JP3758333B2 - Method for producing carboxylic acid by biological hydrolysis and optical resolution method by biological hydrolysis - Google Patents

Description

【０００６】
で表されるアミド化合物を加水分解することにより下記一般式（II）
【０００７】
【化１５】

【０００８】
［上記一般式（Ｉ）及び一般式（II）中、Ｒは置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₁₈のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₈のアルケニル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₈のアルキニル基、置換基を有していてもよいＣ₃ 〜Ｃ₁₀のシクロアルキル基、置換基を有していてもよいＣ₃ 〜Ｃ₁₀のシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいＣ₆ 〜Ｃ₁₄のアリール基、または置換基を有していてもよい複素環残基を表し、Ｒ¹ はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表す。但し、Ｒ¹ がメチル基またはエチル基を表す場合には、Ｒは
【０００９】
【化１６】

【００１０】
｛上記式中、Ｒ² は置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₀のアルケニル基または置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₀のアルキニル基を表し、Ｒ³ はハロゲン原子、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₅ のアルキル基を有していてもよいアミノ基またはヒドロキシル基を表すか、Ｒ² とＲ³ とが結合してＲ² Ｒ³ ＣＨで
【００１１】
【化１７】

【００１２】
（上記式中、Ｒ⁴ ははそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ₂ 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ⁵ （式中、Ｒ⁵ は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）を表す。｝で示される基を表す。］で表される酸を製造する方法に存する。本発明は、詳しくは選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した（Ｓ）−カルボン酸もしくは（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物もしくは（Ｓ）−アミド化合物を単離することにより、光学活性なカルボン酸または光学活性なアミド化合物を製造する方法に存し、さらには、選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III ）
【００１３】
【化１８】

【００１４】
（上記一般式（III ）中、Ｒ¹ はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表し、Ｒ⁴ はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ₂ 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ⁵ （式中、Ｒ⁵ は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（IV）
【００１５】
【化１９】

【００１６】
（上記一般式（IV）中、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｓ）−カルボン酸もしくは下記一般式（Ｖ）
【００１７】
【化２０】

【００１８】
（上記一般式（Ｖ）中、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物もしくは（Ｓ）−アミド化合物を単離することにより、光学活性なカルボン酸または光学活性なアミド化合物を製造する方法に存する。
上記一般式（Ｉ）及び（II）におけるＲで定義される直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₁₈のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₅ のアルキル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₈のアルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₅ のアルケニル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₈のアルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₅ のアルキニル基であり、Ｃ₃ 〜Ｃ₁₀のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられ、Ｃ₃ 〜Ｃ₁₀のシクロアルケニル基としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基、シクロノネニル基、シクロデセニル基等が挙げられ、Ｃ₆ 〜₁₄のアリール基としてはフェニル基、ナフチル基、アントリル基等が挙げられ、複素環残基としては、フラン環、ジヒドロフラン環、テトラヒドロフラン環、ピラン環、ジヒドロピラン環、テトラヒドロピラン環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、クロメン環、クラマン環、イソクロマン環、チオフェン環、ベンゾチオフェン環、ピロール環、ピロリン環、ピロリジン環、イミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、ピラゾール環、ピラゾリン環、ピラゾリジン環、トリアゾール環、テトラゾール環、ピリジン環、ピリジンオキシド環、ピペリジン環、ピラジン環、ピペラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、インドリジン環、インドール環、インドリン環、イソインドール環、イソインドリン環、インダゾール環、ベンゾイミダゾール環、プリン環、キノリジン環、キノリン環、フタラジン環、ナフチリジン環、キノキサリン環、キナゾリン環、シンノリン環、プテリジン環、オキサゾール環、オキサゾリジン環、イソキサゾール環、イシキサゾリジン環、チアゾール環、チアジリジン環、イソチアゾール環、イソチアゾリジン環、ジオキサン環、ジチアン環、モルホリン環、チオモルホリン環等の酸素原子、硫黄原子、窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜４個有し、環を形成する総原子数が５〜１０の複素環の残基が挙げられる。尚、これらの基はカルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ₂ 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ⁶ （式中、Ｒ⁶ は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基を表す）からなる群より選ばれる１以上の置換基を有していてもよい。Ｒとしては、好ましくは複素環残基、更に好ましくはピペラジニル基が挙げられる。
【００１９】
上記一般式（Ｉ）及び（III ）のＲ¹ はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表すが、好ましくはｔ−ブチル基を表す。
また、Ｒ² で定義される直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₅ のアルキル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₀のアルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₅ のアルケニル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₁₀のアルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₂ 〜Ｃ₅ のアルキニル基が挙げられる。尚、これらの基はカルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ₂ 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ⁶ （式中、Ｒ⁶ は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基を表す）からなる群より選ばれる１以上の置換基を有していてもよい。
【００２０】
Ｒ³ で定義される直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₅ のアルキル基を有していてもよいアミノ基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基等を有していてもよいアミノ基が挙げられ、アミノ基に置換している直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₅ のアルキル基には更にカルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ₂ 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ⁶ （式中、Ｒ⁶ は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基を表す）からなる群より選ばれる１以上の置換基を有していてもよい。
また、上記一般式（III ）、（IV）及び（Ｖ）並びにＲ² とＲ³ が結合したＲ² Ｒ³ ＣＨである
【００２１】
【化２１】

【００２２】
としては置換基を有していてもよいアジリジニル基、ピロリジニル基、イミダゾリジニル基、ピラゾリジニル基、モルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基等が挙げられ、好ましくはピペラジニル基である。これらの置換基としては、カルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ₂ 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁ 〜Ｃ₄ のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ⁵ （式中、Ｒ⁵ は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のアルキル基を表す）が挙げられる。
本発明の好ましい実施の形態としては、選択的に光学異性体のＳ体を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III ）
【００２３】
【化２２】

【００２４】
（上記一般式（III ）中、Ｒ¹ 、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（IV）
【化２３】

（上記一般式（IV）中、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｓ）−カルボン酸または下記一般式（VI）
【化２４】

（上記一般式（VI）中、Ｒ¹ 、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物を単離することにより（Ｓ）−カルボン酸または（Ｒ）−アミド化合物を製造する方法が挙げられる。
また、本発明の別の好ましい実施形態としては、選択的に光学異性体のＲ体を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III ）
【００２５】
【化２５】

【００２６】
（上記一般式（III ）中、Ｒ¹ 、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（Ｖ）
【００２７】
【化２６】

【００２８】
（上記一般式（Ｖ）中、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｒ）−カルボン酸または下記一般式（VII ）
【００２９】
【化２７】

【００３０】
（上記一般式（III ）中、Ｒ¹ 、Ｒ⁴ 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される加水分解されなかった（Ｓ）−アミド化合物を単離することにより（Ｒ）−カルボン酸または（Ｓ）−アミド化合物を製造する方法が挙げられる。
本発明で使用する微生物としてはアミド化合物のアミド結合を加水分解する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、好ましくはロイコバクター属、ミコバクテリウム属、リゾビウム属あるいはシュードモナス属に属する微生物が挙げられ、より詳細には工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９３０及びＦＥＲＭ Ｐ−１５９７０として寄託されているＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株から選択される微生物あるいはシュードモナス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ ＩＡＭ１６０３）が挙げられる。選択的に光学異性体のＳ体を加水分解する微生物としては、好ましくはロイコバクター属、ミコバクテリウム属またはリゾビウム属に属する微生物が挙げられ、好ましい菌株としては、工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９３０及びＦＥＲＭ Ｐ−１５９７０として寄託されているＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株から選択される微生物が挙げられる。選択的に光学異性体のＲ体を加水分解する微生物としてはシュードモナス属に属する微生物が挙げられ、好ましい菌株としてはシュードモナス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ ＩＡＭ１６０３）が挙げられる。尚、微生物を使用する際には、菌体のままでもよいし、該菌体の処理物でもよいし、菌体と該菌体処理物を併せて使用してもよい。
【００３１】
選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物を用いた場合、反応液または培養液中の加水分解により生成した有機カルボン酸または加水分解されなかったＮ−ｔ−ブチルアミド化合物を溶媒抽出、クロマトグラフィー等の常法により単離することにより光学分割を行うことができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する微生物のうち光学異性体のＳ体を選択的に加水分解する微生物としては、例えばＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株、ＭＣＩ３３６０株等が挙げられる。ＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株は本発明者らにより天然土壌から分離された細菌であり、それぞれ工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９３０、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９７０として寄託されている。ＭＣＩ３３３１株及びＭＣＩ３３３２株の菌学的性状は以下の通りである。
【００３３】
【表１】

