JP3753607B2 - Method for producing immobilized biocatalyst - Google Patents

Description

（式中、Ｙは直接結合であるか、又は次の式：
【０００９】
【化５】

により表わされる２価基であり、Ｒ₁ 及びＲ₂ は相互に独立に水素又は有機残基であり、
【００１０】
【化６】

は陰イオンを表わし、そしてｎは１００〜５０００の数である）
により表わされるポリマーが使用される。
【００１１】
式中、Ｒ₁ 及びＲ₂ の有機残基としては、炭素数１０個以下のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒ−ブチル基等であり、メチル基が特に好ましい。さらに、ハロゲンやヒドロキシルの置換した有機残基を使用することができ４−クロロ−２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジクロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルノニル基などであり、特に、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル基が好ましい。
【００１２】
Ｘ^- としてはハロゲンイオン、例えばＦ^- 、Ｃｌ^- 、Ｂｒ^- 、Ｉ^- が挙げられ特にＣｌ^- が好ましい。さらに、他の一価の陰イオン、例えばＮＯ₃ ^- などを使用することもできる。ｎは好ましくは１００〜５０００である。具体的なポリマーとしては、次の構造式により示されるものが挙げられる。
【００１３】
【化７】

【００１４】
式（Ａ）のポリマーは、例えば商品名ＰＡＳ４１０として、式（Ｂ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ９２として、式（Ｃ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ−Ｍ−１として、式（Ｄ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ−８８０として、式（Ｅ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ−Ｈ−５Ｌとして、日東紡績株式会社から入手することができる。また、例えば式（Ａ）のポリマーは、ジアリルアミン塩（例えば塩酸塩）とマレイン酸の１：１共重合により製造することができ、式（Ｂ）のポリマーはジアリルアミン塩（例えば塩酸塩）と亜硫酸ガスとの共重合又はラジカル重合により、式（Ｃ）のポリマーはジアリルモノアルキルアミンの共重合又はラジカル重合により、製造することができる。
【００１５】
さらに、本発明の固定化に使用する水溶性架橋性ポリマーとして、下記の式：
【化８】

により示されるポリキャップ（ハーキュレス社製ポリキャップ１７２等）を使用することもできる。
【００１６】
本発明で使用する細胞としては、所望の酵素を含有する任意の細胞を使用することができ、例えば細菌、酵母、藻類、糸状菌等の微生物細胞、植物細胞等が使用できる。酵素としては、特に限定されないが、例えばフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換するアスパルターゼ、マレイン酸をフマル酸に転換するマレイン酸イソメラーゼ、フマル酸をＬ−リンゴ酸に転換するフマラーゼ、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に転換するマレアーゼ、シスエポキシコハク酸をＬ−酒石酸に転換するヒドラターゼ等、種々の酵素が挙げられる。より具体的な細胞の例として、アスパルターゼを含有する細菌細胞、マレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞、アスパルターゼとマレイン酸イソメラーゼの両方を含有する細菌細胞等が使用される。
【００１７】
本発明において使用する細胞はさらに、上記のごとき酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学的に導入した宿主細胞であってもよい。
さらに、具体的には、例えば次のような微生物の細胞を使用することができる。
【００１８】
【表１】

【００１９】
これら微生物の細胞を培養した培養液に先の一般式（化４）で示されるポリマーを低濃度で添加すると、培養菌体を凝縮沈降させることができ、大量の培養液を遠心分離にかける必要がなくなるため操作が簡易となる。具体的には、固定化する微生物を培養した培養液に、先の一般式（化４）で示されるポリマーを固型分濃度として１０〜１００００ppm になるように、好ましくは１００〜１０００ppm になるように添加し、静置すると微生物菌体が凝集し、沈降する。この時、あらかじめ培養液を冷却しておけば、目的の酵素活性の低下を防ぐのに有効である。
【００２０】
このようにして、微生物菌体を沈降させた後、上澄みを抜き出すことによって液量を数分の１に減らすことが出来る。例えば、１Ｌの培養液にＰＡＳ−８８０を５００ppm 添加して、３０分静置すると、約８００mlが上澄みとして分離される。残りの菌体凝集液を３０００rpm の低速遠心分離器にかけると、菌体をケーキとして回収することが出来る。このように凝集した菌体は低速遠心機でも十分に遠心分離できるため、簡易な装置で菌体が回収出来るようになる。
【００２１】
回収した菌体はそのまま、あるいは水を追加して、pH調節したポリマー溶液と混合することによって固定化の材料として使用することができる。また、菌体を回収後、凍結保存していたものを解凍後または凍結ブロック状の菌体を粗く砕いた後に、ミキサーでポリマーと混合して使用することもできる。この凍結菌体とポリマーの混合物は、やわらかいシャーベット状で非常に冷えているために、室温でも特別な冷却操作をせずに固定化作業を行うことができ、酵素の活性を維持する点でも好ましい。
【００２２】
細胞の固定に当っては１種類の細胞を固定することもでき、又は複数種類の細胞を固定することもできる。例えば、マレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞とアスパルターゼを含有する細菌細胞とを組合せて固定することができる。
細胞の固定化方法は、まず弱酸性にした液状のポリマーを水と混合し、pHを中性〜塩基性にした後、細胞を混合する。この細胞とポリマーの混合物を固体担体にまぶしたものを乾燥させればよい。まぶす方法としては、適当な大きさの容器中で棒、へら等による攪拌及び手で直接かき混ぜることによって、細胞とポリマーの混合物を担体と均一に混合する。
【００２３】
固定化すべき細胞とポリマーの比率は細胞（ウェット）１kgに対してポリマー固形分０．２〜１０kg、好ましくは０．５〜５kgの範囲である。ポリマーと細胞との混合物を調製する場合に添加する水の量は、乾燥を早く行うためにはできるだけ少ないほうが好ましく、細胞が懸濁できる量であればよい。通常、細胞１kg（ウェット）あたり０．１〜２kg、好ましくは０．３〜１kgである。
【００２４】
固定化の担体をあらかじめ乾燥させておくと、乾燥時間が短くなるので好ましい。担体の乾燥は、ロータリーエバポレーター、流動床乾燥機、温風乾燥機、棚段乾燥機、噴霧乾燥機、トンネル乾燥機、ナウタミキサー、流動層乾燥機、真空乾燥機、気流乾燥機など常用の乾燥機で、担体の変質が起こらない温度範囲であればよく、担体の重量に対して、３０重量％以下、好ましくは２０％以下、さらにこのましくは１０％以下にまで乾燥することが好ましい。
【００２５】
このように、担体を事前に乾燥させておくと、水溶性のポリマーと菌体の混合物を担体と混合したときに、担体内部に混合物中の水が吸い込まれることによって、担体表面に水溶性ポリマーと菌体混合物がはりつき、一次コーティングを行うことができる。このときの固定化混合物の状態は粘質性が比較的低い状態となるため、その後の乾燥を短時間に行うことができ、結果として得られる固定化生体触媒の活性を高くすることができる。
【００２６】
固定化担体に細胞とポリマーとの混合物をまぶす方法としては、適当な大きさの容器のなかで棒、へら等による攪拌、及び手で直接かき混ぜることによって、細胞とポリマーの混合物を均一に混合する。またこの混合の操作を通常の混合に用いられる装置を用いて行うこともできる。混合の装置としては、リボンミキサー、ニーダーなどのミキサー、特にプラネタリー型ミキサーなど、パン生地を練るのに用いられるような、粘質物を混合できるミキサーであればいずれも好適にもちいることができる。装置としてはたとえば愛工舎製作所製の実験用卓上ミキサーＫＭ−６００にフック型あるいはビーター型の攪拌子をつけたものなどが例示することができる。
【００２７】
固定化の際の乾燥は固定化生体触媒中の水分が２０重量％以下、より好ましくは１０％以下になるまで、例えばロータリーエバポレーター、流動床乾燥機、温風乾燥機、棚段乾燥機、噴霧乾燥機、トンネル乾燥機、ナウタミキサー、流動層乾燥機、真空乾燥機、気流乾燥機などを使用して行う。この範囲より水分が多いと、固定化生体触媒を固定床で使用した場合、短期間で活性が低下してしまう。
【００２８】
ポリマーでの被覆層はゲル状態であるが、乾燥が不十分な場合、このゲル層が厚くなり、ポリマー同士、ポリマーと細胞表面の架橋が緩くなるため、固定化後、固定床の触媒として使用した場合に細胞内の酵素が菌体とポリマーからなっているゲル状の被覆層から漏れ出し、固定化生体触媒の活性が短期間で低下してしまう。このゲル状の被覆層を酵素が漏れ出ない状態まで架橋させるために先の範囲になるまで乾燥を行う。
【００２９】
本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間と固定化酵素の活性との関係を図３に示す。図中、黒丸印は本発明の範囲内の乾燥温度と乾燥時間との組合せであり、×段は本発明の範囲外の乾燥温度と乾燥時間との組合せである。この図において、囲で示す範囲内の乾燥温度と乾燥時間の組合せの範囲内で有用な固定化酵素が得られることが実証された。
【００３０】
しかしながら図１に示す囲いの高温及び長時間側において固定化酵素が２１００Ｕ〜３２００Ｕという実用性のある酵素活性を示すことから、図３における高温及び長時間側の折線よりもさらに高温及び長時間側においても有用な固定化酵素が得られることが明らかである。また、低温及び短時間側においては、酵素の失活はより少ないのであるから、図３の低温及び短時間側の折線よりもさらに低温及び短時間において、有用な酵素が得られることは明らかである。従って、本願発明における乾燥温度と乾燥時間の範囲は図１又は図２により示される。
このようにして固定した後の細胞を含むポリマー層の厚さは、０．００１〜０．３mm、好ましくは０．００５〜０．２mmである。
【００３１】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
参考例１．アスパルターゼ遺伝子を導入した組換え宿主細胞の調製
（１）Eschelichia coliアスパルターゼ組み換え体の作成
財団法人醗酵研究所から購入した大腸菌（Eschelichia coli）ＩＦＯ３３０１株を表１に示すＬＢ培地に接種して、３７℃で８時間培養した。この培養液１mlから菌体を回収し、蒸留水１mlに懸濁した。この菌体懸濁液１μｌをアスパルターゼ遺伝子を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００３２】
【表２】

