JP3760321B2

JP3760321B2 - Transplant immunosuppressant

Info

Publication number: JP3760321B2
Application number: JP16611894A
Authority: JP
Inventors: 拓也仁科; 良夫猶本; 薫三折田
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 2006-03-29
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: JPH0812589A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、皮膚移植等の移植時に問題となるグラフト（移植片）に対する生体の拒絶反応を抑制する移植免疫抑制剤に関する。更に詳しくは、本発明は、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子を有効成分として含有することを特徴とする細胞、組織、臓器等の移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応の抑制に有効な新規な移植免疫抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、骨髄細胞に作用して顆粒球及びマクロファージへの分化・増殖を促進する因子であり、顆粒球の増殖を促進する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球・マクロファージの増殖を促進する単球・マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球及び単球・マクロファージの双方の増殖を促進する顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等に分類されている。
【０００３】
これらのうち、Ｍ−ＣＳＦについては、本発明者及び共同研究者等により、癌免疫補助剤（特開平１−１９３２２７号公報）、血小板減少症治療剤（特開平１−２０７２４４号公報）、造血器疾患治療剤（特開平１−２２１３２２４号公報）、抗悪性腫瘍剤（特開平２−２２５４１８号公報）、悪性腫瘍治療補助剤（特開平２−２６４７２９号公報）、高脂血症治療剤（特開平２−２６４７２８号公報）、骨髄異形成症候群治療剤（特開平３−１７０２１号公報）、大理石骨病治療剤（特開平４−１７８３３４号公報）等の用途が、これまで開発されている。
【０００４】
ところで、細胞、組織、臓器等の移植は、医学上重要な手技である。移植においては、一般に、移し植えられる細胞、組織、臓器等をグラフト（移植片）、グラフトを提供する者をドナー、グラフトを移植される者をレシピエント（宿主）と呼んでいる。
【０００５】
移植は、ドナーとレシピエントとの関係から、
▲１▼一つの個体の一部の組織を、同じ個体の他の部分に移植する自家移植、
▲２▼一つの純系動物群の中でも雌雄も同じ２個体間、即ち、遺伝因子が全く同一と
考えられる２個体間の移植である同系移植、
▲３▼純系以外の同じ種属中の２個体間での移植である同種異系移植、
▲４▼種属の異なる２個体間の移植である異種移植、
の４種類に分類される。
【０００６】
自家移植及び同系移植の場合は、グラフトとレシピエントの遺伝因子が全く同一であり、いわゆる組織適合性抗原が完全に一致しているので、レシピエントはグラフトを異質物とは認めず、自己のものと認知する。従って、異質物の侵入によって生じる抗原抗体反応（即ち、移植免疫反応）は全く惹起せず、移植手技さえ万全であれば、グラフトはレシピエントに永久生着する。
【０００７】
同種異系移植の場合は、たとえ親子間又は兄弟間であっても、レシピエントはグラフトを抗原として認識し、抗体を産生するので、移植免疫反応に基づく拒絶反応により、グラフトは数日後に壞死する。
異種移植の場合は、レシピエントに対するグラフトの異質性は一般に強烈であり、移植後数時間以内にグラフトが壞死することも稀ではない。
【０００８】
一般に、皮膚、肺、腎臓等の臓器を移植する場合は、同種異系移植である。同種異系移植では可能な限り組織適合性のよいグラフトを選択することにより、生着率を向上させることができるが、組織適合性のみで拒絶反応を完全に防止するのは不可能であり、移植の際には細胞性免疫の抑制を主眼として免疫抑制剤が用いられる。
【０００９】
移植時に用いられる主な免疫抑制剤には、化学的免疫抑制剤及び副腎皮質ステロイド剤がある。前者は、更に、アルキル化剤、プリン同族体、葉酸代謝拮抗剤等に分類される。アルキル化剤は、放射線様物質ともいわれるように、Ｘ線照射に類似した細胞障害作用を有し、核酸をアルキル化してその転写及び複製の過程で誤反応を惹起する。プリン同族体は、核酸合成の過程で、リボ核酸の生合成を阻害することにより細胞毒性効果を発揮する。葉酸代謝拮抗剤は、ジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害し、テトラヒドロ葉酸の合成を阻害することにより、ＤＮＡ合成を抑制する。このように、化学的免疫抑制剤は、主として免疫反応において重要な役割を演じるリンパ球の増殖過程を抑制するものである。
一方、副腎皮質ステロイドは、リンパ球の増殖過程のみならず、Ｂリンパ球の形質細胞化、抗体産生過程等の免疫応答のあらゆる過程に作用するといわれている。
【００１０】
化学的免疫抑制剤及び副腎皮質ステロイド剤は、非特異的免疫抑制剤であり、移植抗原に対する免疫抑制にとどまらず、骨髄抑制により一般的な免疫能も抑制し、感染に対する抵抗性が減少する。移植患者の死亡例で、その死因として感染症が４０％にも達するのはそのためである。このほか、プリン同族体には肝毒性及び骨髄毒性が、また副腎皮質ホルモンには消化管潰瘍の易発性、創癒合障害等の副作用があり、これらが致命的な合併症となることもある。
【００１１】
最近、新たな免疫抑制剤として、シリンドロカルポン・ルシダム(Cylindrocarpon lucidum)及びトリコデルマ・ポリスポラム(Trichodema polysporum) の代謝産物として得られ、ポリペプチドであるサイクロスポリンＡが知られている［アナレス・オブ・インターナル・メディシン(Annals of Internal Medicine) ，第１０１巻，第５号，第６６７〜６８２ページ，１９８４年］。このサイクロスポリンＡは、ヘルパーＴ細胞からのインターロイキン−２の分泌を、主に抑制することにより免疫抑制作用を示すものと考えられている。サイクロスポリンＡには、既存の骨髄抑制作用がないといわれているが、腎障害及び肝障害を惹起するという副作用が知られている［ジャーナル・オブ・リューマトロジー(Journal of Rheumatology) ，第１８巻，第１０号，第１４８５〜１４８９ページ，１９９１年］。