【００３４】
６．分類学的考察
（１）高次の同定
ＭＣＩ３３３１及び３３３２株は１）グラム陽性、２）細胞は短桿〜桿状を示すが、顕著な多形性は示さない、３）芽胞を形成しない、４）運動性を持たない、５）細胞壁中にジアミノ酪酸を持つ、６）メナキノンＭＫ１１を有する、７）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は６８〜７０％を示す、などの特徴を持っている。これらの特徴から、両菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第２巻、１２６１〜１４３４頁（１９８６）及び、プロカリオート［Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ］第２版（１９９２）、第２巻、１３５５〜１３６８頁に記載されているＩｒｒｅｇｕｌａｒ，Ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ，Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｏｄｓに近縁であることが示唆された。これらの菌群は細胞壁のアミノ酸組成など化学分類学的特徴によって属の定義が明確に行われている。そこで細胞壁にジアミノ酪酸を持つ属及びその周辺菌と両菌株について比較を行ったところ、下記表２に示すように、ＭＣＩ３３３１及び３３３２株は化学分類学的性状においてロイコバクター属（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ）の特徴とほぼ一致した。
【００３５】
【表２】

【００３６】
（２）属の同定
ロイコバクター属はインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第４６巻、Ｎｏ．４、９６７〜９７１頁（１９９６）に新属として記載されており、ロイコバクター コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅ）ＩＦＯ１５２４５、１種を含んでいる。そこで本菌株ＭＣＩ３３３１及び３３３２株と、ロイコバクター属との系統学的関係を明らかにするため、両菌株及びロイコバクター コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅ）ＩＦＯ１５２４５株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（約１５００ｂｐ）を決定した。得られた塩基配列に基づき、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＤＢＪのデータベースにおいて検索を行い系統樹を作成した。その結果、図１に示すように、ＭＣＩ３３３１、３３３２株及びロイコバクター コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅ）は、独立した１つのグループとして系統枝を形成し、両菌株はロイコバクター属に帰属することが判明した。しかし、ロイコバクター コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅ）とはＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量が異なっており、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に基づく系統樹からも、種レベルで異なっている可能性が示された。また、本菌株ＭＣＩ３３３１株と３３３２株は、生育温度やクエン酸の利用などの点で異なっており、明らかに区別された。
以上のことから、本菌株をそれぞれ、ロイコバクター エスピー（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＭＣＩ３３３１株及びＭＣＩ３３３２株と同定した。
次に、ＭＣＩ３３４６株の菌学的性質は以下の通りである。
【００３７】
１．形態的性質
プレインハートインフュージョン寒天培地上、３０℃、培養２４時間後及び３日後に顕微鏡観察を行った。ＭＣＩ３３４６株は短桿状〜桿状を示し、培養初期においても菌糸状にはならない。細胞は運動性を有しない。気菌糸、胞子及び胞子嚢は観察されなかった。
２．培養的性質
ＩＳＰ［インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）］規定の培地上、３０℃、７日間培養後のＭＣＩ３３４６株の性状を以下の表３に示した。
【００３８】
【表３】

【００３９】
（５）炭素源の利用( プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上で３０℃、７日間培養)
ＭＣＩ３３４６株は炭素源無添加の対照培地でも若干の生育が見られたため、対照を−とする資化性を表４に示した。
【００４０】
【表４】

【００４１】
４．化学分類学的性質
ＭＣＩ３３４６株の化学分類学的性質を表５に示した。
【００４２】
【表５】

【００４３】
５．分類学的考察
（１）高次の同定
ＭＣＩ３３４６株は１）細胞壁ペプチドグリカンにｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を有する、２）全菌体加水分解物中にアラビノース及びガラクトースを含む、３）細胞壁ペプチドグリカンのＮ−アシル型はグリコリル型である、などの化学分類学的特徴を持っている。これらの特徴から、本菌株はプロカリオート［Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏ−ｔｅｓ］第２版（１９９２）、第２巻、１１８０〜１２７０頁に記載されているノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、あるいはミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属することが示唆された。
【００４４】
（２）属の同定
これらの菌群はメナキノンの分子種及び、この菌群に特徴的な菌体成分であるミコール酸の分子種で属の識別が可能である。本菌株ＭＣＩ３３４６は４）メナキノンとしてＭＫ９（Ｈ₂ ）を持つことから、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）に含まれるゴルドナ属（Ｇｏｒｄｏｎａ）、もしくはミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であることが分かった。
しかし、本菌株はゴルドナ属のような培養時間による多形性、ロッド−コッカスサイクル（Ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓ ｃｙｃｌｅ）を示さず、また、薄相クロマトグラフィを用いて、本菌株と各属とのミコール酸を分析、比較したところ、本菌株はミコバクテリウム属と同様のＲｆ値を示し、明らかにゴルドナ属及びその他の属とは区別された。
従って、以上の結果から本菌株ＭＣＩ３３４６株をミコバクテリウム エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
次に、ＭＣＩ３３６０株の菌学的性状は以下の通りである。
【００４５】
【表６】

【００４６】
６．分類学的考察
（１）高次の同定
ＭＣＩ３３６０株は１）グラム陰性桿菌、２）好気性、３）芽胞を形成しない、４）周鞭毛による運動性を有する、５）３−ケトラクトースを生成しない、６）ユビキノンＱ１０を有する、７）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は６５モル％、７）菌体脂肪酸としてＣ_18:1を多く含有するなどの特徴を持っている。これらの特徴から、両菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第１巻、２３４〜２５６頁（１９８４）に記載されているリゾビアシーエ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に帰属することが示唆された。
【００４７】
（２）属の同定
リゾビアシーエ科にはリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びフィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が含まれている。本菌株は周鞭毛を有することから、リゾビウム属もしくはアグロバクテリウム属に近縁であることが示唆された。
【００４８】
次にグラム陰性菌の分類、同定に有効な指標とされている、ハイドロキシ脂肪酸について比較を行った。ＩＦＯ リサーチ・コミュニケーション［Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ］第１５巻、５７〜７５頁（１９９１）では、ハイドロキシ脂肪酸の組成により、リゾビアシーエ科に属する菌群を種または種以下のレベルで分類している。本菌株ＭＣＩ３３６０は共通する３−ＯＨ−Ｃ_14:0以外に、少量の３−ＯＨ−Ｃ_16:0及び３−ＯＨ−Ｃ_18:0を含み、２−ハイドロキシ脂肪酸を持たない。この脂肪酸パターンはリゾビウム メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、リゾビウム フレディ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）及びリゾビウム ガレガ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｅｇａｅ）に類似していた。またアグロバクテリウム属の菌群とはいずれも一致しなかったことから、本菌株はリゾビウム属に帰属するのが妥当と思われた。
以上のことから、本菌株ＭＣＩ３３６０をリゾビウム エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
【００４９】
本発明で使用する微生物のうち光学異性体のＲ体を選択的に加水分解する微生物としては、例えばシュードモナス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ ＩＡＭ１６０３）が挙げられる。この菌株は公知の菌株であり、東京大学分子細胞生物学研究所（ＩＡＭ）より容易に入手できる。
また、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株んどのいずれの株であってもよい。
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物のアミド結合に作用しこれを一般式（II）で表される有機カルボン酸へ変換する能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００５０】
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については常法通り行うことができる。本微生物の培養のために用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトンその他が適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。以上の成分以外にも、ピペラジンカルボン酸やピラジンアミド、ピペラジンアミド、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−ブチルアミド、ｉｓｏ−ブチロニトリル、ｉｓｏ−ブチルアミド、クロトンニトリル、クロトンアミド、メタクリロニトリル、メタクリルアミド等のニトリル化合物やアミド化合物、好ましくはピラジンアミドやピペラジンアミドを加えることにより、高活性が得られることもある。また、炭素源、窒素源として上記のニトリル化合物やアミド化合物を用いることもできる。培養は、好気的条件下に、ｐＨ約６〜８、温度約１５〜３５℃の適当な範囲に制御しつつ１０〜１００時間行う。
【００５１】
上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物に上記微生物を作用させて有機カルボン酸を製造する方法として、本微生物を培養し、得られた菌体懸濁液に上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物を添加し反応させ有機カルボン酸を得る方法、培地に上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物を添加し培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後、上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物を添加して更に培養を行う方法等を用いることができる。反応温度は１５〜４０℃が好ましく、ｐＨ５〜１２の範囲が好ましい。上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物濃度は０．１〜１０％の範囲が望ましく、必要ならば上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物は反応の間、追補添加される。また、必要に応じて金属イオンを添加することにより反応が促進される場合がある。
培養及び反応で得られた有機カルボン酸または未反応のアミド化合物の採取方法としては溶媒抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法により行うことができる。例えば、アミド化合物はクロロホルムや酢酸エチル等を用いた溶媒抽出により抽出できる。また逆相カラムを用いれば、水とメタノールやアセトニトリル等の溶媒との混合液で、有機カルボン酸と未反応のアミド化合物を各々単独で溶出させることも可能である。
【００５２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１
ピラジンアミド ５．０ｇ／Ｌ、イーストエキス ３．０ｇ／Ｌ、肉エキス
１．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（組成を表９に示す）５ｍＬ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、ＭＣＩ３３３１株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジン２．５ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了後、反応液を塩化ナトリウムで飽和した後クロロホルムにて抽出を行った。得られた（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは２．２５ｍｇであり、光学純度は９８％ｅ．ｅ．であった。尚、水層中の（Ｓ）−２−カルボキシピペラジン蓄積量は０．８５ｇ／Ｌであり、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度は高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で測定した。Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンのＳ体の保持時間は下記分析条件１において８．９分であり、Ｒ体の保持時間は１１．５分であった。２−カルボキシピペラジンについては下記分析条件１においてはＳ体が２．２分、Ｒ体が３．６分であり、分析条件２においてはＳ体が５．３分、Ｒ体が３．７分であった。得られたＮ−ｔ−ブチルアミドピペラジンと２−カルボキシピペラジン各々について¹ Ｈ−ＮＭＲにて構造確認を行った。Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは（ＣＤＣｌ₃ ，４００ＭＨｚ）条件下で、δ（ppm ）＝１．３３（９Ｈ，ｓ），２．６７〜２．７９（３Ｈ，ｍ），２．８２〜２．９３（２Ｈ，ｍ），３．１３〜３．２０（２Ｈ，ｍ），６．７５（１Ｈ，ｂｒ）であり、２ーカルボキシピペラジン２塩酸塩は（Ｄ₂ Ｏ，４００ＭＨｚ）条件下で、δ（ppm ）＝３．２２〜３．３８（３Ｈ，ｍ），３．５４〜３．６６（２Ｈ，ｍ），３．８０（１ｈ，ＤＤ，ｊ＝１４．０ｈＺ，３．６ｈＺ），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．６Ｈｚ）であった。
【００５３】
【表７】

