【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子に関するものである。詳細には、本発明は、Aspergillus oryzaeより新規に単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を用いて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを大量に生産させ、ヘミセルロースを分解して燃料アルコールなどの物質へと変換するなど様々な産業分野に利用することを可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アラビノースは細胞壁の構成糖であり、Ｌ−アラビノースのみが１，２−α、１，３−α、１，５−α結合したものがＬ−アラビナンであり、ガラクトースやキシロースと結合したものが、アラビノガラクタン（１，３−α、１，６−α結合）、アラビノキシラン（１，２−α、１，３−α結合）であり、植物の細胞壁多糖として広く存在する。これらアラビノースを含む多糖は、非常に分解が困難で、天然資源として有効に利用できないことが大きな問題点となっている。特にアラビノキシランを主成分とするヘミセルロースは、天然界において２番目に多量に存在する多糖であるにもかかわらず、有効な分解方法が開発されておらず、資源活用の必要性が望まれているバイオマスである。
【０００３】
これらのＬ−アラビノース含有多糖の分解酵素には、エンド型分解酵素のｅｎｄｏ−アラビナナーゼとエキソ型分解酵素のＬ−アラビノフラノシダーゼがある。中でもＬ−アラビノフラノシダーゼはアラビノースと他の糖類との結合であるアラビノフラノシル基の結合を切断するため、Ｌ−アラビノースを含有する複合多糖の分解に有効であると考えられている。実際にヘミセルロースの主成分であるアラビノキシランはキシラナーゼにより、βキシラン主鎖を分解することが可能であるが、アラビノフラノシル基側鎖を分解するＬ−アラビノフラノシダーゼを共存させないと効率的な分解ができない。また、アラビノガラクタンやペクチンなどにもアラビノフラノシル基側鎖が存在し、同様に効率的な分解にはＬ−アラビノフラノシダーゼが必要である。
【０００４】
このように、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、Ｌ−アラビノース含有多糖の分解に有効であることから、ヘミセルロース資源の燃料への変換、パルプの非木質化、植物資源の飼料への利用、ワイン発酵中におけるブドウのモノテルペングリコシドの加水分解、アラビノースの製造、ヘミセルロース含有廃水の処理など、様々な利用方法が期待されている。
【０００５】
これまでの商業的に利用されているアラビノース多糖の分解酵素は、Aspergillus niger由来のものである。この酵素には２種類のアラビノフラノシダーゼと１種類のｅｎｄｏ−Ｌ−アラビナナーゼが含まれている。しかしながら酵素生産性が低く、天然アラビノース多糖を分解して効率的な資源利用することは実用化されていない。特に本菌株のアラビノフラノシダーゼでは、ヘミセルロースなどアラビノース複合多糖を発酵性糖類にまで分解することはできない。
【０００６】
以上のように、ヘミセルロースなどの植物多糖を有効に資源活用するためには、アラビノース多糖を効率よく分解できるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの探索、開発が非常に重要となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、ヘミセルロースを発酵性糖類へ変換し、燃料アルコールなどの物質へ変換することなどをはじめ様々な産業に利用可能なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを、効率よく生産させることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、遺伝子工学的手法によることとし、鋭意研究の結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする塩基配列の決定に成功し、更に該遺伝子を含有した形質転換体の作成、該遺伝子の発現（しかも真核生物による高発現）、該形質転換体の培養によるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するタンパク質の製造（しかも大量製造）、そしてこの酵素（又は酵素活性を有するタンパク質）の利用を現実に確認するのに成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００９】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子又は該遺伝子を含有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、単にα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ということもある）をクローニングするため、フスマ培養を行なった麹菌Aspergillus oryzaeの菌体よりｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライブラリーを構築する。このライブラリーの塩基配列を網羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データベースとのホモロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンからThermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクローンを検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を単離する。単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめる。
【００１０】
宿主としては、各種微生物が適宜使用可能であるが、本発明においては真核生物を利用することが可能であって、目的酵素を効率よく大量に生産できるという特徴を有する。真核生物、例えば麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的発酵産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用なタンパク質を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭62-272988）。発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白生産においては、Aspergillus属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特にＡ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量のタンパク質が生産されることを見いだした（特願平11-154271、特願2000-36754）。本発明は、この系を利用することによって、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を麹菌で効率的に発現せしめ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を大量生産することにはじめて成功したものである。
【００１１】
上記により単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、単独で、あるいは麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ遺伝子：Biochem. Biophys. Acta., 1261(1), p.151, 1995）のプロモーターや固体培養において特異的に大量発現する麹菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のプロモーター（特願平11-154271、特開平11-243965）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、高純度な酵素蛋白を大量に生産させるものである。
【００１２】
