JP3716302B2 - Method for producing complex disease-resistant plants using acidic thaumatin-like protein gene - Google Patents

Description

そのため、酸性型タウマチン様タンパク質は、少なくとも単独では病害抵抗性に関与しないのではないかという議論も成されていた（Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １，２８５）。これまでに、本発明者らによって、酸性型タウマチン様タンパク質の１つであるナシのＰｓＴＬ１をイネで発現させて、糸状菌病であるいもち病に対する抵抗性を付与しようとする試みがなされている（青木ら、第２３回 日本分子生物学会年会講演要旨集、５０７頁（２０００年１１月２５日発行））。しかしこれまで、酸性型タウマチン様タンパク質を植物に導入して病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性の付与に成功した研究は発表されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題を解決するためのものであり、その目的とするところは、イネ新育種素材・新品種の開発のために、酸性型タウマチン様タンパク質を用いて病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性病害耐性の植物を作出する方法を提供することである。本発明の他の目的は、酸性型タウマチン様タンパク質を含み、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を有する植物、およびこの植物から得られる植物組織を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、酸性型タウマチン様タンパク質を植物に導入し、この酸性型タウマチン様タンパク質を恒常的に発現する植物体を作出することに成功した。また、この植物は、病原性真菌病のみならず病原性細菌病に対しても病害抵抗性を有したことから、本発明に従って酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子を導入することによって植物に複合病害抵抗性を付与し得ることが明らかとなった。
【００１１】
病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための本発明の方法は、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜２４４位に記載されるアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｂ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は酸性でありかつ抗真菌活性を有するポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する。
【００１２】
別の実施形態では、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための本発明の方法は、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド残基３５〜７６６位に記載されるヌクレオチド配列を含む、ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法は、発現ベクターが導入された植物細胞を、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、上記病原性細菌が、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が、単子葉植物または双子葉植物である。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が単子葉植物である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、上記単子葉植物がイネ科植物である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、上記イネ科植物がイネである。
【００１９】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜２４４位に記載されるアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｂ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は酸性でありかつ抗真菌活性を有するポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含する方法に関する。
【００２０】
別の実施形態では、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための本発明の方法は、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド残基３５〜７６６位に記載されるヌクレオチド配列を含む、ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法は、上記発現ベクターが導入された植物細胞を、上記酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、上記病原体が、病原性真菌、病原性細菌、および病原性ウイルスからなる群より選択される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、上記少なくとも２つの病原体が、病原性真菌と病原性細菌との組み合わせである。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、上記少なくとも２つの病原体が、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせである。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が、単子葉植物または双子葉植物である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が単子葉植物である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、上記単子葉植物がイネ科植物である。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、上記イネ科植物がイネである。
【００２９】
さらに本発明は、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された、植物組織に関する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織は、カルスおよび芽条原基からなる群から選択される。
【００３１】
さらに本発明は、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された植物体であって、上記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する、植物体に関する。
【００３２】
さらに本発明は、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された上記植物体から得られる、植物組織に関する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される。
【００３４】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された、植物組織に関する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織は、カルスおよび芽条原基からなる群から選択される。
【００３６】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された植物体であって、上記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する、植物体に関する。
【００３７】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された上記植物体から得られる、植物組織に関する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される。
【００３９】
【発明の実施の形態】
発明の理解を容易にするために、本明細書において使用する用語を説明する。
【００４０】
本発明において用いられる「酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、当該ポリヌクレオチドが導入された植物に、以下に説明するような病害抵抗性を与え得る。ここで、用語「植物」とは、他に特に示さない限り、完全な植物体のみではなく、その植物体を構成する植物細胞、組織、および器官をも含み得る。本明細書中に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、茎、葉、塊茎、花粉、種子胚、種子、プロトプラスト、カルス、および芽条原基など）は、当業者が通常理解し得る通りの構成物を表す。
【００４１】
本明細書において使用する用語「酸性型タウマチン様タンパク質」は、ＰＲ５に属するタンパク質であって、等電点が酸性（ｐＩ＜７．０）のタンパク質を意味する。酸性型タウマチン様タンパク質の具体例としては、ナシのＰｓＴＬ１、タバコのＰＲ−ＲおよびＰＲ−Ｓ、シロイヌナズナのＡＴＬＰ−１およびＡＴＬＰ−３、オオムギのＩＦＷ１５（Ｇｒｅｎｉｅｒ，Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：１２７７−１２８３（１９９３）を参照のこと）などが挙げられるが、これらに限定されない。精製された酸性型タウマチン様タンパク質は、インビトロにおいてＣｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ｄａｈｌｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓなどのような真菌類に対して抵抗性を示し得る（例えば、Ｖｉｇｅｒｓら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８３、１５５；およびＨｕら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４、９４９を参照のこと）。
【００４２】
アミノ酸配列に基づいた酸性型タウマチン様タンパク質間の配列比較を、図２に示す（配列整列プログラムｃｌｕｓｔａｌｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を使用）。ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア株式会社、東京）配列解析ソフトを使用して計算した場合、ＰｓＴＬ−１と他の酸性型タウマチン様タンパク質との間の配列相同性は、アミノ酸配列に基づいて４０．８９〜５１．３９％であり、そして塩基配列に基づいて５４．２１〜５９．０３％であった。しかし図２において示されるように、酸性型タウマチン様タンパク質は配列保存性の高い領域を数カ所共有しており（例えば、ＰｓＴＬ−１配列に基づいて、２９残基目のＮから３６残基目のＷまで、７２残基目のＲから９４残基目のＣまで、１２４残基目のＤから１３５残基目のＮまで、１５８残基目のＩから１６３残基目のＰまで、１９１残基目のＣから２４４残基目のＰまで）、このことは、これらの酸性型タウマチン様タンパク質が、この保存領域において共通の機能的活性（例えば、植物の病原体感染防御機構に関わる活性）を担う可能性が高いことを示唆する。
【００４３】
本発明で使用され得る、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに、既知の酸性型タウマチン様タンパク質（例えば、図１に示したアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１））のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を有する改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、既知の酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を有する改変体とは、このタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（すなわち、短縮化）または付加；このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはこのタンパク質の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を意図する。
【００４４】
酸性型タウマチン様タンパク質の改変体において、目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換」とは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限りにおいて、任意の数（例えば、１または数個）のアミノ酸が上記アミノ酸配列において欠失、付加、および／もしくは置換していることを意味する。アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかである。本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限りにおいて、好ましくは以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、置換および／もしくは付加された改変体をコードする。
【００４６】
さらに、本発明で使用される「酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできる遺伝子を意味する。例えば、図１の塩基配列を有するＤＮＡに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを縮重異性体と呼ぶこととする。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドに組み込まれたタウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いても良い。
【００４７】
本発明で使用され得る酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００４８】
さらに、上記に示したように、酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列において、機能的活性（例えば、植物の病原体感染防御機構に関わる活性（例えば、本明細書中に開示された、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性））を担う可能性が高い保存領域は明らかである（図２を参照のこと）。従って、このような保存領域を考慮することによって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列に対して、全体としてはより低い配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを用いても、本願発明と等価な効果が得られることは、当業者に容易に明らかである。従って、例えば、配列表の配列番号２の２９残基目のＡｓｎから３６残基目のＴｒｐまで、７２残基目のＡｒｇから９４残基目のＣｙｓまで、１２４残基目のＡｓｐから１３５残基目のＡｓｎまで、１５８残基目のＩｌｅから１６３残基目のＰｒｏまで、１９１残基目のＣｙｓから２４４残基目のＰｒｏまでのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）の部分配列に対する高い配列同一性（例えば、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性）を含む限りにおいて、アミノ酸配列全体としては、少なくとも４０％、好ましくは４５％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは５５％、なおさらに好ましくは６０％、さらにより好ましくは６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた、本願発明において使用され得る。
【００４９】
本発明で使用され得る酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の３５位のＡから７６６位のＴまでに示されるヌクレオチド配列）と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００５０】
さらに、上記に示したように、酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列において、機能的活性（例えば、植物の病原体感染防御機構に関わる活性（例えば、本明細書中に開示された、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性））を担う可能性が高い保存領域は明らかである（図２を参照のこと）。従って、このような保存領域を考慮することによって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の３５位のＡから７６６位のＴまでに示されるヌクレオチド配列）に対して、全体としてはより低い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを用いても、本願発明と等価な効果が得られることは、当業者に容易に明らかである。従って、例えば、配列表の配列番号１の１１９位のＡから１４２位のＧまで、２４８位のＣから３１６位のＣまで、４０４位のＧから４３９位のＣまで、５０６位のＡから５２３位のＴまで、６０５位のＴから７６６位のＴまでのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）の部分配列に対する高い配列同一性（例えば、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性）を含む限りにおいて、アミノ酸配列全体としては、少なくとも４０％、好ましくは４５％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは５５％、なおさらに好ましくは６０％、さらにより好ましくは６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた、本願発明において使用され得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、記載された配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い類似性となることを避けるために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から差し引くことを理解する。
【００５３】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法として、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。同一性％を算定するためにＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ整列において、一般的には、デフォルトパラメーターが使用され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばしば、保存的アミノ酸置換によって同一ではない残基位置は異なることが理解される。上述したように、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について矯正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００５６】
用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーター（例えば、デフォルトパラメーター）を使用して、記載されるかさもなくば公知のアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされる対応するタンパク質の同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これらのために、対応するアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００５７】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に示したような配列同一性を共有する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を与える酸性型タウマチン様タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明で使用される酸性型タウマチン様タンパク質の全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の２４４アミノ酸）をコードする。ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＰＣＲプライマーについて）として用いるための、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質のフラグメントは、一般に、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードする遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００５９】
ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）以外の他の植物に由来する、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を与える酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドホモログもまた、本願発明において使用され得る。そのようなポリヌクレオチドホモログは、例えば、公知の酸性型タウマチン様タンパク質（例えば、図１に記載されたナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１））の全長または一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が、公知の酸性型タウマチン様タンパク質（例えば、図１に記載されたナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）の配列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために使用され得る。とりわけ、図１に記載の配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって特に好ましく使用される。
【００６０】
ハイブリダイゼーション技術において、公知の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、³²Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製およびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築の方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書中に参考として援用される））において開示される。
【００６１】
例えば、本明細書中に示された病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードするヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質の遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードする遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択された生物から対応する病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードする遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００６２】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００６３】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。例示的な高ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェントな条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な低ストリンジェントな条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。
【００６４】
特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔ_mは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔ_m＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔ_mは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔ_mは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔ_m、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔ_mは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴ_mを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ_mを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００６５】
本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、代表的には、既知の酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に記載されるナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列）の情報またはそれをコードするヌクレオチド配列情報に従って得られるが、それらの既知の配列情報を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）のポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００６６】
さらに他の実施形態では、本発明で使用される酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する１つの方法としては、核酸合成の手法に従ってそのポリヌクレオチドの少なくとも一部を化学合成し、これをプローブとして使用して、適当なｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＢＡＣクローンライブラリー、ＰＡＣクローンライブラリー、ＹＡＣクローンライブラリーなどから、慣用されている方法（例えば、免疫学的方法あるいはハイブリダイゼーション法など）により取得する方法を挙げることができる。上記の方法に用いるいくつかのプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類としては市販のものを使用し得る。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養および培養物からのＤＮＡ，ＲＮＡ等の回収は文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ））に準じて行い得る。
【００６７】
さらに別の実施形態では、以下の様にして、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。まず、既知のタウマチン様タンパク質（例えば、図１に記載されるナシの酸性型タウマチン様タンパク質）中の２種類のアミノ酸部分配列を選択し、これらのアミノ酸配列のＣ末端をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーと上記アミノ酸配列のＮ末端側をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーとを作製し、これらをミックスプライマーとして用い、適当なライブラリーおよびＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７）（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，４５３））を行う。その後、ＰＣＲ反応生成物の中から、増幅が予想される特定の長さの増幅断片を取り出し、これらの塩基配列を決定する。得られた増幅断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、上記のライブラリーからタウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを獲得する。