【００５４】
実施例２
グリセロール １０．０ｇ／Ｌ、ピラジンアミド２．０ｇ／Ｌ、イーストエキス ２．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ２．０ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、ＭＣＩ３３３２株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルメタクリルアミド１０ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了後のメタクリル酸蓄積量は３ｇ／Ｌであった。尚、メタクリル酸は高速液体クロマトグラフィーにより、下記条件３にて測定した。
【００５５】
【表８】

【００５６】
実施例３
ピラジンアミド ５．０ｇ／Ｌ、イーストエキス ３．０ｇ／Ｌ、肉エキス１．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（表９）５ｍｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、ＭＣＩ３３４６株を接種し、２７℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジン２．５ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了後、反応液を塩化ナトリウムで飽和した後クロロホルムにて抽出を行った。得られた（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは２．３７ｍｇであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．であった。尚、水層中の（Ｓ）−２−カルボキシピペラジン蓄積量は０．８５ｇ／Ｌであり、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００５７】
実施例４
実施例３と同様の培地、つまりピラジンアミド ５．０ｇ／Ｌ、イーストエキス ３．０ｇ／Ｌ、肉エキス １．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（表９）５ｍｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地１００ｍＬに、ＭＣＩ３３６０株を接種し、３０℃で１４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジン２．５ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で４８時間反応させた。反応終了後、実施例３と同様の処理にて得られた（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは２．６１ｍｇであり、光学純度は７７％ｅ．ｅ．であった。尚、水層中の（Ｓ）−２−カルボキシピペラジン蓄積量は０．７８ｇ／Ｌであり、光学純度は８０％ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００５８】
実施例５
ニュートリエントブロス １０．０ｇ／Ｌ、ＤＬ−リンゴ酸ナトリウム １０．０ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １．０ｇ／Ｌ、硫酸鉄・７水塩 ０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（表９）５ｍＬ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地１００ｍＬに、シュードモナス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ ＩＡＭ１６０３）株を接種し、３０℃で１２時間好気的に培養した。
得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミド５．０ｇ／Ｌを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量を１０ｍＬとし３０℃で好気条件下で４８時間反応させた。反応終了後、反応液を塩化ナトリウムで飽和した後クロロホルムにて抽出を行った。得られた（Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドは１５．２ｍｇであり、光学純度は９８％であった。尚、水層中の（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の蓄積量は１．２８ｇ／Ｌであり光学純度は７０％であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００５９】
実施例６
実施例５と同様に培養して得られた、シュードモナス アゾトフォルマンス
ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ ＩＡＭ１６０３）の菌体を超音波処理により破砕し、超遠心分離によって無細胞抽出液を得た。本抽出液より、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及びゲルろ過の操作により、Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドをＲ体選択的にそのアミド結合を加水分解する酵素蛋白質を高度に精製した。この蛋白質溶液（０．２ｇ蛋白質／Ｌ）１００μＬを、Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを５．０ｇ／Ｌ含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液１．０ｍＬに添加して、３０℃でかく拌し反応させた。２４時間後、本反応液を上記高速液体クロマトグラフィー分析条件２により分析したところ、１．７２ｇ／Ｌの（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸を検出し、生成したピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．であった。また、同液を高速液体クロマトグラフィー分析条件１において分析したところ、残存したＮ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドの光学純度は９９．６ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００６０】
【表９】

【００６１】
【本発明の効果】
本発明によって、微生物を利用して、Ｎ−ｔ−ブチルアミド化合物から有機酸を簡便に製造することが可能になったのみならず、加水分解により光学活性な有機カルボン酸の製造及びラセミ体のＮ−ｔ−ブチルアミド化合物の光学分割を容易に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列による、本発明の菌株とその周辺菌との系統関係を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing an organic acid by biological hydrolysis and an optical resolution method by biological hydrolysis.
[0002]
[Prior art]
Organic acids or amide compounds are useful compounds as intermediate raw materials for pharmaceuticals and agricultural chemicals. Conventionally, many methods for synthesizing an organic acid by hydrolyzing an amide bond of an organic amide compound have been known, such as a method using an alkali. Further, as an optical resolution of a racemic Nt-butylamide compound by an organic chemical method, a method using a resolving agent such as optically active lactic acid in Nt-butyl-2-piperazinecarboxamide (JP-A-8-3145) It has been known. On the other hand, as a method of biologically optically resolving a racemic amide compound and obtaining an optically active organic acid, cyclic S-α-aminocarboxylic acid and cyclic R-α-aminocarboxamide are obtained from cyclic α-aminocarboxamide. Has been reported (Japanese Patent Laid-Open No. 8-56652). However, a method for enzymatically hydrolyzing the amide bond of an Nt-butylamide compound to produce an organic carboxylic acid has not been found so far.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Conventional methods for producing organic acids by chemical synthesis require harsh reaction conditions and thus have a limited range of application. Furthermore, when the obtained organic acid has an asymmetric carbon, it is necessary to optically resolve the racemate using an appropriate resolving agent in order to use it as an intermediate for pharmaceuticals or agricultural chemicals. Alternatively, no effective method has been found in terms of cost. Therefore, development of a method for optically resolving a racemate and a method for synthesizing an organic acid has been required without causing these problems.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found a microorganism having an ability to hydrolyze an amide bond, and have completed the present invention. Furthermore, as a result of further intensive studies, a microorganism having the ability to selectively hydrolyze one of the optical isomers was found, and if an amide bond was hydrolyzed using the microorganism body and / or the treated body of the microorganism, optical properties could be obtained. It has been found that an active organic carboxylic acid can be produced. As a result, it has been found that an amide compound can be optically resolved by this method, and the present invention has been achieved.
That is, the gist of the present invention is the following general formula (I) in the presence of a microbial cell and / or a processed product of the microbial cell.
[0005]
Embedded image