【００１２】
また、筑波山の土壌から発見されたマクロライド化合物であるＦＫ５０６が、免疫抑制剤として開発されたが［トランスプランテーション(Transplantation) ，第４４巻，第６号，第７３４〜７３８ページ，１９８７年］、その適応は極めて狭く、日本国内では肝移植にのみ認められているのが現状である。
このように、従来、免疫抑制剤が種々開発されているものの、いずれも前記のような問題点を有するものでり、かかる従来技術の状況において、副作用の少ない新たな移植免疫抑制剤の開発が待望されていた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来、骨髄中の幹細胞に作用して特に単球及びマクロファージへの分化・誘導を促進する因子である単球・マクロファージコロニー刺激因子（以下Ｍ−ＣＳＦと記載することがある）が、自家骨髄移植において、その生着率、生存率を改善することは、既に、報告されている（特開平１−２２１３２２４号公報）。しかしながら、このような知見は、あくまで自家骨髄移植に限られたものであって、Ｍ−ＣＳＦが、同種異系移植においてグラフト（移植片）に対する生体の拒絶反応を抑制することは、これまで報告された例はなく、従来、知られていなかった。
【００１４】
本発明者らは、このような状況の中にあって、鋭意研究を行った結果、Ｍ−ＣＳＦが、同種異系移植片に対する移植免疫反応を抑制し、移植片の生着、生存率を改善することを見い出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の目的は、副作用の軽減された新規な移植免疫抑制剤を提供することにある。
【００１６】
また、本発明の目的は、同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応の抑制に有効な移植免疫抑制剤を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子を有効成分として含有し、同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応を抑制するための移植免疫抑制剤に係るものであり、また、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子が、ヒト尿、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子産生細胞の培養液、又は単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子遺伝子組換え細胞の培養液から得られるものである上記移植免疫抑制剤であること、を望ましい態様としてもいる。
【００１８】
次に本発明について詳述する。
本発明に使用するＭ−ＣＳＦの製造法としては、特に制限されるものではないが、例えば、ヒト尿から化学的方法により単離することもでき、また、遺伝子工学的に製造することもできる。具体的には、ヒト尿から化学的方法により単離する方法として、特開昭６３−１９８７００号公報、特開昭６３−２５０４００号公報、特開昭６４−２２８９９号公報、特表昭６２−５０１６０７号公報、遺伝子工学的に製造する方法として、特表平１−５０２３９７号公報等に開示された方法を例示することができる。
【００１９】
前記の方法により製造されたＭ−ＣＳＦは、軟寒天中で哺乳動物の骨髄細胞に作用し、単球・マクローファージ系細胞からなるコロニー形成を促進する活性（以下コロニー刺激活性と記載することがある）を有しており、本発明で使用するＭ−ＣＳＦとしては、これと同様のコロニー刺激活性を有する蛋白質因子であれば使用可能であり、その種類は特に限定されず、一例を示せば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、当該配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部が脱落又は置換したペプチド、当該配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部に他のアミノ酸が挿入又は付加したペプチド等、が好適なものとして例示されるが、これらに限らず、前記コロニー刺激活性を有するものであればよい。また、本発明においては、前記ペプチドの薬理学的に許容し得る誘導体も使用することもできる。
【００２０】
このようにして化学的方法又は遺伝子工学的方法により得られたＭ−ＣＳＦに、必要により、安定剤として、ヒト血清アルブミン、糖類等を含む緩衝液を添加し、Ｍ−ＣＳＦを溶解し、以下、常法により無菌瀘過し、凍結乾燥し、移植免疫抑制剤を製造することができる。尚、ヒト血清アルブミン及び糖類の他に、薬理学的に許容される成分、更には、従来から移植免疫の抑制に使用されている薬剤を添加することもできる。
【００２１】
本発明の移植免疫抑制剤は、例えば、注射用生理食塩水、注射用蒸留水等に溶解し、点滴、静注、皮下注等、適宜の形態において、症状に応じて適宜その有効量を投与することができる。通常、有効投与量は、多くの場合、臨床用量の数倍、数十倍のオーダーである［津田恭介及び野上寿編，「薬効の評価（２）前臨床試験および臨床薬理試験」，第２２２ページ，地人書館，昭和４８年］ことから、本発明の移植免疫抑制剤の投与量は、後記試験結果から、１日、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．０１ｍｇ程度である。
【００２２】
本発明の移植免疫抑制剤は、細胞毒性の極めて強い従来の免疫抑制剤と異なり、元来ヒトの体液中に自然に含まれている天然物であるＭ−ＣＳＦを有効成分としているので、副作用が極めて軽微であるという利点がある。尚、Ｍ−ＣＳＦの急性毒性については、例えば、既に特公平６−１１７０５号公報の実験例１に具体的試験データとして記載してあるとおり、Ｃ57ＢＬ系雄性マウスを用いた試験において、ＬＤ₅₀が腹腔内投与では４ｇ／ｋｇ体重、静脈内投与では２ｇ／ｋｇ体重、皮下投与では４ｇ／ｋｇ体重であることが確認されている。
【００２３】
次に試験例を示して本発明を詳述する。
試験例１
この試験は、コロニー刺激活性を測定するために行った。
１）試料の調製
実施例１と同一の方法により得たＭ−ＣＳＦを用いた。
【００２４】
２）試験方法
Ｍ−ＣＳＦ０．１ｍｌを、０．３％（以下濃度の表示は、重量による値である）寒天、２０％牛胎児血清（フロー・ラボラトリー社製）及びマウス骨髄細胞［Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールズ・リバー社から入手）の大腿骨骨髄から無菌的に採取］１×１０⁵個を含むMcCoy's 5A培地（フロー・ラボラトリー社製）１ｍｌと滅菌シャーレ中で混合し、７．５％炭酸ガス通気下、３７℃で７日間培養した。培養終了後、５０個以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位は１コロニーを形成させるのに必要なＭ−ＣＳＦの量である。また、比活性は、Ｍ−ＣＳＦ蛋白質１ｍｇ当たり形成されるコロニー数（単位）である。
