JP3753734B2 - Peptide-derived radionuclide chelating agents - Google Patents

Abstract

For use in imaging sites of diagnostic interest within the body, the present invention provides radionuclide chelators, optionally coupled to targeting molecules such as peptides of the formula: <IMAGE>

Description

（式中、
Ｘは、直鎖又は分岐の、飽和又は不飽和のＣ_1-4アルキル鎖（これは、場合により、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の複素原子により中断されていてもよく、かつ場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ_1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）であり；
Ｙは、Ｈ又はＸと同義の置換基であり；
Ｘ及びＹは、一緒になって、５−員〜８−員の、飽和又は不飽和複素環（これらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ_1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）を形成してもよく；
Ｒ¹〜Ｒ⁴は、独立して、Ｈ；カルボキシル；Ｃ_1-4アルキル；Ｃ_1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ_1-4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基により置換されている）；プロリン以外のＤ−又はＬ−アミノ酸のα炭素側鎖；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ⁵及びＲ⁶は、独立して、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ_1-4アルキル；Ｃ_1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されている）；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ⁷は、Ｈ及び硫黄保護基から選択され；そして
Ｚは、ヒドロキシル、Ｃ_1-4アルコキシ及び標的分子から選択される）
で示される金属放射性核種キレート化剤を提供する。
本発明の別の特徴により、本発明のキレート化剤は、一般式（II）：

（式中、
Ｘは、直鎖又は分岐の、飽和又は不飽和の、Ｃ_1-4アルキル鎖（これは、場合により、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の複素原子により中断されていてもよく、かつ場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ_1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）であり；
Ｙは、Ｈ又はＸと同義の置換基であり；
Ｘ及びＹは、一緒になって、５−員〜８−員の、飽和又は不飽和複素環（これらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ_1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）を形成してもよく；
Ｒ¹〜Ｒ⁴は、独立して、Ｈ；カルボキシル；Ｃ_1-4アルキル；Ｃ_1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ_1-4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基により置換されている）；プロリン以外のＤ−又はＬ−アミノ酸のα炭素側鎖；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ⁵及びＲ⁶は、独立して、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ_1-4アルキル；Ｃ_1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されている）；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｚは、ヒドロキシル、Ｃ_1-4アルコキシ及び標的分子から選択され；そして
Ｍは、金属放射性核種又はオキシド若しくはそのニトリドである）で示される錯体化した金属放射性核種を有する形態で提供される。
本発明の別の特徴において、キレート化剤は診断的に有用な標的分子に結合した形態、及び場合により造影のために錯体化された金属放射性核種との組み合わせの結合体で提供される。
本発明の別の特徴として、本発明の結合体が先ず患者へ放射性核種錯体として投与され、次いで放射性核種の位置が画像化の手段を用いて検出される診断部位の造影の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、^99mＴ_cで標識された結合体Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨのＨＰＬＣ分析である。
本発明の詳細な説明
本発明は、標的分子に結合したとき、治療又は診断的興味の身体部位に放射性核種を送達するために有用である金属放射性核種キレート化剤を提供する。上記の式で示したように、このキレート化剤は、放射性核種が錯体化されているＮ₃Ｓ配置で存在するペプチド化合物である。
上記で用いたように記号Ｒ¹〜Ｒ⁷、Ｘ、Ｙ及びＺで定義した用語は、以下の意味を有する：
「アルキル」は、直鎖又は分岐のＣ_1-4鎖を意味する；
「アリール」は、芳香族及び複素芳香族環を意味する；
「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃ１及びＢｒを意味する；
「硫黄保護基」は、チオール基の酸化を阻害する化学基を意味し、それは金属のキレート化で切断されるそれらを含む。適切な硫黄保護基は、既知のアルキル、アリール、アシル、アルカノイル、アリーロイル、メルカプトアシル及び有機硫黄基を含む。
本発明の好適な実施態様において、このキレート化剤は、上記の式に適合し、そこでは、
Ｒ¹〜Ｒ⁴は、独立して、Ｈ；並びにヒドロキシメチル及び１−ヒドロキシエチルのようなヒドロキシル−置換Ｃ_1-4アルキルから選択され；
Ｒ⁵及びＲ⁶は、独立して、Ｈ及びＣ_1-4アルキルから選択され、好適には両方Ｈであり；
Ｒ⁷は、水素原子若しくは硫黄保護基であり、最も好適にはアセトアミドメチルであり；
Ｘは、Ｃ_1-4アルキル鎖又は好適にはメチル、エチルであるか、又はＣ_1-4アルキル鎖（これは、アリール基で置換されている）、好適にはベンジル基を形成し；
Ｙは、Ｈ又はＸと同義の置換基であり、好適にはメチル、エチル又はベンジル、最も好適にはＸと同義であり；
Ｚは、ＯＨ、Ｃ_1-4アルコキシ又は標的分子であり、好適にはペプチド標的分子である。
本発明の特定のキレート化剤は：
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；及び
サルコシン−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ。
Ｘ及びＹにより表される置換基が隣接する窒素原子と一緒になって複素環を形成する場合に、そのような環は、５−員〜８−員の、飽和環、例えばピロリジン、ピペリジン、１−アザシクロヘプタン及び１−アザシクロオクタンであってよい。Ｘ及びＹにより形成される不飽和環は、その環の同等の窒素が必然的に３価であり、隣接原子と二重結合を形成できないことが理解されるけれども、ピロール及び４Ｈ−ピリジンを含む。Ｘ及びＹにより形成される複素環は、またＮ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の更なる複素原子を組み入れてもよい。更なる複素原子を有する環は、１−イミダゾール、ピラゾール、ピペラジン、モルホリン及びチオモルホリンを含むが、それらに限定されない。Ｘ及びＹにより形成される環は、またハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、オキソ、Ｃ_1-4アルキル及びアリールからの１個又はそれ以上、好適には３個より少ない基で置換されていてもよく、例えば４−オキソ−１−ピペリジン、４−オキソ−１−ピロリジン及び４−ヒドロキシ−１−ピペリジンを形成することができる。
診断用造影の目的のために、このキレート化剤それ自体は、金属放射性核種との錯体の形態で用いることができる。適切な放射性核種は、それらの種々のオキシド又はニトリド形態での、^99mＴｃ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁹⁸Ａｕ、¹⁹⁹Ａｕ、²⁰³Ｐｂ、²¹²Ｐｂ及び²¹²Ｂｉを含む。好適な金属放射性核種は、それらの種々のオキシド形態のテクネチウム(^99mＴｃ）及びレニウム(^186,188Ｒｅ）、例えばＲｅＯ³⁺、ＲｅＯ₂ ⁺、^99mＴｃＯ₂ ⁺であり、最も好適には^99mＴｃＯ³⁺である。望ましい、かつ本発明の好適な特徴により、このキレート化剤は、上記の式でＺで表される標的分子に結合し、キレート化された放射性核種を哺乳動物の所望の位置へ送達するように結合を形成する。このキレート化剤に結合するために適切な標的分子の例は、ステロイド、タンパク、ペプチド、抗体、ヌクレオチド及び糖類を含むが、これらに限定されない。好適な標的分子は、タンパク及びペプチドを含み、特に特有の病理の特性的な細胞表面受容体に特定的に結合しうるそれらである。例えば、特定のタンパク受容体の過剰発現に結びつく病態は、本発明のキレート化剤にそれらのタンパク又は受容体断片を標識することにより造影することができる。最も好適な標的分子は、標的部位に特定的に結合しうるペプチドであり、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。ある医学状態及び組織を造影するに有用な標的ペプチドは、下記に示した：
アテローム性プラクに対して