[0006]
By hydrolyzing the amide compound represented by the following general formula (II)
[0007]
Embedded image

[0008]
[In the above general formula (I) and general formula (II), R is a linear or branched C which may have a substituent. ₁ ~ C ₁₈ An alkyl group or a linear or branched C which may have a substituent ₂ ~ C ₁₈ An alkenyl group or a linear or branched C which may have a substituent ₂ ~ C ₁₈ An alkynyl group, optionally substituted C _Three ~ C _Ten Of cycloalkyl group, optionally having C _Three ~ C _Ten Of the cycloalkenyl group and C which may have a substituent ₆ ~ C ₁₄ An aryl group, or a heterocyclic residue optionally having a substituent, R ¹ Represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group. However, R ¹ Is a methyl group or an ethyl group, R is
[0009]
Embedded image

[0010]
{In the above formula, R ² Is a linear or branched C which may have a substituent ₁ ~ C _Ten An alkyl group or a linear or branched C which may have a substituent ₂ ~ C _Ten Linear or branched C which may have an alkenyl group or a substituent ₂ ~ C _Ten Represents an alkynyl group of R ^Three Is a halogen atom or a linear or branched C which may have a substituent. ₁ ~ C _Five Represents an amino group or a hydroxyl group which may have an alkyl group of ² And R ^Three Combined with R ² R ^Three In CH
[0011]
Embedded image

[0012]
(In the above formula, R ^Four Each independently represents a carboxyl group, a halogen atom, or NO. ₂ CN, linear or branched C ₁ ~ C _Four Alkyl group, linear or branched C ₁ ~ C _Four An alkoxy group or -CONHR ^Five (Wherein R ^Five Is a hydrogen atom or linear or branched C ₁ ~ C _Four X represents -NH- or -O-, p represents an integer of 0 to 3, m, n and r represent 0, 1 or 2, and q represents 0 or 1 Represents. However, 2 ≦ m + n + r + q ≦ 4. ). } Is represented. ] In the method of manufacturing the acid represented by this. Specifically, the present invention is produced by reacting a microbial cell having the ability to selectively hydrolyze one of optical isomers and / or a treated product thereof with an (RS) -amide compound ( By isolating S) -carboxylic acid or (R) -carboxylic acid or non-hydrolyzed (R) -amide compound or (S) -amide compound, optically active carboxylic acid or optically active amide compound is obtained. In addition, a microbial cell and / or a processed product of a microorganism having the ability to selectively hydrolyze one of the optical isomers is represented by the following general formula (III):
[0013]
Embedded image

[0014]
(In the above general formula (III), R ¹ Represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group, and R ^Four Each independently represents a carboxyl group, a halogen atom, or NO. ₂ CN, linear or branched C ₁ ~ C _Four Alkyl group, linear or branched C ₁ ~ C _Four An alkoxy group or -CONHR ^Five (Wherein R ^Five Is a hydrogen atom or linear or branched C ₁ ~ C _Four X represents -NH- or -O-, p represents an integer of 0 to 3, m, n and r represent 0, 1 or 2, and q represents 0 or 1 Represents. However, 2 ≦ m + n + r + q ≦ 4. The following general formula (IV) produced by hydrolysis with a (RS) -amide compound represented by
[0015]
Embedded image

[0016]
(In the above general formula (IV), R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. (S) -carboxylic acid represented by the following general formula (V)
[0017]
Embedded image

[0018]
(In the above general formula (V), R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. To produce an optically active carboxylic acid or an optically active amide compound by isolating the (R) -carboxylic acid represented by (1) or the (R) -amide compound or the (S) -amide compound that has not been hydrolyzed. Lies in how to do.
Linear or branched C defined by R in the above general formulas (I) and (II) ₁ ~ C ₁₈ As the alkyl group, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, s-butyl group, i-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, i-pentyl group Group, t-pentyl group, n-hexyl group, i-hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, octadecyl group, etc. , Preferably linear or branched C ₁ ~ C _Five A linear or branched C ₂ ~ C ₁₈ Examples of the alkenyl group include vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group, etc., preferably linear or Branched C ₂ ~ C _Five An alkenyl group having a linear or branched C ₂ ~ C ₁₈ Examples of the alkynyl group include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group, etc., preferably linear or Branched C ₂ ~ C _Five An alkynyl group of C _Three ~ C _Ten Examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, a cyclononyl group, and a cyclodecyl group. _Three ~ C _Ten Examples of the cycloalkenyl group include cyclopropenyl group, cyclobutenyl group, cyclopentenyl group, cyclohexenyl group, cycloheptenyl group, cyclooctenyl group, cyclononenyl group, cyclodecenyl group, etc. ₆ ~ ₁₄ Examples of the aryl group include a phenyl group, a naphthyl group, and an anthryl group, and examples of the heterocyclic residue include a furan ring, a dihydrofuran ring, a tetrahydrofuran ring, a pyran ring, a dihydropyran ring, a tetrahydropyran ring, a benzofuran ring, Benzofuran ring, chromene ring, claman ring, isochroman ring, thiophene ring, benzothiophene ring, pyrrole ring, pyrroline ring, pyrrolidine ring, imidazole ring, imidazoline ring, imidazolidine ring, pyrazole ring, pyrazoline ring, pyrazolidine ring, triazole ring, Tetrazole ring, pyridine ring, pyridine oxide ring, piperidine ring, pyrazine ring, piperazine ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, indolizine ring, indole ring, indoline ring, isoindole ring, isoindoline ring, indazole ring, benzo Midazole ring, purine ring, quinolidine ring, quinoline ring, phthalazine ring, naphthyridine ring, quinoxaline ring, quinazoline ring, cinnoline ring, pteridine ring, oxazole ring, oxazolidine ring, isoxazole ring, isixazolidine ring, thiazole ring, thiaziridine ring, isothiazole A ring, an isothiazolidine ring, a dioxane ring, a dithiane ring, a morpholine ring, a thiomorpholine ring, etc., having 1 to 4 heteroatoms selected from oxygen atoms, sulfur atoms, and nitrogen atoms, and the total number of atoms forming the ring is 5 -10 heterocyclic residues. These groups are carboxyl group, halogen, NO ₂ CN, linear or branched C ₁ ~ C _Four Alkyl group, linear or branched C ₁ ~ C _Four An alkoxy group and -CONHR ⁶ (Wherein R ⁶ Is a hydrogen atom or linear or branched C ₁ ~ C _Four And may have one or more substituents selected from the group consisting of: R is preferably a heterocyclic residue, more preferably a piperazinyl group.
[0019]
R in the above general formulas (I) and (III) ¹ Represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group, preferably a t-butyl group.
R ² Linear or branched C as defined by ₁ ~ C _Ten As the alkyl group, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, s-butyl group, i-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, i-pentyl group Group, t-pentyl group, n-hexyl group, i-hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, etc., preferably linear or branched C ₁ ~ C _Five A linear or branched C ₂ ~ C _Ten Examples of the alkenyl group include vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group, etc., preferably linear or Branched C ₂ ~ C _Five An alkenyl group having a linear or branched C ₂ ~ C _Ten Examples of the alkynyl group include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group, etc., preferably linear or Branched C ₂ ~ C _Five Of the alkynyl group. These groups are carboxyl group, halogen, NO ₂ CN, linear or branched C ₁ ~ C _Four Alkyl group, linear or branched C ₁ ~ C _Four An alkoxy group and -CONHR ⁶ (Wherein R ⁶ Is a hydrogen atom or linear or branched C ₁ ~ C _Four And may have one or more substituents selected from the group consisting of:
[0020]
R ^Three Linear or branched C as defined by ₁ ~ C _Five As the amino group which may have an alkyl group, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, s-butyl group, i-butyl group, t-butyl group , An amino group which may have an n-pentyl group, i-pentyl group, t-pentyl group, etc., and a linear or branched C substituted with an amino group ₁ ~ C _Five In addition, the alkyl group further includes a carboxyl group, halogen, NO ₂ CN, linear or branched C ₁ ~ C _Four Alkyl group, linear or branched C ₁ ~ C _Four An alkoxy group and -CONHR ⁶ (Wherein R ⁶ Is a hydrogen atom or linear or branched C ₁ ~ C _Four And may have one or more substituents selected from the group consisting of:
In addition, the above general formulas (III), (IV) and (V) and R ² And R ^Three R bound to ² R ^Three CH
[0021]
Embedded image

