JP3708542B2 - その上に不溶性酵素粒子を含有するカートリッジ・フィルター - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、不溶性酵素粒子を含む新規のフィルター・エレメント及びそれらの製造方法に関する。この粒子充填フィルター・エレメントは、それを連続的に通過する溶液中の溶質の化学反応を行うための触媒としてカートリッジ・フィルター内に有用である。
発明の背景
タンパク質は、ひじょうに多様な生体巨大分子である。酵素として知られるタンパク質の１つのクラスは、複雑な有機合成をを行うためのたぶん天然の最も完全な触媒として機能する。酵素は、低温においてもひじょうに効率的に働いて温度とpHのひじょうに温和な条件下で反応体から生成物への高い変換を引き起こし、そして（影響される官能基に関して）比較できない程度の特異性をもって働くので、それらは、化学反応を行うための触媒として有機化学者により長い間探求されてきた。医学及び医薬化学者は、さらに、特定の炭素原子上の４つの異なる置換基の単に空間的な配置がユニークな薬理学的挙動を生じさせるような化合物の可能性のある光学異性体の中のたった１つを合成するための酵素の能力により好気心をそそられてきた。合成目的のたの酵素における興味は、また、高い精製状態、比較的大きな規模、そして実質的に低減されたコストにおいて特定の酵素の製造を許容してきた分子遺伝学における進歩により、最近高められている。
触媒活性を失わずに酵素を不溶化することは、多くの研究者の目的である。なぜなら、触媒系が反応混合物から容易に取り出されることができ、そして少なくとも、多数回再使用されることができるというまさに実施上の利点をもつからである。
可溶性酵素を上廻る不溶性酵素触媒のコスト低減に貢献し、そして通常その不溶化工程において自然に生ずる。他の利点は、より広いレンジの温度とpHにわたる強化された安定性を含む。
化学反応を触媒するために固定化又は不溶化酵素を使用する最も一般的な技術は、溶解反応体を含む溶液にその不溶化粒子を単に添加することである。この不溶性触媒はしばしば高速で撹拌されて、より効率的に触媒と反応体を混合することにより反応を容易にする。この撹拌は、溶脱（leaching）、酵素失活、及び増加された分離コストを生じさせることができる不溶性酵素粒子の機械的破壊をしばしば引き起こす。なぜなら、より小さな粒子は一般的に、その反応混合物から除去することがより困難であるからである。また、pH制御が強酸又は塩基の同時添加により維持される場合、その不溶化酵素は、その滴定物がその反応混合物に混合されることができる前に、瞬間的に極端なpHにほとんど確実に晒されるであろう。水溶液中、アミノ酸残基、例えばリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、その他は、究極的にタンパク質構造を定める。なぜなら、それらは、しばしば電荷をもち、そしてそのタンパク質の３次構造の周辺に存在するからである。pHの突然の変化は、これらのアミノ酸残基上の基をプロトン化又は脱プロトン化のいずれかを行うことができる。
反応混合物中の不均一成分としての不溶性酵素のバッチ毎の使用の上述の欠陥は、不溶性酵素粒子の充填カラムを使用する様々なフロー・リアクターの開発を導いた。これらの反応システムは、機械的不安定性を最小化するけれども、中程度の容量とpH不安定性の問題は残る。触媒能力は、一般的に、カラム長に直接的に対応するので、そして、より長いカラムを用いると、溶液の妥当に速い通過を達成するためには不所望の高圧が要求される。また、pH制御は、その酵素に対する有害な効果が生じることができるそのカラム内で一般的に完全に失われている。
比較的高い流速、例えば１分間当りのリッター数、及び比較的近い圧力において操作される液体カートリッジ・フィルターが、ここ数年間にわたり開発されてきた。直角流又は放射状の膜カートリッジ・フィルターにおいては、そのフィルター・エレメントは、その液体流（liquid stream flow）に平行な平面内で提示され、そして２つの流出物（effluents）又は浸透物（permiates）が作り出される、１つはそのフィルター・エレメントの通過により濾過又は処理され、そして他はそうされない。これらのフィルター機器類が低圧で操作され、そして非処理浸透物が理論的にリサイクルされることができるので、これらのシステムは、内在的により複雑であり、そしてそのエレメントを通しての比較的低い流れのために液体流を完全に処理するためには遅く；また、酵素を不溶化するために修飾される場合、そのエレメントの１パス・フローにおける反応体の完全な変換が、要求されるであろう。
“終端（dead end）”フィルター内では、このフィルター・エレメントは、その液流の長さ方向に垂直に提示される。その液流の全てがそのエレメントを通過する必要があり、そしてたった１つの浸透物が作り出される。反応がそのフィルター・エレメント上又は内で生じるようなリアクターとして考慮される場合、この終端カートリッジ・フィルターは、ひじょうに広いが短いカラムに類似するであろう。その触媒層の実際の長さが比較的短いので、その酵素反応により引き起こされるpHにおける変化は比較的高い溶液処理量において大きくあってはならない。高い流速においては、１パス変換は、比較的低いことができるがその流出物を反復循環することにより、高い変換を、パス間でpHを調節しながら達成することができる。少なくとも、固定化酵素を含む分析検定においては拡散効果を最小化するための再循環の寄与が、J. R. Ford, et al., Biotechnol. & Bioeng. Symp. No. 3, 1972, 267-284により討議されている。
T. J. Harrington, et al., Enzyme Microb. Technol., 1992, 14, 813-818は、アルミナ・マイクロフィルター（0.45マイクロメーター公称フィルター等級）がアミノシラン／グルタルアルデヒドにより活性化されて酵素アタッチメントに適合された再循環終端遠心分離において使用されたセラミック・マイクロフィルターについて記載している。
終端フィルター・カートリッジの容量及び低い操作圧力を改善するための努力は、酵素と結合し、そしてそれを不溶化させることができる粒子の広い表面積を利用してきた。これらの努力は、それ自体を濾過層内に含まれた不溶化粒子を使用し、そして１パス操作を利用してきた。カナダ国特許第1,179,283号は、シリカ・ゲルがポリ（ビニル・クロライド）膜内に埋め込まれているカートリッジ・フィルターについて開示している。このシリカ・ゲル上への吸着により不溶化された酵素は、スクロースをイソマルトースに異性化するために使用された。同様に、米国特許第4,857,461号は、終端カートリッジ・フィルターであって再びウェブ・マトリックス内に、スルホン酸基をもつ架橋セルロース・カチオン交換樹脂を含むものを使用する１パス連続工程について開示している。酵素は、イオン交換を介して吸着され、グルタルアルデヒドとその後架橋され、そして約12mL／分までの１パス流速（束速度（flux rate）＝0.005cm／分）をもって97％収率においてスクロースを異性化するために使用された。0.20cm／分と高い束速度をもつ“圧力駆動酵素膜リアクター”については、schmidt-kastner, et al., Biochem. Eng.［Intl. Conqr.］, 1986（publ. 1987）, 111-131によりより十二分に記載されている。ここでは、酵素支持シリカ粒子が膜の細孔構造内に埋め込まれている。
発明の要約
簡単に言えば、本発明は、不溶性酵素粒子がその上流表面上に配置された濾過層を含んで成る複合濾過媒質（composite filtration medium）を含んで成るフィルター・エレメントに関する。
他の態様においては、上記フィルター・エレメントを含むフィルター・カートリッジを提供する。
さらに他の態様においては、上記フィルター・カートリッジ及びカートリッジ・フィルター・ハウジングを含んで成る触媒フィルター・アセンブリーであって、本発明に係る複合濾過媒質が触媒として不溶性酵素粒子を使用して化学的変換を行うことができるようなものを提供する。
さらなる態様においては、本発明は、以下の段階：
ａ）本発明の係るフィルター・エレメントを用意し、そして
ｂ）化学的変換を行うのに十分な時間にわたり上記フィルター・エレメントの複合濾過媒質の上流表面上に移動反応溶液が衝突することを許容する。
を含んで成る化学変換の方法であって、そのフィルター・エレメントが触媒として不溶性酵素粒子を含んで成るような方法に関する。
さらなる態様においては、以下の段階：
ａ）不溶性細孔性粒子と（アブザイム（abzyme）であることができる）酵素を含んで成る溶液との混合物を用意し、ここで、この粒子と酵素が相補的な反応性又は求引官能性をもち、
ｂ）上記酵素を含んで成る溶液を、その酵素がその粒子に化学的又は物理的にかの中の少なくとも１で結合するのに十分な時間にわたり、その粒子と相互作用せしめ、そして
ｃ）少なくとも１の濾過層の上流表面上に上記粒子を湿−充填（wet-packing）する、
を含んで成る方法を提供する。
さらなる態様においては、複合濾過媒質を提供する方法であって、以下の段階：
ａ）濾過層を提供し、そして酵素と架橋性ポリマーを含んで成る溶液を提供し、
ｂ）その中に捕獲された酵素をもつ架橋細孔性ポリマー粒子を提供するように上記溶液中でそのポリマーを架橋させ、そして
ｃ）複合濾過媒質を提供するために濾過層の上流表面上にその中に捕獲された酵素をもつ架橋細孔性ポリマー粒子を湿充填する、
を含んで成る方法を提供する。
さらなる態様においては、複合濾過媒質を提供する方法であって、以下の段階：
ａ）濾過層を提供し、そして不溶性酵素粒子、例えば非水性液体中で不溶性である固体酵素、架橋酵素結晶、又は細胞全体を提供し、そして
ｂ）複合濾過媒質を提供するために濾過層の上流表面上に上記酵素粒子を湿充填する、
