JP3750956B2 - Dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチンキナーゼのＭＢアイソザイムの定量用の乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
被験者から採取した血液に含まれているクレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）とも云われる）を定量することにより、進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断が可能なことは以前より知られており、臨床検査に利用されている。また、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には、クレアチンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、そしてクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）という三種のアイソザイムが存在すること、そしてＣＫＭＭは主として骨格筋中に、ＣＫＭＢは主として心筋中に、そしてＣＫＢＢは主として脳や脊髄中に存在することも知られている。さらにＣＫＭＢは、心筋梗塞症が発生すると、心筋より血液中に排出され、その結果、血液中のＣＫＭＢ量が増加することも判明している。従って、被験者の血液中のＣＫＭＢの定量は、心筋梗塞症の発生の有無を検査するために有力な手段とされている。
【０００３】
上記のように、臨床検査に於て、クレアチンキナーゼの定量（すなわち、総クレアチンキナーゼの定量）、及び／又はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量によって、被験者についての進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断に有力な手掛かりを得ることができるため、従来より、それらの定量方法についての研究が進められ、現在では精度の高い定量方法が確立されている。
【０００４】
すなわち、クレアチンキナーゼの測定方法としては、被験者から採取した血液から血清あるいは血漿を得て、この血清や血漿中に含まれるクレアチンキナーゼの酵素活性を利用することにより、分光的方法により検出できる化学種を定量的に生成させ、その化学種の生成量から、血清あるいは血漿中のクレアチンキナーゼの存在量を定量する方法である。さらに詳しく云えば、この定量方法に利用される検出反応系は次の二つに分けることができる。
【０００５】
１）検出反応系１
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域にて緩衝能を示す緩衝性化合物を用いて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグルコース（Ｇｌｕ）とをヘキソキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成させ、次にこのＧ６Ｐをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ（Ｐ））と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下に反応させてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）還元型（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生成させ、最後に、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
【０００６】
なお、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分光的定量の精度が充分でない傾向があるため、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを更にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザン色素を生成させて、そのホルマザン色素の生成量を定量することによって、被検液中のクレアチンキナーゼを定量する方法も既に開発されている（特開昭６３−３２４９９号公報参照）。
この検出反応系１を反応式により次に示す。
【０００７】
２）検出反応系２
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物にて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグリセロールとをグリセロールキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてＬ−α−グリセロリン酸を生成させ、次にこのＬ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの存在下に酸素と反応させて過酸化水素を発生させ、最後に過酸化水素とロイコ色素とを反応させて青色の色素を生成させ、この青色色素の生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
この検出反応系２を反応式により次に示す。
【０００９】
一方、前記のように、クレアチンキナーゼには、三種類のアイソザイムが存在するため、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量は容易ではない。すなわち、原理的には、ＭＭアイソザイムとＢＢアイソザイムとからＭＢアイソザイムを分離して定量する必要がある。ただし、ＢＢアイソザイムは、本来的に脳や脊髄中に存在するものであるため、血液中の存在量は非常に少なく、その存在は無視することができる。従って、ＭＢアイソザイムの定量には、ＭＭアイソザイムを分離することができれば可能となるが、その分離は非常に困難である。このため、クレアチンキナーゼを含む血液試料（血清や血漿など）中のＭＭアイソザイムを分離する代わりに、ＭＢアイソザイムの活性に影響を与えること無く、ＭＭアイソザイムの活性を阻害させる方法により、実質的なＭＢアイソザイムの分離を実現する方法が既に開発されている（特公昭５６−１９２３９号公報参照）。この方法では、予め調製したクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム中のサブユニットＢの酵素活性を阻害することなく、クレアチンキナーゼのＭＭアイソザイムおよびＭＢアイソザイム中のサブユニットＭの酵素活性を完全に阻害する抗体を使用する。すなわち、被検液を先ずこのＭサブユニット不活性化抗体で処理することによってクレアチンキナーゼの活性をクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムに起因するもののみに限定させ、この酵素活性を前記の検出反応系１あるいは検出反応系２を利用して測定することによって、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量が可能となる。
【００１１】