【００３３】
（２）ＰＣＲでのアスパルターゼ遺伝子の増幅と挿入断片の作成公知の大腸菌（Eschelichia coli）Ｋ−１２株のアスパルターゼ遺伝子（該遺伝子の塩基配列及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は、特開平１１−３１３６９４号に記載されている）（Biochem.J.237(2), 547-557)をもとに大腸菌（Eschelichia coli）のアスパルターゼ遺伝子を増幅するために以下の２つのプライマーを作成した。
プライマーＦ１：ＧＧＡＴＡＡＴＣＧＴＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡ
プライマーＲ１：ＣＧＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴ
【００３４】
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、下記の組成の反応液を調製し、ＰＣＲでのアスパルターゼ遺伝子の増幅を行った。
【表３】

【００３５】
ＰＣＲ条件：９８℃ ５分；９８℃ ３０秒；５３℃ ３０秒；６８℃ １分；からのサイクルを３０回繰り返す。ＰＣＲの反応終了後、増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動、エチジウムブロマイド染色したところ、予想された約１６００bpの断片が増幅されていた。この断片をアガロースゲルから切り出して、Prep-A-Gene (Bio Rad）でＤＮＡを回収した。
【００３６】
（３）ベクターへの挿入断片の結合pCR-ScriptAmpSK （＋）クローニングベクターに制限酵素ＳｒｆとＤＮＡリガーゼの存在下、先に回収したＤＮＡ断片を結合させた。この挿入ＤＮＡ断片を入れた形質転換体の一つをPUaspE1 株と命名した。このPUaspE1 株をアンピシリン１００ppm を添加したＬＢ培地３mlに接種し、３７℃で一夜振とう培養し、その培養液１．５mlから菌体を回収した。この菌体から、アルカリＳＤＳ法によってプラスミドを回収した。このプラスミドをpUaspE1 と命名した。
【００３７】
このプラスミドの挿入断片の配列を解析したところベクターのプロモーターに対して逆向きにアスパルターゼ遺伝子が挿入されていることがわかった。プロモーターに対して、順向きにつなぎ直すために、プラスミドpUaspE1 から制限酵素SacIとBamHI で挿入断片を切り出し、pUC19 に導入することにした。プラスミドpUaspE1 を制限酵素BamHI で切断した後エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、次いで制限酵素SacIで切断した。切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ゲルから切り出してprep-A-Gene (bio rad) でＤＮＡを回収した。
【００３８】
（４）ベクターの作成プラスミドpUC19 （ニッポンジーン製）１μｇを制限酵素BamHI で切断後、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、次いで制限酵素SacIで切断した。切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ゲルから切り出してprep-A-Gene (bio rad) でＤＮＡを回収してベクターとした。
【００３９】
（５）ベクターへの挿入断片の結合制限酵素で切断したベクターと挿入断片をライゲーションハイ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃、３０分結合させた。
【００４０】
（６）大腸菌の形質転換ベクターと挿入断片を結合させた反応液２μｌを大腸菌コンピテントセル（XL 2-Blue MRF' Ultracompitent cells STRATAGENE社製）２００μｌに入れ、大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン１００ppm を含有するＬＢ寒天培地に広げて３７℃、一夜培養した。コントロールとして、挿入断片を挿入していないプラスミドpUC18 で形質転換し、同様にアンピシリン１００ppm を含有するＬＢ寒天培地に広げて３７℃で一夜培養した。
【００４１】
出現したコロニーを２０個釣り上げ、アンピシリン１００ppm を含有するＬＢ培地に接種して、３７℃で振とう培養した。８時間後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１mMの濃度に添加して、さらに一夜３０℃で振とう培養し、培養液１mlから菌体を回収した。同様に、挿入断片をもたないコントロールの形質転換体１株を培養し、菌体を回収した。この回収した菌体に表２に示すフマル酸アンモニウム基質液１mlを添加して、菌体を懸濁させ、３０℃で１時間反応させた。
【００４２】
【表４】

