JP3773801B2

JP3773801B2 - Novel yeast and method for producing fermented seasoning

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Publication number: JP3773801B2
Application number: JP2001093905A
Authority: JP
Inventors: 良寿江口; 智美岡本
Original assignee: Saga Prefecture
Current assignee: Saga Prefecture
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: JP2002281958A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、菌体塊形成能を有し、且つ例えば塩類濃度の高い培地においても高効率で発酵できるチゴサッカロミセス属に属する新規酵母、及び当該酵母菌株を使用する発酵調味料の製造方法、及び流動床型のバイオリアクターに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
酵母は、古来より日本酒などのアルコール類の製造、醤油などの発酵調味料の製造、パンの発酵などの各種の製造に使用されている。
例えば、醤油の醸造は、原料の蒸煮した丸大豆若しくは加工脱脂大豆と焙煎した小麦とを混合し、これに種麹を接種して製麹した後に食塩水を加え諸味を造り、発酵・熟成後にこの諸味を圧搾することにより醤油を製造している（本醸造）。
しかしながら、諸味を発酵・熟成させるには通常約６ヶ月と長期にわたっているために、製造工程の大部分をこの発酵・熟成期間が占めることになる。そのため、この発酵・熟成期間を短縮することが可能になれば、醤油製造においてその製造コストを大幅に削減することが可能になる。
【０００３】
そのため、酵母による発酵工程を、バイオリアクターによって効率的に行わせる研究がなされている。
一般に、バイオリアクターを利用する発酵工程では、生体触媒を固定化して使用する方法が採られている。
【０００４】
生体触媒の固定化方法としては、不溶性担体に担持させる結合法、生体触媒同士を結合させる架橋法、高分子ゲルなどの内部に包み込む包括法、及びこれらの複合法などが知られている。
しかしながら、これらの方法では、固定化担体の購入、固定化担体の殺菌、生体触媒の固定化工程、固定化担体の維持管理、固定化担体の廃棄・処理などのような生体触媒を固定化する上でのコストが必要となる。
また、生細胞（増殖細胞）の固定化が必要となる発酵食品の製造やアルコールの連続生産においては、菌体増殖又は原料液中の化学成分等による高分子ゲルなどの固定化担体の崩壊による目詰まりなどの問題が生じるため、一般には、多孔質無機材料等への担体結合法（物理的吸着）が用いられているが、多孔質セラミック等の多孔質無機材料を固定化担体とした場合には固定化される菌体量が少なく、発酵速度の向上や微生物汚染への抵抗性などに問題がある。
【０００５】
これに対して、菌体の分離・回収が容易にできる凝集性酵母を利用する方法では、酵母菌体の固定化工程や、酵母菌体と発酵液との分離工程を省略できるため、全体のシステムが簡略化され、低コストで且つ効率の良い発酵生産が可能となる。
【０００６】
これまで報告のある凝集性酵母菌株は、サッカロミセス・セレヴィシェ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母であり、これらは主に細胞融合技術や遺伝子組換え技術によって育種されている。
しかしながら、これらサッカロミセス・セレヴィシェを改良した菌株では浸透圧耐性（耐塩性を含む）が低いため、塩類や糖濃度の少ない原料を発酵原料として使用することはできるものの、廃糖蜜（例えば、カリウム、マグネシウム、ナトリウムなどの塩類が０．５〜１．５Ｍ程度含まれるもの）や、糖類の加水分解物といった高濃度の塩類、糖類を含む液などを原料として使用する場合は、その原料を希釈する必要があり、このことが発酵・蒸留終了後の廃液処理量の増大につながり、工業的な生産コストを増大させる一因となっている。
【０００７】
また、発酵法による工業的なエタノール生産では、廃糖蜜等の安価な発酵原料を使用し、回分発酵法や、酵母循環法及び固定化酵母法などの連続発酵法が開発されて一部では実用化されているが、従来の技術では酵母菌体を高密度に維持するため、その装置や工程が複雑であり、維持管理の費用が高額となる。
【０００８】
本発明は、以上のような点に鑑みて、固定化担体を用いず、且つ高い浸透圧耐性を有する新規酵母、及びこれを用いた発酵調味料の製造方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、比較的簡易な構造で、連続発酵などの処理ができるバイオリアクター装置を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決しようとする手段】
醤油醸造に用いられているチゴサッカロミセス属の酵母が、高い浸透圧耐性を有し、例えば、２．５Ｍ以上の塩化ナトリウム存在下及び／又は５０％（Ｗ／Ｗ）のグルコース培地でも生育、発酵を行うことができる。
そして、本発明者らは、チゴサッカロミセス属の酵母を含む醤油諸味から酵母をスクリーニングしたところ、所定の菌体塊形成能を有する新規な醤油主発酵酵母菌株（チゴサッカロミセス・ルキシーＲ−２株（Zygosaccharomyces rouxii R-2株）と命名：生命工研菌寄第18251 号〔FERM P-18251〕）を単離した。
この菌株の形成する菌体塊は硬く、通気撹拌による剪断力でも崩壊せず、菌体塊形成能（凝集能及び接着能を含む）は市販の酵母菌より優れていた。ただし、その菌体塊は比較的小さく、バイオリアクターに使用することを想定した場合の沈降性は必ずしも十分ではなかった。
そこで、本発明者らは、更に鋭意研究した結果、この菌株と醤油主発酵酵母とを細胞融合することにより、耐圧性が高く、且つより大きな菌体塊を形成できる優れた酵母を得、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、菌体塊形成能（凝集能及び接着能を含む）を有するチゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）に属する新規酵母（生命工研菌寄第18252
号〔FERM P-18252〕）を提供する。
さらに、本発明は、前記新規酵母を用いる醤油などの発酵調味料の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、管体２の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体２の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口６が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、前記管体２の上方内部には、筒状の隔壁７が管体２の内周面に対して間隔を空けて設けられており、前記隔壁７の下端部が取出口６の下方に延出されているバイオリアクターを提供する。
さらに、本発明は、前記隔壁７の周壁であって、取出口６と非対向位置に、処理液が通過可能な通過口８が形成されている前記バイオリアクターを提供する。
さらに、本発明は、管体２の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体２の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口６が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、前記管体２の内部には、該内部を区画する小孔板５が上下方向に多段状に設けられているバイオリアクターを提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の新規酵母は、上記のように、チゴサッカロミセス属の酵母を含む醤油諸味から、菌体塊形成能を有する酵母菌株（チゴサッカロミセス・ルキシーＲ−２株（Zygosaccharomyces rouxii R-2株）：生命工研菌寄第18251 号〔FERM P-18251〕。以下、「Ｒ−２株」と略称する場合がある）を取得し、この菌株と市販されているチゴサッカロミセス・ルキシー株（Zygosaccharomyces rouxii）（以下、「市販酵母株」と略称する場合がある）とを細胞融合することにより創製することができる。
【００１３】
細胞融合では、通常、両親株に対して変異処理を行い遺伝的性質で標識することが行われるが、酵母の優良な性質を損ねないという点から、標識処理は行わない方が好ましい。また、細胞融合法は、公知の方法を採用できるが、融合効率が高い点で高電圧パルス細胞融合法が好ましい。得られた融合株を複数回培養した後、より大きな菌体塊の形成できる菌株を選択することにより、本発明の新規酵母、特に醤油主発酵酵母として好適な菌株を得ることができる。
この新規酵母菌株を、チゴサッカロミセス・ルキシーＺＲ−２ｆ株（Zygosaccharomyces rouxii ZR-2f株。以下、「ＺＲ−２ｆ株」と略称する場合がある）と命名し、これを工業技術院生命工学工業研究所に生命工研菌寄第18252 号〔FERM
P-18252〕として寄託した。
【００１４】
このチゴサッカロミセス・ルキシーＺＲ−２ｆ株（FERM P-18252）と、両親株（市販酵母株及びＲ−２株）の菌学的性質を、実験農芸化学下第３版（東京大学農学部農芸化学教室著、（株）朝倉書店発行）に基づいて検討したところ、次の通りである。
〔ＺＲ−２ｆ株〕
（ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの菌体の形態：
▲１▼栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ。
▲２▼栄養細胞の形態：卵型。
▲３▼増殖の形態：出芽。
（ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態：
▲１▼形態：円。
▲２▼隆起：頭状。
▲３▼周縁：円滑。
▲４▼大きさ：１〜３ｍｍ。
▲５▼色調：白色で不透明。
▲６▼表面：円滑で半光沢。
（ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソルビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルトースを発酵する。α−メチルグリコシド、トレハロース、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、クエン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しない。
（ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地において生育可能である。
〔市販酵母株〕
（ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの菌体の形態：
▲１▼栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ。
▲２▼栄養細胞の形態：卵型。
