JP3779046B2

JP3779046B2 - Dry analytical element for the determination of pyruvic acid

Info

Publication number: JP3779046B2
Application number: JP27062397A
Authority: JP
Inventors: 和也川崎; 仁美伊藤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2017-09-17
Also published as: JPH1189594A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピルビン酸を定量するための乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液などの生物体液中の活性成分（例、グルコース、各種酵素、蛋白質、免疫成分、および中性脂肪）の定量分析は、医療診断の際に有用な情報を提供するものであり、その分析方法は古くから開発されている。
そして、最近では、その分析方法は大別して、湿式法、すなわち試験管などの容器中で血清などの生物体液試料を適当な試薬と液相にて反応させ、その反応により発生する主として発色などの化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行う方法、そして乾式法、すなわちシート状透明支持体上に、生物体液試料中の分析対象の成分の特性を考慮して予め決められた反応試薬を含浸させた層状物（反応層）を積層させた多層分析要素を用意し、これに血清などの生物体液試料を点着させ、次いで加温（インキュベーション）することにより発色などの化学変化を発生させ、その化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行う方法の二つの方法に分けられている。これらの湿式法と乾式法とは、それぞれ異なる利点を持つため、分析の目的に応じて適宜使い分けられて利用されている。
【０００３】
なかでも、多層分析要素（通常は、乾式分析要素と同じ意味で用いられる）を用いる乾式法は、その分析操作に熟練を必要とせず、また分析結果を得るまでの操作が簡単で、かつ短時間で終了するため、特に迅速を要する医療診断や、比較的小規模の分析箇所で多用されている。
【０００４】
上記の様にこれまでに多数の生物体液中の活性成分の定量分析方法が湿式、乾式を問わず開発され、確立されてきた。しかしながら、血液に存在し、同じく、有用な医療情報を提供する活性成分であるピルビン酸については、これまでに湿式法のみが開発されたのみである。すなわち、血液中のピルビン酸の含有量は、生体の代謝および組織内の酸化状態を知る指標になるものであり、たとえば、心疾患、出血、ショックなどの循環不全の指標になり、また肝疾患、糖尿病、尿毒症、解糖系酸素の欠損などの指標になるため、その含有量を検知することは、医療診断と治療のために非常に有用である。しかし、これまでに知られている血液などの生物体液中のピルビン酸の定量方法は、精度は高いが、定量結果の入手までに時間のかかる湿式法のみであった。
【０００５】
たとえば、特公平５−３８５９５号公報には試料中のピルビン酸を、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニントランスフェラーゼ、そして２−オキソブルタール酸と接触させて、Ｄ−アラニンに変換し、ついでこのＤ−アラニンにＤ−アミノ酸オキシダーゼを接触させることによりピルビン酸に戻すサイクリング反応を行ない、このサイクリング反応中に発生する過酸化水素あるいはアンモニアを定量することにより、ピルビン酸を定量する方法が記載されている。このピルビン酸の定量方法は、微量のピルビン酸を高い精度で定量する方法として優れた方法であるが、その検出に利用する反応が、サイクリング反応という特殊の反応であるため、湿式法による利用が前提となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血液などの生物体液に含まれているピルビン酸を乾式法を利用して高精度に分析するために有利に使用することのできるピルビン酸定量用乾式分析素子を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、透明支持体シート上に、ピルビン酸オキシダーゼ、フラビンアデニンヌクレオチド、チアミンピロホスフェート、リン酸源化合物、二価または三価金属イオン、ペルオキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む反応層を備えてなるピルビン酸定量用乾式分析素子にある。
【０００８】
次に、本発明の好ましい態様を記載する。
（１）反応層が、支持体側に設けられた一もしくは二以上の試薬層およびその上に積層された試料展開層とを含む上記のピルビン酸定量用乾式分析素子。
【０００９】
（２）試料展開層に、アスコルビン酸オキシダーゼ、リン酸源化合物、および二価または三価金属イオンを含む上記のピルビン酸定量用乾式分析素子。
（３）試料展開層に、アスコルビン酸オキシダーゼ、リン酸源化合物、マグネシウムイオン、そして更に水溶性ポリマーを含む上記のピルビン酸定量用乾式分析素子。