【００４３】
反応液を分析したところ、挿入断片を入れた大腸菌形質転換体は、Ｌ−アスパラギン酸への転化率９９．５％であった。一方挿入断片を入れていないコントロールの形質転換体は転化率５％であった。この挿入断片を入れた形質転換体の一つをPUaspE2 と命名した。
【００４４】
PUaspE2 をアンピシリン１００ppm を添加したＬＢ培地３mlに接種し３７℃で８時間培養した。この培養液１．５mlからアルカリＳＤＳ法によってプラスミドを回収した。このプラスミドをpUaspE2 と命名した。プラスミドpUaspE2 を制限酵素SmaI、ついで制限酵素HindIII で切断後、１％アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡ断片の大きさを計算したところ、約２９６０bpと１６００bpの２本の断片が存在していた。
【００４５】
PUaspE2 株をアンピシリン１００ppm を添加したＬＢ培地３mlに接種し、３７℃で振とう培養し、８時間後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１mMの濃度に添加して、さらに一夜３０℃で振とう培養した。この培養液１mlから菌体を回収するとともに菌体濃度ＯＤ６６０nmを測定したところ８．０であった。この菌体を２０％フマル酸アンモニウム基質液１０mlに懸濁し、３０℃で１時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ分析した。生成したＬ−アスパラギン酸と菌体濃度から、アスパルターゼ活性を計算したところ、２，０００，０００μＭ−Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ＯＤ６６０nm菌体濃度であった。
【００４６】
同様に、挿入断片をもたないコントロールの形質転換体１株を培養し、菌体を回収するとともに菌体濃度ＯＤ６６０nmを測定したところ８．５であった。この菌体を２０％フマル酸アンモニウム基質液１０mlに懸濁し、３０℃で１時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ分析した。生成したＬ−アスパラギン酸と菌体濃度から、アスパルターゼ活性を計算したところ、１０，０００μＭ−Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ＯＤ６６０nm菌体濃度であった。このように取得したPUaspE2 株は挿入アスパルターゼ遺伝子を持たない株の２００倍のアスパルターゼ活性を有していた。
【００４７】
（７）組み換え体の培養大腸菌（Eschelichia coli）のアスパルターゼの組換え大腸菌PUaspE2 株を表１に示す培地にアンピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０本に接種して３７℃で８時間培養後、同組成の培地にＩＰＴＧを１mMを添加した培地１００mlを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ１．８５moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００４８】
実施例１．
大腸菌（Eschelichia coli）アスパルターゼ組み換え大腸菌pUasp-E2株を表１に示す培地にアンピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０本に接種して３７℃で８時間培養後、表３の培地にＩＰＴＧ１mMとアンピシリン１００ppm を添加した培地１００mlを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ１．９moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００４９】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの１２０ｇ及び脱イオン水２４０ｇをよく混合し、先に回収した菌体２７０ｇを均一に分散させた。これをあらかじめ乾燥させておいたイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９６ＳＢＣｌ型オルガノ社製、平均粒径０．５mm 水分含量６％）２Ｌに混合してコーティングし、ステンレス製のバットに広げた。
【００５０】
このバットを４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２８％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１５％であった。この固定化生体触媒の活性値は４５００Ｕであった。なお、本発明において、固定化生体触媒の活性値は、「１Ｕ＝１μmol Ｌ−アスパラギン酸生成／１分／ml固定化生体触媒」と定義する。
【００５１】
この固定化生体触媒を、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の基質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ及びアンモニアでpH８．３に調製）を断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時３００mlの速度（ＬＨＳＶ＝３０）で流通させ連続反応を行った。
【００５２】
反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．７７％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。また反応開始後７日目、１ヶ月後の変換率も９９．７％を維持していた。
【００５３】
実施例２．
実施例１と同様にして菌体培養し５０℃の温風乾燥機を用いて１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１７％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は９％であった。
【００５４】
この固定化アスパルターゼの活性は５０００Ｕであった。調製した固定化アスパルターゼを、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムを使用して実施例１と同様にして連続反応を行った。基質液の温度は２０℃で、またその流通速度は毎時３００ml（ＬＨＳＶ＝３０．０）で行った。反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．６％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。また反応開始後７日目、１ヶ月後の変換率も９９．５％を維持していた。
【００５５】
実施例３．
実施例１と同様にして菌体培養し５５℃の温風乾燥機を用いて１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１０％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は６％であった。
【００５６】
この固定化アスパルターゼの活性は４７００Ｕであった。調製した固定化アスパルターゼを、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムを使用して実施例１と同様にして連続反応を行った。
【００５７】
基質液の温度は２０℃で、またその流通速度は毎時３００ml（ＬＨＳＶ＝３０．０）で行った。反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．６％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。また反応開始後７日目、１ヶ月後の変換率も９９．５％を維持していた。
【００５８】
実施例４．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを８０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１７％であり、その活性は５２００Ｕであった。
【００５９】
実施例５．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１００℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１０％であり、その活性は５５００Ｕであった。
【００６０】
実施例６．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１２０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は５３００Ｕであった。
【００６１】
実施例７．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１４０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は４４００Ｕであった。
【００６２】
実施例８．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１６０℃の温風で２分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は３２００Ｕであった。
【００６３】
実施例９．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１８０℃の温風で１分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は５％であり、その活性は２６００Ｕであった。
【００６４】
実施例１０．
実施例１と同様にしてEschelichia coliアスパルターゼ組み換え大腸菌pUasp-E2株を培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ２．０moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００６５】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの１２０ｇ及び脱イオン水１２０ｇをよく混合し、先に回収した菌体２７０ｇを均一に分散させた。これをあらかじめ乾燥させておいたイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９６ＳＢＣｌ型オルガノ社製、平均粒径０．５mm 水分含量６％）２Ｌに混合してコーティングし、ステンレス製のバットに広げた。このバットを４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２１％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１０％であった。この固定化生体触媒の活性値は４８００Ｕであった。
【００６６】
実施例１１．
実施例１と同様にしてEschelichia coliアスパルターゼ組み換え大腸菌pUasp-E2株を培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ２．０moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００６７】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの１２０ｇ及び脱イオン水６０ｇをよく混合し、先に回収した菌体２７０ｇを均一に分散させた。これをあらかじめ乾燥させておいたイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９６ＳＢＣｌ型オルガノ社製、平均粒径０．５mm 水分含量６％）２Ｌに混合してコーティングし、ステンレス製のバットに広げた。このバットを４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性がなくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２０％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１０％であった。この固定化生体触媒の活性値は５０００Ｕであった。
【００６８】
実施例１２．
実施例１０と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを８０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１７％であり、その活性は５４００Ｕであった。
【００６９】
実施例１３．
実施例１０と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１００℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は９％であり、その活性は５６００Ｕであった。
【００７０】
実施例１４．
実施例１０と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１２０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は５３００Ｕであった。
【００７１】
実施例１５．
乾燥時間を１０分にした以外は実施例４と同様にして固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は２６００Ｕであった。
【００７２】
実施例１６．
乾燥時間を７分にした以外は実施例５と同様にして１００℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は２１００Ｕであった。
【００７３】
実施例１７．
乾燥時間を５分にした以外は実施例６と同様にして１２０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は２８００Ｕであった。
【００７４】
実施例１８．
乾燥時間を５分にした以外は実施例７と同様にして１４０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は３２００Ｕであった。
【００７５】
実施例１９．
乾燥時間を３分にした以外は実施例８と同様にして１６０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は２９００Ｕであった。
【００７６】
実施例２０．
乾燥時間を２分にした以外は実施例８と同様にして１８０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は２５００Ｕであった。
【００７７】
実施例２１．（４５℃乾燥、短時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。このうちの１０mlをとり、全体をかき混ぜながらドライヤーの温風を当てて４５℃で１０分間、送風加熱乾燥を行った。５分後、全体が粘性の無いさらさらの状態となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２７％であった。乾燥１０分後の固定化生体触媒の水分含量は１６％であり、その活性は５５００Ｕであった。
【００７８】
実施例２２．（４５℃乾燥、長時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。ステンレス製のバットに広げ、４５℃の恒温器に入れて１時間に１回切り返しながら、送風無しで８時間乾燥を行った。５時間目に全体が粘性の無いさらさらの状態となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２５％であった。乾燥７時間後の固定化生体触媒の水分含量は１９％であり、その活性は１９００Ｕであった。
【００７９】
実施例２３．
未乾燥のイオン交換樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂の混合を行った。用いたイオン交換樹脂の水分含量は６０重量％であった。
【００８０】
菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂を混合したもの（固定化混合物）は、調製直後はペースト状であり若干の流動性を有していた。この固定化混合物の１／１０をステンレス製のバットに薄く広げ、４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。この処理によって１時間後に固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。この時の固定化生体触媒の水分含量は２３％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１３％であり、その活性は３４００Ｕであった。
【００８１】
参考例２．（未乾燥のイオン交換樹脂を用いた例）
未乾燥のイオン交換樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂の混合を行った。用いたイオン交換樹脂の水分含量は６０重量％であった。
【００８２】
菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂を混合したもの（固定化混合物）は、調製直後はペースト状であり若干の流動性を有していた。これをステンレス製のバットに広げ、４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を１０時間行った。１時間後は、固定化混合物の粘性が高く、乾燥が十分に進行せず、その水分含量は６１％であった。さらに乾燥を継続し乾燥７時間でさらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２８％であった。乾燥６時間後の固定化生体触媒の水分含量は１５％であった。この固定化生体触媒の活性値は９００Ｕであった。
【００８３】
参考例３．（未乾燥のイオン交換樹脂を用いた例、菌体懸濁時の水の量半分）菌体を均一に分散させるのに使用する脱イオン水の量を１２０ｇにした以外は比較例１と同様にして菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂の混合を行った。
【００８４】
菌体及び水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂とを混合したもの（固定化混合物）は、調製直後は柔らかいペースト状であった。これをステンレス製のバットに広げ、４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を６時間行った。１時間後は、固定化混合物の粘性が高く、乾燥が十分に進行せず、その水分含量は５１％であった。さらに乾燥を継続し乾燥３時間でさらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２３％であった。乾燥６時間後の固定化生体触媒の水分含量は１３％であった。この固定化生体触媒の活性値は５００Ｕであった。
【００８５】
比較例１．
乾燥時間を３０分にした以外は実施例４と同様にして８０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は９００Ｕであった。
【００８６】
比較例２．
乾燥時間を２０分にした以外は実施例５と同様にして１００℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は６５０Ｕであった。
【００８７】
比較例３．
乾燥時間を１５分にした以外は実施例６と同様にして１２０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は３００Ｕであった。
【００８８】
比較例４．
乾燥時間を１５分にした以外は実施例７と同様にして１４０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は８００Ｕであった。
【００８９】
比較例５．
乾燥時間を１０分にした以外は実施例８と同様にして１６０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は５００Ｕであった。
【００９０】
比較例６．
乾燥時間を６分にした以外は実施例８と同様にして１８０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は検出されなかった。
【００９１】
比較例７．（４５℃乾燥、長時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。ステンレス製のバットに広げ、４５℃の恒温器に入れて２時間に１回切り返しながら、送風無しで１０時間乾燥を行った。６時間目に全体が粘性の無いさらさらの状態となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２５％であった。乾燥１０時間後の固定化生体触媒の水分含量は１９％であり、その活性は２００Ｕであった。
【００９２】
比較例８．（４５℃乾燥、短時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。このうちの１０mlをとり、全体をかき混ぜながらドライヤーの温風を当てて４５℃で５分間、送風加熱乾燥を行った。５分後、全体が粘性の無いさらさらの状態となった。この固定化生体触媒の水分含量は２７％であり、その活性は５５００Ｕであった。この乾燥が不充分な固定化生体触媒を、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。
【００９３】
固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の基質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ及びアンモニアでpH８．３に調製）を断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時３００mlの速度（ＬＨＳＶ＝３０）で流通させ連続反応を行った。
【００９４】
反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．７７％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。反応開始後１ヶ月目の転化率は８７％、４ヶ月目には６５％まで低下した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間との許容される組合せの範囲を示す。
【図２】図２は、本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間との好ましい組合せの範囲を示す。
【図３】図３は、本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間との最も好ましい範囲を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel method for producing an immobilized biocatalyst and a method for using the immobilized biocatalyst.
[0002]
[Prior art]
A water-soluble polymer having the property of causing cross-linking between polymers or between the polymer and the cell surface and cells having catalytic activity are mixed, and the resulting mixture is coated on a water-insoluble solid support to immobilize the living body. As a method for producing a catalyst, a method using a polyazetidine-based polymer (Japanese Patent Laid-Open No. 5-344898), a method using a polyallylamine-based polymer (Japanese Patent Laid-Open No. 10-286087), and the like are disclosed. In these methods, a method is disclosed in which cells are suspended in a water-soluble polymer, mixed with an ion exchange resin, and dried under reduced pressure using a rotary evaporator.
[0003]
When a large amount of immobilized biocatalyst is prepared, the activity of the obtained immobilized biocatalyst varies depending on the drying scale and drying time, and when used as a fixed bed catalyst, the activity can be achieved in a short time. There were problems such as lowering.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for mass-producing an immobilized biocatalyst that solves the above-mentioned drawbacks.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have preferably determined that the water content of the water-insoluble immobilization carrier is 30% in the drying step when coating the water-insoluble immobilization carrier with a water-soluble polymer. After the following, the moisture content of the immobilized biocatalyst is dried at a predetermined temperature and drying time, so that the immobilized biocatalyst can be prepared with good reproducibility and its activity can be kept stable over a long period of time. As a result, the present invention has been completed.
[0006]
Therefore, in the present invention, a water-soluble polymer having a property of causing cross-linking between polymers or a polymer and a cell surface is mixed with a cell having catalytic activity, and the resulting mixture is coated on a water-insoluble solid support. In the method for producing an immobilized biocatalyst by drying, the method for producing an immobilized biocatalyst is characterized in that the relationship between the drying temperature and the drying time is within the enclosure shown in FIG. To do.
The present invention also provides a method for producing L-aspartic acid, wherein fumaric acid and ammonia or ammonium fumarate are contacted with an immobilized biocatalyst using cells containing aspartase as the cells.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The carrier used in the immobilized biocatalyst of the present invention may be either a granular material or a sheet material. For example, the granular material is an ion exchange resin, for example, an anion exchange resin (manufactured by Organo Corp.) Amberlite. IRA-904, IRA-94S, Amberlist A-26, A-27, Amberlite 200C, 201B, IRC-50, IRC-76, etc., which are cation exchange resins (manufactured by Organo Corp.) are used; inorganic Carriers such as molecular sieves, alumina, silica, silica gel and the like are used. The particle size of the granular material is preferably 0.1 mm to 10 mm, more preferably 0.3 mm to 3 mm. As the sheet-like material, an ion exchange membrane, an alumina or silica sheet, or the like is used. The thickness of the sheet is preferably 0.01 mm to 10 mm, more preferably 0.1 mm to 5 mm.
[0008]
The resin used for immobilizing cells in the present invention has the following general formula:
[Formula 4]

