JP3711367B2 - Knockout animals - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子トラップ法によるランダム変異ESクローン技術により得られた胚幹細胞及びノックアウト動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトの進展で、ヒトゲノムの構造解析は2003年又はそれ以前に終了すると言われている。したがって、個々に遺伝子を単離し、構造解析を行なう時代ではなく、ゲノムの「機能解析」の時代に入ったといえる。
【０００３】
しかし、ゲノムの塩基配列のみでは、機能に関する情報は十分でないため、機能解析のための新しい解析系が必要である。さらに、ヒトゲノム解析の一つの大きな目標はヒト疾患の原因遺伝子の解明であるが、原因遺伝子の構造だけでは病気を説明することはできない。また、ヒト患者を用いて実験することはできず、発症機構を解析することはできない。
したがって、原因遺伝子の同定後の発症過程の解析と新たな治療法の開発のためには、モデル個体の作製が必須課題となっている。
【０００４】
一方、ゲノムを、その構造から遺伝子部分とそれ以外の部分に分けるとすれば、それぞれ別個の機能を有すると考えられ、両者の機能を解析することが必要である(図1)。ゲノム全体から見れば、個々の遺伝子は一部の機能しか果たしておらず、ゲノムは単に遺伝子の集合体ではなく、まだ知られていない機能を有しているとも考えられる。事実、position effect mutationという新しい概念が成立したことから、ゲノムには機能が未知の領域を有するものと推察される。
【０００５】
遺伝子部分については、調節領域とコード領域があるが、現在ゲノム機能解析の標的となっているのは、コード領域である。ヒトとマウスを比べてみても、遺伝子の種類はほぼ同じであるため、調節領域の機能解析は重要である。但し、ヒトの遺伝子とマウスの遺伝子との間には、種の相違がある。この違いは、タンパク質の違いではなく、遺伝子発現の調節の違いによるものと思われる。
【０００６】
発現調節にあずかる転写因子等の機能は、遺伝子のコード領域の配列から解明することができる。その転写因子が結合するエレメントの解析は、一つの遺伝子の調節領域内に多数存在するので、機能の解明は現在のところ極めて困難である。但し、機能解析の一手法として、細菌人工染色体を用いる方法等が考え得る。
【０００７】
コード領域の機能解析のレベル（対象）は、mRNAレベル、蛋白レベル、細胞レベル、組織・臓器レベル、個体レベルが考えられる。mRNAレベルは、DNAチップで対応できると考えられる。他方、mRNA以外のレベルの解析を考えるとき、胚幹細胞（ES細胞）を利用するのが最も良い方法と思われる。なぜなら、ES細胞から直接in vitroで、各種細胞や組織の誘導糸が開発されているものもあるし、今後開発され得る可能性のあるものも多いからである。また、個体レベルの解析系が樹立できる利点もあるためである。
【０００８】
上記から、ゲノムの機能解析を考える上でも、ES細胞レベルでの遺伝子破壊とそのマウスの作製は極めて重要であることがわかる。
これまでは、ES細胞を用いた相同遺伝子組換え法が、遺伝子破壊マウス作製において主役を演じていたが、これを個々の遺伝子破壊マウスを作製するという戦術としてではなく、網羅的に作製するという戦略的な立場からみたとき、大きな問題点がある。
【０００９】
第1は、時間がかかりすぎることである。遺伝子破壊マウス作製において、ES細胞を用いた相同組換えによるノックアウトESクローンを単離することが律速段階となっている。1人の熟練した研究者でも、ノックアウトESクローンを単離するには最低3ヵ月かかるので、年間4遺伝子を破壊できるにすぎない。従って、10万個の遺伝子にそれぞれ一つの変異を導入する場合は、1年あたり25,000人が必要とされる。現在世界中で、1年間に約1000系統の遺伝子破壊マウスが作製されていると見積もられている。そうすると、ノックアウトESクローンを10万種類作製するのに100年かかることになる。これでは、2003年に終了するといわれているヒトゲノムの構造解析の進展と比較しても、現実的ではない。
【００１０】
第2は、コストがかかりすぎることである。1系統の遺伝子破壊マウス作製のため、人件費及び減価償却費を除いても、最低200〜400万円必要である。したがって、10万個の単純な遺伝子破壊マウス作製だけで2,000〜4,000億円必要となる。以上のように、従来のES細胞を用いた相同遺伝子組換えには問題点があり、また、ゲノムは巨大ではあるが、数は決まっている。従って、この中から重要な機能を持つ遺伝子を単離することが必要となる。遺伝子の機能については、遺伝子破壊マウスを作製して初めて明らかになることが多いことから、遺伝子破壊マウスは将来画期的な薬剤の開発等にも直結し、極めて付加価値が高い。従って、「ランダム」かつ「大規模」にマウスの変異体作製を行なうのが世界の「戦略」となっており、現在のところ、以下に述べる3つの方法が、ランダム変異マウス作製において、もっとも妥当であると考えられている。
【００１１】
第１は、変異原物質であるエチルニトロソウレア(ethylnitrosourea:ENU)を用いる方法である。ENUを用いた方法による大規模な突然変異体作製のプロジェクトがヨーロッパで開始されている。ドイツではヒトゲノムプロジェクトの一貫として哺乳類遺伝学研究所のパリング博士を中心として1997年度に開始した。英国においてもスミスクライン社が資金を提供し、Harwe11にあるMRCのマウスゲノムセンターにおいてブラウン博士を中心として主に脳・神経系の突然変異マウスを樹立することを目的として開始している。現在までに、両者併せて、優性遺伝を示す変異マウスが約200系統樹立され、予想よりもよい効率でプロジェクトが進行している。米国においてもケースウエスタンリザーブ大学やオークリッジ国立研究所を中心として、膨大な予算(年間60億円)でマウスゲノムの構造解析やENU法による変異体作製が始まることとなった。
【００１２】
ENUを成熟雄マウスに投与すると、減数分裂前の精原細胞に作用し、1細胞当たり約50-100カ所に点突然変異をランダムに引き起こす。そして、1つの遺伝子座につきおよそ1/1,000/配偶子の頻度で突然変異が起こる。したがって、1匹の処理マウスを雌マウスと交配することにより、F1世代で多種類の変異マウスを作製できる。また、ENUを用いる方法は、特定の遺伝子座について1,000匹をスクリーニングすれば、1匹はその遺伝子に変異が生じている確率となるため、極めて効率がよいと考えられている。
【００１３】
第2は、やはり変異原物質であるクロラムブシルを用いる方法である。この方法によれば、ENU法と同じ頻度で精原細胞に突然変異を引き起こす。ただし、この場合は時に1メガベースに及ぶ欠失変異が生じる。
第3は遺伝子トラップ法によるものである。遺伝子トラップ法とは、マーカー遺伝子を含むトラップベクターをES細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を指標として未知遺伝子の探索を行なうことを目的として開発された方法である。トラップベクターの組み込みはランダムであり、その組込みにより、殆どの場合内在性遺伝子（本来、その細胞や組織に存在する遺伝子）は破壊される。したがって、そのES細胞を用いてキメラマウスを作製することにより、種々の遺伝子破壊マウスを作製できる。
しかしながら、これら変異原物質を用いる方法及び遺伝子トラップ法は、それぞれ利点と欠点を有する(表１)。
【００１４】
【表１】
ENU法は、変異マウスの作製は容易であるが、個々の変異系統の樹立は、交配により分離を行わなければならない。また、変異した遺伝子の同定には、まず多型DNAマーカーを用いた連関解析により遺伝子座を同定し、その後にポジショナルクローニング法により遺伝子を単離しなければならない。従って、ENU法は操作が煩雑である。
【００１６】
クロラムブシル法は、変異マウスの作製は容易であるが、欠失部位を同定しなければならず、そのためには多数の多型DNAマーカーを用いて解析する必要がある。また、一般的に、クロラムブシル法などの変異原物質法では、大規模の飼育室を必要とするため、費用及び労力がかかる。
【００１７】
遺伝子トラップ法は、変異マウスの作製に手間と技術を要するが、変異遺伝子の同定は容易であり、飼育室の規模に応じて実験可能である。遺伝子トラップESクローンはそれ自体ゲノム機能解析のための貴重なリソースとなり、この点も他の方法と際立って異なる点である。
【００１８】
遺伝子トラップ法についても、世界のいくつかの研究室で変異体作製が始まっている。米国では、民間のレキシコンジェネティクス社がレトロウイルスベクターを用いた遺伝子トラップによるランダム破壊を行なっている。しかし、遺伝子をトラップできていても、内在性遺伝子を破壊できているかどうかが定かでないこと、生殖キメラマウスが作製できるかどうかが不明であること、キメラマウス作製は別料金を要求されること、利用するに当たって相当な金額を要求していることなどから、一般の研究者にとっては殆ど利用できない状況である。また、ドイツではENUプロジェクトの一貫としても12,000クローンを目標として遺伝子トラップが行なわれている。いずれにしても、マウス系統の樹立よりも、トラップした遺伝子の解析を先行させる方法で進められている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トラップベクターを用いた遺伝子トラップ法によりトラップされた遺伝子が導入されたノックアウト動物を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究の結果、遺伝子トラップ法にバクテリオファージ由来の組換えシステムである、Cre-loxPを利用することを思いつき、本発明を完成するに至ったものである。ここでCreは組換え酵素であり、1oxP配列を認識して、この部位で組換えを起こすものである。
【００２１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
(1) 逆反復配列１、スペーサー配列及び逆反復配列２の順で構成される1oxP配列のうち逆反復配列１及び/又は逆反復配列2の一部の配列に変異が導入された変異型1oxPを含むトラップベクターを導入してなる胚幹細胞又はノックアウト動物であって、Tubedown-1遺伝子が破壊された胚幹細胞又はノックアウト動物。
変異型1oxPとしてはlox71（例えば配列番号１に示されるもの）又はlox66（例えば配列番号２に示されるもの）が挙げられる。また、トラップベクターとしては、以下の(a)〜(j)に示すものから選ばれるいずれかのものが挙げられる。
【００２２】
(a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV
(d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(f) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(g) (lox71が組み込まれたSA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(h) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロモーター-M-lox511-SD
(i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV
(j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV
(SAはスプライスアクセプターを、SDはスプライスドナーを、IRESは分子内リボゾームエントリー部位を、Mはマーカー遺伝子を、puroはピューロマイシン耐性遺伝子を、pAはポリA配列を、PVはプラスミドベクターを表す。)
上記ノックアウト動物としては、ノックアウトマウスが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
１．概要
本発明は、遺伝子トラップ法によりトラップされた遺伝子が導入された胚幹細胞及びノックアウト動物に関するものである。遺伝子トラップ法の概要を図2に示す。まず、本発明の目的を達成するためトラップベクターを構築し、これを胚幹細胞（ES細胞）に導入してトラップクローンを単離及び選択する（図２A〜C）。図２ではpU-8(pU-Hachiともいう)トラップベクターを例示する。その後、キメラ動物（例えばキメラマウス）を作製してトラップクローン由来のマウスを作製する（図２F〜G）。一方、単離及び選択されたトラップクローンを用いて、トラップされた遺伝子の単離及び配列決定、並びにプラスミドレスキューによるゲノムの回収を行う（図２C〜E）。さらに、クローンを電気穿光法及びピューロマイシン等の薬剤選択を行い、トラップされた遺伝子を発現させ、ESクローンのマウス系列の作製を行う（図２H〜I）。
【００２４】
本発明においてトラップされた遺伝子は、胚様体形成によるスクリーニング法により、発生や細胞増殖に関連する遺伝子を効率よくトラップしているかどうかを、遺伝子の種類を調べることで検討した。その結果、Tubedown-1遺伝子がトラップされていることが分かった。このことは、胚様体形成によるスクリーニング系が、よく機能していることを示している。Tubedown-1遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であると考えられており、in vitroにおいては血管形成や血球の発達に関与すると考えられる。
【００２５】
本発明において、遺伝子トラップにより実際に内在性遺伝子が破壊されるかどうかを調べることが重要なポイントの一つであるので、上記遺伝子について、トラップ部位の構造を解析した。その結果、トラップベクターは、上記Tubedown-1遺伝子のエクソン内にされており、遺伝子が部分的に破壊されていた。したがって、本発明の遺伝子トラップ法により、効率よく内在性遺伝子を破壊できることが明らかとなった。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００２６】
２．トラップベクターの構築
遺伝子トラップ法とは、トラップベクターをES細胞に導入すると、偶然及びランダムにマウス内在性遺伝子に組込まれることを利用して、未知遺伝子をゲノム上でトラップするというものである。「遺伝子トラップ」とは、トラップベクターがゲノム上の特定の遺伝子に入り込んで、当該特定の遺伝子を捕まえることを意味し、遺伝子を捕らえるためのベクターを「トラップベクター」という。遺伝子にはエンハンサー、プロモーター、エクソン、ポリAなどが存在し、それぞれを捕獲することができるが、そのためには、目的に応じた構造を持つトラップベクターを使用することができる。
【００２７】
