JP3704982B2

JP3704982B2 - Nucleic acid amplification blood collection tube

Info

Publication number: JP3704982B2
Application number: JP35864298A
Authority: JP
Inventors: 賢鈴木; 芳治岩瀬; 賢樹日野
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: JP2000176006A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血液分離剤入り核酸増幅用採血管に関し、より詳しくは、採血管に正確かつ容易に抗凝固剤を充填することができ、採取された血液への抗凝固剤の溶解性の改良された、核酸増幅に適した血液分離剤入り採血管に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血液生化学検査に際して、採取された全血の核酸を増幅し、その増幅産物から標的核酸を検出して、例えばエイズや肝炎、結核、コレラなどの病気の診断や、遺伝子病などの診断が行われるようになった。全血から分離された血漿中には微量のＤＮＡが含まれているが、この血漿中ＤＮＡを利用する場合、抗凝固剤の溶解性が悪いと微小クロットが発生することがあるため、採血管には正確な量の抗凝固剤を溶解し易い状態で充填する必要がある。
【０００３】
そこで、血液試料への抗凝固剤の溶解性が改良され、採血した血液試料中にクロットが発生することのない採血管として、水を溶剤として噴霧塗布法によりＥＤＴＡ−３Ｋを内表面に塗布した後、溶剤を除去したものが提案されている（特許第２６９０２６１号公報）。
しかしながら、このものは、抗凝固剤の溶解性が改良されたとはいうものの、塗布層の厚みにバラツキが生じるため、必ずしも万全のものではなく、また、塗布量の正確性に関しても充分なものではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたもので、抗凝固剤の溶解性が充分に改良され、正確な量の抗凝固剤を塗布することのできる血液分離剤入り血液凝固管を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑みて鋭意検討の結果、管体に円筒状スリーブを収容し、このスリーブの内壁に抗凝固剤を塗布するようにすることにより、容易かつ経済的に正確な量の抗凝固剤を均一に塗布することができることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、有底の管体と、該管体の口部を閉鎖するゴム栓と、管体の内部に収容された血液分離剤、および、該血液分離剤に近接して収容された円筒状スリーブを含んでなり、該スリーブは、先端と基端を有し、先端で血液分離剤と近接しており、先端側の肉厚が、内径が先端方向にテーパ状に拡径されることにより、薄肉に形成されるとともに、内壁にしぼが形成されて抗凝固剤が塗布されており、前記管体に血液が充填され遠心分離された時に血液分離剤がスリーブの内壁に沿って移動可能である、核酸増幅用採血管である。
ここで、遠心分離時の血液分離剤のスムーズな移動のために、スリーブ先端の肉厚は０．８ｍｍ以下であるのが好ましい。また、スリーブ内壁のしぼの深さは７０μｍ以下が好ましい。スリーブは遠心分離時に底部に位置するように赤血球より重い比重の合成樹脂で形成されるのが好ましい。また、抗凝固剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のアルカリ金属塩、ヘパリンのアルカリ金属塩、クエン酸ナトリウムの群から選ばれる１つであるのが好ましく、特にＥＤＴＡのアルカリ金属塩が好ましい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施例について図面に基づいて説明する。
図１は本発明の一実施例を示す説明図であり、図２は図１に示すスリーブの縦断面図である。
本発明の核酸増幅用採血管は、図１に示すように、有底の管体１と、この管体１の口部を閉鎖するゴム栓２と、管体１の内部に収容された血液分離剤４、および、この血液分離剤４に近接して収容された円筒状スリーブ３を含んでなる。スリーブ３は先端３１と基端３２を有し、先端３１が血液分離剤４に近接している。スリーブ３は、先端側の内径が先端方向にテーパ状に拡径されることにより、その肉厚が薄肉に形成されており、しぼ３３の形成されたスリーブ３の内壁（図１の斜線部分に対応する内壁部分）には抗凝固剤が塗布されている。そして、管体１に血液が充填され遠心分離された時に、血液分離剤４がスリーブ３の内壁に沿って移動可能になっている。
【０００７】
スリーブ３は赤血球より重い比重の合成樹脂の、例えばＡＢＳ樹脂やポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート等で円筒状に形成されており、基端３２の肉厚は通常１．０〜１．５ｍｍであり、その外径は管体１の内径よりやや小さく、図２に示すように、管体１への挿着を容易にするために先端３１側が若干細くなっている。スリーブ３の内壁には塗布された血液分離剤４の剥離を防ぐためにしぼ３３が形成されており、そのしぼ３３の形成された内壁には抗凝固剤が塗布されている。抗凝固剤としては、例えばＥＤＴＡのアルカリ金属塩、ヘパリンのアルカリ金属塩、クエン酸ナトリウム等が採用されるが、血液への溶解性が良いことからＥＤＴＡのアルカリ金属塩、例えばＥＤＴＡ−２Ｋ、ＥＤＴＡ−３Ｋ、ＥＤＴＡ−２Ｎａが好ましい。抗凝固剤の塗布に際しては、抗凝固剤がスリーブ３に付着し難いので、ゼラチンをバインダーとして使用する必要がある。内壁表面のしぼ３３の深さは７０μｍ以下が好ましく、特に１０〜７０μｍが好ましい。しぼが無いと抗凝固剤の付着が悪く、しぼの深さが７０μｍを超えると抗凝固剤の溶解が悪くなる。スリーブ３は血液分離剤４の移動性を良くするために、先端３１側の部分は内径が先端方向にテーパ状に拡径されており、その肉厚が薄肉になっている。先端３１の肉厚は０．８ｍｍ以下が好ましい。
【０００８】
スリーブ３は、これを血液分離剤４に接触させると気泡が発生するので、その先端３１が血液分離剤４から少し離れた位置にくるように血液分離剤４に近接して配置される。管体１に収容される血液分離剤４としては、限定されるものではないが、チキソトロピー性を有する、例えばシリコーンやα−オレフィン−マレイン酸エステル、ポリエステル系重合体、アクリル系重合体、塩素化ポリプデン、シクロペンタジエン樹脂、シクロペンタジエン樹脂に水酸基、エステル基、エーテル基、エポシキ基等を導入した変性シクロペンタジエン樹脂を主成分とするもの等を採用することができる。管体１に血液が充填されると、血液分離剤４はスリーブ３の内壁に沿って移動して血液を上層の血漿と下層の赤血球とに分離する。尚、この時、スリーブ３内壁のしぼ３３をスリーブ３の長手方向に縦溝状に形成すると血液分離剤４の移動が若干スムーズになることが確認されている。
【０００９】
〔実験例１〕
表１に示す核酸増幅用採血管をそれぞれ６本用意し、それぞれに健常者６名から真空採血された全血５ｍｌを充填して、所要時間５〜６秒の間隔で核酸増幅用採血管を５回転倒して血液と抗凝固剤を混和した後、１３００Ｇ×５分の遠心を行い、遠心分離後の血液の状態（分離剤の反転性、分離剤の隔壁強度、部材に対する分離剤の付着、フィブリンの析出）を目視で確認したところ、表２に示すような結果が得られた。尚、スリーブの内壁に塗布される抗凝固剤としてはＥＤＴＡ−２Ｋ（和光純薬工業（株）製）を用い、塗布量は８．０ｍｇ／管（血液１ｍｌ当り１．６ｍｇ）であった。
表から本発明のスリーブを挿入した核酸増幅用採血管が、良好な血液状態に維持されていることがわかる。また、スリーブ内壁のしぼ３３の好ましい深さは１０〜７０μｍの範囲であることがわかる。
【００１０】
【表１】