を含んで成る方法を提供する。
新規の不溶化酵素フィルター・エレメントは、液体中の不溶化酵素粒子のスラリーが、酵素粒子を細孔性材料（濾過層）に部分的に充填するために終端立体配置において配置され、そして好適なハウジング内に収納される濾過層を含んで成るフィルター・カートリッジを通過するような新規の方法により製造される。反応系のフィルター・エレメントをこのように製造する場合、溶解された反応体を含んで成る溶液は、生成物への所望の変換が達成されるまでそのフィルター・エレメントを通して、好ましくは繰り返して、そして比較的高い速度で通過される。このフィルター・エレメントは粒子をほんの一部に充填されるので、反応体溶液の通過は、望ましくは、そのフィルターを横切る最小圧力降下をもって比較的高い束速度で、行われることができる。pHの効果による不溶化酵素の失活は、最小である。なぜなら、１）効率的な混合がその酵素触媒への再暴露の前に生じることができる、補正塩基又は酸がその反応系中のいずれかの場所で添加されることができ、そして２）１パス変換が高い束速度において比較的低く、それによりより小さな、補正されるべきpH変化を作り出す、からである。高束速度における操作は、反応速度に対する有益が効果をもつことも測定されている。
本明細書中：
“濾過層（filtration layer）”は、単一シートを提供するために組み合されることができる１以上の個々の層を含んで成るシート様の織り又は不織り細孔性材料を意味し；その平均小孔サイズは１マイクロメーターより大きく、そして50マイクロメーターまでである；
“複合濾過媒質（composite filtration medium）”は、その上流表面上に配置された酵素粒子を含んで成る濾過層を意味し；その媒質は、大きくとも0.25メガパスカル（MPa）のフィルター・カートリッジ圧において少なくとも0.01cm／分の束速度をもつ；
“フィルター・エレメント（filter element）”又は“濾過エレメント（filtering element）”又は“濾過エレメント（filtration element）”は、流体通過のために形状化された複合濾過媒質を意味し；それは、濾過及び／又は反応操作を達成する触媒フィルター・アセンブリーの実際の部品である；
“フィルター・カートリッジ（filter cartridge）”は、一般的には筒状である濾過装置を意味する；
“フィルター・カートリッジ・ハウジング（filter cartridge houging）”は、フィルター・カートリッジのための支持物を意味する；
“触媒フィルター・アセンブリー（catalyst filter assembly）”は、ハウジング内のフィルター・カートリッジを意味する；
“反応装置（reaction system）”は、リザーバー内に含まれた反応溶液を少なくとも含んで成る触媒フィルター・アセンブリー、ポンプ、及び関連配管を意味する；
“束速度（flux rate）”は、濾過エレメントを通路する液体流の速度を意味し、そしてその濾過エレメントの前面表面積で流速（flow rate）を割ったものに等しい。この方法で記載する場合、液流の流れは、特徴付けされることができ、そしてその濾過エレメントのサイズに依存せず；束速度はまたフィルターを横切る圧力降下に寄与する。すなわち、増加した束速度は一般的に増加した系圧を意味する。商業的なフィルター・カートリッジ用途においては、最大量の液流を処理するであろう最小サイズのフィルターを提供することが高く望ましい。それ故、束速度がその流速を増加させることにより増加されることが望ましい。
“不溶化酵素粒子（insolubilized enzyme particulates）”又は“不溶性酵素粒子（insoluble enzyme particulates）”は、不溶性の粒状物であって、１）（人工酵素又はアブザイムを含む）可溶性酵素分子と不溶性粒子との反応、すなわち、可溶性酵素と不溶性粒子との共有結合、又はその結合相互作用、すなわち、イオン及び疎水結合、の生成物；２）同時−溶質ポリマー（co-solute polymer）が不溶性を付与されるとき、酵素の物理的捕獲又はカプセル化から生じる不溶性粒状生成物；３）非水性液体中で不溶であり、そしてこれらの液体中に充填され、そしてその中で反応される、固体酵素粒子；４）水性媒質中で使用されるとき、結晶を付与され、そして化学的架橋により不溶性となっている可溶性酵素の生成物であるような粒子；及び５）不溶性粒状物、生きた又は死んだ、動物、微生物、又は植物の細胞であって細胞内酵素を含んで成ることができるもの、のようなものを意味する；
“不溶性（insoluble）”は、１部以下の粒子が23℃において100部の溶媒に溶解することを意味する；そして
“フィルター・カートリッジ圧（filter cartridge pressure）”は、その反応装置内のフィルター・カートリッジ・ユニットを横切る、入口、又は上流、と出口、又は下流の間の差を意味する。
本発明のフィルター・エレメントは従来技術の触媒フィルターにおける問題を克服する。一般的な酵素触媒反応、例えば加水分解における酵素の安定性のために重要であることができる１パス操作に伴うpH制御の一般的な問題を別にして、本濾過エレメント内に粒子を含む従来技術のフィルターは、製造チャレンジを提示して、そして限定された能力のみを提供する。空中飛散粒子の災害はよく知られており、そして製造問題が、フィルター・エレメント内に捕獲される必要があるひじょうに小さく反応性のある粒子を物理的に取扱う必要があることによりそのフィルター・カートリッジの構築において容易に生じることができるであろう。従来技術のも、触媒能力を増加させるためにその濾過エレメント中により多くの粒子が充填されなければならないという点で限定された能力をもつ。粒子のより高い充填は、減少された小孔度をもつ濾過エレメントを生じさせ、そして操作システム圧が上昇するであろう。
本発明は、酵素粒子とpH補正液体との接触とを減少させ、乾燥粒子の取扱いを回避し、そして比較的低いカートリッジ圧において粒子の高い充填能力を提供することにより、従来技術のフィルターの上記問題を克服する。
図面の説明
図１は、不溶化された酵素粒子（12）がその上流表面上に配置された、１以上の個々の層であることができる表面濾過層（11）として好ましい細孔性不織ウェブを含んで成る複合濾過媒質（10）の断面の略図である。よく規定された細孔を有する不織濾過層（11）は、粗い上流プレフィルター層（13）、だんだんに細かくなる下流の細孔度をもつ多数の不織り濾過層を含んで成る濾過層（14）、及び下流の不織りカバー層（15）から成ることができる。
図２は、フィルター・カートリッジを作るために使用される複合濾過媒質（20）上のエンボス形状のパターン（22）の非プリーツ部分（non pleated portion）の斜視図である。エンボス加工は、前面表面積を増加させ、そしてその表面濾過エレメントをより完全に定めるために行われる。不溶化酵素粒子は明確にするためにこの図から省かれている。
図３は、長く延びた筒状にプリーツしたフィルター・エレメント（30）の斜視図であり；本発明に係る放射状にプリーツされた濾過エレメント（30）、好ましい複合物の放射状プリーツ（32）も示す；再び、不溶化酵素粒子が明確にするために省かれている。
図４は、筒状フィルター・カートリッジ（40）のための内部及び外部の補助支持部材の斜視図である。外部サポート（41）、例えば多数の穴をもつスクリム（scrim）又はスクリーンは、上記フィルター・エレメントの裂けの傾向を減少させるために内側から外側への液体の流れモードにおいて追加のサポートを提供することができる。同様に、スクリム又はスクリーンから成る内部支持構造物（42）、細孔性ケーシング又は類似の構築物は、好ましい外側から内側への液流状況における高圧適用下でのそのフィルター・エレメント（図示せず）が崩壊するのを防ぐためにサポートを提供することができる。両ケースにおいて、補助支持構造は、通常、統合ユニットを提供するためにそのフィルター・カートリッジのエンドピース（43）に接続される。
図５は、本発明に係る触媒フィルター・アセンブリー（70）の斜視図である。フィルター・ハウジング（72）はフィルター・カートリッジ（74）をサポートする。蓋（78）の入口（76）は、その好ましい外側から内側のモードにおいてスラリー又は溶液がフィルター・カートリッジ（74）内に入ることを許容する。この液体は出口（80）を通って触媒フィルター・アセンブリー（70）を出る。
図６は、本発明に係る反応システム（30）の略図である。反応溶液（51）は容器（52）の中に収められ、これは撹拌機（53）、溶液を加熱するための装置（56）にも接続された温度コントローラー（55）に接続された温度計（54）、そして入口（62）を介して反応溶液リザーバーに滴定物を届けることができるポンプ（61）にチューブ（60）を介してさらに接続されているビウレット（59）内に保持された（その反応の酸性又は塩基性生成物に対して補償的な）pH補正液にさらに接続されたpHスタット（58）に接続された装置（56）を備えている。反応溶液（51）は、上記触媒フィルター・アセンブリー（65）を通してポンプ（64）により出口チューブ（63）からポンプ供給され、そして入口チューブ（66）を介して反応容器中に戻される（液の流れの方向を矢印が示す。）。
図７は、実施例４において行われたような168ｍモルのペニシリンＧの、６−アミノペニシラン酸とフェニル酢酸への変換対時間を、示すグラフである。
図８は、実施例４において行われたような、ペニシリンＧの加水分解の最初の25％反応対時間を示すグラフである。線Ａは不溶化PGAにより；線Ｂは遊離PGAにより；そして線Ｃはカートリッジ・フィルター内の不溶化PGAにより得られた。
図９は、カートリッジを通る反応溶液の束速度対上記PGAカートリッジを使用したペニシリンＧの加水分解の反応速度を示すグラフである。
