JP3695178B2

JP3695178B2 - Antigen / antibody measurement method

Info

Publication number: JP3695178B2
Application number: JP31274098A
Authority: JP
Inventors: 康夫井福; 孝明宗林; 道雄伊藤
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-11-04
Filing date: 1998-11-04
Publication date: 2005-09-14
Anticipated expiration: 2018-11-04
Also published as: JP2000146975A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不溶性磁性粒子及び不溶性標識粒子を用いた抗原抗体反応において、広範囲における抗原又は抗体の濃度を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が種々の疾病の早期検出法や、極微量の物質の検出法として知られている。高感度な免疫測定法には種々の方法があり、抗体または抗原に標識物質として、放射性同位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などを結合して用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）などに分類される。
【０００３】
しかし、かかる従来技術は種々の問題を持つ。例えば、ＲＩＡはＲＩの取扱い及び廃棄に対する制約がある。ＥＩＡなどは取扱いの安全性については有利であるが、測定感度はＲＩＡに若干劣る。
また、最近磁性粒子および蛍光標識粒子を用いて下記に示す工程により、通常のＦＩＡよりも測定感度を上昇させた免疫分析方法が開発されている（特開昭６１−１２８１６８号公報）。
【０００４】
（ａ）測定しようとする抗原または抗体、該抗原または該抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性磁性粒子を含む第１試薬、及び、該抗原または該抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性蛍光標識粒子を含む第２試薬を液体媒体中で反応させる工程。
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物に磁場を付与することにより未反応の不溶性磁性粒子及び不溶性磁性粒子を含む凝集粒子を反応混合物から分離し、次いで該液体媒体及び未反応の不溶性蛍光標識粒子を除去する工程。
（ｃ）残った該不溶性磁性粒子と反応した不溶性蛍光標識粒子の蛍光強度を測定し、予め既知濃度の抗原又は抗体を測定して得た蛍光強度の検量線を用いて抗原または抗体を定量的に測定する工程。
【０００５】
しかしながら、この方法では、測定しようとする抗原または抗体と磁性粒子を含む第１試薬及び蛍光標識粒子を含む第２試薬とを共に反応容器の液体媒体中で反応させた後、磁場の作用により磁性粒子と反応した蛍光標識粒子の蛍光強度を測定する方法いわゆるエンドポイント法を採用しているため、抗原または抗体がある濃度を越えると抗原または抗体による抗原抗体架橋効果がなくなり、磁性粒子と反応する蛍光標識粒子の数が減り、その結果蛍光強度が低下する（これをプロゾ−ン現象と呼ぶ）。プロゾーン現象が起きると、１つの蛍光強度の数値に対し、２つの濃度値が存在することになり、蛍光強度からは濃度を特定することができなくなる。このため、測定感度においては優れているが、広い濃度範囲を測定することができなかった。
一方、プロゾーン判定法としては、従来いくつかの方法が知られているが、これらは吸光度により抗原又は抗体を測定する方法において用いられており、蛍光強度により抗原又は抗体を測定する方法においては、このような判定法は適用されていなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは磁性粒子及び蛍光標識粒子を用いるＦＩＡにおいて蛍光強度を測定するとともに、この工程において生じる各粒子間の凝集反応に伴う透過光（吸光度）または散乱光変化を測定することにより上記問題点を解決した。
即ち、本発明の要旨は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程により液体媒体中の抗原または抗体を定量的に測定する方法において、工程（ａ）における反応に伴う透過光もしくは散乱光の強度を測定することを特徴とする抗原又は抗体の測定方法に存する。
【０００７】
（ａ）測定しようとする抗原または抗体、該抗原または該抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性磁性粒子を含む第１試薬、及び、該抗原または該抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性標識粒子を含む第２試薬を液体媒体中で反応させる工程。
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物に磁場を付与することにより未反応の不溶性磁性粒子及び不溶性磁性粒子を含む凝集粒子を反応混合物から分離し、次いで該液体媒体及び未反応の不溶性標識粒子を除去する工程。
（ｃ）残った該不溶性磁性粒子と反応した不溶性標識粒子の量を定量することにより抗原または抗体を定量的に測定する工程。
【０００８】
また、本発明は、前記工程（ａ）における透過光もしくは散乱光の強度の測定値からプロゾーン判定を行うことを特徴とする抗原又は抗体の測定方法に存する。更に別の態様によれば、本発明は、プロゾーン判定を行って、プロゾーン領域以外の領域であると判定された場合に、予め既知濃度の抗原又は抗体を測定して得た透過光もしくは散乱光の強度の検量線と、不溶性標識粒子の量に基づく検量線とを用いて抗原または抗体の濃度を定量し、濃度が低く工程（ｃ）における測定結果の変化量が大きい領域では工程（ｃ）の測定値を、濃度が高く工程（ｃ）における測定結果の変化量が小さい領域では工程（ａ）の測定値を採用することを特徴とする抗原又は抗体の測定方法に存する。
さらに、前記工程（ａ）において、測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は抗原を担持させた不溶性非磁性非標識粒子を含む第３試薬を使用することを特徴とする抗原又は抗体の測定方法に存する。また、該不溶性標識粒子に担持させる抗体と、該不溶性非磁性非標識粒子に担持させる抗体として力価の異なる抗体を使用することを特徴とする測定方法に存する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の最大の特徴は、不溶性標識粒子を使用し、それを定量することにより抗原又は抗体を測定する方法において、不溶性標識粒子の定量と共に透過光又は散乱光の強度を測定することにある。
【００１０】
本発明では、予め既知濃度の抗原又は抗体を測定して得た透過光強度又は散乱光強度を測定して得た検量線から、透過光強度又は散乱光強度がある一定値を越えた場合にプロゾーン現象が起きていると判定することにより、前記工程（ｃ）において得られた抗原又は抗体の定量値が信頼できるものであるかどうかの指標として使用することができる。
【００１１】
尚、本発明において、プロゾーン判定する方法としては、蛍光強度と比較する点を除き、従来の抗原抗体反応に伴うプロゾーン判定を適用することができる。例えば、抗原抗体反応を経時的に追跡し、反応進行のパタ−ンからプロゾ−ン領域かどうかを判定する方法（特公昭６１−１０７７５号公報）や、二つの波長での透過光の比をとることにより、粒子径の大きさを判定し、プロゾ−ン領域かどうかを判定する方法（特開昭６３−１９５６０号公報）の他、
（１）抗体試薬又は試料を再添加する方法。
（２）複数の測定値から濁度（吸光度）の比や差又は濃度の比や差をとる方法。
（３）複数個の測定値から反応速度の比や差をとる方法。
（４）複数個の測定値から最大反応速度、最大反応速度に達するまでの反応時間及び抗原濃度の三次元検量線を用いる方法。
（５）２波長測定を行い、その吸光度の比や差より判定する方法。
等の方法を使用することができ、これらの方法は例えば日本臨床検査自動化学会会誌第１５巻第６号第６７５〜６８７ペ−ジ（１９９０年）、同誌第１４巻第３号第１７１〜１７６ペ−ジ（１９８９年）等に記載されている。
【００１２】
一方、本発明では、透過光強度又は散乱光強度の測定値を抗原濃度または抗体濃度の定量にも用いることができる。
工程（ｃ）の測定結果のみではプロゾーン現象のために広い濃度範囲を測定することができないが、これと共に凝集反応に伴う透過光又は散乱光の強度変化を測定し、測定しようとする抗原又は抗体の濃度が低く感度を必要とする測定範囲では工程（ｃ）の測定結果から濃度を算出し、濃度が高い測定範囲では凝集反応に伴う透過光又は散乱光の強度変化の測定結果から濃度を算出することにより広い濃度範囲を正確に測定することが可能となる。
【００１３】
抗原または抗体を定量する場合には、予め抗原もしくは抗体の濃度既知品又は抗原もしくは抗体の濃度基準品を試料として測定を行うことにより検量線を作成するが、本発明においては、通常、工程（ａ）から得られる透過光又は散乱光の強度の検量線、及び、工程（ｃ）から得られる検量線という複数の検量線を使用する。このために、例えば、不溶性標識粒子として、不溶性蛍光標識粒子を用いる場合には、後述する図１又は図２に示したような透過光検出機構及び蛍光検出機構を併せ持つ装置を用いることにより、蛍光強度と透過光又は散乱光の強度とを同時に測定することが好ましい。測定機構の詳細については、後述する。
【００１４】
本発明で使用する不溶性磁性粒子は、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子またはこれらの磁性微粒子を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、または上記モノマー２−４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームまたは、上記磁性微粒子をラテックス、ゼラチン、リポソームなどの表面に固定化した粒子などが用いられる。
【００１５】
不溶性磁性粒子の粒径は通常０．０５μｍ〜５μｍのものが用いられ、０．１μｍ〜１μｍの範囲の粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。
不溶性磁性粒子に抗体または抗原を担時させる方法としては、測定しようとする抗原又は抗体あるいは被検体中の抗原又は抗体に対する抗体又は抗原を物理的に吸着させるか、あるいは化学的に担時させることにより行われる。
物理的に吸着させる方法としては、不溶性磁性粒子に、抗体又は抗原を直接固定化する方法が挙げられる。
【００１６】
化学的に担時させる方法としては、磁性粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することにより抗体または抗原分子と結合させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒子と抗体または抗原分子の間にスペ−サ−分子を化学結合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に抗体または抗原を化学結合させた後、そのタンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。
【００１７】
その他、固定化したい抗体または抗原と特異的に結合する物質（たとえば抗体、プロテインＡなど）を粒子表面に物理的または化学的に結合させた後、目的の抗体または抗原を結合させることにより粒子表面に固定化する方法も挙げられる。
不溶性磁性粒子に担時させる抗体としては通常ＩｇＧが用いられるが、ペプシン、パパインなどの消化酵素あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの低分子化したものを用いても良い。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭあるいはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメントを用いても良い。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも適用できる。モノクローナル抗体を用いる時は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のように繰り返し構造をもつタンパク質や、ＣＡ１９−９抗原のように分子内にエピトープを複数持つ抗原に対してはモノクローナル抗体は１種類以上で使用できる。また、認識エピトープの異なるものを２種類以上組み合わせても使用できる。
【００１８】
一方、抗原としては、たとえばタンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、遺伝子工学的に産生された組換えタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、薬物など種々のものが挙げられる。即ち、本発明で言う「抗原」とは、人、あるいは動物に対し抗体産生を促す能力のあるすべての物質のうち、例えば診断等特別の目的下に選択された単一あるいは複数の物質、ないしはそれらを含有する混合物を指す。
【００１９】