感染及びアテローム性プラクに対して

血栓に対して

血小板に対して

アミロイドプラク（アルツハイマー疾患）に対して

このキレート化剤に関連して、標的分子は、キレート化剤と標的分子の間の物理的分離をもたらす「スペーサー」を含んでいてもよい。スペーサーは、キレート化剤に結合するために誘導体化されたアルキル鎖であってよい。標的分子がペプチドである場合に、このスペーサーは、適切には１個又はそれ以上のアミノ酸残基であってよい。好適には、ペプチド標的分子は、グリシン又はβ−アラニン残基のような化学的に不活性なα−炭素側鎖を有するような１〜５個のアミノ酸からのスペーサーを組み込んでいる。
標的分子は、Ｒ¹〜Ｒ⁶、Ｘ、Ｙ及びＺ、並びにＸ及びＹで形成された環を含む種々の部位で本発明のキレート化剤に結合することができる。結合は、反応性である標的分子に存在する基をキレート化剤の置換基と反応させ結合を形成させることにより達成することができる。例えば、Ｎ−末端又はε−アミノ−リシンのような遊離のアミノ基を有するペプチド標的分子は、キレート化剤のカルボキシル基と反応しアミド結合を形成することができる。別の方法として、ペプチド標的分子のＣ末端は、キレート化剤のアミノ置換基と反応することができる。好適な実施態様において、標的分子は、式（Ｉ）のキレート化剤と置換基Ｚでペプチド結合のようなアミド結合により結合する。例えば、ペプチド標的分子のＮ−末端アミノ基は、Ｚのカルボキシル基と反応する。ペプチド以外の標的分子は、キレート化剤に結合する適切な基が存在するならば、本発明のキレート化剤と同様な方法で反応する。適切な基が存在しない場合には、標的分子は、そのような基を存在させるように化学的に誘導体化されてよい。１個以上の反応性基がキレート化剤又は標的分子に存在する場合、単一の結合種を得るために適切な保護試剤で、結合のための特定の基以外のすべての基を保護するのが望ましい。例えば、遊離のカルボキシル基は、ｔ−ブチルエステル（これは、ＴＦＡで除くことができる）のようなエステルを形成することにより保護することができる。遊離のアミノ基は、ＦＭＯＣ（これは、続いてピペリジンで除くことができる）のような保護基で保護することができる。
本発明の特定の実施態様において、病巣炎症部位の生体内での造影は、標的分子がアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＴＫＰＰＲ）を含む化学戦略ペプチドである結合物を用いて達成される。このペプチドは、白血球受容体に特によく結合することが見い出された。標的ペプチドは、その局在化活性を保持するならば、キレート化剤から更なるアミノ酸残基、好適にはグリシンにより隔離されることができる。特定の実施態様において、このペプチドＴＫＰＰＲは、Ｇｌｙ残基による式（Ｉ）のキレート化剤のＺ置換基に結合される。
ペプチドに基づく標的分子は、それ自体としてか、又はキレート化剤との結合体として、種々の確立された方法を用いて製造することができる。それは固相合成により容易であるので、別のＦＭＯＣ保護及び脱保護を実施することが短いペプチドを合成するについて好適な方法である。組み換えＤＮＡの技術は、タンパク及びその長い断片を製造するのに好適である。特定の実施態様において、ペプチド−キレート化剤結合体は、固相ペプチド合成法により合成され、それはポリスチレンのような不溶性の（固体）支持体又はマトリックスに結合している成長ペプチド鎖にアミノ酸残基の逐次付加を含む。標的ペプチドのＣ末端残基は、まず、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基のようなＮ−保護試剤で保護されたそのアミノ基で、商業的に入手しうる支持体につなぎ止める。典型的には、この支持体は、保護された形態で予め結合されたＣ−末端残基として得られる。アミノ保護基は、適切な脱保護剤、例えばピペリジンで除くことができ、次のアミノ酸残基（Ｎ−保護形態での）は、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）のような結合剤と共に加えられる。ペプチド結合の生成後、この試薬は支持体から洗い出される。標的ペプチド鎖が合成された後、キレート化剤の最初の残基、即ちＳ−アセトアミドメチル保護システィンが、Ｎ−末端に加えられる。キレート化剤の最後の残基は、式（Ｘ）（Ｙ）Ｎ−Ｃ（Ｒ¹）（Ｒ²）−ＣＯ（ここで、Ｘ、Ｙ、Ｒ¹及びＲ²は上記と同義である）に適合する誘導体化されたアミノ酸残基である。最後の残基、例えばジメチル−グリシン、ジエチル−グリシン、ジベンジル−グリシン又はサルコシンは、商業的に得ることができるか、又は合成することができる。完了した結合体は、支持体からトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような適切な試薬で開裂される。
本発明のＲ¹〜Ｒ⁴の置換基は、Ｄ−アミノ酸を含む天然由来又は誘導体化されたアミノ酸の側鎖であり、商業的に入手可能であり、固相合成技術に適合すると考えられる。商業的に入手できない誘導体化アミノ酸残基は、確立された有機化学の技術によりそれらを合成し、上述した固相合成の適切な段階で本発明のキレート化剤に挿入して組み込むことができる。同様に、置換基Ｒ⁵及びＲ⁶が、Ｈ以外である場合、誘導体化されたシスティンアミノ酸残基は、ペプチド合成に用いられる。例えば、商業的に入手可能な残基、ペネシラミンは、Ｒ⁵及びＲ⁶が両方メチルである場合に組み込まれる。
Ｘ及びＹの種々の置換基は、固相合成の最後の残基として式（Ｘ）（Ｙ）Ｎ−Ｃ（Ｒ¹)(Ｒ²)−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ（ここで、Ｘ、Ｙ、Ｒ¹及びＲ²は上記と同義である）の誘導体化アミノ酸を、本発明のキレート化剤に組み込むことにより導入することができる。Ｘ及びＹのＮ−末端アミノ置換基を有するアミノ酸は、確立された有機化学の手法及び技術により合成することができる。例えば、Ｘ及びＹが両方ジベンジル置換基である場合、相当するジベンジルグリシン残基は、ジクロロメタンのような適切な溶媒中で商業的に入手可能な試薬、ブロモ酢酸及びジベンジルアミンを反応させ、次いで加熱することにより合成することができる。他のアミンは、ジベンジルアミンの代わりに、例えばジイソプロピルアミンで、相当するジイソプロピルグリシンを得る反応で実施することができる。同様に、ジベンジルアミンに代えて、ピペリジン及びモルホリンは、相当するピペリジン−グリシン及びモルホリン−グリシンを与える。
本発明の最も好適な実施態様において、ペプチド−キレート化剤結合体は、固相支持体上で調製され、式（Ｉ）（ここで、標的分子は、配列、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨであり；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ⁶は、Ｈであり；Ｒ⁴は、ヒドロキシメチル又は１−ヒドロキシメチルであり；そしてＲ⁷は、アセトアミドメチルである）の構造を有する。
キレート化剤中に選択された放射性核種の組み込みは、種々の確立された方法で行うことができる。例えば、以下の一般的方法を用いることができる。水性アルコール、例えばエタノール−水１：１中にキレート化剤を溶解することにより、まずキレート化剤溶液を形成させる。例えば、Ｎ₂で脱ガスすることにより酸素を除き、次いで水酸化ナトリウムを加えて、チオール保護基を除く。この溶液の酸素を再度除き、水浴で加熱してチオール保護基を加水分解し、次いでこの溶液を酢酸のような有機酸（pH６．０〜６．５）で中和する。標識化工程で、テクネチウムナトリウムを、テクネチウム酸を還元するに十分な量の塩化第一スズを有するキレート化剤溶液に加える。この溶液を混合し、室温に放置して反応させ、次いで水浴で加熱する。別の方法として、標識化は、pH８に調整したキレート化剤溶液で行うことができる。この高いｐＨで、ペルテクネチウム塩は、所望のキレート化剤と配位子交換反応のための適切な遊離しうる配位子との錯体化したテクネチウムを含む溶液で置き換えることができる。適切な配位子は、酒石酸塩、クエン酸塩及び７糖類塩である。塩化第一スズは、キレート化剤溶液が、別の方法で標識化工程のために高いpH１２〜１３に調整されているならば、還元試薬としてナトリウムジチオナイトで置き換えることができる。本発明のキレート化剤は、放射性核種での標識の前に標的分子に結合させることができ、この方法は「二官能性キレート」法である。別の方法は、「予め標識された配位子」法であり、キレート化剤は、まず放射性核種で標識され、次いで標的分子に結合される。