図10は、時間に伴うプロピレン・グリコール・メチル・エーテル・アセテート（PGMEA）の加水分解とその消失（線Ａ）と、時間に伴う１−メトキシ−２−プロパノール生成物の出現（線Ｂ）の２本のグラフ・プロットである。
図11は、PGMEAの加水分解の開始速度対循環束速度のグラフ・プロットである。
発明の説明
本発明は、酵素触媒を使用する触媒フィルター・アセンブリーのフィルター・エレメントを提供する。特に、この新規の部品は、反応体がその酵素触媒によりその中で変換される実際の複合濾過媒質である。この触媒フィルター・アセンブリーは、そのフィルター・エレメントの濾過層の上流表面上に配置された不溶性酵素粒子を含んで成る液体フィルター・カートリッジ及び反応溶液のリザーバーに接続されたそのフィルター・エレメントのための好適なカートリッジ・ハウジングを含んで成る。このフィルター・カートリッジは、反応体から生成物へのさらなる変換のためにそのフィルター・エレメントを通してその得られた溶液が繰り返し循環されることができるようにそのフィルター・エレメントを通してその反応溶液を通過させ、そしてそのリザーバーに戻すことができるポンプへの好適なチュービングにより接続されている。この通過は、大きくとも0.25MPaのフィルター・カートリッジ圧力において、少なくとも0.01cm／分、好ましくは少なくとも0.1cm／分、そしてより好ましくは少なくとも0.3cm／分の束速度において行われる。
従来技術においては、液流の濾過による粒子の除去は、以下の濾過機構の中の１又は組合せを適用することにより行われており、そして液体フィルター・カートリッジであって各々の機構により操作されるものが現在商業的に入手可能である。本発明は、これらのフィルター・カートリッジの修正を使用し、それによりその濾過層は流れ反応システム内に酵素触媒を保持する。
ｉ）深さ濾過（Depth Filtration）−この手順は、粒子含有液流がサイズ分けされた孔又は細孔の分布を有する濾過層によりぶつかり、そしてその粒子にその濾過層を通るむしろ曲がりくねった径路を与えるようなものである。この従来技術においては、粒子は、その濾過層内でのそれ自体の吸着及び／又は捕獲により主に除去される。深さ濾過、しばしば、システムに適用される粗い又は最初の濾過手順及び（直径において、最も大きな寸法）数百マイクロメーターから約１マイクロメーターまでの粒子を除去するように考案されたものは、よく規定されていない小孔サイズ及びそのフィルターが装填されるときにいつもすぐに上昇する系圧力のために粒子の不完全な除去という問題に苦しむ。
ii）表面（ケーキ）濾過−この操作は、本発明に伴って好ましく、そしてしばしば液流の処理において深さ濾過に続く。従来技術においては、それは、よく規定された小孔サイズを有するガラス又はポリマーの微細繊維の多層を使用して行われ、そしてその粒子は一般的には、その濾過層内を透過しないが、その層の上流表面上にトラップされて残った。約1.0マイクロメーターまで小さいサイズの粒子が99.99％程高い効率をもって集められた。高い束速度を容易に達成することができ、そして粒子の高い容量が、そのフィルターがほとんど満杯になるまで比較的低い系圧をもって除去されることができた。本発明においては、その液流の多数回の逆流によりその濾過層の表面上濾過された粒子を除去し又は再編成することが有利であり；この機会は、従来技術の深さフィルターによっては存在しない。
iii）膜（スクリーン又は篩分け）濾過−この濾過機構は、表面濾過にひじょうに類似している。但し、正確に規定すれば、0.05マイクロメーター程小さいサイズをもつ粒子の事実上全てを除去することができるひじょうに小さな細孔が存在する。この流れ中に残存する粒子の“絶対的な（absolute）”制御を提供しながら、高い系圧、低い容量、及び閉塞の問題もこの濾過機構に同伴する。
本発明において有用な表面フィルター・カートリッジは、米国特許第3,058,594号の標準的な垂直プリーツ・フィルター及び特に好ましくは、米国特許第4,842,739号の水平で複雑で放射状にプリーツしたフィルターであって本発明のための有用な粒子充填フィルター・カートリッジを開示するものを含む。プリーツの水平な配置が本発明において好ましい。なぜなら、このカートリッジ・フィルターが一般的に水平な配置において使用され、そしてより大きなパーセンテージの粒子が、その流れが中断し、そしてそのカートリッジが使用の間に保管されるとき、その水平なプリーツ内に保持されるからである。他のフィルター・カートリッジ、例えば、ひも巻き（string mound）、樹脂接着、及びスプレー紡糸の深さフィルターも使用されることができるが一般的には、比効的比いフィルター・カートリッジ圧を同時に維持しながらその表面フィルターと同じくらい多くの粒子を充填する能力を欠いている。
標準的な筒状の、プリーツ・フィルター・カートリッジは、さまざまな、サイズ、例えば、4.8×24.8cm（直径×高さ）、6.7×24.8cm，6.7×50.8cm，11.4×24.8cm、及び11.4×50.8cm、フィルター・エレメント材料、例えば、セルロース、セルロース−ポリエステル、ガラス−セルロース、ポリエステル、ポリオレフィン、例えば、ポリプロピレン、及びセラミック、並びに平均公称小孔サイズ、例えば、１，２，３，５，10，20，30、及び50マイクロメーターにおいて、Ametek Inc.（Sheboygan, WI）から、関連のフィルター・ハウジングと一緒に入手可能である。全ポリプロピレン構造の好ましい筒状の、複雑で放射状にプリーツした表面フィルター・カートリッジは、さまざまな、サイズ、例えば、7.6×25.4cm，7.6×50.8cm，7.6×76.2cm、及び17.8×101.6cmにおいて、並びに２，５，10、及び20マイクロメーターの平均公称小孔サイズを有して、３Ｍ Filtration Products（St. Panl, MN）から購入されることができる。より小規模な反応に有用であるより小さな使い捨てカプセル・フィルター及びハウジングは、さまざまな、サイズ、例えば、6.3×6.4cm，5.8×17cm、及び8.6×14cm、フィルター・エレメント材料、例えば、ポリアミド、例えば、アクリル・コート・ポリアミド及びポリプロピレン、及び平均公称小孔サイズ、例えば、１，３、及び５マイクロメーターにおいて、Gelman Sciences, Inc.（Ann Arbor, MI）から入手可能である。
好ましくは、本発明に係る複合濾過媒質は、その上流表面上に不溶性酵素粒子がランダムに置かれた１以上の不織層を含んで成る。機械的観点から、繊維状ウェブ又は細孔層であることができる実際の不織層の組成は、それがその反応溶液により溶解され又はそれと反応されない場合、水性媒質中で反応を行うとき決定的でない。上に特定した濾過層の全ては一般的に水中でよく働く。それは、反応が有機溶媒中で行われるとき（又は有機反応体の濃度がひじょうに高く、そして、結果として、その溶液が比較的“有機性（organic）”であるとき）だけ、その濾過層の性質についての特別の注意が必要である。その入手可能性、コスト、及びほとんどの有機溶媒（及び反応体及び生成物）に対する化学的不活性のために好ましい材料はポリプロピレンである。
濾過層の小孔サイズの選択は、その上流表面上に保持されるべき不溶化酵素粒子のサイズ・レンジに直接的に依存し、そして一般的に、その最小の粒子サイズに対応する。しかしながら、その粒子の一部がその濾過層の小孔サイズよりも小さなサイズを有する場合でさえ、有用な複合濾過媒質を得ることができるということが測定されている。部分的に充填された複合濾過媒質、以下参照、の新規の製造方法のために、これらのより小さな粒子は、初期のサイクルにおいてはそのフィルターを通過することができ；後期のサイクルにおいては、粒子の床が堆積すると伴に、その装置は深さフィルターの性質を呈し、そしてこれらの小さな粒子も保持され、そして本発明において利用されることができる。時間効率の利点及び好ましい表面濾過モードにおけるカートリッジ・フィルターの使用においては、しかしながら、不溶化酵素粒子の少なくとも95％がその濾過を通しての最初のパスにおいて除去されるような表面カートリッジ濾過を使用することが好ましい。１マイクロメーター未満の平均小孔サイズをもつ濾過層、例えば小孔性の非繊維状膜は好ましくない。なぜなら、それらは、存在することができる偶然に生じた粒子からだけではなく、高く濃縮された反応溶液中でしばしば遭遇する懸濁反応体１生成物によってさえも詰まり易くなるからである。一般的には、公称平均１−10マイクロメーター内の等級にあるフィルター・カートリッジが、これらの基準に適合し、そして本発明において使用される粒子のために効率的なフィルター・エレメントを提供し、そしてまた、低いフィルター・カートリッジ圧において比較的高い束速度を届けることができる。
本発明において有用な酵素は、それ自体で、適当な補因子を伴って、又は多酵素プロセスにおける他の酵素を伴ってのいずれかで、合成目的のために使用されてきた全てのクラスの酵素を含む。合成目的のために使用されてきた酵素の例は、非限定的に、アルカリ性ホスファターゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、リゾチーム、ウレアーゼ、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、サーモリシン、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、キサンチン・オキシダーゼ、グリコース・オキシダーゼ、ウマ肝臓アルコール・デヒドロゲナーゼ、インベルターゼ、フィシン（ficin）、ブロメリン（bromelin）、ペプシン、ヘパリナーゼ、スルファターゼ、スクロース・シンセターゼ、アルドラーゼ、アルパルターゼ、フマラーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、ブタ膵臓リパーゼ、リゾープス（Rhizopus）リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）リパーゼ・カンジダ・シリンドラセアエ（Candida cylindraceae）リパーゼ、ムコー・ミヘイ（Mucor mihei）リパーゼ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）リパーゼ、ブタ肝臓エステラーゼ、ペニシリン・アシラーゼ、及びウマ肝臓エステラーゼを含む。