【００２５】
３）試験結果
この試験の結果、実施例１と同様な方法で得たＭ−ＣＳＦは、１×１０⁸単位／ｍｇ蛋白質の比活性を有していた。また、形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジン染色して形態学的に分類した結果、９５％以上のコロニーが単球及びマクロファージからなっていた。
【００２６】
試験例２
この試験は、Ｍ−ＣＳＦの移植免疫抑制効果を調べるために行った。
１）試料の調製
実施例と同一の方法により得たＭ−ＣＳＦを用いた。
【００２７】
２）試験方法
８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６，（Ｂ６）マウス（日本チャールズ・リバー社から入手）をレシピエントとし、８週齢のオスＢ６．Ｃ−Ｈ−２^bm1（ｂｍ１２）マウス（日本チャールズ・リバー社から入手）をドナーとして、ｂｍ１２マウスの背部皮膚をＢ６マウスの側胸部に移植した。このような移植マウス１５匹を、１群５匹からなる３群にわけ、第１群には、移植免疫抑制剤としてＭ−ＣＳＦを１０ｍｇ／ｋｇ、第２群には、同１ｍｇ／ｋｇ、及び第３群には、生理食塩水を、移植後５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１日目にそれぞれそれぞれ静脈内投与し、移植後４０日目までグラフトの生着、生存率を観察した。
【００２８】
３）試験結果
この試験の結果は、図１に示すとおりである。図１において、縦軸及び横軸は、それぞれ移植片生着率及び移植後日数を示し、図中実線、破線、及び一点鎖線は、それぞれ第１群、第２群及び第３群を示す。
図１から明らかなように、第１群では、５例が１５日間移植片が生着し、４例が１９日間、３例が２８日間、２例が３２日間、１例が３８日間移植片が生着した。これに対して、第３群では、５例が１１日間移植片が生着し、４例が１２日間、３例が１４日間移植片が生着し、１７日で全例の移植片が脱落した。
一方、第２群では、拒絶反応による移植片脱落の進行に遅延が認められ、４例に１５日間の生着が認められた。
【００２９】
この結果から、Ｍ−ＣＳＦが移植免疫を抑制し、１日当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で移植片の生着率の改善に有効であることが認められた。尚、Ｍ−ＣＳＦ及びマウスの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３０】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ヒト尿からの移植免疫抑制剤調製）
健康なヒトの尿（１，０００ｌ）をｐＨ８．５に調整し、沈殿物を瀘別し、分画分子量50,000ダルトンの限外瀘過膜 (アミコン社製。Ｈ１０×５０) で濃縮及び脱塩し、濃縮液のｐＨを７．０に調整し、密封容器中で６０℃、１０時間加熱殺菌し、のち遠心分離（５，０００×ｇで３０分間) して沈殿を除去した。次いで０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ファルマシア社製）と混合し、これに吸着させ、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）及び０．１５Ｍ食塩添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で順次洗浄し、のち０．２５Ｍ食塩添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出させ、該溶出液を限外瀘過膜 (アミコン社製。Ｈ１０Ｐ１０）で濃縮した。
【００３１】
セファクリールＳ−３００（登録商標。ファルマシア社製）を充填したカラム（直径２０ｃｍ、長さ８０ｃｍ）を用い、１Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７．２）で該濃縮液をゲル瀘過し、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したフェニル・セファロース４Ｂ（登録商標。ファルマシア社製) カラム（直径１０ｃｍ、長さ２０ｃｍ）に吸着させ、次いで０．５Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出させた。
【００３２】
溶出液を限外瀘過膜（アミコン社製。Ｈ１０Ｐ１０）で濃縮し、ＴＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達社製）カラム（直径２．５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）を用いて高速液体クロマトグラフィーにかけ、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を得た。この画分を再度限外瀘過膜（アミコン社製。Ｈ１０Ｐ１０）で濃縮し、Ｈｉ−Ｐｏｒｅ２１４ＴＰ（登録商標。バイダック社製）逆相カラム（直径２．５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）で０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を含むアセトニトリル１〜１００％（ｐＨ２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、Ｍ−ＣＳＦを溶出させ、溶出液を凍結乾燥した。この方法を反復し、Ｍ−ＣＳＦ約５０ｍｇを得た。
得られたＭ−ＣＳＦの比活性を試験例１と同一の方法で測定した結果、１．０×１０⁸単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００３３】
得られたＭ−ＣＳＦを、１％マンニトール（和光純薬工業社製）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン緩衝液（ｐＨ７．２）に２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ニトロセルロース系無菌瀘過膜を装着した瀘過除菌装置（ミリポア社製）を用いて除菌し、予め１８０℃で２時間乾熱滅菌したガラス製バイアル瓶に１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥し、のちバイアル瓶を密封し、移植免疫抑制剤を調製した。
【００３４】
実施例２
（遺伝子組換え細胞培養液からの移植免疫抑制剤調製）