一般的に担持される抗体または抗原の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量等により異なるが、通常担体粒子１ｇあたり１ｍｇ−５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ−１００ｍｇである。
本発明の不溶性標識粒子に使用される標識としては種々のものがある。酵素標識では、たとえばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、βーガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が良く利用される。また、蛍光標識に用いる蛍光色素としては、たとえば、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）などの希土類キレートや、フィコシアニン、フィコエリスリンなどのフィコビリプロテイン、フルオレッセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４−メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリンなどが知られている。また、化学発光性色素では、たとえば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール、あるいはこれらの誘導体などがある。本発明の不溶性標識粒子としては、これらの標識の中でも、蛍光色素を用いた不溶性蛍光標識粒子を使用することが特に好ましい。
【００２０】
標識を行う不溶性担体粒子および標識を行わない不溶性担体粒子としては、反応させる時に用いる液体媒体に実質的に不溶性で、０．０５〜５μｍ、好ましくは、０．１〜１．０μｍの平均粒径を有するものが用いられる。
担体粒子の材質は上記不溶性磁性粒子で述べたものと同様に、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプライド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２, ３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２, ３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、または上記のモノマー２〜４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームに加えて、赤血球のような生体成分、金コロイドのような金属コロイド粒子等が用いられる。
【００２１】
不溶性担体粒子に例えば蛍光色素を担持させる場合、その方法としては、粒子表面の官能基を利用して、蛍光色素を化学的に結合させる方法、粒子を重合して合成する際に、色素を加えて粒子内部に封じ込める方法、粒子表面に物理的に標識材を吸着させる方法、あらかじめ、タンパク質、ペプチドなどと物理的、化学的に標識材を結合させておいてからそのタンパク質、ペプチドを粒子に固定化する方法などがある。
【００２２】
例えば、特開昭５４−１０１４３９号公報には希土類キレートをＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オクチルホスフィノキシド）との共同抽出法を利用して有機高分子のラテックスの内部に閉じ込める方法が述べられている。これに従って作製した標識粒子は、標識強度、安定性共に良好であった。
不溶性担体粒子には、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも可）または抗原が前述のとおり物理的または化学的に固定化される。さらに、測定しようとする物質が抗体の場合、抗体の免疫グロブリンクラスと特異的に反応する物質も固定化される。免疫グロブリンクラスと特異的に反応する物質とは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの抗体軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡまたは補体成分の一種であるＣ１ｑ等のように、ある種の抗体分子の特徴を選択的に認識して結合する能力を有する物質を言う。
【００２３】
不溶性担体粒子に標識酵素もしくは標識色素及び上記抗体、抗原等を担持する場合、その順序には特に制限はないが、標識として蛍光色素を使用する場合には蛍光色素を担持した後、抗体、抗原等を担持するのが好ましい。
一般的に不溶性担体粒子に担持される抗体または抗原の量は、上記不溶性磁性粒子の場合と同様に、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量等によって異なるが、通常担体粒子１ｇあたり１ｍｇ−５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ−１００ｍｇである。
【００２４】
不溶性磁性粒子、不溶性標識粒子および不溶性非磁性非標識粒子に担持させる物質の組合せの一例としては、測定しようとする物質が抗原の場合、以下のものが挙げられる。
【００２５】
【表１】

【００２６】
上記において、非磁性非標識粒子を含まない系においても同様に成立する。
一方、測定しようとする物質が抗体の場合、以下の組合せが一例として挙げられる。
【００２７】
【表２】

【００２８】
上記において、非磁性非標識粒子を含まない系においても同様に成立する。
また、上記（ｂ）、（ｃ）の場合、不溶性標識粒子に担持させる担体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）としては、抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩｇＭ、抗ヒトＩｇＥ等の免疫グロブリンと特異的に反応する物質が使用される。
【００２９】
次に本発明の具体的な測定方法について、不溶性蛍光標識粒子を使用した場合を例に説明する。
まず測定しようとする抗原または抗体を含むと考えられる試料溶液と、該抗原又は抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする抗原または抗体に対する抗原または抗体を担持させた不溶性蛍光標識粒子からなる第２試薬とを測定しようとする抗原または抗体と共に反応容器の液体媒体中で反応させる。あるいは上記第１試薬と第２試薬と、測定しようとする抗原または抗体に対する抗原または抗体を担持させた不溶性非磁性非標識粒子からなる第３試薬とを測定しようとする抗原または抗体と共に反応容器の液体媒体中で反応させる。
【００３０】
第１試薬、第２試薬、第３試薬を反応容器の液体媒体中に加える際、同時に加えても構わないし、別々に加えても構わない。また、加える順番についてはどの試薬から加えても構わない。各試薬添加後の混合は十分に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止め放置して反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応と同様に通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９にて行う。温度については、通常２〜５０℃の範囲で実施可能であるが、望ましくは室温乃至は３７〜４５℃で反応させる。反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意であるが、感度、操作性を考慮して、通常３〜６０分の範囲で設定される。
【００３１】
目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が用いられるが、中性から弱アルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、塩化ナトリウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタンパク質が添加される。
【００３２】
この時、不溶性磁性粒子は反応液に対して通常０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、不溶性蛍光標識粒子は反応液に対して通常０．００００１〜０．１重量％、好ましくは０．０００１〜０．０１重量％となるように使用される。また、不溶性非磁性非標識粒子を使用する場合、その濃度は反応液に対して通常０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％となるように使用される。
【００３３】
各不溶性粒子表面上の抗体または抗原と反応し、各粒子間の凝集反応を生じさせる。この凝集反応に伴う透過光強度（吸光度）変化を通常３４０〜１２００ｎｍから選択される任意の波長で測定する。
次いで、磁場の作用により、不溶性磁性粒子を反応液から分離し反応容器壁に付着させる。残存する反応液を除いた後、必要に応じて洗浄工程を数回繰り返す。その後、分離した不溶性磁性粒子に最終分散媒を加え、懸濁液として、該溶液に含まれる不溶性蛍光標識粒子の量を蛍光色素に固有の励起光を照射し、放出される蛍光強度を計測することにより測定する。例えば、Ｅｕキレ−トを標識色素とした場合、励起光は３００〜３８０ｎｍまたは２４０〜２７０ｎｍの紫外光であり、蛍光は６００〜６３０ｎｍ（６１５ｎｍに極大値を有する）である。
【００３４】
上記の反応において、試料中の抗原又は抗体を介して各粒子間の凝集反応が生じるためこの凝集反応に伴う濁度（吸光度）変化を測定することにより、各粒子に担持された抗体又は抗原と試料中の抗原又は抗体との反応の度合いを容易に知ることができる。
また上記の反応後の磁石の作用による分離により、試料中の抗原又は抗体を介して不溶性磁性粒子と結合した不溶性蛍光色素標識粒子も一緒に分離されているので、蛍光標識粒子の量を蛍光強度として測定することにより、不溶性磁性粒子および不溶性蛍光標識粒子に担持された抗体又は抗原と試料中の抗原又は抗体との反応の度合いを容易に知ることができる。
【００３５】
抗原または抗体を定量する場合は、予め抗原又は抗体濃度既知品を、或いは抗原又は抗体濃度基準品を試料として測定を行い、得られた定量値を試料の抗原又は抗体濃度に対して図示すれば該抗原又は抗体の検量線が得られるので、濃度未知試料の反応定量値から該抗原又は抗体の濃度が求められる。
本発明の抗原又は抗体の測定方法には、例えば以下のような装置を使用することができる。
【００３６】
（１）回転テーブルの全周縁に亘って反応容器を装着または脱着する容器セット部が形成されるとともに、前記各反応容器間に各反応容器の側面に対向する位置と側面から離れた位置とに移動可能な可動磁石が順次隣接するものの極性を反転させることができるように配置された試料部と、
前記回転テーブルの外方に、前記反応容器を前記容器セット部に装着、脱着する反応容器移動機構と、サンプル分注機構と、試薬分注機構と、前記反応容器の洗浄機構と、前記反応容器の内容物の撹拌機構と、サンプルの蛍光強度を測定する蛍光検出機構と、サンプルの透過光強度を測定する透過光検出機構および前記可動磁石の挿入機構、引抜き機構とが配置固定され、さらに、所定シーケンスに従って前記回転テーブルを回動させるとともに前記各機構をタイミングに応じて作動させる制御機構並びに前記透過光検出機構及び前記蛍光検出機構の測定値から抗原又は抗体の濃度がプロゾーン領域にあるかどうかを判定する判定機構とを有する操作部と、
を備えた免疫化学的測定装置。
【００３７】
（２）回転テーブルの全周縁に亘って反応容器を装着または脱着し、かつセット位置とリセット位置に移動可能な容器セット部が形成されるとともに、前記各反応容器がセット位置にあるときそれぞれ反応容器の側面に対向する位置で順次隣接するものの極性を反転させることができるように配置された固定磁石を有する試料部と、
前記回転テーブルの外方に、前記反応容器を前記容器セット部に装着，脱着する反応容器移動機構と、サンプル分注機構と、試薬分注機構と、前記反応容器の洗浄機構と、前記反応容器の内容物の撹拌機構と、サンプルの蛍光強度を測定する蛍光検出機構と、サンプルの透過光強度を測定する透過光検出機構および前記反応容器をリセット位置からセット位置に移動させる反応容器セット機構および反応容器をセット位置からリセット位置に移動させる反応容器リセット機構とが配置固定され、さらに、所定シーケンスに従って前記回転テーブルを回動させるとともに前記各機構をタイミングに応じて作動させる制御機構並びに前記透過光検出機構及び前記蛍光検出機構の測定値から抗原又は抗体の濃度がプロゾーン領域にあるかどうかを判定する判定機構とを有する操作部と、
を備えた免疫化学的測定装置。
【００３８】
尚、本発明の測定方法においては濁度（吸光度）分析と蛍光分析を同時に行う必要があるが、これは上記の透過光検出機構及び蛍光検出機構として、例えば図１又は図２に示す様な測定機構を用い、光源として白熱ランプ等の連続スペクトル光源とキセノンフラッシュランプ等の紫外線パルス光源を用いることにより可能となる。即ち、連続スペクトル光源が反応容器を透過した後、特定波長の光を検出する光検出器を設置することにより、透過光を検出し、紫外線パルス光源が反応容器に照射された時の蛍光を検出することができる。
【００３９】
図１、２は、透過光検出機構８０Ａと蛍光検出機構８０Ｂとからなる測光機構を示す。
図１のフィルター組み込みの測定機構において、光源７０から出た光は、反応容器１２の内部を透過し、励起用フィルター７２で波長帯域幅が選択されて、透過光用検出器８５にて、透過光量が検出される。
【００４０】