以前のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの臨床検査では、これまでに述べてきた方法を利用して、検出反応を試薬溶液中で実施する湿式法が一般的に利用されていた。しかしながら、湿式法による定量分析操作は、結果を得るまでにかなりの長時間を必要とするという欠点があった。すなわち、例えば、心筋梗塞については、梗塞の発症から治療開始までの時間が短いほど治療の効果が高いことが知られており、このため特に心筋梗塞発症の診断については緊急性の要求が非常に高い。従って、検査の開始から検査結果の入手までの時間が長いことは、治療の開始の遅れを引き起こすことになり、好ましくない。
【００１２】
臨床検査の結果を短時間に得る手段として、透明支持体のうえに検出反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層した構成の各種の乾式分析素子が以前より知られている。そして、上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検査反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層したクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子も既に開発され、実際に使用されている。このようなクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成については、下記の特許公開公報に詳しい記載がある。
特開平６１−２５４１９８号公報、特開平６１−２５４１９９号公報、特開平６１−２６０１６４号公報。
【００１３】
上記の公知のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子は、それぞれクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの短時間での定量分析のために利用できる優れた分析用具であるが、分析素子製造後から実際の定量分析に使用するまでの間における保存性に劣ると云う問題があった。すなわち、それぞれの分析素子を通常の保存条件にて保存を行なうと、製造後短い期間の内に、感度の低下が発生することが見出されている。従って、これらの乾式分析素子を良好な保存状態に維持するためには、分析素子を冷凍保存する必要があった。このような分析素子の保存に、冷凍保存が必要であると云うことは、その冷凍保存の設備が必要である上に、実際の臨床検査の開始に際しても時間的遅れが発生しやすいという問題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、これまでに知られているクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存性を解決することを目的とする。
本発明は特に、常温で保存しても感度低下が少なく、従って常温での保存が可能なクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法で検出が可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子であって、該指示薬組成物が、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むものであり、一方、該指示薬組成物の機能の発現に必要な量のグルコースは含まないことを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子にある。
【００１６】
本発明の発明者の研究によると、従来のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存安定性は、それらの保存中において、試薬組成物中の試薬が、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）が存在しない状態で、徐々に反応を起こすことに起因するものであることが判明した。特に、前記の検出反応系１では、ＣＫやＣＫＭＢが存在しなくても、ＣＰとＡＤＰとが部分的に反応してＡＴＰが生成し、またＣＰとＧｌｕとが反応してＧ６Ｐを生成させる現象が確認された。従って、このクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの不存在下で発生する反応が分析精度の大きな低下をもたらす結果となる。
【００１７】
上記の理由から、本発明者は、上記の様な乾式分析素子の常温での保存中に発生する望ましくない反応の抑制を目的として研究した。そして、その結果、上記の検出反応系１を利用する分析素子において、分析素子の保存中の副反応に関与するグルコースを分析素子から排除することにより、問題の副反応の阻止あるいは抑制が可能なことが判明した。そして、検出反応系１の実際の検出反応の進行を開始させるためには勿論、グルコースの存在が必要となるが、そのグルコースとしては、被検液となる血清や血漿に原料の血液から必然的に持込まれるグルコースが利用できるため、分析素子中の指示薬組成物からグルコースを取り除いても実際の定量分析には何等差し支えないことが判明した。
【００１８】
なお、上記の考え方は、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）定量用分析素子にも原理的には適用できるが、通常の被検液（血清や血漿）中のクレアチンキナーゼの存在量がクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムに比べて多く、従って、その多量のクレアチンキナーゼの存在下での酵素反応により発生するＡＴＰの量が多くなることから、その後の反応に必要なグルコース量を被検液から充分に供給することは困難であるため、本発明の適用は実用的にはあまり有利と言えない。また、検出反応系２においては、指示薬組成物の成分の性質上、被検液から供給できるものがないため、本発明の考え方を利用することはできない。
【００１９】
すなわち、本発明のクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子は、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体と前記の検出反応系１を組合せて利用することにより、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量を行なうものであるが、その検出反応系１で必要とするグルコースとして、血液中に存在するグルコースを利用することを特徴としている。すなわち、分析素子中にグルコースを全く導入しないか、あるいは少なくとも検出反応系の進行に必要な量までのグルコースを導入しないことを特徴とする。本発明の分析素子は、検出反応系１を利用する分析素子でありながら、このようにグルコースを導入していないか、あるいは少なくとも多量のグルコースを導入していないため、保存中にグルコースが関与して発生する副反応を回避あるいは抑制することができ、従って向上した保存性を示すようになる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の分析素子の好ましい態様を次に記す。
１）指示薬組成物が、更にテトラゾリウム塩を含むものである上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
２）指示薬組成物が、グルコースを含むことのない上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