（４）色素前駆体がロイコ色素である上記ピルビン酸定量用乾式分析素子。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子の構造は、これまでに多数の形態で知られている乾式分析素子（乾式分析要素或は乾式分析材料とも呼ばれている）と同様である。すなわち、乾式分析素子の構造は、透明なシート状支持体と、この支持体上に設けられている反応層とからなるものである。
【００１１】
透明なシート状支持体としては、たとえばポリエチレンテレフタレートシートなどのような無色で透明性の高いポリマー製シートが用いられる。
支持体の上に、次に反応層が設けられる。この反応層は、所望により、支持体上に、ゼラチンあるいは水溶性ポリマーからなる下塗り層を設けたのち、その上に設けてもよい。
【００１２】
反応層は、ピルビン酸と接触して反応を起こし、ついで呈色反応を示すまでに必要な反応試薬が含まれる層であり、試薬層（反応試薬含有層）と、所望によって設けられる別の機能層とからなる。試薬層は、ポリマーマトリックスに反応に関与する試薬の少なくとも一部が溶解もしくは分散されているそうである。
試薬層に付設することのできる別の機能層の代表例としては、試料展開層（展開層：表面に点着された液体試料を単位面積当り均一な量に分配して、下層の試薬層に供給する機能を有する多孔性の層）及び光反射層を挙げることができる。試料展開層および光反射層のいずれも、試薬層の上側（支持体側とは反対の側）に設けられる。試薬層の上に光反射層と試料展開層とをこの順に重ねて設けてもよい。また、光反射層と試薬層、試料展開層と試薬層、光反射層と試料展開層の間に、所望により、ゼラチンや水溶性ポリマーなどからなる接着層を設けてもよい。なお、反応に関与する試薬を任意の割合で試薬層と試料展開層とに分けて含有させることもできる。
【００１３】
本発明の分析素子においてピルビリンの検出に用いる検出試薬系は、ピルビン酸オキシダーゼ、フラビンアデニンヌクレオチド、チアミンピロホスフェート、リン酸源化合物、二価または三価金属イオン、およびペルオキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む。これらの試薬成分のそれぞれは、すでに各種の乾式分析素子の反応系において知られているものである。従って、これらの試薬成分について、次に簡単に記載する。
【００１４】
（１）ピルビン酸オキシダーゼ
ピルビン酸オキシダーゼは、グルタル−ピルベートトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）やグルタル−オキサロアセテートトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）などによって代表されるトランスアミダーゼの分析のために使用される酵素で、ピルビン酸を酸化して、過酸化水素を発生させる機能を有する酵素成分である。このようなピルビン酸オキシダーゼ（通常、ＰＯＰと呼ばれている）についての詳しい記載は、特公昭５９−１５６３７号公報、特公平１−４６１１９号公報に示されている。
【００１５】
（２）フラビンアデニンヌクレオチド
フラビンアデニンヌクレオチドは、通常ＦＡＤと呼ばれる化合物で、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物である。このフラビンアデニンヌクレオチドについても、上記の各公報に詳しい記載がある。このフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）（３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を発生する活性を１単位とする）当り、通常０．１〜５０ナノモル、好ましくは０．３〜３０ナノモルに相当する量で用いられる。
【００１６】
（３）チアミンピロホスフェート
チアミンピロホスフェートは、通常ＴＰＰと呼ばれる化合物であって、上記のＦＡＤと同様に、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物であり、このチアミンピロホスフェートについても、上記の各公報に詳しい記載がある。チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）当り、通常５〜５００ナノモル、好ましくは１０〜３００ナノモルに相当する量で用いられる。
【００１７】
（４）リン酸源化合物
リン酸源化合物もまた、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物である。リン酸源化合物の例としては、リン酸、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素アルミニウム、リン酸水素カルシウム、リン酸マンガン、リン酸水素マンガン、リン酸水素マグネシウム、リン酸水素鉄、リン酸水素コバルトなどがある。リン酸源化合物についても、上記の各公報に詳しい記載がある。このリン酸源化合物は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）当り、リン酸イオンに換算して、通常０．１〜１０マイクロモル、好ましくは０．３〜５マイクロモルに相当する量で用いられる。
【００１８】
（５）二価または三価金属イオン