【００１１】
【表２】

【００１２】
〔実験例２〕
表１の実施例１〜５に示す核酸増幅用採血管をそれぞれ３本用意し、それぞれに健常者３名から真空採血された全血５ｍｌを充填し、これに予め用意しておいたＤＮＡ片を添加し、所要時間５〜６秒の間隔で核酸増幅用採血管を５回転倒して血液と抗凝固剤を混和した後、１３００Ｇ×５分の遠心を行い、遠心分離後の血液から血漿のみを採取して、ＡｍｐＤｉｒｅｃｔ（商品名；（株）島津製作所製）を使用してＰＣＲでＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動後、エチジウム・ブロマイドで染色し、その結果をデンシトグラフで確認したところ、全てのサンプルについて２０９ｂｐの目的のバンドを確認することができた。
【００１３】
【発明の効果】
以上説明してきたことから明らかなように、本発明の核酸増幅用採血管を採用することにより、血液試験に際して、抗凝固剤の溶解性が充分に改良され、正確な量の抗凝固剤を塗布することのできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例を示す説明図である。
【図２】図１に示すスリーブの縦断面図である。
【符号の説明】
１管体
２ゴム栓
３スリーブ
３１先端
３２基端
３３しぼ
４血液分離剤[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a blood collection tube for amplifying a nucleic acid containing a blood separating agent. More specifically, the blood collection tube can be accurately and easily filled with an anticoagulant, and the solubility of the anticoagulant in the collected blood is improved. The present invention also relates to a blood collection tube containing a blood separation agent suitable for nucleic acid amplification.
[0002]
[Prior art]
In recent years, during blood biochemical tests, the collected whole blood nucleic acid is amplified, and the target nucleic acid is detected from the amplified product to diagnose diseases such as AIDS, hepatitis, tuberculosis, and cholera, and diagnose genetic diseases. Came to be done. The plasma isolated from whole blood contains trace amounts of DNA, but when this plasma DNA is used, microclots may be generated if the anticoagulant is poorly soluble. However, it is necessary to fill an accurate amount of the anticoagulant in a state in which it is easily dissolved.
[0003]
Therefore, the solubility of the anticoagulant in the blood sample was improved, and EDTA-3K was applied to the inner surface by a spray coating method using water as a solvent as a blood collection tube in which clots do not occur in the collected blood sample. After that, the solvent is removed (Japanese Patent No. 2690261).
However, although this has improved the solubility of the anticoagulant, the thickness of the coating layer varies, so it is not always perfect, and the accuracy of the coating amount is not sufficient. Absent.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a blood coagulation tube containing a blood separating agent in which the solubility of the anticoagulant is sufficiently improved and an accurate amount of the anticoagulant can be applied. With the goal.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above-mentioned problems, the present inventor can easily and economically accurately store a cylindrical sleeve in a tubular body and apply an anticoagulant to the inner wall of the sleeve. It has been found that an amount of anticoagulant can be applied uniformly and has reached the present invention. That is, the present invention includes a bottomed tube, a rubber stopper that closes the mouth of the tube, a blood separating agent housed in the tube, and a container close to the blood separating agent. The sleeve has a distal end and a proximal end, is close to the blood separating agent at the distal end, and has a wall thickness on the distal end side that is increased in taper in the distal direction. As a result, the anti-coagulant is applied to the inner wall with the anti-coagulant applied to the inner wall, and when the tube is filled with blood and centrifuged, the blood separating agent moves along the inner wall of the sleeve. It is a movable blood collection tube for nucleic acid amplification.
Here, in order to smoothly move the blood separating agent during centrifugation, the thickness of the sleeve tip is preferably 0.8 mm or less. Further, the depth of the inner wall of the sleeve is preferably 70 μm or less. The sleeve is preferably formed of a synthetic resin having a specific gravity heavier than that of red blood cells so as to be located at the bottom during centrifugation. The anticoagulant is preferably one selected from the group consisting of an alkali metal salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), an alkali metal salt of heparin, and sodium citrate, and particularly preferably an alkali metal salt of EDTA.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 1 is an explanatory view showing an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a longitudinal sectional view of the sleeve shown in FIG.