３）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）である（すなわち、ＮＡＤＰを用いない）上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
４）指示薬組成物が、更に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性阻害剤を含む上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
５）指示薬組成物が、更にオキサロ酢酸、シュウ酸、およびオキサミン酸からなる群より選ばれた乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性阻害剤を含む上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【００２１】
本発明のクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子において利用される検出反応系は前記の検出反応系１である。従って、アデノシン三リン酸との反応によって分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物としては、前記の検出反応系に利用される指示薬組成物が使用することができる。すなわち、指示薬組成物の例としては、下記の指示薬組成物を挙げることができる。
【００２２】
１）ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、グルコースを含まないか、或は微量のグルコースを含む指示薬組成物。
２）ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びテトラゾリウム塩を含み、グルコースを含まないか、或は微量のグルコースを含む指示薬組成物。
【００２３】
本発明のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成、及びそれらを構成する各種試薬は既に知られており、本発明の乾式分析素子に於ても、グルコースを導入しないか、あるいは少なくとも必要量のグルコースを導入しないかの点を除けば、同様の構成と同様の各種試薬が利用される。このような乾式分析素子の構成と試薬の例は、前述の特許公告公報および公開公報に詳しく記載されているので、ここに改めて詳しく記載しない。
【００２４】
なお、本発明の分析素子に於て使用する、アデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物としては、この目的で従来のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子で一般的に用いられているＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス−トリス）はイミダゾールを用いることができるが、スルホン酸基を有する緩衝性化合物、特にグッドの緩衝剤のリストに含まれ、かつ分子構造中にスルホン酸基を有する化合物を用いることが好ましい。すなわち、グッドの緩衝剤には、スルホン酸基を持つもの、そしてスルホン酸基を持たないもののいずれもがあるが、本発明で有利に用いられる緩衝性化合物は、それらの内のスルホン酸基を持つ緩衝性化合物である。このスルホン酸基を有する緩衝性化合物の使用は、前記の分析素子の保存中の副反応の発生をさらに効果的に抑制する。なお、グッドの緩衝剤（あるいは、グッドの緩衝液とも呼ばれる）については、例えば、「化学辞典」（森北出版株式会社、１９８１年発行）、「化学大辞典」（株式会社東京化学同人、１９８９年発行）などに簡単な記載があり、また更に多くの臨床検査試薬に関する成書に詳しい記載がある。
【００２５】
グッドの緩衝剤に属し、かつ本発明の乾式分析素子に於ける使用に適した緩衝性化合物としては、ＴＥＳ，ＴＡＰＳＯ，ＭＯＰＳＯ，ＭＥＳ，ＤＩＰＳＯ，ＨＥＰＥＳ，ＨＥＰＳＯと名付けられている化合物を挙げることができる。これらの化合物の中でも、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けられている化合物が好ましい。特に好ましいのは、ＴＥＳとＴＡＰＳＯである。
【００２６】
本発明の分析素子における緩衝性化合物の使用量については特に制限はない。すなわち、グッドの緩衝剤の一般的な使用の態様を参考にし、使用量を変動させての試験的使用などの一般的な使用量決定方法を利用することにより、容易に適当な使用量を決定することができる。なお、緩衝性化合物は、二種以上のものを組合せて使用することも可能であり、たとえば、スルホン酸基を持たない緩衝性化合物あるいは他の緩衝剤組成物と組合せて使用することもできる。
【００２７】
本発明の分析素子の試薬層には、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の酵素活性の発現を阻害することのできる化合物を導入しておくことが望ましい。即ち、本発明者の研究によると、分析素子中にグルコースを導入しないか、あるいは必要量に達するまでの量のグルコースを導入しない場合には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤＰ）ではなく、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）を用いることが望ましいが、ＮＡＤを使用した場合には、被検液中に一般的に存在するＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の量によってＣＫＭＢの分析値が変動しやすく、分析精度を低下させることが判明している。従って、そのＬＤＨの酵素活性を阻害あるいは抑制させることのできる化合物（例、オキサロ酢酸、シュウ酸、及びオキサミン酸）を分析素子の試薬含有層に導入しておくことことが望ましい。
【００２８】
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を用いてのクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析の操作は、前述の特許公告公報及び特許公開公報に記載されているように、既に知られており、本発明の乾式分析素子を用いてのＣＫＭＢの定量分析操作は、それらと同様な操作に従って実施することができる。
次に本発明の実施例と比較例とを記載する。
【００２９】
【実施例】
［実施例１］グルコースを導入しないＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥層厚が１２μｍの指示薬層を形成した。
【００３０】
脱イオンゼラチン ２００ｇ
水 １１００ｇ
５％非イオン系界面活性剤水溶液 ８０ｇ
ニトロテトラゾリウムブルー １０ｇ
【００３１】
上記指示薬層をゼラチン架橋剤を含む溶液で湿らせた後（約３０ｇ／ｍ2 ）、その指示薬層の上に、ポリエチレンテトラフタレート紡績糸からなるトリコット編み物を圧着し、乾燥させて展開層とした。
次に、上記展開層の表面に下記の組成の塗布液を、塗布量１３０ｇ／ｍ2 にて塗布、乾燥した。
【００３２】
水 ４６．６ｇ
抗ヒトＣＫ−Ｍヤギ抗体溶液 ２０ｇ
（最終希釈倍率１５００倍時に２０００Ｕ／Ｌの
ＣＫＭＭを５０％以上阻害できる能力を持つ溶液）
１０％非イオン系界面活性剤水溶液 ２．９ｇ
１５％ポリアクリルアミド水溶液 ３３．８ｇ