▲３▼増殖の形態：出芽。
（ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態：
▲１▼形態：円。
▲２▼隆起：頭状。
▲３▼周縁：円滑。
▲４▼大きさ：１〜３ｍｍ。
▲５▼色調：白色で不透明。
▲６▼表面：円滑で光沢。
（ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソルビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルトースを発酵する。α−メチルグルコシド、トレハロース、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、クエン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しない。
（ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地において生育可能であるが時間を要する。
〔Ｒ−２株〕
（ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの菌体の形態：
▲１▼栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ。
▲２▼栄養細胞の形態：卵型。
▲３▼増殖の形態：出芽。
（ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態：
▲１▼形態：円。
▲２▼隆起：頭状。
▲３▼周縁：円滑。
▲４▼大きさ：１〜３ｍｍ。
▲５▼色調：白色で不透明。
▲６▼表面：円滑で半光沢。
（ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソルビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルトースを発酵する。α−メチルグルコシド、トレハロース、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、クエン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しない。
（ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地において生育可能である。
【００１５】
本発明の新規酵母は、それ自身が大きな塊状になるため、酵母菌体の固定化工程や、酵母菌体と処理液（発酵液）との分離が簡易に行えるため、特に、醤油、みりんなどの発酵調味料の製造、日本酒、焼酎、ワインなどのアルコール類の製造、糖ヌクレオチド生産時の菌体の製造などにおける流動床式バイオリアクターで好適に使用できる。更に、比較的高い塩濃度環境下でも発酵を行うことができるので、種々の被処理液を発酵処理することができる。
尚、本発明の新規酵母は、パン、味噌などの発酵に使用することも可能である。
【００１６】
本発明の新規酵母は、これを培養して用いられ、発酵処理後に全液を交換する回分発酵システム、被処理液を連続的に供給して発酵処理を行う連続発酵システムの何れの方式にも使用することができ、特に、連続発酵システムに好適に使用できる。
【００１７】
連続発酵システムに使用されるバイオリアクターとしては、従来公知のものを使用してもよいが、本発明に於いては、下記の流動床式のバイオリアクターを用いることが好ましい。
具体的には、図１及び図２に示すように、バイオリアクター１は、例えば、下方部２ａ（導入部２ａ）、中間部２ｂ（生体処理部２ｂ）及び上方部２ｃ（固液分離部２ｃ）の複数の筒部材が連結された管体２と、管体２の下方部２ａに設けられた供給口３と、管体２の中間部２ｂ内に設けられた区画用の小孔板５と、管体２の上方部２ｃに設けられた取出口６と、管体２の上方部２ｃ内であって、上方部２ｃの中央部に設けられた筒状の隔壁７とを備えている。
【００１８】
管体２は、例えば、耐衝撃性ガラス、ステンレスなどの金属などの耐衝撃性を有する公知の素材からなり、被処理液の処理量に応じて適宜の大きさに形成されている。
なお、管体２は、図１のように、下方部２ａ、中間部２ｂ及び上方部２ｃの複数の筒部材が連結された構成でも良いし、一体的な筒部材から構成されていても良い。
供給口３は、例えば、管体２の下方部２ａの底面に穿設されている。該供給口３には、空気と被処理液を供給する供給路（図示せず）が取り付けられており、該供給口３から空気と被処理液が管体２の内部に供給されるようになっている（図１の矢印）。
尚、供給口３は、下方部２ａの周壁に形成されていてもよいし、又、２以上の供給口３を設けて、空気と被処理液を別々に供給してもよい。
【００１９】
小孔板５は、管体２内部に充填される被処理液と、生体触媒（例えば、本発明の酵母に係る菌体塊）の全部又は一部と、が通過可能な大きさの孔を有する部材であれば特に限定されず、例えば、１．５〜３ｍｍ、より好ましくは２〜２．５ｍｍの大きさのメッシュ板（例えば、金属製網状板）などが例示される。
この小孔板５を設けることにより、管体２内部に於ける生体触媒の濃度勾配及び／又は生成物の濃度勾配を形成することができる。また、小孔板５を設けることにより、該小孔板５によって区画された各領域で流体の対流が生じる（図１に矢印で示す）。小孔板５は１つでも構わないが、濃度勾配を良好に形成させるためには、小孔板５が上下方向に多段に亘って設けられていることが好ましい。
具体的には、図１に示したように、２ｍｍの網目の大きさのメッシュ板５が２枚所定間隔を置いて設けられている。
【００２０】
取出口６は、管体２の上方部２ｃの周壁の中途部に設けられており、該取出口６から、処理がなされ後の処理液が取り出される。
この取出口６には、キャップ１５が嵌着されており、その中央部には、排出用のパイプ１６が設けられている。本実施態様に於いては、このパイプ１６が実質的に取出口６の役割を担い、このパイプ１６から処理液と空気が排出される（図１の矢印）。
このように下方から供給された空気が上方で排出されることにより（空気の流れにより）、管体２内には、下方から上方に向かって水流が生じるようになっている（水流発生手段に相当する）。
尚、水流発生手段は、空気の給排による構成に限られず、例えば、管体２内に回転翼を設け、これを回転させて水流を生じさせる構成などでもよい。
【００２１】
次に、隔壁７は、例えば、管体２と一体的に形成された円筒状体からなり、その上端部が管体２に連結されている。一方、隔壁７の下端部は、自由端となっており、図１に示すように、取出口６の下端部６ａよりも下方に延出されている。
隔壁７は、中間部２ｂから上昇する水流を受け入れるため、中間部２ｂと同じ開口又は中間部２ｂよりも大きな開口を有し、図１に示すように、隔壁７は、その開口部分１２が中間部２ｂの開口部分１４を囲繞するように対向して配置されている（平面から見た場合に、中間部２ｂが隔壁７に囲われるように配置されている）。かかる構成により、中間部２ｂから上昇する流体（処理液及び生体触媒）は、まず隔壁７の内側にほとんどが集約される。
さらに、この隔壁７は、その外周面が、管体２の内周面に対して液が流れる程度の間隔（隙間１１）を有して配置されている。
【００２２】
また、隔壁７のうち、取出口６と非対向位置（真向に向かい合った位置でないという意味である）には、少なくとも処理液が通過可能な通過口８が形成されている。通過口８としては、例えば、図示したように、取出口６の下端より下方又はそれとほぼ同高の位置に通過口８の一部が位置する切欠部８が例示されるが、その他、孔や複数の小孔の集合などを通過口８として構成してもよい。
通過口８が形成される非対向位置は、図示したように、取出口６と正反対（１８０度水平回転させた）位置が好ましいが、取出口に対して直角位置（図２のＢで示す）などであってもよい。また、通過口８は、正反対位置に１箇所形成されていれば十分であるが、複数箇所に形成されていてもよい。
【００２３】
尚、１０は、管体２内部に連通する操作口を示し、隔壁７の内側に設けられている。１１は、操作口を閉塞するキャップを示す。１２は、管体２内の温度を維持するために温水などを通す通路を示す。
また、管体２の下方部２ａ、中間部２ｂ及び上方部２ｃの間などの各部の間には、水密用のパッキンが設けられている。
【００２４】
上記バイオリアクター１は、内部に、（廃）糖蜜などの被処理液と、ＺＲ−２ｆ株などの生体触媒を充填し、空気を供給することにより、生体触媒が流動し、被処理液を発酵、分解、生成などの生物的処理を行い、得られた処理液は、取出口６から排出される。
この際、本発明のバイオリアクター１は、図１〜３（流体の流れを矢印で示す）に示すように、生体触媒と処理された処理液とが、水流発生手段により、管体２の上方部２ｃに上昇する。
上昇した処理液及び生体触媒は、隔壁７の内部で流動し、処理液と一部の生体触媒が通過口８を通じて隔壁７の外部に流出し、隔壁７と管体２との間（隙間１１）を通じて取出口６側へと押し出される。この隙間１１は、隔壁７の存在によって、水流発生手段による上方向きの水流の影響を受けにくいので、隙間１１を通過する途中で、生体触媒は、自重により下降することとなり、ほとんど処理液のみが取出口６へ移動する。従って、処理液と生体触媒の分離を容易に行うことができる。
【００２５】
被処理液としては、（廃）糖蜜、糖質加水分解物など公知のものを用いることができる。
また、生体触媒としては、本発明の新規酵母（ＺＲ−２ｆ株）に限られず、既知の凝集性酵母、担体に固定化された菌体や酵素、ゲルなどに包括された菌体や酵素などを従来公知のものを用いることもできる。
【００２６】
【実施例】
以下に、細胞融合、菌体塊形成能に優れた融合株の選択、選択した融合株の回分発酵および連続発酵試験を具体的に説明する。
ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものでない。また、バイオリアクターなどの説明に於いては、上記実施形態と同じ名称のものは、特段に説明がない限り、上記実施態様と同様のものである。
プロトプラストの調製
プロトプラストの調製は、基本的には野田らの方法（Agr.Biol.Chem.,54巻,2023頁(1990)）に準じて行った。
すなわち、従来型バイオリアクター（市販酵母株が担持された多孔質セラミック担体を使用）より排出された発酵液の中から速やかに沈降する菌体塊形成酵母チゴサッカロミセス・ルキシーＲ−２株と、市販酵母株であるチゴサッカロミセス・ルキシー（ビオック製、品名：醤油主発酵酵母）をそれぞれ１０％のＮａＣｌを含む公知のＹＰＤ培地１０ｍｌで３０℃で定常期初期（１×10⁸細胞／ｍｌ）まで振盪培養し、得られた菌体を滅菌した１０％食塩水で洗浄した。ついで、１．２Ｍのソルビトール、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のメルカプトエタノールを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。この菌体懸濁液にザイモリエース溶液（生化学工業（株）製）を終濃度１ｍｇ／ｍｌになるよう添加し、３０℃で９０分間処理してプロトプラスト化させた。そして、プロトプラストを遠心分離（１，２００×ｇ）して集め、１．２Ｍのソルビトール溶液で３回洗浄して、それぞれ５×10⁷プロトプラスト／ｍｌの濃度で懸濁した。
【００２７】
細胞融合
細胞融合は、高電圧パルス細胞融合法（電気細胞融合法）で行った。