Wherein Y is a direct bond or the following formula:
[0009]
[Chemical formula 5]

R is a divalent group represented by R₁ And R₂ Are independently of one another hydrogen or an organic residue,
[0010]
[Chemical 6]

Represents an anion and n is a number from 100 to 5000)
The polymer represented by is used.
[0011]
Where R₁ And R₂ Examples of the organic residue include an alkyl group having 10 or less carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, and a ter-butyl group. The group is particularly preferred. Further, an organic residue substituted with halogen or hydroxyl can be used, and 4-chloro-2-dimethylpentyl group, 3-ethyl-2,5-dichloroheptyl group, 2-hydroxy-3,5-dimethylnonyl group can be used. In particular, a 3-chloro-2-hydroxypropyl group is preferable.
[0012]
X^- As halogen ions, eg F^- , Cl^- , Br^- , I^- In particular, Cl^- Is preferred. In addition, other monovalent anions such as NO_Three ^- Etc. can also be used. n is preferably 100 to 5,000. Specific polymers include those represented by the following structural formula.
[0013]
[Chemical 7]

[0014]
The polymer of formula (A) is, for example, trade name PAS410, the polymer of formula (B) is, for example, trade name PAS92, the polymer of formula (C) is, for example, trade name PAS-M-1, and the polymer of formula (D) Can be obtained from Nitto Boseki Co., Ltd. under the trade name PAS-880, for example, and the polymer of formula (E) can be obtained under the trade name PAS-H-5L. Also, for example, the polymer of formula (A) can be prepared by 1: 1 copolymerization of diallylamine salt (eg hydrochloride) and maleic acid, and the polymer of formula (B) is dialylamine salt (eg hydrochloride) and sulfite. By copolymerization with gas or radical polymerization, the polymer of formula (C) can be produced by copolymerization or radical polymerization of diallylmonoalkylamine.
[0015]
Furthermore, as a water-soluble crosslinkable polymer used for immobilization of the present invention, the following formula:
[Chemical 8]

It is also possible to use a polycap (such as polycap 172 manufactured by Hercules).
[0016]
As the cell used in the present invention, any cell containing a desired enzyme can be used. For example, microbial cells such as bacteria, yeast, algae, and filamentous fungi, plant cells, and the like can be used. Although it does not specifically limit as an enzyme, For example, aspartase which converts ammonium fumarate into L-aspartic acid, maleate isomerase which converts maleic acid into fumaric acid, fumarase which converts fumaric acid into L-malic acid, maleic acid Examples include various enzymes such as malease that converts A to D-malic acid and hydratase that converts cis-epoxysuccinic acid to L-tartaric acid. As more specific examples of cells, bacterial cells containing aspartase, bacterial cells containing maleate isomerase, bacterial cells containing both aspartase and maleate isomerase, and the like are used.
[0017]
The cell used in the present invention may further be a host cell into which a gene encoding an enzyme as described above has been introduced by genetic engineering.
More specifically, for example, the following microbial cells can be used.
[0018]
[Table 1]