【００６８】
得られたポリヌクレオチドの塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法マキサムーギルバート法（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９）やジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８２，Ｇｅｎｅ １９，２６９））、または市販されている自動シーケンサーにより決定し得る。決定された塩基配列から、取得されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の等電点を決定する方法は、当該分野において周知である。例えば、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列情報を用いて、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア株式会社、東京）などの配列解析ソフトを使用することにより、取得されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の等電点を容易に推測し得る。
【００６９】
また、得られたポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入すること、そして適切な宿主においてポリペプチドを発現させることによって、コードされるタンパク質を容易に組換え的に発現させ得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、組換えタンパク質を発現させ得る。組換えタンパク質の発現は、取得されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞などが挙げられる。好ましくは、用いられる宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物の細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）である。この様式で発現されるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、天然に存在するポリペプチドの一部分、またはそれらの他の改変体をコードし得る。組換えポリペプチドを分泌する適切な宿主／ベクター系由来の上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、アフィニティーマトリクスまたはイオン交換樹脂のような適切な精製マトリクスに供され得る。最後に、１回以上の逆相ＨＰＬＣの工程が用いられ、組換えポリペプチドは、さらに精製され得る。
【００７０】
このようにして精製されたタンパク質の等電点は、ｐＩマーカー（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）と共に等電点電気泳動を行い、そして目的のタンパク質のバンドの位置が、どのマーカーと一致するかを調べることによって容易に決定され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＨＡＰＴＥＲ １０、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【００７１】
上記のように取得されたポリヌクレオチドが、抗真菌活性を有するタンパク質をコードするか否かを、当業者は容易に確認し得る。例えば、タンパク質の抗菌活性を測定する方法としては、阻止円法（佐藤昭二ら、植物病理学実験法、第２１９−２２３頁、講談社を参照のこと）が挙げられる。詳細には、取得されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成することにより獲得し、病原菌胞子などを混合した寒天培地上に、この組換え生成タンパク質を染み込ませた濾紙ディスクを載せて、所定時間培養する。組換え生成タンパク質が、使用された病原菌に対して抗菌性を有している場合、この濾紙の周りに生育阻止円が形成される。さらに、タンパク質濃度に応じて阻止円の大きさを測定することによって、抗菌性の強さを測定し得る。
【００７２】
本発明に用いる酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドの代表的形態は、プラスミドまたはファージＤＮＡなどの中に構成員の一部としてこのポリヌクレオチドが挿入された形態、並びに、ゲノムＤＮＡの中にこのポリヌクレオチドが挿入された形で微生物またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する形態である。本明細書中で使用される微生物の一例として、大腸菌やアグロバクテリウムを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明に用いる酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、３’−末端側に接して少なくとも１個の停止コドン（例えばＴＡＧ）を有することが望ましい。
【００７４】
さらに本発明に用いる酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、所望により５’−側上流に翻訳フレームと合わせて翻訳開始のメチオニンをコードするＡＴＧ配列、その５’−側上流および３’−下流に非翻訳領域として適当な長さの他のポリヌクレオチドが結合しても良い。
【００７５】
本発明における使用に有用な発現ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ２２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）などが挙げられる。酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物中で安定に発現しうるように、このポリヌクレオチドに、種々のプロモーター、エンハンサー、翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ（ＡＴＧ）またはターミネーターを、適宜組み合わせて付加することが好ましい。
【００７６】
上記のプロモーターとしては、本発明のタンパク質を恒常的あるいは誘導的に発現させるためのプロモーターが挙げられる。
【００７７】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌａｎｔ ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用い得る。特に好ましい実施形態では、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーターを使用し得る。
【００７８】
誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、病原体の感染や侵入、光、傷害、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現を誘導することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターの例としては、例えば、光照射によって発現を誘導するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５８）、糸状菌・細菌・ウイルスなどの病原体の感染や侵入によって発現を誘導するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７）およびタバコのＰＲタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２，９５）、低温によって発現を誘導するイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって発現を誘導するイネのｈｓｐ７２，ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ １９３，５７）、乾燥によって発現を誘導するシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって発現を誘導するトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、上記のイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターおよびタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターは、サリチル酸またはジャスモン酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導されることが公知である。
【００７９】
本発明で使用され得るターミネーターとしては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｇｉｅｌｅｎ，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３，８３５）などを用い得る。
【００８０】
植物細胞および植物体への遺伝子導入法としては、通常公知の方法、例えば「Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｄｒａｐｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９」記載の方法を用いて行うことができる。その例としては、生物的方法（例えば、ウイルスを用いる方法またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（Ｈｏｏｄ，１９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２，２１８、Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，１６．）など）、物理・化学的方法（例えば、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，１９９０，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０，４７５）、ポリエチレングリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，４３７）、パーティクル・ガン法（ｓａｎｆｏｒｄ，１９８７，Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５，２７）など）などが挙げられる。
【００８１】
ポリヌクレオチド導入に使用するための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択し得る。植物細胞としては特に制限はないが、植物体への再分化の系が確立されている、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの植物細胞が特に好ましい。適当な導入法および植物材料を選択することは、当業者によって容易になされ得る。
【００８２】
植物培養細胞へポリヌクレオチドを導入する場合、材料として代表的にはプロトプラストを用いて、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってポリヌクレオチドの導入が行われる。植物組織へポリヌクレオチドを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など（好ましくは葉、茎、カルス）を用いて、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法、好ましくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法によって、ポリヌクレオチドの導入が行われる。
【００８３】
上記方法により、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させるには、このような形質転換植物組織または形質転換植物細胞を、再分化培地またはホルモンフリーのＭＳ培地などにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当業者によって容易になされ得る。様々な文献において、各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など）の再分化の方法が記載されている。
【００８４】
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、実施例４に記載のように、特定のイネ品種にその品種に罹病性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。また例えば、白葉枯病の場合は、実施例８に記載のような、枯病細菌懸濁液中に抵抗性を検定する植物の組織（例えば、成葉）を浸漬し、病斑の進行距離を測定する方法、または噴霧接種法、針接種法が挙げられる。いずれの方法においても、葉全体の病斑面積率を測定することによって、発病程度を評価する（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
【００８５】
上記のような方法で酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を導入し、発現させることにより、病原体に対する抵抗性を付与または増強することができる「植物」としては、病原体に感染するあらゆる植物を挙げることができる。特定の実施形態では、本発明の方法に従って形質転換される植物は、単子葉植物または双子葉植物である。より詳細には、本発明の方法に従って形質転換される植物の例としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマトなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の方法に従って得られる植物、またはその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原体」としては、植物に感染可能なあらゆる病原体、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００８７】
病原性真菌としては、イネいもち病菌、イネ紋枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバコ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂病菌、ナシ赤星病菌、カンキツにせ黄斑病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴマ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
病原性ウイルスとしては、イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイルス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイルス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイモＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイルス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明の方法に従って得られる植物が示す「少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性」とは、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどの分類群から選択される少なくとも２つの異なる分類に属する少なくとも２つの病原体に対する抵抗性を意味する。例えば、少なくとも２つの病原体に対する抵抗性としては、病原性真菌と病原性細菌との組み合わせに対する抵抗性、病原性細菌と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性、病原性真菌と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性などが挙げられる。
【００９１】
本発明により、植物に導入された酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子房から形成される種子においても導入したポリヌクレオチド配列が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従って、本発明の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された植物は、例えば、種子による増殖によって、病原菌に対する抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接木、株分けなどによっても、病害抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。このような増殖によって得られた後代または子孫もまた、本発明によって包含される。
【００９２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９３】
【実施例】
本発明者らは、酸性型タウマチン様タンパク質の一例としてナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）（表２）をコードするポリヌクレオチドをアグロバクテリウム形質転換法を用いてイネに形質転換を行い、植物体内で発現させることに成功した。本発明者らは、さらに、この遺伝子の解析を進めた結果、この酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子の発現と植物の病害抵抗性との間に顕著な相関関係が認められることを見いだした。本発明で使用され得る酸性型タウマチン様タンパク質および植物が、以下に記載の特定の例に限定されず、類似の酸性型タウマチン様タンパク質および植物によっても同様の効果が得られ得ることは、当業者に容易に明らかである。
【００９４】
（実施例１．ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）遺伝子を発現させる発現ベクターの構築）
ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）遺伝子は横浜市立大学木原生物学研究所でクローニングされ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングされた形で供与された（表２、図１、Ｓａｓｓａ，１９９８，Ｐｌａｎｔａ ２０５，５１４）。
【００９５】
【表２】

（表２：ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）の特徴）
本研究で使用したタウマチン様タンパク質はナシの花柱で発現するｐＩ４．８の酸性型である。アミノ酸配列から推測される分子量は２２．９ｋＤａであるが、細胞中では糖鎖が付加されるため３２．０ｋＤａに増加する。
【００９６】
形質転換用バイナリーベクターはｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）を用いた。発現ベクター作製の際の基本的実験操作は実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に順じて行った。形質転換の際に用いたプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、大腸菌はＤＨ５α（東洋紡）を用いた。ｐＰＺＰ２０２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）をライゲーションした。ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＮＯＳターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）をライゲーションした。ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＰｓＴＬ１のｃＤＮＡをセンスに組み込んだ。最後にＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ：ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｇｒｉｔｚ，１９８３，ｇｅｎｅ ２５，１７９）にＣａＭＶ３５Ｓプロモ−タ−（Ｏｄｅｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）とＮＯＳターミネーターを連結させた遺伝子を選抜マーカーとして導入した。以上の方法でＰｓＴＬ１が高発現する発現ベクターを構築した（図３）。
【００９７】
（実施例２．ＰｓＴＬ１遺伝子導入イネ系統の作出）
ナシの酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子（ＰｓＴＬ１）を高発現させる形質転換植物の作出はアグロバクテリウムによる方法を用いた（Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，１６．Ｈｉｅｉ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，２７１）。アグロバクテリウムの系統はＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，１２９１）を用いた。
【００９８】
上記実施例１で構築した発現ベクターをエレクトロポレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポレーション装置はＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲａＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振とう培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ ｇ／ｌトリプトン、５ ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調製）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。
【００９９】
遺伝子導入したアグロバクテリウムを水稲品種「どんとこい」胚盤由来カルス（４週間）に感染させた。「どんとこい」種子から穎を除き玄米とし、これを７０％エタノールで１分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。さらに、２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で４０分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。この玄米を、カルス誘導培地（３０ｇ／ｌシュクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを添加し、ｐＨ５．８に調製し、４ ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕ，１９７４，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ １８，６５９））上に置床した。玄米は２８℃明所で生育させカルスを得た。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いた。
【０１００】
２０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地に２８℃で培養したアグロバクテリウム０．５ｃｍ四方をミクロスパテルでかき取り、１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地（Ｔｏｒｉｙａｍａ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４１，１７９）に懸濁した。この懸濁液をカルスに注ぎ、２分間浸漬させた。このカルスを水切りした後、１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴンを含むカルス誘導培地上で２８℃で３日間培養した。感染後のカルスを滅菌蒸留水で５回洗浄し、余分なアグロバクテリウムを除去した。
【０１０１】
アグロバクテリウムを除去したカルスを選抜培地（５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地）に２８℃で２週間培養し、再び同じ培地に移し替えさらに２週間培養した。その結果、遺伝子組換えされたカルスがハイグロマイシン耐性になり、選抜培地上で増殖した。
【０１０２】
増殖したカルスを５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む再分化培地（３０ｇ／ｌシュクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２０μｇ／ｌ ＮＡＡ、２．２ｍｇ／ｌカイネチンを添加し、ｐＨ５．８に調製し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３））上に移植した。再分化培地では２８℃で２週間の培養を２回行い、再分化固体を選抜した。
【０１０３】
再分化したイネを鉢上げし、２００系統の再分化個体（Ｔ₀）を隔離温室内で生育させた。これを図４に示す。左側が原品種「どんとこい」であり、右側が酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子導入系統（ＴＬ１９２）の生育個体である。生育したタウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統では不稔、矮性化などが生じず、外見上、原品種「どんとこい」と大きな差異は認められなかった（図４）。これらの組換え系統からＴ₁種子を採種した。
【０１０４】
（実施例３．Ｔ₁世代の非組換え個体の除去）
遺伝の法則からＴ₁種子には組換え個体と非組換え個体が、３：１の割合で混合していることが示唆された。このうち、組換え個体はハイグロマイシンに対して抵抗性を有することが推測された。
【０１０５】
そこで採種したＴ₁種子と原品種の「どんとこい」種子を５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含み４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３）上で発芽させ、２８℃で１週間培養した。培養後のＴ₁種子および原品種「どんとこい」種子を図５に示す（Ａ：原品種「どんとこい」、Ｂ：組換え系統）。実験に使用したハイグロマイシン濃度において、原品種「どんとこい」種子はすべて、ハイグロマイシンの影響を受けて、発芽後黒変し枯死した（図５Ａ）。タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統から採種したＴ₁種子は正常に生育した個体と枯死した個体に分離した（図５Ｂ）。その比率は約３：１であった（図４）。
【０１０６】
以上の結果から、この選抜方法によってＴ₁世代の非組換え個体を除去し得た。また後に行ったゲノミックサザン法による分析の結果、正常に生育したＴ₁個体にはＰｓＴＬ１遺伝子が導入されていることが確認できた。正常に生育したＴ₁世代系統をシードリングケースに鉢上げし、４．５葉期になるまで生育させた。
【０１０７】
（実施例４．病原性真菌抵抗性検定）
本実施例では、病原性真菌として、糸状菌であるいもち病菌を用いて、本発明の方法によって得られた植物の病原性真菌抵抗性検定を行った。いもち病菌の接種は噴霧接種法を用いた（Ｙａｅｇａｓｈｉ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３７）。
【０１０８】
いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ Ｃａｖ．：レース００７）を粉末オートミール培地に移植し、２６℃で培養した。菌叢がシャーレ全面を覆った段階で殺菌水を加え、絵筆で培地表面をこすり気中菌糸を取り除いた。その後シャーレの蓋を外し、近紫外光を照射して胞子形成を行った（Ｆｕｒｕｔａ，１９６７，Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ２１，１６０）。
【０１０９】
４．５葉期まで生育した原品種個体と組換え体（Ｔ₁）の幼苗に、いもち病菌胞子の懸濁液（胞子数５×１０⁸／ｍｌ）を噴霧し、接種箱内で２６℃で２４時間接種した。接種後の原品種及び組換え系統を隔離温室に移動し、病斑を観察した。この噴霧接種検定の結果を図６に示す。写真中、左の植物群が原品種（接種せず）、中の植物群が原品種（接種後２０日）、右の植物群がＴＬ１９２（接種後２０日）を示す。耐病性検定は病斑の形状の判定と、病斑面積率の測定を行い、以下に示す病斑指数を用いていもち病菌接種後の日数と病状の解析を行った（Ａｓａｇａ，１９８１，Ｊ．Ｃｅｎｔ．Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．Ｓｔｎ．３５，５１）。