純化した遺伝子組換えＭ−ＣＳＦをウサギに免疫して得た抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で透析し、濃度を２０ｍｇ／ｍｌに調整し、該抗体溶液２００ｍｌを予め蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した１００ｇのフォルミル−セルロファイン（生化学工業社製）に添加し、室温で２時間攪拌し、水素化シアノホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）７００ｍｇを加え、更に１６時間攪拌し、フォルミル−セルロファインと抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合させ、抗体結合支持体を調製した。０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液で洗浄し、更に、水素化シアノホウ素ナトリウム５００ｍｇを含むトリス緩衝液２００ｍｌを加え、室温で４時間攪拌し、未反応基を不活化し、抗体結合支持体を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄した。この抗体結合支持体は、支持体１ｇ当り３２．６ｍｇの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合していた。
【００３５】
特表平１−５０２３９７号公報に開示されたＭ−ＣＳＦを発現し得る遺伝子組換え細胞（ＣＨＯ細胞。ジェネティクス・インスティチュート社から入手)培養液１０ｌを限外瀘過濃縮機で濃縮し、脱塩し、ＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、非吸着の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出し、該溶出液に塩化ナトリウムを加えて０．５Ｍの濃度に調整し、Ｍ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。このＭ−ＣＳＦの比活性は、３×１０⁶単位／ｍｇであった。
【００３６】
前記抗体結合支持体１００ｇに、このＭ−ＣＳＦ含有溶液（全量５００ｍｌ）を添加し、１０℃以下で、一夜攪拌し、バッチ式クロマトグラフィー処理を行った。攪拌後、ガラスフィルターで瀘過し、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄した。洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）５００ｍｌを加え、１０℃で１時間攪拌し、Ｍ−ＣＳＦを溶出した。溶出液のｐＨを７．０に調整し、限外瀘過膜で濃縮及び脱塩し、Ｍ−ＣＳＦ画分を得た。
【００３７】
この画分をＨｉ−Ｐｏｕｒ２１４ＴＰ（バイダック社。直径２．２、長さ２５ｃｍ）の逆相カラムで０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を含むアセトニトリル０〜１００％（ｐＨ２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、Ｍ−ＣＳＦを集め、凍結乾燥し、Ｍ−ＣＳＦ約２０ｍｇを得た。
得られたＭ−ＣＳＦの比活性は、試験例１と同一の方法により測定した結果、１．９×１０⁸単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００３８】
得られたＭ−ＣＳＦを、１％マンニトールを含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン緩衝液（ｐＨ７．２）に、１ｍｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ濃度で添加し、ニトロセルロース系無菌瀘過膜を装着した瀘過除菌装置（ミリポア社製）を用いて除菌し、予め１８０℃で２時間乾熱滅菌したガラス製バイアル瓶に、１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥し、のちバイアル瓶を密封し、移植免疫抑制剤を調製した。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳記したように、本発明は、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を有効成分として含有することを特徴とする移植免疫抑制剤に係るものであり、本発明によって奏せられる主たる効果は次のとおりである。
１）本発明の移植免疫抑制剤は、グラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応の抑制に有効である。
２）本発明の移植免疫抑制剤は、移植免疫反応を抑制し、グラフト生着、生存率の向上に有効である。
３）本発明の移植免疫抑制剤は、従来の免疫抑制剤と比較して、副作用が少ないという利点がある。
４）本発明の移植免疫抑制剤は、細胞、組織、臓器等の同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対する生体の移植免疫反応を抑制するのに有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍ−ＣＳＦのグラフト（移植片）生着率に及ぼす影響に関する試験結果の一例を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a transplant immunosuppressive agent that suppresses a rejection reaction of a living body with respect to a graft (graft) that is a problem during transplantation such as skin transplantation. More specifically, the present invention relates to transplantation immunity of a recipient (host) against a graft (graft) in transplantation of cells, tissues, organs, etc., characterized by containing a monocyte / macrophage colony stimulating factor as an active ingredient. The present invention relates to a novel transplanted immunosuppressive agent effective in suppressing the reaction.