標識されたキレート化剤は、汚染物質^99mＴｃＯ₄及びコロイドの^99mＴｃＯ₂からクロマトグラフィ的に、例えばエタノールで活性化し、続いて希釈ＨＣｌでのＣ−１８Sep Pakカラムで分離することができる。希釈ＨＣｌでの溶出は、^99mＴｃＯ₄を分離し、ＥｔＯＨ−食塩水１：１での溶出は、キレート化剤を除くが、コロイドの^99mＴｃＯ₂をカラムに残す。
標的分子に結合し、診断的に有用な金属で標識された場合に、本発明のキレート化剤は、診断用造影の技術での通常の技術で病態を検出するために用いることができる。テクネチウムのような放射性核種で標識されたキレート化剤−標的分子結合物は、哺乳動物にリンパ管内、腹膜内及び静脈内的に、食塩水又は血清媒体のような製薬学的に許容しうる溶液で投与することができる。投与される標識された結合物の量は、選択された標的分子の毒性特性及び金属特性に依存し、典型的にはホスト７０kgあたり約０．０１〜１００、好適には１０〜５０mCiの範囲である。生体内での金属の局在化は、投与に続く適当な時間に標準のシンチグラフィーの手法で追跡される。画像が得られる時間は、標的分子の特性に依存し、例えば大抵のペプチドは急速に局在化し、画像が３時間以内、しばしば１時間以内に得られる。特定の実施態様では、食塩水中でペプチド標的分子ＧＴＫＰＰＲに結合する本発明のキレート化剤は、静脈内注射で病巣炎症の画像部位に投与される。
以下の実施例で更に本発明の実施態様を説明するために与えられる。
実施例１：ペプチド−キレート化剤結合体の調製
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ及び
サルコシン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
表題の結合体は、Applied Biosystems 433Aペプチドシンセサイザー（Foster City, CA)を用いて、ＦＭＯＣ−アルギニンを予め結合させた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Sasrin樹脂、Bachem Biosciences Inc., Philadelphia, PA)上で、ＦＭＯＣ化学を用いて、固相ペプチド合成により単一のペプチド鎖として合成した。誘導体化アミノ酸残基、Ｓ−アセトアミドメチルシスティン（Bachem）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（sigma Chemical Company, St.Louis, Mo）及びサルコシンは、鎖延長の適切な段階で組み入れた。
最後の残基、Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ又はサルコシンの付加において、ペプチド樹脂を真空下に一晩乾燥し、樹脂からペプチドの開裂は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９．５ml、水０．５ml、チオアニソール０．５ml及び２−エタンジチオール０．２５mlの冷却溶液（ペプチド−樹脂１００mg当り１ml）をペプチド−樹脂と室温で１．５〜２時間混合して行った。濾過により樹脂を除去し、ＴＦＡ１〜３mlで洗浄し、透明な黄色溶液６〜８mlを得た。この溶液を５０ml円錐形ポリプロピレン遠心分離管中のｔ−ブチルメチルエーテル３０〜３５ml中にゆっくり滴下し、白色沈殿を形成させた。この沈殿物を０℃で５分間、７，０００rpmで遠心分離（Sorval RT600, Dupont）し、傾斜し、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回以上洗浄した。真空下に乾燥した後、この沈殿物を水に溶解した。この溶液をアセトン−ドライアイスで凍結し、一晩凍結乾燥した。得られた白色粉末を水に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（Gelman Acrodic 3 CR PTFE)を通して濾過し、緩衝液Ａとして水中の０．１％ＴＦＡ及び緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いて、Ｃ１８カラム（Waters RCM 25 x 10）を用いた逆相ＨＰＬＣ（Beckman System Gold)により精製した。カラムを１００：０の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化させ、１ml／分で２５分間かけて、５０％緩衝液Ｂまで直線勾配で溶離した。分画をＨＰＬＣ上で再分析し、適合プロフィールにしたがって集めた。純粋な分画を、アセトン−ドライアイス中で凍結し、１２時間凍結乾燥して、白色粉末を得た。
実施例２：ペプチド−キレート化剤結合体の調製
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
表題の結合体は、Applied Biosystems 433Aペプチドシンセサイザー（Foster City, CA)を用いて、ＦＭＯＣ−アルギニンを予め結合させた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Sasrin樹脂、Bachem BiosciencesInc., Philadelphia, PA）上で、ＦＭＯＣ化学を用いて、固相ペプチド合成により単一のペプチド鎖として合成した。誘導体化アミノ酸残基、Ｓ−アセトアミドメチルシスティン（Bachem）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン及びＮ，Ｎ−ジベンジルグリシンは、鎖延長の適切な段階で組み入れた。
誘導体化アミノ酸残基、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグリシンは、以下の方法で合成した：電磁攪拌装置を備えたフラスコ中で、ブロモ酢酸（５．００ｇ、３５．９９mmol）をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、０℃に冷却し、ジベンジルアミン（８．３１ml、４３．７９mmol）を添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、室温に暖まるまで放置し、次いで３０〜４０℃に１２時間加熱した。この混合物を室温ま冷却し、溶媒を減圧下に蒸発させ、熱エタノールで洗浄し、真空下に乾燥して白色固体残渣（収率７１．２％）を得た。
誘導体化アミノ酸残基Ｎ，Ｎ−ジエチルグリシンは、以下方法で合成した。
フラスコ中で、クロロ酢酸（５．００ｇ、５２．９１mmol）を、ジエチルアミン（３５ml）に加え、室温で１２時間攪拌し、次いで還流下に７２時間加熱した。この反応混合物を室温に冷却し、ＨＣｌで中和し、減圧下に濃縮した。次いで、酢酸エチル及びＥｔＯＨを加え、得られた白色沈殿を濾過し、真空下に乾燥して生成物１．７４ｇ（収率２５％）を得た。
実施例３：ペプチド−キレート化剤結合体の標識
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ及び
サルコシン−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
実施例１と２の結合体を、再構成（２００μl、１mg/ml食塩水）し、次いでペルテクネチウム塩１００μl（１０mCi)及びグルコン酸スズ（５０μg塩化第一スズ及び１mgグルコン酸ナトリウム）を有する３mlバクテイナー（vacutainer）中に注入した。この管を沸騰水浴中に１２分間置き、次いでワットマンＰＶＤＦシリンジ濾過器を通して濾過し、標識された結合体溶液を得、更に食塩水で希釈し注射しうる溶液（２Mbq/ml）を調製した。この結合体は試料（２０μl)（蒸留前）からＨＰＬＣ（Beckman)により単離し、放射活性を測定して標識化収率を決定した。