【０１１０】
病斑指数 病状 病斑面積率
０．罹病性病斑が全く認められない ０％
１．罹病性病斑がわずかに認められる １％
２．罹病性病斑が一見して認められる ２％
３．罹病性病斑が中程度に認められる ５％
４．罹病性病斑が多く認められる １０％
５．罹病性病斑がはなはだしいか、枯死葉がわずかに認められる ２０％
６．枯死葉が一見して認められる ４０％
７．枯死葉が中程度に認められる ６０％
８．枯死葉が多く認められる ８０％
９．全葉ほとんど枯死 ９０％
１０．全茎葉枯死 １００％
この耐病性検定の結果を図７に示す。図７中、横軸は接種後日数、縦軸は病斑指数を表す。また図中、黒菱形はＷＴ（野生型）、白四角は組換え体（１９２−１）、黒三角は組換え体（１９２−２）、Ｘは組換え体（１９２−３）、黒丸は組換え体（１９２−４）を示す。
【０１１１】
この結果、組換え体では原品種と変わらない罹病性病斑が認められた。また、組換え体の中に、原品種と比較していもち病の進行が遅延する系統が見つかった（図６，７；Ｔ₁世代：ＴＬ１９２）。これらの個体はいもち病の罹病性病斑が認められるものの、病斑面積率は非常に小さかった。従って、ＰｓＴＬ１組換え系統はいもち病に対して圃場抵抗性型の抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１１２】
（実施例５．ゲノミックサザン法によるＰｓＴＬ１遺伝子導入の確認）
原品種及び病害抵抗性が確認されたＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ₁）の葉身からＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍｕｒｒａｙ，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４３２１）を用いてゲノミックＤＮＡを抽出した。イネ地上部１０ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１．５×ＣＴＡＢ液（１．５％ＣＴＡＢ、 ７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ８．０、１．０５Ｍ塩化ナトリウム）と混合し、５６℃で２０分間軽く浸透してＤＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／１０容量の１０％ＣＴＡＢ、１．５容の沈殿溶液（１％ＣＴＡＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えＤＮＡを析出した。このＤＮＡを１Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＡでＲＮＡを分解した後、エタノール沈殿を行ってゲノミックＤＮＡを抽出した。
【０１１３】
抽出したゲノミックＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＶ，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、１．２％アガロ−スゲルで１８時間電気泳動を行った。泳動後のゲルを加水分解液（０．２５Ｍ ＨＣｌ液）に１０分間、アルカリ変性（１．５Ｍ ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間浸漬して軽く振とうした。その後、アルカリ転写液（０．４Ｍ ＮａＯＨ）を用いてＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））に転写した。ゲノミックＤＮＡが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間ベーキングしてＤＮＡを固定した後、ＰｓＴＬ１のｃＤＮＡ（約０．９ｋｂｐ）をプローブに用いてゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。サザンハイブリダイゼーションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた。洗浄条件は、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の場合には、０．２×ＳＳＣ濃度の洗浄液を使用し、Ａｌｋｐｈｏｓ（アルカリホスファターゼ）の場合には、供給業者の推奨するプロトコールに記載された洗浄液を用いて、５５℃で洗浄を行った。
【０１１４】
この結果を図８に示す。図８中、レーン１は原品種 ＥｃｏＲＶ、レーンＭは１ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、レーン２はＴＬ１９２ ＥｃｏＲＶ、レーン３はＴＬ１９２ ＰｓｔＩ、レーン４はＴＬ１９２ ＨｉｎｄＩＩＩを示す。
【０１１５】
サザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＰｓＴＬ１プローブとハイブリダイゼーションしたバンドが全く確認されなかったのに対し、いもち病接種検定に用いた酸性型タウマチン様タンパク質組換え系統（ＴＬ１９２）からは１本のバンドが検出された（図８）。従って、これらの組換え系統には１コピーのＰｓＴＬ１遺伝子が導入されていることが明らかになった。
【０１１６】
（実施例６．ノ−ザン法によるＰｓＴＬ１のｍＲＮＡ発現の確認）
原品種及びＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ₁）の葉身から、ＣＴＡＢ／ＬｉＣｌ法で全ＲＮＡを抽出した（Ｃｈａｎｇ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ １１，１１３）。イネ地上部２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１０容の２×ＣＴＡＢ液（２％ＣＴＡＢ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１．４Ｍ塩化ナトリウム，１％メルカプトエタノール）と混合し、６０℃で１０分間軽く浸透してＲＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／４容の１０Ｍ塩化リチウムを加えＲＮＡを析出した。ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解させ、フェノール／クロロホルム抽出理を行った後、上記方法で塩化リチウム抽出をもう一度行い、全ＲＮＡを単離した。
【０１１７】
単離した全ＲＮＡ（３０μｇ）を６．３％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロ−ス変性ゲルで電気泳動し、２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、３００ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物）を用いて全ＲＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））に転写した。全ＲＮＡが転写されたナイロンメンブレンに、ＰｓＴＬ１ ｃＤＮＡ（約０．９ｋｂｐ）をプロ−ブに用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った（Ａｌｗｉｎｅ，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５３５０）。ノーザンハイブリダイゼーションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた。
【０１１８】
これらの結果を、図９に示す。Ａは、全ＲＮＡ像であり、Ｂはノーザンハイブリダイゼーション像を示す。ＡおよびＢの両方とも、レーン１〜４で順に、原品種、ＴＬ１８３、ＴＬ１９２、ＴＬ１９４を示す。
【０１１９】
ノーザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＰｓＴＬ１プローブとハイブリダイゼーションしたバンドが確認されなかったのに対し、いもち病接種検定において抵抗性を示した酸性型タウマチン様タンパク質組換え系統（ＴＬ１８３、１９２、および１９４）から約１，５００ｂｐのバンドが確認できた（図９、矢印）。従って、これらの組換え系統にはＰｓＴＬ１ ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
【０１２０】
（実施例７．ウェスタン法によるＰｓＴＬ１タンパク質発現の確認）
ウェスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，４３５０−４３５４）によるタンパク質の発現解析の際の基本的実験操作は実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に順じて行った。ウサギ由来のナシ酸性型タウマチン様タンパク質に対する一次抗体は横浜市立大学木原生物学研究所で作製されたものを供与された（Ｓａｓｓａ，１９９８，Ｐｌａｎｔａ ２０５，５１４）。二次抗体はＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。抗体の検出にはＡＰ発色キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。また、その他の汎用溶液としてＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、８．１ｍＭリン酸水素二ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ７．４）、ＴＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）、リン酸ナトリウム溶液ｐＨ７．０（リン酸水素二ナトリウム：リン酸二水素ナトリウム＝３９：６１）、Ｄｉｓｓ溶液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％ＳＤＳ、４０％グリセロール、８０μｇ／ｍｌブロムフェノールブルー）を用いた。
【０１２１】
原品種及びＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ₁）の葉身０．２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを８００μｌのタンパク質抽出液（１００ ｍＭリン酸ナトリウム溶液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％２−メルカプトエタノール、１％ＰＶＰ、４％コンプリート（ロシュ））と８００μｌのサンプル溶液（Ｄｉｓｓ溶液：２−メルカプトエタノール＝９２：８）に溶解させた。その後１００℃で５分間加熱し、遠心して上清をサンプルとして用いた。
【０１２２】
イネの葉から抽出したサンプル１００μｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル、トリスグリシン溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、２００ｍＭグリシン、１％ＳＤＳ）を用いて電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをメタノールで前処理したＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）にエレクトロブロット（ＮＡ−１５１３：日本エイドー）した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦメンブレンを、一次ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０％スキムミルク）に浸して１時間、二次ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ）に浸して３０分間振とうし、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ−Ｔ溶液（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０，０００倍希釈したナシの酸性型タウマチン様タンパク質抗体を一次抗体に用いて一晩ウェスタンハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、二次ブロッキング溶液に浸して３０分間振とうし、さらに二次抗体溶液（二次抗体、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）で４０分間ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄液で３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ発色キット（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ：ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて検出した。
【０１２３】
この結果を図１０に示す。図１０中、レーン１はナシ花柱から抽出した総タンパク質を示し、レーン２は原品種、レーン３はＴＬ１８３、レーン４はＴＬ１９２、レーン５はＴＬ１９４を示す。
【０１２４】
ウェスタン法による解析を行った結果、原品種からはＰｓＴＬ１の発現が確認されなかったのに対し、いもち病の接種検定において抵抗性を示した酸性型タウマチン様タンパク質組換え系統（ＴＬ１８３、１９２、および１９４）から約３２ｋＤａの位置にバンドが確認できた（図１０、矢印）。従って、これらの組換え系統にはＰｓＴＬ１タンパク質が発現していることが明らかになった。また、組換え系統から検出されたバンドが３２ｋＤａであったことから、イネの細胞内でもタウマチン様タンパク質に糖鎖付加が行われていることが示唆された。
【０１２５】
（実施例８．病原性細菌抵抗性検定）
本実施例では、病原性細菌として白葉枯病菌を用いて、本発明の方法によって得られた植物の病原性細菌抵抗性検定を行った。上記実施例４において、いもち病菌に対して抵抗性が確認されたＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ₁）を成苗に生育させた。また白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ：レース３−Ａ）を馬鈴薯半合成培地（馬鈴薯３００ｇ、硝酸カルシウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物２ｇ、ペプトン５ｇ、ショ糖１５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１ｌ）で増殖させた。試験管の中に蒸留水１０ｍｌを入れ、白葉枯病菌０．５ｃｍ四方を懸濁させ、接種用の懸濁液を作製した。原品種及びＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ₁）の成葉の先端を白葉枯病菌の懸濁液に浸したハサミで切り取り、白葉枯病の接種を行った（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２８）。
【０１２６】
２０日後、葉の先端から白葉枯病が進行した距離を測定することによって、白葉枯病に対する抵抗性を検定した。この結果を図１１に示す。図中、ＷＴは原品種の葉であり、ＴＬ１９２−２、ＴＬ１９２−８は、それぞれ組換え系統（Ｔ₁）（接種後２０日）の葉である。原品種（ＷＴ）に比べてＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ₁世代：ＴＬ１９２−２，８）は白葉枯病斑の進展の遅延が観察された。原品種１個体（６葉）と、タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統（ＴＬ１９２）のＴ₁世代９個体（それぞれ１０−２１葉）に対して、白葉枯病の進行程度を測定し、グラフにまとめた（図１２）。図１２において、横軸は、試験に供した植物個体（ＷＴ：野生型、ＴＬ１９２−１〜９：組換え系統）を、縦軸は、白葉枯病罹病進度（ｃｍ）を表す。多くのＴＬ１９２の各系統が原品種と比べて白葉枯病の進行が遅延した。従って、ＰｓＴＬ１組換え系統は白葉枯病に対して抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１２７】
【発明の効果】
今回の報告から、酸性型タウマチン様タンパク質が植物における病害抵抗性に重要な役割を担っていることが示唆された。酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを本発明の方法に従って植物細胞、特に高等植物細胞に導入して発現させることにより、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を植物に付与し得る。本発明の方法に従って作出された病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を有する植物は、各種病原菌に対する抵抗性を有するために生産性の向上、収量の安定化、品質の向上、農薬使用量の低減化とそれによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の軽減に効果があると期待される。また、病害抵抗性の性質から、有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保できると考えられる。
【０１２８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列を示す図である。
【図２】アミノ酸配列に基づいた酸性型タウマチン様タンパク質間の配列比較を示す図である。
【図３】ＰｓＴＬ１遺伝子の発現ベクター（ｐＰＺＰ２０２）の構築を示す図である。
【図４】タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統（ＴＬ１９２）の形態を示す生物形態写真である。
【図５】組換え系統Ｔ₁種子のハイグロマイシン選抜の様子を示す生物形態写真である。
【図６】いもち病（レース００７）の噴霧接種検定の結果を示す生物形態写真である。
【図７】組換え系統（ＴＬ１９２）のいもち病に対する抵抗性程度を示すグラフである。
【図８】ゲノミックサザン法による導入遺伝子の確認を示す電気泳動図である。
【図９】ノーザン法によるＰｓＴＬ１ ｍＲＮＡの発現調査を示す電気泳動図である。
【図１０】ウェスタン法によるＰｓＴＬ１タンパク質発現の確認を示すブロット図である。
【図１１】白葉枯病の接種検定の結果を示す生物形態写真である。
【図１２】酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統の白葉枯病に対する抵抗性程度を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention reveals a novel function of a useful gene that can be used for the development of new breeding materials and new varieties, and uses this function to produce a pathogenic bacterial-resistant or complex disease-resistant plant, The present invention relates to a plant containing a gene and having pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance. More specifically, the present invention includes a method for producing a pathogenic bacterial-resistant or complex disease-resistant plant using an acidic thaumatin-like protein gene, and an acidic thaumatin-like protein gene, Or it relates to a plant having compound disease resistance.
[0002]
[Prior art]
Rice is the main crop in Asia, including Japan, and as a result, research has been conducted in Asian countries to increase rice yield. One of the main causes of reducing rice yield is disease. Known plant pathogens include fungi including filamentous fungi, bacteria, viruses, viroids, phytoplasmas, nematodes, insects, and the like. Often pathogens are involved.
[0003]
Examples of diseases causing serious damage to rice include rice blast (Pyricularia oryzae) and white leaf blight (Xanthomonas campestris). Rice blast is the most feared disease in Japan and occurs mainly in the middle and north of Japan due to long rain and cold damage. Rice blast is a type of filamentous fungal disease. Rice affected by rice blast develops black spotted lesions that stop rice growth and die as symptoms progress. White leaf blight is a kind of bacterial disease and causes serious damage from Kyushu to Southeast Asia. In rice affected by white leaf blight, white-brown lesions expand along the edge of the leaf, and the entire leaf dies (Ohata, 1989, Zenkoku Noson Kyoiku Kyokai Co. Ltd. 563).
[0004]
When a plant recognizes an invasion signal of a pathogen, it induces and expresses an infection-specific protein (PR protein) to protect the plant and performs a defense response (Bowles, 1990, Annu. Rev. Biochem. 59, 873). PR proteins are currently classified into 14 types based on their functions and properties, and many of them are proteins having antibacterial activity. Thus, PR protein induced by pathogen infection is considered to be involved in plant defense mechanisms by directly acting on pathogens (Van Loon, 1994, Plant Mol. Biol. Report. 12, 245). Van Loon, 1999, Physiol.Mol.Plant Path.55, 85). So far, reports have been made on disease resistance in plants by genetically recombining PR2 (glucanase) and PR3 (chitinase) using the properties of PR protein (Nishizawa, 1999, Kagaku toto). Sheibutsu 37,295).
[0005]
A thaumatin-like protein is a protein belonging to PR5, and is roughly classified into a basic type, an acidic type, and a neutral type from its isoelectric point. Basic and acidic forms of thaumatin-like proteins are known to be specific for the expressed cytological location, inducers, and pathogenic fungi exhibiting antibacterial properties (Ibeas et al., Plant J. et al. (2000) 23 (3): 375-383; Grenier et al., Plant J. (1999) 19 (4): 473-480; Niki et al., Plant Cell Physiol. (1998) 39 (5): 500-507; Et al., Plant Physiol. (1987) 85: 529-536). Specifically, it is known that a basic thaumatin-like protein is expressed in a localized manner in the vacuole, and its expression is induced mainly by wounding. In addition, it is known that expression of a basic thaumatin-like protein is induced by artificial jasmonic acid treatment. On the other hand, acidic thaumatin-like proteins are known to be secreted extracellularly and are mainly induced by infection. In addition, it is known that expression of an acidic thaumatin-like protein is induced by artificial salicylic acid treatment. Furthermore, it is also known that the fungal resistance exhibited by basic and acidic thaumatin-like proteins is specific. Specifically, in vitro, pathogenic fungi whose growth was suppressed by basic thaumatin-like protein were not affected by growth by acidic thaumatin-like protein, and were similarly suppressed by acidic thaumatin-like protein. It has been reported that pathogenic fungi were not suppressed by basic thaumatin-like proteins (Vigers, 1992, Plant Sci. 83, 155).
[0006]
Basic thaumatin-like proteins have been studied for their antibacterial properties from an early stage and have been found to produce antibacterial properties by recognizing sugar chains present in the cell walls of pathogenic bacteria (Ibeas, 2000, Plant J. 23, 375). ). In addition, a plurality of results obtained by imparting disease resistance by gene transfer of basic type thaumatin-like protein have been reported (Liu, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1888; Malehorn, 1994, Plant Physiol. 106, 1471; Liu, 1996, Plant Sci. 121, 123).