（平均分子量３．７万）
２０％塩化マグネシウム水溶液 ８．７ｇ
エチレンジアミン４酢酸・２Ｎａ塩 ０．５ｇ
クレアチンリン酸（ＣＫ） １．３ｇ
アデノシン−５’−ジホスフェート（ＡＤＰ） ０．３ｇ
Ｐ1 ，Ｐ5 −ジ（アデノシン−５’−）
ペンタホスフェート（ＡＰ５Ａ） ０．２５ｇ
アデノシン−５’−モノホスフェート（ＡＭＰ） １．２ｇ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン ０．１ｇ
ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型
（ＮＡＤ） ０．６ｇ
オキサロ酢酸 ０．０７ｇ
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ） ５．１ｇ
１Ｎ ＮａＯＨ １０．０ｇ
ジアホラーゼ １５００Ｕ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １４０００Ｕ
ヘキソキナーゼ（ＨＫ） １９４００Ｕ
アスコルビン酸オキシダーゼ ５０００Ｕ
【００３３】
最後に、上記にて形成した、支持体上に指示薬層と反応試薬含有展開層とが積層された積層体を１２ｍｍ×１２ｍｍの寸法に裁断して、グルコースを含有しないＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。なお、得られたＣＫＭＢ定量用分析素子中の試薬の分布を調べたところ、指示薬層に導入したニトロテトラゾリウムブルーの大部分が展開層に移動していることが確認された。
【００３４】
［比較例１］グルコースを含有するＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
展開層の表面に塗布する塗布液にグルコース０．６２ｇを添加した以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３５】
［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中のＡＴＰの生成］
実施例１そして比較例１で得られた分析素子を、それぞれ４５℃、１１％ＲＨの保存条件で１日間保存し、次いで微量の水を各分析素子の展開層の表面に点着し、３７℃で６分間インキュベーションした。次に、波長５４０ｎｍにて、各分析素子で発生した呈色を測定した。なお、並行して、製造直後の実施例１と比較例１の分析素子についても同様の呈色試験を行なった。この測定により判明した各分析素子の呈色を下記の第１表に示す。
【００３６】
【表１】
上記の第１表の結果から、本発明で採用するグルコース不導入の分析素子に於ては、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの不存在下でのＡＴＰの副生が効果的に抑制されていることが明らかである。
【００３８】
［実施例２］グルコースとオキサロ酢酸とを含有しないＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
展開層の表面に塗布する塗布液成分からオキサロ酢酸を全量除いた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３９】
［被検液中のＬＤＨ含有量の影響］
実施例１で得られた分析素子そして実施例２で得られた分析素子のそれぞれについて、３５℃、１１ＲＨ％の保存条件で１０日間保存した後のものを用意し、それぞれの分析素子について、ＣＫＭＢ含有量が一定で、ＬＤＨを含まない検体と、ＬＤＨ含有量が１０００Ｕ／Ｌの検体とを点着した。
検体が点着された分析素子から水分を蒸発させた後、３７℃でインキュベーションを行ない、次いで波長５４０ｎｍにて、インキュベーション開始後２分後、そして５分後に分光測定を行ない、予め作成しておいた検量線を参照して、反応速度法によりＣＫＭＢ量の定量を行なった。その結果を下記の第２表に示す。
【００４０】
【表２】
上記の第２表の結果から、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が相当量混在しているＣＫＭＢ含有検体中でのＣＫＭＢの定量のためには、ＣＫＭＢ定量用の分析素子へのＬＤＨ活性阻害剤の導入が有効であることが分る。
【００４２】
【発明の効果】
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析用の乾式分析素子の検出反応系でグルコースを使用する場合、そのグルコースを予め分析素子に導入しないか、あるいはグルコースの導入量を微量に止めることにより、ＣＫＭＢ定量用分析素子の保存性が顕著に向上するため、従来のＣＫＭＢ定量分析用乾式分析素子の使用前の保存の際に必須とされていた分析素子の冷凍保存の必要が無くなり、実用において非常に有利となる。なお、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の含有量が多い血清などの検体を用いる場合には、ＣＫＭＢ定量用乾式分析素子にＬＤＨ活性阻害化合物を導入しておくことが好ましい。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a dry analytical element for quantification of MB isozyme of creatine kinase.
[0002]
[Prior art]
It is possible to diagnose progressive muscular atrophy, dermatomyositis, myocardial infarction, etc. by quantifying creatine kinase (CK, also called creatine phosphokinase (CPK)) contained in blood collected from subjects. It has been known for some time and is used in clinical tests. In addition, creatine kinase (CK) has three types of isozymes, creatine kinase MM (CKMM), creatine kinase MB (CKMB), and creatine kinase BB (CKBB). Is also known to exist mainly in the myocardium and CKBB mainly in the brain and spinal cord. Furthermore, it has also been found that CKMB is excreted from the myocardium into the blood when myocardial infarction occurs, and as a result, the amount of CKMB in the blood increases. Therefore, quantification of CKMB in the blood of a subject is considered to be an effective means for examining the presence or absence of occurrence of myocardial infarction.