遺伝子導入方法としては常法が適宜利用されるが、例えば宿主としては、ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：Nitrate Reductase欠損株）を用いる公知方法により、目的遺伝子であるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と形質転換用マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子（Unkle, E. S. et al., Mol．Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）を同時に導入する。この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。そしてこの形質転換体を培養することにより、目的酵素を菌体内又は菌体外に大量分泌させることができる。
【００１３】
このように本発明によれば、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子をＡ．ｏｒｙｚａｅから単離するのに成功し、酵素蛋白をＡ．ｏｒｙｚａｅによって大量に生産させることに成功したものである。そのうえ更に、該異種遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混入しない方法を採用することにより、セルフクローニング株となり、組換え微生物の規制からも除外されるという著効が奏される。
以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００１４】
ｃＤＮＡライブラリーを網羅的に塩基配列を決定したデータベースより、Thermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と相同性を示すクローンを抽出した。このｃＤＮＡクローンをプローブとして、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーより、染色体のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を含むポジティブクローンを選択した。得られたポジティブクローンをテンペレートとして、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのコーディング領域、プロモーター領域、ターミネーター領域を含む全長３．８ｋｂについてその全塩基配列を決定した。その結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子は５つのイントロンを含み、遺伝子から推定されるタンパク質のアミノ酸配列は４８１残基であり、Thermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼとのホモロジーはアミノ酸レベルで３８％であった。また本遺伝子のプロモーター領域には、−２３６ｂｐにＣＡＡＴ、−１８８ｂｐにＴＡＴＡＡ−ｂｏｘとそれに引き続くＣＴ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎの真核生物プロモーターに特徴的な配列が存在していた。
【００１５】
今回クローニングしたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼはThermotoga maritimaのものと３８％の相同性を示しており、耐熱性が期待される。一方、既にクローニングされているAspergillus nigerのものとは３０％の相同性しか示さず、Aspergillus nigerとAspergillus nidulansのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが７７％の相同性を示すことから考えても、本酵素は糸状菌における新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼであるといえる。
【００１６】
次に、この遺伝子のコーディング領域を、A. oryzaeでの高発現プロモーターであるme1Ｏプロモーター下流に連結し、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの麹菌での高生産を検討した。A. oryzaeの遺伝子発現ベクターにα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子のコーディング領域(ATG下流1.8kb(1128-3009))を連結し（図７）、A. oryzaeのniaD変異株に導入した。その結果、me1Ｏプロモーター制御下において菌体内に大量のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが分泌された。この酵素蛋白を精製し、ヘミセルロースに対する反応を検討した結果、ヘミセルロースを分解する活性が認められた。
【００１７】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片には、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ蛋白を高生産させることが可能であり、生産されたタンパク質はヘミセルロースの分解の他様々な産業分野で応用が可能であることも確認した。
【００１８】
得られた形質転換体の内、好適なもののひとつを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７９５０として寄託した。ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列は、配列番号５及び図８に示す。
【００１９】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片には、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ蛋白を高生産することが可能であり、生産されたタンパク質は、酵素自体が試薬として有用であるだけでなく、様々な産業分野での応用が可能であり、例えば次のような用途への応用が非限定的に例挙される：ヘミセルロース資源の発酵性糖類への変換、更にこれらの燃料アルコールへの変換、パルプの非木質化、ヘミセルロース等難消化性植物資源の可消化による飼料化、ワイン発酵中におけるブドウのモノテルペングリコシドの加水分解、木質材料その他ヘミセルロース等アラビノース複合多糖含有物質の発酵性糖類への分解（例えば、アラビノースの製造、ヘミセルロースの分解、廃水処理への応用等）。その他、医薬品、化粧品、飲食品への応用も可能である。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２０】
【実施例１】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニング
フスマ培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラリー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Thermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子に相同性の高いクローンＪＺ３４７６を選択した。次にＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託 ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の染色体ジーンライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子をクローニングした。ＥＳＴ配列を元にプローブを作成するため、以下に記載する配列のヌクレオチドプライマーを２種類合成した。次いで、これらのプライマーを用い、A. oryzae RIB 40株のゲノムをテンペレートとしてＰＣＲを行い、反応生成物をランダムプライムラベリング法により蛍光標識してプローブとした。
【００２１】
上記２種類のオリゴＤＮＡプライマーの内、一方は、センスプライマーであって、その塩基配列は配列番号３（図５）に示され、他方は、アンチセンスプライマーであって、その塩基配列は配列番号４（図６）に示される。
【００２２】