一般に、エクソントラップベクターは、スプライスアクセプターのみを有するレポーター遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子、及びプラスミド部分から構成されており、マウス内在性遺伝子の下流に組み込まれたときにのみ、レポーター遺伝子が発現する。換言すれば、トラップベクター中のレポーター遺伝子の発現をモニターすることで、内在性遺伝子への組込みを知ることができる。また、pUC19などのプラスミドをトラップベクターに連結しておくと、いわゆるプラスミドレスキュー法と呼ばれる手法により、トラップした内在性遺伝子を単離することができる。「プラスミドレスキュー法」とは、エレクトロポレーション法等により形質転換された細胞をアンピシリン選別等にかけて目的の遺伝子を回収する方法である（図2E）。しかも、トラップ時にその遺伝子を破壊するので直ちに遺伝子破壊マウスを作製することができる。さらに、レポーター遺伝子はマウス内在性遺伝子の発現調節領域に支配されて発現するので、内在性遺伝子の発現の組織特異性、時期特異性を簡単に解析することができる。
【００２８】
従来の遺伝子トラップ法では、遺伝子を完全に破壊できても、ヒト遺伝病で見られるような小さな変異、例えば1アミノ酸置換といった変異を導入することができず、またヒト遺伝子と置換することもできないという問題点があった。そこで、本発明は、これらの問題点を解消するため、バクテリオファージ由来の組換えシステムである、Cre-loxPを改変し、それを遺伝子トラップ法に利用することにより、一旦遺伝子トラップベクターを組み込ませてマウス遺伝子を破壊した後、トラップベクター内の変異lox部位に、任意の遺伝子を挿入できることとしたものである。これによって、ヒト遺伝病で見られるような小さな変異、例えば1アミノ酸置換といった変異を導入することが可能となり、またヒト遺伝子と置換することも可能となる。本発明のトラップベクターは、種々の遺伝子をトラップするために使用することができるが、エクソントラップ又はプロモータートラップ用として好ましく使用することができる。
【００２９】
1oxP（locus of crossing (X-ring) over, P1）は34塩基(5'-ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat-3')からなる配列であり（配列番号３）、5'末端から13塩基(逆反復配列１という)、及び3'末端から13塩基の配列(逆反復配列２という)が、それぞれ逆反復配列を構成し、「gcatacat」により示される8塩基のスペーサーと呼ばれる配列が上記逆反復配列１及び２に挟まれている（図３）。「逆反復配列」とは、スペーサーを境界として一方の側の配列が、他方の側の配列と、互いに向き合う方向に相補的であるような配列を意味する。換言すれば、一方の側の配列のうちセンス鎖の配列が、他方の側の配列のアンチセンス鎖と、互いに向き合う方向に相同であることを意味する。方向が互いに向き合っており、二本鎖を形成したときの配列自体は同一で繰り返されているため、逆反復配列と呼ばれる。図３に示す通り、二本鎖のうち一方の鎖（例えばセンス鎖）において、紙面左側の逆反復配列１（5'-ataacttcgtata-3'：配列番号４）の5'→3'方向の配列が、紙面右側の逆反復配列２（5'-tatacgaagttat-3'：配列番号５）の5'←3'方向の配列に対し、相補的という関係になっている。
【００３０】
1oxPは、通常の配列と異なり方向性を有する。従って、本発明において、上記5'→3'の向きで1oxPの配列を表示するときは、その表示中に紙面左向きの矢印（例えば図３の矢印１）を含めることとする。
Cre（causes recombination）とは、遺伝子組換えを起こさせる組換え酵素（リコンビナーゼともいう）を意味し、上記反復配列を認識し、スペーサー部の「cataca」を粘着末端とする切断様式で切断する(図3)。
【００３１】
ところで、バクテリアの中では、2カ所の1oxP間で組換えが起こり、挿入または削除反応が起こる。哺乳類細胞で挿入反応を起こすことができれば、後に任意の遺伝子を挿入できるので、応用性は格段に広がる。哺乳類細胞では核が大きいため、一旦削除されたloxPを持つ環状DNAは拡散してしまい、挿入反応は殆ど観察されない。
【００３２】
そこで、本発明者は、挿入反応を起こすために1oxP配列に変異を導入し、一旦遺伝子がゲノムに挿入されると挿入された遺伝子は削除できない（ゲノムから脱離しない）ようにすることを考え、このため2種類の変異型1oxPを準備した（図４）。
【００３３】
１つは、loxPの反復配列（センス鎖側）のうち紙面左側の反復配列（ATAACTTCGTATA）の左から5塩基までを、「TACCGTTCGTATA」となるように置換変異(下線部が変異させた部分。)を導入したものであり、これを「lox71」と名付けた（配列番号１；図4b）。もう１つは、loxPの紙面右側の反復配列（TATACGAAGTTAT）を、右から5塩基まで「TATACGAACGGTA」(下線部が変異させた部分。)となるように置換変異を導入したもので、これを「1ox66」と名付けた（配列番号２；図4b）。
【００３４】
ゲノム上の1ox71とプラスミド上のlox66との間で組換えが起こると、挿入されたDNAの5'側（紙面左側）にはloxPの両側の反復配列が変異したもの（「1ox71/66」という：TACCGTTCGTATA GCATACAT TATACGAACGGTA：配列番号６）が、右側には野生型の1oxP(ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT：配列番号３)が配置される（図4a）。その結果、Creはもはや1ox71/66を見分けることができず、loxPとの間で組換えを起こせず、ゲノムに遺伝子は挿入されたままとなる。すなわち、loxP同士の相同組換えの場合は、切り出されたloxPを含む環状DNAが物理的に離れるので、挿入よりも削除に反応は傾く。一方、染色体側にlox71を、及び環状DNA側にlox66を用いると、組み込まれたときに生ずるlox71/66をCreリコンビナーゼは認識できにくくなり、削除反応より挿入反応に傾くため、挿入状態が維持される（図５）。ここで、本発明においては、染色体側にlox66を、環状DNA側にlox71を用いることもできる。
【００３５】
実際に、ES細胞にあらかじめ1ox71などの変異型loxP（以下「変異型lox」ともいう）を組込んでおき、そこに他の変異型loxP （例えばlox66）を含むプラスミドを導入すると、プラスミドがゲノムに組込まれる。したがって、例えばこのlox71をあらかじめ遺伝子トラップベクターに組込んでおけば、あとでいかなる遺伝子でも1ox66を用いて挿入することが可能となる。つまり、小さな変異を導入した遺伝子やヒトの遺伝子で置換することも可能となった。
【００３６】
この変異型lox(1ox71又はlpx66)を利用した遺伝子トラップベクターは、以下の通り構築することができる(図６A)。但し、以下のトラップベクターは例示であって、限定されるものではない。従って、以下のベクターにおいて、変異型loxとしてlox71を例示するが、これに限定されるものではなく、lox71の代わりにlox66を用いたものも、本発明のトラップベクターに含まれる。また、変異型loxPとはせずに、通常のloxPを用いたトラップベクターを構築することもできる(図６B)。
【００３７】
(a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV
(d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(f) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(g) (lox71が組み込まれたSA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(h) (lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロモーター-M-lox511-SD
(i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV
(j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV
【００３８】
上記ベクターの構成要素において、SAはスプライスアクセプターを、SDはスプライスドナーを、IRESは分子内リボゾームエントリー部位を、Mはマーカー遺伝子を、puroはピューロマイシン(puromycin)耐性遺伝子を、pAはポリA配列を、PVはプラスミドベクターを表す。
【００３９】
ところで、トラップベクターがゲノムDNAに組み込まれる際に、ほとんどのケースでベクターの一部が欠失し、その結果、ベクターの重要な部分が欠失する場合がある。本発明では、そのような欠失を防ぐためのダミーとして任意配列を付加することが好ましい。このような任意配列をSP配列という。SP配列は、上記ベクターの先頭部、最後尾部又はそれらの両方に付加することができる。図６Aにおいて、pU-8及びpU-12にはSP配列（「Sp」と表示）を最後尾に付加した態様を示し、図６Bにおいて、pU-San及びpU-Rokには先頭部及び最後尾の両方に付加した態様を示した。また、SP配列自体は自由に決定することができる。SPの配列の長さは100〜1000塩基、好ましくは300〜400塩基である。また、公知の任意配列をSPに使用することができる。公知配列としては、例えばウサギβ-グロビン遺伝子の一部等が挙げられる。
【００４０】
スプライスアクセプターは、スプライシングの際にエキソンの3'末端側に連結することができる配列を意味する。
スプライスドナーは、スプライシングの際にエキソンの5'末端側に連結することができる配列を意味する。
【００４１】
IRESは、分子内リボゾームエントリー部位（internal ribosomal entry site）と呼ばれ、タンパク質合成の際にアミノアシルt-RNAが結合するリボゾーム上の部位（A部位）であり、CAP非依存的に翻訳を開始できるようにするための配列である。
【００４２】
マーカー遺伝子は、本発明のベクターが標的遺伝子をトラップできたか否かを示すマーカーとなる遺伝子であり、大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ遺伝子）、又はlacZ遺伝子とネオマイシン（G418）耐性遺伝子との融合遺伝子（β-geo遺伝子）、CAT遺伝子、GFP遺伝子、SV40ラージT遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４３】
プラスミドベクターは、遺伝子トラップ後に内在性遺伝子をプラスミドレスキュー法により単離するために使用されるものである。従って、トラップベクター内のプラスミド（大腸菌で増やせるもの）の一部を利用して当該プラスミド部分の近接領域を回収することができる。例えば、プラスミドにゲノムDNAが連結された場合において、制限酵素処理によりプラスミドとゲノムDNAとが連結した断片を切り出し、切り出した断片を環状にした後、大腸菌に導入して増殖させると、プラスミドに近接したゲノムDNAを回収することができる。プラスミドベクターとしては、例えばpBR322、pUC(pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等)、pSP(pSP64, pSP65等)、pGEM（pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z等）等が挙げられる。なお、プラスミドベクターには、supF、アンピシリン耐性遺伝子、複製開始点、及びクローニングのための制限酵素部位（例えばマルチクローニング部位）を単独で又は適宜組み合わせて連結しておくことができる。
【００４４】
上記(a)に示すベクターをpU-8という。pU-8の基本部分（SA-IRES-β-geo-pA：図7)は、pGT1.8IRESbetageoに由来している。このpGT1.8IRESbetageoは、マウスEn-2遺伝子由来のスプライスアクセプター、脳心筋炎ウイルス由来のIRES、β-geoを含んでいる。このpGT1.8IRESbetageoのBglII部位に1ox71を組み込んだ後、SalIで処理し、SalI断片を用意しておく。一方、pUC19などのベクターに180塩基対のSP配列、1oxP、及びマウスホスホグリセレートキナーゼ-1（PGK）由来のpoly A付加シグナルを、ベクターのLacZ配列が除去された改変型ベクターに挿入することによりプラスミドpEBN-SE7tiを作製する。このプラスミドの制限酵素SalI部位にSA-IRES-lox71-β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-8を作製する。したがって、この構造は、5'側から順に任意配列、スプライスアクセプター、1ox71、IRES、β-geo、pA、loxP、pA、pUC19、任意配列である（図７）。
【００４５】
上記(b)に示すベクターをpU8deltaという。pU8deltaは、pU-8のスプライスアクセプターを削除したベクターである。このベクターは、lox71がレポーターであるβ-geoの前に、1oxPがβ-geoの後ろに接続された構成となっている。このような構成としたのは、ベクターが組込まれたのちに、Creを一過性に発現させることで、中間のIRESとβ-geo部分を完全に除去できるからである。その結果、プラスミドpUC19が上流に存在するマウス内在性遺伝子の近傍に位置することになり、マウス内在性遺伝子を容易に単離することができる。
【００４６】
上記(c) に示すベクターを「pU-12」という。このベクターは、SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PVで構成されている。pU12トラップベクターを構築するために、まずpE3NSE7のPGK poly(A)シグナルをピューロマイシン耐性遺伝子＋PGK poly(A)シグナルに置き換え、さらにその下流のBglII部位にlox511を挿入する。得られるプラスミドの制限酵素部位にpU-HachiからのSA-IRES-lox71-β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-12を得ることができる。
【００４７】
上記(d) に示すベクターを「pU-15」という。このベクターは、lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511で構成されている。ここで、「lox2272」は、loxPのスペーサー領域（gcatacat）のうち、第２番目のcをgに、第７番目のaをtに置換した配列（ggatactt）を有するものをいう。また、「lox511」は、loxPのスペーサー領域（gcatacat）のうち、第２番目のcをtに置換した配列（gtatacat）を有するものをいう。lox511及びlox2272は、loxP配列のスペーサー部分に変異があるため、それ自身（lox511同士、lox2272同士）とは組換えを起こすが、loxPやlox71とは組換えを起こさない変異lox配列である。なお、lox2272及びlox511の配列順序はどちらを前方又は後方にしてもよく、任意に選択することができる（以下同様）。