サルコシン−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲを除いて、それぞれの結合体は、単一ピークであり、標識収率８５％以上である。標識化２４時間後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを、ＨＰＬＣで再分析し、分解又は放射性分解生成物を観察しなかった。
実施例４：生体内での結合物の画像化及び生物分布
ラット炎症試験を以下のように実施した。２匹の雄性ウィスター系ラット（Charles River、１５０〜２００ｇ）に、酵母細胞壁懸濁液であるザイモサン（２５mg）を、造影の２４時間前にその左後脚に筋注した。脚の病巣炎症は１日後に視覚的に検出可能となった。キレート化剤−ペプチド結合体１mg（約０．７μmol)をジメチルスルホキシド５０μｌ中に溶解し、エタノール−水混合物（１：１、２０μl)に加えた。Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩（約４００MBq)を加え、１００℃、２０分でキレート交換を進行させた。このＴｃ−９９ｍ標識結合体をSep Pakカートリッジを通す溶離により精製し、次いで約１００μCi（３．７MBq)の活性を有する注射しうる製剤（２００μl)を調製するために食塩水で希釈した。
ラットを、ソムニトール(somnitol)（４０〜５０mg/kg)で麻酔し、標識結合体溶液（２００μl)を尾静脈に静注した。３０分で、連続全身シンチグラムを得た。次いでラットを麻酔して屠殺し、器官、尿、血液、炎症筋（左脚）、非炎症筋（右脚）及び炎症滲出液の標本の重量を測定し、器官に従いウェル形ガンマ計数器又はガンマ線量測定器のいずれかで計数した。血液容積は体重の８％であるという仮定に基づいて、線量計算を行った。下表に示した結合体の結果は、２匹のラットの平均であり、尾中残留線量について補正した。
二つの結合体は、他の既知の炎症造影剤、例えばＧａ−６７、^99mＴｃ−ＩｇＧ、¹¹¹Ｉｎ−ＷＢＣ及び^99mＴｃ−ナノコール（これは観察された高い標的対バックグラウンド比（炎症筋対比炎症筋）で示されている）に比べて、優れたシンチグラム画像を与えた。これらの結合体は、既知の試剤よりかなり迅速に画像化し、優れた生体分布を示した。また、肝臓及び胃腸管のような非標的器官は、低い蓄積を示した。

Industrial application fields
The present invention relates to a chemical chelating agent that belongs to the field of diagnostic imaging and is useful as a radiolabeling agent that targets a tissue at a diagnostic site.
Background of the Invention
The diagnostic imaging technique utilizes a contrast agent that binds or localizes selectively in the body and facilitates resolution of the image of the diagnostic site.⁶⁷Gallium salts, for example, have an affinity for tumors and infected tissues, and using scanning tomography, the body lesion area can be shown to the doctor. Other contrast agents^99mTechnetium and^186/188It includes metal radionuclides such as rhenium, which are used to label target molecules such as proteins, peptides and antibodies located in desired regions of the human body. As targeting agents, proteins and other macromolecules can provide the tissue properties necessary for diagnostic accuracy, but the labeling of these reagents with metal radionuclides depends on their physical structure. Have difficulty. In particular, protein and peptide targeting agents have numerous sites where they can bind to radionuclides, resulting in a heterogeneously labeled product. Despite their large dimensions, proteins also have the most appropriate structural arrangement for binding high-affinity radionuclides, ie four or more donor atoms that form a five-membered ring. There are few areas to include. As a result, radionuclides typically bind at abundant low-affinity sites to form unstable complexes.
To deal with the problem of low affinity binding, Paik et al. (Nucl Med Biol 1985, 12: 3) developed an antibody in the presence of excess DPTA (diamine trimethylenepentaacetic acid) to mask the low affinity binding site. A method of labeling was proposed. Although the problem of low affinity binding is mitigated in this way, the actual binding of the radionuclide is consequently very low for this technetium. Direct labeling of proteins with a high percentage of cysteine residues has also been shown (Dean et al; WO92 / 13,572). This method utilizes the thiol group of the cysteine residue as a high affinity site for radionuclide binding, and its application is necessarily limited to those targeting agents with the required thiol structure.
Another promising method for direct labeling of targeting agents is the indirect method, where the targeting agent and the radionuclide are coupled by the use of a chelating agent. Candidates for use as chelating agents are those compounds that bind strongly to the selected metal radionuclide and have a reactive functional group for binding to the target compound. For use in peptide labeling and protein-based targeting agents, this chelator is ideally peptide-based, so chelator-target molecule conjugates can be synthesized using peptide synthesis techniques. It can be synthesized as a whole. For diagnostic imaging applications, chelating agents desirably have properties suitable for in vivo use such as blood and renal clearance and extravascular diffusion.
Summary of the invention
The present invention provides chelating agents that bind to diagnostically useful metal radionuclides and can bind to targeting agents that can be localized to body parts of diagnostic and therapeutic interest. The chelating agent of the present invention comprises^99mTechnetium and^186/188N capable of binding rhenium oxo, dioxo and nitride ions_ThreePeptide analogs that are structurally designed to give the S configuration.
In more detail and according to one of the features of the invention, the following formula (I):