透過光検出は、回転テーブル１０において反応容器１２の移送中に行われるが、場合によっては停止中でも行われる。
抗原または抗体の存在しない場合での、反応容器１２の透過光量、または反応容器１２とその隣の反応容器１２との間の空間の透過光量（ブランク値）を検出し、これを調整基準値として、検出透過光量を補正することによって、検出透過光量から、抗原または抗体の実質の量が算出できる。
【００４１】
化学発光量の検出には、蛍光検出機構８０Ｂを用い蛍光検出器８１の前段には、ミラー付きシャッタ７５を設ける。
蛍光検出機構８０Ｂに、蛍光標準物質７４が設けられてある。
蛍光標準物質７４からの光量を基準値として、これから蛍光検出量を補正し、反応容器内１２における実質の蛍光の量を算出する。
【００４２】
ミラー付きシャッタ７５によって、検出する反応容器１２からの蛍光の光路を閉じたときには、基準値として蛍光基準物質Ｍ４からの光量を得、またミラー付きシャッタ７５を開けたときには、反応容器１２の蛍光の光量を得る。
図２の回折格子組み込みの測光機構において、光源７０から出た光は、反応容器１２の内部を透過し、回折格子８２によって分光されて透過光検出アレに入り、透過光量が検出される。ブランク値の算出については、図１のフィルター組み込みの場合と同じである。透過光検出機構の多数並列配置についても、図１の場合と同じである。蛍光検出機構についても、図１の場合と同じである。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
尚、以下の実施例において使用した洗浄液は、５０ｍＭトリス、０．９％ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（中性界面活性剤；ＴｗｅｅｎはＩＣＩＡｍｅｒｉｃａｎｓ社の登録商標）、ｐＨ９．０からなり、解離液は、０．１Ｎ
ＮａＯＨ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（中性界面活性剤；ＴｒｉｔｏｎはＲｏｈｍ＆Ｈａａｓ社の登録商標）からなる。
【００４４】
実施例１：
平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテックス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社）に、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）に対する抗体である抗ＨＢｓモノクローナル抗体をカルボジイミドを用いて、化学結合法により固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理することにより粒子を安定化させ、緩衝液に０．０５％の濃度で分散させてＭｇラテックス試薬を作製した。
【００４５】
希土類キレートのＥｕ−ＴＴＡ（テノイルトリフルオロアセトン）化合物（イーストマンコダック社製）１×１０^-4モルとＴＯＰＯ（トリオクチルホスフィンオキシド）（同仁化学社製）２×１０^-4モルをアセトン４０ｇに溶解した後、平均粒径０．４０８μｍのポリスチレンラテックス（Ｓｅｒａｄｙｎ社製）３ｇを水４０ｍｌに縣濁させたものを混合し、エバポレーターによりアセトンを除去することにより、ラテックス粒子にＥｕ−キレート化合物をＴＯＰＯと協同抽出し、Ｅｕキレート標識ラテックス（以下、Ｅｕラテックスとする。）を作製した。
【００４６】
ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様に化学結合法で、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を固定化し、ＢＳＡで処理し、緩衝液に０．００３％の濃度で分散させＥｕラテックス試薬を作製した。
平均粒径０．４０８μｍのポリスチレンラテックス（以下、ＰＳラテックスとする。Ｓｅｒａｄｙｎ社）に、Ｍｇラテックスと同様に化学結合法で、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を固定化し、ＢＳＡで処理し、緩衝液に０．１％の濃度で分散させてＰＳラテックス試薬を作製した。
【００４７】
ＨＢｓ抗原溶液をＨＢｓ抗原抗体陰性ヒト血清で希釈して、０、１、４、２０、１００、４００、１０００、４０００、２００００、１０００００、４０００００ＩＵ／ｍｌの濃度の標準液を作製した。（ＩＵ／ｍｌ：国内標準品を基準とした単位）
測定に際しては、ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学株式会社製；ＬＰＩＡは三菱化学株式会社の登録商標）を用い、反応セルに標準液７０μｌ、水５０μｌ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液６０μｌ、上記Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加え撹拌し、５分間免疫反応させた後、上記Ｍｇラテックス試薬４０μｌ、上記ＰＳラテックス試薬４０μｌ加え撹拌し、１０分間免疫反応を行わせ、この時生じる各粒子間の凝集反応に伴う吸光度変化を波長７００ｎｍ及び８００ｎｍにて測定した。
【００４８】
その後磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を３００μｌ加え、撹拌し、直ちに磁石で分離する。その後分離したＭｇラテックスに解離液を加え、撹拌し、直ちに磁石で分離し、反応セルにＥｕラテックスの量を６１５ｎｍの蛍光を計測することにより測定した。
各粒子間の凝集反応に伴う透過光の強度（吸光度）変化の測定結果及び蛍光強度の測定結果を表１、表２、表３に示し、蛍光強度の測定結果を図３に示した。
【００４９】
プロゾーン判定方法（以下、ＰＺ判定という）
図３の蛍光測定の結果によると、ＨＢｓ抗原濃度が２００００ＩＵ／ｍｌ以上になると抗原による抗原抗体架橋効果が低下し、蛍光強度が減少する。このため蛍光強度の測定結果のみではある蛍光強度に対する抗原濃度が一義的には定まらない。そこで、蛍光強度の測定結果とともに、吸光度変化の結果を利用して、以下に示すプロゾ−ン判定を行う。
なお、反応開始後の波長λ1 での時間ｔ_A、ｔ_B間における吸光度の変化量をΔＡｂｓ（λ₁）_AB、この時の反応速度をＶ（λ₁）_AB＝ΔＡｂｓ（λ₁）_AB／（ｔ_B−ｔ_A）とし、反応開始後、反応速度が最大となった時の反応速度（最大反応速度）をＶ（λ₁）max とし、その時の反応時間をｔmax とした。
【００５０】
ＰＺ判定法１：蛍光測定の結果の他に透過光の強度（以下、吸光度とする）の変化の度合いを利用してＰＺ判定する方法。
表１のデータから図４に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の変化量ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABが０．０２以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５１】
ＰＺ判定法２：蛍光測定の結果の他に吸光度の変化から反応速度を算出し、その度合いを利用してＰＺ判定する方法。
表１のデータから図５に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度Ｖ（λ₇₀₀）_ABをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがＶ（λ₇₀₀）_ABが１０以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５２】
ＰＺ判定法３：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から吸光度の比をとる方法。
表３のデータから図６に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の比ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB／ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ACをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるが比ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB／ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ACが０．５以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５３】
ＰＺ判定法４：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から吸光度の差をとる方法。
表３のデータから図７に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の差ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC−ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC−ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABが０．０１以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５４】
ＰＺ判定法５：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から反応速度の比をとる方法。
表３のデータから図８に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度の比Ｖ（λ₇₀₀）_AB／Ｖ（λ₇₀₀）_ACをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがＶ（λ₇₀₀）_AB／Ｖ（λ₇₀₀）_ACが２．０以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５５】
ＰＺ判定法６：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から反応速度の差をとる方法。
表３のデータから図９に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度の差Ｖ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₇₀₀）_ACをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがＶ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₇₀₀）_ACが５．０以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５６】
ＰＺ判定法７：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から最大反応速度に達するまでの反応時間を用いる方法。
表３のｔ₇₀₀maxのデータから図１０に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び最大反応速度に達するまでの時間をプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがｔ₇₀₀maxが０．５以下を示す時ＰＺ領域であると判定すればＰＺ判定を行うことができる。
【００５７】
ＰＺ判定法８：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、上記ＰＺ判定法３と同様にその２波長間の吸光度の比より判定する方法。
表３のデータから図１１に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の比ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC／ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ACをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるが比ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC／ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ACが１．０以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５８】
ＰＺ判定法９：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、上記ＰＺ判定法４と同様にその２波長間の吸光度の差より判定する方法。
表３のデータから図１２に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の差ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB−ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ABをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB−ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ABが０．００４以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００５９】