[0019]
When the polymer represented by the general formula (Chemical Formula 4) is added at a low concentration to the culture medium in which the cells of these microorganisms are cultured, the cultured cells can be condensed and settled, and it is necessary to centrifuge a large amount of the culture liquid. The operation is simple because there is no need. Specifically, in the culture solution in which the microorganism to be immobilized is cultured, the polymer represented by the above general formula (Formula 4) is 10 to 10,000 ppm, preferably 100 to 1000 ppm, as a solid component concentration. When it is added to and allowed to stand, microbial cells aggregate and settle. At this time, if the culture solution is cooled in advance, it is effective to prevent a decrease in the target enzyme activity.
[0020]
In this way, after the microbial cells are settled, the liquid volume can be reduced to a fraction by extracting the supernatant. For example, when 500 ppm of PAS-880 is added to 1 L of a culture solution and left to stand for 30 minutes, about 800 ml is separated as a supernatant. When the remaining bacterial cell agglutinate is applied to a low-speed centrifuge at 3000 rpm, the bacterial cells can be recovered as a cake. Since the agglomerated cells can be sufficiently centrifuged even with a low-speed centrifuge, the cells can be recovered with a simple device.
[0021]
The collected bacterial cells can be used as an immobilization material by mixing with a polymer solution adjusted to pH as it is or after adding water. In addition, after collecting the bacterial cells, the frozen cells can be used after being thawed or after the frozen block-shaped bacterial cells are roughly crushed and then mixed with the polymer using a mixer. This mixture of frozen cells and polymer is soft sherbet-like and very cold, so that it can be fixed at room temperature without any special cooling operation, and is preferable in terms of maintaining enzyme activity. .
[0022]
In fixing cells, one type of cell can be fixed, or a plurality of types of cells can be fixed. For example, bacterial cells containing maleate isomerase and bacterial cells containing aspartase can be fixed in combination.
In the cell immobilization method, first, a weakly acidic liquid polymer is mixed with water to make the pH neutral to basic, and then the cells are mixed. What is necessary is just to dry what apply | coated the mixture of this cell and polymer to the solid support | carrier. As a method of splattering, the cell and polymer mixture is uniformly mixed with the carrier by stirring with a stick, spatula, etc. and directly stirring by hand in a suitably sized container.
[0023]
The ratio of cells to polymer to be immobilized is in the range of 0.2 to 10 kg, preferably 0.5 to 5 kg of polymer solids per 1 kg of cells (wet). The amount of water added when preparing a mixture of polymer and cells is preferably as small as possible in order to dry quickly, and may be any amount that can suspend cells. Usually, the amount is 0.1 to 2 kg, preferably 0.3 to 1 kg per 1 kg (wet) of cells.
[0024]
It is preferable to dry the immobilization carrier in advance because the drying time is shortened. Drying of the carrier can be done by conventional drying such as rotary evaporator, fluid bed dryer, hot air dryer, shelf dryer, spray dryer, tunnel dryer, nauta mixer, fluidized bed dryer, vacuum dryer, air dryer. It is sufficient that the temperature range is such that the carrier does not deteriorate, and it is preferably 30% by weight or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less based on the weight of the carrier.
[0025]
As described above, when the carrier is dried in advance, when the mixture of the water-soluble polymer and the bacterial cells is mixed with the carrier, the water in the mixture is sucked into the inside of the carrier, so that the water-soluble polymer on the surface of the carrier. The bacterial cell mixture sticks and can perform the primary coating. Since the state of the immobilization mixture at this time has a relatively low viscosity, the subsequent drying can be performed in a short time, and the activity of the resulting immobilized biocatalyst can be increased.
[0026]
As a method of applying the mixture of cells and polymer to the immobilization carrier, the mixture of cells and polymer is uniformly mixed by stirring with a stick, a spatula, etc. in a container of an appropriate size and directly stirring by hand. . This mixing operation can also be performed using an apparatus used for normal mixing. As a mixing apparatus, any mixer that can mix a sticky material, such as a mixer such as a ribbon mixer or a kneader, particularly a planetary mixer, can be used. Examples of the apparatus include a laboratory table mixer KM-600 manufactured by Aikosha Seisakusho Co., Ltd. and a hook type or beater type stirrer attached thereto.
[0027]
Drying at the time of immobilization is performed until the water content in the immobilized biocatalyst is 20% by weight or less, more preferably 10% or less, for example, a rotary evaporator, fluidized bed dryer, hot air dryer, shelf dryer, spray It is carried out using a dryer, tunnel dryer, nauta mixer, fluidized bed dryer, vacuum dryer, flash dryer and the like. When there is more moisture than this range, when the immobilized biocatalyst is used in a fixed bed, the activity is reduced in a short period of time.
[0028]
The polymer coating layer is in a gel state, but if the drying is insufficient, the gel layer becomes thick and the cross-link between the polymer and the polymer and the cell surface becomes loose, so use as a fixed bed catalyst after immobilization. In such a case, intracellular enzymes leak out from the gel-like coating layer composed of cells and a polymer, and the activity of the immobilized biocatalyst decreases in a short period of time. In order to crosslink the gel-like coating layer until the enzyme does not leak out, the gel-like coating layer is dried until the previous range is reached.
[0029]
FIG. 3 shows the relationship among the drying temperature, drying time, and immobilized enzyme activity in the method of the present invention. In the figure, black circles are combinations of drying temperature and drying time within the scope of the present invention, and x stages are combinations of drying temperature and drying time outside the scope of the present invention. In this figure, it was demonstrated that useful immobilized enzymes can be obtained within the range of combinations of drying temperature and drying time within the range indicated by the box.
[0030]
However, since the immobilized enzyme exhibits a practical enzyme activity of 2100 U to 3200 U at the high temperature and long time side of the enclosure shown in FIG. 1, it is further higher than the high temperature and long time side broken line in FIG. It is clear that a useful immobilized enzyme can also be obtained. In addition, since the enzyme is deactivated less on the low temperature and short time side, it is clear that a useful enzyme can be obtained at a lower temperature and shorter time than the low temperature and short time side broken line in FIG. is there. Therefore, the range of the drying temperature and the drying time in the present invention is shown in FIG. 1 or FIG.
The thickness of the polymer layer containing cells after fixing in this manner is 0.001 to 0.3 mm, preferably 0.005 to 0.2 mm.
[0031]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Reference example 1.Preparation of recombinant host cells introduced with aspartase gene
(1) Preparation of Escherichia coli aspartase recombinant
Escherichia coli IFO3301 strain purchased from the Fermentation Research Institute was inoculated into the LB medium shown in Table 1 and cultured at 37 ° C. for 8 hours. Bacteria were collected from 1 ml of this culture and suspended in 1 ml of distilled water. 1 μl of this cell suspension was used as a template DNA for amplifying the aspartase gene.
[0032]
[Table 2]

[0033]
(2) Amplification of aspartase gene by PCR and preparation of insert fragment Aspartase gene of known Escherichia coli K-12 strain (the base sequence of the gene and the amino acid sequence encoded by the base sequence are The following two primers are prepared to amplify the aspartase gene of Eschelichia coli based on (Kaihei 11-313694) (Biochem. J.237 (2), 547-557) did.
Primer F1: GGATAATCGTCGGTCGAAAA
Primer R1: CGTCATCTGACGTGCCTTT
[0034]
A reaction solution having the following composition was prepared using KOD DNA polymerase (TOYOBO), and the aspartase gene was amplified by PCR.
[Table 3]