[0007]
On the other hand, research on acidic thaumatin-like protein genes has hardly progressed so far. To date, acidic thaumatin-like proteins have been used in fungi (eg, Trichoderma reesei, Alternariasolani, Verticillame albo-arum, Verticillame dacrea, Fusarium oxysporum, Cercosporium, Cercosporium, Cercosporacea, It was only confirmed in vitro to exhibit antibacterial activity (Hu, X. and Reddy, ASN, Plant Molecular Biology 34: 949-959 (1997); Vigers, AJ. Et al., Plant Science 83: 155-161 (1992); And Grenier, J, et al., Plant Physiol.103:. 1277-1283 see (1993))). In the past, experiments on gene introduction of acidic thaumatin-like protein into plants were performed, but the recombinants did not bring disease resistance (see Table 1).
[0008]
[Table 1]

For this reason, it has been argued that acidic thaumatin-like protein may not be involved in disease resistance at least alone (Linthrst, 1989, Plant Cell 1,285). So far, the present inventors have tried to impart resistance to blast disease, which is a filamentous fungal disease, by expressing PsTL1 of pear, which is one of acidic thaumatin-like proteins, in rice. (Aoki et al., 23rd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 507 (issued on November 25, 2000)). However, no studies have been published that succeeded in imparting pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance by introducing acidic thaumatin-like protein into plants.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is for solving the above-mentioned problems, and the object of the present invention is to develop pathogenic bacteria resistance using acidic thaumatin-like protein for the development of new rice breeding materials and new varieties. It is to provide a method for producing a complex disease resistant disease resistant plant. Another object of the present invention is to provide a plant containing an acidic thaumatin-like protein and having pathogenic bacterial resistance or complex disease resistance, and a plant tissue obtained from the plant.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent efforts to solve the above problems, the present inventors have succeeded in introducing an acidic thaumatin-like protein into a plant and producing a plant that constantly expresses the acidic thaumatin-like protein. Moreover, since this plant had disease resistance not only against pathogenic fungal diseases but also pathogenic bacterial diseases, compound disease resistance was introduced into the plant by introducing an acidic thaumatin-like protein gene according to the present invention. It was revealed that can be imparted.
[0011]
The method of the present invention for producing a plant having resistance to pathogenic bacteria comprises a polynucleotide encoding the following acidic thaumatin-like protein:
(A) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) having the amino acid sequence set forth in amino acid residues 1 to 244 of SEQ ID NO: 2; or
(B) a polynucleotide encoding a protein having one or more amino acid insertions, deletions and / or substitutions in the amino acid sequence of the pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1), wherein the protein The method includes the step of introducing into a plant cell an expression vector that contains and is capable of expressing a polynucleotide that is acidic and has antifungal activity.
[0012]
In another embodiment, the method of the present invention for producing a plant resistant to pathogenic bacteria comprises a polynucleotide encoding the following acidic thaumatin-like protein:
(C) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide residues 35 to 766 of SEQ ID NO: 1; or
(D) An expression vector containing and capable of expressing a polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a polynucleotide encoding the pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) is introduced into plant cells. The process of carrying out is included.
[0013]
In a preferred embodiment of the present invention, the above method for producing a plant resistant to pathogenic bacteria expresses a plant cell into which an expression vector has been introduced, expressing a polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein. And regenerating a plant having resistance to pathogenic bacteria.
[0014]
In a preferred embodiment of the present invention, the pathogenic bacterium is a Xanthomonas campestris.
[0015]
In a preferred embodiment of the present invention, the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
[0016]
In a preferred embodiment of the present invention, the plant is a monocotyledonous plant.
[0017]
In a preferred embodiment of the present invention, the monocotyledonous plant is a gramineous plant.
[0018]
In a preferred embodiment of the present invention, the gramineous plant is rice.
[0019]
Furthermore, the present invention provides a method for producing a plant having combined disease resistance against at least two pathogens, the polynucleotide encoding the following acidic thaumatin-like protein:
(A) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) having the amino acid sequence set forth in amino acid residues 1 to 244 of SEQ ID NO: 2; or
(B) a polynucleotide encoding a protein having one or more amino acid insertions, deletions and / or substitutions in the amino acid sequence of the pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1), wherein the protein The present invention relates to a method comprising the step of introducing into a plant cell an expression vector that contains and is capable of expressing a polynucleotide that is acidic and has antifungal activity.
[0020]
In another embodiment, the method of the invention for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens comprises a polynucleotide encoding the following acidic thaumatin-like protein:
(C) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide residues 35 to 766 of SEQ ID NO: 1; or
(D) An expression vector containing and capable of expressing a polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a polynucleotide encoding the pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) is introduced into plant cells. The process of carrying out is included.
[0021]
In a preferred embodiment of the present invention, the above method for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens comprises treating a plant cell into which the expression vector has been introduced with a polyenzyme encoding the acidic thaumatin-like protein. It further includes the step of expressing the nucleotide and regenerating into a plant having combined disease resistance to at least two pathogens.
[0022]
In a preferred embodiment of the invention, the pathogen is selected from the group consisting of pathogenic fungi, pathogenic bacteria, and pathogenic viruses.
[0023]
In a preferred embodiment of the invention, the at least two pathogens are a combination of pathogenic fungi and pathogenic bacteria.
[0024]
In a preferred embodiment of the present invention, the at least two pathogens are a combination of Pyricularia oryzae and Xanthomonas campestris.
[0025]
In a preferred embodiment of the present invention, the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
[0026]
In a preferred embodiment of the present invention, the plant is a monocotyledonous plant.
[0027]
In a preferred embodiment of the present invention, the monocotyledonous plant is a gramineous plant.
[0028]
In a preferred embodiment of the present invention, the gramineous plant is rice.
[0029]
Furthermore, the present invention relates to a plant tissue produced by the above method for producing a plant having resistance to pathogenic bacteria.
[0030]
In a preferred embodiment of the invention, the plant tissue is selected from the group consisting of callus and bud primordia.
[0031]
Furthermore, the present invention provides a plant produced by the above method for producing a plant resistant to pathogenic bacteria, expressing the acidic thaumatin-like protein, and against the pathogenic bacteria. It relates to a plant having resistance.
[0032]
Furthermore, the present invention relates to a plant tissue obtained from the plant produced by the method for producing a plant having resistance to pathogenic bacteria.
[0033]
In a preferred embodiment of the present invention, the plant tissue is selected from the group consisting of leaves, stems, roots, pollen, seed embryos, and seeds.
[0034]
The invention further relates to a plant tissue produced by the above method for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens.
[0035]
In a preferred embodiment of the invention, the plant tissue is selected from the group consisting of callus and bud primordia.
[0036]
Furthermore, the present invention provides a plant produced by the above method for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens, expressing the acidic type thaumatin-like protein, and against at least two pathogens. The present invention relates to a plant having complex disease resistance.
[0037]
The invention further relates to a plant tissue obtained from the plant produced by the method for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens.
[0038]
In a preferred embodiment of the present invention, the plant tissue is selected from the group consisting of leaves, stems, roots, pollen, seed embryos, and seeds.
[0039]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In order to facilitate understanding of the invention, terms used in this specification will be explained.
[0040]
The “polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein” used in the present invention can impart disease resistance as described below to a plant into which the polynucleotide has been introduced. Here, unless otherwise indicated, the term “plant” may include not only a complete plant but also plant cells, tissues, and organs constituting the plant. Terms used to describe plant components appearing herein (eg, roots, stems, leaves, tubers, pollen, seed embryos, seeds, protoplasts, callus, and shoot primordia) are commonly used by those skilled in the art. Represents a construct as can be understood.
[0041]
As used herein, the term “acidic thaumatin-like protein” means a protein belonging to PR5 and having an acidic isoelectric point (pI <7.0). Specific examples of acidic thaumatin-like proteins include pear PsTL1, tobacco PR-R and PR-S, Arabidopsis ATLP-1 and ATLP-3, barley IFW15 (Grenier, J. et al., Plant Physiol. 103: 1277-1283 (1993)), but is not limited thereto. Purified acidic thaumatin-like proteins can be obtained in vitro from Cercospora beticola, Trichoderma reesei, Fusarium oxysporum, Alternaria solani, Verticillum albo-atrum, Vigers et al., 1992, Plant Sci. 83, 155; and Hu et al., 1997, Plant Mol. Biol. 34, 949).
[0042]
A sequence comparison between acidic thaumatin-like proteins based on amino acid sequences is shown in FIG. 2 (using the sequence alignment program clustalw (http://www.clustalw.genome.ad.jp/)). When calculated using GENETYX (Software, Inc., Tokyo) sequence analysis software, sequence homology between PsTL-1 and other acidic thaumatin-like proteins is 40.89-51. 39% and 54.2 to 59.03% based on the base sequence. However, as shown in FIG. 2, the acidic thaumatin-like protein shares several regions with high sequence conservation (for example, based on the PsTL-1 sequence, the 29th to the 36th residues) From W to R, at residue 72 to C at residue 94, from D at residue 124 to N at residue 135, from I at residue 158 to P at residue 163, 191 residue (From group C to P at residue 244), this indicates that these acidic thaumatin-like proteins have common functional activities in this conserved region (for example, activities related to defense mechanisms against plant pathogen infection). It suggests that there is a high possibility of carrying.
[0043]
A polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein that can be used in the present invention is a known acidic thaumatin-like protein (for example, pear acidic thaumatin-like protein (PsTL1) having the amino acid sequence shown in FIG. 1). Polynucleotides encoding variants having substantial identity to the amino acid sequence or polynucleotide sequence of As used herein, a variant having substantial identity to the amino acid sequence or polynucleotide sequence of a known acidic thaumatin-like protein refers to the N-terminus and / or C-terminus of the protein. Deletion (ie, shortening) or addition of one or more amino acids; deletion or addition of amino acids at one or more sites in the protein; or substitution of amino acids at one or more sites in the protein Contemplates proteins derived from
[0044]
Guidance on suitable amino acid substitutions in variants of acidic thaumatin-like proteins that do not affect the biological activity of the protein of interest can be found in Dayhoff et al. (1987) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found. Washington). , DC, which can be found in the model of (incorporated herein by reference). Conservative substitutions (eg, substitutions that replace one amino acid with another having similar properties) may be preferred. Such substitutions include hydrophobic amino acids (Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Tyr, Val); hydrophilic amino acids (Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Ser, Thr); amino acids having aliphatic side chains (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro); amino acids having hydroxyl-containing side chains (Ser, Thr, Tyr); having sulfur atom-containing side chains Amino acids (Cys, Met); amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (Asp, Asn, Glu, Gln); amino acids with base-containing side chains (Arg, Lys, His); amino acids with aromatic-containing side chains Substitution between (His, Phe, Tyr, Trp).
[0045]
As used herein, “one or more amino acid insertions, deletions, and / or substitutions” refers to any number as long as it can confer pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance. It means that (for example, one or several) amino acids have been deleted, added, and / or substituted in the amino acid sequence. It will be apparent to those skilled in the art that the effect of modifications such as amino acid substitutions, deletions and / or additions on activity may depend on the position, degree, type, etc. of the amino acid being modified. The polynucleotide that can be used in the present invention preferably has a deletion, substitution, and / or addition in a number satisfying the following amino acid sequence identity as long as it can confer pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance. Code the body.
[0046]
Furthermore, the “polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein” used in the present invention includes all degenerate isomers. As used herein, “degenerate isomer” means a gene that differs only in a degenerate codon and can encode the same polypeptide. For example, for a DNA having the base sequence of FIG. 1, a codon corresponding to any of its amino acids, for example, a codon corresponding to Asn (AAC) is changed to a codon that is degenerate with this, such as AAT. It will be called a degenerate isomer. In addition, pBluescriptSK ⁺ A polynucleotide encoding a thaumatin-like protein incorporated in a plasmid such as (Stratagene) may be used.
[0047]
A polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein that can be used in the present invention is capable of conferring pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance. At least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, most preferably at least 99% sequence identity A polynucleotide having a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence is included.
[0048]
Further, as indicated above, in the amino acid sequence of the acidic thaumatin-like protein, functional activity (eg, activity related to a plant pathogen defense mechanism (eg, pathogenic bacterial resistance disclosed herein) The conserved regions that are likely to be responsible for sex or combined disease resistance)) are clear (see FIG. 2). Therefore, by considering such a conserved region, an amino acid sequence having a lower sequence identity as a whole with respect to the amino acid sequence from Met at position 1 to Pro at position 244 in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It will be readily apparent to those skilled in the art that an effect equivalent to that of the present invention can be obtained even when a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding is used. Therefore, for example, from Asn at the 29th residue to Trp at the 36th residue in Sequence No. 2 of the Sequence Listing, from Arg at the 72nd residue to Cys at the 94th residue, from the Asp at the 124th residue to 135 residues. From Asn of the first group, from Ile at the 158th residue to Pro at the 163rd residue, from Cys at the 191st residue to Pro at the 244th residue (for example, 1, 2, 3, High sequence identity (eg, at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%) to 4 or 5 subsequences, The amino acid sequence as a whole is at least 40%, preferably 45%, more preferably 50 , More preferably 55%, even more preferably 60%, even polynucleotides even more preferably has a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 65% sequence identity also be used in the present invention.
[0049]
A polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein that can be used in the present invention is capable of conferring pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance. At least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85% of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence up to (preferably the nucleotide sequence shown from A at position 35 to T at position 766 of SEQ ID NO: 1) Including polynucleotides having a nucleotide sequence having a% sequence identity, even more preferably at least 90% sequence identity, even more preferably at least 95% sequence identity, most preferably at least 99% sequence identity To do.