ＰＺ判定法１０：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、上記ＰＺ判定法５と同様にその２波長間の反応速度の比より判定する方法
表３のデータから図１３に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度の比Ｖ（λ₇₀₀）_AC／Ｖ（λ₈₀₀）_ACをプロットした。この図が示す様に蛍光強度のみでは２００００ＩＵ／ｍｌ以上でＰＺ現象が生じるがＶ（λ₇₀₀）_AC／Ｖ（λ₈₀₀）_ACが１．０以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００６０】
ＰＺ判定法１１：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、上記ＰＺ判定法６と同様にその２波長間の反応速度の差より判定する方法
表３に示した抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度の差Ｖ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₈₀₀）_ABが２．０以上を示す時ＰＺ領域であるとすればＰＺ判定を行うことができる。
【００６１】
吸光度の変化を濃度の定量に利用する方法
図３の測定結果によると、ＨＢｓ抗原濃度が１００ＩＵ／ｍｌ以上となると蛍光強度の抗原濃度に対する変化量が小さくなる。このため、蛍光強度の測定結果のみでは、測定に好ましい範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となる。
そこで、蛍光強度の測定結果と共に、吸光度変化の結果を利用して、以下に示すデータ処理を行うことにより１００ＩＵ／ｍｌ以上も測定することを可能とした。
【００６２】
測定法１：蛍光測定の結果の他に吸光度の変化の度合いを利用して広い測定範囲を得る方法。
表１のデータから図４に抗原濃度に対する吸光度の変化量ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図４に示した抗原濃度に対するΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABの変化を利用することにより測定範囲を２００００ＩＵ／ｍｌ付近まで広げることができる。
【００６３】
測定法２：蛍光測定の結果の他に吸光度の変化から反応速度を算出し、その度合いを利用して広い測定範囲を得る方法。
表１のデータから図５に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度Ｖ（λ₇₀₀）_ABをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図５に示した抗原濃度に対するＶ（λ₇₀₀）_ABの変化を利用することにより測定範囲を２００００ＩＵ／ｍｌ付近まで広げることができる。
【００６４】
測定法３：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から吸光度（透過光強度）の比をとる方法。
表３のデータから図６に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の比ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB／ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ACをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図６に示す様に抗原濃度に対するΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB／ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ACの変化を利用することにより測定範囲を１０００００ＩＵ／ｍｌ以上に広げることができる。
【００６５】
測定法４：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から吸光度の差をとる方法。
表３のデータから図７に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の差ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC−ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図７に示す様に抗原濃度に対するΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC−ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_ABの変化を利用することにより測定範囲を４０００ＩＵ／ｍｌ付近まで広げることができる。
【００６６】
測定法５：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して複数個の測定値から反応速度の比をとる方法。
表３のデータから図８に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度の比Ｖ（λ₇₀₀）_AB／Ｖ（λ₇₀₀）_ACをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図８に示す様に抗原濃度に対するＶ（λ₇₀₀）_AB／Ｖ（λ₇₀₀）_ACの変化を利用することにより測定範囲を１０００００ＩＵ／ｍｌ以上に広げることができる。
【００６７】
測定法６：蛍光測定の結果の他に吸光度（透過光強度）の測定結果を利用して複数個の測定値から反応速度の差をとる方法。
表３のデータから図９に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の差Ｖ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₇₀₀）_ACをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図９に示す様に抗原濃度に対するＶ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₇₀₀）_ACの変化を利用することにより測定範囲を２００００ＩＵ／ｍｌ付近まで広げることができる。
【００６８】
測定法７：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、上記測定法３、４と同様にその２波長間の吸光度の差や比をとる方法。
表３のデータから図１０に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び吸光度の差ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB−ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ABをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図１０に示す様に抗原濃度に対するΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AB−ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ABの変化を利用することにより測定範囲を２００００ＩＵ／ｍｌ付近まで広げることができる。
また、この結果の他に、吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、その２波長間の吸光度の比ΔＡｂｓ（λ₇₀₀）_AC／ΔＡｂｓ（λ₈₀₀）_ACの変化を利用して２００００ＩＵ／ｍｌ以上を測定する（図１１参照）ことを加えることにより測定範囲を４０００００ＩＵ／ｍｌまで広げることができる。
【００６９】
測定法８：蛍光測定の結果の他に吸光度の測定結果を利用して２波長測定を行い、上記測定法５、６と同様にその２波長間の反応速度の差や比をとる方法。
表３のデータから図１２に抗原濃度に対する蛍光強度の変化及び反応速度の差Ｖ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₈₀₀）_ABをプロットした。図３が示す様に蛍光強度のみでは測定範囲は１００ＩＵ／ｍｌ以下となるが、１００ＩＵ／ｍｌ以上の抗原濃度の時、図１２に示す様に抗原濃度に対するＶ（λ₇₀₀）_AB−Ｖ（λ₈₀₀）_ABの変化を利用することにより測定範囲を２００００ＩＵ／ｍｌ付近まで広げることができる。
また、この結果の他に、吸光度（透過光強度）の測定結果を利用して２波長測定を行い、その２波長間の反応速度の比Ｖ（λ₇₀₀）_AC／Ｖ（λ₈₀₀）_ACの変化を利用して２００００ＩＵ／ｍｌ以上を測定する（図１３参照）ことを加えることにより測定範囲を４０００００ＩＵ／ｍｌまで広げることができる。
【００７０】
【表３】

【００７１】
【表４】

【００７２】
【表５】

【００７３】
【発明の効果】
本発明によって、不溶性磁性粒子及び不溶性蛍光標識粒子を用いる抗原抗体反応において、プロゾーン判定を行い、また、広範囲における濃度の抗原又は抗体を定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法に利用できるフィルター組み込み測光機構の例を示す図である。（ａ）は、その平面図、（ｂ）は、そのＡ−Ａ’線における断面図である。
【図２】本発明の測定方法に利用できる回折格子組み込み測光機構の例を示す図である。（ａ）は、その平面図、（ｂ）は、そのＡ−Ａ’線における断面図である。
【図３】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図４】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図５】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図６】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図７】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図８】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図９】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図１０】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図１１】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図１２】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【図１３】吸光度のパラメータと抗原濃度との関係を示す図である。
【符号の説明】
１０回転テーブル
１２反応容器
７０光源
７１ハーフミラー
７２励起光用フィルター
７３ミラー
７４蛍光標準物質
７５ミラー付シャッタ
７６蛍光用フィルター
８１蛍光用検出器
８２回折格子
８３透過光用検出アレー
８４透過光用フィルター
８５透過光用検出器
８６フィルター板回転モータ
８７フィルター板[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for quantifying the concentration of an antigen or antibody in a wide range in an antigen-antibody reaction using insoluble magnetic particles and insoluble labeled particles.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
Conventionally, an immunoassay method using an antigen-antibody reaction is known as an early detection method for various diseases and a detection method for a very small amount of a substance. There are various high-sensitivity immunoassay methods, such as radioimmunoassay (RIA) and enzyme immunoassay in which a radioisotope (RI), an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is bound to an antibody or antigen as a labeling substance. (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA) and the like.
