JP3749887B2

JP3749887B2 - Ｄｎａの伸長固定方法

Info

Publication number: JP3749887B2
Application number: JP2002289848A
Authority: JP
Inventors: 敏郎大谷; 滋杉山; 智之吉野
Original assignee: 独立行政法人食品総合研究所; 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
Priority date: 2002-10-02
Filing date: 2002-10-02
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2022-10-02
Also published as: JP2004121096A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡの伸長固定方法に関し、詳しくはＤＮＡを基板上に配向、伸長して固定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ上の遺伝子の位置を決定することは、遺伝子機能の解析や病原遺伝子・有用遺伝子の探索などにおいて非常に重要な意味を持つ。最近、ナノメートルレベルの分解能を持つ原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope, AFM）や走査型近接場光プローブ顕微鏡（Scanning Near-field Optical/Atomic Force Microscope, SNOM/AFM)などを用いて、正確に遺伝子位置を決定することが可能になっている。
しかし、これらの方法を適用するためには、対象となるＤＮＡを直線状に引き延ばすことが必要になる。また、AFM やSNOM/AFMは、観察範囲が数十μｍと比較的狭いため、基板上の特定位置にＤＮＡを固定することも必要である。従来、ＤＮＡを基板上に伸長固定するためには、基板をＤＮＡ溶液に浸した後、一定速でゆっくりと引き上げ、その時に起きる気液界面の移動によりＤＮＡを伸長固定する方法（Science 277 (1997) p.1518-1523、特表平9-509057号）が一般的に用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法ではＤＮＡは基板の全面に分散して固定されてしまい、固定されたＤＮＡの位置をAFM やSNOM/AFMにより走査しながら捜す必要があった。さらに、SNOM/AFMでは、ＤＮＡは基板の片面だけに固定される必要があるが、従来の方法では両面にＤＮＡが固定され、測定時のノイズとなっていた。
また、試料作成に要するＤＮＡ溶液の量も数ｍＬという大量が必要であるという問題点もあった。
そこで、本発明は、大量のＤＮＡ溶液を要せず、ＤＮＡを基板上の特定位置に直線状に引き伸ばして固定する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、溶液中のＤＮＡを溶液の流れまたは気液界面の移動により基板上に配向固定する方法において、基板上に高さ１μｍ以下１０ｎｍ以上の段差を設け、前記段差と交差する方向にＤＮＡ溶液を流すか、または気液界面を移動させることにより、ＤＮＡの末端を段差面に付着させ、溶液の流れまたは気液界面の表面張力によりＤＮＡを配向、伸長させることを特徴とするＤＮＡの伸長固定方法である。
請求項２記載の本発明は、段差が、直線、円弧、方形または円形の凹みの形状をなして形成されていることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの伸長固定方法である。
請求項３記載の本発明は、溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段が、重力、遠心力、電気泳動またはポンプによる送液あるいは吸い上げであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの伸長固定方法である。
請求項４記載の本発明は、基板が、雲母板、ガラス板、シリコン板およびサファイア板のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの伸長固定方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡを基板上に配向、伸長して固定する方法である。本発明の対象とされるＤＮＡに制限はなく、あらゆる生物のゲノムまたはプラスミド、ファージ（ウイルス）、人工染色体などのベクターに由来するものでよく、長さも限定されない。
ＤＮＡを懸濁する溶液としては、例えばＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７〜８）、トリス緩衝液、蒸留水などが用いられ、これらの中ではＴＥ緩衝液が好ましい。
【０００６】