[0003]
As described above, progressive muscular atrophy, dermatomyositis, myocardial infarction for a subject by quantification of creatine kinase (ie, quantification of total creatine kinase) and / or quantification of creatine kinase MB isozyme in clinical examination. As a result, research on the quantification method has been advanced, and now a highly accurate quantification method has been established.
[0004]
That is, as a method for measuring creatine kinase, a chemical species that can be detected by a spectroscopic method by obtaining serum or plasma from blood collected from a subject and utilizing the enzyme activity of creatine kinase contained in the serum or plasma. Is quantitatively produced, and the abundance of creatine kinase in serum or plasma is quantified from the amount of the chemical species produced. More specifically, the detection reaction system used in this quantification method can be divided into the following two types.
[0005]
1) Detection reaction system 1
While adjusting the pH environment of the enzymatic reaction, creatine phosphate (CP) and adenosine diphosphate (ADP) were adjusted using a buffering compound having a buffer capacity in the pH range of 5.5 to 8.5. Reacting with creatine kinase (CK) present in the fluid (serum, plasma, etc.) to produce an amount of adenosine triphosphate (ATP) proportional to the amount of creatine kinase (CK); The ATP and glucose (Glu) are reacted in the presence of hexokinase (HK) to produce glucose-6-phosphate (G6P), which is then oxidized to nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form ( NAD (P)) in the presence of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) to react with nicotinamide adenine dinucleotide Acid) reduced form (NAD (P) H) is produced, and finally, the amount of NAD (P) H produced is measured by a spectroscopic measurement method, and a separately prepared calibration curve is used to produce creatine kinase (CK ).
[0006]
Since the accuracy of spectroscopic quantification of the produced NAD (P) H tends to be insufficient, the NAD (P) H is further reacted with a tetrazolium salt to produce a formazan dye, and the amount of the formazan dye produced A method for quantifying creatine kinase in a test solution by quantifying the amount of creatine has already been developed (see JP-A-63-32499).
This detection reaction system 1 is shown by the following reaction formula.
[0007]
2) Detection reaction system 2
While adjusting the pH environment of the enzyme reaction between creatine phosphate (CP) and adenosine diphosphate (ADP) with a buffering compound having a buffer capacity in the range of pH 5.5 to 8.5, Reaction with creatine kinase (CK) present in serum, plasma, etc.) to produce an amount of adenosine triphosphate (ATP) proportional to the amount of creatine kinase (CK), and then the ATP And glycerol are reacted in the presence of glycerol kinase (HK) to produce L-α-glycerophosphate, and this L-α-glycerophosphate is then reacted with oxygen in the presence of L-α-glycerophosphate oxidase. To generate hydrogen peroxide, and finally react hydrogen peroxide with a leuco dye to produce a blue dye. A spectroscopic measurement method for the amount of blue dye produced. More measured, using a calibration curve separately prepared, a method for quantifying creatine kinase (CK).
This detection reaction system 2 is shown below by a reaction equation.
[0009]
On the other hand, as described above, since creatine kinase has three types of isozymes, quantification of creatine kinase MB isozyme is not easy. That is, in principle, it is necessary to separate and quantify MB isozymes from MM isozymes and BB isozymes. However, since BB isozyme is inherently present in the brain and spinal cord, its abundance in blood is very small and its presence can be ignored. Therefore, the MB isozyme can be quantified if the MM isozyme can be separated, but the separation is very difficult. For this reason, instead of separating MM isozymes in blood samples containing creatine kinase (serum, plasma, etc.), the method of inhibiting the activity of MM isozymes without affecting the activity of MB isozymes, A method for realizing isozyme separation has already been developed (see Japanese Patent Publication No. 56-19239). In this method, an antibody that completely inhibits the MM isozyme of creatine kinase and the enzyme activity of subunit M in the MB isozyme without inhibiting the enzyme activity of subunit B in the creatine kinase MB isozyme prepared in advance is used. . That is, the test solution is first treated with this M subunit-inactivating antibody to limit the activity of creatine kinase to only that caused by creatine kinase MB isozyme, and this enzyme activity is detected in the above detection reaction system 1 or detection. By measuring using the reaction system 2, creatine kinase MB isozyme can be quantified.
[0011]
In the previous clinical examination of creatine kinase MB isozyme, a wet method in which a detection reaction is carried out in a reagent solution using the method described so far is generally used. However, the quantitative analysis operation by the wet method has a drawback that it takes a considerable time to obtain a result. That is, for example, for myocardial infarction, it is known that the shorter the time from the onset of infarction to the start of treatment, the higher the effect of treatment, and thus there is a very urgent need for diagnosis of myocardial infarction. high. Therefore, a long time from the start of the test to the acquisition of the test result causes a delay in starting the treatment, which is not preferable.