二価または三価の金属イオンもまた、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物である。その例としては、二価のカルシウムイオン、コバルトイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、そして三価のアルミニウムイオンを挙げることができる。これらは、塩化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸水素塩、リン酸水素塩、炭酸塩、炭酸水素塩、酢酸塩などとして、反応層に導入される。具体的な化合物例としては、塩化マンガン、リン酸マンガン、リン酸水素マンガン、塩化マグネシウム、およびリン酸水素マグネシウムを挙げる事ができる。これらの金属イオンそして、それらの塩についても、上記の各公報に詳しい記載がある。この金属イオンは、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）当り、通常５ナノモル〜１０マイクロモル、好ましくは１０ナノモル〜５マイクロモルに相当する量で用いられる。
【００１９】
（６）ペルオキシダーゼと色素前駆体（呈色性指示薬組成物）
ピルビン酸の酸化によって発生した過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在下で、色素前駆体に発色をもたらす。このような発色を示す色素前駆体（過酸化水素検出呈色指示薬成分）としては、４−アミノアンチピリンなどのＮ，Ｎ−ジ置換アニリン、及びロイコ色素が知られている。本発明における色素前駆体としてはロイコ色素が好ましい。
【００２０】
反応層は通常、ゼラチンなどの親水性ポリマーあるいはラテックスを構造形成マトリックスとして構成される。
【００２１】
本発明の反応層には、さらにアスコルビン酸オキシダーゼを含むことが望ましい。このアスコルビン酸オキシダーゼは、血液試料中に混在するアスコルビン酸が、反応層において、生成した過酸化水素を還元して本来の測定値に負誤差を与えるのを防ぐために、予めアスコルビン酸を分解して、不活性化する機能を果たすものであり、その使用は、ピルビン酸を乾式法により定量する際において、微量のピルビン酸を正確に測定する点から非常に有効である。なお、このアスコルビン酸オキシダーゼは、特に試料展開層に導入することが有利である。
【００２２】
また、試料展開層には、セルロース誘導体のような親水性ポリマーを導入することが好ましい。この親水性ポリマーは、試料展開層に点着された液体試料の展開を制御し、微量の反応を均等かる高感度にするために、有用である。特に好ましい親水性ポリマーは、カルボキシメチルセルロースである。
【００２３】
本発明の乾式分析素子は、支持体シートの上（あるいは、その表面に設けた下塗り層の上）に、試薬層形成材料の水溶液を均一に塗布し、乾燥させることにより形成する。試薬層は、一層のみでもよく、所望により二層以上とすりこともできる。試料展開層は、一旦乾燥した試薬層の表面を濡らした状態にして、その表面に織物あるいは編物を押しつけるなどして接合して形成する。必要により、接着層や光反射層などの補助層を介在させてもよい。この試料展開層に任意に、試薬の一部を溶解した水溶液を含浸させるて試薬含有展開層とすることもできる。また、試料展開層は、親水性樹脂中に微粒子が分散されて多孔性層であってもよい。
【００２４】
本発明の乾式分析素子は通常、長尺状の透明プラスチックシートの上に、試薬層と、試料展開層を順に形成させ、ついで、これを所定のサイズに切断する方法を利用して工業的に製造する。この所定のサイズに切断された乾式分析素子は通常、プラスチック材料製のマウントに収容されて、医療診断において、ピルビン酸の定量分析に使用される。
【００２５】
本発明の乾式分析素子を利用してのピルビン酸の定量分析は、乾式分析素子を利用する、グルコース、中性脂肪、トランスアミナーゼ、蛋白質などの生体内活性成分の分析方法と同様にして行なわれる。具体的には、反応層（通常は、その最上層にある試料展開層）の表面に、血清などの試料溶液をピペットなどを用いて点着し、その後、３７℃附近の温度で一定時間保存し（インクベーション）、次いでそのインクベーションにより生成した発色を比色法により測定する方法が用いられる。そして、この測定値を、別に標準試料（ピルビン酸含有量が予め確認されている試料）を用いて作製した検量線と照合させることにより、測定試料中のピルビン酸含有量を高精度で知ることができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子を用いることにより、湿式法では必須の分析操作の実施時における試薬液の調整などが不必要になり、特に熟練を必要とすることなく、短時間のうちに、湿式法と同様な高精度のピルビン酸の定量が可能となる。
【００２７】
【実施例】
［実施例１］ピルビン酸定量用乾式分析素子の製造
下記の方法により、支持体表面に試薬層と試料展開層（試薬の一部を含有するもの）とがこの順に積層された本発明に従うピルビン酸定量用乾式分析素子を製造した。
【００２８】
（１）支持体表面への試薬層の形成
下記組成の試薬を水溶液として、ゼラリン下塗りが施されている、表面が平滑で、厚さが１８０μｍの無色透明なポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの表面に、乾燥膜厚が約１５μｍになるように塗布乾燥させた。
【００２９】
【表１】