[0002]
[Prior art]
Colony-stimulating factor (CSF) is a factor that acts on bone marrow cells to promote differentiation and proliferation into granulocytes and macrophages, and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and monocytes that promote granulocyte proliferation・ Monocytes / macrophage colony stimulating factor (M-CSF) that promotes proliferation of macrophages, granulocytes / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) that promotes proliferation of both granulocytes and monocytes / macrophages, etc. ing.
[0003]
Among these, for M-CSF, the present inventor and collaborators etc. have cancer immunity adjuvants (JP-A-1-193227), thrombocytopenia therapeutics (JP-A-1-207244), hematopoiesis. Remedies for organ disease (Japanese Patent Laid-Open No. 1-2213224), antineoplastic agents (Japanese Patent Laid-Open No. 2-225418), adjuvants for malignant tumor treatment (Japanese Patent Laid-Open No. 2-264729), therapeutic agents for hyperlipidemia ( JP-A-2-264728), myelodysplastic syndrome therapeutic agent (JP-A-3-17021), marble bone disease therapeutic agent (JP-A-4-178334), and the like have been developed so far. .
[0004]
By the way, transplantation of cells, tissues, organs and the like is a medically important procedure. In transplantation, generally, cells, tissues, organs, etc. to be transferred and transplanted are called grafts (grafts), those who provide the grafts are called donors, and those who receive the grafts are called recipients (hosts).
[0005]
Transplantation is based on the relationship between the donor and the recipient
(1) Autologous transplantation in which a part of tissue of one individual is transplanted to another part of the same individual,
(2) Syngeneic transplantation, which is a transplant between two individuals of the same sex within a single pure animal group, that is, between two individuals whose genetic factors are considered to be exactly the same.
(3) Allogeneic transplantation, which is a transplant between two individuals in the same species other than the pure system,
(4) Xenotransplantation, which is a transplant between two individuals of different species.
It is classified into four types.
[0006]
In the case of autologous and syngeneic transplants, the genetic factors of the graft and the recipient are exactly the same, and the so-called histocompatibility antigens are perfectly matched, so the recipient does not recognize the graft as foreign, Recognize it as a thing. Therefore, the antigen-antibody reaction (ie, transplantation immune reaction) caused by the invasion of foreign matter is not caused at all, and if the transplantation procedure is perfect, the graft is permanently engrafted in the recipient.
[0007]
In the case of allogeneic transplantation, even between parents and siblings or between siblings, the recipient recognizes the graft as an antigen and produces antibodies, so that the graft dies several days later due to rejection based on the transplant immune response. To do.
In the case of xenotransplantation, the heterogeneity of the graft to the recipient is generally intense, and it is not uncommon for the graft to die within hours after transplantation.
[0008]
Generally, when transplanting organs such as skin, lungs, and kidneys, allogeneic transplantation is performed. In allogeneic transplantation, it is possible to improve the engraftment rate by selecting grafts with as good a tissue compatibility as possible, but it is impossible to completely prevent rejection with only histocompatibility, At the time of transplantation, an immunosuppressant is used mainly for suppressing cellular immunity.
[0009]
The main immunosuppressants used at the time of transplantation include chemical immunosuppressants and corticosteroids. The former is further classified into alkylating agents, purine analogs, folic acid antimetabolites, and the like. The alkylating agent has a cytotoxic effect similar to that of X-ray irradiation, which is called a radiation-like substance, and alkylates a nucleic acid to cause a false reaction in the process of transcription and replication. Purine homologues exert a cytotoxic effect by inhibiting the biosynthesis of ribonucleic acid during the process of nucleic acid synthesis. Antifolate inhibitors inhibit dihydrofolate reductase and inhibit DNA synthesis by inhibiting the synthesis of tetrahydrofolate. Thus, a chemical immunosuppressant suppresses the proliferation process of lymphocytes that mainly play an important role in the immune response.
On the other hand, corticosteroids are said to act not only on the proliferation process of lymphocytes but also on all processes of immune responses such as plasma cell formation of B lymphocytes and antibody production processes.
[0010]
Chemical immunosuppressants and corticosteroids are non-specific immunosuppressants, which not only suppress immunosuppression against transplanted antigens, but also suppress general immunity by bone marrow suppression and reduce resistance to infection. This is the reason why infectious diseases have reached 40% of deaths in transplant patients. In addition, purine congeners have hepatotoxicity and myelotoxicity, and corticosteroids have side effects such as gastrointestinal ulcers and wound healing disorders, which can be fatal complications. .
[0011]
Recently, as a new immunosuppressant, Cyclosporin A, a polypeptide obtained as a metabolite of Cylindrocarpon lucidum and Trichoderma polysporum, has been known [Anales [Annals of Internal Medicine, Vol. 101, No. 5, pp. 667-682, 1984]. This cyclosporin A is considered to exhibit an immunosuppressive action by mainly suppressing the secretion of interleukin-2 from helper T cells. Cyclosporine A is said to have no existing myelosuppressive action, but it has a known side effect of causing renal and hepatic disorders [Journal of Rheumatology, 18th. Vol. 10, No. 1485-1489, 1991].