[0035]
PCR conditions: 98 ° C. for 5 minutes; 98 ° C. for 30 seconds; 53 ° C. for 30 seconds; 68 ° C. for 1 minute; After completion of the PCR reaction, the amplified DNA fragment was electrophoresed on 1% agarose gel and stained with ethidium bromide. As a result, the expected fragment of about 1600 bp was amplified. This fragment was cut out from the agarose gel, and the DNA was recovered with Prep-A-Gene (Bio Rad).
[0036]
(3) Binding of insert fragment to vector In the presence of restriction enzyme Srf and DNA ligase, the previously recovered DNA fragment was bound to pCR-ScriptAmpSK (+) cloning vector. One of the transformants containing the inserted DNA fragment was named PUaspE1 strain. This PUaspE1 strain was inoculated into 3 ml of LB medium supplemented with 100 ppm of ampicillin, cultured overnight at 37 ° C. with shaking, and the cells were collected from 1.5 ml of the culture. From this microbial cell, the plasmid was collect | recovered by the alkaline SDS method. This plasmid was named pUaspE1.
[0037]
Analysis of the sequence of the inserted fragment of this plasmid revealed that the aspartase gene was inserted in the opposite direction to the promoter of the vector. In order to reconnect to the promoter in the forward direction, it was decided to cut out the inserted fragment from plasmid pUaspE1 with restriction enzymes SacI and BamHI and introduce it into pUC19. The plasmid pUaspE1 was cleaved with the restriction enzyme BamHI, the DNA was recovered by ethanol precipitation, and then cleaved with the restriction enzyme SacI. The cleaved DNA fragments were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel, cut out from the gel, and DNA was recovered with prep-A-Gene (bio rad).
[0038]
(4) Preparation of vector 1 μg of plasmid pUC19 (manufactured by Nippon Gene) was cleaved with restriction enzyme BamHI, DNA was recovered by ethanol precipitation, and then cleaved with restriction enzyme SacI. The cleaved DNA fragments were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel, cut out from the gel, and recovered with prep-A-Gene (bio rad) to obtain a vector.
[0039]
(5) Binding of inserted fragment to vector The vector cleaved with a restriction enzyme and the inserted fragment were ligated at 16 ° C. for 30 minutes using ligation high (TOYOBO).
[0040]
(6) 2 μl of the reaction solution in which the E. coli transformation vector and the inserted fragment were combined was placed in 200 μl of E. coli competent cells (XL 2-Blue MRF 'Ultracompitent cells STRATAGENE) to transform E. coli. The transformed E. coli was spread on an LB agar medium containing 100 ppm of ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. As a control, it was transformed with the plasmid pUC18 into which the inserted fragment had not been inserted, and was similarly spread on an LB agar medium containing 100 ppm of ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
[0041]
20 colonies that emerged were picked up, inoculated into LB medium containing 100 ppm of ampicillin, and cultured at 37 ° C. with shaking. After 8 hours, IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) was added to a concentration of 1 mM, and further cultured with shaking at 30 ° C. overnight, and the cells were collected from 1 ml of the culture solution. Similarly, one control transformant strain having no insert fragment was cultured, and the cells were recovered. To the recovered cells, 1 ml of an ammonium fumarate substrate solution shown in Table 2 was added to suspend the cells and reacted at 30 ° C. for 1 hour.
[0042]
[Table 4]

