JP3741277B2 - Measuring chip and manufacturing method thereof - Google Patents

Description

また、エバネッセント波の波数ｋ_Eは、次の式で与えられる。ここで、プリズムの屈折率をｎ₀、入射角をθとする。
ｋ_E＝ｋ₀ｎ₀ｓｉｎθ …（２）
【０００６】
エバネッセント波の波数ｋ_Eと、表面プラズモンの波数ｋ_SPが等しくなるような入射角θ₀において表面プラズモン共鳴が起こり、全反射減衰が生じる。従って、全反射減衰が生じる入射角θ₀を観測することにより、式（１）及び式（２）に基づいて、全反射減衰が生じるときの誘電率ε_Sを算出することができる。さらに、この誘電率ε_Sから、較正曲線等を利用することにより、試料中の検出対象である物質の濃度を求めることができる。
【０００７】
ＳＰＲ測定をバイオセンサに適用するためには、例えば、金属薄膜１０２の上に、検出対象である物質と特定の反応を起こす媒体（以下、「センシング媒体」という）を固定しておく。特定の反応とは、例えば、抗原抗体反応であり、試料に含まれる抗原を検出する場合に、その抗原に対する抗体をセンシング媒体として用いる。センシング媒体の上に検出対象である物質を含む試料を置くと、金属薄膜１０２上で、試料に含まれる抗原の濃度に応じた抗原抗体反応が起こる。これにより試料１０３の屈折率が変化するので、金属薄膜１０２と試料１０３との界面において生じる表面プラズモンの波数が変化する。これに伴い、上記のような表面プラズモン共鳴が起こる入射角θ₀及びその反射角が変化する。従って、光検出器８によって暗線の位置（角度）変化を検出することにより、試料中の特定物質の濃度を間接的に測定することができる。
【０００８】
このようなＳＰＲ測定においては、いかにセンシング媒体を金属薄膜１０２上に固定するかということが、ＳＰＲ測定の感度に関わってくる。ここで、日本国特許出願公開（特開）平１１−２１１７２８号公報には、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定チップにおいて、固定するヘモグロビンＡ₁抗体が金属膜と強固にかつ容易に結合する手段として、疎水結合或いは静電結合により、金属膜上にヘモグロビンＡ₁抗体を固定させることが開示されている。
【０００９】
また、特開２０００−３９４０１号公報には、プラズマ重合膜を介して生理活性物質を固定することにより、固定する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得られる表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定セルならびに、その測定セルの製造方法及びその測定セルを使用した表面プラズモン共鳴バイオセンサが開示されている。この文献において、測定セルは、金属膜上に形成されたプラズマ重合膜を有している。しかしながら、モノマー原料をプラズマ重合する際には高温（２００℃程度）になるため、プラスチックのように熱に対して変形又は変質する材料は、基材として用いることができない。また、プラズマ重合膜は、３次元的に高密度に架橋された重合膜であり、構造が不規則で光学特性が低く屈折率の変動が大きいため、ＳＰＲ測定には適していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、上記の点に鑑み、本発明は、ＳＰＲ測定等に用いられる測定チップであって、多種類のタンパク質を固定することができると共に光学的に安定な測定チップを提供することを目的とする。また、本発明は、そのような測定チップの製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
以上の課題を解決するため、本発明に係る測定チップは、全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップであって、光透過性を有する誘電体と、該誘電体に形成されている金属薄膜と、該金属薄膜を覆うように形成されている疎水性を有する薄膜とを具備する。
【００１２】
また、本発明の第１の観点に係る測定チップの製造方法は、全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップの製造方法であって、光透過性を有する誘電体に金属薄膜を形成するステップ（ａ）と、分子蒸留方式を用いて、ステップ（ａ）において形成された金属薄膜を覆うように疎水性を有する薄膜を形成するステップ（ｂ）とを具備する。
【００１３】
さらに、本発明の第２の観点に係る測定チップの製造方法は、全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップの製造方法であって、光透過性を有する誘電体に金属薄膜を形成するステップ（ａ）と、イオンビームスパッタ法を用いて、ステップ（ａ）において形成された金属薄膜を覆うように疎水性を有する薄膜を形成するステップ（ｂ）とを具備する。
【００１４】
本発明によれば、測定チップの金属薄膜上に疎水性を有する薄膜を形成するので、多種類のタンパク質を固定することができ、光学特性が高く安定な測定チップを実現することができる。また、分子蒸留方式等を用いるので、疎水性を有する薄膜が均一に形成された測定チップを製造することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、同一の構成要素には同一の参照番号を付して、説明を省略する。
図１は、本発明の一実施形態に係る測定チップを示す断面図である。測定チップ１は、光透過性を有する誘電体（以下、透明誘電体という）１０と金属薄膜１１と、疎水性薄膜１２とを含んでいる。測定チップ１をＳＰＲ測定に用いる際には、疎水性薄膜１２の上にセンシング媒体が固定され、その上に、タンパク質等の検出対象の物質を含む試料が配置される。
【００１６】
透明誘電体１０は、四角錐台の形状を有しており、その上面には試料が配置される空孔１３が形成されている。なお、透明誘電体１０の形状は四角錐台に限られず、例えば、他の角錐台、円錐台、角柱、円柱、平板等の様々な形状を有する透明誘電体を使用することができる。
【００１７】
透明誘電体１０は、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙ ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａ ｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、非晶性ポリオレフィン、又は、シクロオレフィンを含む透明プラスチックや、ガラス等によって形成されている。
【００１８】
透明誘電体１０の空孔１３の内底面には、金属薄膜１１が形成されている。金属薄膜１１としては、例えば、金やアルミニウム等が用いられ、本実施形態においては金を用いている。金属薄膜１１は、例えば、蒸着等によって形成される。
【００１９】
金属薄膜１１上には、疎水性薄膜１２が形成されている。ここで、ＳＰＲ測定において金属薄膜に固定されるセンシング媒体は、例えば、タンパク質、グリコタンパク、リボタンパク、ポリサッカライド等であり、これらは、その分子内に多くの疎水性部位を有している。このため、測定チップに形成されている金属表面を疎水性にすれば、多種類のタンパク質を安定して固定することができる。そこで、本実施形態においては、疎水性を有する表面材質を用いて金属薄膜１１を覆っている。
【００２０】
疎水性薄膜１２としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリフェニレンスルフィド、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルクロライド、ポリシクロオレフィン、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙ ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａ ｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）等を含むプラスチック材料が用いられる。特に、ポリスチレンは、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immuno sorbent assay：エライザ）法等の検査法において広く利用されているので、疎水性薄膜１２の材料としてポリスチレンを用いる場合には、既存の結合プロトコル等を利用することができる。
【００２１】
疎水性薄膜１２は、１ｎｍ〜１００ｎｍ程度の厚さ、望ましくは、１ｎｍ〜５０ｎｍ程度の厚さを有している。ＳＰＲ測定によって検出される信号のＳＮ比は、金属表面と試料との距離、即ち、疎水性薄膜１２の厚さに対して指数関数的に減衰する。このため、検出対象のタンパク質の分子量が小さい場合や、検出対象が極微量の場合等には、ＳＮ比を高くするために、例えば、１ｎｍ〜５ｎｍ程度に膜厚を薄くする。一方、検出対象のタンパク質の分子量が大きい場合、検出対象が大量の場合、或いは、高熱等によってインキュベートするために膜に歪みが加わる場合等には、例えば、５ｎｍ〜５０ｎｍ程度に膜厚を厚くする。しかしながら、疎水性薄膜１２の厚さを１００ｎｍより厚くすると、検出信号において必要なＳＮ比を得ることができないので、実用的でない。従って、本実施形態においては、疎水性薄膜１２の厚さを１００ｎｍ以下としている。
【００２２】
図２は、本実施形態に係る測定チップを使用している状態を示す模式図である。測定チップ１に形成されている疎水性薄膜１２の上には、予めセンシング媒体（タンパク質）１４が疎水結合によって固定され、さらに、検出対象の物質を含む試料が配置される。これにより、センシング媒体と検出対象の物質との間で、例えば、抗原抗体反応が起こり、試料の屈折率が、反応前に比較して変化する。この測定チップ１に、光源１５から発生した光Ｌ１を、透明誘電体１０と金薄膜１１との界面において全反射条件となるように入射させる。これにより、金薄膜１１とタンパク質１４との間において表面プラズモンが励起され、反射光Ｌ２において全反射減衰が生じる。この反射光Ｌ２を光検出器１６によって検出し、検出信号に基づいて較正曲線等を利用することにより、試料に含まれる検出対象の物質の濃度を求めることができる。