[0012]
In addition, FK506, a macrolide compound discovered from the soil of Mt. Tsukuba, was developed as an immunosuppressant [Transplantation, Vol. 44, No. 6, pp. 734-738, 1987]. However, its indication is very narrow and it is currently only accepted for liver transplantation in Japan.
Thus, although various immunosuppressive agents have been developed in the past, all of them have the above-mentioned problems, and in the situation of such prior art, development of new transplanted immunosuppressive agents with few side effects has been made. It was long-awaited.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
Meanwhile, monocyte / macrophage colony-stimulating factor (hereinafter sometimes referred to as M-CSF), which is a factor that acts on stem cells in bone marrow and promotes differentiation / induction into monocytes and macrophages in particular, has been used in-house. In bone marrow transplantation, improving the survival rate and survival rate has already been reported (Japanese Patent Laid-Open No. 1-2213224). However, such findings are limited to autologous bone marrow transplantation to the last, and it has been reported so far that M-CSF suppresses biological rejection of grafts (grafts) in allogeneic transplantation. There has been no example, and it has not been known so far.
[0014]
In this situation, the present inventors have conducted intensive research. As a result, M-CSF suppresses the transplantation immune reaction against allografts and increases graft survival and survival rate. We found improvements and completed the present invention.
[0015]
An object of the present invention is to provide a novel transplanted immunosuppressant with reduced side effects.
[0016]
Another object of the present invention is to provide a transplant immunosuppressive agent effective in suppressing the transplantation immune reaction of a recipient (host) against a graft (graft) in allogeneic transplantation.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
The present invention for solving the above problems, the monocyte-macrophage - a Jikoroni stimulating factor containing as an active ingredient, transplantation for suppressing transplantation immune reactions of the recipient (host) for the graft (graft) in allogeneic transplantation It relates to an immunosuppressant, and the monocyte / macrophage colony stimulating factor is a human urine, a culture solution of monocyte / macrophage colony stimulating factor producing cells, or a monocyte / macrophage colony stimulating factor gene recombination. It is also desirable that the transplant immunosuppressant is obtained from a cell culture solution.
[0018]
Next, the present invention will be described in detail.
The method for producing M-CSF used in the present invention is not particularly limited. For example, it can be isolated from human urine by a chemical method, or can be produced by genetic engineering. . Specifically, as a method of isolating from human urine by a chemical method, JP-A-63-198700, JP-A-63-250400, JP-A-64-22899, JP-A-62-2 As a method for producing by genetic engineering, Japanese Patent No. 501607, the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-502397 can be exemplified.
[0019]
M-CSF produced by the above method acts on mammalian bone marrow cells in soft agar and promotes the formation of colonies composed of monocytes and macrophage cells (hereinafter referred to as colony stimulating activity). As the M-CSF used in the present invention, any protein factor having the same colony-stimulating activity can be used, and the type thereof is not particularly limited. A peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a peptide in which a part of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is omitted or substituted, Peptides having amino acid inserted or added are exemplified as suitable ones, but are not limited thereto, and any peptide having the colony stimulating activity may be used. In the present invention, a pharmacologically acceptable derivative of the peptide can also be used.
[0020]
A buffer solution containing human serum albumin, saccharides or the like as a stabilizer is added to M-CSF obtained by the chemical method or genetic engineering method as described above as necessary, and M-CSF is dissolved. Then, aseptic filtration can be performed by a conventional method, followed by lyophilization to produce a transplanted immunosuppressant. In addition to human serum albumin and saccharides, pharmacologically acceptable components, and drugs conventionally used for suppressing transplantation immunity can also be added.
[0021]
The transplant immunosuppressant of the present invention is dissolved in, for example, physiological saline for injection, distilled water for injection, and the like, and in an appropriate form such as infusion, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., an effective amount is appropriately administered depending on symptoms. can do. In general, the effective dose is often on the order of several times or several tens of times the clinical dose [Tsusuke Tsuda and Kotoshi Nogami, “Evaluation of drug efficacy (2) Preclinical studies and clinical pharmacology studies”, 222 Page, Jinshokan, 1973], the dose of the transplanted immunosuppressive agent of the present invention is about 0.01 mg / kg body weight per day based on the test results described later.
[0022]
Since the transplanted immunosuppressive agent of the present invention contains M-CSF, which is a natural product naturally contained in human body fluids, as an active ingredient, unlike the conventional immunosuppressive agent having extremely high cytotoxicity, it has side effects. There is an advantage that is very slight. As for the acute toxicity of M-CSF, for example, as already described as specific test data in Experimental Example 1 of Japanese Examined Patent Publication No. 6-11705, LD ₅₀ is determined in a test using C57BL male mice. It has been confirmed that the intraperitoneal administration is 4 g / kg body weight, the intravenous administration is 2 g / kg body weight, and the subcutaneous administration is 4 g / kg body weight.
[0023]
Next, the present invention will be described in detail with reference to test examples.
Test example 1
This test was performed to measure colony stimulating activity.
1) Preparation of sample M-CSF obtained by the same method as in Example 1 was used.