(Where
X is linear or branched, saturated or unsaturated C_1-4An alkyl chain (which is optionally interrupted by one or two heteroatoms selected from N, O and S, and optionally halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, C_1-4Optionally substituted by at least one group selected from alkyl, aryl and (CO) Z;
Y is a substituent having the same meaning as H or X;
X and Y are taken together to form a 5- to 8-membered saturated or unsaturated heterocycle (optionally halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, oxo, C_1-4Optionally substituted by at least one group selected from alkyl, aryl and (CO) Z);
R¹~ R^FourAre independently H; carboxyl; C_1-4Alkyl; C_1-4Alkyl (which includes hydroxyl, amino, sulfhydryl, halogen, carboxyl, C_1-4Substituted with a group selected from alkoxycarbonyl and aminocarbonyl); the α-carbon side chain of D- or L-amino acids other than proline; and C (O) Z;
R^FiveAnd R⁶Are independently H; carboxyl; amino; C_1-4Alkyl; C_1-4Selected from alkyl (which is substituted by hydroxyl, carboxyl or amino); and C (O) Z;
R⁷Is selected from H and sulfur protecting groups; and
Z is hydroxyl, C_1-4Selected from alkoxy and target molecules)
A metal radionuclide chelating agent represented by the formula:
According to another characteristic of the present invention, the chelating agent of the present invention has the general formula (II):

(Where
X is linear or branched, saturated or unsaturated, C_1-4An alkyl chain (which is optionally interrupted by one or two heteroatoms selected from N, O and S, and optionally halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, C_1-4Optionally substituted by at least one group selected from alkyl, aryl and (CO) Z;
Y is a substituent having the same meaning as H or X;
X and Y are taken together to form a 5- to 8-membered saturated or unsaturated heterocycle (optionally halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, oxo, C_1-4Optionally substituted by at least one group selected from alkyl, aryl and (CO) Z);
R¹~ R^FourAre independently H; carboxyl; C_1-4Alkyl; C_1-4Alkyl (which includes hydroxyl, amino, sulfhydryl, halogen, carboxyl, C_1-4Substituted with a group selected from alkoxycarbonyl and aminocarbonyl); the α-carbon side chain of D- or L-amino acids other than proline; and C (O) Z;
R^FiveAnd R⁶Are independently H; carboxyl; amino; C_1-4Alkyl; C_1-4Selected from alkyl (which is substituted by hydroxyl, carboxyl or amino); and C (O) Z;
Z is hydroxyl, C_1-4Selected from alkoxy and target molecules; and
M is provided in a form having a complexed metal radionuclide represented by a metal radionuclide or oxide or nitride thereof.
In another aspect of the invention, the chelator is provided in a conjugate in combination with a diagnostically useful target molecule bound form and optionally a metal radionuclide complexed for imaging.
Another feature of the present invention provides a method for imaging a diagnostic site where a conjugate of the present invention is first administered to a patient as a radionuclide complex and then the location of the radionuclide is detected using imaging means.
[Brief description of the drawings]
FIG.^99mT_cHPLC analysis of the conjugate N, N-dimethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH labeled with.
Detailed Description of the Invention
The present invention provides metal radionuclide chelating agents that are useful for delivering a radionuclide to a body part of therapeutic or diagnostic interest when bound to a target molecule. As shown in the above formula, this chelating agent is an N-complexed radionuclide._ThreeIt is a peptide compound that exists in the S configuration.
The symbol R as used above¹~ R⁷The terms defined by X, Y, and Z have the following meanings:
“Alkyl” means linear or branched C_1-4Means a chain;
“Aryl” means aromatic and heteroaromatic rings;
“Halogen” means F, C1 and Br;
“Sulfur protecting group” means a chemical group that inhibits oxidation of a thiol group, including those that are cleaved upon chelation of a metal. Suitable sulfur protecting groups include known alkyl, aryl, acyl, alkanoyl, aryloyl, mercaptoacyl and organic sulfur groups.
In a preferred embodiment of the invention, the chelator conforms to the above formula, where
R¹~ R^FourAre independently H; and hydroxyl-substituted C, such as hydroxymethyl and 1-hydroxyethyl_1-4Selected from alkyl;
R^FiveAnd R⁶Are independently H and C_1-4Selected from alkyl, preferably both H;
R⁷Is a hydrogen atom or a sulfur protecting group, most preferably acetamidomethyl;
X is C_1-4Alkyl chain or preferably methyl, ethyl or C_1-4An alkyl chain (which is substituted with an aryl group), preferably a benzyl group;
Y is a substituent as defined for H or X, preferably methyl, ethyl or benzyl, most preferably as defined for X;
Z is OH, C_1-4Alkoxy or a target molecule, preferably a peptide target molecule.
Specific chelating agents of the present invention are:
N, N-dimethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -OH;
N, N-dimethyl Gly-Thr-Cys (Acm) -OH;
N, N-diethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -OH;
N, N-dibenzyl Gly-Ser-Cys (Acm) -OH; and
Sarcosine-Ser-Cys (Acm) -OH.
Where the substituents represented by X and Y together with the adjacent nitrogen atom form a heterocycle, such a ring is a 5-membered to 8-membered saturated ring such as pyrrolidine, piperidine, It may be 1-azacycloheptane and 1-azacyclooctane. Unsaturated rings formed by X and Y include pyrrole and 4H-pyridine, although it is understood that the equivalent nitrogen of the ring is necessarily trivalent and cannot form double bonds with adjacent atoms. . The heterocycle formed by X and Y may also incorporate one or two further heteroatoms selected from N, O and S. Rings having additional heteroatoms include, but are not limited to, 1-imidazole, pyrazole, piperazine, morpholine and thiomorpholine. The ring formed by X and Y can also be halogen, hydroxyl, carboxyl, oxo, C_1-4It may be substituted with one or more, preferably less than 3, groups from alkyl and aryl, such as 4-oxo-1-piperidine, 4-oxo-1-pyrrolidine and 4-hydroxy-1- Piperidine can be formed.
For diagnostic imaging purposes, the chelator itself can be used in the form of a complex with a metal radionuclide. Suitable radionuclides are in their various oxide or nitride forms,^99mTc,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁹⁷Ru,¹⁰⁵Rh,¹⁰⁹Pd,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁹⁸Au,¹⁹⁹Au,²⁰³Pb,²¹²Pb and²¹²Bi is included. Suitable metal radionuclides are technetium (these various oxide forms)^99mTc) and rhenium (^186,188Re), for example ReO³⁺, ReO₂ ⁺,^99mTcO₂ ⁺And most preferably^99mTcO³⁺It is. In accordance with desirable and preferred features of the present invention, the chelator binds to the target molecule represented by Z in the above formula and delivers the chelated radionuclide to the desired location in the mammal. Form a bond. Examples of suitable target molecules for binding to this chelator include, but are not limited to, steroids, proteins, peptides, antibodies, nucleotides and sugars. Suitable target molecules include proteins and peptides, particularly those that can specifically bind to characteristic cell surface receptors of particular pathology. For example, pathological conditions associated with overexpression of specific protein receptors can be imaged by labeling the chelating agent of the present invention with those proteins or receptor fragments. The most preferred target molecule is a peptide that can specifically bind to the target site and has 3 or more amino acid residues. Target peptides useful for imaging certain medical conditions and tissues are shown below:
Against atherosclerotic plaque