【００２３】
次に、本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法について説明する。本実施形態に係る製造方法によれば、透明誘電体に形成された金属薄膜の上に、分子蒸留方式を用いて疎水性薄膜を形成する。本実施形態においては、金属薄膜の材料として金を用い、疎水性薄膜の材料としてポリスチレンを用いる。なお、以下において、金薄膜が形成された透明誘電体を材料チップという。
【００２４】
図３は、本実施形態における測定チップの製造方法を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１において、例えば、通常の真空蒸着法によって透明誘電体に金薄膜を形成する。次に、ステップＳ２において、金薄膜の表面に付着した汚染物質（例えば、脂肪酸系の有機物等）をアセトンによって洗浄し、乾燥させる。次に、ステップＳ３において、分子蒸留方式を用いて金薄膜の上にポリスチレン薄膜を形成する。
【００２５】
ここで、ステップＳ３において分子蒸留方式を用いる理由を述べる。
本実施形態におけるように、ポリスチレン等のプラスチック薄膜を形成する場合には、プラズマ重合法のように材料が高温になる方法を用いることはできない。プラスチックをその熱分解温度以上に加熱すると、自発的解重合が起こって分解してしまうからである。また、熱分解温度より低い温度でも、薄膜を形成する基板等がプラスチックの場合には、基板が変形したり変質するおそれがある。そのため、基板等に薄膜を形成する際には、真空蒸着法が用いられることが多い。真空蒸着法は、基板等の温度を低温に保ったまま薄膜を形成することができるからである。しかしながら、実際に真空蒸着法を用いて薄膜を形成したところ、膜厚の均一な高分子膜が得られないことが判明した。これは、プラスチックの蒸着分子が、基板等に到達した際にその表面において再凝集するためと考えられる。一方、室温程度の環境において真空蒸着を行うと、蒸着分子が固形化せずにアモルファス状態となってしまい、実用性のある膜にならないことも判明した。これは、蒸着源と基板との距離が、例えば、３００ｍｍ程度離れているため、平均自由工程の長い低分子しか基板等に到達できないためと考えられる。
【００２６】
しかしながら、測定チップの表面（この場合には、ポリスチレン薄膜の表面）が揺らいでいると、ＳＰＲ測定の際に観測される暗線の反射角度が揺らぎのために変動してしまい、反応による暗線の変化との区別がつかなくなってしまう。従って、ＳＰＲ測定においては、このような測定チップを使用することはできない。
【００２７】
そこで、本実施形態においては、分子蒸留方式を用いて様々な条件の下で薄膜形成を行い、作製された蒸着膜の評価を行った。その結果、分子蒸留方式によれば、膜厚が均一なポリスチレン薄膜を形成することができることが明らかになった。
【００２８】
ここで、分子蒸留方式とは、一般に、１０^-4Ｔｏｒｒ以下の高真空において分子の蒸留を行い、薄膜材料の蒸発面と凝集面（基板面）との距離を、蒸気となっている分子の平均自由工程以下に近づけ、蒸発面から飛び出した分子を他の分子と衝突することなく凝集面に到達させる方法である。この分子蒸留方式は、特に、熱的に不安定な物質を蒸留する際に用いられており、例えば、脂溶性ビタミン類の濃縮や油脂の生成等のために広く利用されている。本実施形態は、この分子蒸留方式を疎水性薄膜の形成に応用したものである。
【００２９】
図４は、本実施形態において用いられる測定チップの製造装置（成膜装置）の断面図である。成膜装置２は、チップホルダ２１と、マスク２２と、蒸発皿２３と、チャンバ２４と、蒸着源加熱装置２５と、冷却液槽２６と、真空装置２７とを有している。
【００３０】
チップホルダ２１には、所定の大きさの空孔が形成されており、この空孔に材料チップ１７を保持する。材料チップ１７は、予め形成されている金属薄膜が蒸着皿２３の方向を向くように、チップホルダ２１に配置される。
マスク２２は、材料チップ１７の所定の位置にポリスチレン薄膜を形成するために用いられる。即ち、マスク２２は、材料チップ１７に形成されている金属薄膜を除く部分をマスクする。
【００３１】
蒸発皿２３には、蒸着源が配置される。
蒸着源加熱装置２５は、例えば、赤外線ランプによって構成され、蒸発皿２３を所定の温度まで加熱し、その温度に保つ。また、蒸着源加熱装置２５は、温度コントローラを有しており、蒸発皿２３が所定の温度以上に加熱されるのを防ぐ。
【００３２】
冷却液槽２６には、例えば、液体窒素、ドライアイス、冷却水等が注入されており、チップホルダ２１及び材料チップ１７を冷却する。
真空装置２６は、ターボポンプやロータリーポンプ等を含んでおり、チャンバ２４内を排気する。
【００３３】
ここで、図５は、図４に示す成膜装置の一部を示す斜視図である。チップホルダ２１は冷却液槽２６に接続されており、これにより、両者の間において効率良く熱が伝導する。このようなチップホルダ２１に形成されている空孔に、材料チップ１７が所定の向きに挿入され、さらに、マスク２２が配置され、固定具２８によって固定される。
【００３４】
本実施形態においては、以上において説明した製造装置を用いて、次のような条件の下で測定チップを作製し、その評価を行った。
まず、測定チップの作製における条件について説明する。
▲１▼蒸着源：重量平均分子量Ｍｗ≦１．１×１０⁴、且つ、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６のポリスチレンテロマー（Ｍｎは数平均分子量）
▲２▼真空度：１０^-2Ｔｏｒｒ
▲３▼蒸着距離（チップ〜蒸着源距離）：４０ｍｍ
▲４▼冷却液：液体窒素
▲５▼蒸着源温度：２００℃〜２５０℃
▲６▼蒸着時間：３分〜１０分
【００３５】
次に、蒸着源について説明する。分子蒸留を行っている際に、ほとんどの蒸発分子は、数個の分子によって構成されるクラスターとなっている。仮に、蒸着源として高分子であるポリスチレンを用いたとしても、長い分子鎖がそのまま空間に飛び出すことは不可能であり、蒸着可能な程度に分解されて飛来する。そこで、予め分子量の比較的小さい分子を多く含む原料を用いることにより、効率的に薄膜形成を行うことができる。この場合に、蒸着可能な分子量はＭｗ≦２０００、望ましくはＭｗ＜１５００である。
本実施形態においては、蒸着可能な分子量成分（Ｍｗ＜１５００）を２０〜３０％程度含むポリスチレンテロマーを合成し、これを蒸着原料として用いた。
【００３６】
次に、蒸着距離については、分子量１５００程度の分子の平均自由工程を５０ｍｍ程度とし、この程度の大きさの分子が、蒸発皿から材料チップに、他の分子と衝突することなく到達できる距離を想定して４０ｍｍに設定した。
【００３７】
本実施形態において、冷却液を用いて材料チップを冷却する理由は、次のとおりである。蒸発分子の末端はラジカル化されているために、蒸着面に到達した分子は再凝集しやすく、これが、蒸着面に均一に薄膜が形成されない原因のひとつになっている。そこで、材料チップを冷却することにより、蒸着面に到達した分子の再凝集を抑制している。
【００３８】
さらに、本実施形態においては、ポリスチレン薄膜の膜厚を制御するために、ポリスチレンの蒸発温度以上、且つ、ポリスチレンが変形及び変性しない範囲で蒸着源温度を変化させると共に、蒸着時間を変化させた。
【００３９】
このように作製された測定チップを、表面反射赤外線吸収スペクトル測定及びＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像の観察によって評価した。
まず、ポリスチレン薄膜が形成された測定チップに対して表面反射赤外線吸収スペクトル測定を行い、吸収スペクトルを観察することによりポリスチレン薄膜が形成されていることを確認すると共に、吸光バンド６９５ｃｍ^-1における吸光度を換算することにより、ポリスチレン薄膜の膜厚を求めた。図６は、ポリスチレン薄膜の形成において使用した条件と、それによって得られた薄膜の膜厚とを示す表である。また、図７は、比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない金薄膜に対して行った表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。
図６に示すように、蒸着温度２１０℃〜２５０℃の下では、概ね膜厚０．５ｎｍ〜６０ｎｍのポリスチレン薄膜を形成することができた。
【００４０】
図６に示す試料の中から、最も膜厚が薄くなった試料（４）、中程度の厚さとなった試料（２）、及び、最も膜厚が厚くなった試料（６）について、さらに詳しく検討した。
図８の（ａ）は、試料（４）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。試料（４）におけるポリスチレン薄膜の膜厚は、今回作製した中で膜厚が最も薄い０．５ｎｍ〜１ｎｍであった。しかしながら、図８の（ａ）の矢印に示すように、３０３０ｃｍ^-1付近において吸光バンドが観察されたことから、ベンゼン環のＣ−Ｈ収縮振動が起こっていることがわかる。これより、試料において、少なくとも部分的にはポリスチレンが蒸着していると考えられる。
【００４１】
図８の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（４）の表面を観察したＡＦＭ像である。図８の（ｂ）は、試料表面の堅さ（粘弾性）の情報、図８の（ｃ）は試料表面の高さの情報をそれぞれ示している。
図８の（ｂ）において、図中の矢印に示すように、金薄膜の凹凸が直接観察された。また、図８の（ｃ）の矢印に示す白い部分は、１０ｎｍ程度の高さを有する粒子状のものであり、ポリスチレンの凝集体と考えられる。これより、試料（４）の表面全体がポリスチレン薄膜によって覆われている可能性は小さい。
