Each of these reagent components is already known in the reaction system of various dry analytical elements. Therefore, these reagent components are briefly described next.
[0020]
(1) The benzoylcholine derivative represented by the general formula (I) is described in the above-mentioned JP-A-57-21352. Preferable benzoylcholine derivatives include p-hydroxybenzoylcholine halides, particularly iodides.
[0021]
(2) The choline oxidase is described in the aforementioned JP-A No. 54-136895.
[0022]
(3) Peroxidase and dye precursor (coloring indicator composition)
Hydrogen peroxide generated by the oxidation of choline by choline oxidase causes color development in the dye precursor in the presence of peroxidase. As a dye precursor (hydrogen peroxide detection color indicator component) exhibiting such color development, N, N-disubstituted anilines such as 4-aminoantipyrine and leuco dyes are known.
[0023]
The reaction layer is usually composed of a hydrophilic polymer such as gelatin or latex as a structure forming matrix.
[0024]
Moreover, it is preferable to introduce a hydrophilic polymer such as a cellulose derivative into the sample development layer. This hydrophilic polymer is useful for controlling the development of the liquid sample spotted on the sample development layer, and for achieving high sensitivity that equalizes a small amount of reaction.
[0025]
The dry analytical element of the present invention is formed by uniformly applying an aqueous solution of a reagent layer forming material on a support sheet (or on an undercoat layer provided on the surface) and drying it. There may be only one reagent layer, and two or more reagent layers may be used if desired. The sample spreading layer is formed by bringing the surface of the dried reagent layer into a wet state and then joining the surface by pressing a woven fabric or a knitted fabric. If necessary, an auxiliary layer such as an adhesive layer or a light reflecting layer may be interposed. The sample development layer can optionally be impregnated with an aqueous solution in which a part of the reagent is dissolved to form a reagent-containing development layer. The sample development layer may be a porous layer in which fine particles are dispersed in a hydrophilic resin.
[0026]
The dry analytical element of the present invention is usually industrially produced by forming a reagent layer and a sample development layer in this order on a long transparent plastic sheet and then cutting it into a predetermined size. To manufacture. The dry analytical element cut to a predetermined size is usually housed in a plastic material mount and used for quantitative analysis of cholinesterase in medical diagnosis.
[0027]
The quantitative analysis of cholinesterase using the dry analytical element of the present invention is performed in the same manner as the method for analyzing in vivo active components such as glucose, neutral fat, transaminase, and protein using the dry analytical element. Specifically, a sample solution such as serum is spotted on the surface of the reaction layer (usually the sample development layer at the uppermost layer) with a pipette, and then stored at a temperature around 37 ° C. for a certain period of time. (Incubation), and then a method of measuring the color produced by the incubation by a colorimetric method is used. Then, by collating this measured value with a calibration curve prepared using a standard sample (a sample in which the cholinesterase content is confirmed in advance), the cholinesterase content in the measurement sample can be quantified with high accuracy. it can.
[0028]
【The invention's effect】
By using the dry analytical element for quantifying cholinesterase of the present invention, adjustment of the reagent solution at the time of carrying out the essential analytical operation is unnecessary in the wet method, and in particular, without requiring skill, in a short time. Thus, cholinesterase can be quantified with high accuracy and a wide dynamic range similar to the wet method.
[0029]
【Example】
[Example 1] Production of dry analytical element for quantification of cholinesterase According to the present invention, a reagent layer (color-developing layer) and a sample development layer (containing a part of a reagent) are laminated on the support surface by the following method. A dry analytical element for quantifying cholinesterase was produced.
[0030]
(1) Formation of a reagent layer on the surface of the support A colorless transparent polyethylene having a smooth surface and a thickness of 180 μm, having a reagent having the following composition as an aqueous solution (pH of aqueous solution: 7.6), coated with geraline undercoat On the surface of a terephthalate (PET) film, each reagent component was applied and dried so as to have the following coating amount.
[0031]
[Table 1]