[0003]
However, such conventional techniques have various problems. For example, RIA has restrictions on handling and disposal of RI. EIA and the like are advantageous in terms of handling safety, but measurement sensitivity is slightly inferior to RIA.
Recently, an immunoassay method has been developed that uses magnetic particles and fluorescently labeled particles to increase measurement sensitivity compared to ordinary FIA by the steps shown below (Japanese Patent Laid-Open No. 61-128168).
[0004]
(A) a first reagent containing an antigen or antibody to be measured, an antigen or an antibody against the antibody or an insoluble magnetic particle carrying the antigen, and an insoluble fluorescence carrying the antibody or the antigen against the antigen or the antibody Reacting a second reagent containing labeled particles in a liquid medium.
(B) Separating unreacted insoluble magnetic particles and agglomerated particles containing insoluble magnetic particles from the reaction mixture by applying a magnetic field to the reaction mixture of step (a), then the liquid medium and unreacted insoluble fluorescent labeled particles Removing.
(C) Measure the fluorescence intensity of the insoluble fluorescently labeled particles reacted with the remaining insoluble magnetic particles, and quantitatively determine the antigen or antibody using a calibration curve of fluorescence intensity obtained by measuring the antigen or antibody at a known concentration in advance. The process of measuring.
[0005]
However, in this method, the antigen or antibody to be measured is reacted with the first reagent containing magnetic particles and the second reagent containing fluorescently labeled particles together in the liquid medium of the reaction vessel, and then magnetically by the action of the magnetic field. A method for measuring the fluorescence intensity of fluorescently labeled particles that react with particles. So-called end point method is adopted, so when antigen or antibody exceeds a certain concentration, antigen-antibody cross-linking effect by antigen or antibody disappears and reacts with magnetic particles. The number of fluorescent labeling particles decreases, and as a result, the fluorescence intensity decreases (this is called the “prozone phenomenon”). When the prozone phenomenon occurs, two concentration values exist for one fluorescence intensity value, and the concentration cannot be specified from the fluorescence intensity. For this reason, the measurement sensitivity is excellent, but a wide concentration range cannot be measured.
On the other hand, as a prozone determination method, several methods are conventionally known, but these are used in a method for measuring an antigen or antibody by absorbance, and in a method for measuring an antigen or antibody by fluorescence intensity. Such a determination method has not been applied.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The inventors measured the fluorescence intensity in FIA using magnetic particles and fluorescently labeled particles, and measured the transmitted light (absorbance) or the scattered light change accompanying the aggregation reaction between the particles generated in this step. The point was solved.
That is, the gist of the present invention is that, in the method for quantitatively measuring an antigen or antibody in a liquid medium by the following steps (a) to (c), the intensity of transmitted light or scattered light accompanying the reaction in step (a): In the method for measuring an antigen or antibody.
[0007]
(A) an antigen or antibody to be measured, a first reagent containing insoluble magnetic particles carrying the antigen or antibody against the antigen or the antibody, and an insoluble label carrying the antibody or antigen against the antigen or the antibody Reacting a second reagent containing particles in a liquid medium.
(B) Separating unreacted insoluble magnetic particles and agglomerated particles containing insoluble magnetic particles from the reaction mixture by applying a magnetic field to the reaction mixture of step (a), and then separating the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles Removing.
(C) A step of quantitatively measuring the antigen or antibody by quantifying the amount of the insoluble labeled particles reacted with the remaining insoluble magnetic particles.
[0008]
The present invention also lies in a method for measuring an antigen or antibody, characterized in that prozone determination is performed from the measured value of the intensity of transmitted light or scattered light in the step (a). According to yet another aspect, the present invention provides:When it is determined that it is an area other than the pro zone area after performing the pro zone determination,Calibration curve of the intensity of transmitted or scattered light obtained by measuring an antigen or antibody at a known concentration in advance.And a calibration curve based on the amount of insoluble labeled particlesQuantify the concentration of the antigen or antibody usingLow and large change in measurement results in step (c)In the region, the measured value of step (c)High and small change in measurement results in step (c)In the area, the measurement value of the step (a) is employed, and the measurement method of antigen or antibody is characterized.
Furthermore, in the step (a), the antigen or antibody measurement method is characterized by using a third reagent containing an insoluble nonmagnetic unlabeled particle carrying an antibody or antigen against the antigen or antibody to be measured. Exist. Further, the present invention resides in a measuring method characterized in that antibodies carried on the insoluble labeled particles and antibodies having different titers are used as the antibodies carried on the insoluble nonmagnetic non-labeled particles.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The greatest feature of the present invention lies in measuring the intensity of transmitted light or scattered light together with quantification of insoluble labeled particles in a method of measuring antigen or antibody by using insoluble labeled particles and quantifying them.
[0010]
In the present invention, when a transmitted light intensity or scattered light intensity exceeds a certain value from a calibration curve obtained by measuring a transmitted light intensity or scattered light intensity obtained by measuring an antigen or antibody at a known concentration in advance. By determining that the prozone phenomenon has occurred, it can be used as an indicator of whether or not the quantitative value of the antigen or antibody obtained in the step (c) is reliable.
[0011]
In the present invention, as a method for determining a prozone, a conventional prozone determination associated with an antigen-antibody reaction can be applied, except that it is compared with the fluorescence intensity. For example, the antigen-antibody reaction is traced over time, and a method of determining whether the region is a prozone region from the reaction progress pattern (Japanese Patent Publication No. 61-10775) or the ratio of transmitted light at two wavelengths is determined. In addition to a method for determining the size of the particle diameter and determining whether it is a zone of the zone (Japanese Patent Laid-Open No. 63-19560),
(1) A method of adding an antibody reagent or a sample again.
(2) A method of calculating a turbidity (absorbance) ratio or difference or a concentration ratio or difference from a plurality of measured values.
(3) A method of obtaining a reaction rate ratio or difference from a plurality of measured values.
(4) A method using a three-dimensional calibration curve of a maximum reaction rate, a reaction time until reaching the maximum reaction rate, and an antigen concentration from a plurality of measured values.
(5) A method of measuring two wavelengths and judging from the absorbance ratio or difference.
These methods can be used, for example, as described in Japanese Society for Clinical Laboratory Automation Vol. 15, No. 6, No. 675-687 (1990), No. 14, No. 3, No. 171-176. Page (1989).
[0012]
On the other hand, in the present invention, the measured value of transmitted light intensity or scattered light intensity can also be used for quantification of antigen concentration or antibody concentration.
The measurement result of step (c) alone cannot measure a wide concentration range due to the prozone phenomenon, but together with this, the intensity change of transmitted light or scattered light accompanying the agglutination reaction is measured, and the antigen to be measured or In the measurement range where the antibody concentration is low and sensitivity is required, the concentration is calculated from the measurement result of step (c). In the measurement range where the concentration is high, the concentration is calculated from the measurement result of the intensity change of transmitted light or scattered light accompanying the agglutination reaction. By calculating, it is possible to accurately measure a wide concentration range.
[0013]
When quantifying an antigen or antibody, a calibration curve is prepared by measuring in advance a sample having a known concentration of the antigen or antibody or a concentration reference product of the antigen or antibody. In the present invention, usually, a step ( A plurality of calibration curves of the intensity of transmitted light or scattered light obtained from a) and a calibration curve obtained from step (c) are used. For this reason, for example, when insoluble fluorescently labeled particles are used as the insoluble labeled particles, an apparatus having both a transmitted light detection mechanism and a fluorescence detection mechanism as shown in FIG. It is preferable to measure the intensity and the intensity of transmitted light or scattered light simultaneously. Details of the measurement mechanism will be described later.