【００４８】
上記(e) に示すベクターを「pU-16」という。このベクターは、lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511で構成されており、pU-15のlox71とマーカー（β-geo）との間にIRESを挿入することにより作製することができる。
上記(f) に示すベクターを「pU-17」という。このベクターにおいて、1ox71はSAの一部の領域に挿入されている。例えば、pSPプラスミドに、lox511、loxP、PGK poly(A)シグナル、lox2272を挿入してプラスミドを構築し、次に、pU-HachiのSA内にlox71配列を挿入し、続いてβ-geoをこの順に挿入する。このプラスミドを、先に構築しておいたプラスミドと連結することにより、pU-17を得ることができる。
【００４９】
上記(g)に示すベクターを「pU-18」という。このベクターも、pU-17と同様、SAの中にlox71が挿入されている。pU-18は、pU-17のSAとβ-geoとの間にIRESを挿入することにより得ることができる。
上記(h)に示すベクターは、(lox71が組み込まれたSA)-M-loxP-pA-lox2272-プロモーター-M-lox511-SDで構成される。このベクターは、pU-17内のPVの代わりに プロモーター及びMをこの順で挿入し、lox511の後方にSDを連結することにより得ることができる。このベクターには、プロモーターが付加されている。プロモーターとしては、特に限定されるものではなく、任意のものを使用することができる。例えば、後述の形質転換体作製の項に記載の細菌由来プロモーター、酵母由来プロモーターなどのほか、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、T7RNAポリメラーゼプロモーター、T3RNAポリメラーゼプロモーターなどのRNAポリメラーゼプロモーター、あるいは、EF1（伸長因子１）プロモーター、PGK(グリセロリン酸キナーゼ)プロモーター、MC1(ポリオーマエンハンサー/単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどの哺乳動物由来プロモーターを例示することができる。
【００５０】
上記(i)に示すベクターを「pU-San」といい、上記(j)に示すベクターを「pU-Rok」という。pU-Sanは、pU-8に使用されているlox71がloxPとなっていることを除き、その構成はpU-8と同じである。換言すれば、pU-SanのloxPをlox71で置換すると、pU-8となる。pU-Rokは、pU-SanのSAとIRESとの間にloxPを挿入することにより得ることができる。
【００５１】
３．遺伝子トラップ
前記の通り作製されたベクターを用い、2段階の遺伝子トラップを行う。
第1段階は通常の遺伝子トラップ法である。「通常の遺伝子トラップ」とは、ES細胞に前記トラップベクターを導入し、ES細胞内に本来的に存在する内在性遺伝子をトラップすることを意味する。これにより、ES細胞中の内在性遺伝子は破壊される。なお、このES細胞を用いて、後述の遺伝子破壊動物（例えばノックアウトマウス）を作製することができる。そして、トラップされた内在性遺伝子（図８、遺伝子X）を単離した後に、大腸菌の中で部位特異的変異導入法等の方法でこの遺伝子に微細な変異を導入し（図８、遺伝子X'）、これをプラスミド上で1ox66の下流につなぎ、第２段階の遺伝子トラップを行う（図８）。なお、遺伝子Xに変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K又はMutan-G(宝酒造）)などを用いて、あるいは、LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット（宝酒造）を用いて変異の導入が行われる。
【００５２】
第２段階の遺伝子トラップは、1ox66の下流に連結された内在性遺伝子の変異型（遺伝子X'）をES細胞に導入することを意味する。これにより、第１段階で導入されたトラップベクターの1ox71部位が、第２段階で導入したベクターのlox66との間で組換えを起こし、「（lox71/66)-(遺伝子X')-(loxP)」で構成されるカセットを含む改変した遺伝子を導入できる(図８)。
この方法によれば、改変した内在性遺伝子のみならず、ヒト遺伝子で置換することも可能であり、あらゆる遺伝子を導入することができる。これを本発明において可変型遺伝子トラップ法と名付ける。
【００５３】
４．トラップベクターが組み込まれたクローン（ES細胞）のスクリーニング
遺伝子トラップベクターをES細胞に導入しネオ耐性クローンを選別すれば、これらはマウス内在性遺伝子の下流にトラップベクターが組み込まれているクローンであるとみなされる。これらのクローンからDNAを抽出し、サザンブロット法等により解析し、トラップベクターが1コピーのみ組み込まれているクローンを選択する。この選択方法を用いることにより、効率良くマウス遺伝子をトラップしているクローンを選択できることがわかったので、これをスクリーニング系として用いる。
【００５４】
(1)ネオ耐性クローンの単離
本発明において、トラップベクターをES細胞に導入するには、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が採用される。例えば、トラップベクター100μgを電気穿孔法(バイオラッドGenePulserを用い、800V, 3μFの条件下)にて0.8m1のリン酸緩衝液中に浮遊させた3000万個のTT2 ES細胞に導入し、200μg/m1の濃度のG418存在下で培養する。1週間後に、ネオ耐性クローンを単離する。
【００５５】
遺伝子トラップベクターはES細胞のゲノム上にランダムに組み込まれる。したがって、単にトラップベクターをES細胞に導入しただけでは、必ずしも遺伝子の中に組み込まれるわけではなく、遺伝子とは関係のない場所にも組み込まれる。しかし、トラップベクター内には薬剤耐性遺伝子であるネオ耐性遺伝子がまれているので、それが発現している細胞は、ネオマイシン(G418ともいう)耐性となる。逆に言えば、ネオマイシン存在下で生存する細胞は、ネオ耐性遺伝子を発現していることになる。トラップベクター内のネオ耐性遺伝子は、ES細胞で発現しているマウスの遺伝子の下流に組み込まれないと発現しない。したがって、発現するということは、ある遺伝子の下流に組み込まれたことを意味する。
【００５６】
(2)組込みパターンによるESクローンの選別
ESクローンから常法にしたがってDNAを抽出し、サザンブロット法等により組込みパターンを解析する。サザンブロットのパターンが単一バンドとして現れた場合は、1コピーのみが組込まれていると判断できるため、そのパターンを表したDNAを選別する。これは、プラスミドによるマウス内在性遺伝子の単離を容易に行なえるクローンを選別するためであり、また、1コピーでネオ耐性となるクローンでは、実際にマウス遺伝子をトラップしている確率が極めて高いからである。
【００５７】
５．キメラ動物作製によるトラップ系統（トランスジェニック動物）の樹立
キメラ動物の作製は標準的な方法で行う（図9）。本発明において作製されるキメラ動物の種類は特に限定されるものではない。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ等が挙げられる。本発明においては、取り扱いが容易で繁殖もしやすいマウスが好ましい。
【００５８】
ネオマイシンで選別したES細胞を動物由来の桑実胚と凝集させ（ES細胞と桑実胚との集合体を形成させること）、キメラ動物胚(例えば胚盤胞まで発生したもの)を作製する。これらを不妊雄と交尾し偽妊娠状態となった仮親の子宮に移植する。例えばマウスの場合は約17日後に子が生まれるので、仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。
【００５９】
その後正常な雌と交配し、F1を得て変異動物系統を樹立する。系統（トランスジェニック動物）樹立ができたもののみについて以下の解析を行なう。なお、F1からの精子、及び該精子を用いて体外受精を行なって得られる2細胞期胚は、超急速凍結法にて凍結保存しておくことができる。
【００６０】
(1)発現パターンの解析
F1動物を交配し、胚（例えばマウスの場合9.5日目のもの）と成体における発現パターンを解析する。
(2)表現型の解析
樹立した動物系統について、ヘテロ及びホモ動物の表現型を解析する。表現型の解析は、肉眼的観察、解剖による内部の観察、各臓器の組織切片、X線撮影による骨格系、行動や記憶、血液を用いて行う。
【００６１】
(3)トラップした遺伝子の単離と構造解析、染色体地図の作成
トラップクローンからDNAの単離と塩基配列の決定を行ない（後述）、ホモロジーサーチを行なう。その結果、得られた配列情報が既知遺伝子、EST、未知遺伝子及びリピートのいずれに属するのか、区別しておく。ESTと未知遺伝子については、染色体地図を作成することもできる。染色体地図は、蛍光in situ hybridization(FISH)法、またはマイクロサテライトプローブ等を用いた連関解析若しくは放射線照射による雑種細胞を用いた解析によって行なう。染色体上の位置が明らかになれば、既存の変異マウスの位置と対比し、一致するかどうかも調べておく。
【００６２】
(4)データベース構築
樹立した各系統について、マーカー遺伝子の胚（例えばマウスの場合10日目の胚）と成体における発現パターン、F1およびF2動物における表現型、トラップした動物内在性DNAの塩基配列、ESTと未知遺伝子についてはその染色体上の位置について、データベースを作成する。
【００６３】
６．ノックアウト動物
本発明のノックアウト動物は、遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。その処理方法について説明する。
本発明において使用し得る動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ等が挙げられる。本発明においては、取り扱いが容易で繁殖もしやすいマウスが好ましい。
【００６４】
未知遺伝子を含むゲノム DNAを、動物ES細胞から調製したゲノムDNAから PCRにより、又はゲノムライブラリーから得、これに本発明のトラップベクターに組み込む。この操作により、このエクソンの機能は破壊される。これと同時にベクターの中にネガティブ選別用のチミジンキナーゼ (tk) 遺伝子又はジフテリア (DT) 毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーション等によりトラップベクターをES細胞に導入し、この細胞をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ選別用の核酸類似体 FIAU (fluoroiodoadenosyluracil)、又はジフテリア毒素の存在下で培養する。この選別によりトラップベクターが挿入されたES細胞のみが残る。このESクローンでは、破壊されたエクソンを含む遺伝子がノックアウトされる。得られた細胞を仮親の子宮に移植し、その後生まれるキメラ動物を選ぶ。キメラ動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得られ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体を得ることができる。
【００６５】
なお、ノックアウトマウスが得られたことの確認は、外見上の異常の有無及び解剖を行った際の諸組織-臓器の異常を観察することもできる。さらに、組織からRNAを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析し、必要に応じて血液を採取し、血液検査や血清生化学検査を実施してもよい。
【００６６】
７．遺伝子の単離、組換えベクターの構築及び形質転換体の作製
(1) 遺伝子の単離
本発明においては、前記の通りトラップされた遺伝子のクローニングを行い、構造解析を行うことができる。
【００６７】
トラップクローンからDNAの単離は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、トラップクローンのmRNAからクローニングする場合は、まず、トラップクローンをグアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全RNAを得た後、オリゴdT-セルロース又はセファロース2Bを担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A+)RNA(mRNA)を得る。得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。このようにして得られた二本鎖cDNAを適当な発現ベクター(例えばλgt11等)に組み込むことによって、cDNAライブラリーを得る。
【００６８】
上記の通り得られた遺伝子について塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はDNAポリメラーゼを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができる。通常は、自動塩基配列決定装置等により塩基配列を決定することができる。また、cDNAの5'領域又は3'領域の塩基配列が未決定の場合は、5'-RACE法、3'-RACE等を用いて全塩基配列の決定を行う。RACE (Raped Amplification of cDNA Ends)法は、当該技術分野において周知であり（Frohman,M.A. et al., Methods Enzymol. Vol. 218, pp340-358 (1993)）、RACEを行うためのキットも市販されている（例えば、MarathonTM cDNA Amplification Kit; CLONETECH社、その他）。
【００６９】
本発明においてノックアウトされたTubedown-1遺伝子の塩基配列を配列番号７に、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。塩基配列解析の結果、トラップベクターは配列番号７に示す塩基配列の413番目と414番目との間に挿入されていた。なお、Tubedown-1遺伝子の翻訳領域は、配列番号７に示す塩基配列の355番目から2949番目であることから、トラップベクターはゲノムのエクソン領域に挿入されたものと考えられる。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用いたPCRによって、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００７０】
(2) 組換えベクターの構築
目的とする遺伝子断片を精製し、ベクターDNAと連結する。ベクターとしては、ファージベクター、プラスミドベクター等の任意のものを用いることができる。DNAとベクターとの連結手法は、当該分野で周知である(J. Sambrook, et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。