[0032]
(2) Formation of the sample development layer on the reagent layer After the reagent layer is dried, an aqueous solution of p-nonylphenoxypolyglycidol (glycidol surfactant 10G) is supplied over the entire surface at a rate of 30 g / m ² and moistened. After that, a separately prepared knitted fabric (gauge number 40) was placed thereon, laminated under a uniform pressure, and dried. Next, an aqueous solution of the following composition (aqueous solution pH: 7.6) was uniformly applied and infiltrated into the knitted fabric layer so that the application amount of each component was the following amount, and then dried. A sample development layer was formed to produce a dry analytical element for quantifying cholinesterase according to the present invention.
[0033]
[Table 2]

[0034]
[Comparative Example 1] Production of dry analytical element for quantification of cholinesterase The same operation as in Example 1 was performed except that 0.3 g of p-hydroxybenzoylcholine iodide (substrate) was changed to 1.26 g of benzoylcholine iodide. Produced a comparative analytical element for the determination of cholinesterase for comparison.
[Example 2] Production of dry analytical element for quantification of cholinesterase 2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4- (4-dimethylaminophenyl) -5- (2-phenylethyl) imidazole acetate (Coloring reagent) Except that 0.3 g was changed to 0.42 g of 4-methoxy-1-naphthol, the same operation as in Example 1 was performed to produce a dry analytical element for quantifying cholinesterase according to the present invention.
[0036]
[Comparative Example 2] Production of dry analytical element for quantification of cholinesterase The same operation as in Example 2 was performed except that 0.3 g of p-hydroxybenzoylcholine iodide (substrate) was changed to 1.26 g of benzoylcholine iodide. Manufactured a dry analytical element for quantification of cholinesterase for comparison.
[Example 3] Example of measurement using a dry analytical element for quantifying cholinesterase Cholinesterase activity (ChE activity) having cholinesterase concentrations of 1 U / L, 64 U / L, 154 U / L, 245 U / L and 335 U / L, respectively. ), 10 μL of each was taken, spotted on the dry analytical element for quantifying cholinesterase produced in each of Examples 1-2 and Comparative Examples 1-2, incubated at 37 ° C., and 2 minutes After and 5 minutes later, the color reflection optical density (ODr) generated in the dry analytical element was measured from the support side by a reflection density measurement method at a wavelength of 600 nm. The relationship between cholinesterase concentration (test value) and reflection optical density (ODr) in each measurement data was examined. The results are shown in Tables 1 and 2 below.
[0038]
[Table 3]

[0039]
[Table 4]

[0040]
From the results shown in Tables 1 and 2 above, when the dry analytical element for quantifying cholinesterase according to the present invention obtained in Example 1 and Example 2 was used, in the test solution (human serum) Even if the cholinesterase concentration of 335 U / L is as high as 335 U / L, it can be measured with sufficient sensitivity, and the dynamic range of the measurement is wide. On the other hand, in the case where the dry analytical element for quantifying cholinesterase obtained in Comparative Example 1 and Comparative Example 2 is used, when the cholinesterase concentration in the test solution becomes a high concentration of 245 U / L or more, It can be seen that the dynamic range of the measurement is narrow because the sensitivity is reduced and the measured value is reversed.

Claims

A transparent support sheet, Ri Na comprises a reaction layer containing benzoyl choline derivative represented by the following formula (I), choline oxidase, and a coloring indicator composition comprising a peroxidase and a dye precursor, the reaction A dry analytical element for quantifying cholinesterase comprising : a color-forming layer provided on the support side containing the colorimetric indicator composition; and a benzoylcholine derivative-containing sample development layer laminated thereon :

[In the above general formula (I), R ¹ and R ² each independently represents a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and X represents a halogen atom. ]

The dry analytical element for quantifying cholinesterase according to claim 1, wherein the benzoylcholine derivative of the general formula (I) is a halide of p-hydroxybenzoylcholine.

The dry analytical element for quantifying cholinesterase according to any one of claims 1 and 2, wherein the reaction layer further contains ascorbate oxidase .