For infection and atherosclerotic plaque

Against blood clots

Against platelets

For amyloid plaques (Alzheimer's disease)

In connection with this chelator, the target molecule may include a “spacer” that provides physical separation between the chelator and the target molecule. The spacer may be an alkyl chain derivatized to bind to the chelator. Where the target molecule is a peptide, this spacer may suitably be one or more amino acid residues. Preferably, the peptide target molecule incorporates a spacer from 1 to 5 amino acids such as having a chemically inert α-carbon side chain such as a glycine or β-alanine residue.
The target molecule is R¹~ R⁶, X, Y and Z, and the chelating agent of the present invention can be attached at various sites including the ring formed by X and Y. Coupling can be accomplished by reacting a group present on the reactive target molecule with a substituent of the chelator to form a bond. For example, peptide target molecules having a free amino group, such as the N-terminus or ε-amino-lysine, can react with the carboxyl group of the chelator to form an amide bond. Alternatively, the C-terminus of the peptide target molecule can be reacted with an amino substituent on the chelator. In a preferred embodiment, the target molecule is attached to the chelator of formula (I) with substituent Z by an amide bond such as a peptide bond. For example, the N-terminal amino group of the peptide target molecule reacts with the carboxyl group of Z. Target molecules other than peptides react in the same manner as the chelating agents of the present invention, provided that appropriate groups are present that bind to the chelating agent. In the absence of a suitable group, the target molecule may be chemically derivatized so that such a group is present. If more than one reactive group is present in the chelator or target molecule, protect all groups other than the specific group for conjugation with a suitable protecting agent to obtain a single binding species. Is desirable. For example, free carboxyl groups can be protected by forming esters such as t-butyl esters (which can be removed with TFA). The free amino group can be protected with a protecting group such as FMOC, which can subsequently be removed with piperidine.
In a particular embodiment of the invention, in vivo imaging of focal inflammatory sites is achieved using a conjugate where the target molecule is a chemical strategy peptide comprising the amino acid sequence Thr-Lys-Pro-Pro-Lys (TKPPR). Is done. This peptide has been found to bind particularly well to leukocyte receptors. If the target peptide retains its localization activity, it can be sequestered from the chelator by an additional amino acid residue, preferably glycine. In certain embodiments, the peptide TCKPR is attached to the Z substituent of the chelator of formula (I) by a Gly residue.
Peptide-based target molecules can be produced using a variety of established methods, either as such or as a conjugate with a chelator. Since it is easy by solid phase synthesis, performing another FMOC protection and deprotection is the preferred method for synthesizing short peptides. Recombinant DNA technology is suitable for producing proteins and long fragments thereof. In certain embodiments, the peptide-chelator conjugate is synthesized by solid phase peptide synthesis, which is an amino acid residue on a growing peptide chain attached to an insoluble (solid) support or matrix such as polystyrene. Including sequential addition. The C-terminal residue of the target peptide is first tethered to a commercially available support with its amino group protected with an N-protecting agent such as a fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) group. Typically, this support is obtained as a C-terminal residue pre-bound in protected form. The amino protecting group can be removed with a suitable deprotecting agent, such as piperidine, and the next amino acid residue (in the N-protected form) is added with a binder such as dicyclocarbodiimide (DCC). After formation of the peptide bond, the reagent is washed out from the support. After the target peptide chain is synthesized, the first residue of the chelator, ie S-acetamidomethyl protected cysteine, is added to the N-terminus. The last residue of the chelator is of formula (X) (Y) N—C (R¹) (R²) -CO (where X, Y, R¹And R²Is a derivatized amino acid residue compatible with the above. The last residue, such as dimethyl-glycine, diethyl-glycine, dibenzyl-glycine or sarcosine, can be obtained commercially or synthesized. The completed conjugate is cleaved from the support with a suitable reagent such as trifluoroacetic acid (TFA).
R of the present invention¹~ R^FourThe substituents of are naturally-derived or derivatized amino acid side chains, including D-amino acids, which are commercially available and are believed to be compatible with solid phase synthesis techniques. Non-commercially available derivatized amino acid residues can be synthesized by established organic chemistry techniques and inserted into the chelating agents of the present invention at the appropriate stage of solid phase synthesis described above. Similarly, the substituent R^FiveAnd R⁶Is other than H, the derivatized cysteine amino acid residue is used for peptide synthesis. For example, the commercially available residue penesillamine is R^FiveAnd R⁶Is incorporated when both are methyl.
The various substituents of X and Y can be of the formula (X) (Y) N—C (R¹) (R²) -C (O) -OH (where X, Y, R¹And R²Can be introduced by incorporating into the chelating agent of the present invention. Amino acids having X and Y N-terminal amino substituents can be synthesized by established organic chemistry techniques and techniques. For example, if X and Y are both dibenzyl substituents, the corresponding dibenzylglycine residue can be reacted with commercially available reagents, bromoacetic acid and dibenzylamine in a suitable solvent such as dichloromethane, Subsequently, it can synthesize | combine by heating. Other amines can be carried out in the reaction to obtain the corresponding diisopropylglycine, for example with diisopropylamine instead of dibenzylamine. Similarly, instead of dibenzylamine, piperidine and morpholine give the corresponding piperidine-glycine and morpholine-glycine.
In the most preferred embodiment of the invention, the peptide-chelator conjugate is prepared on a solid support and is of formula (I) (where the target molecule is the sequence, Gly-Thr-Lys-Pro- Pro-Arg-OH; R¹, R², R^Three, R^FiveAnd R⁶Is H; R^FourIs hydroxymethyl or 1-hydroxymethyl; and R⁷Is acetamidomethyl).
Incorporation of the selected radionuclide into the chelating agent can be accomplished in a variety of established ways. For example, the following general method can be used. A chelating agent solution is first formed by dissolving the chelating agent in an aqueous alcohol such as ethanol-water 1: 1. For example, N₂Remove the oxygen by degassing with, then add sodium hydroxide to remove the thiol protecting group. The solution is deoxygenated again, heated in a water bath to hydrolyze the thiol protecting group, and then the solution is neutralized with an organic acid such as acetic acid (pH 6.0-6.5). In the labeling step, technetium sodium is added to a chelator solution having an amount of stannous chloride sufficient to reduce technetic acid. The solution is mixed and allowed to react at room temperature and then heated in a water bath. Alternatively, labeling can be performed with a chelating agent solution adjusted to pH8. At this high pH, the pertechnetium salt can be replaced with a solution containing technetium complexed with the desired chelating agent and the appropriate free ligand for the ligand exchange reaction. Suitable ligands are tartrate, citrate and heptasaccharide salts. Stannous chloride can be replaced with sodium dithionite as a reducing reagent if the chelator solution is otherwise adjusted to a high pH 12-13 for the labeling step. The chelating agents of the present invention can be conjugated to a target molecule prior to labeling with a radionuclide, a method that is a “bifunctional chelate” method. Another method is the “pre-labeled ligand” method, where the chelator is first labeled with a radionuclide and then bound to the target molecule.