[0043]
When the reaction solution was analyzed, the E. coli transformant containing the inserted fragment had a conversion rate to L-aspartic acid of 99.5%. On the other hand, the control transformant containing no insert fragment had a conversion rate of 5%. One of the transformants containing this insert was named PUaspE2.
[0044]
PUaspE2 was inoculated into 3 ml of LB medium supplemented with 100 ppm of ampicillin and cultured at 37 ° C. for 8 hours. The plasmid was recovered from the culture broth 1.5 ml by the alkaline SDS method. This plasmid was named pUaspE2. The plasmid pUaspE2 was cleaved with restriction enzyme SmaI and then with restriction enzyme HindIII, and the size of the DNA fragment was calculated by 1% agarose gel electrophoresis. As a result, two fragments of about 2960 bp and 1600 bp were present.
[0045]
The PUaspE2 strain was inoculated into 3 ml of LB medium supplemented with 100 ppm of ampicillin, cultured with shaking at 37 ° C., and 8 hours later, IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) was added to a concentration of 1 mM, and 30 overnight. Cultured with shaking at ℃. The bacterial cells were recovered from 1 ml of this culture and measured for a bacterial cell concentration OD660 nm of 8.0. The cells were suspended in 10 ml of 20% ammonium fumarate substrate solution and reacted at 30 ° C. for 1 hour, and then the reaction solution was analyzed by HPLC. Aspartase activity was calculated from the produced L-aspartic acid and the bacterial cell concentration, and it was 2,000,000 μM L-aspartic acid produced / hr / OD660 nm bacterial cell concentration.
[0046]
Similarly, one control transformant strain having no insert fragment was cultured, and the cells were collected and the cell density OD660nm was measured to be 8.5. The cells were suspended in 10 ml of 20% ammonium fumarate substrate solution and reacted at 30 ° C. for 1 hour, and then the reaction solution was analyzed by HPLC. Aspartase activity was calculated from the produced L-aspartic acid and the bacterial cell concentration, and it was 10,000 μM-L-aspartic acid produced / hr / OD660 nm bacterial cell concentration. The PUaspE2 strain thus obtained had aspartase activity 200 times that of the strain without the inserted aspartase gene.
[0047]
(7) Recombinant culture Escherichia coli aspartase recombinant Escherichia coli PUaspE2 strain was inoculated into 10 test tubes in which 3 ml of medium containing 100 ppm of ampicillin was added to the medium shown in Table 1 for 8 hours at 37 ° C. After culturing, 10 Sakaguchi flasks each containing 100 ml of a medium with 1 mM IPTG added to the same composition were inoculated one by one and cultured overnight at 30 ° C. with shaking. The cells were collected from this culture solution by centrifugation. When the aspartase activity of this microbial cell was measured, it was 1.85 moles L-aspartic acid production / hr / g microbial cell.
[0048]
Example 1.
Escherichia coli aspartase recombinant Escherichia coli pUasp-E2 strain was inoculated into 10 test tubes containing 3 ml of medium containing 100 ppm of ampicillin in the medium shown in Table 1 and cultured at 37 ° C. for 8 hours. One each was inoculated into 10 Sakaguchi flasks containing 100 ml of medium supplemented with 1 mM IPTG and 100 ppm ampicillin, and cultured overnight at 30 ° C. with shaking. The cells were collected from this culture solution by centrifugation. When the aspartase activity of this microbial cell was measured, it was 1.9 moles L-aspartic acid production / hr / g microbial cell.
[0049]
120 g of PAS-880 (manufactured by Nitto Boseki Co., Ltd.) adjusted to pH 7.0 with alkali and 240 g of deionized water were mixed well, and 270 g of the cells recovered earlier were uniformly dispersed. This was mixed with 2 L of previously dried ion exchange resin (Amberlite IRA-96SBCl type Organo, average particle size 0.5 mm, water content 6%), coated, and spread on a stainless steel vat.
[0050]
The vat was placed in a 45 ° C. hot air dryer, and the immobilized biocatalyst was dried for 4 hours while stirring once per hour. After 1 hour, the immobilization mixture became less viscous and became more granular. At this time, the moisture content of the immobilized biocatalyst was 28%. The water content of the immobilized biocatalyst after 4 hours of drying was 15%. The activity value of this immobilized biocatalyst was 4500 U. In the present invention, the activity value of the immobilized biocatalyst is defined as “1U = 1 μmol L-aspartic acid production / 1 min / ml immobilized biocatalyst”.
[0051]
This immobilized biocatalyst was immersed in a 20% ammonium fumarate solution (pH 8.3) at 4 ° C. overnight, and 10 ml thereof was packed in a 1 cm diameter column. The packed bed length of the immobilized aspartase was about 12.7 cm. The reactor was insulated by keeping the outside of the column warm with a foamed polystyrene heat insulating material. To this column, a 20 ° C. substrate solution (200 g fumaric acid, 200 g 25% aqueous ammonia, 0.25 g MgSO in 1 L) kept in a constant temperature water bath at 20 ° C._Four・ 7H₂PH was adjusted to 8.3 with O and ammonia) through a Teflon tube wrapped with a heat insulating material at a rate of 300 ml per hour (LHSV = 30) to carry out a continuous reaction.
[0052]
The reaction solution was analyzed 3 hours after the start of the reaction. As a reaction product, consumed fumaric acid and approximately equimolar L-aspartic acid were produced, and the reaction conversion rate was 99.77%. It was. At this time, the temperature of the effluent was 33 ° C. Further, the conversion rate on the seventh day after the start of the reaction and one month later was maintained at 99.7%.
[0053]
Example 2.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1, and the immobilized biocatalyst was dried for 4 hours while stirring once per hour using a 50 ° C. hot air dryer. After 1 hour, the immobilization mixture became less viscous and became more granular. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 17%. The water content of the immobilized biocatalyst after 4 hours of drying was 9%.
[0054]
The activity of this immobilized aspartase was 5000 U. The prepared immobilized aspartase was immersed in a 20% ammonium fumarate solution (pH 8.3) at 4 ° C. overnight, and 10 ml thereof was packed into a 1 cm diameter column. The packed bed length of the immobilized aspartase was about 12.7 cm. Using this column, a continuous reaction was carried out in the same manner as in Example 1. The temperature of the substrate solution was 20 ° C., and the flow rate was 300 ml per hour (LHSV = 30.0). The reaction solution was analyzed 3 hours after the start of the reaction. As a reaction product, consumed fumaric acid and almost equimolar L-aspartic acid were produced, and the reaction conversion rate was 99.6%. It was. At this time, the temperature of the effluent was 33 ° C. Further, the conversion rate after 7 days and 1 month after the start of the reaction was maintained at 99.5%.
[0055]
Example 3.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1, and the immobilized biocatalyst was dried for 4 hours while stirring once per hour using a hot air dryer at 55 ° C. After 1 hour, the immobilization mixture became less viscous and became more granular. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 10%. The water content of the immobilized biocatalyst after 4 hours of drying was 6%.
[0056]
The activity of this immobilized aspartase was 4700 U. The prepared immobilized aspartase was immersed in a 20% ammonium fumarate solution (pH 8.3) at 4 ° C. overnight, and 10 ml thereof was packed into a 1 cm diameter column. The packed bed length of the immobilized aspartase was about 12.7 cm. Using this column, a continuous reaction was carried out in the same manner as in Example 1.
[0057]
The temperature of the substrate solution was 20 ° C., and the flow rate was 300 ml per hour (LHSV = 30.0). The reaction solution was analyzed 3 hours after the start of the reaction. As a reaction product, consumed fumaric acid and almost equimolar L-aspartic acid were produced, and the reaction conversion rate was 99.6%. It was. At this time, the temperature of the effluent was 33 ° C. Further, the conversion rate after 7 days and 1 month after the start of the reaction was maintained at 99.5%.
[0058]
Example 4.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of this immobilized mixture was treated with warm air at 80 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 17%, and its activity was 5200 U.
[0059]
Example 5.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of this immobilized mixture was treated with hot air at 100 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 10%, and its activity was 5500 U.
[0060]
Example 6.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of this immobilized mixture was treated with warm air at 120 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 8%, and its activity was 5300 U.
[0061]
Example 7.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of the immobilized mixture was treated with warm air at 140 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 6%, and its activity was 4400 U.
[0062]
Example 8.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of the immobilized mixture was treated with warm air at 160 ° C. for 2 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 6%, and its activity was 3200 U.
[0063]
Example 9.
The cells were cultured in the same manner as in Example 1 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of the immobilization mixture was treated with warm air at 180 ° C. for 1 minute and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 5%, and its activity was 2600 U.
[0064]
Example 10.
In the same manner as in Example 1, Escherichia coli aspartase recombinant E. coli pUasp-E2 strain was cultured. The cells were collected from this culture solution by centrifugation. When the aspartase activity of this microbial cell was measured, it was 2.0 moles L-aspartic acid production / hr / g microbial cell.
[0065]
120 g of PAS-880 (manufactured by Nittobo Co., Ltd.) adjusted to pH 7.0 with alkali and 120 g of deionized water were mixed well, and 270 g of the cells recovered earlier were uniformly dispersed. This was mixed with 2 L of previously dried ion exchange resin (Amberlite IRA-96SBCl type Organo, average particle size 0.5 mm, water content 6%), coated, and spread on a stainless steel vat. The vat was placed in a 45 ° C. hot air dryer, and the immobilized biocatalyst was dried for 4 hours while stirring once per hour. After 1 hour, the immobilization mixture became less viscous and became more granular. At this time, the moisture content of the immobilized biocatalyst was 21%. The water content of the immobilized biocatalyst after 4 hours of drying was 10%. The activity value of this immobilized biocatalyst was 4800U.
[0066]
Example 11.
In the same manner as in Example 1, Escherichia coli aspartase recombinant E. coli pUasp-E2 strain was cultured. The cells were collected from this culture solution by centrifugation. When the aspartase activity of this microbial cell was measured, it was 2.0 moles L-aspartic acid production / hr / g microbial cell.
[0067]
120 g of PAS-880 (manufactured by Nittobo Co., Ltd.) adjusted to pH 7.0 with alkali and 60 g of deionized water were mixed well, and 270 g of the cells recovered earlier were uniformly dispersed. This was mixed with 2 L of previously dried ion exchange resin (Amberlite IRA-96SBCl type Organo, average particle size 0.5 mm, water content 6%), coated, and spread on a stainless steel vat. The vat was placed in a 45 ° C. hot air dryer, and the immobilized biocatalyst was dried for 4 hours while stirring once per hour. After 1 hour, the immobilization mixture had lost its viscosity and became smooth and granular. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 20%. The water content of the immobilized biocatalyst after 4 hours of drying was 10%. The activity value of this immobilized biocatalyst was 5000 U.
[0068]
Example 12.