すなわち、細胞融合装置（（株）島津製作所製、品名：ＳＳＨ−１０）を用いて行い、融合条件は、電極間隔１ｍｍ、交流周波数１ＭＨｚ、交流初期印加電圧４０Ｖ、パルス幅５００μＳ、パルス電圧４５０Ｖ（電界強度４．５ｋＶ／ｃｍ）、交流２次印加電圧４０Ｖとした。印加処理後のプロトプラスト懸濁液を３０℃で３０分間保温し、これをＳＤプレート（最少培地：０．６７％のイーストニトロゲンベース、アミノ酸不含、２％のグルコース、１．２Ｍのソルビトール、２％の寒天）に０．１ｍｌ塗布し、２５℃、３〜７日間培養して、プロトプラストを再生させた。ついで、この再生した菌体を１５％のＮａＣｌを含む１０ｍｌのＹＰＤ液体培地（ｐＨ５．０）に入れ、同培地５mlをＳＤプレート表面に添加後，生育してきたコロニー（菌体）を分散させ，その０．５ｍｌを植菌し、３０℃で定常期に達するまで（２〜３日）振盪培養を行った。この培養液を５分間静置後、浮遊している菌体を除去し、これに新たな１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌを加えて、さらに３０℃で定常期に達するまで振盪培養を行った。この操作を５〜９回繰り返して行い、菌体塊形成能の向上した菌株の濃縮を行った。その後、沈降した菌体を、滅菌処理した１５％の食塩水で３回洗浄後、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤプレートに塗布し、（１０００倍希釈した懸濁液を０．１ml塗布する）、生育したコロニーを取得した。さらに、これらのコロニーを１５％のＮａＣｌを含む１０ｍｌのＹＰＤ液体培地（ｐＨ５．０）に植菌して（１コロニー植菌する）、３０℃、３日間振盪培養し、菌体塊形成能を有するコロニー（ＺＲ−２ｆ株）を選抜した。
【００２８】
菌体塊沈降速度の評価
菌体塊の沈降速度の評価は、分光光度計（MILTONROY製、品名：SPECTORONIC 20）による濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）の減少速度により行った。
供試菌株を１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、（凝集菌体のかさとして０．５mlを植菌する）、３０℃、４８時間振盪培養し、これをボルテックスミキサー（iuchi 製、品名：AUTOMATIC LABO.MIXER）で１０秒間撹拌後、経時的に６６０ｎｍの吸光度変化を計測した。その結果を図４に示す。
尚、供試菌株は、市販酵母株、Ｒ−２株、上記細胞融合で得られたコロニー（ＺＲ−２ｆ株）の３種を用いた。
【００２９】
市販酵母株では、６６０ｎｍの吸光度に変化が認められず、又、Ｒ−２株では僅かながら変化が見られたのに対して、ＺＲ−２ｆ株では６６０ｎｍの吸光度が急速に減少していた。このことからＺＲ−２ｆ株は、菌体塊が速やかに沈降することがわかった。
又、視覚によってもＺＲ−２ｆ株は、おおよそ直径０．５〜３ｍｍ程度の菌体塊を形成していた。
このＺＲ−２ｆ株の菌体塊形成効果を明確にするため、Ｒ−２株、ＺＲ−２ｆ株、市販酵母株を直径１８ｍｍの試験管に採り、それらの菌体塊の様子を参考写真１に示す。
参考写真１からも明らかなように、ＺＲ−２ｆ株は、Ｒ−２株に比べてはるかに大きい菌体塊を形成していた。
また、Ｒ−２株では、比較的小さいものの、試験管底面部の写真において菌体塊の形成が明らかに認められた。
これに対して、市販酵母株では、試験管側面部の写真はもちろん、試験管底面部の写真においても菌体塊の形成は全く認められなかった。
この結果、ＺＲ−２ｆ株は、きわめて特徴的な菌体塊形成能を有し、Ｒ−２株は、少なくとも市販酵母株とは明確に識別できる菌体塊形成能を有することが判明した。
【００３０】
パルスフィールド電気泳動
次に、各供試菌株０．５ｍｌを、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌで３０℃、４８時間振盪培養して得られる各菌体を、遠心分離器で集菌・洗浄して使用した。試料の調製は、染色体ＤＮＡの断片化を防止するため、可能なすべての過程をアガロースゲル中で行い、ゲルブロックを調整した。ゲルは、１％のアガロース（Bio-Rad 社製 Pulsed Field Centrified Agarose）ゲルを用い、泳動には０．５×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した。泳動は、Bio- Rad社製ＣＨＥＦ−ＤＲ III System を用い、泳動電圧６Ｖ／ｃｍ、パルス間隔（開始：ＩＮＴ）６０〜（終了：ＦＩＮ）１２０秒、パルス角１２０度、泳動時間２２時間、槽内温度１４℃で行った。
電気泳動後のバンドを参考写真２に示す。参考写真２からも明らかなように、Ｒ−２株、ＺＲ−２ｆ株、市販酵母株ともに、ほとんど同一の染色体分離パターンであった。ただし、Ｒ−２株及びＺＲ−２ｆ株では、市販酵母株には認められない約８００ｋｂの位置に染色体ＤＮＡが認められた。
このことから、ＺＲ−２ｆ株及びＲ−２株は、同属菌株ではあるものの、市販酵母株とは明らかに異なる菌株であることが確認された。
【００３１】
実施例１
（ジャーファメンターによる回分発酵試験）
上記細胞融合によって得られたＺＲ−２ｆ株２０ｍｌを、前培養として、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地５００ｍｌで３０℃、４８時間振盪培養した。
その後１０分間静置して培養液と共に沈降しない菌体を除去することによって得られたＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持せずに、そのままの状態で発酵試験用培地（酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、グルコース１０％、ＮａＣｌが１５％、ｐＨ５．０）１リットルが入れられたジャーファーメンター（東京理化器械（株）製、品名：MINI FERMENTOR M-100）に充填し、３０℃で発酵させ、経時的にそのアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＣ−９Ａ）によって測定した。その結果を図５に示す。
１回目の発酵は若干遅延時間が長いものの、順調に発酵は進み、発酵５日目には３．７％（Ｗ／Ｖ）のアルコールが生成された。このとき非凝集性となった株が出現するものの、発酵終了後には凝集塊が沈降し、繰り返し回分発酵が可能であった。また、繰り返し回分発酵の２、３回目には遅延時間が短縮され、発酵３日目で３．８％（Ｗ／Ｖ）のアルコールが生産された。
【００３２】
実施例２
（バイオリアクターによるエタノールの連続発酵試験）
実施例２−▲１▼．
図６に示す形状のように、管体２０全体が円筒状のバイオリアクター１００（仕様：下方部２０ａが容量約７４ｍｌ、中間部２０ｂが内径（直径）４５ｍｍで容量約２８６ｍｌ、上方部２０ｃが容量約６０ｍｌで総容積４２０ｍｌ）（東京理化器械（株）製、特注品）を用いて、次の試験を行った。尚、このバイオリアクター１００には隔壁及び小孔板は設けられていない。
このバイオリアクター１００内に、発酵試験用培地（酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、グルコース１０％、ＮａＣｌが１５％、ｐＨ５．０）１リットルを充填し、上記実施例１と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持せずにそのまま充填し、通気量０．１ｖｖｍ、３０℃で２日間循環発酵させた。その後、同培地を流速１０ｍｌ／ｈｒ〜２５ｍｌ／ｈｒの速さ同バイオリアクター装置に供給して連続発酵させた。
経時的に生産された発酵液をサンプリングし、このアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＡ−９Ａ）により分析し、アルコール生産性を測定した。その結果、菌体の生育と共に凝集塊が増加したが、この増加した菌体塊が１８日目にはバイオリアクターの取出口６に付着し、その取出口６の閉塞が起こり、安定した連続発酵は不可能であった。
【００３３】
実施例２−▲２▼．
次に、上記実施形態で説明したバイオリアクター１を用いて同様に連続発酵試験を行った。すなわち、図１に示す形状のバイオリアクター１（仕様：下方部２ａが容量約７４ｍｌ、中間部２ｂが内径（直径）約４５ｍｍで容量約２８６ｍｌ、上方部２ｃが容量約２７０ｍｌで総容積６３０ｍｌ。隔壁７の内径（直径）７０ｍｍ、各壁７の下端部と取出口６の下端部６ａの高低差Ｈが約２０ｍｍ、隙間の幅約１０ｍｍを作製した。尚、このものには、小孔板５は設けなかった。
そして、これを用いて上記実施例２−▲１▼と同様にして循環発酵及び連続発酵を行ったところ、発酵液と、非凝集菌体及び菌体塊との分離が速やかに行われ、取出口６の閉塞が起きることはなかった。
また、非凝集性となった株は発酵液と共に排出されるものの、菌体塊はリアクター内に保持され、凝集塊の増殖が観察されることから、融合株の安定性の欠如は問題とはならなかった。
【００３４】
実施例２−▲２▼の結果を図７に示す。アルコール生産性は発酵開始後、菌体塊の増殖と共に徐々に向上し、２０日後以降において、約１．４ｇ／リットル・ｈｒ以上（１リットルのリアクター反応槽によって１時間あたり１．４ｇ以上のアルコールが生産されることを意味する）を維持した。このことから、固定化担体を用いなくても安定した連続発酵が可能であることがわかる。このときのエタノール濃度は３．８％（Ｗ／Ｖ）であり、エタノール転換率は７４％であった。
【００３５】
実施例２−▲３▼．
さらに、菌体密度を増加させて連続発酵試験を行った。
すなわち、菌体として、実施例２−▲１▼で得られた菌体塊のみを嵩容量約３０ｍｌ取り出し、これを用いた以外は、実施例２−▲２▼と同様にして循環発酵及び連続発酵を行った。その結果を図８に示す。これにより、エタノール濃度４．１％、転換率８０％に向上させることが可能であった。
【００３６】
実施例２−▲４▼．
さらに、実施例２−▲１▼で得られた菌体塊のみを嵩容量約６０ｍｌ取り出し、実施例２−▲３▼と同じ条件で下方部２ａと中間部２ｂの間及び中間部２ｂと上方部２ｃの間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）をそれぞれ介在させたバイオリアクター１（図１のもの）を用いステンレス製メッシュの影響について検討を行った。その結果を図９に示す。ステンレス製メッシュを介在させることにより、生成エタノール濃度及びアルコール生産性がステンレス製メッシュを介在させないものは１９日間の発酵期間でほとんど上昇していないのに対して，ステンレス製メッシュを介在させたものは速やかに向上することがわかる。これは、ステンレス製メッシュを介在させることで菌体増殖の増加と排出菌体量の減少による、槽内菌体密度の上昇のためだと考えられた（発酵終了後の凝集菌体量はステンレス製メッシュを介在させないもので嵩容量約７０ｍｌ、介在させたもので嵩容量約１２０ｍｌであった）。また、生成エタノール濃度及びアルコール生成速度ともステンレス製メッシュを介在させた方がばらつきが少なく、安定した発酵が可能であった。
【００３７】
実施例３
（バイオリアクターによる超うす口生揚げ醤油の連続発酵試験）
実施例３−▲１▼．
本実施例では、下方部２ａと中間部２ｂの間及び中間部２ｂと上方部２ｃの間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）をそれぞれ介在させた点を除いては、実施例２−▲２▼で用いたバイオリアクター１（図１のもの）と全く同じものを用いた。