[0022]
Examples thereof include an aziridinyl group, pyrrolidinyl group, imidazolidinyl group, pyrazolidinyl group, morpholinyl group, piperidinyl group, piperazinyl group and the like, which may have a substituent, and a piperazinyl group is preferable. These substituents include carboxyl group, halogen, NO ₂ CN, linear or branched C ₁ ~ C _Four Alkyl group, linear or branched C ₁ ~ C _Four An alkoxy group and -CONHR ^Five (Wherein R ^Five Is a hydrogen atom or linear or branched C ₁ ~ C _Four Represents an alkyl group of
As a preferred embodiment of the present invention, a microbial cell having the ability to selectively hydrolyze an S-isomer of an optical isomer and / or a treated product thereof is represented by the following general formula (III):
[0023]
Embedded image

[0024]
(In the above general formula (III), R ¹ , R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. The following general formula (IV) produced by hydrolysis with a (RS) -amide compound represented by
Embedded image

(In the above general formula (IV), R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. (S) -carboxylic acid represented by the following general formula (VI)
Embedded image

(In the above general formula (VI), R ¹ , R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. The method of producing (S) -carboxylic acid or (R) -amide compound by isolating the (R) -amide compound which was not hydrolyzed represented by this.
In another preferred embodiment of the present invention, a microbial cell having the ability to selectively hydrolyze an R isomer of an optical isomer and / or a treated product thereof are represented by the following general formula (III):
[0025]
Embedded image

[0026]
(In the above general formula (III), R ¹ , R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. The following general formula (V) produced by hydrolysis with a (RS) -amide compound represented by
[0027]
Embedded image

[0028]
(In the above general formula (V), R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. (R) -carboxylic acid represented by the following general formula (VII)
[0029]
Embedded image

[0030]
(In the above general formula (III), R ¹ , R ^Four , X, p, m, n, r and q are as defined above. And (R) -carboxylic acid or (S) -amide compound is produced by isolating the non-hydrolyzed (S) -amide compound represented by
The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to hydrolyze the amide bond of the amide compound, but preferably includes microorganisms belonging to the genus Leucobacter, Mycobacterium, Rhizobium or Pseudomonas. More specifically, the MCI3331, MCI3332, MCI3346 and MCI3360 strains deposited as FERM P-1585, FERM P-15886, FERM P-15930, and FERM P-15970 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Or Pseudomonas azotoformans IAM1603 (Pseudomonas azotoformans IAM1603). The microorganism that selectively hydrolyzes the S-isomer of the optical isomer preferably includes microorganisms belonging to the genus Leucobacter, Mycobacterium, or Rhizobium, and preferred strains include the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology. And microorganisms selected from the strains MCI3331, MCI3332, MCI3346, and MCI3360 deposited as FERM P-15585, FERM P-15886, FERM P-15930, and FERM P-15970. A microorganism that selectively hydrolyzes the R-isomer of the optical isomer includes a microorganism belonging to the genus Pseudomonas, and a preferable strain includes Pseudomonas azotoformans IAM1603 (Pseudomonas azotoformans IAM1603). In addition, when using microorganisms, a microbial cell may be used as it is, the processed material of this microbial cell may be sufficient, and a microbial cell and this microbial cell processed material may be used together.
[0031]
When a microorganism having the ability to selectively hydrolyze one of the optical isomers is used, the organic carboxylic acid produced by hydrolysis in the reaction solution or culture solution or the non-hydrolyzed Nt-butylamide compound is used as a solvent. Optical resolution can be carried out by isolation by conventional methods such as extraction and chromatography.
[0032]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Among the microorganisms used in the present invention, examples of microorganisms that selectively hydrolyze the optical isomer S-form include MCI3331 strain, MCI3332 strain, MCI3346 strain, and MCI3360 strain. MCI3331 strain, MCI3332 strain, MCI3346 strain and MCI3360 strain are bacteria isolated from natural soil by the present inventors, and FERM P-1585, FERM P-15886, FERM P- 15930, deposited as FERM P-15970. The bacteriological properties of MCI3331 strain and MCI3332 strain are as follows.
[0033]
[Table 1]

[0034]
6). Taxonomic considerations
(1) Higher order identification
MCI3331 and 3332 strains are 1) gram positive, 2) cells are short to rod-shaped but do not show significant polymorphism, 3) do not form spores, 4) have no motility, 5) in the cell wall It has diaminobutyric acid, 6) has menaquinone MK11, and 7) the G + C content in DNA is 68 to 70%. Based on these characteristics, both strains are categorized as “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology”, Volume 2, 1261-1434 (1986), and Pro Caliotes, 2nd edition (1992). ), Vol. 2, pages 1355 to 1368, it was suggested that they are closely related to Irregular, Nonsporting, Gram-Positive Rods. The genus of these fungal groups is clearly defined by chemical taxonomic characteristics such as amino acid composition of the cell wall. Thus, when a genus having diaminobutyric acid on the cell wall and its surrounding bacteria were compared with each other, as shown in Table 2 below, MCI3331 and 3332 strains were characterized by the characteristics of Leucobacter in terms of chemical taxonomy. Almost matched.
[0035]
[Table 2]

[0036]
(2) Identification of genera
The genus Leucobacter is International Journal of Systemic Bacteriology, Vol. 46, No. 4, pp. 967-971 (1996), and includes one species, Leucobacter komagatae IFO15245. Therefore, in order to clarify the phylogenetic relationship between the present strains MCI3331 and 3332 and the genus Leucobacter, the nucleotide sequence (about 1500 bp) of both strains and Leucobacter komagatae IFO15245 was determined. Based on the obtained base sequence, a search was made in the database of Genbank, EMBL and DDBJ to create a phylogenetic tree. As a result, as shown in FIG. 1, MCI3331, 3332 strain and Leucobacter komagatae formed phylogenetic branches as one independent group, and both strains were found to belong to the genus Leucobacter. However, the G + C content in DNA is different from that of Leucobacter komagatae, and the possibility that it differs at the species level from the phylogenetic tree based on the base sequence of 16S rRNA was also shown. In addition, the strains MCI3331 and 3332 differed in terms of growth temperature, use of citric acid, etc., and were clearly distinguished.
From the above, this strain was identified as Leucobacter sp. MCI3331 strain and MCI3332 strain, respectively.
Next, the mycological properties of MCI3346 strain are as follows.
[0037]
1. Morphological properties
Microscopic observation was performed on plain heart infusion agar medium at 30 ° C., 24 hours after culture, and 3 days later. The MCI3346 strain exhibits a short rod shape to a rod shape, and does not become mycelium even in the early stage of culture. Cells do not have motility. No aerial hyphae, spores or sporangia were observed.
2. Culture properties
Table 3 below shows the properties of the MCI3346 strain after cultivation for 7 days at 30 ° C. on an ISP (International Streptomyces Project) defined medium.
[0038]
[Table 3]

[0039]
(5) Utilization of carbon source (cultured at 30 ° C. for 7 days on Prideham Goat Leve agar)
Since the MCI3346 strain showed some growth even in the control medium without the carbon source, Table 4 shows the assimilation properties when the control is-.
[0040]
[Table 4]

[0041]
4). Chemical taxonomic properties
The chemical taxonomic properties of the MCI3346 strain are shown in Table 5.
[0042]
[Table 5]