この方法により約１００００個のファージクローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズするクローンλＡＦ５４を単離した。上記のオリゴＤＮＡをプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定し、本クローンが確かに目的のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子であることを確認した。
【００２３】
【実施例２】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ポジティブクローンλＡＦ５４株をテンペレートとしてα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の全塩基配列の決定を行なった。プロモーター部分、コーディング領域、ターミネーター部分をあわせて、３．８ｋｂの配列を決定した（配列番号２：図３、図４）。上記配列の内、１位置から１１２７の位置までがプロモーター部分であり、１１２８の位置から３００９の位置までの領域がコーディング領域であり、３０１０の位置から３７５２の位置までがターミネーター部分である。
【００２４】
また、Thermotoga maritimaとのホモロジー検索の結果から、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼには５つのイントロンが存在し、そのコーディング領域は１８８２ｂｐであり、塩基配列から推定されるタンパク質は、４８１残基であることが明らかとなった。（配列番号１：図１、図２）。
【００２５】
【実施例３】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子麹菌への導入
得られたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の中のコーディング領域（配列番号２の１１２８−３００９）を麹菌の高発現プロモーターであるme1Ｏプロモーター下流に連結した。さらにこの融合遺伝子を麹菌発現ベクターであるpIN93のPstIサイトに挿入したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ発現プラスミドpGH2を構築した。（図７）このpGH2をA. oryzaeのniaD変異株Aspergillus oryzae 1013-niaD (工業技術院生命工学工業技術研究所寄託FERM P-17707）に導入し、硝酸資化能が回復した株を遺伝子導入株として選択した。このようにして得た形質転換体の内、そのひとつをAspergillus oryzae MEL-Abfと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17950として寄託した。
【００２６】
得られた遺伝子導入株を、DPY培地にて液体培養を行い、菌体内のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を測定した。（表１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の測定はVan der Veenらの方法に従い行った。(Van der Veen, P., Flipphi, M.J., Voragen, A.G.J. & Visser, J. (1991) Archi Microbiol 157, 23-28）
【００２７】
（表１）
【００２８】
その結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、菌体内に非常に高いα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性が認められた。この結果、単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子には、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。
【００２９】
【実施例４】
組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの大量生産
実施例３で作成した、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子導入株を培養し、組換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの大量生産を試みた。３ＬのCz-Dox培地で、３０℃で１０日間培養した菌体を遠心分離などで集菌して、液体窒素下でパウダー状になるまですりつぶした。この破砕した菌体（乾燥重量８ｇ）に、１００ｍｌの５０ｍＭのリン酸バッファー(ｐＨ７．０）を加え、よく混合した後、遠心分離によって固形分を除去した。
このようにして得られた菌体抽出液を、５０ｍＭのリン酸バッファーで透析し、低分子画分を除いた後、これをα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ粗酵素液とし、１００ｍｌを得た。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、麹菌のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを大量に生産することがはじめて可能となり、従来活用が困難であったヘミセルロース資源の分解などパイマス利用に広く利用することができる。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高く、パイオマスからの燃料製造だけでなく食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】センスプライマーを示す。
【図６】アンチセンスプライマーを示す。
【図７】麹菌発現プラスミドｐＧＨ２の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図８】ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an α-L-arabinofuranosidase gene of Aspergillus. In detail, the present invention uses α-L-arabinofuranosidase gene newly isolated from Aspergillus oryzae to produce α-L-arabinofuranosidase in large quantities, decomposes hemicellulose, and produces fuel alcohol. It can be used in various industrial fields such as conversion to substances such as
[0002]
[Prior art]
L-arabinose is a constituent sugar of the cell wall, and only L-arabinose linked to 1,2-α, 1,3-α, 1,5-α is L-arabinan, which is bound to galactose or xylose Are arabinogalactans (1,3-α, 1,6-α bonds) and arabinoxylans (1,2-α, 1,3-α bonds), which are widely present as plant cell wall polysaccharides. These arabinose-containing polysaccharides are very difficult to decompose and cannot be effectively used as natural resources. In particular, hemicellulose based on arabinoxylan is the second most abundant polysaccharide in the natural world, but no effective decomposition method has been developed, and the need for resource utilization is desired. It is.
[0003]