本発明において有用な不溶化酵素粒子は、５つの一般的タイプの内にある：１）不溶性粒子への共有、疎水又はイオン結合から生じたもの；２）不溶性ポリマー・マトリックス内へのカプセル化又は捕獲から生じたもの；３）非水性液体中で不溶であり、そしてこれらの液体中に包まれ、そしてその中で反応される固体酵素粒子；４）架橋された酵素結晶粒子；５）不溶性アブザイム粒子；及び６）酵素を含む全細胞。本発明において有用な不溶性酵素粒子のサイズは、例えば５％未満の小部分が、使用されるフィルター・カートリッジに依存して、マイクロメーター以下（最大直径）からであるような分布最大直径において数ミリメーター程の大きさまでのレンジにあることができる。粒子のサイズ下限に関する討議及び予告は、適当な小孔サイズの濾過層の選択に関して既に与えられている。粒子のサイズ上限は、特定の種類のフィルター・カートリッジに依存するであろうし、そしてプリーツ又は折り畳また先端の分離により最終的に決定される。粒子サイズは、フィルター・エレメントのプリーツ又は折り畳みの上流表面中及び上での透過が生じることができるように、プリーツ又は折り畳み入口先端の間の距離よりも小さいことが必要とされる。作業実行可能性として、粒子が協同して働き、そしてそのプリーツ／折り畳み先端距離を超えることを防止するために、有意に小さな粒子サイズ、すなわち、約１／５又はそれ未満のプリーツ／折り畳み先端距離が好ましくは使用されるような経験が示されている。本発明の重要は貢献は、比較的高い濃度の酵素が、比較的大きな表面積を有する粒子サポートを使用することにより不溶化されることができるということである。一般的には、前形成された不溶性サポートを必要とする不溶化酵素粒子タイプのために、その表面積は少なくとも10ｍ²/ｇ、好ましくは少なくとも50ｍ²/ｇ、そしてより好ましくは少なくとも100ｍ²/ｇでなければならない。これらの表面積を提供するためには、対応の粒子サイズは好ましくは、直径において、マイクロメーター下〜400マイクロメーター、より好ましくは１〜200マイクロメーター、そして最も好ましくは10〜100マイクロメーターのレンジ内にある。
酵素は、そのタンパク質の３次元又は３次球状構造の周辺に配置された特定のアミノ酸残基上に存在する電荷をもった基からそれらの水溶解性のほとんどを得ている。共有結合技術が本発明において好ましい。なぜなら、これらのより多く周辺に配置された電荷をもった基、特にリシン残基上のアミノ基がしばしばこの結合方法に直接的に関係し、そして結果として、その活性部位又は触媒中心が通常、比較的影響されず、そして触媒機能が維持されるからである。また、効率的な共有結合方法によって、その酵素の脱着及び溶脱が生じないはずである。共有結合による酵素不溶化は、典型的には電子親和性官能基、を有するさまざまな不溶性反応体、例えば、アズラクトン、オキシラン、クロロメチルフェニル、シアネート、スルホニル・ハライド、カルボニル・イミダゾール、カルボジイミドにより活性化されたカルボン酸、アジド、アルデヒド、チオールスルホネート、イソチオシアネート、イソシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トレジル・エステル、フルオロニトロ芳香族、ビニル・スルホン、カルボン酸無水物、ハロアセチル、及びクロロカーボネートを使用して行われてきた。これらの基は、酵素上に存在する求核基、例えば第１アミン基（例えば、リシン残基及びタンパク質末端）、チオール基（例えば、システイン残基）、及びカルボン酸（例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基）と反応する。酵素の共有結合のために有用な商業的に入手可能な官能性粒子支持体は：（３Ｍ Bioapplications, St. Paul, MNから入手可能な）アズラクトン−官能性EMPHAZE^ＴＭバイオサポート媒質、（Rohm-Pharma, Darmstadt, Germanyから入手可能な）オキシラン−官能性EUPERGIT^ＴＭサポート、（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WIから入手可能な）クロロメチルフェニル−官能性Merrifield Resinサポート、（Sterogene Bioseparations Inc., Arcadia, CAから入手可能な）アルデヒド−官能性Actigel A^ＴＭサポート、（Pharmacia, Uppsala, Swedenから入手可能な）シアネート−官能性Sepharose^ＴＭサポート、（Pierce Chemical Co., Rockford, ILから入手可能な）カルボニル・イミダゾール−官能性Reacti-Gel^ＴＭサポート、（Millipore, Bedford, MAから入手可能な）ビニル・スルホン−官能性Immobilon^ＴＭサポート、及びトレジル活性化Sepharose^ＴＭサポート（Pharmacia）を含む。酵素結合指示は、各サポートについてユニークであり、そして上記製造者から得られることができる。
球状、水溶性酵素の外側表面上の電荷をもつ基は、酵素上の同様に電荷をもつ基との不溶性粒子上の遊離反対イオン（counterions）又はゲーゲンイオン（gegenions）の交換を通じて結合のために利用されることもできる。このイオン交換生成物がその酵素のゲーゲンイオンを置換するであろう他のイオンに遭遇しない限り、その結合は持続することができる。非共有結合の上記方法の欠点は：１）反応が生じるときpH及びイオン強度における変化により引き起こされる解裂に対するその結合の感受性及び２）その結合条件における酵素の高い電荷をもつ微小環境が水性溶液中のその正常環境とは全く異なり、そして作用酵素のタンパク質成分の必要な会合、すなわち４次構造における変更及び触媒機能における破壊を導くことができること、を含む。通常プロトン化されており、そして結合pHにおいて電荷をもつ求核官能基、例えばアミン基をと有する不溶性粒子、例えばDEAE Sepharose^ＴＭサポート（Pharmacia）も、タンパク質結合についての指示をもって入手可能である。
酵素の外側表面上の水溶性アミノ酸残基の存在にも拘らず、ほとんどの酵素構成するアミノ酸の大部分は、天然において比較的疎水性である。さまざまな疎水性芳香族及び脂肪族基が存在するからである。球状酵素のより中心に配置されたアミノ酸のこの疎水性は、比較的疎水性の粒子サポート、例えばｎ−オクチルSepharoseサポート、パルミトイルSepharoseサポート、ベーターナフチル綿、セライト、ヘキサデシル・シリカ、油含浸ポリプロピレンその他に酵素を疎水的に結合させるのために使用されてきた。特定の場合においては、その疎水性相互作用の強度は、単独で、本発明における不溶化酵素粒子としての使用のために十分である。その疎水的結合方法の逆反応に対する追加の保護は、そのサポート粒子からの酵素の損失又は溶脱に対して追加の安定化を提供するであろう酵素のための架橋剤、例えばグルタルアルデヒドによりその酵素粒子を処理することである。非共有結合技術、例えば疎水結合に伴う欠点は、その結合相互作用が、その活性触媒中心がしばしば影響され、そして触媒機能がその結合工程が進行するとき時間とともに減少し続けるであろうようにその球状構造内のかなり深くにその酵素を含む傾向にあるということである。
上記タイプの不溶化酵素粒子を用いて、固定化又は不溶化が、好適な溶媒中に含まれる酵素によるバッチ毎のその不溶性反応性粒子の慣用の処理により引き起こされることができる。あるいは、この不溶性反応性粒子はフィルター・カートリッジ上に最初に充填され、そしてその酵素は、その粒子充填カートリッジ・フィルターを通してその酵素溶液のリサイクリングによりその後に固定化されることができる。酵素を不溶化するこの後者の方法は、製造コスト及び環境関連コストを有意に減少させるためのかなりの潜在能力を提供する。なぜなら、合成された粒子は、単離、乾燥、サイズ分け、等される必要がないが、その重合又は合成リアクターからフィルター・カートリッジ上に直接的に充填されることができるからである。
本発明に係る不溶化酵素粒子は、不溶性酵素、細胞小器官、又は全細胞成分を用いる捕獲又はカプセル化方法を使用することにより調製されることもできる。一般的に、酵素捕獲を最大化し、そして漏れを最小化するために、高い程度の架橋であって反応体と生成物の拡散を制限することができるものが必要とされる。また、酵素の活性部位は、その捕獲性媒質によりいくぶんじゃまされ、そして高分子量の反応体に接近できなくなる傾向がある。ポリアクリルアミド／メチレン−ビス−アクリルアミド網目構造、アルギネート・ゲル、及び繊維形成性ポリマー、例えばセルロース・トリアセテート中への酵素捕獲のための方法が考案された。半透膜、リポソーム、及び中空繊維内のマイクロカプセル化も酵素を不溶化するために使用されてきた。さらに、さまざまたプレ−ポリマー技術であって、光架橋形成システム及び生体触媒の水溶液又は懸濁液を架橋させ、そしてカプセル化することができるイソシアネート官能性樹脂を含むものが使用されてきた。多くの酵素は、水がそれから除去されるとき、固体、いくつかは結晶である。これらの固体酵素調製物は一般的に非水性溶媒中で不溶であり、そして特に包装液体及び反応溶媒、例えばヘキサン、ヘプタン、トルエン、及びキシレンと共にフィルター・エレメント上に直接的に充填されることができる。これらの不溶性酵素粒子が望ましいかもしれない。なぜなら、その固体酵素のための貧弱な溶媒でありながら非水性溶媒は反応体と生成物のための優れた溶媒である傾向をもつからである。