【００３０】
【化１】

【００３１】
（２）試薬層上への試料展開層の形成
上記の試薬層に約３０ｍｇ／ｍ² の割合で水を全面に供給して湿潤させた後、その上に、別に用意したポリエステル製のブロード織物（空隙体積：９．８μＬ／ｍ² ）を載せ、軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥させた。次いで、そのブロード織物層に、下記組成物の水溶液を塗布（１００ｃｃ／ｍ² ）して、均一に浸透させた後、乾燥して試料展開層を形成した。
【００３２】
【表２】

【００３３】
［実施例２］ピルビン酸定量用乾式分析素子を用いての測定例−Ｉ
ピルビン酸濃度がそれぞれ、０．２５〜５．０ｍｇ／ｄＬ（市販の湿式法によるピルビン酸測定キット「デタミナーＰＡ」（協和メデックス（株）製）で濃度検定したもの）の範囲にあるヒト血清を用意し、それぞれを１０μＬ採り、実施例１で製造したピルビン酸定量用乾式分析素子に点着し、３７℃にて２．５分間インキュベートした。その後、分析素子に発生した発色の光学濃度を、６５０ｎｍの波長にて支持体側から反射濃度測定法により測定した。それぞれの測定データにおけるピルビン酸濃度（検定値）と反射濃度（ＯＤｒ）との関係を調べた。その結果を下記の表に示す。また、それぞれの関係から作成した検量線を第１図に示す。
【００３４】
【表３】

【００３５】
第１図の検量線から、ピルビン酸濃度（ｘ）と反射光学濃度（ｙ）との関係として、下記の関係式が得られ、本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子は、ピルビン酸定量の高精度の分析素子として有用であることが確認された。
ｙ＝０．６５ｘ³ ＋０．１９３５ｘ² ＋１．２４０５ｘ−０．４３０７
【００３６】
［実施例３］ピルビン酸定量用乾式分析素子を用いての測定例−Ｉ
ピルビン酸濃度が、０．５ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、そして３．０ｍｇ／ｄＬ（前記のピルビン酸測定キット「デタミナーＰＡ」で濃度検定したもの）の範囲にある三種類のヒト血清を用意し、それぞれを１０μＬ採り、実施例１で製造したピルビン酸定量用乾式分析素子に点着し、３７℃にて２．５分間インキュベートした。その後、分析素子に発生した発色の光学濃度を、６５０ｎｍの波長にて支持体側から反射濃度測定法により測定した。
なお、本発明の乾式分析素子を用いた場合の測定データの再現性を評価するために、同一の血清を用い、それぞれ５点の分析素子に点着し、発色を測定する実験を行なった。それぞれの測定データにおけるピルビン酸濃度（検定値）と反射濃度（ＯＤｒ）、そして実施例２で得られた検量線（第１図）から計算した乾式法によるピルビン酸濃度との関係を調べた。その結果を下記に示す。
【００３７】
【表４】