[0043]
5. Taxonomic considerations
(1) Higher order identification
The MCI3346 strain has chemical classification such as 1) having meso-diaminopimelic acid in cell wall peptidoglycan, 2) containing arabinose and galactose in the whole cell hydrolyzate, and 3) N-acyl type of cell wall peptidoglycan is glycolyl type. It has a scientific feature. From these characteristics, this strain is classified as Nocardiaceae described in The Prokaryo-tes 2nd edition (1992), Volume 2, pages 1180 to 1270, or Mycobacterium genus ( It was suggested that it belongs to Mycobacterium.
[0044]
(2) Identification of genera
These bacterial groups can be distinguished from each other by the molecular species of menaquinone and the molecular species of mycolic acid, which is a cell component characteristic of this bacterial group. This strain MCI3346 is 4) MK9 (H ₂ ), It was found that the genus Gordona included in the Nocardiaceae family, or the genus Mycobacterium.
However, this strain does not show polymorphism due to the culture time like that of the genus Gordona, Rod-coccus cycle, and the mycolic acid between this strain and each genus can be obtained using thin-phase chromatography. As a result of analysis and comparison, this strain showed an Rf value similar to that of Mycobacterium, and was clearly distinguished from Gordona and other genera.
Therefore, the above strain MCI3346 was identified as Mycobacterium sp. From the above results.
Next, the mycological properties of MCI3360 strain are as follows.
[0045]
[Table 6]

[0046]
6). Taxonomic considerations
(1) Higher order identification
The MCI3360 strain is 1) Gram-negative bacilli, 2) aerobic, 3) does not form spores, 4) has motility by periflagellum, 5) does not produce 3-ketolactose, 6) has ubiquinone Q10, 7) G + C content in DNA is 65 mol%, 7) C as cell fatty acid _{18: 1} It has features such as containing a lot of. From these characteristics, both strains belong to the Rhizobiaceae group described in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1, pages 234-256 (1984). Was suggested.
[0047]
(2) Identification of genera
The Rhizobicaceae family includes the genus Rhizobium, the genus Bradyrhizobium, the genus Agrobacterium and the genus Phyllobacterium. Since this strain has periflagellum, it was suggested that it is closely related to Rhizobium or Agrobacterium.
[0048]
Next, we compared hydroxy fatty acids, which are effective indicators for classification and identification of Gram-negative bacteria. In IFO Research Communication [Institute for formation, Osaka Research Communication] Vol. 15, pp. 57-75 (1991), the fungal group belonging to Rhizobicaceae is classified at the species or sub-species level according to the composition of hydroxy fatty acid. This strain MCI3360 is a common 3-OH-C _{14: 0} In addition, a small amount of 3-OH-C _{16: 0} And 3-OH-C _{18: 0} And no 2-hydroxy fatty acids. This fatty acid pattern was similar to Rhizobium meriroti, Rhizobium frediii and Rhizobium galegae. Moreover, since it did not correspond to the Agrobacterium group, it seemed appropriate that this strain belonged to the genus Rhizobium.
From the above, this strain MCI3360 was identified as Rhizobium sp.
[0049]
Examples of the microorganism that selectively hydrolyzes the R isomer of the optical isomer among the microorganisms used in the present invention include Pseudomonas azotoformans IAM1603 (Pseudomonas azotoformans IAM1603). This strain is a known strain and can be easily obtained from the Institute for Molecular Cell Biology (IAM), the University of Tokyo.
In addition, the microorganism may be a mutant obtained by UV irradiation, N-methyl-N′-nitrosoguanidine (NTG) treatment, ethylmethanesulfonate (EMS) treatment, nitrous acid treatment, acridine treatment, or the like, or a cell fusion or gene recombination method. Any of the recombinant strains induced by genetic techniques such as
In the production method of the present invention, one type or two or more types of the above-mentioned microorganisms are used as cells and / or treated cells. Specifically, the cells obtained by culturing the above microorganisms as they are, or those obtained by culturing the cells obtained by culturing by a known method, that is, those treated with acetone, those obtained by freeze-drying, Processed microbial cells such as those obtained by physically or enzymatically disrupting microbial cells can be used. In addition, the ability of these cells or treated cells to act on the amide bond of the amide compound represented by the above general formula (I) and convert it to the organic carboxylic acid represented by the general formula (II) It is also possible to take out and use the enzyme fraction it has as a crude product or a purified product. Furthermore, it is also possible to use those obtained by immobilizing the cells, treated cells, enzyme fractions, and the like thus obtained on a carrier such as polyacrylamide gel and carrageenan gel. Therefore, in the present specification, the term “bacteria and / or treated product thereof” is used as a concept containing all of the above-mentioned cells, treated product, enzyme fraction, and their immobilized products.
[0050]
Next, the production method of the present invention will be specifically described.
In the production method of the present invention, microorganisms are usually used after culturing, but this culturing can be performed as usual. The medium used for culturing the microorganism includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and the like that can be assimilated by the microorganism. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, alcohols such as glycerol, organic acids and the like are appropriately used. As the nitrogen source, NZ amine, tryptose, yeast extract, polypeptone and the like are appropriately used. As the inorganic ions, phosphate ions, magnesium ions, iron ions, manganese ions, molybdenum ions and others are appropriately used as necessary. Furthermore, it is effective to add inositol, pantothenic acid, nicotinamide and other vitamins as necessary. In addition to the above components, nitrile compounds such as piperazine carboxylic acid, pyrazine amide, piperazine amide, n-butyronitrile, n-butyramide, iso-butyronitrile, iso-butyramide, crotonnitrile, crotonamide, methacrylonitrile, methacrylamide and the like High activity may be obtained by adding an amide compound, preferably pyrazine amide or piperazine amide. Moreover, said nitrile compound and amide compound can also be used as a carbon source and a nitrogen source. Cultivation is carried out for 10 to 100 hours under aerobic conditions while controlling the pH within a suitable range of about 6 to 8 and a temperature of about 15 to 35 ° C.
[0051]
As a method for producing an organic carboxylic acid by allowing the above microorganism to act on the amide compound represented by the above general formula (I), the present microorganism is cultured, and the obtained cell suspension is represented by the above general formula (I). A method of adding an amide compound represented by the reaction to obtain an organic carboxylic acid, a method of adding an amide compound represented by the above general formula (I) to the medium and performing the incubation and reaction simultaneously, or the above general formula A method of further culturing by adding the amide compound represented by (I) can be used. The reaction temperature is preferably 15 to 40 ° C., and preferably in the range of pH 5 to 12. The concentration of the amide compound represented by the general formula (I) is desirably in the range of 0.1 to 10%. If necessary, the amide compound represented by the general formula (I) is supplemented during the reaction. Moreover, reaction may be accelerated | stimulated by adding a metal ion as needed.
The organic carboxylic acid or unreacted amide compound obtained by culturing and reaction can be collected by usual separation / purification methods such as solvent extraction and chromatography. For example, the amide compound can be extracted by solvent extraction using chloroform, ethyl acetate or the like. If a reverse phase column is used, it is possible to elute each of the organic carboxylic acid and the unreacted amide compound with a mixed solution of water and a solvent such as methanol or acetonitrile.
[0052]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, ordinary changes in the technical field of the present invention can be made without departing from the gist thereof.
Example 1
Pyrazineamide 5.0 g / L, yeast extract 3.0 g / L, meat extract
1.5 g / L, peptone 2.5 g / L, dipotassium phosphate 3.0 g / L, monopotassium phosphate 1.0 g / L, NaCl 1 g / L, FeSO _Four ・ 7H ₂ MCI3331 strain was inoculated into 20 mL of liquid medium composed of O 0.01 g / L, trace metal mixture (composition shown in Table 9) 5 mL / L (pH 7.0), and aerobically at 30 ° C. for 24 hours. Cultured. The obtained culture broth was centrifuged, and the cells were collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). To this was added 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2.5 g / L of (RS) -Nt-butylamidopiperazine to make a total volume of 2 mL, and allowed to react at 30 ° C. under aerobic conditions for 24 hours. It was. After completion of the reaction, the reaction solution was saturated with sodium chloride and extracted with chloroform. The obtained (R) -Nt-butylamide piperazine was 2.25 mg, and the optical purity was 98% e.e. e. Met. The accumulated amount of (S) -2-carboxypiperazine in the aqueous layer was 0.85 g / L, and the optical purity was 100% e.e. e. Met. The optical purity was measured by high performance liquid chromatography under the following conditions. The retention time of the N form of Nt-butylamide piperazine was 8.9 minutes under the following analysis condition 1, and the retention time of the R form was 11.5 minutes. As for 2-carboxypiperazine, in the following analysis condition 1, the S form is 2.2 minutes and the R form is 3.6 minutes, and in the analysis condition 2, the S form is 5.3 minutes and the R form is 3.7 minutes. Met. About each of the obtained Nt-butylamidopiperazine and 2-carboxypiperazine ¹ The structure was confirmed by 1 H-NMR. Nt-Butylamide piperazine is (CDCl _Three , 400 MHz), δ (ppm) = 1.33 (9H, s), 2.67 to 2.79 (3H, m), 2.82 to 2.93 (2H, m), 3.13. ~ 3.20 (2H, m), 6.75 (1H, br) and 2-carboxypiperazine dihydrochloride is (D ₂ O, 400 MHz), δ (ppm) = 3.22 to 3.38 (3H, m), 3.54 to 3.66 (2H, m), 3.80 (1 h, DD, j = 14 0.0 hZ, 3.6 hZ), 4.11 (1H, dd, J = 11.2 Hz, 3.6 Hz).
[0053]
[Table 7]