[0050]
Furthermore, as indicated above, in the amino acid sequence of the acidic thaumatin-like protein, functional activity (eg, activity related to a plant pathogen defense mechanism (eg, pathogenic bacterial resistance disclosed herein) The conserved regions that are likely to be responsible for sex or combined disease resistance)) are clear (see FIG. 2). Therefore, by considering such a conserved region, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence from Met at position 1 to Pro at position 244 in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (preferably an A at position 35 of SEQ ID NO: 1). To 766 at position T to 766), even if a polynucleotide having a nucleotide sequence having a lower sequence identity as a whole is used, an effect equivalent to that of the present invention can be obtained. It will be readily apparent to the merchant. Thus, for example, from A at position 119 to G at position 142 in sequence number 1 of the Sequence Listing, C from position 248 to C at position 316, G from position 404 to C at position 439, A to 523 at position 506 High sequence identity (eg, at least 70%) to one or more (eg, 1, 2, 3, 4, or 5) subsequences from T at position 605 to T at position 766 , Preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, most preferably at least 99% sequence identity) Is at least 40%, preferably 45%, more preferably 50%, even more preferably 55%, still more preferably 60%, even more preferred May also be used in the present invention are polynucleotide having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 65% sequence identity.
[0051]
As used herein, a “reference sequence” is a defined sequence used as a basis for sequence comparison. The reference sequence can be a subset or the whole of the described sequence; for example, as a full-length cDNA or gene sequence segment, or as a complete DNA or gene sequence.
[0052]
As used herein, a “comparison window” refers to a contiguous and specified segment of a polynucleotide sequence, where the polynucleotide sequence in the comparison window is the optimal alignment of the two sequences. Thus, an addition or deletion (ie, a gap) may be included as compared to a reference sequence (which does not include an addition or deletion). In general, the comparison window is at least 20 contiguous nucleotides in length, and can be 30, 40, 50, 100 or more as required. One skilled in the art typically introduces a gap penalty to avoid high similarity to the reference sequence by including gaps in the polynucleotide sequence, and this is calculated from the number of matches. Understand deducting.
[0053]
Methods for alignment of sequences for comparison are well known in the art. Preferred methods for determining the optimal overall match between a reference sequence (sequence of the invention) and a subject sequence include, for example, BLAST (Altshul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402). Utilized homology analysis is used. In sequence alignment, the reference sequence and the subject sequence are both DNA sequences. RNA sequences can be compared by converting U to T. The result of the above overall sequence alignment is% identity. In general, default parameters can be used in BLAST alignments of DNA sequences to calculate percent identity.
[0054]
As used herein, in the context of two nucleic acid sequences or two polypeptide sequences, “sequence identity” or “identity” is aligned to a maximum match over a specified comparison window. Reference is made to residues in the two sequences that are identical. When% sequence identity is used for proteins, it is often understood that residue positions that are not identical differ by conservative amino acid substitutions. As noted above, conservative amino acid substitutions do not alter the functional properties of the molecule because amino acid residues are replaced with other amino acid residues that have similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). . If the sequences differ in conservative substitutions, the percent sequence identity can be adjusted upwards to correct for the conservative nature of the substitution. Sequences that differ by such conservative substitutions are said to have “sequence similarity” or “similarity”. Means for making this adjustment are well known to those skilled in the art. Typically this involves scoring conservative substitutions as partial rather than complete mismatches, thereby increasing the percent sequence identity. Thus, for example, if the same amino acid is given a score of 1 and a non-conservative substitution is given a score of 0, a conservative substitution is given a score between 0 and 1. Conservative substitution scoring is calculated, for example, to be performed in the program PC / GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
[0055]
As used herein, “% sequence identity” means a value determined by comparing two sequences that are optimally aligned over a comparison window, where the polynucleotide sequence in the comparison window Some may contain additions or deletions (ie, gaps) relative to a reference sequence (which does not include additions or deletions) for optimal alignment of the two sequences. This percentage determines the number of positions where the same nucleobase or amino acid residue is present in both sequences, resulting in a number of matching positions, the number of matching positions in the comparison window Is calculated by dividing by the total number of and multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
[0056]
The term “substantial identity” of a polynucleotide means that the polynucleotide is described using standard parameters (eg, default parameters) or using one of the known alignment programs. It is meant to include sequences that have at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence identity compared to a reference sequence. Those skilled in the art are able to determine the identity of the corresponding proteins encoded by two nucleotide sequences by taking into account codon degeneracy, amino acid similarity, reading frame position, etc. Understand that it can be adjusted appropriately. For these reasons, substantial identity of the corresponding amino acid sequence usually means at least 70%, more preferably at least 75%, 80%, 90%, and most preferably at least 95% sequence identity. .
[0057]
The term “substantial identity” in the context of a peptide means that the peptide has at least 70% sequence identity, preferably 80%, more preferably 85%, most relative to a reference sequence over a specified comparison window. Preferably it is meant to include sequences having at least 90% or 95% sequence identity. Preferably, the optimal alignment is described by Needleman et al. Mol. Biol. This is done using the 48: 443 homology alignment algorithm. For example, a peptide is substantially identical to a second peptide when the two peptides differ only by conservative substitutions. “Substantially similar” peptides share sequence identity as set forth above, except that residue positions that are not identical may differ by conservative amino acid changes.
[0058]
As used herein, a fragment encoding a biologically active portion of an acidic thaumatin-like protein that confers pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance is at least 15, 25, 30, 50, Coding up to 100, 125, 150, 175, 200, 225 consecutive amino acids, or up to the total number of amino acids present in the full-length protein of the acidic thaumatin-like protein used in the present invention (for example, 244 amino acids of SEQ ID NO: 2) To do. Fragments of acidic thaumatin-like proteins that confer pathogenic bacterial resistance or complex disease resistance for use as hybridization probes (eg, for PCR primers) generally exhibit pathogenic bacterial resistance or complex disease resistance. It is not necessary to encode the biologically active portion of the protein expressed by the gene encoding the acidic thaumatin-like protein to be applied.
[0059]
Polynucleotide homologues encoding acidic thaumatin-like proteins conferring pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance derived from other plants other than pear (Pyrus pyrifolia) can also be used in the present invention. Such polynucleotide homologues were designed based on, for example, the full-length or partial nucleotide sequence of a known acidic thaumatin-like protein (eg, pear acidic thaumatin-like protein (PsTL1) described in FIG. 1). PCR can be carried out using a selected plant genomic DNA as a template using primers, and then the resulting amplified DNA fragment can be used as a probe to screen the same plant genomic DNA or cDNA library. In this way, methods such as PCR, hybridization, etc. can be used to identify known acidic thaumatin-like proteins (eg, pear acidic thaumatin-like protein (PsTL1) described in FIG. 1 with their sequence identity). In particular, sequences isolated on the basis of their sequence identity to the entire sequence described in Figure 1 or to fragments thereof can be used to identify such sequences based on the present invention. Are particularly preferably used.
[0060]
In hybridization techniques, all or part of a nucleotide sequence encoding a known acidic thaumatin-like protein is converted into a population of cloned genomic DNA fragments or cDNA fragments from a selected organism (ie, a genomic library or cDNA library). As a probe that selectively hybridizes to other corresponding nucleotide sequences present in the library. The hybridization probe can be a genomic DNA fragment, cDNA fragment, RNA fragment, or other oligonucleotide, and can be a detectable group (eg, ³² P) or any other detectable marker. Thus, for example, probes for hybridization are generated by labeling oligonucleotides synthesized based on the nucleotide sequence of an acidic thaumatin-like protein conferring pathogenic bacterial resistance or complex disease resistance of the present invention. Can be done. Methods for preparing probes for hybridization and constructing cDNA and genomic libraries are generally known in the art, and Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition, Cold Spring). Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, which is hereby incorporated by reference.
[0061]
For example, the entire nucleotide sequence encoding an acidic thaumatin-like protein conferring pathogenic bacterial resistance or complex disease resistance as set forth herein, or one or more portions thereof, may correspond to the corresponding pathogenic bacteria It can be used as a probe that can specifically hybridize to the gene sequence and messenger RNA of an acidic thaumatin-like protein that confers resistance or combined disease resistance. In order to achieve specific hybridization under a variety of conditions, such probes are unique among gene sequences encoding acidic thaumatin-like proteins that confer pathogenic bacterial resistance or complex disease resistance. And preferably includes sequences that are at least about 10 nucleotides in length, and most preferably at least about 20 nucleotides in length. Such probes can be used to amplify, by PCR, gene sequences encoding acidic thaumatin-like proteins that confer corresponding pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance from selected organisms. Methods of PCR amplification are well known in the art (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, edited by HA Electric, Freeman Press, NewYork, NY (1992); PCR Protocol: pG). Ed., Snsky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattilla et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, KA and Kunkel, TA and (1991) PCR Me. Applications 1: 17; PCR, McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford, which are incorporated herein by reference). This technique can be used to isolate additional coding sequences from the desired organism. Hybridization techniques include hybridization screening of plated DNA libraries (either plaques or colonies; see, eg, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview). , New York).
[0062]
Such sequence hybridization may be performed under stringent conditions. “Stringent conditions” or “stringent hybridization conditions” are those in which a probe is detectable to its target sequence to a greater extent (eg, at least twice background) than to other sequences. Conditions that hybridize to are intended. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. By controlling the stringency of hybridization and / or wash conditions, target sequences that are 100% complementary to the probe can be identified. Alternatively, stringency conditions can be adjusted to allow some mismatch in the sequence so that a lower degree of similarity can be detected. In general, probes are less than about 1000 nucleotides in length, preferably less than 500 nucleotides in length.
[0063]
Typically, stringent conditions are such that the salt concentration is less than about 1.5 M Na ion, typically about 0.01-1.0 M Na ion concentration (or other salt) (from pH 7.0). 8.3) and the temperature is at least about 30 ° C. for short probes (eg, 10-50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for long probes (eg, greater than 50 nucleotides) It is. Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide. Exemplary high stringency conditions include hybridization in 50% formamide, 1M NaCl, 1% SDS at 37 ° C., and washing in 0.1 × SSC at 60-65 ° C. Exemplary moderate stringency conditions include 40-45% formamide, 1M NaCl, hybridization at 37 ° C. in 1% SDS, and washing in 0.5 × -1 × SSC at 55-60 ° C. Is mentioned. Exemplary low stringency conditions include hybridization at 37 ° C. with a buffer solution of 30-35% formamide, 1M NaCl, 1% SDS (sodium dodecyl sulfate), and 1 × -2 at 50-55 ° C. X Washing in SSC (20 x SSC = 3.0 M NaCl / 0.3 M trisodium citrate).
[0064]
Specificity is typically a function of post-hybridization washes, with decisive factors being the ionic strength and temperature of the final wash solution. For DNA-DNA hybrids, T _m Are described by Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284 Formula: T _m = 81.5 ° C + 16.6 (logM) + 0.41 (% GC)-0.61 (% form)-500 / L; where M is the molar concentration of monovalent cations and% GC is the percentage of guanosine and cytosine nucleotides in DNA,% form is the percentage of formamide in the hybridization solution, and L is the length of the hybrid in base pairs. T _m Is the temperature (at a defined ionic strength and pH) at which 50% of the complementary target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. T _m Drops by about 1 ° C. per 1% mismatch; _m Hybridization and / or wash conditions can be adjusted to hybridize to sequences of the desired identity. For example, if a sequence having 90% or more identity is desired, T _m Can drop by 10. Generally, stringent conditions are such that the thermal melting point (T) for a specific sequence and its complement at a defined ionic strength and pH. _m ) About 5 ° C. However, severe stringent conditions are the thermal melting point (T _m 1, 2, 3, or 4 ° C. lower hybridization and / or washing than moderately stringent conditions may be used. _m 6), 7, 8, 9, or 10 ° C. lower than hybridization and / or washing; low stringent conditions may be _m 11, 12, 13, 14, 15, or 20 ° C. lower hybridization and / or washing than This formula, hybridization and washing composition, and the desired T _m Will be understood by those skilled in the art that variations in hybridization stringency and / or wash solutions are uniquely described. T of lower degree of mismatch desired than 45 ° C. (aqueous solution) or 32 ° C. (formamide solution) _m It is preferable to increase the SSC concentration so that higher temperatures can be used. Extensive guides for nucleic acid hybridization can be found in Tijsssen (1993) Laboratory Technologies in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter Y (Neluk). Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). See Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), which is incorporated herein by reference.
[0065]
The polynucleotide that can be used in the present invention is typically an amino acid sequence of a known acidic thaumatin-like protein (for example, the amino acid sequence of pear acidic thaumatin-like protein (PsTL1) described in SEQ ID NO: 2). It can be obtained according to the information or the nucleotide sequence information encoding it, but can also be obtained by chemical synthesis based on the known sequence information. For example, a polynucleotide that can be used in the present invention can be synthesized according to specifications provided by the manufacturer using a polynucleotide synthesizer from Applied BioSystems (now Perkin Elmer).
[0066]
In yet another embodiment, one method for obtaining a polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein used in the present invention is to chemically synthesize at least a part of the polynucleotide according to a nucleic acid synthesis technique. Can be used as a probe from a suitable cDNA library, genomic library, BAC clone library, PAC clone library, YAC clone library, etc., by conventional methods (for example, immunological methods or hybridization methods) Etc.). Some plasmids used in the above method, various restriction enzymes, T4 DNA ligase, and other enzymes may be commercially available. In addition, DNA cloning, construction of each plasmid, host transformation, culture of the transformant and recovery of DNA, RNA, etc. from the culture are performed according to methods described in the literature (Molecular Cloning, Second Edition (Sambrook, 1989 Cold Spring). (Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1987, John Wiley & Sons)).
[0067]
In yet another embodiment, a polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein can be obtained as follows. First, two types of amino acid partial sequences in a known thaumatin-like protein (for example, pear acid-type thaumatin-like protein shown in FIG. 1) are selected, and any base that is considered to encode the C-terminus of these amino acid sequences. And a primer of any base combination that is thought to encode the N-terminal side of the amino acid sequence, and using these as a mix primer, a PCR reaction (Saiki, 1988) using an appropriate library and RNA as a template. , Science 239, 487) (for example, RT-PCR reaction (Berchtold, 1989, Nucl. Acid Res. 17, 453)). Thereafter, an amplified fragment having a specific length expected to be amplified is taken out from the PCR reaction product, and the base sequence thereof is determined. By hybridizing the obtained amplified fragment as a probe, a polynucleotide encoding a thaumatin-like protein is obtained from the above library.
[0068]
The nucleotide sequence of the obtained polynucleotide is a nucleotide sequence analysis method known in the art, such as Maxamu Gilbert method (Maxam-Gilbert, 1980, Methods Enzymol. 65, 499) or dideoxy method (Messing 1982, Gene 19, 269)), Alternatively, it can be determined by a commercially available automatic sequencer. A method for determining the isoelectric point of the protein encoded by the obtained polynucleotide from the determined base sequence is well known in the art. For example, by using sequence analysis software such as GENETYX (Software Inc., Tokyo) using amino acid sequence information deduced from the determined base sequence, isoelectricity of the protein encoded by the obtained polynucleotide is used. The point can be easily guessed.