【００４２】
ポリスチレン薄膜において、膜厚１ｎｍ以下という長さは分子数個程度に相当する。このため、蒸着条件を最適化しても均一な蒸着層にならずに、蒸着分子が凝集して穴の空いた構造になると考えられる。
【００４３】
図９の（ａ）は、試料（２）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。試料（２）におけるポリスチレン薄膜の膜厚は、１６ｎｍ〜２０ｎｍであった。図９の（ａ）においては、図中の▲１▼〜▲３▼に示すように、３０３０ｃｍ^-1、３０６０ｃｍ^-1、３０８０ｃｍ^-1の３本の吸収バンドが観察された。これは、ベンゼン環のＣ−Ｈ伸縮振動の特徴であり、これらの吸収バンドは、試料（２）の他にも、１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度の膜厚を有する試料において観察された。
【００４４】
また、図９の（ａ）においては、図中の▲４▼及び▲５▼に示すように、吸収バンド２９３０ｃｍ^-1及び２８６０ｃｍ^-1における吸光度が大きくなっている。これは、ポリスチレン薄膜において主鎖のＣ−Ｈ伸縮振動が起こっていることを示している。さらに、これらの吸光度は、ベンゼン環の吸収バンドよりも大きい。これより、数１０ｎｍ程度の膜厚を有する試料においては、ベンゼン環が金薄膜の表面に向いており、主鎖が試料表面に向いているという選択的配向をしていると考えられる。
【００４５】
図９の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（２）の表面を観察したＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像である。図９の（ｂ）は、試料表面の堅さ（粘弾性）の情報、図９の（ｃ）は試料表面の高さの情報をそれぞれ示している。図９の（ｂ）及び（ｃ）においては、所々に金薄膜の凹凸が観察されるが、概ね全体に渡ってポリスチレン薄膜が形成されていると観察される。また、図９の（ｂ）において、矢印に示す白い部分は全て金粒子の上に形成されていることから、これらは金薄膜表面の中でも高い位置に蒸着された部分と考えられる。
【００４６】
図１０の（ａ）及び（ｂ）は、図９の（ｃ）の中央部分における断面を示している。図１０の（ａ）は、Ａ−Ｂ方向における断面、図１０の（ｂ）は、Ｃ−Ｄ方向における断面をそれぞれ示している。図１０の（ａ）及び（ｂ）においては、揺らぎの振幅が０．５ｎｍ程度、揺らぎの周期は１００ｎｍ〜２００ｎｍ程度になっている。このように、試料（２）においては、Ａ−Ｂ方向及びＣ−Ｄ方向の両方向において同程度の高さ揺らぎになっており、特に顕著な凹凸は観察されない。また、揺らぎの周期である１００ｎｍ〜２００ｎｍは、金粒子の径に相当するものである。これより、蒸着されたポリスチレン薄膜における揺らぎは、１ｎｍ程度であると考えられる。
【００４７】
図１１の（ａ）は、試料（６）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。試料（６）におけるポリスチレン薄膜の膜厚は、５０ｎｍ〜６０ｎｍであった。図１１の（ａ）に示すように、試料（６）程度の膜厚になると、ベンゼン環のＣ−Ｈ伸縮振動を表す吸光度と、主鎖のＣ−Ｈ伸縮振動を表す吸光度との相対強度がほぼ等しくなる。このことから、ポリスチレン薄膜においては、膜厚が数１０ｎｍ以上の厚さになると、金薄膜に対するポリスチレン分子の選択的な配向がなくなり、ランダムに積層すると考えられる。
【００４８】
図１１の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（６）の表面を観察したＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像である。図１１の（ｂ）は、試料表面の堅さ（粘弾性）の情報、図１１の（ｃ）は試料表面の高さの情報をそれぞれ示している。図１１の（ｂ）及び（ｃ）に示すように、試料表面において金薄膜の凹凸は観察されずに、全体がポリスチレン薄膜によって覆われている。また、図１１の（ｃ）に示すように、ポリスチレン薄膜の高さ揺らぎは１ｎｍ〜２ｎｍ程度であり、ほぼ均一な表面が形成されていることがわかる。
【００４９】
以上説明したように、分子蒸留方式を用い、最適な蒸着温度及び蒸着時間を設定することにより、金薄膜上に均一なポリスチレン薄膜を形成することが可能であることがわかった。
【００５０】
次に、このようにして作製された測定チップに、タンパク質を固定する実験を行った。実験は、金薄膜の上に膜厚２０ｎｍを有するポリスチレン薄膜が形成された測定チップを用い、図１２に示す手順によって行われた。また、比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない測定チップについても、同様の実験が行われた。
【００５１】
図１２は、この実験手順を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１１において、濃度５０μｇ／ｍｌのアビジン液１００μｌを測定チップに注入する。次に、ステップＳ１２において、バッファ液を用いて測定チップを洗浄する。
【００５２】
次に、ステップＳ１３において、ビオチンによって標識された濃度１μｇ／ｍｌのプロテインＡ（ビオチン化プロテインＡ）１００μｌを測定チップに注入する。これにより、多数の標識分子を含むアビジン・ビオチン複合体が形成される。さらに、ステップＳ１４において、バッファ液を用いて測定チップを洗浄する。
【００５３】
次に、ステップＳ１５において、バッファ液１００μｌを測定チップに注入してＳＰＲ測定を行う。ここで得られた信号値を信号Ｖ１とする。
ステップＳ１６において、バッファ液を取り除き、ステップＳ１７において、濃度の異なるＩｇＧ（免疫グロブリン）１００μｌを測定チップに注入する。この実験においては、ウサギ抗ＢＳＡ（bovine serum albumin）抗体を用いた。
【００５４】
ステップＳ１８において、バッファ液を用いて測定チップを洗浄し、ステップＳ１９において、バッファ液１００μｌを注入してＳＰＲ測定を行う。ここで得られた信号値を信号Ｖ２とする。
【００５５】
ステップＳ２０において、ステップＳ１５において得られた信号Ｖ１と、ステップＳ１９において得られた信号Ｖ２との差を求めることにより、信号ΔＶを算出する。この信号ΔＶが、ＳＰＲ測定におけるＳＰＲ信号を表す。
【００５６】
図１３は、このようにして行われた実験により得られた結果を示している。この実験においては、信号Ｖ１及びＶ２を得るとき以外にもステップＳ１１〜Ｓ１９にわたって随時ＳＰＲ測定を行い、それぞれのステップにおける信号値を得た。図１３の（ａ）は、それらの信号値の変化を示している。
【００５７】
図１３の（ａ）に示すように、ステップＳ１７においてＩｇＧを加えた際に、信号値が大きく変化していることから、プロテインＡとＩｇＧとが反応したと考えられる。さらに、ステップＳ１８においてバッファ液により洗浄した後も信号値があまり変化しないことから、プロテインＡは測定チップに固定されており、ＩｇＧはこのプロテインＡと反応していたことがわかる。
【００５８】
図１３の（ｂ）は、ステップＳ１７において注入したＩｇＧの濃度に対するＳＰＲ信号ΔＶの変化を示している。図１３の（ｂ）に示すように、ＳＰＲ信号ΔＶは、ＩｇＧの濃度に比例して大きくなっている。これは、ＩｇＧが十分に反応したことを示しており、測定チップにプロテインＡが良好に固定されていたことがわかる。
【００５９】
図１４は、比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない測定チップについて行った実験結果を示している。図１４の（ａ）は、ステップＳ１〜Ｓ１９にわたって随時行ったＳＰＲ測定の信号値の変化を示している。図１４の（ａ）に示すように、ステップＳ１７においてＩｇＧを加えた際に信号値の変化が見られたが、ステップＳ１８において測定チップを洗浄すると、信号値はステップＳ１７の前のレベルに戻っている。これより、測定チップにプロテインＡは固定されておらず、ステップＳ１７における信号値の変化は、単にＩｇＧを注入したために起こった変化である考えられる。
【００６０】
図１４の（ｂ）は、ステップＳ１７において注入したＩｇＧの濃度に対するＳＰＲ信号ΔＶの変化を示している。また、図１４の（ｂ）に示すように、ＳＰＲ信号ΔＶは、ＩｇＧの濃度に関わらずほぼ一定である。これにより、測定チップに、ＩｇＧと反応するプロテインＡが固定されていなかったことがわかる。
【００６１】
以上述べたように、本実施形態によれば、ＳＰＲ測定に用いられる測定チップにおいて、金属薄膜の上にポリスチレンを含むプラスチック等による疎水性薄膜を形成するので、センシング媒体であるタンパク質等を良好に固定することができる。また、分子蒸留法を用いることにより、そのような疎水性薄膜が均一に形成された測定チップを作製することができる。
【００６２】
本実施形態においては、形成された薄膜を安定化させるために、さらに再重合処理を行っても良い。この場合に、プラズマ重合法のように材料が高温になる方法は使用することができないので、測定チップに形成された薄膜に不活性ガスのイオンビーム、高速電子線、又は、Ｘ線等を照射する方法を用いる。或いは、成膜された測定チップを加熱しても良い。
【００６３】
また、本実施形態においては、蒸着源としてポリスチレンテロマーを用いたが、蒸着源としてポリスチレンモノマーを用い、測定チップに形成された薄膜に対して上記の方法により再重合しても良い。
【００６４】
さらに、本実施形態においては、蒸着膜の構造をより密にすると共に、化学的に安定化するため、蒸着中に飛来する分子の向きを制御し、材料チップにおける分子集合構造を制御しても良い。このためには、例えば、図４に示す成膜装置２において、蒸発皿２３付近に高周波コイルを設け、蒸発分子をイオン化して材料チップにイオンプレーティングしても良い。