[0014]
The insoluble magnetic particles used in the present invention include, for example, iron trioxide (Fe_ThreeO_Four), Iron sesquioxide (γ-Fe₂O_Three), Fine particles made of various metals such as ferrite, iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, alloys of nickel, manganese, etc., or polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile, polymethacryl containing these magnetic fine particles inside Hydrophobic polymers such as methyl acid, polycapramide, polyethylene terephthalate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2-oxyethyl methacrylate), poly (2,3 -Dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), cross-linked hydrophilic polymer such as polyethylene glycol methacrylate, or copolymer of about 2-4 kinds of the above monomers Latex such as, gelatin, liposome or the magnetic fine particle latex, gelatin, surface-immobilized particles such as liposomes are employed.
[0015]
The particle size of the insoluble magnetic particles is usually 0.05 μm to 5 μm, preferably insoluble magnetic particles having a particle size in the range of 0.1 μm to 1 μm.
The insoluble magnetic particles can be loaded with an antibody or antigen by physically adsorbing the antigen or antibody to be measured, or the antigen or antibody in the specimen, or the antibody or antigen, or chemically loading it. Is done.
Examples of the physical adsorption method include a method of directly immobilizing an antibody or an antigen on insoluble magnetic particles.
[0016]
The chemical loading method includes binding to an antibody or antigen molecule by chemically modifying amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, hydroxyl groups, aldehyde groups, epoxy groups, etc. present on the surface of magnetic particles. A method of directly immobilizing on a particle using a functional group capable of, a method of immobilizing by introducing a spacer molecule with a chemical bond between the particle and an antibody or antigen molecule, and other methods such as albumin Examples include a method in which an antibody or antigen is chemically bound to a protein and then the protein is chemically bound to particles.
[0017]
In addition, a substance that specifically binds to the antibody or antigen to be immobilized (eg, antibody, protein A, etc.) is physically or chemically bound to the particle surface, and then the target antibody or antigen is bound to the particle surface. There is also a method of immobilizing.
Usually, IgG is used as an antibody to be carried on the insoluble magnetic particles. However, F (ab ′) 2, Fab ′, Fab are prepared by using a digestive enzyme such as pepsin or papain or a reducing agent such as dithiothreitol or mercaptoethanol. Those having a low molecular weight such as may be used. Further, not only IgG but also IgM or a fragment obtained by reducing the molecular weight by the same treatment as IgG may be used. Either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be applied. When using monoclonal antibodies, use one or more monoclonal antibodies for proteins with repetitive structures such as hepatitis B surface antigen and antigens with multiple epitopes in the molecule such as CA19-9 antigen. it can. Further, two or more types having different recognition epitopes can be used in combination.
[0018]
On the other hand, examples of the antigen include various proteins, polypeptides, steroids, polysaccharides, lipids, pollen, recombinant proteins produced by genetic engineering, nucleic acids such as DNA and RNA, and drugs. That is, the “antigen” as used in the present invention refers to a single substance or a plurality of substances selected for a special purpose such as diagnosis among all substances capable of promoting antibody production to humans or animals, or It refers to a mixture containing them.
[0019]
The amount of antibody or antigen generally carried varies depending on the surface area of the insoluble carrier particles used, the amount of functional groups, and the like, but is usually 1 mg-500 mg, preferably 10 mg-100 mg, per 1 g of carrier particles.
There are various labels used for the insoluble label particles of the present invention. For enzyme labeling, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, β-galactosidase, luciferase and the like are often used. Examples of fluorescent dyes used for fluorescent labeling include rare earth chelates such as europium (Eu), terbium (Tb), and samarium (Sm), phycobiliproteins such as phycocyanin and phycoerythrin, fluorescein, and tetramethyl. Rhodamine, Texas Red, 4-methylumbelliferone, 7-amino-4-methylcoumarin and the like are known. Examples of chemiluminescent dyes include acridinium esters, luminol, isoluminol, and derivatives thereof. Among these labels, it is particularly preferable to use insoluble fluorescent labeled particles using a fluorescent dye as the insoluble labeled particles of the present invention.
[0020]
The insoluble carrier particles that are labeled and the insoluble carrier particles that are not labeled are substantially insoluble in the liquid medium used for the reaction, and have an average particle size of 0.05 to 5 μm, preferably 0.1 to 1.0 μm. What has is used.
The material of the carrier particles is the same as that described for the above insoluble magnetic particles, hydrophobic polymer such as polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile, polymethyl methacrylate, polycoupler, polyethylene terephthalate, polyacrylamide, polymethacrylamide. , Polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2-oxyethyl methacrylate), poly (2,3-dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), polyethylene In addition to latex, gelatin, and liposomes such as cross-linked hydrophilic polymers such as glycol methacrylate, or copolymers of about 2 to 4 monomers mentioned above, biological components such as red blood cells, metal colloids such as gold colloids Particles or the like are used.
[0021]
For example, when a fluorescent dye is supported on an insoluble carrier particle, a method of chemically binding the fluorescent dye using a functional group on the surface of the particle, a dye is added when the particles are synthesized and synthesized. The method of confining the label inside the particle, the method of physically adsorbing the labeling material on the surface of the particle, the labeling material is bound physically and chemically to proteins and peptides in advance, and then the protein and peptide are fixed to the particle. There is a way to make it.
[0022]
For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 54-101439 describes a method in which a rare earth chelate is confined inside an organic polymer latex using a joint extraction method with TOPO (tri-n-octylphosphinoxide). . The labeled particles produced according to this were good in both label strength and stability.
On the insoluble carrier particles, an antibody (both polyclonal antibody and monoclonal antibody is acceptable) or an antigen is physically or chemically immobilized as described above. Furthermore, when the substance to be measured is an antibody, a substance that specifically reacts with the immunoglobulin class of the antibody is also immobilized. Substances that specifically react with the immunoglobulin class include certain kinds such as antibodies against IgG, IgA, IgM, IgD, IgE or their antibody light chain part, protein A, or C1q, which is a type of complement component. A substance having the ability to selectively recognize and bind to the characteristics of the antibody molecule.
[0023]
The order of the labeling enzyme or the labeling dye and the above antibody, antigen, etc. carried on the insoluble carrier particles is not particularly limited. However, when the fluorescent dye is used as the label, the antibody, antigen, Etc. are preferably supported.
In general, the amount of antibody or antigen supported on insoluble carrier particles varies depending on the surface area, the amount of functional groups, etc. of the insoluble carrier particles used as in the case of the insoluble magnetic particles, but usually 1 mg-500 mg per 1 g of carrier particles. , Preferably 10 mg-100 mg.
[0024]
As an example of the combination of the substances carried on the insoluble magnetic particles, the insoluble labeled particles and the insoluble nonmagnetic non-labeled particles, when the substance to be measured is an antigen, the following may be mentioned.
[0025]
[Table 1]

[0026]
In the above, the same holds true for a system that does not include non-magnetic non-labeled particles.
On the other hand, when the substance to be measured is an antibody, the following combinations are listed as examples.
[0027]
[Table 2]

[0028]
In the above, the same holds true for a system that does not include non-magnetic non-labeled particles.
In the cases (b) and (c), the carrier (monoclonal antibody or polyclonal antibody) carried on the insoluble labeled particles specifically reacts with immunoglobulins such as anti-human IgG, anti-human IgM and anti-human IgE. The substance to be used is used.
[0029]
Next, a specific measurement method of the present invention will be described using an example where insoluble fluorescently labeled particles are used.
First, a sample solution considered to contain the antigen or antibody to be measured, a first reagent comprising an antibody against the antigen or antibody or insoluble magnetic particles carrying the antigen, and an antigen or antibody against the antigen or antibody to be measured Is reacted with the antigen or antibody to be measured in the liquid medium of the reaction vessel. Alternatively, together with the antigen or antibody to be measured, the first reagent and the second reagent, and the third reagent composed of insoluble nonmagnetic unlabeled particles carrying the antigen or antibody against the antigen or antibody to be measured, React in a liquid medium.
[0030]
When the first reagent, the second reagent, and the third reagent are added to the liquid medium in the reaction vessel, they may be added simultaneously or separately. Further, the order of addition may be added from any reagent. Mixing after the addition of each reagent needs to be performed sufficiently, but after mixing uniformly, the mixing may be stopped and allowed to react. The reaction is usually carried out at a pH of 5 to 10, preferably at a pH of 7 to 9, as in a general immunochemical reaction. About temperature, although it can implement normally in the range of 2-50 degreeC, it is made to react desirably at room temperature thru | or 37-45 degreeC. The reaction time is arbitrary from immediately after the reaction to 1 day and night, but is usually set in the range of 3 to 60 minutes in consideration of sensitivity and operability.