本発明において有用である他の種類の不溶化酵素粒子は、Altus Biologics（Cambridge, MA）により商品化された“Cross-Liuked Enzyme Crystals”（CLECs）である。このCLEC^ＴＭ−形成工程においては、酵素はさまざまな技術により最初に結晶化され、そして次に架橋剤、例えばグルタルアルデヒドによる処理により永久に不溶化される。得られたCLECsは、本発明に係る不溶化酵素粒子として直接使用されることができる。
不溶化酵素粒子の１のさらなる種類は、触媒抗体又はアブザイムとして知られる共有結合固定化人工酵素である。これらは、生きた生物内に存在する抗体が、そのために触媒がデザインされるところの他の基質の遷移状態に構造的に近似する抗原により処理されるような触媒である。例えば、通常、４配位ホスホネート（tetracoordinate phosphonates）が、４配位遷移状態をもつカルボン酸エステルを立体特異的に加水分解させるために使用されることができる抗体（アブザイム）の製造のために抗原として使用されてきた。これらのアブザイムは、K. D. Janda, et. al., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 8868（これを引用により本明細書中に取り込む。）により開示された手順により無機粒子材料上に固定化されてきた。
収穫され、そして合成に使用されてきた有用な微生物又は全細胞は、ペンシリウム・ディジタタム（Penicillium digitatum）、リゾープス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）、ムコー・ロウキシアヌス（Mucor rouxianus）、カンジダ・ウティリス（Candida utilis）、サッカロミセス（Saccharomyces）種、ピチア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、クロエケラ・サターヌス（Kloeckera saturnus）、ノカルディア・サルモニコル（Nocardia salmonicor）、プロテロス・ブルガリス（Proteous vulgaris）、ラクトバチルス・ケフィール（Lactohacillus kefir）、スルフォロブス・スルファタリカス（Sulfolobus sulfataricus）、ゲオトリチャム・カンジダム（Geotrichum candidum）、及びトルラスポラ・デルブルエキイ（Torulaspora delbrueckii）を含む。
これまで、フィルター・カートリッジ、反応システム、及び不溶性酵素粒子について記載してきたが、それにより本触媒フィルター・アセンブリーを調製する新規の方法をこれから詳細に説明する。この方法は、以下の段階：
ｉ）閉じたループ配置において、ハウジング内に収められたフィルター・カートリッジを、少なくとも0.01cm／分の束速度を届けることができるポンプに、そして液体中に不溶性の酵素粒子のスラリーを含むリザーバーに、接続し；
ii）不溶性酵素粒子の所望量が充填されるまで又はそのフィルター・カートリッジ圧が約0.15MPaに達するまで、リサイクリング・モードにおいてそのフィルター・カートリッジを通して上記スラリーをポンプ供給する、
を含む。
本発明において有用なポンプは、0.01cm／分の過剰において、好ましくは0.10cm／分の過剰において、そしてより好ましくは0.30cm／分の過剰において、フィルター・カートリッジを通る束速度を提供する。反応溶液がそれを通って流れるポンプ及び関連がスケット材料及びチューブ材料／配管は、その反応溶液及びpHにおける小さな変化により、比較的影響されない。好ましいポンプは、蠕動、ダイアフラム、ギアー、及び遠心ポンプであってその反応溶液に接触する現実のポンプ成分がステンレス・スチール又はポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から構築されているものを含む。ほとんどのタイプのゴム又はプラスチックのチーブ材料／配管は水性媒質中で行われる反応に好適であるが、有機溶液中での使用（そして高い有機反応体の濃度がさらに水溶媒と共に使用されるとき）のために、ポリプロピレン、ポリエチレン、PTFE、ステンレス・スチール、及びガラス・チューブ材料を使用しなければならない。フィルター・ハウジングに対するフィルター・カートリッジの接続及びそのシステムの残りとの接続をに介在する好ましいガスケット材料はPTFEとポリプロピレンを含む。
“乾燥（dry）”充填（Packing）製造技術とは異なり、液体担体の使用による濾過層上への粒子の“湿（met）”充填は、それらの粒子が、反応溶液にその後にアクセスされることができる濾過エレメントの領域内に配置されることを保証する。これらの粒子は、それらの位置が前もって選ばれていないという意味においてその濾過層上にランダムに配置される。但し、その液体担体の流れは、粒子の最終的な位置に影響を及ぼすことができる。上記の方法によるフィルター・カートリッジの充填においては、その濾過エレメントの比較的均一な部分的荷重を達成するために各充填期間にわたり、その液体中の粒子のかなり希釈された濃度、例えばその液体スラリーの５重量パーセント未満を使用することが望ましい。粒子は、各部分の間に生じるリザーバー含量の肉眼清澄化をもって、部分に分けてそのリザーバーに添加されることができる。このパッキング操作の束速度は好ましくは、少なくとも0.01cm／分、より好ましくは少なくとも0.10cm／分、そして最も好ましくは少なくとも0.30cm／分である。比較的高い束速度が、それらの粒子がプリーツ・フィルター・エレメントの折り畳みをよりよく透過し、これによりこのフィルター・エレメントによりよくアクセスし、そして高負荷を容易にするために、好ましい複雑で放射状にプリーツしたフィルター・カートリッジに伴って、特に好ましい。これらの粒子をスラリーにするために使用される液体は、その後に行われるであろう反応のための溶媒として働くであろう同一の液であっても又はそうでなくてもよい。有用な液体は、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、アセトニトリル、及び水、好ましくは緩衝水をを含む。
粒子は、フィルター・カートリッジ圧が0.15MPa以下に、好ましくは0.10MPa以下に、そしてより好ましくは0.05MPa以下に達するまで、リザーバー内に、そして最終的にフィルター・エレメントの上流表面上にロードされる。十分にロードされた好ましい複雑な放射状にプリーツしたフィルター・カートリッジのための実際のフィルター・カートリッジの圧力限界は約0.25MPaである。フィルター・カートリッジの用途の一般的ルールとして、約0.05MPa過剰のフィルター・カートリッジ圧が達成されるとき、追加の粒子のための後のローディングは、だんだん大きくなるフィルター・カートリッジ圧をもたらす。しかしながら、特に、より低い推奨フィルター・カートリッジ圧を用いて、そのフィルター・カートリッジを通過する溶液の束速度は高く、そして本発明の目的に望ましいレンジ内に残る。このやり方で、本ユニットは、その後の反応及び取扱い操作の間に遭遇する傾向にある外来的粒子に未だ応答することができる。操作の間に残りの粒子容量を保存することにより、シャット・ダウンを避け、そしてフィルター・カートリッジの寿命を延長することができる。
粒子がロードされたフィルター・カートリッジは、これで通過する溶液中の化学反応を触媒するための触媒フィルター・アセンブリーとして使用される状態にある。この触媒フィルター・アセンブリー及びカートリッジを図１−５に図示する。
粒子をロードして複合濾過媒質を提供した後、入口と出口のチューブ材料の端をリザーバーから取り外し（又はそのパッキング・リザーバーが反応体溶液リザーバーとしても働くであろう場合には接続したまま残し）、そして液体溶媒中に溶解された反応体を含む適当な反応容器に接続する。反応体は、酵素触媒により反応生成物に化学的に変換されることができるいずれかの有機又は無機溶質であることができる。単独で使用されることができる有用な反応体は、異性化されることができるさまざまな炭水化物化合物、例えばグルコース及びスクロース、並びに環化されることができるスクアレン様化合物を含む。有用な反応体の対は、エステル−水、ニトリル−水、アミド−水、オレフィン−水、酸−アルコール、無水物−アルコール、無水物−アミノ酸、エステル−アミン、アルデヒド−ヒドロキシケトン、アルデヒド−シアノヒドリン、ニトリル・オキシド−オレフィン、オキシラン−水、及びオレフィン−アミンを含む。酵素触媒に関連する補因子仲介還元は、ケトン、アルデヒド、及びオレフィン基質を含む。同様に、酸化は、アルコール、アルデヒド、ケトン、スルフィド、及びさまざまな脂肪族及び芳香族炭化水素基質を含む。
使用される液体溶媒は、行われるべき反応の性質にかなり依存する。水が反応体である場合、水は溶媒としても使用されることが高く望ましく；エステル化又はトランスエステル化が所望の反応である場合、対応のアルコール又はエステルが溶媒として使用されることができる。行われるべき化学反応のための溶媒として有用な液体のリストは、フィルター・カートリッジ・パッキングのために先に列記したものを含むであろう。
追加の添加物、例えば緩衝剤も、特に化学反応が酸性又は塩基性生成物を作り出すとき、安定な条件においてその不溶化酵素を維持するために必要とされることができる。
もちろん、最も短期間において最も高い生成物の品質を得ることが通常望ましい。酵素触媒の使用においては当業者に自明であろうが、生成物が蓄積される程度並びに酵素及び反応体の濃度はその反応に対して重要な影響力をもつ。一般的に、所定の反応体又は基質のために、そして複雑な基質阻外因子の非存在において、かなりの、例えばいわゆるミカエリス−メンテン定数（km）よりも10倍大きな基質濃度が、反応が最大速度で生じるであろうために望ましい。