[0012]
Various dry analytical elements having a structure in which a reagent layer containing a reagent composition involved in a detection reaction is laminated on a transparent support have been known as means for obtaining a result of a clinical test in a short time. A dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme in which a reagent layer containing a reagent composition involved in the creatine kinase MB isozyme test reaction is laminated has already been developed and actually used. The configuration of such a dry analytical element for quantifying creatine kinase MB isozyme is described in detail in the following Patent Publication.
JP-A-61-254198, JP-A-61-2254199, JP-A-61-260164.
[0013]
The above known dry analytical elements for quantification of creatine kinase MB isozyme are excellent analytical tools that can be used for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme in a short time. There was a problem that it was inferior in storage stability until it was used. That is, it has been found that if each analytical element is stored under normal storage conditions, the sensitivity will decrease within a short period after production. Therefore, in order to maintain these dry analytical elements in a good storage state, the analytical elements have to be stored frozen. The fact that cryopreservation is necessary for the storage of such an analytical element requires a facility for the cryopreservation, and there is a problem that a time delay is likely to occur at the start of an actual clinical test. is there.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the low storage stability of dry analytical elements for quantification of creatine kinase MB isozyme known so far.
In particular, an object of the present invention is to provide a dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme capable of being stored at room temperature with little decrease in sensitivity even when stored at room temperature.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides, on a support, an antibody that specifically inhibits the M subunit activity of creatine kinase, creatine phosphate and adenosine diphosphate that produce adenosine triphosphate in the presence of creatine kinase MB isozyme, and It contains a buffering compound that exhibits buffering capacity in the region of pH 5.5-8.5, providing a pH environment for the production of adenosine triphosphate, and further spectroscopically by reaction with the produced adenosine triphosphate. A dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme comprising a creatine kinase MB isozyme detection reagent layer containing an indicator composition that generates a compound that can be detected by a measurement method, wherein the indicator composition comprises hexokinase, Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form and glucose-6-phosphorus Is intended to include the dehydrogenases, whereas, in creatine kinase MB isozyme dry analytical element for quantifying, characterized in that does not include the amount of glucose necessary for the expression of function of the indicator composition.
[0016]
According to the research of the inventors of the present invention, the low storage stability of conventional dry analytical elements for quantification of creatine kinase MB isozyme is that during their storage, the reagent in the reagent composition is creatine kinase MB isozyme (CKMB). It has been found that this is caused by a gradual reaction in the absence of. In particular, in the detection reaction system 1 described above, even when CK or CKMB is not present, CP and ADP partially react to generate ATP, and CP and Glu react to generate G6P. Was confirmed. Therefore, the reaction that occurs in the absence of this creatine kinase MB isozyme results in a significant decrease in analytical accuracy.
[0017]
For the above reasons, the present inventor has studied for the purpose of suppressing undesirable reactions that occur during the storage of the dry analytical element as described above at room temperature. As a result, in the analysis element using the detection reaction system 1 described above, by eliminating glucose involved in the side reaction during storage of the analysis element from the analysis element, the problem side reaction can be prevented or suppressed. It has been found. And of course, the presence of glucose is necessary to start the actual detection reaction in the detection reaction system 1, but the glucose is inevitably from the blood of the raw material to the serum or plasma to be tested. Since it is possible to use glucose brought into the cell, it has been found that even if glucose is removed from the indicator composition in the analytical element, there is no problem in actual quantitative analysis.
[0018]
The above concept can be applied in principle to analytical elements for creatine kinase (CK) quantification, but the amount of creatine kinase in a normal test solution (serum or plasma) is higher than that of creatine kinase MB isozyme. Therefore, since the amount of ATP generated by the enzyme reaction in the presence of such a large amount of creatine kinase increases, it is difficult to supply a sufficient amount of glucose necessary for the subsequent reaction from the test solution. Therefore, the application of the present invention is not very advantageous in practice. Moreover, in the detection reaction system 2, since there is no thing which can be supplied from a test liquid on the property of the component of an indicator composition, the idea of this invention cannot be utilized.
[0019]
That is, the dry analytical element for quantification of creatine kinase MB of the present invention uses a combination of an antibody that specifically inhibits the M subunit activity of creatine kinase and the detection reaction system 1 described above. Although quantitative determination is performed, glucose present in blood is used as glucose required in the detection reaction system 1. That is, it is characterized in that no glucose is introduced into the analytical element, or at least glucose up to an amount necessary for the progress of the detection reaction system is not introduced. Although the analytical element of the present invention is an analytical element that utilizes the detection reaction system 1, glucose is not introduced in this way, or at least a large amount of glucose is not introduced, so that glucose is involved during storage. Side reactions generated can be avoided or suppressed, and therefore, improved storage stability is exhibited.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Preferred embodiments of the analytical element of the present invention are described below.
1) The above dry analytical element for quantitative determination of creatine kinase MB isozyme, wherein the indicator composition further contains a tetrazolium salt.
2) The dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme as described above, wherein the indicator composition does not contain glucose.