[0054]
Example 2
Glycerol 10.0 g / L, pyrazine amide 2.0 g / L, yeast extract 2.0 g / L, polypeptone 2.0 g / L, dipotassium phosphate 3.0 g / L, monopotassium phosphate 1.0 g / L, MCI3332 strain was inoculated into 20 mL of a liquid medium composed of NaCl 1 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.02 g / L, (pH 7.0), and cultured aerobically at 30 ° C. for 24 hours. The obtained culture broth was centrifuged, and the cells were collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). A 50 mM potassium phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 10 g / L of (RS) -Nt-butylmethacrylamide was added thereto, and the total amount was adjusted to 2 mL and reacted at 30 ° C. under aerobic conditions for 24 hours. The accumulated amount of methacrylic acid after the reaction was 3 g / L. Methacrylic acid was measured under the following condition 3 by high performance liquid chromatography.
[0055]
[Table 8]

[0056]
Example 3
Pyrazineamide 5.0 g / L, yeast extract 3.0 g / L, meat extract 1.5 g / L, peptone 2.5 g / L, dipotassium phosphate 3.0 g / L, monopotassium phosphate 1.0 g / L , NaCl 1g / L, FeSO _Four ・ 7H ₂ O
The MCI3346 strain was inoculated into 20 mL of a liquid medium having a composition of 0.01 g / L and a mixture of trace metals (Table 9) 5 ml / L (pH 7.0), and aerobically cultured at 27 ° C. for 24 hours. The obtained culture broth was centrifuged, and the cells were collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). To this was added 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2.5 g / L of (RS) -Nt-butylamidopiperazine to make a total volume of 2 mL, and allowed to react at 30 ° C. under aerobic conditions for 24 hours. It was. After completion of the reaction, the reaction solution was saturated with sodium chloride and extracted with chloroform. The obtained (R) -Nt-butylamidopiperazine was 2.37 mg, and the optical purity was 99% e.e. e. Met. The accumulated amount of (S) -2-carboxypiperazine in the aqueous layer was 0.85 g / L, and the optical purity was 100% e.e. e. Met. The optical purity and product identification were determined using the same method as in Example 1.
[0057]
Example 4
Medium similar to Example 3, namely pyrazine amide 5.0 g / L, yeast extract 3.0 g / L, meat extract 1.5 g / L, peptone 2.5 g / L, dipotassium phosphate 3.0 g / L, Monopotassium phosphate 1.0 g / L, NaCl 1 g / L, FeSO _Four ・ 7H ₂ The MCI3360 strain was inoculated into 100 mL of a liquid medium having a composition of O 0.01 g / L and a trace metal mixture (Table 9) 5 ml / L (pH 7.0), and aerobically cultured at 30 ° C. for 14 hours. The obtained culture broth was centrifuged, and the cells were collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). To this was added 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2.5 g / L of (RS) -Nt-butylamidopiperazine to make a total volume of 2 mL and allowed to react at 30 ° C. under aerobic conditions for 48 hours. It was. After completion of the reaction, (R) -Nt-butylamidopiperazine obtained by the same treatment as in Example 3 was 2.61 mg, and the optical purity was 77% e.e. e. Met. The accumulated amount of (S) -2-carboxypiperazine in the aqueous layer was 0.78 g / L, and the optical purity was 80% e.e. e. Met. The optical purity and product identification were determined using the same method as in Example 1.
[0058]
Example 5
Nutrient broth 10.0 g / L, DL-sodium malate 10.0 g / L, dipotassium phosphate 3.0 g / L, monopotassium phosphate 1.0 g / L, iron sulfate heptahydrate 0.01 g / L Inoculate Pseudomonas azotoformans IAM1603 (Pseudomonas azotoforms IAM1603) strain into 100 mL of a liquid medium consisting of 5 mL / L (pH 7.0) of a mixture of L and trace metals (Table 9) and aerobic for 12 hours at 30 ° C. Cultured.
The obtained culture solution was centrifuged, and the cells were collected and washed with 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). To this, 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 5.0 g / L of (RS) -Nt-butylpiperazine-2-carboxamide was added to make a total volume of 10 mL. Reacted for hours. After completion of the reaction, the reaction solution was saturated with sodium chloride and extracted with chloroform. The obtained (S) -Nt-butylpiperazine-2-carboxamide was 15.2 mg and the optical purity was 98%. The accumulated amount of (R) -piperazine-2-carboxylic acid in the aqueous layer was 1.28 g / L, and the optical purity was 70%. The optical purity and product identification were determined using the same method as in Example 1.
[0059]
Example 6
Pseudomonas azotoformans obtained by culturing in the same manner as in Example 5.
Cell bodies of IAM1603 (Pseudomonas azotoforms IAM1603) were crushed by ultrasonic treatment, and a cell-free extract was obtained by ultracentrifugation. An enzyme protein that selectively hydrolyzes the amide bond of Nt-butylpiperazine-2-carboxamide from this extract by ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel filtration. Was highly purified. 100 μL of this protein solution (0.2 g protein / L) was added to 1.0 mL of 25 mM potassium phosphate buffer containing 5.0 g / L of Nt-butylpiperazine-2-carboxamide and stirred at 30 ° C. Reacted. After 24 hours, this reaction solution was analyzed under the above-mentioned high performance liquid chromatography analysis condition 2. 1.72 g / L of (R) -piperazine-2-carboxylic acid was detected, and the generated piperazine-2-carboxylic acid was analyzed. The optical purity is 99.8% e.e. e. Met. Further, when the same solution was analyzed under high performance liquid chromatography analysis condition 1, the optical purity of the remaining Nt-butylpiperazine-2-carboxamide was 99.6 e. e. Met. The optical purity and product identification were determined using the same method as in Example 1.
[0060]
[Table 9]

[0061]
[Effect of the present invention]
According to the present invention, it is possible not only to easily produce an organic acid from an Nt-butylamide compound using a microorganism, but also to produce an optically active organic carboxylic acid by hydrolysis and to produce racemic N. It became possible to easily perform optical resolution of the t-butylamide compound.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the phylogenetic relationship between a strain of the present invention and its surrounding bacteria based on the base sequence of 16S rRNA.