【００６５】
次に、本発明の第２の実施形態に係る測定チップの製造方法について、図１５及び図１６を参照しながら説明する。本実施形態は、透明誘電体に形成された金属薄膜の上に、イオンビームスパッタ法を用いて疎水性薄膜を形成する方法である。
【００６６】
図１５は、本実施形態において用いられるイオンビームスパッタ装置を示す模式図である。このイオンビームスパッタ装置３は、真空セル３１を有しており、真空セル３１の内部には、ホルダ３２と、ターゲット３３と、マスク３４とが配置されている。ホルダ３２は、ポリスチレン薄膜が形成される材料チップ１７を所定の向きに保持する。また、ターゲット３３には、薄膜の材料となるポリスチレンが配置されている。さらに、マスク３４は、材料チップ１７の所定の位置にポリスチレン薄膜を形成するために用いられる。
【００６７】
また、このイオンビームスパッタ装置３は、ターゲットに向けてイオンを出射するイオンガン３５と、真空セル３１内の真空度を測定するピラニーゲージ３６及びイオンゲージ３７とを有している。イオンガン３５は、高周波の電磁波を発生させることによって希ガスをイオン化し、さらに、このイオンを高電圧で加速することによりターゲット３３に衝突させる。
【００６８】
さらに、このイオンビームスパッタ装置３は、真空セル３１の内部を排気するためのクライオポンプ３８と、吸着ポンプ３９と、ロータリーポンプ４０とを有している。ここで、クライオポンプ３８とは、極低温面を有し、これにセル内の気体分子を凝縮したり吸着することにより分子を捕捉して排気するポンプであり、これを用いることにより、セル内を超高真空にすることが可能である。
【００６９】
図１６は、本実施形態に係る測定チップの製造方法を示すフローチャートである。まず、ステップＳ３１において、材料チップ１７、ターゲット３３、及び、マスク３４を所定の位置に配置する。
【００７０】
次に、ステップＳ３２において、真空セル３１内を排気する。この際に、真空セル３１内の真空度を一端１０^-6Ｔｏｒｒ程度に下げた後に、アルゴンやキセノン等の希ガスを導入して１０^-3Ｔｏｒｒ程度にする。
次に、ステップＳ３３において、真空セルに１３．５６ＭＨｚ程度の高周波電力を印加する。これにより、真空セルに導入されている希ガスがイオン化される。
【００７１】
ステップＳ３４において、ターゲット３３側が負極、ホルダ３２側が正極となるように、両者間に直流バイアスをかける。このバイアスによって希ガスイオンが加速され、ターゲットに衝突する。この際に、ターゲットであるポリスチレンの高分子鎖が切断され、ターゲット分子（スチレン分子）がはじき出される。このターゲット分子の切断部はラジカル化されており、ターゲット分子は、ラジカル状態のまま材料チップ１７に到達する。材料チップ１７に到達したターゲット分子は、ラジカル重合に近いプロセスにより、短い分子鎖で互いに再重合する。これにより、材料チップ１７にポリスチレン薄膜が形成される。このように形成されたポリスチレン薄膜は、架橋構造を有しており、安定な性質を示す。
【００７２】
ここで、ポリスチレン薄膜の膜厚は、印加する高周波電力や真空セル内に導入する希ガスのガス圧及び流量を設定し、スパッタ時間を変えることによって制御することができる。
【００７３】
本実施形態におけるようなイオンビームスパッタ法によれば、通常の高周波スパッタ法と異なり、イオンガンからＡｒ⁺等のイオンビームをターゲットに向けて照射して高分子をはじき出すので、多量のラジカルは生成されない。このため、成膜後にラジカルを除去する工程が不要であり、ほとんどラジカルがない薄膜を形成することができる。
本実施形態においては、ターゲットにイオンビームを照射したが、高速電子線やＸ線等を照射しても良い。この場合には、ターゲットにおけるチャージアップの問題も解決される。
【００７４】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、ＳＰＲ測定に用いられる測定チップに疎水性薄膜を形成するので、タンパク質、グリコタンパク、リボタンパク、ポリサッカライド等の疎水性部位を有する種々の高分子材料を疎水結合により良好に固定することができる。これより、タンパク質同士の相互作用や、タンパク質と他の化合物との相互作用等の解析を広く行うことができ、多種多様な物質をＳＰＲ測定によって検出可能になる可能性がある。特に、疎水性薄膜材料としてポリスチレンを用いる場合には、例えば、ＥＬＩＳＡ法において既知の抗原（タンパク質）固定法をそのまま応用することができる。これにより、新薬を開発する場合等において、抗原抗体反応に対してその反応を阻害する低分子化合物を探索する際に、新たなタンパク質固定法やその信頼性の試験を行うための開発期間が不要になり、創薬開発期間を大幅に短縮することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る測定チップを示す断面図である。
【図２】図１に示す測定チップを用いてＳＰＲ測定を行う様子を示す模式図である。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法を示すフローチャートである。
【図４】本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法において用いられる測定チップ製造装置（成膜装置）を示す断面図である。
【図５】図４に示す成膜装置の一部を示す斜視図である。
【図６】本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法を用い、製造条件を変えて測定チップを作製した場合の製造条件とその条件の下で作製された測定チップの膜厚を示す表である。
【図７】金薄膜について測定した表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図８】図８の（ａ）は、図６に示す試料（４）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図であり、図８の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（４）のＡＦＭ撮像写真である。
【図９】図９の（ａ）は、図６に示す試料（２）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図であり、図９の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（２）のＡＦＭ撮像写真である。
【図１０】図９の（ｃ）に示す試料における表面揺らぎを測定した結果を示す断面図である。
【図１１】図１１の（ａ）は、図６に示す試料（６）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図であり、図１１の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（６）のＡＦＭ撮像写真である。
【図１２】本発明の一実施形態に係る測定チップを評価するための実験手順を示すフローチャートである。
【図１３】本発明の一実施形態に係る測定チップについて行った実験結果を示す図である。
【図１４】比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない測定チップについて行った実験結果を示す図である。
【図１５】本発明の第２の実施形態に係る測定チップの製造方法において用いられる測定チップの製造装置を示す模式図である。
【図１６】本発明の第２の実施形態に係る測定チップの製造方法を示すフローチャートである。
【図１７】ＳＰＲ測定の原理を説明するための図である。
【符号の説明】
１ 測定チップ
２、３ 測定チップ製造装置（成膜装置）
１０、１０１ 透明誘電体
１１、１０２ 金属薄膜（金薄膜）
１２ 疎水性薄膜（ポリスチレン薄膜）
１３ 空孔
１４ タンパク質
１５、１０４ 光源
１６、１０６ 光検出器
１７ 材料チップ
２１ チップホルダ
２２ マスク
２３ 蒸発皿
２４ チャンバ
２５ 蒸着源加熱装置
２６ 冷却液槽
２７ 真空装置
２８ 固定具
３１ 真空セル
３２ ホルダ
３３ ターゲット
３４ マスク
３５ イオンガン
３６ ピラニーゲージ
３７ イオンゲージ
３８ クライオポンプ
３９ 吸着ポンプ
４０ ロータリーポンプ
１０３ 試料
１０５ レンズ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a measuring chip used for surface plasmon resonance (SPR) measurement and a method for manufacturing the same.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, a method for quantitatively analyzing a substance in a sample using total reflection attenuation is known, and in particular, surface plasmon resonance (SPR) measurement is widely used as a biosensor for detecting proteins and the like. .
FIG. 17 is a diagram for explaining the principle of SPR measurement. A metal thin film 102 is formed on the surface of the prism 101 by vapor deposition or the like. Furthermore, a sample 103 containing a substance to be detected is placed on the metal thin film 102.