Labeled chelating agents are pollutants^99mTcO_FourAnd colloidal^99mTcO₂Can be chromatographically activated, for example with ethanol, followed by separation on a C-18 Sep Pak column with dilute HCl. Elution with dilute HCl is^99mTcO_FourAnd elution with EtOH-saline 1: 1 removes the chelating agent,^99mTcO₂On the column.
When bound to a target molecule and labeled with a diagnostically useful metal, the chelating agents of the present invention can be used to detect disease states with conventional techniques in diagnostic imaging techniques. A chelating agent-target molecule conjugate labeled with a radionuclide such as technetium is applied to a mammal in a pharmaceutically acceptable solution, such as saline or serum medium, intralymphatic, intraperitoneally and intravenously. Can be administered. The amount of labeled conjugate administered depends on the toxicity and metal properties of the selected target molecule and is typically in the range of about 0.01-100, preferably 10-50 mCi per 70 kg of host. is there. In vivo metal localization is followed by standard scintigraphic techniques at the appropriate time following administration. The time at which an image is obtained depends on the properties of the target molecule, for example most peptides are localized quickly and images are obtained within 3 hours, often within 1 hour. In a particular embodiment, a chelating agent of the invention that binds to the peptide target molecule GTKPPR in saline is administered intravenously to the image site of focal inflammation.
The following examples are given to further illustrate embodiments of the present invention.
Example 1: Preparation of peptide-chelator conjugate
N, N-dimethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg
N, N-dimethyl Gly-Thr-Cys (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg and
Sarcosine-Gly-Ser-Cys- (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg
The title conjugate was obtained using an Applied Biosystems 433A peptide synthesizer (Foster City, CA) using 2-methoxy-4-alkoxybenzyl alcohol resin (Sasrin resin, Bachem Biosciences Inc., Philadelphia, pre-conjugated FMOC-arginine). PA) was synthesized as a single peptide chain by solid phase peptide synthesis using FMOC chemistry. Derivatized amino acid residues, S-acetamidomethylcysteine (Bachem), N, N-dimethylglycine (sigma Chemical Company, St. Louis, Mo) and sarcosine were incorporated at the appropriate stage of chain extension.
In the addition of the last residue, N, N-dimethyl Gly or sarcosine, the peptide resin was dried overnight under vacuum and the cleavage of the peptide from the resin was 9.5 ml trifluoroacetic acid (TFA), 0.5 ml water, A cold solution of 0.5 ml thioanisole and 0.25 ml 2-ethanedithiol (1 ml per 100 mg peptide-resin) was mixed with the peptide-resin at room temperature for 1.5-2 hours. The resin was removed by filtration and washed with 1-3 ml TFA to give 6-8 ml clear yellow solution. This solution was slowly dropped into 30-35 ml of t-butyl methyl ether in a 50 ml conical polypropylene centrifuge tube to form a white precipitate. The precipitate was centrifuged at 7,000 rpm (Sorval RT600, Dupont) for 5 minutes at 0 ° C., decanted and washed twice or more with t-butyl methyl ether. After drying under vacuum, the precipitate was dissolved in water. This solution was frozen with acetone-dry ice and lyophilized overnight. The resulting white powder was dissolved in water and filtered through a 0.45 μm syringe filter (Gelman Acrodic 3 CR PTFE), 0.1% TFA in water as buffer A and 0.1% in acetonitrile as buffer B Purification was by reverse phase HPLC (Beckman System Gold) using a C18 column (Waters RCM 25 × 10) with TFA. The column was equilibrated with 100: 0 buffer A: buffer B and eluted with a linear gradient to 50% buffer B over 25 minutes at 1 ml / min. Fractions were re-analyzed on HPLC and collected according to the fit profile. The pure fraction was frozen in acetone-dry ice and lyophilized for 12 hours to give a white powder.
Example 2: Preparation of peptide-chelator conjugate
N, N-dibenzyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg
N, N-diethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg
The title conjugate was obtained using an Applied Biosystems 433A peptide synthesizer (Foster City, Calif.) And 2-methoxy-4-alkoxybenzyl alcohol resin (Sasrin resin, Bachem Biosciences Inc., Philadelphia, PA) pre-conjugated with FMOC-arginine. ) Above, synthesized as a single peptide chain by solid phase peptide synthesis using FMOC chemistry. Derivatized amino acid residues, S-acetamidomethylcysteine (Bachem), N, N-dimethylglycine and N, N-dibenzylglycine were incorporated at the appropriate stage of chain extension.
The derivatized amino acid residue, N, N-dibenzylglycine, was synthesized by the following method: In a flask equipped with a magnetic stirrer, bromoacetic acid (5.00 g, 35.9 mmol) was added to CH.₂Cl₂And cooled to 0 ° C. and dibenzylamine (8.31 ml, 43.79 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour, allowed to warm to room temperature and then heated to 30-40 ° C. for 12 hours. The mixture was cooled to room temperature and the solvent was evaporated under reduced pressure, washed with hot ethanol and dried under vacuum to give a white solid residue (yield 71.2%).
The derivatized amino acid residue N, N-diethylglycine was synthesized by the following method.
In a flask, chloroacetic acid (5.00 g, 52.91 mmol) was added to diethylamine (35 ml) and stirred at room temperature for 12 hours and then heated at reflux for 72 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature, neutralized with HCl, and concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate and EtOH were then added and the resulting white precipitate was filtered and dried under vacuum to give 1.74 g (25% yield) of product.
Example 3: Labeling of peptide-chelator conjugate
N, N-dimethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -GTKPPR
N, N-dimethyl Gly-Thr-Cys (Acm) -GTKPPR
N, N-diethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -GTKPPR
N, N-dibenzyl Gly-Ser-Cys (Acm) -GTKPPR and
Sarcosine-Ser-Cys (Acm) -GTKPPR
The conjugates of Examples 1 and 2 were reconstituted (200 μl, 1 mg / ml saline) and then 3 ml with 100 μl pertechnetium salt (10 mCi) and stannous gluconate (50 μg stannous chloride and 1 mg sodium gluconate). Injection into a vacutainer. The tube was placed in a boiling water bath for 12 minutes and then filtered through a Whatman PVDF syringe filter to obtain a labeled conjugate solution, which was further diluted with saline to prepare an injectable solution (2 Mbq / ml). The conjugate was isolated from a sample (20 μl) (before distillation) by HPLC (Beckman) and the radioactivity was measured to determine the labeling yield.