The cells were cultured in the same manner as in Example 10 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of this immobilized mixture was treated with warm air at 80 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 17%, and its activity was 5400 U.
[0069]
Example 13.
The cells were cultured in the same manner as in Example 10 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of this immobilized mixture was treated with hot air at 100 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 9%, and its activity was 5600 U.
[0070]
Example 14.
The cells were cultured in the same manner as in Example 10 to prepare an immobilization mixture. About 10 ml of this immobilized mixture was treated with warm air at 120 ° C. for 3 minutes and dried. This treatment reduced the viscosity of the immobilized mixture and resulted in a smoother grain. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 8%, and its activity was 5300 U.
[0071]
Example 15.
An immobilized biocatalyst was prepared in the same manner as in Example 4 except that the drying time was 10 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 8% and an activity of 2600 U.
[0072]
Example 16.
An immobilized biocatalyst was prepared with 100 ° C. hot air in the same manner as in Example 5 except that the drying time was changed to 7 minutes. The water content of this immobilized biocatalyst was 8% and its activity was 2100U.
[0073]
Example 17.
An immobilized biocatalyst was prepared with warm air at 120 ° C. in the same manner as in Example 6 except that the drying time was 5 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 6% and an activity of 2800 U.
[0074]
Example 18.
An immobilized biocatalyst was prepared with 140 ° C. hot air in the same manner as in Example 7 except that the drying time was 5 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 6% and an activity of 3200 U.
[0075]
Example 19.
An immobilized biocatalyst was prepared with 160 ° C. warm air in the same manner as in Example 8 except that the drying time was 3 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 6% and an activity of 2900 U.
[0076]
Example 20.
An immobilized biocatalyst was prepared with hot air at 180 ° C. in the same manner as in Example 8 except that the drying time was 2 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 6% and an activity of 2500 U.
[0077]
Example 21.(45 ° C drying, short time)
A mixture of cells cultured in the same manner as in Example 10, a water-soluble polymer, and an ion exchange resin was prepared. 10 ml of this was taken out, and the hot air of the dryer was applied while stirring the whole, and blast heating drying was performed at 45 ° C. for 10 minutes. After 5 minutes, the whole became a clean state with no viscosity. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 27%. The water content of the immobilized biocatalyst after 10 minutes of drying was 16%, and its activity was 5500 U.
[0078]
Example 22.(45 ° C drying, long time)
A mixture of cells cultured in the same manner as in Example 10, a water-soluble polymer, and an ion exchange resin was prepared. They were spread on a stainless steel vat, placed in a 45 ° C. thermostat and turned over once per hour, and dried for 8 hours without blowing. At 5 hours, the whole became a smooth state with no viscosity. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 25%. The water content of the immobilized biocatalyst after 7 hours after drying was 19%, and its activity was 1900 U.
[0079]
Example 23.
Except for using an undried ion exchange resin, the mixture of the microbial cells and water-soluble polymer and the ion exchange resin were mixed in the same manner as in Example 1. The water content of the ion exchange resin used was 60% by weight.
[0080]
A mixture (an immobilization mixture) of a mixture of microbial cells and a water-soluble polymer and an ion exchange resin was pasty and had a slight fluidity immediately after preparation. 1/10 of this immobilized mixture was spread thinly on a stainless steel vat, placed in a 45 ° C. hot air dryer, and the immobilized biocatalyst was dried for 4 hours while stirring once an hour. This treatment reduced the viscosity of the immobilization mixture after 1 hour and resulted in a smooth granulate. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 23%. The water content of the immobilized biocatalyst after 4 hours of drying was 13% and its activity was 3400 U.
[0081]
Reference example 2.(Example using undried ion exchange resin)
Except for using an undried ion exchange resin, the mixture of the microbial cells and water-soluble polymer and the ion exchange resin were mixed in the same manner as in Example 1. The water content of the ion exchange resin used was 60% by weight.
[0082]
A mixture (an immobilization mixture) of a mixture of microbial cells and a water-soluble polymer and an ion exchange resin was pasty and had a slight fluidity immediately after preparation. This was spread on a stainless steel vat, placed in a 45 ° C. hot air dryer, and the immobilized biocatalyst was dried for 10 hours while stirring once an hour. After 1 hour, the viscosity of the immobilization mixture was high, drying did not proceed sufficiently, and its water content was 61%. Furthermore, drying was continued and it became a smooth granule in 7 hours of drying. At this time, the moisture content of the immobilized biocatalyst was 28%. The water content of the immobilized biocatalyst after 6 hours of drying was 15%. The activity value of this immobilized biocatalyst was 900 U.
[0083]
Reference example 3.(Example using undried ion exchange resin, half the amount of water when the cells are suspended)The mixture of the microbial cell and water-soluble polymer and the ion exchange resin were mixed in the same manner as in Comparative Example 1 except that the amount of deionized water used for uniformly dispersing the microbial cell was 120 g.
[0084]
A mixture (an immobilization mixture) of a mixture of cells and a water-soluble polymer and an ion exchange resin was a soft paste immediately after preparation. This was spread on a stainless steel vat, placed in a 45 ° C. hot air dryer, and the immobilized biocatalyst was dried for 6 hours while stirring once an hour. After 1 hour, the immobilization mixture had a high viscosity, drying did not proceed sufficiently, and its water content was 51%. Furthermore, drying was continued and it became a smooth granule in 3 hours of drying. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 23%. The water content of the immobilized biocatalyst after 6 hours of drying was 13%. The activity value of this immobilized biocatalyst was 500 U.
[0085]
Comparative Example 1.
An immobilized biocatalyst was prepared with hot air at 80 ° C. in the same manner as in Example 4 except that the drying time was 30 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 8% and an activity of 900 U.
[0086]
Comparative Example 2.
An immobilized biocatalyst was prepared with hot air at 100 ° C. in the same manner as in Example 5 except that the drying time was 20 minutes. The water content of this immobilized biocatalyst was 8%, and its activity was 650U.
[0087]
Comparative Example 3.
An immobilized biocatalyst was prepared with warm air at 120 ° C. in the same manner as in Example 6 except that the drying time was 15 minutes. The water content of this immobilized biocatalyst was 6%, and its activity was 300U.
[0088]
Comparative Example 4.
An immobilized biocatalyst was prepared with 140 ° C. hot air in the same manner as in Example 7 except that the drying time was 15 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 6% and an activity of 800 U.
[0089]
Comparative Example 5.
An immobilized biocatalyst was prepared with 160 ° C. warm air in the same manner as in Example 8 except that the drying time was 10 minutes. This immobilized biocatalyst had a water content of 6% and an activity of 500 U.
[0090]
Comparative Example 6.
An immobilized biocatalyst was prepared with hot air at 180 ° C. in the same manner as in Example 8 except that the drying time was 6 minutes. The water content of this immobilized biocatalyst was 6%, and its activity was not detected.
[0091]
Comparative Example 7.(45 ° C drying, long time)
A mixture of cells cultured in the same manner as in Example 10, a water-soluble polymer, and an ion exchange resin was prepared. The sample was spread on a stainless steel vat, placed in a 45 ° C. thermostat and turned over once every 2 hours, and then dried for 10 hours without blowing. At 6 hours, the whole became free-flowing with no viscosity. At this time, the water content of the immobilized biocatalyst was 25%. The water content of the immobilized biocatalyst after 10 hours of drying was 19% and its activity was 200 U.
[0092]
Comparative Example 8.(45 ° C drying, short time)
A mixture of cells cultured in the same manner as in Example 10, a water-soluble polymer, and an ion exchange resin was prepared. 10 ml of this was taken, and the whole was stirred and heated with air from a dryer and blown and dried at 45 ° C. for 5 minutes. After 5 minutes, the whole became a clean state with no viscosity. This immobilized biocatalyst had a water content of 27% and an activity of 5500 U. The immobilized biocatalyst that was insufficiently dried was immersed in a 20% ammonium fumarate solution (pH 8.3) at 4 ° C. overnight, and 10 ml thereof was packed into a 1 cm diameter column.
[0093]
The packed bed length of the immobilized aspartase was about 12.7 cm. The reactor was insulated by keeping the outside of the column warm with a foamed polystyrene heat insulating material. To this column, a 20 ° C. substrate solution (200 g fumaric acid, 200 g 25% aqueous ammonia, 0.25 g MgSO in 1 L) kept in a constant temperature water bath at 20 ° C._Four ・ 7H₂ PH was adjusted to 8.3 with O and ammonia) through a Teflon tube wrapped with a heat insulating material at a rate of 300 ml per hour (LHSV = 30) to carry out a continuous reaction.
[0094]
The reaction solution was analyzed 3 hours after the start of the reaction. As a reaction product, consumed fumaric acid and approximately equimolar L-aspartic acid were produced, and the reaction conversion rate was 99.77%. It was. At this time, the temperature of the effluent was 33 ° C. The conversion rate in the first month after the start of the reaction decreased to 87% and in the fourth month to 65%.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the range of acceptable combinations of drying temperature and drying time in the method of the present invention.
FIG. 2 shows the range of preferred combinations of drying temperature and drying time in the method of the present invention.
FIG. 3 shows the most preferred range of drying temperature and drying time in the method of the present invention.

Claims (6)

  A water-soluble polymer that has the property of causing cross-linking between polymers or between the polymer and the cell surface is mixed with catalytically active cells, and the resulting mixture is coated and dried on a water-insoluble solid support. A method for producing a biocatalyst, wherein the relationship between the drying temperature and the drying time in the drying is within the range of the enclosure shown in FIG.   The method of claim 1, wherein the relationship between temperature and drying time is in the enclosure of FIG.   The method according to claim 2, wherein the relationship between the temperature and the drying time is within the enclosure of FIG. 3.   The method according to claim 1, wherein the water content of the water-insoluble solid carrier before coating is 30% or less. The polymer has the following general formula:

Wherein Y is a direct bond or the following formula:

R ₁ and R ₂ are each independently a hydrogen atom or an organic residue,

Represents an anion and n is a number from 100 to 5000)
The method according to claim 1, represented by:   The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell is a fungal cell containing aspartase.

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