【００７１】
(3) 形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主は、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
【００７２】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972))、エレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990))等が挙げられる。
【００７３】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978))、酢酸リチウム法(Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983))等が挙げられる。
【００７４】
動物細胞を宿主とする場合は、COS細胞、Vero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウス骨髄腫細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、EF1プロモーター、PGKプロモーター、MC1プロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが挙げられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００７５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕 遺伝子トラップベクター変異体の作製
(1) pU-8トラップベクターの構築
pU-8ベクターはpGT1.8IRESβ-geoに由来し、マウスEn-2遺伝子からのSA配列と、脳心筋炎ウイルス由来のIRES配列に連結したβ-geo配列とを含有する。まず、lox71のBamHI断片をpGT1.8IRESβ-geoのBglII部位に挿入した。次いで、ウサギβ-グロビン遺伝子の一部である180bpの配列、loxP配列、及びマウスホスホグリセレートキナーゼ-1（PGK）由来のpoly A付加シグナルを、ベクターpUC19のLacZ配列が除去された改変型ベクターに挿入することにより、プラスミドpEBN-SE7tiを構築した。SP配列は、トラップベクターの3'側を保護するために使用した。プラスミドpEBN-SE7tiのSalI部位にSA-IRES-lox71-β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-Hachiを得た。
【００７６】
(2) pU-12トラップベクターの構築
pU-12トラップベクターを構築するために、まずpE3NSE7のPGK poly(A)シグナルをピューロマイシン耐性遺伝子＋PGK poly(A)シグナルに置き換え、さらにその下流のBglII部位にlox511を挿入したプラスミドを作製した。そのプラスミドのSalI部位にpU-HachiからのSA-IRES-lox71-β-geoのSalI断片を挿入することにより、pU-12を得た。
【００７７】
(3) pU-17トラップベクターの構築
まず、pSP73（Promega）に、lox511、loxP、PGK poly(A)シグナル、lox2272をこの順で挿入し、プラスミドpSP5PP2を構築した。次に、pU-HachiのSA内に2箇所あるBamHIのうち上流のBamHI部位で切断し、pBluescriptII KS+ プラスミドに、SA前半のBamHIまでのDNA断片、lox71配列、SA後半BamHIからKpnIまでのDNA断片、β-geoのNcoIからSalI部位までをこの順に挿入し、プラスミドpKS+S71Aβgeoを構築した。このpKS+S71Aβgeoからlox71を含むSA-βgeoのXbaI断片を切り出し、これをpSP5PP2のSpeI部位に挿入することによりpU-17を得た。
【００７８】
(4) pU-San及びpU-Rokトラップベクターの構築
pU-Sanベクターは、pU-8を作製する際に使用したlox71の代わりにloxPを使用した点以外は、pU-8と同様にして構築した。pU-Rokベクターは、pU-SanのSA(En2)とIRESとの間にloxPを挿入することにより構築した。
【００７９】
〔実施例2〕 ES細胞クローンの選別
ネオマイシン耐性初代マウス線維芽細胞をPEF培地でコンフルエントに培養した後、100μg/mlマイトマイシンCで3時間処理し、0.25％トリプシンで処理した。トリプシン処理した細胞を、0.01％ゼラチンコート培養ディッシュに播種し、ES細胞用フィーダー細胞とした。pU-8トラップベクターを用いたエレクトロポレーションにおいては、100μgのSpeIで消化したDNA及び3×107個のES細胞を用いた。ES細胞を0.8mlのPBSに懸濁し、Bio-Rad Gene Pulserを用いて、以下のいずれかの条件でエレクトロポレーションを行った。
【００８０】
（i）電極間距離： 0.4 cm、電圧：0.2 kV、キャパシタンス： 960μF、抵抗：無し
(ii)電極間距離： 0.4 cm、電圧： 0.8 kV、キャパシタンス： 3μF、抵抗：無し
48時間後、200μg/mlのG418の存在下で培養した。選別を7日間維持し、コロニーを24ウェルプレートにまいて増殖させ、凍結保存した。トラップクローンをサザンブロッティングにより解析し、単一コピーの組み込みパターンを示す細胞株を選別した。
【００８１】
トラップクローンからβ-geo配列を除去するため、pCAGGS-Cre（Araki, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:160-164,1995; Araki, K. et al., Nucl. Acids Res.,25:868-872,1997; Araki, K. et al., J. Biochem. Tokyo, 122: 977-982, 1997）を環状の形態でエレクトロポレーションにより導入した。細胞数が1.5×107個、PBS容量が0.4mlであることを除き上記と同一の条件でエレクトロポレーションを行った。
【００８２】
処理された細胞の半分を1枚の100mmプレートにまき、48時間増殖させた。次に、1×103個/プレートの濃度で100mmのプレートに再度まき、コロニーを形成させた。1週間後、コロニーを取り上げ、DNA調製のために増殖させた。
トラップベクターのlox71部位に組み込みが行われるよう設計した共エレクトロポレーションを行うため、20μgの各プラスミド（p662IEGPPac, p662INZPPac又はp66PGKPac-5）及びpCAGGS-Creを環状形態で使用した。
【００８３】
なお、プラスミドp66PGKPac-5は、lox66断片及びPGKプロモーター-ピューロマイシン耐性遺伝子コード配列を、pSP73ベクター（Promega）に挿入することにより構築した。プラスミドp662IEGPPacは、pSP73ベクター（Promega）、IRES配列、EGFP遺伝子（Clonetech）、PGKプロモーター、Pca遺伝子及びlox66配列から構築した。プラスミドp662INZPPacは、p662IEGPPacのEGFP遺伝子を、SV40ラージT遺伝子由来の核局在シグナルと融合したlacZ遺伝子で置換することにより構築した。
【００８４】
PBS中、1×107個/0.8mlの細胞をエレクトロポレーションにかけた（200V, 950μF）。48時間後、2μg/mlのピューロマイシンを用いて3日間選別にかけ、その後通常の培地に細胞を移した。エレクトロポレーション後9日目にコロニーを取り上げ、増殖させた。
【００８５】
公知方法（Abe, K.,Niwa,H. et al., Exp. Ce11 Res. 229: 27-34, 1996）に従って胚様体（EB）の生産を行った。ES細胞中のβ-ガラクトシダーゼ活性及びEBは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)で染色することにより測定した(Gossler, A. and Zachgo, J., Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, A. (ed.), Oxford University Press, Oxford, 1993, pp.181-227)。
【００８６】
トラップベクターpU-8を直鎖状にしてTT2 ES細胞に導入し、クローン（Ayu-8030クローン）を単離した。Ayu-8030クローンは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、平成13年（2001年）５月23日付で寄託されている（受託番号：FERM P-18341）。
【００８７】
〔実施例3〕 キメラマウスの作製及び遺伝子解析
(1) マウスへのクローン導入
トラップしたESクローン（Ayu-8030）をICRマウス由来の８細胞期胚と凝集させ、１晩培養した。翌日、ES細胞と８細胞期胚とが凝集しあい、1つの胚盤胞へと発生したものを選択した。これらのキメラ胚約20個を不妊雄と交尾した雌（仮親）の子宮の中へ移植した。約17日後に出生し、性成熟する生後８週以降にキメラマウスを雌のマウスと交配し、ESクローン由来のF1マウス(ヘテロ接合体)個体を得た。
F1個体同士を交配したが、ホモ接合体は8.5日胚より前に致死であるが、ヘテロ接合体は正常に生まれ、外観上特に目立った表現型は見られなかった。
【００８８】
(2) トラップした遺伝子の解析
(i)RNAの抽出
トラップしたES細胞（Ayu-8030）からのサンプルにTRIzol reagent（GIBCO-BRL、Gaithersburg, MD）を加え、ポリトロンホモジナイザーで細胞を破壊した。0.2倍量のクロロホルムを加え激しく振とう後、４℃で15分間遠心し、上層を注意深く取った。等量のプロパノールを加え、撹拌し沈殿させた。遠心後上清を捨て沈殿したRNAを75%エタノールでリンスし、風乾した。0.5 ml TEに溶解し、-80℃で保存した。
【００８９】
(ii)トラップされた遺伝子のcDNAの解析
上記RNAサンプルを元に、5'-RACE法を用いてトラップされた遺伝子の一部（約380bp)を得た。使用したプライマーは5'-TCCTCTTTGTTAGGGTTCTTCTTC-3'（配列番号9）であった。インターネット上に登録されている遺伝子（ESTを含む）のデータベースを検索したところ、数種のマウスESTとホモロジーが高いことがわかった。トラップベクターは開始コドンのすぐ近くの下流に挿入されていた。
また、RT-PCRにより、開始コドンから終始コドンまでの配列を含む約3KbのcDNAフラグメントを得、正確な塩基配列を決定した。
RT-PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
5'-AGTTACCACGTGAACCGCC-3'（配列番号10）
5'-CAAAGTCATTCCATTTGCTTGT-3'（配列番号11）
【００９０】
(iii)結果
上記の通り得られた遺伝子の塩基配列決定を行った結果、配列番号７に示す配列が得られた。これは、公知のTubedown-1遺伝子に相当することが判明した。従って、本発明のノックアウトマウスは、Tubedown-1遺伝子が破壊されたものであることが判明した。
【００９１】
【発明の効果】
本発明により、ノックアウトマウスが提供される。本発明のノックアウトマウスは、血管形成や血球の発達のプロセス、あるいはこれらをターゲットとした新薬の開発のためのモデル動物として利用できる。
【００９２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
IDE, HIROYUKI
<120> KNOCKOUT ANIMAL
<130> P01-0333
<140>
<141>
<160> 11
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 1
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 2
ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 3
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 4
ataacttcgt ata 13
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 5
tatacgaagt tat 13
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 6
taccgttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 7
<211> 3000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (355)..(2949)
<400> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 9
tcctctttgt tagggttctt cttc 24
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 10
agttaccacg tgaaccgcc 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 11
caaagtcatt ccatttgctt gt 22
【００９３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号10：合成DNA
配列番号11：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】遺伝子部分とそれ以外の部分における両者の機能解析の概念を示す図である。
【図２】本発明のトラップベクターの構築法及び遺伝子のトラップ法の概要を示す図である。
【図３】 1oxPの構造を示す図である。
【図４】 lox71とlox66との組換えを示す図である。
【図５】変異型loxPによるDNA断片の挿入を示す図である。
【図６Ａ】本発明のトラップベクターを示す図である。
【図６Ｂ】本発明のトラップベクターを示す図である。
【図７】トラップベクターpU-Hachiの構築図である。
【図８】 2段階の可変型遺伝子トラップ法を示す図である。
【図９】キメラ動物作製によるトラップ系統の樹立の概要を示す図である。
【符号の説明】
１：矢印[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an embryonic stem cell and a knockout animal obtained by a random mutation ES clone technique using a gene trap method.