次に、基板に関しては、特に限定されないが、雲母板、ガラス板、シリコン板、サファイア板などが好適である。
基板には、段差が設けてあり、その高さは１μｍ以下１０ｎｍ以上、好ましくは０．５μｍ以下５０ｎｍ以上である。段差の形状については任意であるが、例えば直線、円弧、方形または円形の凹みが好適であり、そのサイズは１０μｍから１ｍｍの範囲が適当である。
【０００７】
ＤＮＡを含む溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段としては、例えば重力、遠心力、電気泳動、ポンプ（電動等の自動または手動）などによる送液や吸い上げが挙げられる。いずれの方法でもＤＮＡを伸長することは可能であるが、遠心力またはポンプによる方法が望ましい。
【０００８】
以下に、本発明を図面に基づいて詳しく説明する。
図１は、本発明によるＤＮＡ伸長固定の原理を示した模式図である。図に示されるように、ＤＮＡは溶液中ではランダムコイル状（１）に丸まっている。ＤＮＡは溶液の流れに従って移動し、基板上に設けた段差（２）を通過するときにある確率で末端部分が段差（２）に付着する。
末端が段差に付着したランダムコイル状ＤＮＡ（３）は、水流の力により引き伸ばされて直線状（４）になり、ＤＮＡ分子自身が持つ極性や電荷のため基板面に付着し、（５）のように基板面に固定される。
【０００９】
図２は、実際に本原理に基づいて基板上に伸長固定したＤＮＡの蛍光顕微鏡写真である。基板上に段差を作成するには、基板の材質を考慮して適切な手段を採用すればよく、例えば雲母板の場合は雲母を劈開することによって段差を形成することができる。１例を示すと、雲母を劈開して高さ４００ｎｍ程度の段差を作成することができた。
【００１０】
次に、雲母板に段差を形成した基板を用いてＤＮＡを該基板上に配向、伸長して固定する方法について説明する。
雲母板をＭｇＣｌ₂ 処理することにより雲母板上に正電荷を有するＭｇ⁺ イオンを吸着させて、ＤＮＡの付着を容易にした後、その中心に５μＬの蛍光色素（YOYO-1) で染色したλファージＤＮＡ溶液（濃度５μｇ／ｍＬ）を滴下し、５０００ｒｐｍで回転させた。ＤＮＡ溶液は回転にともなう遠心力により中心から外縁部へと押し流され、その時起きる水流により、図１の原理に基づきＤＮＡが段差部に伸長固定された。
図３では、AFM により個別のＤＮＡを観察した結果を立体で表示した。図２では、ＤＮＡ１本を確認することはできないが、図３では、AFM によって雲母基板上の段差部に本発明の方法により伸長固定された１本１本のＤＮＡの形状像が確認された。また、段差部分に対し、ＤＮＡが一方向に配向して直線状に固定されていることがわかる。
【００１１】
このように伸長固定されたＤＮＡ上の遺伝子を蛍光色素ないしは微小金粒子などにより標識すれば、AFM やSNOM/AFMにより、その位置をナノメートルレベルで逐次決定して行くことが可能になる。
【００１２】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡを基板上の片面の特定位置に直線状に引き伸ばして固定することができるので、AFM やSNOM/AFMによる遺伝子位置の詳細な決定を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｅ）は本発明の原理を示す模式図である。
【符号の説明】
１溶液中のランダムコイル状ＤＮＡ
２基板上に作成した段差
３末端が段差に付着したランダムコイル状ＤＮＡ
４水流により直線状に伸ばされたＤＮＡ
５基板面に直線状に固定されたＤＮＡ
【図２】本発明により実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。
【図３】基板の段差部に伸長固定されたＤＮＡのAFM 観察像である。

Claims

溶液中のＤＮＡを溶液の流れまたは気液界面の移動により基板上に配向固定する方法において、基板上に高さ１μｍ以下１０ｎｍ以上の段差を設け、前記段差と交差する方向にＤＮＡ溶液を流すか、または気液界面を移動させることにより、ＤＮＡの末端を段差面に付着させ、溶液の流れまたは気液界面の表面張力によりＤＮＡを配向、伸長させることを特徴とするＤＮＡの伸長固定方法。
段差が、直線、円弧、方形または円形の凹みの形状をなして形成されていることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの伸長固定方法。
溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段が、重力、遠心力、電気泳動またはポンプによる送液あるいは吸い上げであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの伸長固定方法。
基板が、雲母板、ガラス板、シリコン板およびサファイア板のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの伸長固定方法。