[0003]
The light L1 is incident on the prism 101 at various incident angles so that the total reflection condition is satisfied at the interface between the transparent dielectric of the prism 101 and the metal thin film 102. Here, in order to make the light L1 enter the prism 101 at various incident angles, a thin light beam may be incident on the prism 101 while being deflected, or a thick light beam is converged on the prism 101. It may be incident. In FIG. 17, the light emitted from the light source 104 is converged by the lens 105 and is incident on the prism 101.
[0004]
When the light L1 is incident on the metal thin film 102 at an incident angle greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the sample 103 in contact with the metal thin film 102. By this evanescent wave, surface plasmon is excited at the interface between the metal thin film 102 and the sample 103. At this time, when wave number matching is established between the evanescent wave and the surface plasmon, a resonance state is established, and the energy of the evanescent wave is transferred to the surface plasmon. As a result, a specific incident angle θ is formed at the interface between the prism 101 and the metal thin film 102. ₀ The intensity of the light that is incident and totally reflected is sharply reduced. Such a decrease in light intensity is detected by the photodetector 106 as a dark line in the reflected light L2. Note that such surface plasmon resonance occurs when the incident light is p-polarized light, and is thus set in advance so that the incident light L1 becomes p-polarized light.
[0005]
Wave number k of surface plasmon _SP Is determined by the following equation: Where the wave number of the surface plasmon is k _SP , The wave number of light in vacuum ₀ , The dielectric constant of the metal ε _M , The dielectric constant of the sample ε _S And
[Expression 1]

The wave number k of the evanescent wave _E Is given by: Here, the refractive index of the prism is n ₀ The incident angle is θ.
k _E = K ₀ n ₀ sin θ (2)
[0006]
Wave number k of evanescent wave _E And wave number k of surface plasmon _SP Are incident angles such that ₀ , Surface plasmon resonance occurs and total reflection attenuation occurs. Therefore, the incident angle θ at which total reflection attenuation occurs ₀ By observing the above, the dielectric constant ε when total reflection attenuation occurs based on the equations (1) and (2) _S Can be calculated. Furthermore, this dielectric constant ε _S Therefore, the concentration of the substance to be detected in the sample can be obtained by using a calibration curve or the like.
[0007]
In order to apply SPR measurement to a biosensor, for example, a medium (hereinafter referred to as “sensing medium”) that causes a specific reaction with a substance to be detected is fixed on the metal thin film 102. The specific reaction is, for example, an antigen-antibody reaction, and when detecting an antigen contained in a sample, an antibody against the antigen is used as a sensing medium. When a sample containing a substance to be detected is placed on the sensing medium, an antigen-antibody reaction corresponding to the concentration of the antigen contained in the sample occurs on the metal thin film 102. Thereby, since the refractive index of the sample 103 changes, the wave number of the surface plasmon generated at the interface between the metal thin film 102 and the sample 103 changes. Accordingly, the incident angle θ at which surface plasmon resonance as described above occurs ₀ And its reflection angle changes. Therefore, the concentration of the specific substance in the sample can be indirectly measured by detecting the change in the position (angle) of the dark line by the photodetector 8.
[0008]
In such SPR measurement, how the sensing medium is fixed on the metal thin film 102 is related to the sensitivity of the SPR measurement. Here, Japanese Patent Application Publication (JP-A) No. 11-2111728 discloses hemoglobin A immobilized on a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor. ₁ As a means for the antibody to bind firmly and easily to the metal film, hemoglobin A is formed on the metal film by hydrophobic bonding or electrostatic bonding. ₁ Immobilizing antibodies is disclosed.
[0009]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-39401 discloses a surface plasmon resonance biosensor capable of obtaining good sensitivity even when a small amount of physiologically active substance is immobilized by immobilizing the physiologically active substance via a plasma polymerized membrane. , A method for manufacturing the measurement cell, and a surface plasmon resonance biosensor using the measurement cell are disclosed. In this document, the measurement cell has a plasma polymerization film formed on a metal film. However, since the monomer raw material is subjected to high temperature (about 200 ° C.) when plasma polymerization is performed, a material that is deformed or deteriorated by heat such as plastic cannot be used as a base material. In addition, the plasma polymerized film is a polymer film that is three-dimensionally crosslinked at high density, and is not suitable for SPR measurement because of its irregular structure, low optical characteristics, and large refractive index fluctuation.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, in view of the above points, an object of the present invention is to provide a measurement chip used for SPR measurement and the like, which can fix various kinds of proteins and is optically stable. . Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing such a measuring chip.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-described problems, a measurement chip according to the present invention is a measurement chip used in measurement using total reflection attenuation, and includes a dielectric having light transmittance and a metal formed on the dielectric. A thin film and a hydrophobic thin film formed so as to cover the metal thin film.
[0012]
A manufacturing method of a measuring chip according to the first aspect of the present invention is a manufacturing method of a measuring chip used in measurement using total reflection attenuation, and forms a metal thin film on a light-transmitting dielectric. Step (a) and Step (b) of forming a hydrophobic thin film so as to cover the metal thin film formed in Step (a) using a molecular distillation method.
[0013]
Furthermore, a manufacturing method of a measuring chip according to a second aspect of the present invention is a manufacturing method of a measuring chip used in measurement using total reflection attenuation, and forms a metal thin film on a light-transmitting dielectric. A step (a) and a step (b) of forming a hydrophobic thin film so as to cover the metal thin film formed in the step (a) by using an ion beam sputtering method.
[0014]
According to the present invention, a hydrophobic thin film is formed on the metal thin film of the measurement chip, so that various types of proteins can be immobilized, and a stable measurement chip with high optical characteristics can be realized. In addition, since a molecular distillation method or the like is used, a measurement chip in which a hydrophobic thin film is uniformly formed can be manufactured.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The same constituent elements are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
FIG. 1 is a cross-sectional view showing a measuring chip according to an embodiment of the present invention. The measuring chip 1 includes a light-transmitting dielectric (hereinafter referred to as a transparent dielectric) 10, a metal thin film 11, and a hydrophobic thin film 12. When the measurement chip 1 is used for SPR measurement, a sensing medium is fixed on the hydrophobic thin film 12, and a sample containing a substance to be detected such as protein is disposed thereon.
[0016]
The transparent dielectric 10 has a quadrangular pyramid shape, and a hole 13 in which a sample is arranged is formed on the upper surface thereof. The shape of the transparent dielectric 10 is not limited to a quadrangular pyramid, and for example, a transparent dielectric having various shapes such as other pyramids, a truncated cone, a prism, a cylinder, and a flat plate can be used.
[0017]
The transparent dielectric 10 is made of a transparent plastic containing polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, amorphous polyolefin, or cycloolefin, glass, or the like.
[0018]
A metal thin film 11 is formed on the inner bottom surface of the hole 13 of the transparent dielectric 10. For example, gold or aluminum is used as the metal thin film 11, and gold is used in the present embodiment. The metal thin film 11 is formed, for example, by vapor deposition.
[0019]
A hydrophobic thin film 12 is formed on the metal thin film 11. Here, the sensing medium fixed to the metal thin film in the SPR measurement is, for example, a protein, glycoprotein, riboprotein, polysaccharide, etc., and these have many hydrophobic sites in the molecule. For this reason, if the metal surface formed on the measuring chip is made hydrophobic, it is possible to stably fix many kinds of proteins. Therefore, in the present embodiment, the metal thin film 11 is covered using a hydrophobic surface material.
[0020]
As the hydrophobic thin film 12, for example, a plastic material containing polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polypropylene, polyphenylene sulfide, polyvinylidene fluoride, polyvinyl chloride, polycycloolefin, polymethyl methacrylate (PMMA), or the like is used. . In particular, since polystyrene is widely used in inspection methods such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), when polystyrene is used as the material of the hydrophobic thin film 12, an existing binding protocol or the like is used. be able to.
[0021]
The hydrophobic thin film 12 has a thickness of about 1 nm to 100 nm, preferably about 1 nm to 50 nm. The S / N ratio of the signal detected by the SPR measurement attenuates exponentially with respect to the distance between the metal surface and the sample, that is, the thickness of the hydrophobic thin film 12. For this reason, when the molecular weight of the protein to be detected is small, or when the detection target is extremely small, the film thickness is reduced to, for example, about 1 nm to 5 nm in order to increase the SN ratio. On the other hand, when the molecular weight of the protein to be detected is large, when the amount of detection is large, or when the film is distorted due to incubation by high heat or the like, the film thickness is increased to about 5 nm to 50 nm, for example. . However, if the thickness of the hydrophobic thin film 12 is greater than 100 nm, a necessary signal-to-noise ratio cannot be obtained in the detection signal, which is not practical. Therefore, in the present embodiment, the thickness of the hydrophobic thin film 12 is set to 100 nm or less.