[0069]
Alternatively, the encoded protein can be easily expressed recombinantly by inserting the resulting polynucleotide into a suitable expression vector and expressing the polypeptide in a suitable host. Any of a variety of expression vectors known to those skilled in the art can be used to express the recombinant protein. Expression of the recombinant protein can be achieved in any suitable host cell transformed or transfected with an expression vector containing the obtained polynucleotide. Suitable host cells include prokaryotic cells, yeast cells and higher eukaryotic cells. Preferably, the host cell used is E. coli. E. coli, yeast or mammalian cell lines (eg COS cells or CHO cells). A polypeptide expressed in this manner may encode a naturally occurring polypeptide, a portion of a naturally occurring polypeptide, or other variants thereof. Supernatant from a suitable host / vector system secreting the recombinant polypeptide can first be concentrated using a commercially available filter. This concentrate can then be subjected to a suitable purification matrix such as an affinity matrix or an ion exchange resin. Finally, one or more reverse phase HPLC steps can be used and the recombinant polypeptide can be further purified.
[0070]
The isoelectric point of the protein thus purified is determined by performing isoelectric focusing with a pI marker (eg, available from Amersham pharmacia biotech, Inc.), and the position of the band of the protein of interest is determined by which marker (E.g., see current protocol in molecular biology: CHAPTER 10, John Wiley & Sons, Inc.).
[0071]
Those skilled in the art can easily confirm whether or not the polynucleotide obtained as described above encodes a protein having antifungal activity. For example, as a method for measuring the antibacterial activity of a protein, there is a blocking circle method (see Shoji Sato et al., Plant Pathology Experimental Method, pages 219-223, Kodansha). Specifically, a filter paper disk obtained by recombinantly producing the protein encoded by the obtained polynucleotide as described above, and impregnating the recombinantly produced protein on an agar medium mixed with pathogenic bacteria spores and the like. And incubate for a predetermined time. When the recombinantly produced protein has antibacterial activity against the pathogen used, a growth inhibition circle is formed around the filter paper. Furthermore, the antibacterial strength can be measured by measuring the size of the inhibition circle according to the protein concentration.
[0072]
A representative form of a polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein used in the present invention includes a form in which this polynucleotide is inserted as a member in a plasmid or phage DNA, and a genomic DNA. It is a form that exists in microorganisms, phage particles, or plants in an inserted form of this polynucleotide. Examples of microorganisms used in the present specification include, but are not limited to, Escherichia coli and Agrobacterium.
[0073]
The polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein used in the present invention preferably has at least one stop codon (for example, TAG) in contact with the 3′-terminal side.
[0074]
Furthermore, the polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein used in the present invention may optionally comprise an ATG sequence encoding the translation initiation methionine in the 5′-upstream upstream, its 5′-upstream and 3′-upstream. Another polynucleotide having an appropriate length may be bound downstream as an untranslated region.
[0075]
Examples of expression vectors useful for use in the present invention include plasmids pBI121, pBI221, pBI101 (Clontech), pPZP202 (Hajdukiwicz, 1994, Plant Mol. Biol. 25, 989). In order for the polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein to be stably expressed in plants, this polynucleotide is appropriately combined with various promoters, enhancers, DNAs encoding translation initiation codons (ATG) or terminators. It is preferable to add.
[0076]
Examples of the promoter include promoters for constitutively or inducibly expressing the protein of the present invention.
[0077]
Examples of promoters for constitutive expression include promoters of nopaline synthase gene (Langridge, 1985, Plant Cell Rep. 4, 355), promoters that generate cauliflower mosaic virus 19S-RNA (Guilley, 1982, Cell 30, 763). ), A promoter that produces cauliflower mosaic virus 35S-RNA (Odell, 1985, nature 313, 810), rice actin promoter (Zhang, 1991, Plant Cell 3, 1155), corn ubiquitin promoter (Cornejo 1993, Plant mol. Biol. 23, 567), CaMV35S improved REXφ promoter (Mittsuhara, 1996, Plant Cell Physiol.37, 49) and the like can be used. In a particularly preferred embodiment, the CaMV35S modified REXφ promoter may be used.
[0078]
As a promoter for inducible expression, for example, it is known to induce expression by external factors such as pathogen infection and invasion, light, injury, low temperature, high temperature, dryness, ultraviolet irradiation, application of specific compounds, etc. Promoters and the like. Examples of such a promoter include, for example, a promoter of a gene encoding ribulose-1,5-2 phosphate carboxylase small subunit that induces expression by light irradiation (Fluhr, 1986, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2358), a rice chitinase gene promoter (Xu, 1996, Plant Mol. Biol. 30, 387) that induces expression by infection and invasion of pathogens such as filamentous fungi, bacteria, and viruses, and a PR protein of tobacco Promoter of gene (Ohshima, 1990, Plant Cell 2, 95), promoter of rice lip19 gene that induces expression by low temperature (Aguan, 1993, Mol. Gen. Genet. 240, 1), by high temperature The rice hsp72 and hsp80 gene promoters (Van Breusegem, 1994, Planta 193, 57) that induce the present, the Arabidopsis lab16 gene promoter that induces expression by drying (Nundy, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 87, 1406), and a maize alcohol dehydrogenase gene promoter (Schulze-Leffert, 1989, EMBO J. 8, 651) whose expression is induced by ultraviolet irradiation. It is also known that the rice chitinase gene promoter and tobacco PR protein gene promoter are induced by specific compounds such as salicylic acid or jasmonic acid, and the lab16 gene promoter is also induced by spraying the plant hormone abscisic acid. It is.
[0079]
Terminators that can be used in the present invention include nopaline synthase gene terminator (Depicker, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1,561), octopine synthase gene terminator (Gielen, 1984, EMBO J. 3, 835) or the like.
[0080]
As a method for introducing a gene into a plant cell or a plant body, a generally known method such as “Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual, Draper, Blackwell Scientific Publications, 19” can be used. Examples thereof include biological methods (for example, methods using viruses or methods using Agrobacterium (Hood, 1993, Transgenic Res. 2,218, Toki S, Plant Mol. Biol. Reporter 15, 16. )), Physical / chemical methods (for example, electroporation method (Tada, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 475), polyethylene glycol method (Lazeri, 1991, Theor. Appl. Genet. 81, 437). Particle gun method (sanford, 1987, J. Part. Sci. Tech. 5, 27) and the like.
[0081]
As a plant material for use in introducing a polynucleotide, an appropriate material can be selected from leaves, stems, roots, tubers, protoplasts, callus, pollen, seed embryos, shoot primordia, etc., depending on the introduction method and the like. Although there is no restriction | limiting in particular as a plant cell, Plant cells, such as a rice, corn, a potato, a tobacco, etc. with which the system of the re-differentiation to a plant body is established are especially preferable. Selecting an appropriate introduction method and plant material can be easily done by one skilled in the art.
[0082]
When introducing a polynucleotide into a plant cultured cell, the polynucleotide is typically introduced by a physical / chemical method such as an electroporation method or a polyethylene glycol method using a protoplast as a material. When introducing a polynucleotide into a plant tissue, a material such as a leaf, stem, root, tuber, callus, pollen, seed embryo, shoot primordium (preferably leaf, stem, callus), virus or Agrobacterium The polynucleotide is introduced by a biological method using a physique or a physical / chemical method such as a particle gun method, preferably a biological method using Agrobacterium.
[0083]
In order to regenerate a complete plant from a plant tissue or a plant cell into which a polynucleotide sequence encoding an acidic thaumatin-like protein has been introduced by the above method, such a transformed plant tissue or transformed plant cell is regenerated. What is necessary is just to culture | cultivate in a differentiation culture medium or a hormone free MS culture medium. The rooted young plant body can be made into a plant body by transplanting and cultivating it in soil. The method of regeneration differs depending on the type of plant tissue or plant cell used, and selection of an appropriate regeneration method can be easily made by those skilled in the art. In various literatures, various plants (for example, rice (Fujimura, 1995, Plant Tissue Culture Lett. 2, 74), maize (Shillito, 1989, Bio / Technol. 7, 581, Golden-Kamm, 1990, Plant Cell 2). 603), potatoes (Visser, 1989, Theor. Appl. Genet. 78, 594), tobacco (Nagata, 1971, Planta 99, 12), etc.) are described.
[0084]
Whether or not the transgenic plant produced by the method of the present invention has resistance to pathogens is described in, for example, Methods for Isolation, Culture, Inoculation of Plant Pathogens, Japan Plant Protection Association. It can be easily confirmed by the method. For example, in the case of rice blast, as described in Example 4, the degree of lesion formation and the rate of lesion area when a particular rice cultivar is inoculated with a race of susceptible rice blast fungus to that cultivar is determined. It is possible to test by comparing the original cultivar and the recombinant, but the present invention is not limited to this. For example, for the resistance test for rice blast, in addition to the spray inoculation method used in this experiment, a hole was made in the rice leaf with an inoculation punch, and then a blast spore paste was placed on it to infect it. A punch inoculation method or a needle inoculation method in which a blast spore paste is attached to the tip of a needle and a leaf is pierced. In these inoculation methods, lesions develop so as to spread from the wounds of the leaves, and thus resistance strength can be assayed by measuring the extension length of the lesions (for example, K. Ohta et al., Methods for Isolation). , Culture, Inoculation of Plant Pathogens, pp. 37-41, Japan Plant Protection Association (1995)). In addition, for example, in the case of white leaf blight, as shown in Example 8, a plant tissue (for example, an adult leaf) to be tested for resistance is immersed in a bacterial suspension of blight, and the distance traveled by the lesion Or a spray inoculation method or a needle inoculation method. In either method, the extent of disease is evaluated by measuring the lesion area ratio of the entire leaf (see, for example, K. Ohta et al., Methods for Isolation, Culture, Innovation of Plant Pathogens, pp. 37-41, Japan). (See Plant Protection Association (1995)).
[0085]
By introducing and expressing a polynucleotide sequence encoding an acidic thaumatin-like protein by the method as described above, any plant that can infect a pathogen can be given as a “plant” that can impart or enhance resistance to the pathogen. Can be mentioned. In certain embodiments, the plant transformed according to the method of the present invention is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant. More specifically, examples of plants transformed according to the method of the present invention include, but are not limited to, rice, corn, wheat, barley, rye, bread wheat, potato, tobacco, eggplant, tomato and the like. Not.
[0086]
The “pathogen” to which the plant obtained according to the method of the present invention or its plant organ or tissue is resistant refers to any pathogen capable of infecting the plant, for example, fungi (including filamentous fungi), bacteria, viruses, etc. However, it is not limited to these.
[0087]
The pathogenic fungi include rice blast fungus, rice blight fungus, rice seed rot fungus, rice seedling blight fungus, rice blast fungus, rice yellow dwarf fungus, rice sesame leaf blight fungus, wheat rust fungus , Wheat powdery mildew fungus, potato blight fungus, tobacco blight fungus, tobacco gray mold fungus, tobacco dance fungus, fern rust fungus, blight fungus, snow rot fungus, vegetable fungus Fungus, powdery mildew fungus, gray mold fungus, anthracnose fungus, seedling blight fungus, carp wilt fungus, carnation wilt fungus, chrysanthemum rust fungus, cucumber downy mildew fungus, barley smut fungus, pear scab, fungus Examples include, but are not limited to, macular disease.
[0088]
As pathogenic bacteria, rice white leaf blight bacteria, rice seedling bacterial disease bacteria, rice foliage bacterial disease bacteria, rice sesame leaf blight bacteria, tobacco cavity disease bacteria, tobacco wildfire disease bacteria, soft rot bacteria of various vegetables , Spot bacterial disease bacteria, bacterial wilt disease bacteria, kidney bean wilt disease bacteria, nuclear fruit scab disease bacteria, mulberry leaf bacteriobacterium bacteria, cruciferous plant black rot bacteria, citrus scab disease bacteria, tomato scab disease bacteria, potato rings Examples include, but are not limited to, rot bacteria, potato scab bacteria.
[0089]
Pathogenic viruses include rice dwarf virus, rice stripe blight virus, wheat leaf mosaic virus virus, tobacco mosaic disease virus, tobacco ring spot virus disease virus, tobacco streak virus disease virus, cauliflower mosaic virus disease virus Potato mosaic virus, potato leaf curl virus, potato X virus disease virus, potato Y virus disease virus, cucumber mosaic disease virus, cucumber green spot mosaic disease virus, tomato yellow spot disease virus, soybean dwarf virus, pea Examples include, but are not limited to, stem rot virus and beet dwarf virus.
[0090]
The “complex disease resistance against at least two pathogens” indicated by the plant obtained according to the method of the present invention means at least two different classifications selected from taxonomic groups such as fungi (including filamentous fungi), bacteria, and viruses. By resistance to at least two pathogens to which it belongs. For example, resistance to at least two pathogens includes resistance to combinations of pathogenic fungi and pathogenic bacteria, resistance to combinations of pathogenic bacteria and pathogenic viruses, and combinations of pathogenic fungi and pathogenic viruses. The resistance to is mentioned.
[0091]
According to the present invention, a polynucleotide sequence encoding an acidic thaumatin-like protein introduced into a plant can be inherited from the plant body to the plant body through seeds to progeny. For this reason, the introduced polynucleotide sequence also exists in the seeds formed from the pollen or ovary of the plant body of the present invention, and the inheritance can be inherited to the offspring. Therefore, a plant into which a polynucleotide sequence encoding the acidic thaumatin-like protein of the present invention has been introduced can be grown without losing resistance to pathogens due to growth by seeds, for example. In addition, proliferation is possible without loss of disease resistance even by mass cultivation methods using plant tissue cells and conventional cuttings, grafting, and straining. Progeny or progeny obtained by such propagation are also encompassed by the present invention.
[0092]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, the scope of the present invention is not limited by these Examples.
[0093]
【Example】
The present inventors transformed a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) (Table 2) as an example of an acidic type thaumatin-like protein into rice using the Agrobacterium transformation method, It was successfully expressed in plants. As a result of further analysis of this gene, the present inventors have found that there is a significant correlation between the expression of this acidic thaumatin-like protein gene and disease resistance of plants. Those skilled in the art are aware that acidic thaumatin-like proteins and plants that can be used in the present invention are not limited to the specific examples described below, and similar effects can be obtained by similar acidic thaumatin-like proteins and plants. It is easy to see.