このバイオリアクターに、生揚醤油脱色液（全窒素１．４１％、食塩分１７％、直糖分４．５％、アルコール１．６５％、ｐＨ５．１）１リットルを充填し、上記実施例１と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持させずにそのまま充填し、通気量０．１ｖｖｍ、３０℃で２日間循環発酵させた。その後、同生揚醤油脱色液を流速３０〜６０ｍｌ／ｈｒで同バイオリアクターに供給してエタノール濃度が１％増加するように連続発酵させた。
経時的に生産された発酵液をサンプリングし、このアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＣ−９Ａ）により分析し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１０に示す。
アルコール生産性は発酵開始後急速に向上し、１４日後以降約１．１ｇ／ｌ・ｈｒを維持し、固定化担体を用いなくても安定した連続発酵が可能であった。
【００３８】
実施例３−▲２▼．
次に、バイオリアクター１から小孔板５を取り外したバイオリアクター（即ち、実施例２−▲２▼と同じバイオリアクター）を用いた以外は、上記実施例３−▲１▼と同様の試験を行った。その結果を図１０に示す。
【００３９】
実施例３−▲３▼．
実施例３−▲３▼は、従来法で行った。すなわち、実施例３−▲１▼と同じバイオリアクター１に、生体触媒として、市販酵母株を多孔質セラミック担体（岩尾磁器社製、品名：セラミック担体）に担持させた固定化担体を約４００ｍｌ（嵩容量）充填し、以後、実施例３−▲１▼と同様の試験を行った。その結果を図１０に併せて示す。
この固定化担体を用いた従来法では、ＺＲ−２ｆ株に比して、アルコール生産性は約１／２倍であった。また、得られた発酵液は公知の発酵液（品名：超うすくち生揚げ）との官能上の差は全く認められなかった。
【００４０】
実施例４
（バイオリアクターによる超淡口生揚醤油の連続発酵試験）
バイオリアクター（仕様：下方部が容量３０００ｍｌ、中間部が容量３０００ｍｌ、上方部が容量３０００ｍｌで総容積９リットル）（東京理化器械（株）製、品名：ＭＢＲＢ−３０３）を用いて、次の試験を行った。尚、このリアクターには、下方部と中間部の間及び中間部と上方部の間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板）をそれぞれ介在させた。
このバイオリアクターに、上記実施例１と同様にして前培養し，生揚醤油脱色液によって２日間３０℃で静置培養（時々撹拌）することによって馴化したＺＲ−２ｆ株の約２０００ｍｌを、固定化担体に担持させずにそのまま充填し、生揚醤油脱色液９リットルを通気しながら３０℃で２日間培養した。その後、同生揚醤油脱色液を流速９リットル〜２７リットル／日で同バイオリアクターに供給して３０日間連続発酵を行った。
経時的にアルコール濃度を酸化法により測定し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１１に示す。
【００４１】
アルコール生産性は発酵開始後から順調に向上し、最高で１．４ｇ／ｌ・ｈｒを示した。安定した連続発酵が可能であり、１日でバイオリアクター容量の３倍量の発酵液を得ることができた。また官能上、得られた発酵液は従来法で得られるものとの差は見られなかった。
【００４２】
実施例５
（バイオリアクターによる超淡口生揚の連続発酵試験）
図１２に示す形状のような、管体１２０全体が円筒状に形成されたバイオリアクター１１０（仕様：内径（直径）約３００ｍｍ、高さ約1500ｍｍ、総容積１００リットル）（東京理化器械（株）製，特注品）を用いて、次の試験を行った。
尚、このリアクター１２０の内部には、小孔板５よりも大きな目開きの上面開口型の網籠３０が多段（６個）設けられている（直径２８０ｍｍで高さ２１０ｍｍの底面付き円筒。６個のうち、下方から３番目のものは高さ２８０ｍｍ）。さらに、この網籠３０のうち、図示した網籠３０の底面外側に、目開き１．５〜２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）が設けられている。また、このリアクター１１０の供給口３は、被処理液用供給口３ａと空気用供給口３ｂに別けられている。さらに、取出口６は、管体１２０の上方に設けられており、同様に、管体１２０の上方には、空気排気口３１が別途設けられている。尚、隔壁は設けられていない。
このバイオリアクター１１０に、生揚醤油脱色液１００リットルを充填し、上記実施例４と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株の約７０リットルを、固定化担体に担持させずにそのまま充填し、通気量８．０リットル／ｍｉｎ、３０℃で２日間培養した。その後、同生揚醤油脱色液を流速５０リットル〜２００リットル／日で同バイオリアクター１１０に供給して約２２５日間連続発酵を行った。
比較例として、従来法（同バイオリアクター１１０に、生体触媒として市販酵母株を多孔質セラミック担体（岩尾磁器社製、品名：セラミック担体）に担持させた固定化担体を、約７０リットル（嵩容量）充填したもの）により、同様にして約５６日間連続発酵を行った。尚、従来法では、５６日以後は、発酵ができなくなってしまった。
経時的にアルコール濃度を酸化法により測定し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１３に示す。
【００４３】
アルコール生産性は発酵開始後から順調に向上し、１日でバイオリアクター容量の２倍量の発酵液を得ることができた。得られた発酵液は従来法で得られるものとの官能上の差は見られなかった。また、開始から３週間後、運転を約２週間中断し、その後再運転したが、従来法と比較して復帰が早く、復帰後も順調にアルコール生産性が向上し、安定した運転が可能であった。その後も断続的に運転を中断させたが、同様に復帰した。また、凝集性を有することで、漏洩菌の量が減少したために濾過性がよくなり、作業性が向上した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明に係る新規酵母は、自己凝集性が高く、大きな塊状となるため、担体に固定化などしなくても、バイオリアクターなどを用いて効率的な発酵が可能となる。
特に、醤油などの発酵調味料の連続生産に好適である。
また、本発明の新規酵母は、塩類濃度の高い培地においても高効率で発酵処理ができるので、種々の被処理液を用いて発酵処理を行うことができる。
さらに、本発明のバイオリアクターは、比較的簡易な構造で、処理液と生体触媒とを分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のバイオリアクターの一実施形態を示す縦断面図。
【図２】図１のＡ−Ａ線断面図。
【図３】バイオリアクターの固液分離部（上方部）を示す参考斜視図。
【図４】供試菌株の沈降速度を示すグラフ。
【図５】実施例１の回分発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図６】従来のバイオリアクターを示す縦断面図。
【図７】実施例２−▲２▼の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図８】実施例２−▲３▼の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図９】実施例２−▲４▼の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図１０】実施例３の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図１１】実施例４の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図１２】実施例５で用いた本発明のバイオリアクターを示す縦断面参考図。
【図１３】実施例５の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【符号の説明】
１…バイオリアクター、２…管体、２ａ…下方部、２ｂ…中間部、２ｃ…上方部、５…小孔板、６…取出口、７…隔壁、８…通過口、１１…隙間[0001]
[Industrial application fields]
The present invention is a novel yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces that has a cell mass formation ability and can be fermented with high efficiency even in a medium with a high salt concentration, for example, and a method for producing a fermented seasoning using the yeast strain The present invention relates to a fluidized bed type bioreactor.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
Yeast has been used for various productions such as the production of alcohol such as Japanese sake, the production of fermented seasonings such as soy sauce, and the fermentation of bread.
For example, soy sauce brewing is made by mixing cooked whole soybeans or processed defatted soybeans with roasted wheat, inoculating seed koji and making koji, and then adding salt to create flavors, fermenting and aging Later, soy sauce is produced by pressing this moromi (honjozo).
However, since it takes about 6 months to ferment and ripen moromi, the fermentation and ripening period occupies most of the production process. Therefore, if the fermentation / ripening period can be shortened, the production cost can be greatly reduced in soy sauce production.
[0003]
Therefore, studies have been made to efficiently perform the fermentation process using yeast by a bioreactor.
In general, in a fermentation process using a bioreactor, a method in which a biocatalyst is immobilized is used.