These L-arabinose-containing polysaccharide degrading enzymes include endo-arabinanase, an endo-degrading enzyme, and L-arabinofuranosidase, an exo-degrading enzyme. Among them, L-arabinofuranosidase is considered to be effective in decomposing complex polysaccharides containing L-arabinose because it cuts the bond of arabinofuranosyl group, which is a bond between arabinose and other saccharides. Actually, arabinoxylan, which is the main component of hemicellulose, can decompose the β-xylan main chain by xylanase, but it is efficient if L-arabinofuranosidase that decomposes the side chain of arabinofuranosyl group is not present. It cannot be disassembled. Moreover, arabinofuranosyl group side chain exists also in arabinogalactan, pectin, etc. Similarly, L-arabinofuranosidase is required for efficient decomposition | disassembly.
[0004]
Thus, since α-L-arabinofuranosidase is effective in degrading L-arabinose-containing polysaccharides, conversion of hemicellulose resources to fuel, non-woody pulp, utilization of plant resources for feed, Various uses such as hydrolysis of monoterpene glycosides of grapes during wine fermentation, production of arabinose, and treatment of wastewater containing hemicellulose are expected.
[0005]
The commercially available arabinose polysaccharide degrading enzyme so far is derived from Aspergillus niger. This enzyme contains two types of arabinofuranosidases and one type of endo-L-arabinanase. However, enzyme productivity is low, and it has not been put into practical use to efficiently use natural resources by decomposing natural arabinose polysaccharides. In particular, the arabinofuranosidase of this strain cannot decompose arabinose complex polysaccharides such as hemicellulose into fermentable saccharides.
[0006]
As described above, in order to effectively utilize resources of plant polysaccharides such as hemicellulose, the search and development of α-L-arabinofuranosidase capable of efficiently decomposing arabinose polysaccharide is very important.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the inventor is to efficiently convert α-L-arabinofuranosidase that can be used in various industries including conversion of hemicellulose into fermentable saccharides and conversion into substances such as fuel alcohol. It is to make it produce.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made in order to achieve the above-mentioned object. As a result of examination from various directions, the present invention is based on a genetic engineering technique, and as a result of earnest research, a base encoding α-L-arabinofuranosidase. Successful sequence determination, creation of a transformant containing the gene, expression of the gene (and high expression by eukaryotes), α-L-arabinofuranosidase or α by culturing the transformant -Successful production of a protein having an enzyme activity of L-arabinofuranosidase enzyme (and mass production) and the actual use of the enzyme (or protein having the enzyme activity) led to the completion of the present invention. Is.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
α-L-arabinofuranosidase gene or gene encoding the protein having α-L-arabinofuranosidase enzyme activity containing the gene (hereinafter sometimes simply referred to as α-L-arabinofuranosidase gene) In order to clone, mRNA is prepared from cells of Aspergillus oryzae that have been subjected to bran culture, and a cDNA library synthesized from this mRNA is constructed. The base sequence of this library is comprehensively determined, and the homology between each sequence and a known gene database is searched. A clone showing high homology with the α-L-arabinofuranosidase gene of Thermotoga maritima was searched from these cDNA clones. The oryzae α-L-arabinofuranosidase gene is isolated. The isolated α-L-arabinofuranosidase gene is introduced into a host for expression.