[0022]
FIG. 2 is a schematic diagram showing a state in which the measurement chip according to the present embodiment is used. On the hydrophobic thin film 12 formed on the measurement chip 1, a sensing medium (protein) 14 is fixed in advance by hydrophobic bonding, and a sample containing a substance to be detected is arranged. Thereby, for example, an antigen-antibody reaction occurs between the sensing medium and the substance to be detected, and the refractive index of the sample changes compared to before the reaction. The light L1 generated from the light source 15 is incident on the measurement chip 1 so as to satisfy the total reflection condition at the interface between the transparent dielectric 10 and the gold thin film 11. Thereby, surface plasmon is excited between the gold thin film 11 and the protein 14, and total reflection attenuation occurs in the reflected light L2. The reflected light L2 is detected by the photodetector 16, and the concentration of the substance to be detected contained in the sample can be obtained by using a calibration curve or the like based on the detection signal.
[0023]
Next, a method for manufacturing a measurement chip according to the first embodiment of the present invention will be described. According to the manufacturing method according to the present embodiment, the hydrophobic thin film is formed on the metal thin film formed on the transparent dielectric using the molecular distillation method. In this embodiment, gold is used as the material for the metal thin film, and polystyrene is used as the material for the hydrophobic thin film. In the following, the transparent dielectric on which the gold thin film is formed is referred to as a material chip.
[0024]
FIG. 3 is a flowchart showing a method for manufacturing a measurement chip in the present embodiment. First, in step S1, a gold thin film is formed on a transparent dielectric by, for example, a normal vacuum deposition method. Next, in step S2, contaminants (for example, fatty acid organic substances) adhering to the surface of the gold thin film are washed with acetone and dried. Next, in step S3, a polystyrene thin film is formed on the gold thin film using a molecular distillation method.
[0025]
Here, the reason why the molecular distillation method is used in step S3 will be described.
When a plastic thin film such as polystyrene is formed as in the present embodiment, a method in which the material becomes high temperature like the plasma polymerization method cannot be used. This is because when a plastic is heated to a temperature higher than its thermal decomposition temperature, spontaneous depolymerization occurs and decomposes. Further, even when the temperature is lower than the thermal decomposition temperature, if the substrate or the like on which the thin film is formed is plastic, the substrate may be deformed or deteriorated. Therefore, vacuum deposition is often used when forming a thin film on a substrate or the like. This is because the vacuum deposition method can form a thin film while keeping the temperature of the substrate or the like at a low temperature. However, when a thin film was actually formed using a vacuum deposition method, it was found that a polymer film having a uniform film thickness could not be obtained. This is presumably because the plastic vapor deposition molecules re-aggregate on the surface when they reach the substrate or the like. On the other hand, it has also been found that when vacuum deposition is performed in an environment of about room temperature, the deposited molecules do not solidify and become an amorphous state, which does not result in a practical film. This is considered because the distance between the vapor deposition source and the substrate is, for example, about 300 mm, so that only low molecules having a long mean free path can reach the substrate.
[0026]
However, if the surface of the measuring chip (in this case, the surface of the polystyrene thin film) is fluctuating, the reflection angle of the dark line observed during the SPR measurement fluctuates due to fluctuation, and the change of the dark line due to the reaction. Can no longer be distinguished. Therefore, such a measuring chip cannot be used in SPR measurement.
[0027]
Therefore, in the present embodiment, a thin film was formed under various conditions using a molecular distillation method, and the produced deposited film was evaluated. As a result, it became clear that according to the molecular distillation method, a polystyrene thin film having a uniform film thickness can be formed.
[0028]
Here, the molecular distillation method is generally 10 ^-Four Molecules are distilled in a high vacuum of Torr or less, the distance between the evaporation surface and the aggregation surface (substrate surface) of the thin film material is brought close to the average free process of the molecules that are vapor, and the molecules that jump out of the evaporation surface are removed. This is a method of reaching the aggregation surface without colliding with other molecules. This molecular distillation method is used particularly when distilling a thermally unstable substance, and is widely used, for example, for the concentration of fat-soluble vitamins and the production of fats and oils. In the present embodiment, this molecular distillation method is applied to the formation of a hydrophobic thin film.
[0029]
FIG. 4 is a cross-sectional view of a measuring chip manufacturing apparatus (film forming apparatus) used in this embodiment. The film forming apparatus 2 includes a chip holder 21, a mask 22, an evaporating dish 23, a chamber 24, a vapor deposition source heating apparatus 25, a cooling liquid tank 26, and a vacuum apparatus 27.
[0030]
A hole having a predetermined size is formed in the chip holder 21, and the material chip 17 is held in the hole. The material chip 17 is arranged in the chip holder 21 so that a metal thin film formed in advance faces the direction of the vapor deposition dish 23.
The mask 22 is used to form a polystyrene thin film at a predetermined position on the material chip 17. That is, the mask 22 masks a portion excluding the metal thin film formed on the material chip 17.
[0031]
A vapor deposition source is disposed on the evaporating dish 23.
The vapor deposition source heating device 25 is constituted by, for example, an infrared lamp, and heats the evaporating dish 23 to a predetermined temperature and maintains the temperature. Moreover, the vapor deposition source heating device 25 has a temperature controller, and prevents the evaporating dish 23 from being heated to a predetermined temperature or higher.
[0032]
For example, liquid nitrogen, dry ice, cooling water, or the like is injected into the cooling liquid tank 26 to cool the chip holder 21 and the material chip 17.
The vacuum device 26 includes a turbo pump, a rotary pump, and the like, and exhausts the inside of the chamber 24.
[0033]
Here, FIG. 5 is a perspective view showing a part of the film forming apparatus shown in FIG. The chip holder 21 is connected to the coolant tank 26, whereby heat is efficiently conducted between the two. The material chip 17 is inserted into the hole formed in the chip holder 21 in a predetermined direction, and the mask 22 is arranged and fixed by the fixture 28.
[0034]
In the present embodiment, using the manufacturing apparatus described above, a measurement chip was produced under the following conditions and evaluated.
First, conditions for manufacturing a measurement chip will be described.
(1) Deposition source: weight average molecular weight Mw ≦ 1.1 × 10 ^Four And a polystyrene telomer having a molecular weight distribution Mw / Mn = 1.6 (Mn is a number average molecular weight)
(2) Degree of vacuum: 10 ^-2 Torr
(3) Deposition distance (chip-deposition source distance): 40 mm
(4) Coolant: Liquid nitrogen
(5) Deposition source temperature: 200 ° C to 250 ° C
(6) Deposition time: 3-10 minutes
[0035]
Next, the vapor deposition source will be described. When performing molecular distillation, most of the evaporated molecules are clustered by several molecules. Even if polystyrene, which is a polymer, is used as a vapor deposition source, it is impossible for a long molecular chain to jump out into the space as it is, and it is decomposed to the extent that vapor deposition is possible. Therefore, the thin film can be efficiently formed by using a raw material containing a large number of molecules having a relatively small molecular weight in advance. In this case, the molecular weight that can be deposited is Mw ≦ 2000, preferably Mw <1500.
In the present embodiment, a polystyrene telomer containing about 20 to 30% of a molecular weight component (Mw <1500) that can be deposited is synthesized and used as a deposition raw material.
[0036]
Next, regarding the deposition distance, the mean free path of molecules having a molecular weight of about 1500 is set to about 50 mm, and the distance that a molecule of this size can reach the material chip from the evaporating dish without colliding with other molecules. Assuming it was set to 40 mm.
[0037]
In the present embodiment, the reason for cooling the material chip using the cooling liquid is as follows. Since the ends of the evaporated molecules are radicalized, the molecules that have reached the vapor deposition surface are likely to re-aggregate, which is one of the reasons why a thin film is not uniformly formed on the vapor deposition surface. Therefore, the material chip is cooled to suppress reaggregation of molecules that have reached the vapor deposition surface.
[0038]
Furthermore, in this embodiment, in order to control the film thickness of the polystyrene thin film, the deposition source temperature is changed and the deposition time is changed within a range not lower than the evaporation temperature of polystyrene and in the range where the polystyrene is not deformed or modified.
[0039]
The measurement chip thus prepared was evaluated by measuring the surface reflection infrared absorption spectrum and observing an AFM (atomic force microscope) image.
First, the surface reflection infrared absorption spectrum measurement is performed on the measurement chip on which the polystyrene thin film is formed, and it is confirmed that the polystyrene thin film is formed by observing the absorption spectrum, and the absorption band is 695 cm. ^-1 The film thickness of the polystyrene thin film was determined by converting the absorbance at. FIG. 6 is a table showing the conditions used in forming the polystyrene thin film and the film thickness of the thin film obtained thereby. Moreover, FIG. 7 has shown the surface reflection infrared absorption spectrum performed with respect to the gold thin film in which the polystyrene thin film is not formed for the comparison.
As shown in FIG. 6, a polystyrene thin film having a film thickness of approximately 0.5 nm to 60 nm could be formed at a deposition temperature of 210 ° C. to 250 ° C.