[0004]
As a method for immobilizing a biocatalyst, a binding method for supporting on an insoluble carrier, a cross-linking method for binding biocatalysts to each other, a comprehensive method for wrapping inside a polymer gel, a composite method of these, and the like are known.
However, in these methods, the biocatalyst is immobilized such as purchase of an immobilization carrier, sterilization of the immobilization carrier, immobilization process of the biocatalyst, maintenance of the immobilization carrier, and disposal / treatment of the immobilization carrier. The above cost is required.
Also, in the production of fermented foods and the continuous production of alcohol that require immobilization of living cells (proliferating cells), it is due to cell growth or the disintegration of an immobilization carrier such as a polymer gel due to chemical components in the raw material liquid. In general, the carrier binding method (physical adsorption) to porous inorganic materials is used because of problems such as clogging. However, when porous inorganic materials such as porous ceramics are used as immobilized carriers Has a small amount of cells to be immobilized and has problems such as an increase in fermentation rate and resistance to microbial contamination.
[0005]
On the other hand, in the method using aggregating yeast that allows easy separation and recovery of bacterial cells, the yeast cell immobilization step and the separation step between the yeast cells and the fermentation broth can be omitted. The system is simplified, and low-cost and efficient fermentation production is possible.
[0006]
The aggregating yeast strains reported so far are yeasts belonging to Saccharomyces cerevisiae, and these are bred mainly by cell fusion technology and gene recombination technology.
However, these strains improved from Saccharomyces cerevisiae have low osmotic pressure resistance (including salt tolerance), so although raw materials with low salt and sugar concentration can be used as fermentation raw materials, molasses (eg, potassium, magnesium) When using as a raw material high-concentration salts such as sodium and other salts such as sodium), saccharide hydrolysates, and liquids containing saccharides, it is necessary to dilute the raw materials. This leads to an increase in the amount of waste liquid treated after completion of fermentation / distillation, which contributes to an increase in industrial production costs.
[0007]
In addition, in industrial ethanol production by fermentation methods, inexpensive fermentation raw materials such as molasses are used, and batch fermentation methods and continuous fermentation methods such as the yeast circulation method and the immobilized yeast method have been developed. However, since the conventional technique maintains yeast cells at a high density, the apparatus and process are complicated, and the cost of maintenance is high.
[0008]
This invention makes it a subject to provide the manufacturing method of the fermented seasoning using the novel yeast which does not use an immobilization support | carrier, and has high osmotic pressure tolerance in view of the above points.
Furthermore, this invention makes it a subject to provide the bioreactor apparatus which can process a continuous fermentation etc. with a comparatively simple structure.
[0009]
[Means to solve the problem]
Yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces used for soy sauce brewing has high osmotic pressure resistance, for example, it grows and ferments in the presence of 2.5M sodium chloride and / or 50% (W / W) glucose medium. It can be performed.
And when the present inventors screened yeast from soy sauce moromi containing yeast of the genus Tigosaccharomyces, a novel soy sauce main fermenting yeast strain (Tigo Saccharomyces ruxii R-2 strain having a predetermined cell mass formation ability ( Zygosaccharomyces rouxii R-2 strain) was named: Seikoku Kenkyu No. 18251 [FERM P-18251]).
The cell mass formed by this strain was hard and did not collapse even by shearing force by aeration stirring, and the cell mass formation ability (including aggregation ability and adhesion ability) was superior to commercially available yeast. However, the cell mass was relatively small, and sedimentation was not always sufficient when assumed to be used in a bioreactor.
Therefore, as a result of further earnest research, the present inventors obtained an excellent yeast that has high pressure resistance and can form a larger cell mass by cell fusion of this strain and soy sauce main fermentation yeast. Completed the invention.
[0010]
That is, the present invention is a novel yeast belonging to Zygosaccharomyces having a cell mass formation ability (including agglutination ability and adhesion ability).
Issue [FERM P-18252]).
Furthermore, the present invention provides a method for producing a fermented seasoning such as soy sauce using the novel yeast.
[0011]
Further, the present invention is provided with water flow generating means for generating a water flow from the lower side to the upper side of the tube body 2, and the outlet 6 from which the processing liquid processed by the biocatalyst is taken out above the tube body 2. And a bioreactor in which the biocatalyst flows by the water flow generating means to process the liquid to be processed, and a cylindrical partition wall 7 is provided in the inner periphery of the pipe body 2 above the pipe body 2. Provided is a bioreactor that is provided at a distance from the surface and in which the lower end of the partition wall 7 extends below the outlet 6.
Further, the present invention provides the bioreactor in which a passage port 8 through which a treatment liquid can pass is formed at a position that is a peripheral wall of the partition wall 7 and is not opposed to the outlet 6.
Furthermore, the present invention is provided with water flow generating means for generating a water flow from the lower side to the upper side of the tube body 2, and the outlet 6 from which the processing liquid processed by the biocatalyst is taken out above the tube body 2. And a bioreactor in which the biocatalyst flows by the water flow generating means to process the liquid to be processed, and a small hole plate 5 that divides the inside of the pipe body 2 is provided in the vertical direction. A multi-stage bioreactor is provided.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
As described above, the novel yeast of the present invention is a yeast strain having a cell mass formation ability (Zygosaccharomyces rouxii R-2 strain) from soy sauce moromi containing yeast of the genus Tigosaccharomyces: Biotechnological No. 18251 [FERM P-18251] (hereinafter sometimes referred to as “R-2 strain”), and this strain and a commercially available strain of Zygosaccharomyces rouxii (Zygosaccharomyces rouxii) (Hereinafter may be abbreviated as “commercial yeast strain”) by cell fusion.
[0013]
In cell fusion, the parent strain is usually subjected to a mutation treatment and labeled with genetic properties, but it is preferable not to perform the labeling treatment from the viewpoint that the excellent properties of yeast are not impaired. As the cell fusion method, a known method can be adopted, but the high voltage pulse cell fusion method is preferable from the viewpoint of high fusion efficiency. After culturing the obtained fused strain a plurality of times, a strain suitable for the novel yeast of the present invention, particularly the soy sauce main fermentation yeast, can be obtained by selecting a strain capable of forming a larger cell mass.
This new yeast strain was named Zigogosaccharomyces rouxii ZR-2f (hereinafter sometimes abbreviated as “ZR-2f”), and this was researched by the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Biotechnological Bacteria No. 18252 [FERM
P-18252].
[0014]
The bacteriological properties of this Tigosaccharomyces luxi ZR-2f strain (FERM P-18252) and its parent strains (commercial yeast strain and R-2 strain) were examined under experimental agricultural chemistry, 3rd edition (Faculty of Agriculture, Faculty of Agriculture, University of Tokyo) By the author, published by Asakura Shoten Co., Ltd.), it is as follows.
[ZR-2f strain]
(A) Cell morphology when cultured for 2 days at 30 ° C. using a YPD medium containing 15% NaCl:
(1) Size of vegetative cells: 4 to 8 μm.
(2) Morphological cell morphology: egg shape.
(3) Form of growth: budding.
(B) Colony morphology when cultured on a YPD agar medium containing 15% NaCl at 30 ° C. for 4 days:
(1) Form: Circle.
(2) Uplift: Head shape.
(3) Perimeter: Smooth.
(4) Size: 1-3 mm.
(5) Color tone: White and opaque.
(6) Surface: Smooth and semi-glossy.
(C) Carbon source assimilation: glucose, galactose, sucrose, maltose, cellobiose, soluble starch, sorbitol, methanol, fructose, mannose, mannitol and dextrin are assimilated to ferment glucose and maltose. α-methyl glycoside, trehalose, lactose, melibiose, raffinose, inulin, sodium citrate, ethanol, xylose are not assimilated.
(D) Salt tolerance: Can grow on YPD medium containing 25% NaCl.
[Commercial yeast strain]
(A) Cell morphology when cultured for 2 days at 30 ° C. using a YPD medium containing 15% NaCl:
(1) Size of vegetative cells: 4 to 8 μm.
(2) Morphological cell morphology: egg shape.
(3) Form of growth: budding.
(B) Colony morphology when cultured on a YPD agar medium containing 15% NaCl at 30 ° C. for 4 days:
(1) Form: Circle.
(2) Uplift: Head shape.
(3) Perimeter: Smooth.
(4) Size: 1-3 mm.
(5) Color tone: White and opaque.
(6) Surface: Smooth and glossy.
(C) Carbon source assimilation: glucose, galactose, sucrose, maltose, cellobiose, soluble starch, sorbitol, methanol, fructose, mannose, mannitol and dextrin are assimilated to ferment glucose and maltose. α-methylglucoside, trehalose, lactose, melibiose, raffinose, inulin, sodium citrate, ethanol and xylose are not assimilated.
(D) Salt tolerance: Although it can grow on a YPD medium containing 25% NaCl, it takes time.
[R-2 stock]
(A) Cell morphology when cultured for 2 days at 30 ° C. using a YPD medium containing 15% NaCl:
(1) Size of vegetative cells: 4 to 8 μm.
(2) Morphological cell morphology: egg shape.
(3) Form of growth: budding.
(B) Colony morphology when cultured on a YPD agar medium containing 15% NaCl at 30 ° C. for 4 days:
(1) Form: Circle.
(2) Uplift: Head shape.
(3) Perimeter: Smooth.
(4) Size: 1-3 mm.
(5) Color tone: White and opaque.
(6) Surface: Smooth and semi-glossy.
(C) Carbon source assimilation: glucose, galactose, sucrose, maltose, cellobiose, soluble starch, sorbitol, methanol, fructose, mannose, mannitol and dextrin are assimilated to ferment glucose and maltose. α-methylglucoside, trehalose, lactose, melibiose, raffinose, inulin, sodium citrate, ethanol and xylose are not assimilated.