As shown in FIG. 1, the blood collection tube for nucleic acid amplification of the present invention includes a bottomed tube 1, a rubber plug 2 that closes the mouth of the tube 1, and blood contained in the tube 1. It comprises a separating agent 4 and a cylindrical sleeve 3 accommodated in close proximity to the blood separating agent 4. The sleeve 3 has a distal end 31 and a proximal end 32, and the distal end 31 is close to the blood separating agent 4. The sleeve 3 has an inner diameter on the distal end side that is increased in a taper shape in the distal direction, so that the thickness of the sleeve 3 is reduced. The inner wall of the sleeve 3 in which the wrinkles 33 are formed (in the hatched portion in FIG. The corresponding inner wall portion) is coated with an anticoagulant. When the tube 1 is filled with blood and centrifuged, the blood separating agent 4 is movable along the inner wall of the sleeve 3.
[0007]
The sleeve 3 is formed of a synthetic resin having a specific gravity heavier than that of red blood cells, for example, ABS resin, polystyrene, polyester, polyamide, polycarbonate, etc., and the thickness of the base end 32 is usually 1.0 to 1.5 mm. The outer diameter is slightly smaller than the inner diameter of the tube body 1, and the tip 31 side is slightly narrowed to facilitate insertion into the tube body 1, as shown in FIG. A warp 33 is formed on the inner wall of the sleeve 3 to prevent the applied blood separating agent 4 from peeling off, and an anticoagulant is applied to the inner wall on which the warp 33 is formed. As the anticoagulant, for example, an alkali metal salt of EDTA, an alkali metal salt of heparin, sodium citrate, etc. are adopted, but because of its good solubility in blood, EDTA alkali metal salts such as EDTA-2K, EDTA, etc. -3K, EDTA-2Na are preferred. When the anticoagulant is applied, it is difficult for the anticoagulant to adhere to the sleeve 3, so it is necessary to use gelatin as a binder. The depth of the grain 33 on the inner wall surface is preferably 70 μm or less, particularly preferably 10 to 70 μm. If there is no wrinkle, adhesion of the anticoagulant is bad, and if the depth of the wrinkle exceeds 70 μm, the dissolution of the anticoagulant becomes bad. In order for the sleeve 3 to improve the mobility of the blood separating agent 4, the inner diameter of the portion on the tip 31 side is increased in a tapered shape in the tip direction, and the thickness thereof is thin. The thickness of the tip 31 is preferably 0.8 mm or less.
[0008]
When the sleeve 3 is brought into contact with the blood separating agent 4, air bubbles are generated. Therefore, the sleeve 3 is arranged close to the blood separating agent 4 so that the tip 31 thereof is slightly away from the blood separating agent 4. The blood separating agent 4 accommodated in the tube 1 is not limited, but has thixotropic properties, for example, silicone, α-olefin-maleic acid ester, polyester polymer, acrylic polymer, chlorination. A polypentene, cyclopentadiene resin, a resin having a modified cyclopentadiene resin in which a hydroxyl group, an ester group, an ether group, an epoxy group, or the like is introduced as a main component can be used. When the tube 1 is filled with blood, the blood separating agent 4 moves along the inner wall of the sleeve 3 to separate the blood into upper plasma and lower red blood cells. At this time, it has been confirmed that the movement of the blood separating agent 4 becomes slightly smooth when the dent 33 on the inner wall of the sleeve 3 is formed in a longitudinal groove shape in the longitudinal direction of the sleeve 3.
[0009]
[Experimental Example 1]
Prepare six blood collection tubes for nucleic acid amplification shown in Table 1, each filled with 5 ml of whole blood vacuum-collected from 6 healthy subjects, and install the blood collection tubes for nucleic acid amplification at intervals of 5 to 6 seconds. After 5 turns, mix blood and anticoagulant, centrifuge at 1300G x 5 minutes, and blood state after centrifugation (reversibility of separating agent, partition wall strength of separating agent, adhesion of separating agent to member, When fibrin precipitation was visually confirmed, the results shown in Table 2 were obtained. As an anticoagulant applied to the inner wall of the sleeve, EDTA-2K (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and the coating amount was 8.0 mg / tube (1.6 mg per 1 ml of blood).
It can be seen from the table that the blood collection tube for nucleic acid amplification into which the sleeve of the present invention is inserted is maintained in a good blood state. It can also be seen that the preferred depth of the inner wall 33 of the sleeve is in the range of 10 to 70 μm.
[0010]
[Table 1]