[0024]
2) Test method M-CSF 0.1 ml, 0.3% (the following concentration is indicated by weight) agar, 20% fetal bovine serum (manufactured by Flow Laboratory) and mouse bone marrow cells [C57BL / 6 Aseptically collected from femur bone marrow of mice (obtained from Charles River, Japan)] Mix 1 ml of 1 × 10 ⁵ McCoy's 5A medium (manufactured by Flow Laboratory) in a sterile petri dish, 7.5% The cells were cultured at 37 ° C. for 7 days under aeration of carbon dioxide gas. After completion of the culture, 50 or more cell clumps were determined as colonies, and the number of formed colonies was counted. Colony stimulating activity is expressed in units, and one unit is the amount of M-CSF required to form one colony. The specific activity is the number of colonies (unit) formed per 1 mg of M-CSF protein.
[0025]
3) Test results As a result of this test, M-CSF obtained by the same method as in Example 1 had a specific activity of 1 × 10 ⁸ units / mg protein. Moreover, as a result of morphologically classifying the formed colonies by staining with hematoxylin-eosin, 95% or more colonies were composed of monocytes and macrophages.
[0026]
Test example 2
This test was conducted to examine the transplant immunosuppressive effect of M-CSF.
1) Preparation of sample M-CSF obtained by the same method as in Example was used.
[0027]
2) Test method 8-week-old male C57BL / 6, (B6) mice (obtained from Charles River Japan) were used as recipients, and 8-week-old male B6. Using C-H-2 ^bm1 (bm12) mice (obtained from Charles River, Japan) as a donor, the dorsal skin of bm12 mice was transplanted into the lateral chest of B6 mice. Such transplanted mice 15 animals, divided into 3 groups of 5 animals per group, the first group, M-CSF and 10 mg / kg as a transplant immunosuppressant, the second group, the 1 mg / kg, In group 3 and 3, physiological saline was intravenously administered on days 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, and 21 after transplantation, respectively, and grafts were viable until day 40 after transplantation. The arrival and survival rate were observed.
[0028]
3) Test results The results of this test are as shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis and the horizontal axis represent the graft survival rate and the number of days after transplantation, respectively, and the solid line, the broken line, and the alternate long and short dash line in the figure represent the first group, the second group, and the third group, respectively.
As is apparent from FIG. 1, in the first group, 5 cases were engrafted for 15 days, 4 cases were 19 days, 3 cases were 28 days, 2 cases were 32 days, and 1 case were 38 days. Engrafted. In contrast, in the third group, 5 cases had grafts for 11 days, 4 cases had grafts for 12 days, 3 cases had grafts for 14 days, and 17 days had all grafts dropped. did.
On the other hand, in the second group, there was a delay in the progress of graft loss due to rejection, and engraftment for 15 days was observed in 4 cases.
[0029]
From this result, it was confirmed that M-CSF suppresses transplantation immunity and is effective in improving the graft survival rate at a dose of at least 1 mg / kg body weight per day. In addition, although it tested by changing the kind of M-CSF and a mouse | mouth, the substantially same result was obtained.
[0030]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is further explained in full detail, this invention is not limited to a following example.
Example 1
(Preparation of transplant immunosuppressant from human urine)
Healthy human urine (1,000 l) is adjusted to pH 8.5, the precipitate is filtered off, concentrated and desalted with an ultrafiltration membrane (Amicon, H10 × 50) with a molecular weight cut off of 50,000 daltons Then, the pH of the concentrated solution was adjusted to 7.0, sterilized by heating in a sealed container at 60 ° C. for 10 hours, and then centrifuged (5,000 × g for 30 minutes) to remove the precipitate. Next, it was mixed with DEAE-cellulose (manufactured by Pharmacia) equilibrated with 0.02M phosphate buffer (pH 7.2), adsorbed thereto, 0.02M phosphate buffer (pH 7.2) and 0.15M. Washing sequentially with 0.02M phosphate buffer (pH 7.2) containing saline, followed by elution with 0.02M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.25M sodium chloride, the eluate was subjected to ultrafiltration. (Amicon, H10P10).
[0031]
Using a column (diameter 20 cm, length 80 cm) packed with Sephacreel S-300 (registered trademark, manufactured by Pharmacia), the concentrated solution was gel-filtered with 1M ammonium sulfate addition buffer (pH 7.2) to obtain a molecular weight range. A fraction of 70,000 to 150,000 daltons was adsorbed to a phenyl sepharose 4B (registered trademark, manufactured by Pharmacia) column (diameter 10 cm, length 20 cm) equilibrated with the above 1M ammonium sulfate addition buffer (pH 7.2). And then eluted with 0.5 M ammonium sulfate addition buffer (pH 7.2).
[0032]
The eluate is concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon, H10P10), subjected to high performance liquid chromatography using a TSKG-3000SW (Toyo Soda Co., Ltd.) column (diameter 2.5 cm, length 60 cm), and the molecular weight range. A fraction of 70,000-150,000 daltons was obtained. This fraction was again concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon, H10P10), and 0.1% with a Hi-Pore 214TP (registered trademark, Baidak) reverse phase column (diameter 2.5 cm, length 60 cm). M-CSF was eluted by high performance liquid chromatography using a linear concentration gradient of acetonitrile 1 to 100% (pH 2.0) containing trifluoroacetic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the eluate was freeze-dried. This method was repeated to obtain about 50 mg of M-CSF.