【００３８】
上記の表の結果から明らかなように、本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子を用いた試料中のピルビン酸濃度の定量は、高精度でかつ高い再現性にて実施できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で製造した本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子を用いての血清試料中のピルビン酸濃度（Ｐｙｒｍｇ／ｄＬ）］と反射光学濃度（ＯＤｒ）との関係を示す検量線である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a dry analytical element for quantifying pyruvic acid.
[0002]
[Prior art]
Quantitative analysis of active components (eg, glucose, various enzymes, proteins, immune components, and neutral fat) in biological fluids such as blood provides useful information for medical diagnosis, and its analysis method Has been developed since ancient times.
Recently, the analysis method is roughly divided into wet methods, that is, a biological fluid sample such as serum is reacted with an appropriate reagent in a liquid phase in a container such as a test tube, and mainly color development generated by the reaction is performed. The chemical change is read using a method such as a colorimetric method, the target component is quantitatively analyzed, and the dry method, that is, the characteristics of the component to be analyzed in the biological fluid sample are measured on a sheet-like transparent support. Prepare a multi-layer analytical element in which a layered material (reaction layer) impregnated with a reaction reagent determined in advance in consideration is prepared, and a biological fluid sample such as serum is spotted on this, and then heated (incubation) Thus, a chemical change such as color development is generated, the chemical change is read using a method such as a colorimetric method, and a quantitative analysis of the target component is performed. Since these wet methods and dry methods have different advantages, they are appropriately used according to the purpose of analysis.
[0003]
Among them, the dry method using a multilayer analysis element (usually used in the same meaning as the dry analysis element) does not require skill in the analysis operation, and the operation until obtaining an analysis result is simple and short. Since it is completed in time, it is frequently used in medical diagnoses that require a rapid response and comparatively small analysis locations.
[0004]
As described above, methods for quantitative analysis of active ingredients in a large number of biological fluids have been developed and established so far, whether wet or dry. However, only the wet method has been developed so far for pyruvic acid, which is an active ingredient that is present in blood and also provides useful medical information. That is, the content of pyruvic acid in the blood is an index for knowing the metabolism of the living body and the oxidation state in the tissue. For example, it is an index of circulatory failure such as heart disease, bleeding, shock, etc. Since it becomes an index of diabetes, uremia, deficiency of glycolytic oxygen, etc., detecting its content is very useful for medical diagnosis and treatment. However, the known methods for quantifying pyruvic acid in biological fluids such as blood are only wet methods that have high accuracy but take time to obtain quantitative results.
[0005]
For example, Japanese Patent Publication No. 5-38595 discloses that pyruvic acid in a sample is converted to D-alanine by contacting with D-glutamic acid, D-alanine transferase, and 2-oxobutalic acid. A method is described in which pyruvic acid is quantified by carrying out a cycling reaction to return it to pyruvic acid by contacting D-amino acid oxidase with alanine and quantifying hydrogen peroxide or ammonia generated during this cycling reaction. This method for quantifying pyruvic acid is an excellent method for quantifying a small amount of pyruvic acid with high accuracy. However, since the reaction used for the detection is a special reaction called a cycling reaction, it can be used by a wet method. It is a premise.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a dry analytical element for quantitative determination of pyruvic acid that can be advantageously used for analyzing pyruvic acid contained in biological fluids such as blood with high accuracy using a dry method. And
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a color comprising pyruvate oxidase, flavin adenine nucleotide, thiamine pyrophosphate, phosphate source compound, divalent or trivalent metal ion, peroxidase, ascorbate oxidase and a dye precursor on a transparent support sheet. It exists in the dry analytical element for pyruvic acid determination provided with the reaction layer containing a sex indicator composition.
[0008]
Next, preferred embodiments of the present invention will be described.
( 1 ) The dry analytical element for determining pyruvic acid as described above, wherein the reaction layer includes one or more reagent layers provided on the support side and a sample development layer laminated thereon.
[0009]
( 2 ) The dry analytical element for the determination of pyruvic acid as described above, wherein the sample development layer contains ascorbic acid oxidase, a phosphoric acid source compound, and a divalent or trivalent metal ion.
( 3 ) The dry analytical element for quantitative determination of pyruvic acid, wherein the sample developing layer contains ascorbic acid oxidase, a phosphoric acid source compound, magnesium ions, and further a water-soluble polymer.