[0011]
[Table 2]

[0012]
[Experimental example 2]
Three nucleic acid amplification blood collection tubes shown in Examples 1 to 5 in Table 1 were prepared, and each was filled with 5 ml of whole blood vacuum-collected from three healthy subjects, and a DNA piece prepared beforehand. After mixing the blood and anticoagulant with 5 rotations of the blood collection tube for nucleic acid amplification at intervals of 5 to 6 seconds, mix the blood and anticoagulant, centrifuge at 1300G x 5 minutes, and only the plasma from the centrifuged blood The DNA was amplified by PCR using Amp Direct (trade name; manufactured by Shimadzu Corporation). PCR products were electrophoresed on polyacrylamide gel, stained with ethidium bromide, and the results were confirmed by densitograph. As a result, a target band of 209 bp could be confirmed for all samples.
[0013]
【The invention's effect】
As can be seen from the above explanation, by adopting the blood collection tube for nucleic acid amplification of the present invention, the solubility of the anticoagulant is sufficiently improved in the blood test, and an accurate amount of the anticoagulant is applied. Can do.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram showing an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a longitudinal sectional view of a sleeve shown in FIG.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Tubing body 2 Rubber stopper 3 Sleeve 31 Tip 32 Base end 33 Wrinkle 4 Blood separating agent

Claims

A bottomed tube, a rubber stopper for closing the mouth of the tube, a blood separating agent housed in the tube, and a cylindrical sleeve housed in close proximity to the blood separating agent The sleeve has a distal end and a proximal end and is close to the blood separating agent at the distal end, and the wall thickness on the distal end side is reduced by increasing the inner diameter in a tapered shape toward the distal end. A nucleic acid having an inner wall formed with a wrinkle and coated with an anticoagulant, and the blood separating agent is movable along the inner wall of the sleeve when the tube is filled with blood and centrifuged. Amplification blood collection tube.

The blood collection tube for nucleic acid amplification according to claim 1, wherein the thickness of the tip of the sleeve is 0.8 mm or less.

The nucleic acid amplification blood collection tube according to claim 1 or 2, wherein the depth of the inner wall of the sleeve is 70 µm or less.

The blood collection tube for nucleic acid amplification according to any one of claims 1 to 3, wherein the sleeve is formed of a synthetic resin having a specific gravity heavier than that of red blood cells.

The blood collecting tube for nucleic acid amplification according to any one of claims 1 to 4, wherein the anticoagulant is one selected from the group consisting of an alkali metal salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), an alkali metal salt of heparin, and sodium citrate.

The blood collection tube for nucleic acid amplification according to claim 5, wherein the anticoagulant is an alkali metal salt of EDTA.