(D) Salt tolerance: Can grow on YPD medium containing 25% NaCl.
[0015]
Since the novel yeast of the present invention itself becomes a large lump, since the yeast cell immobilization process and the separation of the yeast cell and the treatment liquid (fermented liquid) can be easily performed, in particular, soy sauce, mirin, etc. It can be suitably used in a fluidized bed bioreactor in the production of fermented seasonings, the production of alcohols such as sake, shochu and wine, and the production of bacterial cells during sugar nucleotide production. Furthermore, since fermentation can be performed even in a relatively high salt concentration environment, various treatment liquids can be subjected to fermentation treatment.
The novel yeast of the present invention can also be used for fermentation of bread, miso and the like.
[0016]
The novel yeast of the present invention is used by culturing the yeast, and it can be used for any system of a batch fermentation system in which the whole liquid is replaced after the fermentation process, or a continuous fermentation system in which the liquid to be treated is continuously supplied to perform the fermentation process. In particular, it can be suitably used for a continuous fermentation system.
[0017]
As the bioreactor used in the continuous fermentation system, a conventionally known bioreactor may be used, but in the present invention, the following fluidized bed bioreactor is preferably used.
Specifically, as shown in FIGS. 1 and 2, the bioreactor 1 includes, for example, a lower part 2a (introduction part 2a), an intermediate part 2b (biological treatment part 2b), and an upper part 2c (solid-liquid separation part 2c). ) A plurality of cylindrical members 2, a supply port 3 provided in a lower portion 2 a of the tube 2, and a small hole plate 5 for partition provided in an intermediate portion 2 b of the tube 2. And an outlet 6 provided in the upper part 2c of the tube body 2 and a cylindrical partition wall 7 provided in the upper part 2c of the tube body 2 and in the center of the upper part 2c. .
[0018]
The tubular body 2 is made of a known material having impact resistance such as, for example, impact resistant glass, metal such as stainless steel, and is formed in an appropriate size according to the processing amount of the liquid to be processed.
As shown in FIG. 1, the tubular body 2 may have a configuration in which a plurality of cylindrical members of the lower portion 2 a, the intermediate portion 2 b, and the upper portion 2 c are connected, or may be configured by an integral cylindrical member. .
The supply port 3 is formed in the bottom surface of the lower part 2a of the tube body 2, for example. A supply path (not shown) for supplying air and liquid to be processed is attached to the supply port 3 so that air and liquid to be processed are supplied from the supply port 3 to the inside of the tube body 2. (Arrow in FIG. 1).
The supply port 3 may be formed in the peripheral wall of the lower portion 2a, or two or more supply ports 3 may be provided to supply air and the liquid to be processed separately.
[0019]
The small hole plate 5 has a hole having a size through which the liquid to be treated filled in the tube body 2 and all or a part of the biocatalyst (for example, the cell mass according to the yeast of the present invention) can pass. The member is not particularly limited as long as it is a member having, for example, a mesh plate (for example, a metal net-like plate) having a size of 1.5 to 3 mm, more preferably 2 to 2.5 mm.
By providing the small hole plate 5, a concentration gradient of the biocatalyst and / or a concentration gradient of the product in the tube body 2 can be formed. Further, by providing the small hole plate 5, fluid convection is generated in each region partitioned by the small hole plate 5 (indicated by arrows in FIG. 1). One small hole plate 5 may be used, but it is preferable that the small hole plate 5 is provided in multiple stages in the vertical direction in order to form a good concentration gradient.
Specifically, as shown in FIG. 1, two mesh plates 5 having a mesh size of 2 mm are provided at predetermined intervals.
[0020]
The outlet 6 is provided in the middle portion of the peripheral wall of the upper portion 2c of the tube body 2, and the processing liquid after processing is taken out from the outlet 6.
A cap 15 is fitted to the outlet 6, and a discharge pipe 16 is provided at the center. In this embodiment, the pipe 16 substantially serves as the outlet 6 and the processing liquid and air are discharged from the pipe 16 (arrows in FIG. 1).
In this way, the air supplied from below is discharged upward (by the air flow), so that a water flow is generated in the pipe body 2 from below to above (to the water flow generating means). Equivalent to).
The water flow generating means is not limited to the configuration by supplying and discharging air, and for example, a configuration in which a rotating blade is provided in the tube body 2 and rotated to generate a water flow may be used.
[0021]
Next, the partition wall 7 is formed of, for example, a cylindrical body formed integrally with the tube body 2, and an upper end portion of the partition wall 7 is connected to the tube body 2. On the other hand, the lower end portion of the partition wall 7 is a free end, and extends downward from the lower end portion 6a of the outlet 6 as shown in FIG.
The partition wall 7 has the same opening as the intermediate part 2b or an opening larger than the intermediate part 2b in order to receive the water flow rising from the intermediate part 2b. As shown in FIG. It arrange | positions so that the opening part 14 of the part 2b may be surrounded (when it sees from a plane, it arrange | positions so that the intermediate part 2b may be enclosed by the partition 7). With this configuration, most of the fluid (treatment liquid and biocatalyst) rising from the intermediate portion 2 b is first concentrated inside the partition wall 7.
Further, the partition wall 7 is disposed with an interval (gap 11) at which the outer peripheral surface thereof flows with respect to the inner peripheral surface of the tube body 2.
[0022]
Further, in the partition wall 7, a passage port 8 through which at least the treatment liquid can pass is formed at a position that does not face the outlet 6 (which means that the partition wall 7 is not a position facing the straight direction). Examples of the passage port 8 include a notch portion 8 where a part of the passage port 8 is located below or at substantially the same height as the lower end of the outlet 6 as shown in the figure. A collection of a plurality of small holes may be configured as the passage port 8.
As shown in the drawing, the non-opposing position where the passage port 8 is formed is preferably a position opposite to the outlet 6 (rotated 180 degrees horizontally), but is perpendicular to the outlet (shown as B in FIG. 2). It may be. Moreover, although it is sufficient if the passage port 8 is formed at one place in the opposite position, it may be formed at a plurality of places.
[0023]
Reference numeral 10 denotes an operation port that communicates with the inside of the tube body 2 and is provided inside the partition wall 7. Reference numeral 11 denotes a cap that closes the operation port. Reference numeral 12 denotes a passage through which hot water or the like is passed in order to maintain the temperature in the tube body 2.
Further, a watertight packing is provided between the respective parts such as the lower part 2a, the intermediate part 2b and the upper part 2c of the tubular body 2.
[0024]
The bioreactor 1 is filled with a liquid to be treated such as (waste) molasses and a biocatalyst such as ZR-2f strain inside, and by supplying air, the biocatalyst flows to ferment the liquid to be treated. Then, biological treatment such as decomposition and generation is performed, and the obtained treatment liquid is discharged from the outlet 6.
At this time, as shown in FIGS. 1 to 3 (indicated by arrows of the fluid flow), the bioreactor 1 of the present invention allows the biocatalyst and the treated treatment liquid to be placed above the tubular body 2 by the water flow generating means. It rises to the part 2c.
The rising processing liquid and biocatalyst flow inside the partition wall 7, and the processing liquid and a part of the biocatalyst flow out to the outside of the partition wall 7 through the passage port 8, and between the partition wall 7 and the tubular body 2 (gap 11). ) Through the outlet 6 side. Since the gap 11 is not easily affected by the upward water flow by the water flow generating means due to the presence of the partition wall 7, the biocatalyst descends due to its own weight while passing through the gap 11, and almost only the treatment liquid is present. Move to the outlet 6. Therefore, the treatment liquid and the biocatalyst can be easily separated.
[0025]
As the liquid to be treated, known ones such as (waste) molasses and saccharide hydrolysates can be used.
In addition, the biocatalyst is not limited to the novel yeast (ZR-2f strain) of the present invention, but is known flocculent yeast, cells and enzymes immobilized on a carrier, cells and enzymes included in a gel, and the like. A conventionally well-known thing can also be used.
[0026]
【Example】
Hereinafter, selection of a fusion strain excellent in cell fusion and cell mass formation ability, batch fermentation and continuous fermentation test of the selected fusion strain will be specifically described.
However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples. In the description of the bioreactor and the like, those having the same names as those in the above embodiment are the same as those in the above embodiment unless otherwise specified.
Preparation Preparation <br/> protoplasts Protoplasts are basically Noda et al method was carried out in accordance with (Agr.Biol.Chem., 54, pp. 2023 (1990)).
That is, a cell mass-forming yeast Tigosaccharomyces ruxii R-2 that quickly settles from the fermentation liquid discharged from a conventional bioreactor (using a porous ceramic carrier on which a commercially available yeast strain is supported) Shake the yeast strain Tigosaccharomyces luxi (Bioc, product name: soy sauce main fermenting yeast) in 10 ml of known YPD medium each containing 10% NaCl at 30 ° C. to the early stationary phase (1 × 10 ⁸ cells / ml) After culturing, the obtained cells were washed with sterilized 10% saline. Subsequently, it was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1.2 M sorbitol, 5 mM EDTA, and 0.5% mercaptoethanol. To this cell suspension, a zymolyce solution (manufactured by Seikagaku Corporation) was added to a final concentration of 1 mg / ml and treated at 30 ° C. for 90 minutes to produce a protoplast. The protoplasts were collected by centrifugation (1,200 × g), washed 3 times with 1.2 M sorbitol solution and suspended at a concentration of 5 × 10 ⁷ protoplasts / ml.
[0027]
Cell fusion Cell fusion was performed by a high voltage pulse cell fusion method (electric cell fusion method).