3) The above dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme, wherein the nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form is nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (NAD) (that is, NADP is not used).
4) The above dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme, wherein the indicator composition further contains a lactate dehydrogenase (LDH) activity inhibitor.
5) The above dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme, wherein the indicator composition further comprises a lactate dehydrogenase (LDH) activity inhibitor selected from the group consisting of oxaloacetate, oxalic acid, and oxamic acid.
[0021]
The detection reaction system used in the dry analytical element for quantification of creatine kinase MB of the present invention is the detection reaction system 1 described above. Therefore, the indicator composition used in the detection reaction system can be used as the indicator composition for producing a compound detectable by a spectroscopic measurement method by reaction with adenosine triphosphate. That is, the following indicator composition can be mentioned as an example of an indicator composition.
[0022]
1) An indicator composition comprising hexokinase, nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, and no glucose or a trace amount of glucose.
2) An indicator composition containing hexokinase, nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form, glucose-6-phosphate dehydrogenase and a tetrazolium salt and no glucose or a trace amount of glucose.
[0023]
The structure of the dry analytical element for quantification of the creatine kinase MB isozyme of the present invention and the various reagents constituting them are already known. In the dry analytical element of the present invention, glucose is not introduced or at least necessary. Various reagents having the same configuration are used except that the amount of glucose is not introduced. The configuration of such a dry analytical element and examples of reagents are described in detail in the above-mentioned patent publications and publications, and therefore will not be described in detail here.
[0024]
In addition, as a buffering compound having a buffering capacity in the region of pH 5.5 to 8.5 that provides a pH environment for the production of adenosine triphosphate, used in the analytical element of the present invention, Bis-Tris (bis-tris), which is generally used in conventional dry analytical elements for quantification of creatine kinase MB isozyme, can use imidazole, but is a buffering compound having a sulfonic acid group, particularly Good's buffer. It is preferable to use a compound which is included in the list of agents and has a sulfonic acid group in the molecular structure. That is, Good's buffering agents include those having a sulfonic acid group and those having no sulfonic acid group, but the buffering compound advantageously used in the present invention has a sulfonic acid group contained therein. It has a buffering compound. The use of the buffering compound having a sulfonic acid group further effectively suppresses the occurrence of side reactions during storage of the analytical element. As for Good's buffer (also referred to as Good's buffer), for example, “Chemical Dictionary” (Morikita Publishing Co., Ltd., published in 1981), “Chemical Dictionary” (Tokyo Chemical Co., Ltd., 1989) (Published), etc., and there are detailed descriptions in the books on more clinical laboratory reagents.
[0025]
Examples of buffering compounds belonging to Good's buffer and suitable for use in the dry analytical element of the present invention include compounds named TES, TAPSO, MOPSO, MES, DIPSO, HEPES, HEPSO. it can. Of these compounds, compounds named TES, TAPSO, MOPSO, and MES are preferred. Particularly preferred are TES and TAPSO.
[0026]
There is no restriction | limiting in particular about the usage-amount of the buffering compound in the analytical element of this invention. That is, referring to the general usage mode of Good's buffer, the appropriate usage amount can be easily determined by using a general usage amount determination method such as trial use with varying usage amount. can do. In addition, a buffering compound can also be used in combination of 2 or more types, for example, it can also be used in combination with the buffering compound which does not have a sulfonic acid group, or another buffering agent composition.
[0027]
It is desirable to introduce a compound capable of inhibiting the expression of the enzyme activity of LDH (lactate dehydrogenase) into the reagent layer of the analytical element of the present invention. That is, according to the research of the present inventor, when glucose is not introduced into the analytical element or when the amount of glucose up to the required amount is not introduced, nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form (NADP) ) Instead of nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (NAD), but when NAD is used, CKMB is analyzed by the amount of LDH (lactate dehydrogenase) generally present in the test solution. It has been found that the values are likely to fluctuate, reducing the analysis accuracy. Therefore, it is desirable to introduce a compound (eg, oxaloacetic acid, oxalic acid, and oxamic acid) that can inhibit or suppress the LDH enzyme activity into the reagent-containing layer of the analytical element.
[0028]
The operation of quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme (CKMB) using a dry analytical element for quantification of creatine kinase MB isozyme has already been known, as described in the aforementioned patent publications and patent publications. The CKMB quantitative analysis operation using the dry analytical element of the present invention can be carried out according to the same operation.
Next, examples of the present invention and comparative examples will be described.
[0029]
【Example】
[Example 1] Manufacture of analytical element for quantification of CKMB without introduction of glucose The surface of a transparent polyethylene terephthalate film (thickness 180 µm) is hydrophilized, and a coating solution having the following composition is applied to the treated surface and dried. An indicator layer having a dry layer thickness of 12 μm was formed.