[0040]
Among the samples shown in FIG. 6, the sample (4) with the smallest film thickness, the sample (2) with the medium thickness, and the sample (6) with the largest film thickness are described in more detail. investigated.
FIG. 8A shows a surface reflection infrared absorption spectrum of the sample (4). The film thickness of the polystyrene thin film in the sample (4) was 0.5 nm to 1 nm, the thinnest film thickness produced this time. However, as shown by the arrow in FIG. ^-1 Since an absorption band was observed in the vicinity, it can be understood that C—H contraction vibration of the benzene ring occurred. From this, it is considered that polystyrene is deposited at least partially in the sample.
[0041]
FIGS. 8B and 8C are AFM images obtained by observing the surface of the sample (4). 8B shows information on the hardness (viscoelasticity) of the sample surface, and FIG. 8C shows information on the height of the sample surface.
In (b) of FIG. 8, as shown by the arrows in the figure, the unevenness of the gold thin film was directly observed. Moreover, the white part shown by the arrow of (c) of FIG. 8 is a particulate thing which has a height of about 10 nm, and is considered to be an aggregate of polystyrene. Thus, the possibility that the entire surface of the sample (4) is covered with the polystyrene thin film is small.
[0042]
In the polystyrene thin film, the length of 1 nm or less corresponds to about several molecules. For this reason, it is considered that even if the vapor deposition conditions are optimized, a uniform vapor deposition layer is not obtained, but vapor deposition molecules aggregate to form a holed structure.
[0043]
(A) of FIG. 9 has shown the surface reflection infrared absorption spectrum of the sample (2). The film thickness of the polystyrene thin film in the sample (2) was 16 nm to 20 nm. In (a) of FIG. 9, as shown in (1) to (3) in the figure, 3030 cm. ^-1 3060cm ^-1 , 3080cm ^-1 These three absorption bands were observed. This is a characteristic of the C—H stretching vibration of the benzene ring, and these absorption bands were observed in a sample having a film thickness of about 10 nm to 20 nm in addition to the sample (2).
[0044]
Further, in FIG. 9A, as shown in (4) and (5) in the figure, an absorption band of 2930 cm ^-1 And 2860 cm ^-1 The absorbance at has increased. This indicates that C—H stretching vibration of the main chain occurs in the polystyrene thin film. Furthermore, these absorbances are greater than the absorption band of the benzene ring. From this, in the sample having a film thickness of about several tens of nanometers, it is considered that the benzene ring is directed to the surface of the gold thin film and the main chain is directed to the sample surface.
[0045]
(B) and (c) in FIG. 9 are AFM (atomic force microscope) images obtained by observing the surface of the sample (2). FIG. 9B shows information on the hardness (viscoelasticity) of the sample surface, and FIG. 9C shows information on the height of the sample surface. In (b) and (c) of FIG. 9, the unevenness of the gold thin film is observed in some places, but it is observed that the polystyrene thin film is formed almost entirely. Further, in FIG. 9B, since the white portions indicated by the arrows are all formed on the gold particles, these are considered to be portions deposited at a high position on the gold thin film surface.
[0046]
(A) and (b) of FIG. 10 have shown the cross section in the center part of (c) of FIG. 10A shows a cross section in the AB direction, and FIG. 10B shows a cross section in the CD direction. 10A and 10B, the amplitude of fluctuation is about 0.5 nm, and the period of fluctuation is about 100 nm to 200 nm. Thus, in the sample (2), the height fluctuations are approximately the same in both the AB direction and the CD direction, and no particularly unevenness is observed. The fluctuation period of 100 nm to 200 nm corresponds to the diameter of the gold particles. From this, it is considered that the fluctuation in the deposited polystyrene thin film is about 1 nm.
[0047]
(A) of FIG. 11 has shown the surface reflection infrared absorption spectrum of the sample (6). The film thickness of the polystyrene thin film in the sample (6) was 50 nm to 60 nm. As shown in FIG. 11A, when the film thickness is about the sample (6), the relative intensity between the absorbance representing the CH stretching vibration of the benzene ring and the absorbance representing the CH stretching vibration of the main chain. Are almost equal. From this, in the polystyrene thin film, when the film thickness is several tens of nm or more, the selective orientation of the polystyrene molecules with respect to the gold thin film is lost, and it is considered that they are laminated at random.
[0048]
(B) and (c) in FIG. 11 are AFM (atomic force microscope) images obtained by observing the surface of the sample (6). FIG. 11B shows information on the hardness (viscoelasticity) of the sample surface, and FIG. 11C shows information on the height of the sample surface. As shown in FIGS. 11B and 11C, the unevenness of the gold thin film is not observed on the sample surface, and the whole is covered with the polystyrene thin film. Further, as shown in FIG. 11C, the height fluctuation of the polystyrene thin film is about 1 nm to 2 nm, and it can be seen that a substantially uniform surface is formed.
[0049]
As described above, it has been found that a uniform polystyrene thin film can be formed on a gold thin film by using a molecular distillation method and setting an optimal vapor deposition temperature and vapor deposition time.
[0050]
Next, an experiment was carried out in which the protein was immobilized on the measurement chip thus prepared. The experiment was performed according to the procedure shown in FIG. 12 using a measuring chip in which a polystyrene thin film having a film thickness of 20 nm was formed on a gold thin film. For comparison, a similar experiment was performed on a measurement chip on which no polystyrene thin film was formed.
[0051]
FIG. 12 is a flowchart showing this experimental procedure. First, in step S11, 100 μl of avidin solution having a concentration of 50 μg / ml is injected into the measuring chip. Next, in step S12, the measurement chip is washed using a buffer solution.
[0052]
Next, in step S13, 100 μl of protein A (biotinylated protein A) labeled with biotin at a concentration of 1 μg / ml is injected into the measurement chip. As a result, an avidin / biotin complex containing a large number of labeled molecules is formed. Further, in step S14, the measurement chip is washed with the buffer solution.
[0053]
Next, in step S15, 100 μl of buffer solution is injected into the measurement chip to perform SPR measurement. The signal value obtained here is defined as a signal V1.
In step S16, the buffer solution is removed, and in step S17, 100 μl of IgG (immunoglobulin) having a different concentration is injected into the measurement chip. In this experiment, a rabbit anti-BSA (bovine serum albumin) antibody was used.
[0054]
In step S18, the measurement chip is washed with the buffer solution, and in step S19, 100 μl of the buffer solution is injected to perform SPR measurement. The signal value obtained here is defined as a signal V2.
[0055]
In step S20, the signal ΔV is calculated by obtaining the difference between the signal V1 obtained in step S15 and the signal V2 obtained in step S19. This signal ΔV represents the SPR signal in the SPR measurement.
[0056]
FIG. 13 shows the results obtained from the experiments thus performed. In this experiment, SPR measurement was performed as needed over steps S11 to S19 in addition to obtaining the signals V1 and V2, and the signal values in the respective steps were obtained. FIG. 13A shows changes in the signal values.
[0057]
As shown to (a) of FIG. 13, when IgG was added in step S17, since the signal value has changed a lot, it is thought that protein A and IgG reacted. Furthermore, since the signal value does not change much even after washing with the buffer solution in step S18, it can be seen that protein A is immobilized on the measurement chip and IgG has reacted with protein A.
[0058]
FIG. 13B shows the change of the SPR signal ΔV with respect to the concentration of IgG injected in step S17. As shown in FIG. 13B, the SPR signal ΔV increases in proportion to the IgG concentration. This indicates that IgG has sufficiently reacted, and it can be seen that protein A was well immobilized on the measurement chip.
[0059]
FIG. 14 shows the result of an experiment performed on a measurement chip on which a polystyrene thin film is not formed for comparison. (A) of FIG. 14 has shown the change of the signal value of the SPR measurement performed at any time over step S1-S19. As shown in FIG. 14A, a change in signal value was observed when IgG was added in step S17. However, when the measurement chip was washed in step S18, the signal value returned to the level before step S17. ing. Thus, protein A is not fixed to the measurement chip, and the change in the signal value in step S17 is considered to be a change that occurs because the IgG is simply injected.
[0060]
FIG. 14B shows a change in the SPR signal ΔV with respect to the concentration of IgG injected in step S17. As shown in FIG. 14B, the SPR signal ΔV is substantially constant regardless of the IgG concentration. Thereby, it turns out that protein A which reacts with IgG was not fixed to the measurement chip.
[0061]
As described above, according to the present embodiment, in the measurement chip used for SPR measurement, a hydrophobic thin film made of plastic containing polystyrene or the like is formed on the metal thin film, so that the protein that is the sensing medium is excellent. Can be fixed. Further, by using the molecular distillation method, a measuring chip in which such a hydrophobic thin film is uniformly formed can be produced.