[0002]
[Prior art]
With the progress of the Human Genome Project, the structure analysis of the human genome is said to end in 2003 or earlier. Therefore, it can be said that we have entered the age of “functional analysis” of the genome, not the age of individual gene isolation and structural analysis.
[0003]
However, since information on the function is not sufficient with only the genomic base sequence, a new analysis system for functional analysis is required. Furthermore, one major goal of human genome analysis is to elucidate the causative genes of human diseases, but the structure of causative genes alone cannot explain the disease. In addition, it is impossible to conduct experiments using human patients, and it is not possible to analyze the onset mechanism.
Therefore, in order to analyze the onset process after identification of the causative gene and to develop a new treatment method, preparation of a model individual has become an essential issue.
[0004]
On the other hand, if the genome is divided into a gene part and other parts from its structure, it is considered that each has a separate function, and it is necessary to analyze the functions of both (FIG. 1). From the viewpoint of the entire genome, each gene has only a partial function, and it is considered that the genome is not merely a collection of genes but has a function not yet known. In fact, since a new concept of position effect mutation was established, it is presumed that the genome has a region whose function is unknown.
[0005]
Regarding the gene part, there are a regulatory region and a coding region, but the coding region is currently targeted for genome function analysis. When humans and mice are compared, the types of genes are almost the same, so the functional analysis of the regulatory region is important. However, there are species differences between human genes and mouse genes. This difference is likely due to differences in gene expression regulation, not protein differences.
[0006]
Functions of transcription factors involved in expression regulation can be elucidated from the sequence of the coding region of the gene. Since there are many analyzes of the elements to which the transcription factor binds within the regulatory region of one gene, it is extremely difficult to elucidate the function at present. However, as a method of functional analysis, a method using a bacterial artificial chromosome can be considered.
[0007]
The functional analysis level (target) of the coding region may be mRNA level, protein level, cell level, tissue / organ level, and individual level. It is considered that the mRNA level can be handled by a DNA chip. On the other hand, when considering analysis at a level other than mRNA, it seems that the best method is to use embryonic stem cells (ES cells). This is because there are some that have been developed in vitro from ES cells directly in vitro, and many that can be developed in the future. This is also because there is an advantage that an analysis system at the individual level can be established.
[0008]
From the above, it can be seen that gene disruption at the ES cell level and the production of the mouse are extremely important in considering the functional analysis of the genome.
So far, homologous gene recombination methods using ES cells have played a leading role in the creation of gene-disrupted mice, but this is not a tactic for creating individual gene-disrupted mice, but comprehensively. From a strategic standpoint, there are major problems.
[0009]
The first is that it takes too much time. Isolation of knockout ES clones by homologous recombination using ES cells is the rate-limiting step in the generation of gene-disrupted mice. Even one skilled researcher can only disrupt four genes annually, as it takes at least three months to isolate a knockout ES clone. Therefore, if one mutation is introduced into 100,000 genes, 25,000 people are required per year. Currently, it is estimated that approximately 1000 gene-disrupted mice are produced every year in the world. Then, it would take 100 years to create 100,000 kinds of knockout ES clones. This is not realistic compared with the progress of structural analysis of the human genome, which is said to end in 2003.
[0010]
Second, it is too expensive. Even if labor costs and depreciation costs are excluded, a minimum of 2 to 4 million yen is required for the production of a gene-disrupted mouse. Therefore, 200 to 400 billion yen is required only for the production of 100,000 simple gene-disrupted mice. As described above, there are problems in homologous gene recombination using conventional ES cells, and the genome is huge, but the number is fixed. Therefore, it is necessary to isolate genes having important functions from these. The gene function is often revealed only after the generation of a gene-disrupted mouse. Therefore, the gene-disrupted mouse is directly linked to the development of a breakthrough drug in the future and has extremely high added value. Therefore, the creation of mouse mutants “randomly” and “large-scale” has become a global “strategy”, and at present, the following three methods are most appropriate for the creation of random mutant mice. It is considered to be.
[0011]
The first is a method using ethylnitrosourea (ENU) which is a mutagen. A large-scale mutant production project by the method using ENU has been started in Europe. In Germany, as part of the Human Genome Project, it was started in 1997 mainly by Dr. Palling at the Institute of Mammal Genetics. In the UK, SmithKline has provided funding and started the purpose of establishing mutant mice mainly in the brain / nervous system centered on Dr. Brown at the MRC Mouse Genome Center in Harwe11. To date, about 200 strains of mutant mice exhibiting dominant inheritance have been established, and the project is progressing with better efficiency than expected. In the United States, structural analysis of the mouse genome and creation of mutants by the ENU method began with a huge budget (6 billion yen per year), mainly at Case Western Reserve University and Oak Ridge National Laboratory.
[0012]
When ENU is administered to adult male mice, it acts on pre-meiotic spermatogonia, causing random point mutations at approximately 50-100 locations per cell. Mutations occur at a frequency of approximately 1 / 1,000 / gamete per locus. Therefore, by breeding one treated mouse with a female mouse, various types of mutant mice can be produced in the F1 generation. In addition, the method using ENU is considered to be extremely efficient because if 1,000 animals are screened for a specific locus, one has the probability of mutation in that gene.
[0013]
The second method uses chlorambucil, which is also a mutagen. According to this method, mutations are caused in spermatogonia with the same frequency as the ENU method. However, this sometimes results in a deletion mutation that spans 1 megabase.
The third is based on the gene trap method. The gene trap method is a method developed for the purpose of searching for unknown genes by introducing a trap vector containing a marker gene into ES cells and using the expression of the marker gene as an index. The integration of the trap vector is random, and in most cases, the endogenous gene (gene originally present in the cell or tissue) is destroyed. Therefore, various gene-disrupted mice can be produced by producing chimeric mice using the ES cells.
However, the method using these mutagens and the gene trap method each have advantages and disadvantages (Table 1).
[0014]
[Table 1]
Although the ENU method is easy to create mutant mice, the establishment of individual mutant lines must be separated by mating. In order to identify a mutated gene, the locus must first be identified by linkage analysis using a polymorphic DNA marker, and then the gene must be isolated by positional cloning. Therefore, the operation of the ENU method is complicated.
[0016]
Although the chlorambucil method is easy to produce mutant mice, the deletion site must be identified, and for this purpose, analysis using a large number of polymorphic DNA markers is necessary. In general, the mutagen method such as the chlorambucil method requires a large-scale breeding room, which is expensive and labor intensive.
[0017]
The gene trap method requires labor and skill to produce mutant mice, but identification of mutant genes is easy and experiments can be performed according to the size of the breeding room. The gene trap ES clone itself is a valuable resource for genome function analysis, and this is also a significant difference from other methods.
[0018]
For gene trapping methods, the creation of mutants has begun in several laboratories around the world. In the US, a private lexicon genetics company performs random disruption by gene traps using retroviral vectors. However, even if the gene can be trapped, it is not certain whether the endogenous gene can be destroyed, whether it is unclear whether a reproductive chimeric mouse can be produced, the creation of a chimeric mouse requires a separate fee, Since it requires a considerable amount of money to use it, it is almost impossible for general researchers. In Germany, as part of the ENU project, 12,000 clones are targeted for gene trapping. In any case, it is advanced by a method that precedes the analysis of the trapped gene rather than the establishment of the mouse strain.
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a knockout animal into which a gene trapped by a gene trap method using a trap vector is introduced.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventor came up with the idea of using Cre-loxP, a bacteriophage-derived recombination system for gene trapping, and completed the present invention. is there. Here, Cre is a recombination enzyme that recognizes the 1oxP sequence and causes recombination at this site.
[0021]
That is, the present invention is as follows.
(1) Mutant 1oxP in which mutations are introduced into a part of inverted repeat sequence 1 and / or inverted repeat sequence 2 among 1oxP sequences composed of inverted repeat sequence 1, spacer sequence and inverted repeat sequence 2 An embryonic stem cell or knockout animal into which a trap vector containing the above is introduced, wherein the tubedown-1 gene is disrupted.
Examples of the mutant 1oxP include lox71 (for example, shown in SEQ ID NO: 1) or lox66 (for example, shown in SEQ ID NO: 2). Examples of the trap vector include any one selected from the following (a) to (j).
[0022]
(a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV
(d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(f) (SA with lox71 embedded) -M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(g) (SA with lox71 embedded) -IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(h) (SA with lox71 incorporated) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD
(i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV
(j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV
(SA represents a splice acceptor, SD represents a splice donor, IRES represents an intramolecular ribosome entry site, M represents a marker gene, puro represents a puromycin resistance gene, pA represents a polyA sequence, and PV represents a plasmid vector. .)
An example of the knockout animal is a knockout mouse.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
1. Overview
The present invention relates to an embryonic stem cell and a knockout animal into which a gene trapped by a gene trap method is introduced. An outline of the gene trap method is shown in FIG. First, in order to achieve the object of the present invention, a trap vector is constructed, introduced into embryonic stem cells (ES cells), and trap clones are isolated and selected (FIGS. 2A to 2C). FIG. 2 illustrates a pU-8 (also called pU-Hachi) trap vector. Thereafter, a chimeric animal (for example, a chimeric mouse) is prepared, and a mouse derived from a trap clone is prepared (FIGS. 2F to G). On the other hand, using the isolated and selected trap clone, the trapped gene is isolated and sequenced, and the genome is recovered by plasmid rescue (FIGS. 2C to 2E). Furthermore, the clone is subjected to electroporation and drug selection such as puromycin to express the trapped gene, and a mouse line of ES clones is prepared (FIGS. 2H to I).
[0024]
The gene trapped in the present invention was examined by examining the type of gene to determine whether or not genes related to development and cell proliferation were efficiently trapped by a screening method using embryoid body formation. As a result, it was found that the Tubedown-1 gene was trapped. This indicates that the screening system based on embryoid body formation functions well. The Tubedown-1 gene is considered to be a gene encoding acetyltransferase, and is considered to be involved in angiogenesis and blood cell development in vitro.
[0025]
In the present invention, since it is one of the important points to investigate whether or not an endogenous gene is actually destroyed by a gene trap, the structure of the trap site was analyzed for the gene. As a result, the trap vector was placed in the exon of the Tubedown-1 gene, and the gene was partially disrupted. Therefore, it was revealed that the endogenous gene can be efficiently destroyed by the gene trap method of the present invention.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0026]
2. Construction of trap vector
The gene trap method traps an unknown gene on the genome by utilizing the fact that when a trap vector is introduced into an ES cell, it is accidentally and randomly integrated into a mouse endogenous gene. “Gene trap” means that a trap vector enters a specific gene on the genome and captures the specific gene, and a vector for capturing the gene is called a “trap vector”. Genes include enhancers, promoters, exons, poly A, and the like, which can be captured. For this purpose, a trap vector having a structure according to the purpose can be used.
[0027]
In general, an exon trap vector is composed of a reporter gene having only a splice acceptor, a drug selection marker gene, and a plasmid portion, and the reporter gene is expressed only when incorporated downstream of the mouse endogenous gene. In other words, the integration into the endogenous gene can be known by monitoring the expression of the reporter gene in the trap vector. Moreover, when a plasmid such as pUC19 is linked to a trap vector, the trapped endogenous gene can be isolated by a so-called plasmid rescue method. The “plasmid rescue method” is a method for recovering a target gene by subjecting cells transformed by electroporation or the like to ampicillin selection or the like (FIG. 2E). Moreover, since the gene is destroyed at the time of trapping, a gene-disrupted mouse can be produced immediately. Furthermore, since the reporter gene is expressed by being controlled by the expression regulatory region of the mouse endogenous gene, the tissue specificity and time specificity of the expression of the endogenous gene can be easily analyzed.