反応溶液が複合濾過媒質を通過する速度、すなわち束速度、及びリサイクルされる速度も、本発明における性能に対する重要な基準である。束速度の効果の説明は、高束速度において不溶性酵素粒子と反応体のより良好な剪断混合、より高い束速度における濾過エレメントのプリーツ又は折り畳み内に深く含まれるより多くの数の粒子へのアクセス、及び／又は他の要因を含むことができる。少なくとも0.01cm／分の反応溶液通過の束速度、より好ましくは少なくとも0.10cm／分、そして最も好ましくは0.30cm／分が好ましい。
本発明の追加の寄与及び図６の反応システムの説明により容易に識別されることは、それらの完全な、未希釈の強さにおけるpH補正滴定物液体が不溶化酵素粒子に遭遇する機会をもたないということである。滴定物が反応スラリーに直接的に添加される固定化酵素の慣用のバッチ毎の使用に反して、本発明における滴定物は、カートリッジ・フィルター上に含まれる不溶化酵素粒子に出会う前にそれが撹拌され、そして希釈される反応溶液リザーバーに添加され、そしてそのモジュールの反応システムの他の部分内に収められる。これは、本発明のひじょうに重要な特徴であり、そして多くの再使用の経過にわたり、最初のピーク性能の維持に貢献するものである。この不溶化された酵素粒子は、それらがスラリー又はバッチワイズに適用され、そして一時的であるが広く振れるpHの有害効果に苦しむ場合よりも長く、それらの活性触媒形態で残存する。
本発明のフィルター・エレメントは、さまざまな触媒化学反応、例えば、エステル化、異性化、酸化、還元、及び還化において使用される。
本発明の目的及び利点を、以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例中に述べる特定の材料及びその量、並びに他の条件及び詳細は本発明を不当に限定すると解されるべきではない。
実施例１
本実施例は、ペニシリン・アシラーゼ（penicillin acylase）がアズラクトン官能性EMPHAZE Biosupport Media上で共有結合により固定化され、そして好ましい複雑な放射状プリーツ・カートリッジ・フィルター上にロードされた本発明のフィルター・エレメントの製造について教示する。
固定化ペニシリン・アシラーゼ粒子
ペニシリン・アシラーゼ（PGA；ペニシリン・アミドヒドロラーゼ（penicillin amidohydrolase），ED３．５．１．11）を、典型的には60〜70mg／mLのタンパク質含量をもつ、0.1Ｍリン酸ナトリウム、pH7.5中の溶液としてPharma Biotechnologie Hannover（Hannover, Germany）から購入した。比活性は17〜24ユニット／mgタンパク質のレンジにあり；１ユニットは、水酸化ナトリウムによりその放出された酸を滴定することにより測定されるような、37℃及びpH7.8における１分間当りにペニシリンＧからフェニル酢酸の１マイクロモルを解裂するために必要とされる酵素の量として規定される。この酵素は受領されたときに使用された。
（３Ｍ Bioapplications, St. Paul, MNから得られた）アズラクトン官能性EMPHAZE Biosupport Mediaの特定サンプルを、その粒子の80％が６と40マイクロメーターの間（平均＝21マイクロメーター）のサイズを有し、マイクロメーターよりも大きな粒子は全く検出されない、結合試験において使用され；粒子サイズは、Coulter LS-100 Particle Size Analyzer（Coulter Corp., Hialeah, FL）を使用して測定された。10.00グラムのEMPHAZE材料に、PGA溶液（5.75mLの0.1Ｍホスフェート中に溶解された399mg PGA, 7200ユニット）及び600mLの1.0Ｍクエン酸ナトリウム、0.05Ｍリン酸水素２ナトリウム、及び0.05Ｍリン酸２水素ナトリウム溶液を添加した。このスラリーを室温において５時間混合し；この混合物を濾過し、そしてこの濾過ケーキを、リン酸塩バッファー生理食塩水（0.85％塩化ナトリウム及び0.10Ｍリン酸ナトリウム、pH7.2）（２×600mL）、0.005Ｍ EPPS（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔３−プロパンスルホン酸〕；pH＝8.0；Sigma）（２×600mL）により洗浄し、そして次にその濾過ケーキを600mLの0.01Ｍホスフェート及び0.1Ｍの塩化カリウム（pH＝7.6）中に再懸濁させた。この不溶化酵素粒子の活性は6600ユニットであった。
カートリッジ・フィルター上への不溶化PGA粒子のローディング
ローディング手順のために、Millipore Peristaltic Pump（802G230, Millipore Corp., Bedford, MA）, Ametek Water Filter Housing（Model PSCL, Ametek, Inc., Sheboygan, WI）であってポリプロピレン・ガスケットにより接続された３Ｍ High Capacity Liquid Filter Cartridge（Model 313B, ３Ｍ, St. Paul, MN；7.6×25.4cm；全ポリプロピレン；２マイクロメーター細孔サイズ等級）を含むもの、及び効率的な磁気撹拌能力を備えた６Ｌビーカーを、Norprene^ＴＭチューブ材料（カタログ番号6485-73；Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, ILから入手可能なもの）により相互に接続した。このビーカー・リザーバー内に、pH7.6における５Ｌの0.01Ｍリン酸２水素カリウム及び0.1Ｍの塩化カリウムを入れた。上記ポンプを3.7Ｌ／分の流速（束速度＝0.44cm／分）において連動させ；入口と出口のチューブ材料端を、空気泡が形成されないようにそのリザーバー中の液体の表面下に沈めた。次に、上記PGA粒子スラリーの100−150mL部分を添加し、そしてその濁った混合物を激しく撹拌し、そして各スラリー添加の間に肉眼により清澄化させた。約20分間の合計時間がこのローディング操作のために必要であった。このカートリッジを以降、“PGAカートリッジ”という。反応の間、このカートリッジ及びそのハウジングを５℃において保存した。
実施例２
本実施例は、アズラクトン官能性分散ポリマー上に共有結合により固定化されたブタ肝臓エステラーゼが複雑な放射状にプリーツされたカートリッジ・フィルター上にロードされる、本発明に係るフィルター・エレメントの製造について教示する。
アズラクトン官能性分散ポリマーの調製
機械撹拌機、温度計、ガス入口、滴下漏斗、及びコンデンサーを備えた３リッター、３首丸底フラスコに、トリメチルオールプロパン・トリメタクリレート（50.0グラム；Sartomer Co., Inc., Exton, PAから入手可能）、ヒドロキシエチル・メタクリレート（HEMA；30.0グラム；Alcolac, Baltimore, MDから入手可能）、２−ビニル−４，４′−ジメチルアズラクント（VDM；20.0グラム；SNPE, Inc., Princetou, NJから入手可能）、1.67グラムの安定化溶液〔Isoparg^ＴＭ中33％固形分；HEMAと反応したラウリル・メタクリレート：VDM（94：６ｗ／ｗ）から成る〕、及びヘプタン（800mL）をチャージした。この溶液を撹拌し（350rpm）、そして70℃まで温める前10分間窒素を散布した。アゾビス（イソブチロ−ニトリル）（2.5グラム；Polyscieuces, Inc., Warrington, PAから入手可能なもの）を、上記の熱い溶液に添加し、そして数分以内に粒子がその反応容器内で見られた。重合が進行するとき、８つの脱酸素化ヘプタンの200mL部分を混合を容易にするために各時間において添加した。粒子の検出から２時間後に、その反応混合物、この時には白色のクリーム状の羊毛のようなポリマーの塊り、を冷却に供した。この固形物を濾過し、そして１Torr未満において一定重量まで乾燥させる前にヘプタン及び酢酸エチルで洗浄した。このポリマーは、98.9グラムの重さであり（98.9％収率）、93ｍ²/ｇの表面積（BET法）を有し、18％のVDM取り込みを示す1.8％の％窒素、そして14−203マイクロメーターの間（平均サイズ＝54マイクロメーター）許容される直径をその粒子の80％が有するけれども、いくつかの粒子凝集物が1000マイクロメーターに近い許容されることができない大きな直径をもって存在したことを示すような粒子直径サイズのレンジにある。濾過操作が困難になることを妨ぐために、より大きな凝集材料が、その酵素結合手順の後により小さなサイズに壊されるであろう。
不溶化ブタ肝臓エステラーゼ粒子
ブタ肝臓エステラーゼ（PLE；カルボキシ・エステラーゼ、EC３．１．１．１）を、3.2Ｍ硫酸アンモニウム中の懸濁液としてSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から購入した。その比活性は、１ミリグラムのタンパク質当り約200ユニットであった（１ユニットはpH8.0,25℃における１分間当りの１マイクロモルのエチル・ブチレートを加水分解するのに必要な量として規定される。）。結合前に、その酵素を、pH7.5に調整された0.7Ｍクエン酸ナトリウム及び0.05Ｍリン酸水素２ナトリウムから成る溶液の３回の交換に対して最初に透析した。この手順は、その酵素を所望のpH及びイオン強度にもっていき、そしてアンモニウム・イオンを取り除く。この透析物を次に0.45マイクロメーターのセルロース性シリンジ・フィルター（model SLHA 02505, Millipore Corp., Bedford, MAから入手可能なもの）を通して濾過し、そしてその酵素濃度を280nmにおける14.8の消光係数を使用して分光光度計により測定した（１％，１cm）。これは重量測定され、そしてBarker and Jencks in Biochemistry, 1969, 8, 3879-3889により報告された13.8の値に近似する。