[0010]
As the host, various microorganisms can be used as appropriate. In the present invention, eukaryotes can be used, and the target enzyme can be efficiently produced in large quantities. Eukaryotes such as Neisseria gonorrhoeae oryzae is a filamentous fungus that has been used in traditional Japanese fermentation industries such as sake, soy sauce, and miso. The feature of this strain is that it produces a very large amount of protein useful in the fermentation industry. This strain has attracted attention as a host for heterologous protein production because of its high protein production ability and safety as a brewing microorganism (Biotechnology, 6, 1419 (1988), JP 62-272988). From the inventors' research, A. In the production of heterologous proteins using oryzae, it was confirmed that the production ability of a gene of a near species such as Aspergillus was further increased. In particular A. oryzae gene It was found that a very large amount of protein was produced when expressed under the control of an oryzae high expression promoter (Japanese Patent Application No. 11-154271, Japanese Patent Application No. 2000-36754). The present invention was the first to succeed in mass-producing the α-L-arabinofuranosidase gene by efficiently expressing the α-L-arabinofuranosidase gene in Aspergillus using this system. is there.
[0011]
The α-L-arabinofuranosidase gene isolated as described above may be used alone or as a promoter or solid of a gonococcal tyrosinase gene (melO gene: Biochem. Biophys. Acta., 1261 (1), p.151, 1995). Along with a high expression promoter such as a glucoamylase gene (glaB) promoter (Japanese Patent Application No. 11-154271, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-243965) derived from Aspergillus oryzae that is specifically expressed in a large amount in culture. It is expressed in oryzae to produce a large amount of high-purity enzyme protein.
[0012]
As a gene introduction method, a conventional method is appropriately used. For example, as a host, α-L, which is the target gene, is obtained by a known method using a niaD mutant strain (gonococcal mutant strain that cannot assimilate nitrate: Nitrate Reductase deficient strain) -An arabinofuranosidase gene and a niaD gene (Unkle, ES et al., Mol. Gen. Genet., 218, p. 99-104, 1989), which is a marker gene for transformation, are introduced simultaneously. When this gene is introduced, a heterologous gene such as a vector sequence is excluded, whereby a transformant of a self-cloning strain containing no heterologous gene can be obtained. By culturing this transformant, the target enzyme can be secreted in large quantities outside or inside the cells.
[0013]
Thus, according to the present invention, the α-L-arabinofuranosidase gene is expressed as A. was successfully isolated from Oryzae and the enzyme protein It has been successfully produced in large quantities by oryzae. Furthermore, when the heterologous gene is introduced, A. By adopting a method in which heterologous DNA other than oryzae is not mixed, a self-cloning strain is obtained, and a remarkable effect is obtained that it is excluded from the regulation of recombinant microorganisms.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
[0014]
A clone having homology with the α-L-arabinofuranosidase gene of Thermotoga maritima was extracted from a database in which the nucleotide sequence of the cDNA library was comprehensively determined. Using this cDNA clone as a probe, A. A positive clone containing the chromosomal α-L-arabinofuranosidase gene was selected from the EMBL3 phage library of oryzae. Using the obtained positive clone as a template, the entire nucleotide sequence of the full length 3.8 kb including the coding region, promoter region, and terminator region of α-L-arabinofuranosidase was determined. As a result, the α-L-arabinofuranosidase gene contains 5 introns, the amino acid sequence of the protein deduced from the gene is 481 residues, and the homology with Thermotoga maritima α-L-arabinofuranosidase is It was 38% at the amino acid level. In the promoter region of this gene, there were sequences characteristic of the eukaryotic promoter of CAAT at -236 bp, TATAA-box at -188 bp, and subsequent CT-rich region.