Claims (15)

A microorganism selected from the group consisting of Leucobacter, Mycobacterium, Rhizobium and Pseudomonas, which has a hydrolytic ability of an amide compound represented by the following general formula (I) and / or In the presence of the treated microbial cell, the following general formula (I)

By hydrolyzing the amide compound represented by the following general formula (II)
R-COOH (II)
A method for hydrolyzing an amide compound, characterized in that an acid represented by the formula:
[In the above general formula (I) and general formula (II), R has a linear or branched C ₁ -C ₁₈ alkyl group which may have a substituent, and a substituent. Linear or branched C _{2 to} C ₁₈ alkenyl group, which may have a linear or branched C _{2 to} C ₁₈ alkynyl group which may have a substituent, or a substituent An optionally substituted C _{3 to} C ₁₀ cycloalkyl group, an optionally substituted C _{3 to} C ₁₀ cycloalkenyl group, and an optionally substituted C _{6 to} C ₁₄ aryl group. Or a heterocyclic residue which may have a substituent, and R ¹ represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group. However, when R ¹ represents a methyl group or an ethyl group, R is

{In the above formula, R ² is a linear or branched C _{1 to} C ₁₀ alkyl group which may have a substituent, or a linear or branched chain which may have a substituent. Represents a C _{2 to} C ₁₀ alkenyl group or a linear or branched C _{2 to} C ₁₀ alkynyl group which may have a substituent, and R ³ has a halogen atom or a substituent. Represents an amino group or a hydroxyl group which may have a linear or branched C _{1 to} C ₅ alkyl group, or R ² and R ³ are bonded to each other to form R ² R ³ CH so

(In the above formula, each R ⁴ is independently a carboxyl group, a halogen atom, NO ₂ , CN, a linear or branched C _{1 to} C ₄ alkyl group, a linear or branched C _1, alkoxy group, or -CONHR ⁵ (where, R ⁵ represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group of C ₁ -C ₄₎ the -C ₄ represents, X is -NH- or -O -Represents an integer of 0 to 3, m, n, and r represent 0, 1 or 2, and q represents 0 or 1, provided that 2≤m + n + r + q≤4. } Is represented. ] R is

The method for hydrolyzing an amide compound according to claim 1, wherein the amide compound is a group represented by the formula:   The method for hydrolyzing an amide compound according to claim 1, wherein R is a piperazinyl group. The method for hydrolyzing an amide compound according to any one of claims 1 to 3, wherein R ¹ is a t-butyl group. A microorganism selected from the group consisting of Leucobacter, Mycobacterium, Rhizobium and Pseudomonas, and selectively hydrolyzes one of the optical isomers of the amide compound represented by the following general formula (I) Cells having the ability to act and / or treated products thereof are represented by the following general formula (I)

(RS) -amide compound represented by the following general formula (II) produced by hydrolysis
R-COOH (II)
At least one of (S) -carboxylic acid or (R) -carboxylic acid or (R) -amide compound or (S) -amide compound not hydrolyzed A method for producing an optically active compound.
[In the above general formula (I) and general formula (II), R has a linear or branched C ₁ -C ₁₈ alkyl group which may have a substituent, and a substituent. Linear or branched C _{2 to} C ₁₈ alkenyl group, which may have a linear or branched C _{2 to} C ₁₈ alkynyl group which may have a substituent, or a substituent An optionally substituted C _{3 to} C ₁₀ cycloalkyl group, an optionally substituted C _{3 to} C ₁₀ cycloalkenyl group, and an optionally substituted C _{6 to} C ₁₄ aryl group. Or a heterocyclic residue which may have a substituent, and R ¹ represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group. However, when R ¹ represents a methyl group or an ethyl group, R is

{In the above formula, R ² is a linear or branched C _{1 to} C ₁₀ alkyl group which may have a substituent, or a linear or branched chain which may have a substituent. Represents a C _{2 to} C ₁₀ alkenyl group or a linear or branched C _{2 to} C ₁₀ alkynyl group which may have a substituent, and R ³ has a halogen atom or a substituent. Represents an amino group or a hydroxyl group which may have a linear or branched C _{1 to} C ₅ alkyl group, or R ² and R ³ are bonded to each other to form R ² R ³ CH so

(In the above formula, each R ⁴ is independently a carboxyl group, a halogen atom, NO ₂ , CN, a linear or branched C _{1 to} C ₄ alkyl group, a linear or branched C _1, alkoxy group, or -CONHR ⁵ (where, R ⁵ represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group of C ₁ -C ₄₎ the -C ₄ represents, X is -NH- or -O -Represents an integer of 0 to 3, m, n, and r represent 0, 1 or 2, and q represents 0 or 1, provided that 2≤m + n + r + q≤4. } Is represented. ] R is

6. The method for producing an optically active compound according to claim 5, wherein 7. The method for producing an optically active compound according to claim 5, wherein R ¹ is a t-butyl group. A microorganism selected from the group consisting of Leucobacter, Mycobacterium, Rhizobium and Pseudomonas, and selectively hydrolyzes one of the optical isomers of the amide compound represented by the following general formula ( III ) Cells having the ability to act and / or treated products thereof are represented by the following general formula (III
)

(In the above general formula (III), R ¹ represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group, and R ⁴ each independently represents a carboxyl group, a halogen atom, NO ₂ , CN, linear or branched chain. C ₁ -C ₄ alkyl group, an alkoxy group, or -CONHR ⁵ (where the linear or branched C ₁ -C _4, R ⁵ is C ₁ hydrogen atom or a linear or branched represents an alkyl group -C _4), X represents -NH- or -O-, p represents an integer of 0 to 3, m, n and r represents 0, 1 or 2, q is It represents 0 or 1, provided that 2 ≦ m + n + r + q ≦ 4), and is reacted with an (R, S) -amide compound represented by the following general formula (IV)

(In the above general formula (IV), R ⁴ , X, p, m, n, r and q are as defined above) or (S) -carboxylic acid represented by the following general formula (V)

(In the general formula (V), R ⁴ , X, p, m, n, r and q are as defined above) or (R) -carboxylic acid represented by the above or not hydrolyzed (R) A method for producing an optically active compound, comprising isolating at least one of an amide compound and an (S) -amide compound.   Microorganisms are selected from MCI3331, MCI3332, MCI3346, and MCI3360 strains that have been deposited as FERM P-15858, FERM P-15886, FERM P-15930, and FERM P-15970 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology The method for producing an optically active compound according to any one of claims 5 to 8, which is a microorganism or Pseudomonas azotoformans IAM1603. A microorganism selected from the group consisting of Leucobacter genus, Mycobacterium genus and Rhizobium genus, which selectively hydrolyzes S form among optical isomers of amide compounds represented by the following general formula ( III ) Cells having the ability to act and / or treated cells thereof are represented by the following general formula (III)

(In the above general formula (III), R ¹ represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group, and R ⁴ each independently represents a carboxyl group, a halogen atom, NO ₂ , CN, linear or branched chain. C ₁ -C ₄ alkyl group, an alkoxy group, or -CONHR ⁵ (where the linear or branched C ₁ -C _4, R ⁵ is C ₁ hydrogen atom or a linear or branched represents an alkyl group -C _4), X represents -NH- or -O-, p represents an integer of 0 to 3, m, n and r represents 0, 1 or 2, q is It represents 0 or 1, provided that 2 ≦ m + n + r + q ≦ 4), and is reacted with an (R, S) -amide compound represented by the following general formula (IV)

(In the above general formula (IV), R ⁴ , X, p, m, n, r and q are as defined above) or (S) -carboxylic acid represented by the above or not hydrolyzed (R) -A method for producing an optically active compound, wherein at least one of the amide compounds is isolated.   Microorganisms are selected from MCI3331, MCI3332, MCI3346, and MCI3360 strains that have been deposited as FERM P-15858, FERM P-15886, FERM P-15930, and FERM P-15970 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It is a microorganism, The manufacturing method of the optically active compound of Claim 10 characterized by the above-mentioned. A sheet Yudomonasu microorganism selected from the group consisting of the genus represented by the following general formula cells those which selectively hydrolyze the R-form of optical isomers represented by the amide compound (III) and / or fungus The body treatment product has the following general formula (III)

(In the above general formula (III), R ¹ represents a methyl group, an ethyl group or a t-butyl group, and R ⁴ each independently represents a carboxyl group, a halogen atom, NO ₂ , CN, linear or branched chain. C ₁ -C ₄ alkyl group, an alkoxy group, or -CONHR ⁵ (where the linear or branched C ₁ -C _4, R ⁵ is C ₁ hydrogen atom or a linear or branched represents an alkyl group -C _4), X represents -NH- or -O-, p represents an integer of 0 to 3, m, n and r represents 0, 1 or 2, q is Represents 0 or 1, provided that 2 ≦ m + n + r + q ≦ 4), and is reacted with an (R, S) -amide compound to generate the following general formula (V)

(In the above general formula (V), R ⁴ , X, p, m, n, r and q are as defined above) (R) -carboxylic acid represented by the above or not hydrolyzed (S) -A method for producing an optically active compound, wherein at least one of the amide compounds is isolated.   The method for producing an optically active compound according to claim 12, wherein the microorganism is Pseudomonas azotoformans IAM1603 (Pseudomonas azotoformans IAM1603). The process for producing an optically active compound according to any one of claims 5 to 13, characterized in that R ¹ is a t- butyl group.

The method for producing an optically active compound according to claim 5, wherein is a piperazinyl group.

Images