[0094]
(Example 1. Construction of an expression vector for expressing a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) gene)
The pear acid type thaumatin-like protein (PsTL1) gene was cloned at the Institute of Kihara Biology, Yokohama City University, pBluescriptSK ⁺ (Stratagene) was subcloned into the EcoRI site (Table 2, FIG. 1, Sassa, 1998, Planta 205, 514).
[0095]
[Table 2]

(Table 2: Characteristics of pear acid type thaumatin-like protein (PsTL1))
The thaumatin-like protein used in this study is an acidic form of pI4.8 expressed in the pear style. The molecular weight deduced from the amino acid sequence is 22.9 kDa, but increases to 32.0 kDa due to the addition of sugar chains in the cell.
[0096]
As a binary vector for transformation, pPZP202 (Hajdukiwicz, 1994, Plant Mol. Biol. 25, 989) was used. The basic experimental procedures for constructing the expression vector are the experimental document Molecular Cloning, 2nd edition (Sambrook, 1989 Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, and Current Protocols in Molecular Bios in Molecular Bios. I went in order. Plasmid vector pBluescriptSK used for transformation ⁺ (Stratagene), DH5α (Toyobo) was used for Escherichia coli. pPZP202 was treated with HindIII-BamHI (Takara Shuzo), and Ligation high (Toyobo) was used to ligate the CaMV35S improved REXφ promoter (Mittsuhara, 1996, Plant Cell Physiol. 37, 49). After treatment with SacI-EcoRI (Takara Shuzo), a NOS terminator (Depicker, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1,561) was ligated using Ligation high (Toyobo). After treatment with KpnI-SacI (Takara Shuzo), PsTL1 cDNA was incorporated into the sense using Ligation high (Toyobo). Finally, it was treated with HindIII-BamHI (Takara Shuzo), and Ligation high (Toyobo Co., Ltd.) was added to the hygromycin resistance gene (HPT: hygromycin B phosphotransferase, 1983, gene 25, 179) CaMV35S Promoter-O5 (Od). , Nature 313, 810) and NOS terminator were introduced as selection markers. An expression vector that highly expresses PsTL1 was constructed by the above method (FIG. 3).
[0097]
(Example 2. Production of PsTL1 transgenic rice line)
Production of a transgenic plant that highly expresses the pear acid type thaumatin-like protein gene (PsTL1) was carried out using an Agrobacterium method (Toki S, Plant Mol. Biol. Reporter 15, 16. Hiei, 1994, Plant J. et al. 6,271). As the Agrobacterium strain, EHA101 (Hood, 1986, J. Bacteriol. 168, 1291) was used.
[0098]
The expression vector constructed in Example 1 was transformed into Agrobacterium EHA101 by electroporation. The electroporation apparatus was GENE PULSERa II (BIO-RAD), and the introduction conditions were set to 200Ω, 25 μF, 2.5 kV, 0.2 cm cuvette. The electroporated Agrobacterium was suspended in the SOC medium and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 hours. LB plate medium containing 20 mg / l kanamycin and 100 mg / l spectinomycin (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l sodium chloride, adjusted to pH 5.8 with sodium hydroxide) Transformed individuals that spread and proliferated were selected.
[0099]
Agrobacterium into which the gene was introduced was infected with callus derived from rice cultivar “Dontokoi” (4 weeks). The “dontokoi” seeds were freed from cocoons to give brown rice, which was sterilized with 70% ethanol for 1 minute and washed twice with sterile distilled water. Further, it was sterilized with a 2.5% sodium hypochlorite solution for 40 minutes and washed twice with sterilized distilled water. The brown rice was adjusted to pH 5.8 by adding callus induction medium (30 g / l sucrose, 0.3 g / l casamino acid, 2.8 g / l proline, 2 mg / l 2,4-D, 4 g / I gellite solidified N6 medium (Chu, 1974, Sci. Sinica 18, 659)). Brown rice was grown in a light place at 28 ° C. to obtain callus. This callus was used for Agrobacterium infection.
[0100]
Agrobacterium 0.5 cm square cultured at 28 ° C. in an LB plate medium containing 20 mg / l kanamycin and 100 mg / l spectinomycin was scraped with a microspatel, and an AAM medium containing 10 mg / l acetosyringone (Toriyama, 1985, Plant Sci. 41, 179). This suspension was poured into callus and allowed to soak for 2 minutes. The callus was drained and then cultured at 28 ° C. for 3 days on a callus induction medium containing 10 mg / l acetosyringone. The callus after infection was washed 5 times with sterilized distilled water to remove excess Agrobacterium.
[0101]
The callus from which Agrobacterium had been removed was cultured for 2 weeks at 28 ° C. in a selective medium (callus induction medium containing 50 mg / l hygromycin and 300 mg / l carbenicillin), transferred again to the same medium, and further cultured for 2 weeks. As a result, the genetically modified callus became hygromycin resistant and grew on the selection medium.
[0102]
Regenerated medium containing 50 mg / l hygromycin and 200 mg / l carbenicillin (30 g / l sucrose, 30 g / l sorbitol, 2 g / l casamino acid, 20 μg / l NAA, 2.2 mg / l kinetin added) Then, it was adjusted to pH 5.8 and transplanted onto MS medium (Murashige, 1962, Physiol. Plant 15, 473) solidified with 4 g / l gellite. The redifferentiation medium was cultured twice at 28 ° C. for 2 weeks, and the redifferentiated solid was selected.
[0103]
Potted re-differentiated rice, and 200 lines of re-differentiated individuals (T ₀ ) In an isolated greenhouse. This is shown in FIG. The left side is the original variety “Dontokoi”, and the right side is a growing individual of the acidic thaumatin-like protein gene introduction line (TL192). The grown thaumatin-like protein transgenic lines did not show sterility or dwarfism, and apparently there was no significant difference from the original variety “Dontokoi” (FIG. 4). From these recombinant lines, T ₁ Seeds were collected.
[0104]
Example 3. T ₁ Removal of non-recombinant generations)
T from genetic law ₁ It was suggested that recombinant and non-recombinant individuals were mixed in the seed at a ratio of 3: 1. Of these, it was speculated that the recombinant individuals were resistant to hygromycin.
[0105]
So T ₁ Seeds and the original "Dontokoi" seeds were germinated on MS medium (Murashige, 1962, Physiol. Plant 15, 473) containing 50 mg / l hygromycin and solidified with 4 g / l gellite. Cultured for a week. T after culture ₁ Seeds and seeds of the original variety “Dontokoi” are shown in FIG. 5 (A: original variety “Dontokoi”, B: recombinant line). At the concentration of hygromycin used in the experiment, all seeds of the original cultivar “Dontokoi” were affected by hygromycin and turned black and died after germination (FIG. 5A). T seeded from thaumatin-like protein transgenic line ₁ Seeds were separated into normally grown individuals and withered individuals (FIG. 5B). The ratio was about 3: 1 (FIG. 4).
[0106]
Based on the above results, T ₁ Generation non-recombinant individuals could be removed. Moreover, as a result of analysis by the genomic Southern method performed later, T grown normally ₁ It was confirmed that the PsTL1 gene was introduced into the individual. T growing normally ₁ Generation strains were planted in seeding cases and grown to 4.5 leaf stage.
[0107]
(Example 4. Pathogenic fungus resistance test)
In this example, a pathogenic fungus resistance test was performed on a plant obtained by the method of the present invention using a blast fungus that is a filamentous fungus as a pathogenic fungus. Spray inoculation was used for inoculation of blast fungus (Yaegashi, 1995, Methods for Isolation, Culture, Inoculation of Plant Pathogens, Japan Plant Protection Association, 37).
[0108]
A rice blast fungus (Pyricularia oryzae Cav .: Race 007) was transplanted to a powdered oatmeal medium and cultured at 26 ° C. When the flora covered the petri dish, sterilized water was added, and the surface of the medium was rubbed with a paint brush to remove the aerial mycelium. Thereafter, the petri dish lid was removed, and spore formation was performed by irradiation with near-ultraviolet light (Furuta, 1967, Plant Protection 21, 160).
[0109]
4.5 Original varieties and recombinants (T ₁ ) Seedlings of rice blast fungus spores (5 × 10 spores) ⁸ / Ml) and inoculated in an inoculation box at 26 ° C. for 24 hours. The original varieties and recombinant lines after inoculation were moved to an isolated greenhouse, and lesions were observed. The result of this spray inoculation test is shown in FIG. In the photograph, the left plant group is the original variety (not inoculated), the middle plant group is the original variety (20 days after inoculation), and the right plant group is TL192 (20 days after inoculation). In the disease resistance test, lesion shape was determined and lesion area ratio was measured, and the number of days after inoculation of blast fungus and disease state was analyzed using the lesion index shown below (Asaga, 1981, J. et al. Cent. Agric. Exp. Stn. 35, 51).
[0110]
Disease spot index Disease state Disease spot area rate
0. No diseased lesions found 0%
1. Slight morbid lesions are observed 1%
2. Susceptible lesions at first glance 2%
3. Moderate morbid lesions 5%
4). 10% with many morbid lesions
5. 20% of suspicious lesions appear, or few dead leaves
6). 40% of dead leaves are recognized at first glance
7. 60% of dead leaves are moderately recognized
8). 80% with many dead leaves
9. 90% of all leaves are almost dead
10. 100% stem and leaf death
The results of this disease resistance test are shown in FIG. In FIG. 7, the horizontal axis represents the number of days after inoculation, and the vertical axis represents the lesion index. In the figure, black diamonds are WT (wild type), white squares are recombinant (192-1), black triangles are recombinant (192-2), X is recombinant (192-3), and black circles are Recombinant (192-4) is shown.
[0111]
As a result, susceptible lesions that were not different from the original cultivar were observed in the recombinant. In addition, a line was found in the recombinant that delayed the progression of blast disease compared to the original variety (FIGS. 6, 7; T ₁ Generation: TL192). Although these individuals showed susceptible lesions of blast, the lesion area rate was very small. Therefore, it was revealed that the PsTL1 recombinant line brings field resistance type resistance against blast.
[0112]
(Example 5. Confirmation of PsTL1 gene introduction by genomic Southern method)
PsTL1 recombinant line (T ₁ ) Genomic DNA was extracted from the leaf blades using the CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) method (Murray, 1980, Nucleic Acids Res. 8, 4321). After 10 g of the above-ground part of rice was frozen with liquid nitrogen, it was pulverized in a mortar. Rice in powder form was mixed with 1.5 × CTAB solution (1.5% CTAB, 75 mM Tris-HCl, pH 8.0, 15 mM EDTA pH 8.0, 1.05 M sodium chloride), and lightly mixed at 56 ° C. for 20 minutes. After permeating and eluting the DNA, chloroform extraction was performed twice to remove the protein. 1/10 volume of 10% CTAB and 1.5 volume of precipitation solution (1% CTAB, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, pH 8.0) were added to this solution to precipitate DNA. This DNA was dissolved in 1M sodium chloride, and RNA was digested with Ribonuclease A, followed by ethanol precipitation to extract genomic DNA.
[0113]
The extracted genomic DNA (10 μg) was treated with restriction enzymes EcoRV, PstI and HindIII, and electrophoresed on a 1.2% agarose gel for 18 hours. The gel after electrophoresis was immersed in a hydrolysis solution (0.25M HCl solution) for 10 minutes and in alkali-denatured (1.5M NaOH, 0.5M NaCl) for 30 minutes and shaken lightly. Thereafter, the DNA was transferred to a nylon membrane (Hybond-N + (Amersham pharmacia biotech, Inc.)) using an alkaline transfer solution (0.4 M NaOH). The nylon membrane to which genomic DNA was transferred was baked at 80 ° C. for 2 hours to immobilize the DNA, and then genomic Southern hybridization was performed using PsTL1 cDNA (about 0.9 kbp) as a probe (Southern, 1975, J Mol.Biol.98,503). For detection of Southern hybridization, AlkPhos Direct (Amersham pharmacia biotech, Inc.) was used. For ECL (Enhanced Chemiluminescence), use a wash solution with a concentration of 0.2 × SSC. For Alkphos (alkaline phosphatase), use the wash solution described in the protocol recommended by the supplier. Washing was performed at 55 ° C.
[0114]
The result is shown in FIG. In FIG. 8, lane 1 is the original variety EcoRV, lane M is 1 kb DNA ladder, lane 2 is TL192 EcoRV, lane 3 is TL192 PstI, and lane 4 is TL192 HindIII.
[0115]
As a result of Southern hybridization, no band hybridized with the PsTL1 probe was found in the original cultivar, whereas one from the acidic thaumatin-like protein recombinant line (TL192) used for the blast disease inoculation test. A band was detected (Figure 8). Therefore, it was revealed that one copy of the PsTL1 gene was introduced into these recombinant lines.
[0116]
(Example 6. Confirmation of mRNA expression of PsTL1 by Northern method)
Original variety and PsTL1 recombinant line (T ₁ ) Total RNA was extracted from the leaf blades by the CTAB / LiCl method (Chang, 1993, Plant Mol. Biol. Report 11, 113). After 2 g of the above-ground part of rice was frozen with liquid nitrogen, it was pulverized in a mortar. Rice in powder form is mixed with 10 volumes of 2 × CTAB solution (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M sodium chloride, 1% mercaptoethanol), and 10 at 60 ° C. RNA was eluted by light permeation for 5 minutes, and then chloroform extraction was performed twice to remove proteins. 1/4 volume of 10M lithium chloride was added to this solution to precipitate RNA. RNA was dissolved in TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0), phenol / chloroform extraction was performed, lithium chloride extraction was performed once again by the above method, and total RNA was isolated. .
[0117]
Isolated total RNA (30 μg) was electrophoresed on a 1.2% agarose denaturing gel containing 6.3% formaldehyde and using 20 × SSC (3 M sodium chloride, 300 mM trisodium citrate dihydrate). The total RNA was transferred to a nylon membrane (Hybond-N + (Amersham pharmacia biotech, Inc.)). Northern hybridization was performed on the nylon membrane onto which the total RNA had been transcribed using PsTL1 cDNA (about 0.9 kbp) as a probe (Alwine, 1977, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5350). AlkPhos Direct (Amersham pharmacia biotech, Inc.) was used for detection of Northern hybridization.
[0118]
These results are shown in FIG. A is a total RNA image and B is a Northern hybridization image. Both A and B show the original varieties, TL183, TL192, and TL194, in order in lanes 1-4.