10.00グラムの先のように調製されたアズラクトン官能性分散ポリマーを、30mLのPLE溶液（シトレート／ホスフェート透析溶媒中に溶解された264mg PLE）、600mLの0.7Ｍクエン酸ナトリウム及び0.1Ｍホスフェート（pH＝7.4）、及び15mLの水に溶解された（BASF Corp., Parsippany, NJから入手可能な）0.60グラムのPluronic L-31^ＴＭ界面活性剤を添加した。この混合物を約１時間機械的に振とうし、次に室温においてさらに２時間緩かに混合した。この混合物を濾過し（焼結ガラス漏斗；10−20マイクロメーター平均公称フィルター等級）、そしてその濾液は、ｐ−ニトロフェニル・アセテートの加水分解についての触媒として検査されたとき本質的に背景活性を有していた。この濾過ケーキをリン酸塩バッファー生理食塩水の400mL部分及び0.005Ｍ EPPSで洗浄した（３回）。この濾過ケーキを次に0.005Ｍ EPPS（600mL）中に溶解された１％ Pluronic L-31界面活性剤中に再懸濁し、そして16時間室温において混合した。この混合物を濾過し、そしてこの濾過ケーキを0.005Ｍ EPPSの400mL部分でよく洗浄した。この濾過ケーキを次に0.05Ｍ EPPSの600mL部分中に懸濁し、そして５分間中速において（Brinkmann Instruments, Westbury, NYから入手可能な）Willems Polytron Model PT 10-35 Tissue Homogenizerを使用してホモジュナイズした。得られた粒子サイズ・レンジは、直径において200マイクロメーターよりも大きな粒子を全く示さず、そして80％が６と112マイクロメーターの間のレンジにある。
カートリッジ・フィルター上への不溶化PLE粒子のローディング
上記スラリーを0.05Ｍ EPPSを含むリザーバーを使用して20分間にわたりロードして、実施例１の手順を使用した。そのパッキング流速は４Ｌ／分（束速度＝0.48cm／分）であり；遊離のPLEはこのローディング操作の後に清澄化されたリザーバー内で全く検出されなかった。このカートリッジを、その後の実施例において“PLEカートリッジ”という。
実施例３
本実施例は、本発明の目的のための表面濾過カートリッジ・フィルターが深さフィルターに比べた優れたローディング能力を有していることを教示する。また、この複雑な放射状のプリーツ・フィルターの優秀性は、優れたローディング能力によるだけでなく、一定流速において評価されるそのフィルター・カートリッジの最小束速度の提供によっても立証された。
実施例１のローディング手順を使用した。但し、圧力計をそのフィルター・ハウジング・ユニットの入口及び出口上に挿入した。以下の表Ｉに記載するカートリッジ・フィルターの全てのために使用した粒子は実施例１のEMPHAZE Biosupport Mediaであった。但し、PGAは、粒子のローディング能力を計測するために案出されたこの一連の試験のためには全く結合されなかった。バッファー溶液を水により置換し、そしてその流速は3.8Ｌ／分であった。EMPHAZEの計量部分を水中でスラリーにし、リザーバーに添加し、そして、その有効容量を、入口圧が0.05MPa程出口圧を超えるときに添加された粒子の量を記録することにより決定した。データを表Ｉに示す。

実施例４
本実施例は、以下の点を作り出す；１）PGAカートリッジの効率的な合成用途が立証された；２）固定化PGAの触媒効率が遊離の可溶性PGAと比較された示され、すなわち本不溶化酵素の比活性は高かった；３）フィルター・エレメントの上流表面上にリサイクリング・フロー・システム内の固定化PGA粒子を取り込むことによっては触媒活性における損失が全く存在しなかった；そして４）そのPGAカートリッジの触媒性能は、多くの再使用後に本質的に変更されずに残った。
図６の反応システムを、使用した。ここで、反応リザーバー（52）は５Ｌ丸底フラスコであり、ポンプとチューブ材料は実施例１と同一であり、カートリッジ・フィルター・アセンブリー（65）が実施例１のPGAカートリッジのためのものと同一であり、温度コントローラ（55）はTherm-O-Watch^ＴＭ（Model L7-800SS；Instruments for Research & Industry［Cheltenham, PA］から入手可能なもの）であり、滴定物ポンプをもつpHスタットは（New Brunswick Scientific［Edison, NJ］から入手可能な）モデルpH4000であり、電極（57）はIngold pH Electrode（Model 9100232, Wilmington, MA）であり、そして0.750Ｍ水酸化ナトリウム滴定物は100mLビウレット（59）内に収められていた。
pH7.8における0.01Ｍリン酸２水素カリウム及び0.1Ｍ塩化ナトリウムから成るバッファー／電解質溶液（1320mL）を上記反応リザーバーに添加した。カートリッジ・フィルター・ハウジング及び関連チュービング内に既にある1280mLと共に、この点における系容量は2600mLであった。このポンプは４Ｌ／分において連動され、そしてバッファー溶液は循環され、そして28℃に温められた。ペニシリンＧ（60.0グラム；0.168モル；Sigmaから入手可能なもの）を400mLのバッファー／電解質溶液に溶かし、そして１回で添加した；この全系容量は3000mLであった。pHを、上記ビウレットからの腐食薬の添加によりpHスタットにより7.8に維持した。反応の進行及び現実の速度を時間に伴って添加された腐食薬の量を観察することによりモニターした；時間に対しての、（フェニル酢酸副生成物を中和するために添加された腐食薬のｍモル数に等しい）変換されたペニシリンＧのプロットを図７に示す。この曲線は最初は直線であり、すなわち０次であるが、この反応についてよく知られている生成物阻害の効果は、反応が進行するにつれてその速度を徐々に低下させ、完全な変換が凡そ160分以内に達成された。
PGAの触媒効率が不溶化の間及びカートリッジ・フィルターの上流表面上に取り込まれる時に害される（Impuned）かどうかを理解することは有益である。PGAのこれらの操作の効果を測定するために、実施例１に記載された不溶化PGAを再び調製したが、同一量のペニシリンＧを変換するためにその反応に慣用のバッチ毎のやり方で、そして上記と同一の全系容量内で添加されるスラリーとして使用した。
その間に、線形０次プロットが得られ、そして反応速度が直接的に比較された最初の約25％反応についての、時間につれて変換されたペニシリンＧのｍモルのプロットを図８のＡ線に示す（勾配＝速度＝2.60ｍモル／分）。
EMPHAZE粒子により示されたPGAの活性は6,600ユニットであった。6,600ユニットの可溶性PGAが同一バッファー溶液中のペニシリンＧの28℃溶液に添加されるとき、時間に対して変換されたペニシリンＧの量を図８中にＢ線に示す（速度＝2.68ｍモル／分）。この結果は、固定化が、PGAの触媒性能に対する有害効果を全く作り出さないということを示した。なぜなら、ほとんど競合可能な性能がPGAの遊離と不溶化形態の両方により（実質的に同一勾配により示されるように）観察されたからである。
カートリッジ・フィルター内への取り込みの効果を評価するために、PGAカートリッジの性能を図８中に再プロットし（Ｃ線；速度＝2.68ｍモル／分）、そしてこの結果は、カートリッジ内の取り込みによる性能における損失は全く示さなかった。さらに、PGAカートリッジを使用した反応が19回再運転されたとき、その初期速度は、未だ2.68ｍモル／分であり、これは、優れた再使用可能性及びPGAカートリッジの安定性を示す。この再使用情報は、PGAがどれ程強く結合し、そして共有結合により不溶化酵素が溶脱に対しどれ程抵抗性であるかについての洞察をも提供する。その結合PGAが反応溶液流のきびしさ（rigors）に耐えなければならなかっただけでなく、８−10Ｌの濯ぎバッファー溶液が全て４Ｌ／分の流速においてそれぞれの使用の間に使用された。
実施例５
本実施例は、その反応溶液の束速度が0.01cm／分よりも大きいときPGAカートリッジがより良好に働くことを教示する。
実施例４の材料と手順を使用した。但し、反応溶液の以下の束速度：0.036，0.068，0.124，0.307，0.494、及び0.718cm／分を使用した；最初の３つの束速度は、より小さな蠕動ポンプ、Master flex Model 7520-00（Cole Palmer Instrument Co., Chicago, ILから入手可能である）の使用により供給された。開始反応速度を、各束速度において測定し、そしてその開始反応速度を図９中に束速度に対してプロットした。これらの試験からのデータは、0.01cm／分過剰におけるリサイクリング束速度が好ましく、0.10cm／分過剰における束速度がより好ましく、そして0.30cm／分過剰における束速度が最も好ましかった。
実施例６
本実施例は、酵素が、フィルター・エレメントの上流表面上に既にロードされた好適な粒子状に不溶化されることができるということを教示する。これは、本発明の濾過層の重要な能力である。なぜなら、製造コストがかなり減少されることができるからである。“単離された（isolated）”EMPHAZE粒子は、酵素の結合後の能力を記述するための以下の研究において使用されたけれども“単離された”合成粒子、例えばEMPHAZEを使用することは必要ではない。不溶性ポリマー生成物は、さらにコストを減少させるためにその重合リアクターから直接的にそのポリマー生成物スラリーをポンプ供給することによりフィルター・カートリッジ上にロードされることができる。