[0031]
In order to maintain the target pH, a buffer solution is usually used. As the buffer solution, for example, phosphoric acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane, and the like are used, but most of the buffer solutions that are commonly used from neutral to weakly alkaline can be used. In many cases, salts such as sodium chloride and proteins such as bovine serum albumin are added to avoid non-specific reactions.
[0032]
At this time, the insoluble magnetic particles are usually 0.0001 to 1% by weight, preferably 0.001 to 0.1% by weight, based on the reaction solution, and the insoluble fluorescently labeled particles are usually 0.00001 to 0.001% to the reaction solution. 1% by weight, preferably 0.0001 to 0.01% by weight is used. When using insoluble nonmagnetic non-labeled particles, the concentration is usually 0.0001 to 1% by weight, preferably 0.001 to 0.1% by weight, based on the reaction solution.
[0033]
It reacts with antibodies or antigens on the surface of each insoluble particle, causing an agglutination reaction between the particles. Changes in transmitted light intensity (absorbance) associated with this agglutination reaction are usually measured at an arbitrary wavelength selected from 340 to 1200 nm.
Next, the insoluble magnetic particles are separated from the reaction solution by the action of the magnetic field and attached to the reaction vessel wall. After removing the remaining reaction solution, the washing step is repeated several times as necessary. Thereafter, the final dispersion medium is added to the separated insoluble magnetic particles, and the amount of the insoluble fluorescent labeled particles contained in the solution is irradiated as a suspension to the excitation light specific to the fluorescent dye, and the emitted fluorescence intensity is measured. To measure. For example, when Eu chelate is used as the labeling dye, the excitation light is ultraviolet light of 300 to 380 nm or 240 to 270 nm, and the fluorescence is 600 to 630 nm (having a maximum value at 615 nm).
[0034]
In the above reaction, since an agglutination reaction occurs between the particles via the antigen or antibody in the sample, by measuring the change in turbidity (absorbance) associated with the agglutination reaction, the antibody or antigen carried on each particle The degree of reaction with the antigen or antibody in the sample can be easily known.
In addition, the separation by the action of the magnet after the reaction described above separates the insoluble fluorescent dye-labeled particles bound to the insoluble magnetic particles via the antigen or antibody in the sample, so the amount of the fluorescently labeled particles As a result, it is possible to easily know the degree of reaction between the antibody or antigen carried on the insoluble magnetic particle and the insoluble fluorescently labeled particle and the antigen or antibody in the sample.
[0035]
When quantifying the antigen or antibody, measure the antigen or antibody concentration in advance or the antigen or antibody concentration reference sample as a sample, and plot the obtained quantitative value against the antigen or antibody concentration of the sample. Since a calibration curve of the antigen or antibody is obtained, the concentration of the antigen or antibody is determined from the reaction quantitative value of the sample of unknown concentration.
In the method for measuring an antigen or antibody of the present invention, for example, the following apparatus can be used.
[0036]
(1) A container set part for attaching or detaching the reaction container is formed over the entire periphery of the rotary table, and a position facing the side surface of each reaction container and a position away from the side surface between the reaction containers. A sample part arranged so that movable polar magnets can sequentially reverse the polarity of adjacent ones;
A reaction container moving mechanism that attaches and detaches the reaction container to and from the container setting unit, a sample dispensing mechanism, a reagent dispensing mechanism, a washing mechanism for the reaction container, and the reaction container. A stirring mechanism for the contents of the above, a fluorescence detection mechanism for measuring the fluorescence intensity of the sample, a transmitted light detection mechanism for measuring the transmitted light intensity of the sample, an insertion mechanism for the movable magnet, and a pulling mechanism are arranged and fixed. Whether the concentration of the antigen or antibody is in the prozone region from the measured values of the control mechanism that rotates the rotary table according to a predetermined sequence and operates each mechanism according to the timing, and the transmitted light detection mechanism and the fluorescence detection mechanism An operation unit having a determination mechanism for determining whether or not
An immunochemical measurement apparatus comprising:
[0037]
(2) A reaction container is attached or detached over the entire periphery of the rotary table, and a container setting unit is formed that can be moved to a set position and a reset position, and each reaction container reacts when it is in the set position. A sample part having a fixed magnet arranged so as to be able to reverse the polarity of the sequentially adjacent ones at a position facing the side of the container;
A reaction container moving mechanism that attaches and detaches the reaction container to and from the container setting unit, a sample dispensing mechanism, a reagent dispensing mechanism, a washing mechanism for the reaction container, and the reaction container. A stirring mechanism for the contents of the sample, a fluorescence detection mechanism for measuring the fluorescence intensity of the sample, a transmitted light detection mechanism for measuring the transmitted light intensity of the sample, and a reaction container setting mechanism for moving the reaction container from the reset position to the set position; A reaction container reset mechanism for moving the reaction container from the set position to the reset position, and a control mechanism for rotating the rotary table according to a predetermined sequence and operating the mechanisms according to timing, and the transmitted light. From the detection mechanism and the measured value of the fluorescence detection mechanism, it can be determined whether the antigen or antibody concentration is in the prozone region. An operation unit and a determination mechanism,
An immunochemical measurement apparatus comprising:
[0038]
In the measurement method of the present invention, it is necessary to perform turbidity (absorbance) analysis and fluorescence analysis at the same time. This is because, for example, as shown in FIG. 1 or FIG. This is possible by using a measurement mechanism and using a continuous spectrum light source such as an incandescent lamp and an ultraviolet pulse light source such as a xenon flash lamp as the light source. In other words, after the continuous spectrum light source passes through the reaction vessel, a light detector that detects light of a specific wavelength is installed to detect the transmitted light and detect fluorescence when the reaction vessel is irradiated with the ultraviolet pulse light source. can do.
[0039]
1 and 2 show a photometric mechanism composed of a transmitted light detection mechanism 80A and a fluorescence detection mechanism 80B.
1, the light emitted from the light source 70 is transmitted through the inside of the reaction vessel 12, the wavelength bandwidth is selected by the excitation filter 72, and transmitted by the transmitted light detector 85. The amount of light is detected.
[0040]
The transmitted light detection is performed during the transfer of the reaction vessel 12 on the turntable 10, but may be performed even when stopped.
When there is no antigen or antibody, the amount of light transmitted through the reaction container 12 or the amount of light transmitted through the space between the reaction container 12 and the adjacent reaction container 12 (blank value) is detected, and this is used as the adjustment reference value. By correcting the detected transmitted light amount, the substantial amount of the antigen or antibody can be calculated from the detected transmitted light amount.
[0041]
For detection of the amount of chemiluminescence, a fluorescence detection mechanism 80B is used, and a shutter 75 with a mirror is provided in front of the fluorescence detector 81.
A fluorescence standard substance 74 is provided in the fluorescence detection mechanism 80B.
Using the amount of light from the fluorescence standard substance 74 as a reference value, the fluorescence detection amount is corrected from this, and the actual fluorescence amount in the reaction container 12 is calculated.
[0042]
When the fluorescent light path from the reaction container 12 to be detected is closed by the shutter 75 with a mirror, the amount of light from the fluorescent reference material M4 is obtained as a reference value, and when the shutter 75 with a mirror is opened, the fluorescence of the reaction container 12 is obtained. Get light intensity.
In the photometric mechanism incorporating the diffraction grating of FIG. 2, the light emitted from the light source 70 passes through the inside of the reaction vessel 12, is dispersed by the diffraction grating 82, enters the transmitted light detection array, and the amount of transmitted light is detected. The calculation of the blank value is the same as in the case of incorporating the filter in FIG. The arrangement of many transmitted light detection mechanisms in parallel is the same as in FIG. The fluorescence detection mechanism is the same as in FIG.
[0043]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to the following examples.
The cleaning solution used in the following examples was composed of 50 mM Tris, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20 (neutral surfactant; Tween is a registered trademark of ICI Americans), pH 9.0, and dissociated. The liquid is 0.1N
NaOH, 0.1% Triton X100 (neutral surfactant; Triton is a registered trademark of Rohm & Haas).
[0044]
Example 1:
Using carbodiimide, an anti-HBs monoclonal antibody that is an antibody against hepatitis B virus surface antigen (HBs antigen) is coated on a magnetic substance-containing polystyrene latex having an average particle size of 0.7 μm (hereinafter referred to as Mg latex, Rhone-Poulenc). After immobilization by the chemical bonding method, the particles were stabilized by treatment with bovine serum albumin (BSA) and dispersed in a buffer solution at a concentration of 0.05% to prepare an Mg latex reagent.
[0045]
Eu-TTA (thenoyltrifluoroacetone) compound of rare earth chelate (Eastman Kodak) 1 × 10^-FourMole and TOPO (trioctylphosphine oxide) (manufactured by Dojin Chemical) 2 × 10^-FourAfter dissolving the mole in 40 g of acetone, 3 g of polystyrene latex (manufactured by Seradyn) having an average particle size of 0.408 μm suspended in 40 ml of water is mixed, and acetone is removed by an evaporator to obtain Eu in the latex particles. -A chelate compound was extracted in cooperation with TOPO to prepare an Eu chelate-labeled latex (hereinafter referred to as Eu latex).