That is, a cell fusion device (manufactured by Shimadzu Corporation, product name: SSH-10) was used, and fusion conditions were as follows: electrode spacing 1 mm, AC frequency 1 MHz, AC initial applied voltage 40 V, pulse width 500 μS, pulse voltage 450 V ( The electric field intensity was 4.5 kV / cm), and the AC secondary applied voltage was 40 V. The protoplast suspension after the application treatment was incubated at 30 ° C. for 30 minutes, and this was stored in an SD plate (minimum medium: 0.67% yeast nitrogen base, no amino acid, 2% glucose, 1.2 M sorbitol, The protoplasts were regenerated by applying 0.1 ml to 2% agar) and culturing at 25 ° C. for 3 to 7 days. Next, the regenerated cells are placed in 10 ml of YPD liquid medium (pH 5.0) containing 15% NaCl, and 5 ml of the medium is added to the surface of the SD plate, and then the grown colonies (cells) are dispersed. 0.5 ml of the cells were inoculated and subjected to shaking culture at 30 ° C. until a stationary phase was reached (2 to 3 days). This culture solution is allowed to stand for 5 minutes, then the floating cells are removed, and 10 ml of a new YPD medium containing 15% NaCl is added thereto, followed by further shaking culture at 30 ° C. until reaching the stationary phase. It was. This operation was repeated 5 to 9 times to concentrate strains having improved cell mass formation ability. Thereafter, the settled cells were washed three times with sterilized 15% saline, and then applied to a YPD plate containing 15% NaCl (applying 0.1 ml of a 1000-fold diluted suspension), Growing colonies were obtained. Furthermore, these colonies were inoculated into 10 ml of YPD liquid medium (pH 5.0) containing 15% NaCl (inoculate one colony), and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days. The colony having (ZR-2f strain) was selected.
[0028]
Evaluation of the cell mass sedimentation rate The cell mass sedimentation rate was evaluated by the rate of decrease in turbidity (OD660 nm) by a spectrophotometer (product name: SPECTORONIC 20 manufactured by MILTONROY).
The test strain is inoculated into 10 ml of YPD medium containing 15% NaCl (inoculated with 0.5 ml as a bulk of aggregated cells), and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours. This is vortex mixer (manufactured by iuchi). , Product name: AUTOMATIC LABO.MIXER), and after stirring for 10 seconds, the change in absorbance at 660 nm was measured over time. The result is shown in FIG.
In addition, the test strain used three types, the commercially available yeast strain, R-2 strain, and the colony (ZR-2f strain) obtained by the said cell fusion.
[0029]
In the commercial yeast strain, no change was observed in the absorbance at 660 nm, and a slight change was observed in the R-2 strain, whereas the absorbance at 660 nm rapidly decreased in the ZR-2f strain. From this, it was found that the cell mass of ZR-2f strain settles quickly.
Moreover, visually, the ZR-2f strain formed a bacterial mass having a diameter of about 0.5 to 3 mm.
In order to clarify the cell mass formation effect of this ZR-2f strain, R-2 strain, ZR-2f strain, and commercially available yeast strain were taken in a test tube having a diameter of 18 mm, and the appearance of those cell masses was shown in Reference Photo 1. Shown in
As is clear from Reference Photo 1, the ZR-2f strain formed a much larger cell mass than the R-2 strain.
In the R-2 strain, although it was relatively small, the formation of cell mass was clearly observed in the photograph of the bottom of the test tube.
On the other hand, in the commercially available yeast strain, the formation of the cell mass was not recognized at all in the photograph of the side surface portion of the test tube and the photograph of the bottom surface portion of the test tube.
As a result, it was found that the ZR-2f strain has a very characteristic cell mass formation ability, and the R-2 strain has at least a cell mass formation ability that can be clearly distinguished from a commercially available yeast strain.
[0030]
Pulse field electrophoresis Next, 0.5 ml of each test strain was shaken and cultured in 10 ml of YPD medium containing 15% NaCl at 30 ° C. for 48 hours. Bacteria were collected and washed before use. Sample preparation was carried out in an agarose gel and the gel block was adjusted to prevent fragmentation of chromosomal DNA. As the gel, 1% agarose (Pulsed Field Centrified Agarose manufactured by Bio-Rad) gel was used, and 0.5 × TBE buffer (pH 8.0) was used for electrophoresis. For electrophoresis, CHEF-DR III System manufactured by Bio-Rad was used, electrophoresis voltage 6 V / cm, pulse interval (start: INT) 60 to (end: FIN) 120 seconds, pulse angle 120 degrees, electrophoresis time 22 hours, bath The internal temperature was 14 ° C.
The band after electrophoresis is shown in Reference Photo 2. As is clear from Reference Photo 2, the R-2 strain, the ZR-2f strain, and the commercially available yeast strain had almost the same chromosome separation pattern. However, in the R-2 and ZR-2f strains, chromosomal DNA was observed at a position of about 800 kb, which was not observed in the commercially available yeast strain.
From this, although it was confirmed that the ZR-2f strain and the R-2 strain are the same strains, they are clearly different from the commercially available yeast strains.
[0031]
Example 1
(Batch fermentation test with jar fermenter)
As a pre-culture, 20 ml of the ZR-2f strain obtained by the cell fusion was cultured with shaking in 500 ml of YPD medium containing 15% NaCl at 30 ° C. for 48 hours.
Thereafter, the medium for fermentation test (yeast) was left as it was without being supported on an immobilization carrier, and about 50 ml of the ZR-2f strain obtained by removing the cells that did not settle together with the culture solution by standing for 10 minutes. To a jar fermenter (product name: MINI FERMENTOR M-100, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) containing 1 liter of extract 0.5%, polypeptone 1%, glucose 10%, NaCl 15%, pH 5.0) The mixture was filled and fermented at 30 ° C., and the alcohol concentration was measured over time by a gas chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation, product name: GC-9A). The result is shown in FIG.
Although the first fermentation had a slightly longer delay time, the fermentation proceeded smoothly, and 3.7% (W / V) of alcohol was produced on the fifth day of fermentation. At this time, although a strain that became non-aggregating appeared, aggregates settled after the end of fermentation, and repeated batch fermentation was possible. In addition, the delay time was shortened in the second and third batch fermentations, and 3.8% (W / V) alcohol was produced on the third fermentation day.
[0032]
Example 2
(Ethanol continuous fermentation test using bioreactor)
Example 2- (1).
As shown in FIG. 6, the entire tubular body 20 is a cylindrical bioreactor 100 (specifications: the lower part 20a has a capacity of about 74 ml, the intermediate part 20b has an inner diameter (diameter) of 45 mm and a capacity of about 286 ml, and the upper part 20c has a capacity. The following test was performed using about 60 ml (total volume 420 ml) (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd., special order product). The bioreactor 100 is not provided with a partition wall and a small hole plate.
The bioreactor 100 was filled with 1 liter of a fermentation test medium (yeast extract 0.5%, polypeptone 1%, glucose 10%, NaCl 15%, pH 5.0), and the same as in Example 1 above. About 50 ml of the pre-cultured ZR-2f strain was filled as it was without being supported on an immobilization carrier, and subjected to circulation fermentation at 30 ° C. for 2 days with an aeration rate of 0.1 vvm. Thereafter, the same medium was supplied to the bioreactor apparatus at a flow rate of 10 ml / hr to 25 ml / hr for continuous fermentation.
The fermentation broth produced over time was sampled, and the alcohol concentration was analyzed by a gas chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation, product name: GA-9A) to measure alcohol productivity. As a result, the agglomerate increased with the growth of the bacterial cells, but this increased bacterial mass adhered to the outlet 6 of the bioreactor on the 18th day, and the outlet 6 was clogged, resulting in stable continuous fermentation. Was impossible.
[0033]
Example 2- (2).
Next, a continuous fermentation test was similarly performed using the bioreactor 1 described in the above embodiment. That is, the bioreactor 1 having the shape shown in FIG. 1 (specifications: the lower part 2a has a capacity of about 74 ml, the intermediate part 2b has an inner diameter (diameter) of about 45 mm and a capacity of about 286 ml, the upper part 2c has a capacity of about 270 ml and a total volume of 630 ml. 7 has an inner diameter (diameter) of 70 mm, a height difference H of the lower end portion of each wall 7 and the lower end portion 6a of the outlet 6 is about 20 mm, and the gap width is about 10 mm. Was not provided.
Then, using this, circulation fermentation and continuous fermentation were carried out in the same manner as in Example 2- (1) above. As a result, the fermentation broth was rapidly separated from the non-aggregated bacterial cells and the bacterial cell mass. The outlet 6 was not blocked.
In addition, although the non-aggregating strain is discharged together with the fermentation broth, the bacterial mass is retained in the reactor and the growth of the aggregate is observed, so the lack of stability of the fused strain is a problem did not become.
[0034]
The results of Example 2- (2) are shown in FIG. Alcohol productivity gradually improves with the growth of the cell mass after the start of fermentation, and after 20 days, about 1.4 g / liter · hr or more (1.4 g or more alcohol per hour by 1 liter reactor reaction tank) Means that will be produced). This shows that stable continuous fermentation is possible without using an immobilization support. The ethanol concentration at this time was 3.8% (W / V), and the ethanol conversion rate was 74%.
[0035]
Example 2- <3>.
Furthermore, the continuous fermentation test was conducted by increasing the cell density.
That is, as the microbial cells, only about 30 ml of the bulk capacity obtained in Example 2- (1) was taken out, and this was used. Fermentation was performed. The result is shown in FIG. As a result, it was possible to improve the ethanol concentration to 4.1% and the conversion rate to 80%.