実施例１のローディング手順を繰り返した。但し、ロードされたEMPHAZE粒子にはPGAは全く結合されず、そして10.0グラムのその粒子が４Ｌ／分の流速においてロードされた。ローディング後、このカートリッジを２Ｌのシトレート・バッファーにより濯ぎ、そしてPGA（5.75mL；400mgの酵素）を、２Ｌの反応リザーバー内の660mLの新鮮シトレートに添加した。得られた溶液を４Ｌ／分（束速度＝0.48cm／分）において30分間カートリッジを通してポンプ供給した。この点において、そのリザーバー内の溶液を遊離のPGA活性について分析し、そしてその元の負荷活性の１％末端を検出した。次にカートリッジを、10Ｌの0.01Ｍホスフェート/0.1Ｍ塩化ナトリウムにより濯ぎ、そして次に図６及び実施例４の反応システムに触媒フィルター・アセンブリーとしてフィットさせた。2.09ｍモル／分の開始速度を観察し、又はその速度の約80％が実施例４中の固定化前粒子を用いて得られた。
実施例７
本実施例は、実施例２のPLEカートリッジの合成用途及び再使用能力を示す。
図６の反応システムの単純化バージョンを使用した。ここでは、追加のpH補正滴定物が必要とされないように、十分な緩衝能力がその反応溶液中に存在した。また、その反応は外部加熱が全く必要とされないので室温において行われた。プロピレン・グリコール・メチル・エーテル・アセテート（26.4グラム；0.200モル；Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WIから入手可能なもの）、7.02mLのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（内部標準）、及び４Ｌの0.10Ｍ EPPS pH8.0バッファーをその反応リザーバーに添加した。このポンプを3.8Ｌ／分（束速度＝0.45cm／分）において連動し、そしてその反応溶液のアリコートが時間につれて除去され、そしてキャピラリー・ガス・クロマトグラフィーにより反応体及び生成物について評価された。図１０中のデータは、反応体の消失（勾配＝−2.9）と生成物の出現（勾配＝＋2.7）の間の重要な１対１対応を示す；これは、所望の加水分解反応だけが生じていたことを示している。PLEカートリッジを用いたその後の運転において、EPPSバッファーがより安価な0.10Ｍホスフェート・バッファーにより置き換えられ、そして10ラン後、そのPLEカートリッジの活性における損失は全く観察されなかった。
実施例８
本実施例は、高い束速度がPLEカートリッジによる交換に対しても有益な効果をもつことを立証する。
実施例７の反応システムと方法を以下の束速度：0.021，0.043，0.064，0.170、及び0.631cm／分をもって使用した。図11中の開始反応速度対束速度のプロットは、増加された束速度が、実施例のPGAカートリッジによるように、変換に対して有益な効果をもち、好ましい束速度が少なくとも0.10cm／分であり、そしてより好ましくは少なくとも0.30cm／分であることを示している。
実施例９
本実施例は、PLEカートリッジの大規模合成利用について立証する。Ｒ−メチル３−メチルグルタレート含有可溶性PLEを得るための従来の努力を、５グラム（３日間；J. B. Jones, et al., J. Chem. Soc. chem. Commun., 1984, 579）及び15グラム（一夜、C. Tamm, et al., Helv. Chim. Acta., 1983, 66, 744）の出発ジメチル３−メチルグルタレート（DMMG)に対して行った。これに反し、本実施例中のPLEカートリッジは、96.2グラムのDMMGを使用して３時間未満において、99％を上廻る光学的吸率及び91.5％の単離化学的収率においてそのＲ−異性体加水分解生成物を提供する。
ジメチル３−メチルグルタレートの鏡像選択的加水分解
図６の、そして実施例１におけるように調製した反応システムを使用した。但し、実施例２のPLEカートリッジを触媒フィルター・アセンブリーとして使用した。反応を、DMMG（25.0グラム；0.143モル；Aldrich）をpH7.8におけるホスフェート／クロライド溶液に添加することにより行った。この加水分解反応の進行を、一定pHを維持するために添加される1.00Ｎ水酸化ナトリウム滴定物の量を観察することによりモニターした；比較運転を、DMMGの自動−又は化学的加水分解がpH7.8において全く生じないことを示すためにその反応全体の時間枠にわたって行った。45分以内に、計算量の腐食薬が添加され、そしてさらに25.0グラムのDMMGが添加された；この加水分解反応が、反応溶液温度が24℃に上昇したとき僅かに発熱性であったことも記載された。３番目のDMMGが添加され、そして変換された後、第４部が、96.2グラム（0.552モル）の合計DMMG添加のために、添加された。この時までに、その反応溶液の温度は26℃であり、そして最後の数ミリリッターの腐食薬は、添加されるべきより長い時間期間を必要として、これは、そのDMMG添加の開始からの生成物の蓄積のために最後に現われるおそらく生成物阻害の指標であった。全反応時間は144分間であった。この溶液は、大きな別個の漏斗にポンプ供給され、そしてその触媒フィルター・アセンブリーを1700mLのバッファー溶液で洗浄し、そしてこれをまたその水性生成物溶液に添加した。この溶液をエーテル（１Ｌ）で洗浄し、そして46mLの濃塩酸の添加によりpH2.37に酸性とした。これを次にエーテルで抽出し（２×1500mL）、そしてエーテルで一夜連続的に抽出した。乾燥（硫酸マグネシウム）後、エーテルを減圧において留去して80.8グラムの無色の液体を得た（91.5％収率）。メチル３−メチルグルタレートとしてのこの液体の同定を、スペクトル分析により確認し、そして光学的純度を、キラル溶媒を使用してNMR技術を使用することにより99％を超えるものとして測定された。
実施例10
本実施例は、複雑な放射状プリーツ・フィルター・カートリッジの上流表面上に不溶化酵素粒子としての全細胞の合成用途について示す。
パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）を地方の食品雑貨店から得て、そして３Ｌ Erlenmyerフラスコ内の２ＬのPotato Dextrose Broth（Difco, Detroit, MI）中で培養した。接種後、これらの細胞を、環境振とう機内で通気し、そして撹乱しながら28℃において48時間インキュベートした。この培養中の細胞の最終濃度は１mL当り約25億個の細胞であった。これらの細胞を１時間3000rpmにおいてSorvall RC5C Centrifuge（Dupont Aralytical Instruments, Wilmington, De）内での遠心分離により収穫し、そしてリン酸塩バッファー生理食塩水で２回洗浄し、そして遠心分離により洗浄の間に集めた。これらの細胞を、遠心分離によりそのバッファーから収穫し、その細胞ペレットを0.1Ｍリン酸塩バッファーpH7.0中に再懸濁した。実施例７の反応システムを使用し、パッキング手順と反応手順の両方を0.06cm／分の束速度をもって行った。この反応リザーバー内のバッファーは、0.86wt％の開始濃度をもつグルコースをも含有する0.1Ｍリン酸塩バッファーであった。エタノールの生産をガス・クロマトグラフィーによりモニターし、そして52時間後、エタノール変換は24.2％であった。
本発のさまざまな修正及び変更は本発明の範囲から逸脱せずに当業者に明らかになるであろう。

Claims (5)

1. フィルター・カートリッジ内に取り込まれた、その上流表面上に不溶性酵素粒子が配置されているところの濾過層を含む複合濾過材を含むフィルター・エレメントであって、当該濾過層の小孔サイズは、当該不溶性酵素粒子の最小の粒子サイズに対応し、かつ、当該不溶性酵素粒子のサイズは、直径１〜２００マイクロメーターの範囲内にある、前記フィルター・エレメント。
2. 前記濾過材が１又は多数の繊維状の層を含む濾過層を含み、前記フィルター・エレメントが、放射状のプリーツのフィルター・エレメントである、請求項１に記載のフィルター・エレメント。
3. 前記１又は多数の繊維状の層が、ポリアミド、ポリオレフィン、ガラス、セルロース性材料、ポリエステル、及びセラミックスから成る群から選ばれ、前記酵素粒子が、その上に酵素が結合され、接着され、又は捕獲されているサポートを含み、そして
   上記サポートが、アズラクトン官能性サポート、オキシラン官能性サポート、及びイソシアネート官能性サポートから成る群から選ばれる、請求項２に記載のフィルター・エレメント。
4. 化学的変換方法であって以下のステップ：
   ａ）請求項１〜３の中のいずれか１項に記載のフィルター・エレメントを用意し、そして
   ｂ）化学的変換を行うために十分な時間にわたり前記フィルター・エレメントの濾過材の上流表面に、移動する反応溶液を、衝突せしめ、そのフィルター・エレメントが触媒として前記不溶性酵素粒子を含み、そして少なくとも0.01cm／分の束速度（flux rate）において上記移動する反応溶液を上記濾過材に通過せしめる、
   を含む前記方法。
5. 以下のステップ：
   ａ）濾過層を用意し、そして不溶性細孔性粒子及び酵素含有溶液を含む混合物を用意し、上記粒子と上記酵素は、互いに補う反応性又は引き合う官能性を有し、
   ｂ）上記酵素が上記粒子に化学的にか又は物理的にかの少なくとも１で結合するようになるために十分な時間にわたり上記酵素含有溶液を上記粒子と相互作用せしめ、そして
   ｃ）上記濾過層の上流表面上に上記粒子を湿−パッキングして、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフィルター・エレメントを提供する、
   を含むフィルター・エレメントの製造方法であって、ここで、上記フィルター・エレメントが、フィルター・カートリッジ・アセンブリー内に取り込まれる、前記方法。

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