With the exception of sarcosine-Ser-Cys (Acm) -GTKPPR, each conjugate is a single peak with a label yield of 85% or more. After 24 hours of labeling, N, N-dimethylGly-Ser-Cys (Acm) -Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg was reanalyzed by HPLC and no degradation or radiolysis products were observed. .
Example 4: Imaging and biodistribution of conjugates in vivo
The rat inflammation test was performed as follows. Two male Wistar rats (Charles River, 150-200 g) were intramuscularly injected with zymosan (25 mg), a yeast cell wall suspension, into its left hind leg 24 hours prior to imaging. Leg foci inflammation became visually detectable after 1 day. 1 mg (about 0.7 μmol) of the chelator-peptide conjugate was dissolved in 50 μl of dimethyl sulfoxide and added to an ethanol-water mixture (1: 1, 20 μl). Tc-99m tartrate (about 400 MBq) was added, and chelate exchange was allowed to proceed at 100 ° C. for 20 minutes. The Tc-99m labeled conjugate was purified by elution through a Sep Pak cartridge and then diluted with saline to prepare an injectable formulation (200 μl) having an activity of about 100 μCi (3.7 MBq).
Rats were anesthetized with somnitol (40-50 mg / kg) and labeled conjugate solution (200 μl) was injected intravenously into the tail vein. In 30 minutes, continuous whole body scintigrams were obtained. Rats are then anesthetized and sacrificed, and organ, urine, blood, inflammatory muscle (left leg), non-inflammatory muscle (right leg) and inflammatory exudate specimens are weighed, and a well-type gamma counter or gamma ray depending on the organ Counting was done with either of the measuring instruments. Dose calculations were performed based on the assumption that the blood volume is 8% of body weight. The conjugate results shown in the table below are averages of two rats and corrected for tail residual dose.
The two conjugates are other known inflammatory contrast agents such as Ga-67,^99mTc-IgG,¹¹¹In-WBC and^99mCompared to Tc-nanocol, which is indicated by the observed high target-to-background ratio (inflammatory muscle versus inflammatory muscle), it gave superior scintigram images. These conjugates imaged much faster than known reagents and showed excellent biodistribution. Also non-target organs such as liver and gastrointestinal tract showed low accumulation.

Claims (16)

The following formula (I):

(Where
X is a linear or branched, saturated or unsaturated, C _1-4 alkyl chain, optionally interrupted by one or two heteroatoms selected from N, O and S. And optionally substituted with at least one group selected from halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, C _1-4 alkyl, aryl and C (O) Z);
Y is a substituent having the same meaning as X or H;
X and Y taken together are a 5- to 8-membered saturated or unsaturated heterocycle (optionally halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, oxo, C _1-4 alkyl, aryl and C ( O) may be substituted with at least one group selected from Z);
R ^{1 to} R ⁴ are independently substituted with a group selected from H; carboxyl; C _1-4 alkyl; hydroxyl, amino, sulfhydryl, halogen, carboxyl, C _1-4 alkoxycarbonyl and aminocarbonyl. Selected from C _1-4 alkyl; α-carbon side chain of D or L amino acids other than proline; and C (O) Z;
R ⁵ and R ⁶ are independently, H; carboxyl; amino; C _1-4 alkyl; is selected from and C (O) Z; hydroxyl, C _1-4 alkyl substituted by carboxyl or amino;
R ⁷ is selected from H and a sulfur protecting group; and Z is selected from hydroxyl, C _1-4 alkoxy, and a target molecule that is a peptide comprising 3 or more amino acid residues)
An agent for radiographic imaging or treatment with radiation in a mammal, comprising a compound represented by: The agent according to claim 1, wherein R ¹ , R ² , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are hydrogen. The agent of claim 1, wherein X and Y are independently selected from C _1-4 alkyl and aryl-substituted C _1-4 alkyl. The agent of claim 1, wherein R ³ is selected from hydroxymethyl and 1-hydroxyethyl. The drug according to claim 1 or 4, wherein X and Y are the same group selected from methyl, ethyl and benzyl. R ¹ , R ² , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are hydrogen, R ³ is selected from hydroxymethyl and 1-hydroxyethyl, X and Y are methyl, Z is a target molecule The drug according to claim 5, wherein The drug according to claim 1, wherein Z is a target molecule. 8. An agent according to claim 7, wherein the peptide comprises the sequence TKPPR. 9. An agent according to claim 8, wherein the peptide comprises the sequence Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH. The drug according to any one of claims 1 to 9, which is in the form of a complex with a metal radionuclide or an oxide or nitride thereof. 11. The agent according to claim 10, wherein the metal radionuclide is ^99m Tc. General formula (II):

(Where
X is a linear or branched, saturated or unsaturated, C _1-4 alkyl chain, optionally interrupted by one or two heteroatoms selected from N, O and S. And optionally substituted with at least one group selected from halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, C _1-4 alkyl, aryl and C (O) Z);
Y is a substituent having the same meaning as X or H;
X and Y taken together are a 5- to 8-membered saturated or unsaturated heterocycle (optionally halogen, hydroxyl, amino, carboxyl, oxo, C _1-4 alkyl, aryl and C ( O) may be substituted with at least one group selected from Z);
R ^{1 to} R ⁴ are independently substituted with a group selected from H; carboxyl; C _1-4 alkyl; hydroxyl, amino, sulfhydryl, halogen, carboxyl, C _1-4 alkoxycarbonyl and aminocarbonyl. Selected from C _1-4 alkyl; α-carbon side chain of D or L amino acids other than proline; and C (O) Z;
R ⁵ and R ⁶ are independently, H; carboxyl; amino; C _1-4 alkyl; is selected from and C (O) Z; hydroxyl, C _1-4 alkyl substituted by carboxyl or amino;
Z is selected from hydroxyl, C _1-4 alkoxy and the target molecule;
M is a metal radionuclide or its oxide or its nitride)
A compound represented by M is selected from ^99m Tc, ⁶⁴ Cu, ⁶⁷ Cu, ⁹⁷ Ru, ¹⁰⁵ Rh, ¹⁰⁹ Pd, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁹⁸ Au, ¹⁹⁹ Au, ²⁰³ Pb, ²¹² Pb and ²¹² Bi, and their oxides or nitrides 13. The compound according to claim 12. 14. A compound according to claim 13, wherein M is ^99m Tc or its oxide or nitride. N, N-dimethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Z;
N, N-dimethyl Gly-Thr-Cys (Acm) -Z;
The agent according to claim 1, wherein the agent is selected from N, N-diethyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Z; and N, N-dibenzyl Gly-Ser-Cys (Acm) -Z, wherein Z is a target molecule. 16. The agent according to claim 15, which is in the form of a metal radionuclide or a complex thereof with an oxide or nitride.

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