( 4 ) The dry analytical element for quantitative determination of pyruvic acid, wherein the dye precursor is a leuco dye.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The structure of the dry analytical element for quantifying pyruvic acid of the present invention is the same as that of dry analytical elements (also called dry analytical elements or dry analytical materials) that have been known in many forms. That is, the structure of the dry analytical element is composed of a transparent sheet-like support and a reaction layer provided on the support.
[0011]
As the transparent sheet-like support, for example, a colorless and highly transparent polymer sheet such as a polyethylene terephthalate sheet is used.
A reaction layer is then provided on the support. If desired, this reaction layer may be provided on an undercoat layer made of gelatin or a water-soluble polymer on a support.
[0012]
The reaction layer is a layer that contains a reaction reagent necessary for causing a reaction upon contact with pyruvic acid and then showing a color reaction, and a reagent layer (reaction reagent-containing layer) and another function provided as desired. Consists of layers. The reagent layer seems to have at least a part of the reagent involved in the reaction dissolved or dispersed in the polymer matrix.
As a representative example of another functional layer that can be attached to the reagent layer, a sample development layer (development layer: a liquid sample spotted on the surface is distributed in a uniform amount per unit area and is applied to the lower reagent layer. And a light reflecting layer). Both the sample development layer and the light reflection layer are provided on the upper side of the reagent layer (the side opposite to the support side). A light reflection layer and a sample development layer may be provided in this order on the reagent layer. In addition, an adhesive layer made of gelatin or a water-soluble polymer may be provided between the light reflecting layer and the reagent layer, the sample developing layer and the reagent layer, or between the light reflecting layer and the sample developing layer, if desired. In addition, the reagent involved in the reaction can be separately contained in the reagent layer and the sample development layer at an arbitrary ratio.
[0013]
The detection reagent system used for detecting pyruline in the analytical element of the present invention comprises pyruvate oxidase, flavin adenine nucleotide, thiamine pyrophosphate, phosphate source compound, divalent or trivalent metal ion, and peroxidase and a dye precursor. A color indicator composition is included. Each of these reagent components is already known in the reaction system of various dry analytical elements. Therefore, these reagent components are briefly described next.
[0014]
(1) Pyruvate oxidase Pyruvate oxidase is an enzyme used for the analysis of transamidases typified by glutar-pyruvate transaminase (GPT) and glutar-oxaloacetate transaminase (GOT), and oxidizes pyruvate. Thus, the enzyme component has a function of generating hydrogen peroxide. Detailed description of such pyruvate oxidase (usually called POP) is shown in Japanese Patent Publication No. 59-15637 and Japanese Patent Publication No. 1-461119.
[0015]
(2) Flavin Adenine Nucleotide Flavin adenine nucleotide is a compound usually called FAD and is a compound that functions as a cofactor of pyruvate oxidase. These flavin adenine nucleotides are also described in detail in the above-mentioned publications. This flavin adenine nucleotide (FAD) is usually 0.1 unit per unit (U) of pyruvate oxidase (POP) (1 unit is the activity of generating 1 micromole of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C.). It is used in an amount corresponding to ˜50 nmol, preferably 0.3 to 30 nmol.
[0016]
(3) Thiamine pyrophosphate Thiamine pyrophosphate is a compound usually referred to as TPP, and is a compound that functions as a cofactor of pyruvate oxidase, similar to the above FAD. There is a detailed description in the publication. Thiamine pyrophosphate (TPP) is usually used in an amount corresponding to 5 to 500 nanomoles, preferably 10 to 300 nanomoles per unit (U) of pyruvate oxidase (POP).
[0017]
(4) Phosphate source compound The phosphate source compound is also a compound that functions as a cofactor of pyruvate oxidase. Examples of phosphoric acid source compounds include phosphoric acid, trisodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, tripotassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, aluminum hydrogen phosphate , Calcium hydrogen phosphate, manganese phosphate, manganese hydrogen phosphate, magnesium hydrogen phosphate, iron hydrogen phosphate, cobalt hydrogen phosphate, and the like. The phosphoric acid source compound is also described in detail in the above-mentioned publications. This phosphate source compound is converted into phosphate ions per unit (U) of pyruvate oxidase (POP) and is usually in an amount corresponding to 0.1 to 10 micromol, preferably 0.3 to 5 micromol. Used in
[0018]
(5) Divalent or trivalent metal ion A divalent or trivalent metal ion is also a compound that functions as a cofactor of pyruvate oxidase. Examples thereof include divalent calcium ions, cobalt ions, magnesium ions, manganese ions, and trivalent aluminum ions. These are introduced into the reaction layer as chlorides, sulfates, nitrates, phosphates, hydrogen sulfates, hydrogen phosphates, carbonates, bicarbonates, acetates, and the like. Specific examples of the compound include manganese chloride, manganese phosphate, manganese hydrogen phosphate, magnesium chloride, and magnesium hydrogen phosphate. These metal ions and their salts are also described in detail in the above publications. This metal ion is usually used in an amount corresponding to 5 nanomole to 10 micromole, preferably 10 nanomole to 5 micromole per unit (U) of pyruvate oxidase (POP).