[0015]
The α-L-arabinofuranosidase cloned this time shows 38% homology with that of Thermotoga maritima, and heat resistance is expected. On the other hand, it is only 30% homologous to that of already cloned Aspergillus niger, and considering that Aspergillus niger and Aspergillus nidulans α-L-arabinofuranosidase show 77% homology, This enzyme can be said to be a novel α-L-arabinofuranosidase in filamentous fungi.
[0016]
Next, the coding region of this gene was ligated downstream of the me1O promoter, which is a high expression promoter in A. oryzae, and high production of α-L-arabinofuranosidase in Aspergillus was examined. The coding region of the α-L-arabinofuranosidase gene (1.8 kb (1128-3009) downstream of ATG) was ligated to the gene expression vector of A. oryzae (FIG. 7) and introduced into the niaD mutant of A. oryzae. As a result, a large amount of α-L-arabinofuranosidase was secreted into the cells under the control of the me1O promoter. As a result of purifying this enzyme protein and examining the reaction to hemicellulose, the activity of decomposing hemicellulose was observed.
[0017]
From the above results, it was confirmed that the cloned gene fragment encoded a protein having α-L-arabinofuranosidase activity. It was also confirmed that α-L-arabinofuranosidase protein can be produced at a high level using this gene, and that the produced protein can be applied in various industrial fields in addition to degradation of hemicellulose. .
[0018]
One of the obtained transformants was deposited as FERM P-17950 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. The base sequence of the melO promoter is shown in SEQ ID NO: 5 and FIG.
[0019]
From the above results, it was confirmed that the cloned gene fragment encoded a protein having α-L-arabinofuranosidase activity. Moreover, it is possible to produce α-L-arabinofuranosidase protein at a high level using this gene. The produced protein is not only useful as a reagent for the enzyme itself but also used in various industrial fields. Applications are possible, for example, but not limited to the following applications: conversion of hemicellulose resources into fermentable sugars, further conversion into fuel alcohol, non-woody pulp, Digestion of indigestible plant resources such as hemicellulose, hydrolysis of grape monoterpene glycosides during wine fermentation, degradation of wood materials and other arabinose complex polysaccharide-containing substances such as hemicellulose into fermentable sugars (eg, production of arabinose , Decomposition of hemicellulose, application to wastewater treatment, etc.). In addition, it can be applied to pharmaceuticals, cosmetics, and foods and drinks.
Examples of the present invention will be described below.
[0020]
[Example 1]
Cloning of α-L-arabinofuranosidase gene Clone JZ3476 having high homology to the α-L-arabinofuranosidase gene of Thermotoga maritima from the cDNA library (EST library) by mRNA obtained from the bran culture. Selected. Next, α-L-arabinofuranosidase was obtained from the chromosome gene library of Aspergillus oryzae O-1013 strain using EMBL3 phage (FERM P-16528 deposited by Biotechnology Institute of Industrial Science and Technology, Institute of Industrial Science and Technology) by plaque hybridization. The gene was cloned. In order to create a probe based on the EST sequence, two types of nucleotide primers having the sequences described below were synthesized. Subsequently, PCR was performed using these primers and the genome of A. oryzae RIB 40 strain as a template, and the reaction product was fluorescently labeled by random priming labeling to obtain a probe.
[0021]
Of the two types of oligo DNA primers, one is a sense primer whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 5), and the other is an antisense primer whose base sequence is SEQ ID NO: 4 (FIG. 6).
[0022]
By this method, clone λAF54 that hybridizes with the probe was isolated from about 10,000 phage clones. The DNA base sequence was determined by the dideoxy method using the above oligo DNA as a primer, and it was confirmed that this clone was indeed the target α-L-arabinofuranosidase gene.