[0028]
Even if the gene can be completely disrupted by conventional gene trapping methods, it cannot introduce small mutations such as those found in human genetic diseases, such as single amino acid substitutions, and cannot replace human genes. There was a problem. Therefore, in order to eliminate these problems, the present invention modifies Cre-loxP, which is a bacteriophage-derived recombination system, and uses it in the gene trap method to temporarily incorporate a gene trap vector. After the mouse gene is destroyed, an arbitrary gene can be inserted into the mutant lox site in the trap vector. This makes it possible to introduce small mutations such as those found in human genetic diseases, such as single amino acid substitutions, and to replace human genes. The trap vector of the present invention can be used for trapping various genes, but can be preferably used for exon traps or promoter traps.
[0029]
1oxP (locus of crossing (X-ring) over, P1) is a sequence consisting of 34 bases (5'-ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat-3 ') (SEQ ID NO: 3), and 13 bases from the 5' end (repeated sequence 1) And a sequence of 13 bases from the 3 ′ end (referred to as inverted repeat sequence 2) constitute an inverted repeat sequence, and the sequence called an 8-base spacer indicated by “gcatacat” is the inverted repeat sequences 1 and 2 above. (Fig. 3). “Inverted repeat sequence” means a sequence in which a sequence on one side is complementary to a sequence on the other side in a direction facing each other with a spacer as a boundary. In other words, it means that the sequence of the sense strand in the sequence on one side is homologous to the antisense strand of the sequence on the other side in the direction facing each other. Since the directions are opposite to each other and the sequences themselves when forming a double strand are identical and repeated, they are called inverted repeat sequences. As shown in FIG. 3, in one strand (for example, sense strand) of double strands, the sequence in the 5 ′ → 3 ′ direction of the inverted repeat sequence 1 (5′-ataacttcgtata-3 ′: SEQ ID NO: 4) on the left side of the page Is complementary to the sequence in the 5 ′ ← 3 ′ direction of the inverted repeat 2 (5′-tatacgaagttat-3 ′: SEQ ID NO: 5) on the right side of the page.
[0030]
1oxP has a directionality unlike a normal arrangement. Therefore, in the present invention, when a 1 oxP sequence is displayed in the 5 ′ → 3 ′ direction, an arrow pointing leftward on the page (for example, arrow 1 in FIG. 3) is included in the display.
Cre (causes recombination) means a recombination enzyme (also called recombinase) that causes gene recombination, recognizes the above repetitive sequence, and cleaves it in a cleavage mode with the spacer portion “cataca” as the sticky end ( (Figure 3).
[0031]
By the way, in bacteria, recombination occurs between two 1oxP, and insertion or deletion reaction occurs. If an insertion reaction can be caused in a mammalian cell, any gene can be inserted later, so the applicability is greatly expanded. Since mammalian cells have large nuclei, circular DNA with loxP once deleted diffuses and almost no insertion reaction is observed.
[0032]
Therefore, the present inventor considered introducing a mutation into the 1oxP sequence to cause an insertion reaction, and once inserted into the genome, the inserted gene cannot be deleted (not detached from the genome). Therefore, two types of mutant 1oxP were prepared (FIG. 4).
[0033]
One of the repetitive sequence of loxP (sense strand side), the left side of the repetitive sequence (ATAACTTCGTATA) on the left side of the paper, up to 5 bases, TACCG A substitution mutation (the part where the underlined part was mutated) was introduced so as to be “TTCGTATA”, and this was named “lox71” (SEQ ID NO: 1; FIG. 4b). The other is a repetitive sequence (TATACGAAGTTAT) on the right side of the loxP on the right side of the paper. CGGTA The substitution mutation was introduced so that “(the underlined part was mutated)” was named “1ox66” (SEQ ID NO: 2; FIG. 4b).
[0034]
When recombination occurs between 1ox71 on the genome and lox66 on the plasmid, the repetitive sequences on both sides of loxP are mutated on the 5 'side (left side of the paper) of the inserted DNA (referred to as "1ox71 / 66") : TACCG TTCGTATA GCATACAT TATACGAA CGGTA : SEQ ID NO: 6) on the right side is wild-type 1oxP ( ATAAC TTCGTATA GCATACAT TATACGAA GTTAT : SEQ ID NO: 3) is arranged (Fig. 4a). As a result, Cre can no longer discern 1ox71 / 66, does not recombine with loxP, and the gene remains inserted into the genome. That is, in the case of homologous recombination between loxPs, since the circular DNA containing the excised loxP is physically separated, the reaction is more inclined to deletion than insertion. On the other hand, using lox71 on the chromosome side and lox66 on the circular DNA side makes it difficult for Cre recombinase to recognize lox71 / 66 that occurs when it is incorporated, and the insertion state is maintained because it tends to be inserted into the insertion reaction rather than the deletion reaction. (FIG. 5). Here, in the present invention, lox66 can be used on the chromosome side and lox71 can be used on the circular DNA side.
[0035]
In fact, if a mutant loxP such as 1ox71 (hereinafter also referred to as “mutant lox”) is incorporated into ES cells in advance, and a plasmid containing another mutant loxP (for example, lox66) is introduced, the plasmid becomes genomic. It is built in. Therefore, for example, if this lox71 is previously incorporated into a gene trap vector, any gene can be inserted later using 1ox66. In other words, it became possible to replace with a gene introduced with a small mutation or a human gene.
[0036]
A gene trap vector using this mutant lox (1ox71 or lpx66) can be constructed as follows (FIG. 6A). However, the following trap vectors are examples and are not limited. Accordingly, in the following vectors, lox71 is exemplified as a mutant lox, but is not limited thereto, and those using lox66 instead of lox71 are also included in the trap vector of the present invention. In addition, a trap vector using ordinary loxP can be constructed without using mutant loxP (FIG. 6B).
[0037]
(a) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(b) lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(c) SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV
(d) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(e) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(f) (SA with lox71 embedded) -M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(g) (SA with lox71 embedded) -IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(h) (SA with lox71 incorporated) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD
(i) loxP-SA-IRES-M-pA-loxP-PV
(j) loxP-SA-loxP-IRES-M-pA-loxP-PV
[0038]
In the above vector components, SA is a splice acceptor, SD is a splice donor, IRES is an intramolecular ribosome entry site, M is a marker gene, puro is a puromycin resistance gene, and pA is polyA. In the sequence, PV represents a plasmid vector.
[0039]
By the way, when the trap vector is incorporated into genomic DNA, in most cases, a part of the vector is deleted, and as a result, an important part of the vector may be deleted. In the present invention, it is preferable to add an arbitrary sequence as a dummy for preventing such deletion. Such an arbitrary sequence is called an SP sequence. The SP sequence can be added to the head, tail or both of the vector. In FIG. 6A, SPU (indicated as “Sp”) is added to pU-8 and pU-12 at the end, and in FIG. 6B, the leading and trailing ends are shown in pU-San and pU-Rok. The embodiment added to both of these was shown. The SP sequence itself can be freely determined. The length of the SP sequence is 100 to 1000 bases, preferably 300 to 400 bases. Also, any known sequence can be used for SP. Examples of the known sequence include a part of the rabbit β-globin gene.
[0040]
A splice acceptor means a sequence that can be linked to the 3 ′ end of an exon during splicing.
A splice donor means a sequence that can be linked to the 5 ′ end of an exon during splicing.
[0041]
IRES, called an internal ribosomal entry site, is a site on the ribosome to which aminoacyl-t-RNA binds during protein synthesis (A site) and can initiate translation independent of CAP. It is an arrangement for doing so.
[0042]
The marker gene is a gene that serves as a marker indicating whether or not the vector of the present invention was able to trap the target gene. The β-galactosidase gene (lacZ gene) derived from E. coli, or the lacZ gene and the neomycin (G418) resistance gene Examples include fusion genes (β-geo gene), CAT gene, GFP gene, SV40 large T gene, neomycin resistance gene, puromycin resistance gene, hygromycin resistance gene, blasticidin S resistance gene and the like.
[0043]
A plasmid vector is used to isolate an endogenous gene by a plasmid rescue method after gene trapping. Therefore, by using a part of the plasmid in the trap vector (which can be increased by E. coli), the adjacent region of the plasmid portion can be recovered. For example, when genomic DNA is ligated to a plasmid, the plasmid-genomic DNA-ligated fragment is excised by restriction enzyme treatment, and the excised fragment is circularized and then introduced into E. coli to proliferate. The collected genomic DNA can be recovered. Examples of plasmid vectors include pBR322, pUC (pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 etc.), pSP (pSP64, pSP65 etc.), pGEM (pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z etc.) and the like. In addition, supF, an ampicillin resistance gene, a replication origin, and a restriction enzyme site for cloning (for example, a multicloning site) can be linked to the plasmid vector alone or in appropriate combination.
[0044]
The vector shown in (a) above is called pU-8. The basic part of pU-8 (SA-IRES-β-geo-pA: Fig. 7) is derived from pGT1.8IRESbetageo. This pGT1.8IRESbetageo contains a splice acceptor derived from the mouse En-2 gene, an IRES derived from encephalomyocarditis virus, and β-geo. After 1ox71 is incorporated into the BglII site of this pGT1.8IRESbetageo, it is treated with SalI to prepare a SalI fragment. On the other hand, a 180 base pair SP sequence, 1oxP, and a poly A addition signal derived from mouse phosphoglycerate kinase-1 (PGK) are inserted into a vector such as pUC19 into a modified vector from which the LacZ sequence of the vector has been removed. To produce plasmid pEBN-SE7ti. PU-8 is prepared by inserting the SalI fragment of SA-IRES-lox71-β-geo into the restriction enzyme SalI site of this plasmid. Therefore, this structure is an arbitrary sequence, a splice acceptor, 1ox71, IRES, β-geo, pA, loxP, pA, pUC19, and an arbitrary sequence in this order from the 5 ′ side (FIG. 7).
[0045]
The vector shown in (b) above is called pU8delta. pU8delta is a vector from which the splice acceptor of pU-8 has been deleted. This vector has a structure in which 1oxP is connected behind β-geo in front of β-geo, where lox71 is a reporter. This is because the intermediate IRES and β-geo part can be completely removed by transiently expressing Cre after the vector has been incorporated. As a result, the plasmid pUC19 is located in the vicinity of the mouse endogenous gene existing upstream, and the mouse endogenous gene can be easily isolated.
[0046]
The vector shown in (c) above is referred to as “pU-12”. This vector is composed of SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-puro-pA-lox511-PV. In order to construct a pU12 trap vector, the PGK poly (A) signal of pE3NSE7 is first replaced with a puromycin resistance gene + PGK poly (A) signal, and lox511 is further inserted into the downstream BglII site. PU-12 can be obtained by inserting the SalI fragment of SA-IRES-lox71-β-geo from pU-Hachi into the restriction enzyme site of the resulting plasmid.
[0047]
The vector shown in (d) above is referred to as “pU-15”. This vector is composed of lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511. Here, “lox2272” refers to a loxP spacer region (gcatacat) having a sequence (ggatactt) in which the second c is replaced with g and the seventh a is replaced with t. “Lox511” refers to a loxP spacer region (gcatacat) having a sequence (gtatacat) in which the second c is replaced with t. lox511 and lox2272 are mutated lox sequences that cause recombination with themselves (lox511 to each other, lox2272 to each other), but do not cause recombination with loxP or lox71, because there is a mutation in the spacer part of the loxP sequence. It should be noted that the arrangement order of lox2272 and lox511 may be either forward or backward, and can be arbitrarily selected (the same applies hereinafter).
[0048]
The vector shown in (e) above is referred to as “pU-16”. This vector consists of lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511, and is prepared by inserting IRES between px-15 lox71 and the marker (β-geo) Can do.