[0119]
As a result of Northern hybridization, no band hybridized with the PsTL1 probe was confirmed in the original cultivar, whereas acidic thaumatin-like protein recombinant lines (TL183, 192, and 194), a band of about 1,500 bp was confirmed (FIG. 9, arrow). Therefore, it was revealed that PsTL1 mRNA was expressed in these recombinant lines.
[0120]
(Example 7. Confirmation of PsTL1 protein expression by Western method)
The basic experimental procedure for protein expression analysis by Western method (Towbin, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354) is the experimental document Molecular Cloning, 2nd edition (Sambrook, 1989, Cold Spring). (Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). The primary antibody against the pear acid type thaumatin-like protein derived from rabbit was provided by the Kihara Biology Laboratory, Yokohama City University (Sassa, 1998, Planta 205, 514). As the secondary antibody, Alkaline phosphatase conjugated Affinipurate Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (Jackson) was used. AP detection kit (BIO-RAD) was used for antibody detection. Other general-purpose solutions include PBS (137 mM sodium chloride, 8.1 mM disodium hydrogen phosphate, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM sodium dihydrogen phosphate, pH 7.4), TBS (137 mM sodium chloride, 2. 68 mM potassium chloride, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4), sodium phosphate solution pH 7.0 (disodium hydrogen phosphate: sodium dihydrogen phosphate = 39: 61), Diss solution (250 mM Tris-HCl, pH 6.8) 8% SDS, 40% glycerol, 80 μg / ml bromophenol blue).
[0121]
Original variety and PsTL1 recombinant line (T ₁ ) 0.2 g of leaf blades were frozen in liquid nitrogen and then ground in a mortar. Powdered rice was mixed with 800 μl of protein extract (100 mM sodium phosphate solution pH 7.0, 1 mM PMSF, 1% 2-mercaptoethanol, 1% PVP, 4% complete (Roche)) and 800 μl of sample solution ( Diss solution: 2-mercaptoethanol = 92: 8). Thereafter, the mixture was heated at 100 ° C. for 5 minutes, centrifuged and the supernatant was used as a sample.
[0122]
100 μg of a sample extracted from rice leaves was subjected to electrophoresis using a 12.5% SDS-PAGE gel and a trisglycine solution (25 mM Tris-HCl, pH 8.2, 200 mM glycine, 1% SDS). The gel after electrophoresis was electroblotted (NA-1513: Nippon Aido) on a PVDF membrane (Immun-Blot PVDF membrane, BIO-RAD) pretreated with methanol. The PVDF membrane to which the protein has been transferred is immersed in a primary blocking solution (PBS, 0.05% Tween 20, 10% skim milk) for 1 hour, and then immersed in a secondary blocking solution (PBS, 0.05% Tween 20, 1% BSA). The pear acid-type thaumatin-like protein antibody diluted 10,000 times with a TBS-T solution containing 0.05% sodium azide (TBS, 0.05% Tween 20) was used as the primary antibody. Western hybridization was performed overnight. The membrane was washed 3 times with a washing solution (PBS, 0.05% Tween 20), immersed in a secondary blocking solution and shaken for 30 minutes, and further a secondary antibody solution (secondary antibody, PBS, 0.05% Tween 20, 1 % BSA, 0.05% sodium azide) for 40 minutes. The membrane was washed three times with a washing solution, and then detected using an alkaline phosphatase color development kit (NBT / BCIP: BIO-RAD).
[0123]
The result is shown in FIG. In FIG. 10, lane 1 shows the total protein extracted from the pear style, lane 2 shows the original variety, lane 3 shows TL183, lane 4 shows TL192, and lane 5 shows TL194.
[0124]
As a result of the analysis by Western method, the expression of PsTL1 was not confirmed from the original cultivar, whereas the acidic thaumatin-like protein recombinant lines (TL183, 192, and 194), a band was confirmed at a position of about 32 kDa (FIG. 10, arrow). Therefore, it was revealed that PsTL1 protein was expressed in these recombinant lines. Moreover, since the band detected from the recombinant strain was 32 kDa, it was suggested that sugar chain addition was performed to the thaumatin-like protein also in the rice cell.
[0125]
(Example 8. Pathogenic bacteria resistance assay)
In the present Example, the pathogenic bacteria resistance test of the plant obtained by the method of the present invention was performed using white leaf blight fungus as the pathogenic bacteria. In Example 4 above, the PsTL1 recombinant strain (T ₁ ) Was grown on adult seedlings. In addition, a white leaf blight fungus (Xanthomonas campestris pv. Oryzae: race 3-A) was prepared from potato hemi-synthetic medium (potato 300 g, calcium nitrate 0.5 g, disodium hydrogenphosphate 12 hydrate 2 g, peptone 5 g, sucrose 15 g The mixture was grown on 20 g of agar and 1 l of distilled water. 10 ml of distilled water was placed in a test tube, and 0.5 cm square of white leaf blight fungus was suspended to prepare a suspension for inoculation. Original variety and PsTL1 recombinant line (T ₁ ) Was cut off with scissors soaked in a suspension of white leaf blight fungus and inoculated with white leaf blight (Tushishima, 1995, Methods for Isolation, Culture, Inoculation of Plant Pathogens, Japan Plant Aspect). 28).
[0126]
Twenty days later, the resistance to white leaf blight was tested by measuring the distance at which the white leaf blight progressed from the tip of the leaf. The result is shown in FIG. In the figure, WT is the leaf of the original variety, and TL1922-2 and TL192-8 are the recombinant lines (T ₁ ) (20 days after inoculation) PsTL1 recombinant line (T) compared to the original variety (WT) ₁ In the generation: TL192-2, 8), the development of white leaf blight was delayed. One original variety (6 leaves) and T of thaumatin-like protein gene recombination line (TL192) ₁ The progress of white leaf blight was measured for 9 generations (each 10-21 leaves) and summarized in a graph (FIG. 12). In FIG. 12, the horizontal axis represents a plant individual subjected to the test (WT: wild type, TL1922-1 to 9: recombinant line), and the vertical axis represents white leaf blight disease progression (cm). Many TL192 strains were delayed in the progression of leaf blight disease compared to the original cultivar. Therefore, it was revealed that the PsTL1 recombinant line brings resistance to leaf blight.
[0127]
【The invention's effect】
This report suggests that acidic thaumatin-like protein plays an important role in disease resistance in plants. By introducing and expressing a polynucleotide encoding an acidic thaumatin-like protein into plant cells, particularly higher plant cells, according to the method of the present invention, pathogenic bacterial resistance or combined disease resistance can be imparted to plants. Plants having pathogenic bacteria resistance or compound disease resistance produced according to the method of the present invention have resistance to various pathogens, so that productivity is improved, yield is stabilized, quality is improved, and agricultural chemicals are used. It is expected to be effective in reducing the production cost and working hours, and reducing the burden on the environment. In addition, due to disease resistance, it is considered that high yields can be secured even in developing countries where organic farming methods and pesticide use are difficult.
[0128]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the base sequence and translated amino acid sequence of pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) cDNA.
FIG. 2 is a diagram showing a sequence comparison between acidic thaumatin-like proteins based on amino acid sequences.
FIG. 3 is a diagram showing the construction of an expression vector (pPZP202) for PsTL1 gene.
FIG. 4 is a biomorphological photograph showing the morphology of a thaumatin-like protein gene recombination line (TL192).
FIG. 5: Recombinant line T ₁ It is the biomorphism photograph which shows the mode of hygromycin selection of a seed.
FIG. 6 is a biomorphic photograph showing the results of a spray inoculation test for rice blast (race 007).
FIG. 7 is a graph showing the degree of resistance of the recombinant strain (TL192) to blast.
FIG. 8 is an electrophoresis diagram showing confirmation of a transgene by a genomic Southern method.
FIG. 9 is an electrophoretogram showing the investigation of PsTL1 mRNA expression by the Northern method.
FIG. 10 is a blot diagram showing confirmation of PsTL1 protein expression by Western method.
FIG. 11 is a biomorphological photograph showing the results of an inoculation test for white leaf blight.
FIG. 12 is a graph showing the degree of resistance to bacterial leaf blight of an acid type thaumatin-like protein gene recombinant line.

Claims (52)

A method for producing a plant resistant to pathogenic bacteria, wherein the polynucleotide encodes the following acidic thaumatin-like protein:
(A) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) having the amino acid sequence described in amino acid residues 1 to 244 of SEQ ID NO: 2; or (b) the pear acidic type thaumatin-like protein. A polynucleotide encoding a protein having one or more amino acid insertions, deletions, and / or substitutions in the amino acid sequence of (PsTL1), wherein the protein is acidic and has antifungal activity nucleotide,
A method comprising introducing into a plant cell an expression vector containing and capable of expression.   The method further comprises the step of expressing the plant cell introduced with the expression vector into a plant body expressing the polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein and having resistance to pathogenic bacteria. The method according to 1.   The method according to claim 1 or 2, wherein the pathogenic bacterium is a white leaf blight bacterium (Xanthomonas campestris).   The method of claim 1, wherein the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.   The method according to claim 4, wherein the plant is a monocotyledonous plant.   The method according to claim 5, wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.   The method according to claim 6, wherein the gramineous plant is rice. A method for producing a plant resistant to pathogenic bacteria, wherein the polynucleotide encodes the following acidic thaumatin-like protein:
(C) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide residues 35 to 766 of SEQ ID NO: 1; or (d) the pear acidic type thaumatin-like A polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a polynucleotide encoding the protein (PsTL1);
A method comprising introducing into a plant cell an expression vector containing and capable of expression.   The method further comprises the step of expressing the plant cell introduced with the expression vector into a plant body expressing the polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein and having resistance to pathogenic bacteria. 9. The method according to 8.   The method according to claim 8 or 9, wherein the pathogenic bacterium is Xanthomonas campestris.   The method according to claim 8, wherein the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.   The method according to claim 11, wherein the plant is a monocotyledonous plant.   The method according to claim 12, wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.   The method according to claim 13, wherein the gramineous plant is rice. A method for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens, the polynucleotide encoding the following acidic thaumatin-like protein:
(A) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) having the amino acid sequence described in amino acid residues 1 to 244 of SEQ ID NO: 2; or (b) the pear acidic type thaumatin-like protein. A polynucleotide encoding a protein having one or more amino acid insertions, deletions, and / or substitutions in the amino acid sequence of (PsTL1), wherein the protein is acidic and has antifungal activity nucleotide,
The expression vector may contain and express comprising the step of introducing into a plant cell,
The at least two pathogens, comprising at least one pathogenic fungi and at least one pathogenic bacteria or at least two pathogenic bacteria, methods.   The method further comprises the step of expressing the plant cell introduced with the expression vector into a plant body that expresses a polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein and has a compound disease resistance against at least two pathogens. Item 16. The method according to Item 15. It said pathogen comprises pathogenic fungi and pathogenic bacteria, the method according to any one of claims 15 or 16.   The method of claim 17, wherein the at least two pathogens are a combination of pathogenic fungi and pathogenic bacteria.   19. The method of claim 18, wherein the at least two pathogens are a combination of Pyricularia oryzae and Xanthomonas campestris.   The method according to claim 15, wherein the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.   21. The method of claim 20, wherein the plant is a monocotyledonous plant.   The method according to claim 21, wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.   23. The method of claim 22, wherein the gramineous plant is rice. A method for producing a plant having combined disease resistance to at least two pathogens, the polynucleotide encoding the following acidic thaumatin-like protein:
(C) a polynucleotide encoding a pear acidic type thaumatin-like protein (PsTL1) comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide residues 35 to 766 of SEQ ID NO: 1; or (d) the pear acidic type thaumatin-like A polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a polynucleotide encoding the protein (PsTL1);
The expression vector may contain and express, comprising the step of introducing into a plant cell,
The method wherein the at least two pathogens comprise at least one pathogenic fungus and at least one pathogenic bacterium or at least two pathogenic bacteria .   The method further comprises the step of expressing the plant cell introduced with the expression vector into a plant body that expresses a polynucleotide encoding the acidic thaumatin-like protein and has a compound disease resistance against at least two pathogens. Item 25. The method according to Item 24. It said pathogen comprises pathogenic fungi and pathogenic bacteria, the method according to any one of claims 24 or 25.   27. The method of claim 26, wherein the at least two pathogens are a combination of pathogenic fungi and pathogenic bacteria.   28. The method of claim 27, wherein the at least two pathogens are a combination of Pyricularia oryzae and Xanthomonas campestris.   25. The method of claim 24, wherein the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.   30. The method of claim 29, wherein the plant is a monocotyledonous plant.   The method according to claim 30, wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.   32. The method of claim 31, wherein the gramineous plant is rice.   A plant tissue produced by the method of claim 1.   34. The plant tissue of claim 33, selected from the group consisting of callus and bud primordia.   A plant produced by the method according to claim 2, wherein the plant expresses the acidic thaumatin-like protein and has resistance to pathogenic bacteria.   A plant tissue obtained from the plant according to claim 35.   37. The plant tissue of claim 36, wherein the plant tissue is selected from the group consisting of leaves, stems, roots, pollen, seed embryos, and seeds.   A plant tissue produced by the method according to claim 8.   39. The plant tissue of claim 38, selected from the group consisting of callus and bud primordia.   A plant produced by the method of claim 9, wherein the plant expresses the acidic thaumatin-like protein and is resistant to pathogenic bacteria.   A plant tissue obtained from the plant according to claim 40.   42. The plant tissue of claim 41, wherein the plant tissue is selected from the group consisting of leaves, stems, roots, pollen, seed embryos, and seeds.   A plant tissue produced by the method of claim 15.   44. The plant tissue of claim 43, selected from the group consisting of callus and bud primordia.   17. A plant produced by the method of claim 16, wherein the plant expresses the acidic thaumatin-like protein and has combined disease resistance against at least two pathogens.   A plant tissue obtained from the plant according to claim 45.   47. The plant tissue of claim 46, wherein the plant tissue is selected from the group consisting of leaves, stems, roots, pollen, seed embryos, and seeds.   A plant tissue produced by the method of claim 24.   49. The plant tissue of claim 48, selected from the group consisting of callus and bud primordia.   26. A plant produced by the method of claim 25, wherein the plant expresses the acidic thaumatin-like protein and has combined disease resistance against at least two pathogens.   A plant tissue obtained from the plant according to claim 50.   52. The plant tissue of claim 51, wherein the plant tissue is selected from the group consisting of leaves, stems, roots, pollen, seed embryos, and seeds.

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