[0023]
[Example 2]
Determination of the base sequence of the α-L-arabinofuranosidase gene The entire base sequence of the α-L-arabinofuranosidase gene was determined using the positive clone λAF54 as a template. The 3.8 kb sequence was determined by combining the promoter portion, coding region, and terminator portion (SEQ ID NO: 2: FIGS. 3 and 4). Among the above sequences, the region from position 1 to position 1127 is the promoter portion, the region from position 1128 to position 3009 is the coding region, and the region from position 3010 to position 3752 is the terminator portion.
[0024]
Further, from the results of homology search with Thermotoga maritima, α-L-arabinofuranosidase has 5 introns, its coding region is 1882 bp, and the protein deduced from the base sequence is 481 residues. It became clear that there was. (SEQ ID NO: 1: FIGS. 1 and 2).
[0025]
[Example 3]
α-L-arabinofuranosidase gene introduced into Aspergillus oryzae The coding region (1128-3009 of SEQ ID NO: 2) in the obtained α-L-arabinofuranosidase gene is downstream of the me1O promoter which is a high expression promoter of Aspergillus oryzae Connected. Furthermore, an α-L-arabinofuranosidase expression plasmid pGH2 was constructed in which this fusion gene was inserted into the PstI site of pIN93, which is an gonococcal expression vector. (Fig. 7) This pGH2 was introduced into the A. oryzae niaD mutant Aspergillus oryzae 1013-niaD (FERM P-17707 deposited by Biotechnology Institute of Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Selected as a stock. One of the transformants thus obtained was named Aspergillus oryzae MEL-Abf and deposited as FERM P-17950 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0026]
The obtained gene-introduced strain was subjected to liquid culture in DPY medium, and the α-L-arabinofuranosidase activity in the cells was measured. (Table 1) α-L-arabinofuranosidase activity was measured according to the method of Van der Veen et al. (Van der Veen, P., Flipphi, MJ, Voragen, AGJ & Visser, J. (1991) Archi Microbiol 157, 23-28)
[0027]
(Table 1)
[0028]
As a result, the transformant into which the α-L-arabinofuranosidase gene was introduced showed very high α-L-arabinofuranosidase activity in the microbial cells. As a result, it was confirmed that the isolated α-L-arabinofuranosidase gene encoded a protein having α-L-arabinofuranosidase activity.
[0029]
[Example 4]
Mass production of recombinant α-L-arabinofuranosidase The α-L-arabinofuranosidase gene-introduced strain prepared in Example 3 was cultured to attempt mass production of recombinant α-L-arabinofuranosidase. . Bacteria cultured for 10 days at 30 ° C. in 3 L of Cz-Dox medium were collected by centrifugation, etc., and ground under liquid nitrogen until powdered. 100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) was added to the crushed cells (dry weight 8 g), and after mixing well, solid content was removed by centrifugation.
The bacterial cell extract thus obtained was dialyzed with a 50 mM phosphate buffer to remove the low molecular fraction, and this was used as an α-L-arabinofuranosidase crude enzyme solution to obtain 100 ml. .
[0030]
【The invention's effect】
According to the present invention, α-L-arabinofuranosidase of Neisseria gonorrhoeae can be produced in a large amount for the first time, and can be widely used for pie mass utilization such as decomposition of hemicellulose resources, which has been difficult to use conventionally. In addition, since the present invention produces the koji mold enzyme by koji mold, the enzyme protein produced is extremely safe and can be applied not only to the production of fuel from piomas but also to the food, pharmaceutical and cosmetic industries. Technology.
[0031]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of α-L-arabinofuranosidase.
FIG. 2 shows the continuation of the above.
FIG. 3 shows the base sequence of the α-L-arabinofuranosidase gene.
FIG. 4 shows the continuation of the above.
FIG. 5 shows sense primers.
FIG. 6 shows antisense primers.
FIG. 7 shows the construction of a koji mold expression plasmid pGH2 and its restriction enzyme map.
FIG. 8 shows the base sequence of the melO promoter.