[0036]
Example 2- (4).
Further, only about 60 ml of the bulk capacity obtained in Example 2- (1) was taken out, and between the lower part 2a and the intermediate part 2b, and between the intermediate part 2b and the upper part under the same conditions as in Example 2- (3). The influence of the stainless steel mesh was examined using the bioreactor 1 (the one shown in FIG. 1) in which the stainless steel mesh (small hole plate 5) having a mesh size of 2 mm was interposed between the flanges between the portions 2c. The result is shown in FIG. By interposing a stainless steel mesh, the product ethanol concentration and alcohol productivity that did not intervene with the stainless steel mesh hardly increased during the fermentation period of 19 days, whereas those with the stainless steel mesh intervened. It turns out that it improves rapidly. This was thought to be due to the increase in cell growth and decrease in the amount of discharged cells by interposing a stainless steel mesh (the amount of aggregated cells after fermentation was The bulk capacity was about 70 ml without intervening mesh, and the intermediary volume was about 120 ml). In addition, the production ethanol concentration and the alcohol production rate were less varied when stainless steel mesh was interposed, and stable fermentation was possible.
[0037]
Example 3
(Continuous fermentation test of ultra-low-mouthed deep-fried soy sauce by bioreactor)
Example 3- (1).
In this embodiment, except that stainless steel mesh (small hole plate 5) having a mesh opening of 2 mm is interposed between the flanges between the lower part 2a and the intermediate part 2b and between the intermediate part 2b and the upper part 2c, respectively. The same bioreactor 1 (in FIG. 1) used in Example 2- (2) was used.
This bioreactor was charged with 1 liter of raw soy sauce decolorization solution (total nitrogen 1.41%, salt content 17%, straight sugar content 4.5%, alcohol 1.65%, pH 5.1), and Similarly, about 50 ml of the pre-cultured ZR-2f strain was filled as it was without being supported on an immobilization carrier, and circulating fermentation was performed at 30 ° C. for 2 days with an aeration rate of 0.1 vvm. Thereafter, the same-colored soy sauce decolorization solution was supplied to the bioreactor at a flow rate of 30 to 60 ml / hr and continuously fermented so that the ethanol concentration increased by 1%.
The fermentation broth produced over time was sampled, and the alcohol concentration was analyzed by a gas chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation, product name: GC-9A) to measure alcohol productivity. The result is shown in FIG.
Alcohol productivity improved rapidly after the start of fermentation, maintained about 1.1 g / l · hr after 14 days, and stable continuous fermentation was possible without using an immobilized carrier.
[0038]
Example 3- (2).
Next, the same test as in Example 3- (1) was performed except that a bioreactor in which the small hole plate 5 was removed from the bioreactor 1 (that is, the same bioreactor as Example 2- (2)) was used. went. The result is shown in FIG.
[0039]
Example 3- (3).
Example 3- (3) was performed by a conventional method. That is, about 400 ml of an immobilized carrier in which a commercially available yeast strain was supported on a porous ceramic carrier (product name: ceramic carrier, manufactured by Iwao Porcelain Co., Ltd.) as a biocatalyst in the same bioreactor 1 as in Example 3- (1) Thereafter, the same test as in Example 3- (1) was conducted. The results are also shown in FIG.
In the conventional method using this immobilized carrier, the alcohol productivity was about ½ times that of the ZR-2f strain. In addition, the obtained fermented broth showed no sensory difference from a known fermented broth (product name: ultra-thin fried).
[0040]
Example 4
(Continuous fermentation test of ultra-fresh raw soy sauce by bioreactor)
Using the bioreactor (specification: the lower part has a capacity of 3000 ml, the middle part has a capacity of 3000 ml, the upper part has a capacity of 3000 ml and has a total volume of 9 liters) (product name: MBRB-303, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) Went. In this reactor, stainless steel meshes (small hole plates) having a mesh size of 2 mm were interposed between the flanges between the lower part and the intermediate part and between the intermediate part and the upper part, respectively.
In this bioreactor, about 2000 ml of the ZR-2f strain that had been pre-cultured in the same manner as in Example 1 and conditioned by standing at 30 ° C. for 2 days with fresh soy sauce decolorizing solution (sometimes stirred) was immobilized. The sample was filled as it was without being supported on a carrier, and cultured for 2 days at 30 ° C. with aeration of 9 liters of fresh soy sauce decolorizing solution. Thereafter, the same-colored soy sauce decolorizing solution was supplied to the bioreactor at a flow rate of 9 liters to 27 liters / day, and continuous fermentation was performed for 30 days.
The alcohol concentration was measured over time by an oxidation method, and alcohol productivity was measured. The result is shown in FIG.
[0041]
Alcohol productivity improved steadily after the start of fermentation, showing a maximum of 1.4 g / l · hr. Stable continuous fermentation was possible, and a fermented liquid of 3 times the volume of the bioreactor could be obtained in one day. Moreover, functionally, the obtained fermentation broth did not show a difference from that obtained by the conventional method.
[0042]
Example 5
(Continuous fermentation test of ultra-fresh mouth raising by bioreactor)
A bioreactor 110 having a cylindrical shape as a whole shown in FIG. 12 (specifications: inner diameter (diameter) of about 300 mm, height of about 1500 mm, total volume of 100 liters) (Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) The following test was conducted using a specially manufactured product.
The reactor 120 is provided with a plurality of (six) upper surface opening type mesh rods 30 having openings larger than the small hole plate 5 (a cylinder with a bottom surface having a diameter of 280 mm and a height of 210 mm. 6 The third one from the bottom is 280mm in height). Further, a stainless mesh (small hole plate 5) having a mesh size of 1.5 to 2 mm is provided on the outer side of the bottom surface of the mesh cage 30 shown in the mesh mesh 30. Further, the supply port 3 of the reactor 110 is divided into a liquid supply port 3a to be processed and an air supply port 3b. Further, the outlet 6 is provided above the tube body 120, and similarly, an air exhaust port 31 is separately provided above the tube body 120. In addition, the partition is not provided.
The bioreactor 110 was filled with 100 liters of fresh soy sauce decolorizing solution, and about 70 liters of the ZR-2f strain pre-cultured in the same manner as in Example 4 was filled as it was without being supported on the immobilization carrier, and aerated. The amount was 8.0 liters / min and cultured at 30 ° C. for 2 days. Thereafter, the same-colored soy sauce decolorizing solution was supplied to the bioreactor 110 at a flow rate of 50 liters to 200 liters / day, and continuous fermentation was performed for about 225 days.
As a comparative example, about 70 liters (bulk capacity) of a conventional method (in the same bioreactor 110, a commercially available yeast strain as a biocatalyst supported on a porous ceramic carrier (product name: ceramic carrier). In the same manner, continuous fermentation was performed for about 56 days. In the conventional method, fermentation could not be performed after 56 days.
The alcohol concentration was measured over time by an oxidation method, and alcohol productivity was measured. The result is shown in FIG.
[0043]
Alcohol productivity improved steadily after the start of fermentation, and a fermented liquor twice the volume of the bioreactor could be obtained in one day. The obtained fermented liquor did not show a difference in functionality from that obtained by the conventional method. In addition, after 3 weeks from the start, the operation was interrupted for about 2 weeks and then restarted. However, the recovery was quicker than the conventional method, and the alcohol productivity improved steadily after the return and stable operation was possible. there were. After that, the operation was interrupted intermittently, but it returned in the same way. Moreover, since it has aggregability, the amount of leaking bacteria was reduced, so the filterability was improved and the workability was improved.
[0044]
【The invention's effect】
Since the novel yeast according to the present invention has a high self-aggregation property and becomes a large lump, efficient fermentation using a bioreactor or the like is possible without immobilization on a carrier.
In particular, it is suitable for continuous production of fermented seasonings such as soy sauce.
In addition, since the novel yeast of the present invention can be fermented with high efficiency even in a medium with a high salt concentration, it can be fermented using various liquids to be treated.
Furthermore, the bioreactor of the present invention can separate the treatment liquid and the biocatalyst with a relatively simple structure.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a longitudinal sectional view showing an embodiment of a bioreactor of the present invention.
FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
FIG. 3 is a reference perspective view showing a solid-liquid separation part (upper part) of a bioreactor.
FIG. 4 is a graph showing the sedimentation rate of the test strain.
5 is a graph showing the degree of fermentation in the batch fermentation test of Example 1. FIG.
FIG. 6 is a longitudinal sectional view showing a conventional bioreactor.
FIG. 7 is a graph showing the degree of fermentation in the continuous fermentation test of Example 2- (2).
FIG. 8 is a graph showing the degree of fermentation in the continuous fermentation test of Example 2- (3).
FIG. 9 is a graph showing the degree of fermentation in the continuous fermentation test of Example 2- (4).
10 is a graph showing the degree of fermentation in the continuous fermentation test of Example 3. FIG.
11 is a graph showing the degree of fermentation in the continuous fermentation test of Example 4. FIG.
12 is a longitudinal cross-sectional reference diagram showing the bioreactor of the present invention used in Example 5. FIG.
13 is a graph showing the degree of fermentation in the continuous fermentation test of Example 5. FIG.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Bioreactor, 2 ... Pipe body, 2a ... Lower part, 2b ... Middle part, 2c ... Upper part, 5 ... Small hole board, 6 ... Outlet, 7 ... Bulkhead, 8 ... Passage port, 11 ... Gap

Claims

Zygosaccharomyces (Zygosaccharomyces) to F ERM P-18252 yeast belonging with cell mass forming ability (including aggregation and adhesion ability).

Method for producing a fermented seasoning using yeast according to claim 1, wherein.