[0019]
(6) Peroxidase and dye precursor (coloring indicator composition)
Hydrogen peroxide generated by the oxidation of pyruvate brings about color development in the dye precursor in the presence of peroxidase. As a dye precursor (hydrogen peroxide detection color indicator component) exhibiting such color development, N, N-disubstituted anilines such as 4-aminoantipyrine and leuco dyes are known. A leuco dye is preferred as the dye precursor in the present invention.
[0020]
The reaction layer is usually composed of a hydrophilic polymer such as gelatin or latex as a structure forming matrix.
[0021]
It is desirable that the reaction layer of the present invention further contains ascorbate oxidase. This ascorbic acid oxidase decomposes ascorbic acid in advance in order to prevent ascorbic acid mixed in the blood sample from reducing the generated hydrogen peroxide in the reaction layer and giving a negative error to the original measurement value. It serves to inactivate, and its use is very effective in accurately measuring a small amount of pyruvic acid when quantifying pyruvic acid by a dry method. It is particularly advantageous to introduce this ascorbate oxidase into the sample development layer.
[0022]
Moreover, it is preferable to introduce a hydrophilic polymer such as a cellulose derivative into the sample development layer. This hydrophilic polymer is useful for controlling the development of the liquid sample spotted on the sample development layer, and for achieving high sensitivity that equalizes a small amount of reaction. A particularly preferred hydrophilic polymer is carboxymethylcellulose.
[0023]
The dry analytical element of the present invention is formed by uniformly applying an aqueous solution of a reagent layer forming material on a support sheet (or on an undercoat layer provided on the surface) and drying it. The reagent layer may be a single layer or may be rubbed into two or more layers as desired. The sample spreading layer is formed by bringing the surface of the dried reagent layer into a wet state and then joining the surface by pressing a woven fabric or a knitted fabric. If necessary, an auxiliary layer such as an adhesive layer or a light reflecting layer may be interposed. The sample development layer can optionally be impregnated with an aqueous solution in which a part of the reagent is dissolved to form a reagent-containing development layer. The sample development layer may be a porous layer in which fine particles are dispersed in a hydrophilic resin.
[0024]
The dry analytical element of the present invention is usually industrially produced by forming a reagent layer and a sample development layer in this order on a long transparent plastic sheet and then cutting it into a predetermined size. To manufacture. The dry analytical element cut to a predetermined size is usually housed in a plastic material mount and used for quantitative analysis of pyruvic acid in medical diagnosis.
[0025]
Quantitative analysis of pyruvic acid using the dry analytical element of the present invention is performed in the same manner as in the method for analyzing in vivo active components such as glucose, neutral fat, transaminase, and protein using the dry analytical element. Specifically, a sample solution such as serum is spotted on the surface of the reaction layer (usually the sample development layer at the uppermost layer) with a pipette, and then stored at a temperature around 37 ° C. for a certain period of time. (Incubation), and then a method of measuring the color produced by the incubation by a colorimetric method is used. And, by comparing this measured value with a calibration curve prepared using a standard sample (a sample whose pyruvic acid content is confirmed in advance), the pyruvic acid content in the measurement sample can be known with high accuracy. Can do.
[0026]
【The invention's effect】
By using the dry analytical element for quantifying pyruvic acid according to the present invention, adjustment of the reagent solution at the time of performing the essential analytical operation is unnecessary in the wet method, and it is not necessary to be particularly skilled, in a short time. In addition, it is possible to quantify pyruvic acid with high accuracy similar to the wet method.
[0027]
【Example】
[Example 1] Manufacture of dry analytical element for quantitative determination of pyruvic acid A pyrubin according to the present invention in which a reagent layer and a sample development layer (containing a part of the reagent) are laminated in this order on the support surface by the following method. A dry analytical element for acid determination was manufactured.
[0028]
(1) Formation of a reagent layer on the surface of a support On the surface of a colorless and transparent polyethylene terephthalate (PET) film having a smooth surface and a thickness of 180 μm, which is coated with geraline undercoating, using a reagent having the following composition as an aqueous solution. The coating film was dried so that the dry film thickness was about 15 μm.
[0029]
[Table 1]