[0030]
200g deionized gelatin
1100 g of water
80 g of 5% nonionic surfactant aqueous solution
Nitrotetrazolium Blue 10g
[0031]
After the indicator layer was moistened with a solution containing a gelatin cross-linking agent (about 30 g / m 2 ), a tricot knitted fabric made of polyethylene tetraphthalate spun yarn was pressure-bonded onto the indicator layer and dried to form a development layer. .
Next, a coating solution having the following composition was applied to the surface of the spreading layer at a coating amount of 130 g / m 2 and dried.
[0032]
46.6g of water
20g anti-human CK-M goat antibody solution
(Solution capable of inhibiting CKMM of 2000 U / L by 50% or more at a final dilution factor of 1500)
10% nonionic surfactant aqueous solution 2.9 g
15% polyacrylamide aqueous solution 33.8g
(Average molecular weight 37,000)
8.7 g of 20% magnesium chloride aqueous solution
Ethylenediaminetetraacetic acid, 2Na salt 0.5g
Creatine phosphate (CK) 1.3g
Adenosine-5′-diphosphate (ADP) 0.3 g
P 1 , P 5 -di (adenosine-5'-)
0.25 g of pentaphosphate (AP5A)
Adenosine-5′-monophosphate (AMP) 1.2 g
N-acetyl-L-cysteine 0.1 g
Nicotinamide adenine nucleotide oxidation type (NAD) 0.6g
Oxaloacetic acid 0.07g
N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-
Aminoethanesulfonic acid (TES) 5.1 g
1N NaOH 10.0g
Diaphorase 1500U
Glucose-6-phosphate dehydrogenase 14000U
Hexokinase (HK) 19400U
Ascorbate oxidase 5000U
[0033]
Finally, the laminate formed in the above, in which the indicator layer and the reaction reagent-containing development layer are laminated, is cut into a size of 12 mm × 12 mm to obtain an analytical element for CKMB determination that does not contain glucose. It was. In addition, when the distribution of the reagent in the obtained analytical element for CKMB determination was examined, it was confirmed that most of the nitrotetrazolium blue introduced into the indicator layer was moved to the developing layer.
[0034]
[Comparative Example 1] Production of CKMB quantitative analysis element containing glucose A CKMB quantitative analysis element was obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.62 g of glucose was added to the coating solution applied to the surface of the development layer. .
[0035]
[Evaluation of analytical element for quantitative determination of CKMB: Generation of ATP during storage]
The analytical elements obtained in Example 1 and Comparative Example 1 were stored for 1 day under storage conditions of 45 ° C. and 11% RH, respectively, and then a small amount of water was spotted on the surface of the development layer of each analytical element. Incubated for 6 minutes at ° C. Next, the coloration generated in each analytical element was measured at a wavelength of 540 nm. In parallel, the same color test was performed for the analytical elements of Example 1 and Comparative Example 1 immediately after manufacture. The coloration of each analytical element found by this measurement is shown in Table 1 below.
[0036]
[Table 1]
From the results of Table 1 above, it is clear that the ATP by-product in the absence of creatine kinase MB isozyme is effectively suppressed in the glucose-introduced analytical element employed in the present invention. It is.
[0038]
[Example 2] Manufacture of analytical element for quantification of CKMB not containing glucose and oxaloacetic acid Analysis for quantification of CKMB in the same manner as in Example 1 except that the whole amount of oxaloacetic acid was removed from the coating solution component applied to the surface of the development layer. An element was obtained.
[0039]
[Influence of LDH content in test solution]
For each of the analytical element obtained in Example 1 and the analytical element obtained in Example 2, those prepared after storage for 10 days under storage conditions of 35 ° C. and 11 RH% were prepared. Samples having a constant content and no LDH and samples having an LDH content of 1000 U / L were spotted.
After evaporating moisture from the analytical element on which the sample was spotted, incubation was performed at 37 ° C., followed by spectroscopic measurement at a wavelength of 540 nm, 2 minutes after the start of incubation, and 5 minutes after the start. The amount of CKMB was quantified by the reaction rate method with reference to the calibration curve. The results are shown in Table 2 below.
[0040]
[Table 2]
From the results of Table 2 above, in order to quantify CKMB in a CKMB-containing sample containing a considerable amount of lactate dehydrogenase (LDH), introduction of an LDH activity inhibitor into the analytical element for CKMB quantification It turns out that it is effective.
[0042]
【The invention's effect】
When glucose is used in the dry reaction element detection reaction system for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme (CKMB), the glucose is not introduced into the analysis element in advance, or the introduction amount of glucose is stopped to a very small amount. Since the storage stability of the analytical element for quantification is remarkably improved, the necessity of freezing the analytical element, which has been essential when storing the conventional dry analytical element for quantitative analysis of CKMB, is eliminated. It will be advantageous. When using a specimen such as serum having a high content of LDH (lactate dehydrogenase), it is preferable to introduce an LDH activity inhibitory compound into the dry analytical element for quantifying CKMB.
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