[0062]
In the present embodiment, a repolymerization process may be further performed in order to stabilize the formed thin film. In this case, a method of raising the temperature of the material like the plasma polymerization method cannot be used, so that the thin film formed on the measurement chip is irradiated with an inert gas ion beam, a high-speed electron beam, or X-rays. The method to be used is used. Alternatively, the formed measurement chip may be heated.
[0063]
In this embodiment, polystyrene telomer is used as the vapor deposition source, but polystyrene monomer may be used as the vapor deposition source, and the thin film formed on the measurement chip may be repolymerized by the above method.
[0064]
Furthermore, in this embodiment, in order to make the structure of the vapor deposition film denser and chemically stabilized, the direction of molecules flying during vapor deposition is controlled, and the molecular assembly structure in the material chip is controlled. good. For this purpose, for example, in the film forming apparatus 2 shown in FIG. 4, a high frequency coil may be provided in the vicinity of the evaporating dish 23, and the evaporated molecules may be ionized and ion-plated on the material chip.
[0065]
Next, a method for manufacturing a measuring chip according to the second embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. The present embodiment is a method of forming a hydrophobic thin film on a metal thin film formed on a transparent dielectric using an ion beam sputtering method.
[0066]
FIG. 15 is a schematic diagram showing an ion beam sputtering apparatus used in the present embodiment. The ion beam sputtering apparatus 3 includes a vacuum cell 31, and a holder 32, a target 33, and a mask 34 are disposed inside the vacuum cell 31. The holder 32 holds the material chip 17 on which the polystyrene thin film is formed in a predetermined direction. The target 33 is provided with polystyrene as a thin film material. Further, the mask 34 is used to form a polystyrene thin film at a predetermined position of the material chip 17.
[0067]
The ion beam sputtering apparatus 3 includes an ion gun 35 that emits ions toward the target, and a Pirani gauge 36 and an ion gauge 37 that measure the degree of vacuum in the vacuum cell 31. The ion gun 35 ionizes a rare gas by generating a high-frequency electromagnetic wave, and further collides with the target 33 by accelerating the ions with a high voltage.
[0068]
The ion beam sputtering apparatus 3 further includes a cryopump 38 for exhausting the inside of the vacuum cell 31, an adsorption pump 39, and a rotary pump 40. Here, the cryopump 38 is a pump that has a cryogenic surface and traps and exhausts molecules by condensing or adsorbing gas molecules in the cell. Can be made into an ultra-high vacuum.
[0069]
FIG. 16 is a flowchart showing a method for manufacturing a measurement chip according to the present embodiment. First, in step S31, the material chip 17, the target 33, and the mask 34 are arranged at predetermined positions.
[0070]
Next, in step S32, the inside of the vacuum cell 31 is evacuated. At this time, the degree of vacuum in the vacuum cell 31 is set to one end 10. ^-6 After lowering to about Torr, a rare gas such as argon or xenon is introduced and 10 ^-3 Set to about Torr.
Next, in step S33, high frequency power of about 13.56 MHz is applied to the vacuum cell. Thereby, the noble gas introduced into the vacuum cell is ionized.
[0071]
In step S34, a DC bias is applied between the two so that the target 33 side is a negative electrode and the holder 32 side is a positive electrode. This bias accelerates rare gas ions and collides with the target. At this time, the polymer chain of polystyrene as a target is cut, and target molecules (styrene molecules) are ejected. The cut part of the target molecule is radicalized, and the target molecule reaches the material chip 17 in a radical state. The target molecules that have reached the material chip 17 are re-polymerized with each other with a short molecular chain by a process close to radical polymerization. As a result, a polystyrene thin film is formed on the material chip 17. The polystyrene thin film thus formed has a crosslinked structure and exhibits stable properties.
[0072]
Here, the film thickness of the polystyrene thin film can be controlled by setting the high-frequency power to be applied and the gas pressure and flow rate of the rare gas introduced into the vacuum cell and changing the sputtering time.
[0073]
According to the ion beam sputtering method as in the present embodiment, unlike a normal high-frequency sputtering method, an ion gun is used for Ar. ⁺ A large amount of radicals are not generated because the polymer is ejected by irradiating the target with an ion beam such as. Therefore, a step of removing radicals after film formation is unnecessary, and a thin film having almost no radicals can be formed.
In this embodiment, the target is irradiated with an ion beam, but a high-speed electron beam, X-ray, or the like may be irradiated. In this case, the problem of charge up at the target is also solved.
[0074]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a hydrophobic thin film is formed on a measuring chip used for SPR measurement, so that various polymer materials having hydrophobic sites such as proteins, glycoproteins, riboproteins, and polysaccharides. Can be better fixed by hydrophobic bonds. As a result, it is possible to widely analyze the interaction between proteins and the interaction between proteins and other compounds, and a wide variety of substances may be detectable by SPR measurement. In particular, when polystyrene is used as the hydrophobic thin film material, for example, a known antigen (protein) immobilization method can be applied as it is in the ELISA method. This eliminates the need for a new protein immobilization method and development period for testing its reliability when searching for low molecular weight compounds that inhibit the antigen-antibody reaction when developing new drugs. Therefore, the drug development period can be significantly shortened.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a cross-sectional view showing a measurement chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram showing how SPR measurement is performed using the measurement chip shown in FIG.
FIG. 3 is a flowchart showing a method for manufacturing a measuring chip according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a cross-sectional view showing a measuring chip manufacturing apparatus (film forming apparatus) used in the measuring chip manufacturing method according to the first embodiment of the present invention.
5 is a perspective view showing a part of the film forming apparatus shown in FIG. 4. FIG.
FIG. 6 shows a manufacturing condition and a film thickness of the measuring chip manufactured under the condition when the measuring chip is manufactured by changing the manufacturing condition using the measuring chip manufacturing method according to the first embodiment of the present invention. It is a table | surface which shows.
FIG. 7 is a diagram showing a surface reflection infrared absorption spectrum measured for a gold thin film.
8A is a view showing a surface reflection infrared absorption spectrum of the sample (4) shown in FIG. 6, and FIGS. 8B and 8C are AFM views of the sample (4). It is a photograph taken.
9A is a diagram showing a surface reflection infrared absorption spectrum of the sample (2) shown in FIG. 6, and FIGS. 9B and 9C are AFMs of the sample (2). It is a photograph taken.
10 is a cross-sectional view showing the results of measuring surface fluctuations in the sample shown in FIG. 9C. FIG.
11A is a diagram showing a surface reflection infrared absorption spectrum of the sample (6) shown in FIG. 6, and FIGS. 11B and 11C are AFMs of the sample (6). It is a photograph taken.
FIG. 12 is a flowchart showing an experimental procedure for evaluating a measurement chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a diagram showing a result of an experiment performed on a measurement chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 14 is a diagram showing a result of an experiment performed on a measurement chip on which a polystyrene thin film is not formed for comparison.
FIG. 15 is a schematic view showing a measuring chip manufacturing apparatus used in the measuring chip manufacturing method according to the second embodiment of the present invention.
FIG. 16 is a flowchart showing a method for manufacturing a measuring chip according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 17 is a diagram for explaining the principle of SPR measurement;
[Explanation of symbols]
1 Measuring chip
2, 3 Measuring chip manufacturing equipment (film forming equipment)
10, 101 Transparent dielectric
11,102 Metal thin film (gold thin film)
12 Hydrophobic thin film (polystyrene thin film)
13 holes
14 protein
15, 104 Light source
16, 106 photodetector
17 Material chips
21 Chip holder
22 Mask
23 Evaporating dishes
24 chambers
25 Deposition source heating device
26 Coolant tank
27 Vacuum equipment
28 Fixing tool
31 Vacuum cell
32 Holder
33 Target
34 Mask
35 ion gun
36 Pirani Gauge
37 Ion gauge
38 Cryopump
39 Suction pump
40 Rotary pump
103 samples
105 lenses

Claims (4)

A measurement chip used in measurement using total reflection attenuation,
A light-transmitting dielectric;
A metal thin film formed on the dielectric;
Covers the metal thin film, and has hydrophobicity formed by a plastic containing polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polypropylene, polyphenylene sulfide, polyvinylidene fluoride, polyvinyl chloride, polycycloolefin, or PMMA (polymethyl methacrylate). A thin film,
A measuring chip comprising: The metal thin film is formed by gold, claim 1, wherein the measuring chip. A method of manufacturing a measuring chip used in measurement using total reflection attenuation,
Forming a metal thin film on a light-transmissive dielectric (a);
Using a molecular distillation method to form a hydrophobic thin film so as to cover the metal thin film formed in step (a) (b);
The said manufacturing method which comprises. A method of manufacturing a measuring chip used in measurement using total reflection attenuation,
Forming a metal thin film on a light-transmissive dielectric (a);
(B) forming a hydrophobic thin film so as to cover the metal thin film formed in step (a) using an ion beam sputtering method;
The said manufacturing method which comprises.

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