As a result of measuring the specific activity of the obtained M-CSF by the same method as in Test Example 1, it was 1.0 × 10 ⁸ units / mg protein.
[0033]
The obtained M-CSF was dissolved at a concentration of 2.5 mg / ml in a 0.15 M sodium chloride-containing phosphorus buffer solution (pH 7.2) containing 1% mannitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Bacteria sterilized using a filter sterilizer equipped with a sterile filter membrane (Millipore), aseptically filled into glass vials that have been sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours in advance, and freeze-dried. Thereafter, the vial was sealed and a transplanted immunosuppressant was prepared.
[0034]
Example 2
(Preparation of transplantation immunosuppressant from recombinant cell culture)
The anti-M-CSF antibody obtained by immunizing rabbits with purified recombinant M-CSF was dialyzed in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) to adjust the concentration to 20 mg / ml, and the antibody 200 ml of the solution was added to 100 g of formyl-cellulofine (manufactured by Seikagaku Corporation) previously washed with distilled water and 0.1 M phosphate buffer, stirred at room temperature for 2 hours, and sodium cyanoborohydride (Wako Pure Chemical) (Manufactured by Kogyo Co., Ltd.) 700 mg was added, and the mixture was further stirred for 16 hours to bind formyl-cellulofine and anti-M-CSF antibody to prepare an antibody-binding support. Wash with 0.2M Tris-HCl buffer, add 200 ml of Tris buffer containing 500 mg of sodium cyanoborohydride, and stir at room temperature for 4 hours to inactivate unreacted groups. Wash thoroughly with 0.02M phosphate buffer containing 5M sodium chloride. This antibody-bound support bound 32.6 mg of anti-M-CSF antibody per gram of support.
[0035]
Recombinant cells capable of expressing M-CSF disclosed in Japanese Patent Publication No. 1-502397 (CHO cells; obtained from Genetics Institute Inc.) 10 l of the culture solution was concentrated with an ultrafiltration concentrator. , Desalted, adsorbed on DEAE-cellulose, removed non-adsorbed contaminants, eluted with 0.3M aqueous sodium chloride solution, adjusted to a concentration of 0.5M by adding sodium chloride to the eluate, -A solution containing CSF was prepared. The specific activity of this M-CSF was 3 × 10 ⁶ units / mg.
[0036]
This M-CSF-containing solution (total amount: 500 ml) was added to 100 g of the antibody-binding support, and the mixture was stirred overnight at 10 ° C. or lower to perform batch chromatography. After stirring, the mixture was filtered with a glass filter, and the antibody-bound support was collected. The antibody-bound support was thoroughly washed with 0.02M phosphate buffer containing 0.5M sodium chloride. After washing, 500 ml of 0.2 M acetate buffer (pH 2.5) was added and stirred at 10 ° C. for 1 hour to elute M-CSF. The pH of the eluate was adjusted to 7.0, and concentrated and desalted with an ultrafiltration membrane to obtain an M-CSF fraction.
[0037]
This fraction was subjected to Hi-Pour 214TP (Vydac Corporation, diameter 2.2, length 25 cm) reverse phase column containing 0.1% trifluoroacetic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in acetonitrile 0 to 100% (pH 2. 0) was subjected to high performance liquid chromatography using a linear concentration gradient, and M-CSF was collected and lyophilized to obtain about 20 mg of M-CSF.
The specific activity of the obtained M-CSF was measured by the same method as in Test Example 1, and as a result, it was 1.9 × 10 ⁸ units / mg protein.
[0038]
The obtained M-CSF was added to a 0.15 M sodium chloride-containing phosphate buffer (pH 7.2) containing 1% mannitol at a M-CSF concentration of 1 mg / ml, and a nitrocellulose-based sterile filter membrane was attached. The glass vials were sterilized using the filter sterilization apparatus (Millipore), pre-sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours, aseptically filled 1 ml at a time, lyophilized, Sealed and a transplanted immunosuppressant was prepared.
[0039]
【The invention's effect】
As described in detail above, the present invention relates to a transplant immunosuppressive agent characterized by containing monocyte / macrophage colony stimulating factor (M-CSF) as an active ingredient. The main effects are as follows.
1) The transplant immunosuppressive agent of the present invention is effective in suppressing the transplantation immune reaction of the recipient (host) against the graft (graft).
2) The transplant immunosuppressant of the present invention suppresses transplant immune reaction and is effective in improving graft survival and survival rate.
3) The transplanted immunosuppressive agent of the present invention has the advantage of fewer side effects compared to conventional immunosuppressive agents.
4) The transplant immunosuppressive agent of the present invention is useful for suppressing the transplantation immune reaction of a living body against a graft (graft) in allogeneic transplantation of cells, tissues, organs and the like.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an example of test results regarding the effect of M-CSF on graft (graft) survival rate.

Claims

A transplantation immunosuppressant containing a monocyte / macrophage colony stimulating factor as an active ingredient, and suppressing a transplantation immune reaction of a recipient (host) to a graft (graft) in allogeneic transplantation.

The monocyte / macrophage colony stimulating factor is obtained from human urine, a culture solution of monocyte / macrophage colony stimulating factor-producing cells, or a culture solution of monocyte / macrophage colony stimulating factor gene recombinant cells. Item 12. The transplant immunosuppressant according to Item 1.