The vector shown in (f) above is referred to as “pU-17”. In this vector, 1ox71 is inserted into a partial region of SA. For example, the plasmid is constructed by inserting lox511, loxP, PGK poly (A) signal, lox2272 into the pSP plasmid, and then the lox71 sequence is inserted into pU-Hachi SA, followed by β-geo. Insert in order. PU-17 can be obtained by ligating this plasmid with the previously constructed plasmid.
[0049]
The vector shown in (g) above is referred to as “pU-18”. This vector also has lox71 inserted in SA, similar to pU-17. pU-18 can be obtained by inserting an IRES between SA and β-geo of pU-17.
The vector shown in (h) above is composed of (SA incorporating lox71) -M-loxP-pA-lox2272-promoter-M-lox511-SD. This vector can be obtained by inserting a promoter and M in this order instead of PV in pU-17 and ligating SD behind lox511. A promoter is added to this vector. The promoter is not particularly limited, and any promoter can be used. For example, in addition to bacterial-derived promoters and yeast-derived promoters described in the section of transformant preparation described below, RNA polymerase promoters such as SP6 RNA polymerase promoter, T7 RNA polymerase promoter, T3 RNA polymerase promoter, or EF1 (elongation factor 1) Examples include promoters derived from mammals such as promoter, PGK (glycerophosphate kinase) promoter, MC1 (polyoma enhancer / herpes simplex virus thymidine kinase) promoter.
[0050]
The vector shown in (i) above is called “pU-San”, and the vector shown in (j) above is called “pU-Rok”. The configuration of pU-San is the same as that of pU-8 except that lox71 used in pU-8 is loxP. In other words, when loxP of pU-San is replaced with lox71, pU-8 is obtained. pU-Rok can be obtained by inserting loxP between SA and IRES of pU-San.
[0051]
3. Gene trap
A two-step gene trap is performed using the vector prepared as described above.
The first stage is the usual gene trap method. “Normal gene trap” means introducing the trap vector into an ES cell and trapping an endogenous gene originally present in the ES cell. This destroys the endogenous gene in the ES cell. In addition, a gene-disrupted animal (for example, a knockout mouse) described later can be produced using the ES cells. Then, after isolating the trapped endogenous gene (FIG. 8, gene X), a fine mutation is introduced into the E. coli by a method such as site-specific mutagenesis (FIG. 8, gene X). '), This is connected downstream of 1ox66 on the plasmid, and the second stage gene trap is performed (Fig. 8). In order to introduce a mutation into gene X, a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method, or a method according to this can be employed. For example, mutation kits using site-directed mutagenesis (for example, Mutan-K or Mutan-G (Takara Shuzo)) or LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (Takara Shuzo) Introduction is done.
[0052]
The second stage gene trap means introduction of a mutant form of the endogenous gene (gene X ′) linked downstream of 1ox66 into ES cells. As a result, the 1ox71 site of the trap vector introduced in the first stage undergoes recombination with lox66 of the vector introduced in the second stage, and “(lox71 / 66)-(gene X ′)-(loxP ) ”Can be introduced (FIG. 8).
According to this method, not only a modified endogenous gene but also a human gene can be substituted, and any gene can be introduced. This is named variable gene trap method in the present invention.
[0053]
4). Screening for clones (ES cells) incorporating trap vectors
If a gene trap vector is introduced into ES cells and neo-resistant clones are selected, these are regarded as clones in which the trap vector is incorporated downstream of the mouse endogenous gene. DNA is extracted from these clones and analyzed by Southern blotting or the like, and a clone in which only one copy of the trap vector is incorporated is selected. Since it was found that clones trapping mouse genes can be selected efficiently by using this selection method, this is used as a screening system.
[0054]
(1) Isolation of neo-resistant clones
In the present invention, an electroporation method, a microinjection method, or the like is employed to introduce a trap vector into an ES cell. For example, 100 μg of the trap vector was introduced into 30 million TT2 ES cells suspended in 0.8 ml phosphate buffer by electroporation (using BioRad GenePulser under conditions of 800 V and 3 μF), and 200 μg / Incubate in the presence of G418 at a concentration of m1. After one week, neo resistant clones are isolated.
[0055]
The gene trap vector is randomly integrated into the ES cell genome. Therefore, simply introducing a trap vector into an ES cell does not necessarily result in integration into a gene, and it is also integrated into a place unrelated to the gene. However, since a neo-resistance gene, which is a drug resistance gene, is included in the trap vector, the cell in which it is expressed becomes neomycin (also referred to as G418) resistance. Conversely, cells that survive in the presence of neomycin express a neo-resistance gene. The neo resistance gene in the trap vector is not expressed unless it is inserted downstream of the mouse gene expressed in ES cells. Therefore, to express means to have been incorporated downstream of a certain gene.
[0056]
(2) Selection of ES clones by integration pattern
DNA is extracted from ES clones according to a conventional method, and the integration pattern is analyzed by Southern blotting or the like. If the Southern blot pattern appears as a single band, it can be determined that only one copy is incorporated, so DNA representing the pattern is selected. This is to select clones that can easily isolate mouse endogenous genes using plasmids, and clones that are neo-resistant with one copy have a very high probability of actually trapping mouse genes. Because.
[0057]
5. Establishment of trap lines (transgenic animals) by production of chimeric animals
Chimeric animals are produced by standard methods (Figure 9). The kind of the chimeric animal produced in the present invention is not particularly limited. For example, mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep, pig, dog and the like can be mentioned. In the present invention, a mouse that is easy to handle and easy to breed is preferred.
[0058]
ES cells selected with neomycin are aggregated with animal-derived morula (formation of an assembly of ES cells and morula) to produce a chimeric animal embryo (for example, one that has developed into a blastocyst). These are mated with infertile males and transplanted to the womb of a foster parent who has become pseudopregnant. For example, in the case of a mouse, a child is born after about 17 days, so a chimeric animal is selected from the offspring born from a temporary parent. An animal having a high chimera contribution rate is highly likely to be a germ line, but it is possible to confirm that it is a germ line chimeric animal by mating the chimeric animal with a normal animal.
[0059]
After that, they are mated with normal females to obtain F1 and establish mutant animal lines. The following analysis is carried out only for those that have established lines (transgenic animals). The sperm from F1 and the 2-cell embryo obtained by in vitro fertilization using the sperm can be cryopreserved by the ultra-rapid freezing method.
[0060]
(1) Analysis of expression pattern
F1 animals are mated and the expression pattern in the embryo (eg, 9.5 days for mice) and adults is analyzed.
(2) Phenotypic analysis
Analyze heterozygous and homozygous phenotypes for established animal lines. Phenotype analysis is performed using macroscopic observation, internal observation by anatomy, tissue section of each organ, skeletal system by X-ray photography, behavior and memory, and blood.
[0061]
(3) Isolation and structural analysis of trapped genes, creation of chromosome maps
DNA is isolated from the trap clone and the nucleotide sequence is determined (described later), and a homology search is performed. As a result, it is distinguished whether the obtained sequence information belongs to a known gene, EST, unknown gene, or repeat. Chromosome maps can also be created for ESTs and unknown genes. Chromosome mapping is performed by fluorescence in situ hybridization (FISH), linkage analysis using a microsatellite probe, or analysis using hybrid cells by irradiation. If the position on the chromosome is clarified, it is compared with the position of the existing mutant mouse, and it is examined whether it matches.
[0062]
(4) Database construction
For each established line, marker gene embryos (eg, embryos on day 10 in mice) and adult expression patterns, F1 and F2 animal phenotypes, trapped animal endogenous DNA sequences, ESTs and unknown genes Creates a database of positions on the chromosome.
[0063]
6). Knockout animals
The knockout animal of the present invention has been treated so that the function of the gene is lost. The processing method will be described.
Examples of animals that can be used in the present invention include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, pigs, dogs and the like. In the present invention, a mouse that is easy to handle and easy to breed is preferred.
[0064]
Genomic DNA containing an unknown gene is obtained from genomic DNA prepared from animal ES cells by PCR or from a genomic library, and incorporated into the trap vector of the present invention. This operation destroys the function of this exon. At the same time, a thymidine kinase (tk) gene or diphtheria (DT) toxin gene for negative selection is linked to the vector. The trap vector is introduced into ES cells by electroporation or the like, and the cells are cultured in the presence of neomycin for positive selection and nucleic acid analog FIAU (fluoroiodoadenosyluracil) for negative selection or diphtheria toxin. By this selection, only ES cells into which the trap vector has been inserted remain. In this ES clone, the gene containing the disrupted exon is knocked out. The obtained cells are transplanted into a temporary parent's uterus, and then a chimeric animal born is selected. A heterozygous animal can be obtained by crossing a chimeric animal with a normal animal, and a homozygote can be obtained by crossing heterozygotes.
[0065]
It should be noted that the confirmation that the knockout mouse has been obtained can also be used to observe the presence or absence of an appearance abnormality and abnormalities of various tissues and organs when dissection is performed. Furthermore, RNA may be extracted from the tissue, gene expression patterns may be analyzed by Northern blot analysis, blood may be collected as necessary, and blood tests or serum biochemical tests may be performed.
[0066]
7. Isolation of genes, construction of recombinant vectors and preparation of transformants
(1) Gene isolation
In the present invention, the trapped gene can be cloned as described above to perform structural analysis.
[0067]
Isolation of DNA from the trap clone can be performed by a conventional method. For example, when cloning from trap clone mRNA, first, the trap clone is treated with guanidine reagent, phenol reagent, etc. to obtain total RNA, and then poly U-sepharose or the like using oligo dT-cellulose or Sepharose 2B as a carrier. Poly (A +) RNA (mRNA) is obtained by an affinity column method using or by a batch method. A single-stranded cDNA is synthesized using the obtained mRNA as a template using an oligo dT primer and reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA. A cDNA library is obtained by incorporating the double-stranded cDNA thus obtained into an appropriate expression vector (for example, λgt11).
[0068]
The nucleotide sequence of the gene obtained as described above is determined. The base sequence can be determined by a known method such as a chemical modification method of Maxam-Gilbert or a dideoxynucleotide chain termination method using DNA polymerase. Usually, the base sequence can be determined by an automatic base sequence determination device or the like. When the nucleotide sequence of the 5 ′ region or 3 ′ region of the cDNA has not been determined, the entire nucleotide sequence is determined using 5′-RACE method, 3′-RACE or the like. The RACE (Raped Amplification of cDNA Ends) method is well known in the art (Frohman, MA et al., Methods Enzymol. Vol. 218, pp340-358 (1993)), and kits for performing RACE are also commercially available. (For example, Marathon TM cDNA Amplification Kit; CLONETECH, etc.).
[0069]
The base sequence of the Tubedown-1 gene knocked out in the present invention is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 8. As a result of base sequence analysis, the trap vector was inserted between the 413th and 414th positions of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Since the translation region of the Tubedown-1 gene is from the 355th to 2949th of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, it is considered that the trap vector was inserted into the exon region of the genome.
Once the base sequence of the gene of the present invention is determined, the gene of the present invention can be obtained by chemical synthesis or by PCR using primers synthesized from the determined base sequence.
[0070]
(2) Construction of recombinant vector
The target gene fragment is purified and ligated with vector DNA. Any vector such as a phage vector or a plasmid vector can be used. Techniques for ligating DNA and vectors are well known in the art (J. Sambrook, et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
[0071]
(3) Transformant
The transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention. For example, bacteria, yeast, animal cells, insect cells and the like can be mentioned.
[0072]
When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium, and at the same time is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a gene of the present invention, and a transcription termination sequence. Is preferred. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli K12 and DH1, and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage, such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, etc. are used. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used. The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions (Cohen, SN et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)), electroporation method (Becker, DM et al .: Methods. Enzymol) , 194: 182-187 (1990)).
[0073]
When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe and the like are used. In this case, the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter Is mentioned. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, electroporation method, spheroplast method (Hinnen, A. et al .: Proc. Natl. Acad Sci., USA, 75: 1929-1933 (1978)), lithium acetate method (Itoh, H .: J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)) and the like.