[0030]
[Chemical 1]

[0031]
(2) Formation of the sample development layer on the reagent layer After supplying the above reagent layer with water at a ratio of about 30 mg / m ² and moistening it, a polyester broad fabric prepared separately is provided on the reagent layer. (Void volume: 9.8 μL / m ² ) was placed, lightly laminated under pressure, and dried. Next, an aqueous solution of the following composition was applied to the broad woven fabric layer (100 cc / m ² ), uniformly infiltrated, and then dried to form a sample development layer.
[0032]
[Table 2]

[0033]
[Example 2] Measurement example-I using a dry analytical element for the determination of pyruvic acid-I
Human sera having pyruvic acid concentrations in the range of 0.25 to 5.0 mg / dL (concentration assay using commercially available wet method pyruvate measuring kit “Determiner PA” (manufactured by Kyowa Medex Co., Ltd.)) 10 μL of each was prepared, spotted on the dry analytical element for quantification of pyruvic acid produced in Example 1, and incubated at 37 ° C. for 2.5 minutes. Thereafter, the optical density of the color developed on the analytical element was measured by a reflection density measurement method from the support side at a wavelength of 650 nm. The relationship between pyruvate concentration (test value) and reflection density (ODr) in each measurement data was examined. The results are shown in the table below. Moreover, the calibration curve created from each relationship is shown in FIG.
[0034]
[Table 3]

[0035]
From the calibration curve of FIG. 1, the following relational expression is obtained as the relation between the pyruvic acid concentration (x) and the reflection optical density (y). The dry analytical element for quantifying pyruvic acid according to the present invention has It was confirmed that it is useful as a highly accurate analytical element.
y = 0.65x < ³ > + 0.1935x < ² > + 1.2405x-0.4307
[0036]
[Example 3] Measurement example-I using a dry analytical element for the determination of pyruvic acid-I
Three types of human sera with pyruvic acid concentrations in the range of 0.5 mg / dL, 1.0 mg / dL, and 3.0 mg / dL (concentration assay using the aforementioned pyruvate measuring kit “Determiner PA”) 10 μL of each was prepared, spotted on the dry analytical element for quantification of pyruvic acid produced in Example 1, and incubated at 37 ° C. for 2.5 minutes. Thereafter, the optical density of the color developed on the analytical element was measured by a reflection density measurement method from the support side at a wavelength of 650 nm.
In addition, in order to evaluate the reproducibility of the measurement data when using the dry analytical element of the present invention, an experiment was performed in which the same serum was spotted on each of the five analytical elements and the color development was measured. The relationship between the pyruvate concentration (test value) and the reflection concentration (ODr) in each measurement data and the pyruvate concentration calculated by the dry method calculated from the calibration curve obtained in Example 2 (FIG. 1) was examined. The results are shown below.
[0037]
[Table 4]

[0038]
As is clear from the results in the above table, it was confirmed that the determination of pyruvic acid concentration in a sample using the dry analytical element for determining pyruvic acid of the present invention can be performed with high accuracy and high reproducibility.
[Brief description of the drawings]
1 shows the relationship between pyruvate concentration (Pyr mg / dL) in a serum sample and reflection optical density (ODr) using the dry analytical element for quantification of pyruvate of the present invention produced in Example 1. FIG. It is a calibration curve.

Claims

A color indicator composition comprising pyruvate oxidase, flavin adenine nucleotide, thiamine pyrophosphate, phosphate source compound, divalent or trivalent metal ion, peroxidase and ascorbate oxidase and a dye precursor on a transparent support sheet A dry analytical element for quantitative determination of pyruvic acid, comprising a reaction layer containing.

The dry analytical element for quantifying pyruvic acid according to claim 1, wherein the reaction layer includes one or more reagent layers provided on the support side and a sample development layer laminated thereon .

The dry analytical element for quantifying pyruvic acid according to claim 2 , wherein the sample development layer contains ascorbate oxidase, a phosphate source compound, and a divalent or trivalent metal ion .

The dry analytical element for determining pyruvic acid according to claim 2 , wherein the sample development layer contains ascorbic acid oxidase, a phosphate source compound, magnesium ions, and further a water-soluble polymer .

The dry analytical element for quantifying pyruvic acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the dye precursor is a leuco dye .