[0074]
When animal cells are used as hosts, COS cells, Vero cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse myeloma cells and the like are used. As the promoter, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, EF1 promoter, PGK promoter, MC1 promoter, etc. may be used, and human cytomegalovirus early gene promoter may also be used. Examples of methods for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
When insect cells are used as hosts, examples include Sf9 cells and Sf21 cells. As a method for introducing a recombinant vector into insect cells, for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like are used.
[0075]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Preparation of gene trap vector mutant
(1) Construction of pU-8 trap vector
The pU-8 vector is derived from pGT1.8IRESβ-geo and contains an SA sequence from the mouse En-2 gene and a β-geo sequence linked to an IRES sequence derived from encephalomyocarditis virus. First, the BamHI fragment of lox71 was inserted into the BglII site of pGT1.8IRESβ-geo. Next, a 180 bp sequence, a loxP sequence, which is part of the rabbit β-globin gene, and a poly A addition signal derived from mouse phosphoglycerate kinase-1 (PGK) were used as a modified vector in which the LacZ sequence of the vector pUC19 was removed. The plasmid pEBN-SE7ti was constructed by inserting into. The SP sequence was used to protect the 3 ′ side of the trap vector. PU-Hachi was obtained by inserting the SalI fragment of SA-IRES-lox71-β-geo into the SalI site of the plasmid pEBN-SE7ti.
[0076]
(2) Construction of pU-12 trap vector
In order to construct a pU-12 trap vector, a PGK poly (A) signal of pE3NSE7 was first replaced with a puromycin resistance gene + PGK poly (A) signal, and a plasmid in which lox511 was further inserted into the downstream BglII site was prepared. PU-12 was obtained by inserting the SalI fragment of SA-IRES-lox71-β-geo from pU-Hachi into the SalI site of the plasmid.
[0077]
(3) Construction of pU-17 trap vector
First, lox511, loxP, PGK poly (A) signal and lox2272 were inserted in this order into pSP73 (Promega) to construct plasmid pSP5PP2. Next, cleave at the upstream BamHI site out of the two BamHI sites in pU-Hachi's SA. Then, the NcoI to SalI sites of β-geo were inserted in this order to construct plasmid pKS + S71Aβgeo. PU-17 was obtained by excising the XbaI fragment of SA-βgeo containing lox71 from this pKS + S71Aβgeo and inserting it into the SpeI site of pSP5PP2.
[0078]
(4) Construction of pU-San and pU-Rok trap vectors
The pU-San vector was constructed in the same manner as pU-8, except that loxP was used instead of lox71 used when pU-8 was produced. The pU-Rok vector was constructed by inserting loxP between pU-San SA (En2) and IRES.
[0079]
[Example 2] Selection of ES cell clones
Neomycin-resistant primary mouse fibroblasts were cultured confluent in PEF medium, treated with 100 μg / ml mitomycin C for 3 hours, and treated with 0.25% trypsin. Trypsin-treated cells were seeded in 0.01% gelatin-coated culture dishes to prepare feeder cells for ES cells. For electroporation using the pU-8 trap vector, DNA digested with 100 μg SpeI and 3 × 10 7 ES cells were used. ES cells were suspended in 0.8 ml of PBS, and electroporation was performed using Bio-Rad Gene Pulser under any of the following conditions.
[0080]
(I) Distance between electrodes: 0.4 cm, voltage: 0.2 kV, capacitance: 960 μF, resistance: none
(ii) Distance between electrodes: 0.4 cm, voltage: 0.8 kV, capacitance: 3 μF, resistance: none
After 48 hours, the cells were cultured in the presence of 200 μg / ml G418. Sorting was maintained for 7 days and colonies were grown in 24-well plates and stored frozen. Trap clones were analyzed by Southern blotting to select cell lines exhibiting a single copy integration pattern.
[0081]
To remove the β-geo sequence from the trap clone, pCAGGS-Cre (Araki, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 160-164, 1995; Araki, K. et al., Nucl. Acids Res., 25: 868-872, 1997; Araki, K. et al., J. Biochem. Tokyo, 122: 977-982, 1997) were introduced by electroporation in a circular form. Cell count is 1.5 × 10 7 Electroporation was performed under the same conditions as above except that the PBS volume was 0.4 ml.
[0082]
Half of the treated cells were seeded on one 100 mm plate and allowed to grow for 48 hours. Then 1 × 10 Three A 100 mm plate was seeded again at a concentration of pcs / plate to form colonies. One week later, colonies were picked and grown for DNA preparation.
For co-electroporation designed to integrate into the lox71 site of the trap vector, 20 μg of each plasmid (p66 2 IEGPPac, p66 2 INZPPac or p66PGKPac-5) and pCAGGS-Cre were used in cyclic form.
[0083]
The plasmid p66PGKPac-5 was constructed by inserting the lox66 fragment and the PGK promoter-puromycin resistance gene coding sequence into the pSP73 vector (Promega). Plasmid p66 2 IEGPPac was constructed from pSP73 vector (Promega), IRES sequence, EGFP gene (Clonetech), PGK promoter, Pca gene and lox66 sequence. Plasmid p66 2 INZPPac, p66 2 It was constructed by replacing the EGFP gene of IEGPPac with the lacZ gene fused to the nuclear localization signal from the SV40 large T gene.
[0084]
1 × 10 in PBS 7 Cells / 0.8 ml of cells were subjected to electroporation (200 V, 950 μF). After 48 hours, the cells were sorted for 3 days with 2 μg / ml puromycin, and then transferred to normal medium. On day 9 after electroporation, colonies were picked and grown.
[0085]
Embryoid bodies (EB) were produced according to a known method (Abe, K., Niwa, H. et al., Exp. Ce11 Res. 229: 27-34, 1996). Β-galactosidase activity and EB in ES cells were measured by staining with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) (Gossler, A. and Zachgo , J., Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, A. (ed.), Oxford University Press, Oxford, 1993, pp.181-227).
[0086]
The trap vector pU-8 was linearized and introduced into TT2 ES cells, and a clone (Ayu-8030 clone) was isolated. The Ayu-8030 clone was deposited on May 23, 2001 at the Patent Organism Depositary (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). : FERM P-18341).
[0087]
[Example 3] Production and gene analysis of chimeric mice
(1) Introduction of clones into mice
The trapped ES clone (Ayu-8030) was aggregated with an 8-cell stage embryo derived from ICR mice and cultured overnight. The next day, ES cells and 8-cell stage embryos aggregated together and selected to develop into one blastocyst. About 20 of these chimeric embryos were transplanted into the uterus of a female (temporary parent) mated with an infertile male. The chimeric mice were bred about 17 days later and sexually matured after 8 weeks of age. The chimeric mice were mated with female mice to obtain ES clone-derived F1 mice (heterozygotes).
Although F1 individuals were mated, the homozygote was lethal before the 8.5th day embryo, but the heterozygote was born normally and no phenotype was noticeable.
[0088]
(2) Analysis of trapped genes
(i) RNA extraction
TRIzol reagent (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) was added to the sample from the trapped ES cells (Ayu-8030), and the cells were disrupted with a polytron homogenizer. After adding 0.2 volumes of chloroform and shaking vigorously, the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes, and the upper layer was carefully taken out. An equal volume of propanol was added and stirred to precipitate. After centrifugation, the supernatant was discarded and the precipitated RNA was rinsed with 75% ethanol and air-dried. Dissolved in 0.5 ml TE and stored at -80 ° C.
[0089]
(ii) cDNA analysis of trapped genes
Based on the RNA sample, a part of the trapped gene (about 380 bp) was obtained using the 5′-RACE method. The primer used was 5′-TCCTCTTTGTTAGGGTTCTTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 9). When searching a database of genes (including ESTs) registered on the Internet, it was found that they had high homology with several mouse ESTs. The trap vector was inserted immediately downstream of the start codon.
In addition, an approximately 3 Kb cDNA fragment containing the sequence from the start codon to the end codon was obtained by RT-PCR, and the correct base sequence was determined.
The primers used for RT-PCR are as follows.
5'-AGTTACCACGTGAACCGCC-3 '(SEQ ID NO: 10)
5'-CAAAGTCATTCCATTTGCTTGT-3 '(SEQ ID NO: 11)
[0090]
(iii) Results
As a result of base sequencing of the gene obtained as described above, SEQ ID NO: 7 The sequence shown in was obtained. This is the known Tubedown-1 gene In It turns out that it corresponds. Therefore, it was found that the knockout mouse of the present invention was a tubedown-1 gene disrupted.
[0091]
【The invention's effect】
According to the present invention, a knockout mouse is provided. The knockout mouse of the present invention can be used as a model animal for the process of angiogenesis and blood cell development, or for the development of new drugs targeting these.
[0092]
[Sequence Listing]
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
IDE, HIROYUKI
<120> KNOCKOUT ANIMAL
<130> P01-0333
<140>
<141>
<160> 11
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 1
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 2
ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 3
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 4
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 5
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 6
taccgttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 7
<211> 3000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (355) .. (2949)
<400> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 9
tcctctttgt tagggttctt cttc 24
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 10
agttaccacg tgaaccgcc 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 11
caaagtcatt ccatttgctt gt 22
[0093]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 1 synthetic DNA
Sequence number 2: Synthetic DNA
Sequence number 3: Synthetic DNA
Sequence number 4: Synthetic DNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
Sequence number 6: Synthetic DNA
Sequence number 9: Synthetic DNA
Sequence number 10: Synthetic DNA
Sequence number 11: Synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the concept of functional analysis of both a gene part and other parts.
FIG. 2 is a diagram showing an outline of a trap vector construction method and a gene trap method of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing the structure of 1oxP.
FIG. 4 is a diagram showing recombination between lox71 and lox66.
FIG. 5 is a diagram showing insertion of a DNA fragment by a mutant loxP.
FIG. 6A shows a trap vector of the present invention.
FIG. 6B is a diagram showing a trap vector of the present invention.
FIG. 7 is a construction diagram of a trap vector pU-Hachi.
FIG. 8 shows a two-stage variable gene trap method.
FIG. 9 is a diagram showing an outline of establishment of a trap line by production of a chimeric animal.
[Explanation of symbols]
1: Arrow
Claims (6)
SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PVSA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(( ここで、here, SASA はスプライスアクセプターを、Is a splice acceptor, IRESIRES は分子内リボゾームエントリー部位を、Is the intramolecular ribosome entry site, MM はマーカー遺伝子を、Is the marker gene, pApA はポリIs poly AA 配列を、Array PVPV はプラスミドベクターをそれぞれ表す。Represents a plasmid vector, respectively. ))
を含むトラップベクターの導入によって行われる、請求項１記載のノックアウトマウス。The knockout mouse according to claim 1, which is carried out by introduction of a trap vector containing
SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PVSA-lox71-IRES-M-pA-loxP-pA-PV
(( ここで、here, SASA はスプライスアクセプターを、Is a splice acceptor, IRESIRES は分子内リボゾームエントリー部位を、Is the intramolecular ribosome entry site, MM はマーカー遺伝子を、Is the marker gene, pApA はポリIs poly AA 配列を、Array PVPV はプラスミドベクターをそれぞれ表す。Represents a plasmid vector, respectively. ))
を含むトラップベクターをマウス胚幹細胞に導入して前記遺伝子が破壊された胚幹細胞を選別し、Introducing a trap vector containing mouse embryonic stem cells to select embryonic stem cells in which the gene is disrupted,
前記遺伝子が破壊された胚幹細胞からキメラ胚を作製し、Producing a chimeric embryo from embryonic stem cells in which the gene is disrupted,
前記キメラ胚を仮親マウスの子宮に移植し、出産により仔マウスを得て、前記遺伝子が破壊されたキメラマウスを選別し、Transplanting the chimeric embryo into the uterus of a temporary parent mouse, obtaining a pup mouse by birth, selecting the chimeric mouse having the gene disrupted;
前記キメラマウスの雌と雄の交配によって前記ノックアウトマウスを得る、Obtaining the knockout mouse by mating a female and a male of the chimeric mouse,
工程を含む方法。A method comprising steps.
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