[0046]
Similarly to Mg latex, an anti-HBs polyclonal antibody was immobilized on Eu latex by a chemical bonding method, treated with BSA, and dispersed in a buffer solution at a concentration of 0.003% to prepare an Eu latex reagent.
An anti-HBs polyclonal antibody was immobilized on polystyrene latex having an average particle size of 0.408 μm (hereinafter referred to as PS latex, Seradyn) by chemical bonding as in the case of Mg latex, treated with BSA, and added to a buffer solution with a concentration of 0.8. A PS latex reagent was prepared by dispersing at a concentration of 1%.
[0047]
The HBs antigen solution was diluted with HBs antigen antibody-negative human serum to prepare standard solutions having concentrations of 0, 1, 4, 20, 100, 400, 1000, 4000, 20000, 100,000, and 400,000 IU / ml. (IU / ml: Unit based on domestic standard products)
In the measurement, LPIA-A700 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation; LPIA is a registered trademark of Mitsubishi Chemical Corporation) was used, and 70 μl of standard solution, 50 μl of water, 60 μl of BSA-containing Tris buffer, and 40 μl of the above Eu latex reagent were used in the reaction cell. Add and stir for 5 minutes to immunoreact, then add 40 μl of the Mg latex reagent and 40 μl of the PS latex reagent and stir to allow the immune reaction to occur for 10 minutes. Measurements were taken at 700 nm and 800 nm.
[0048]
Thereafter, the Mg latex in the reaction cell is separated from the reaction solution using a magnet, the remaining reaction solution is removed, 300 μl of washing solution is added, stirred, and immediately separated with a magnet. Thereafter, the dissociated solution was added to the separated Mg latex, stirred and immediately separated with a magnet, and the amount of Eu latex was measured in the reaction cell by measuring fluorescence at 615 nm.
Tables 1, 2 and 3 show the measurement results of the intensity (absorbance) change of the transmitted light accompanying the aggregation reaction between the particles, and the measurement results of the fluorescence intensity are shown in FIG.
[0049]
Pro zone determination method (hereinafter referred to as PZ determination)
According to the result of the fluorescence measurement in FIG. 3, when the HBs antigen concentration is 20000 IU / ml or more, the antigen-antibody cross-linking effect by the antigen is lowered and the fluorescence intensity is reduced. For this reason, the antigen concentration with respect to a certain fluorescence intensity is not uniquely determined only by the measurement result of the fluorescence intensity. Therefore, using the result of the absorbance change together with the measurement result of the fluorescence intensity, the following zone determination is performed.
The time t at the wavelength λ1 after the start of the reaction_A, T_BThe amount of change in absorbance during the period is ΔAbs (λ₁)_AB, V (λ₁)_AB= ΔAbs (λ₁)_AB/ (T_B-T_A) And the reaction rate (maximum reaction rate) when the reaction rate reaches the maximum after the start of the reaction is V (λ₁) Max, and the reaction time at that time was tmax.
[0050]
PZ determination method 1: A method of determining PZ using the degree of change in transmitted light intensity (hereinafter referred to as absorbance) in addition to the result of fluorescence measurement.
From the data in Table 1, FIG. 4 shows the change in fluorescence intensity and the change in absorbance ΔAbs (λ₇₀₀)_ABWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs when the fluorescence intensity alone is 20000 IU / ml or more, but ΔAbs (λ₇₀₀)_ABIf the value is 0.02 or more, if it is the PZ region, PZ determination can be performed.
[0051]
PZ determination method 2: A method in which a reaction rate is calculated from a change in absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and PZ is determined using the degree.
From the data in Table 1, FIG. 5 shows the change in the fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the reaction rate V (λ₇₀₀)_ABWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs at 20,000 IU / ml or more with only fluorescence intensity, but V (λ₇₀₀)_ABIf P is in the PZ region when 10 indicates 10 or more, PZ determination can be performed.
[0052]
PZ determination method 3: A method of obtaining a ratio of absorbance from a plurality of measured values using a result of absorbance measurement in addition to a result of fluorescence measurement.
From the data in Table 3, FIG. 6 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the ratio of absorbance ΔAbs (λ₇₀₀)_AB/ ΔAbs (λ₇₀₀)_ACWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs when the fluorescence intensity alone is 20000 IU / ml or more, but the ratio ΔAbs (λ₇₀₀)_AB/ ΔAbs (λ₇₀₀)_ACPZ determination can be performed if it is in the PZ region when the value indicates 0.5 or more.
[0053]
PZ determination method 4: A method of taking the difference in absorbance from a plurality of measured values using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement.
From the data in Table 3, FIG. 7 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the difference ΔAbs (λ₇₀₀)_AC−ΔAbs (λ₇₀₀)_ABWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs when the fluorescence intensity alone is 20000 IU / ml or more, but ΔAbs (λ₇₀₀)_AC−ΔAbs (λ₇₀₀)_ABIf P is in the PZ region when the value indicates 0.01 or more, PZ determination can be performed.
[0054]
PZ determination method 5: A method of obtaining a reaction rate ratio from a plurality of measurement values by using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement.
From the data of Table 3, FIG. 8 shows the ratio of the fluorescence intensity to the antigen concentration and the reaction rate ratio V (λ₇₀₀)_AB/ V (λ₇₀₀)_ACWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs at 20,000 IU / ml or more with only fluorescence intensity, but V (λ₇₀₀)_AB/ V (λ₇₀₀)_ACIf P is in the PZ region when the value indicates 2.0 or more, PZ determination can be performed.
[0055]
PZ determination method 6: A method of obtaining a difference in reaction rate from a plurality of measured values by using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement.
From the data in Table 3, FIG. 9 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the difference in reaction rate V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₇₀₀)_ACWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs at 20,000 IU / ml or more with only fluorescence intensity, but V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₇₀₀)_ACIf the value is 5.0 or more, if it is the PZ region, PZ determination can be performed.
[0056]
PZ determination method 7: A method of using a reaction time from a plurality of measured values until reaching a maximum reaction rate using an absorbance measurement result in addition to a fluorescence measurement result.
T in Table 3₇₀₀From the data of max, the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the time to reach the maximum reaction rate are plotted in FIG. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs at 20,000 IU / ml or more with only fluorescence intensity, but t₇₀₀If it is determined that the region is the PZ region when max indicates 0.5 or less, the PZ determination can be performed.
[0057]
PZ determination method 8: A method of performing two-wavelength measurement using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and determining from the ratio of absorbance between the two wavelengths in the same manner as the PZ determination method 3.
From the data in Table 3, FIG. 11 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the ratio of absorbance ΔAbs (λ₇₀₀)_AC/ ΔAbs (λ₈₀₀)_ACWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs when the fluorescence intensity alone is 20000 IU / ml or more, but the ratio ΔAbs (λ₇₀₀)_AC/ ΔAbs (λ₈₀₀)_ACPZ determination can be performed if it is in the PZ region when is 1.0 or more.
[0058]
PZ determination method 9: A method of performing two-wavelength measurement using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and determining from the difference in absorbance between the two wavelengths in the same manner as the PZ determination method 4.
From the data in Table 3, FIG. 12 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the difference ΔAbs (λ₇₀₀)_AB−ΔAbs (λ₈₀₀)_ABWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs when the fluorescence intensity alone is 20000 IU / ml or more, but ΔAbs (λ₇₀₀)_AB−ΔAbs (λ₈₀₀)_ABWhen the value is 0.004 or more, if it is the PZ region, PZ determination can be performed.
[0059]
PZ determination method 10: A method of performing two-wavelength measurement using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and determining from the reaction rate ratio between the two wavelengths as in the PZ determination method 5
From the data in Table 3, FIG. 13 shows the ratio of the fluorescence intensity to the antigen concentration and the reaction rate ratio V (λ₇₀₀)_AC/ V (λ₈₀₀)_ACWas plotted. As shown in this figure, the PZ phenomenon occurs at 20,000 IU / ml or more with only fluorescence intensity, but V (λ₇₀₀)_AC/ V (λ₈₀₀)_ACPZ determination can be performed if it is in the PZ region when is 1.0 or more.
[0060]
PZ determination method 11: A method of performing two-wavelength measurement using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and determining from the difference in reaction rate between the two wavelengths as in the PZ determination method 6
Changes in fluorescence intensity and reaction rate difference V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₈₀₀)_ABIf P is in the PZ region when the value indicates 2.0 or more, PZ determination can be performed.
[0061]
Method of using change in absorbance for quantification of concentration
According to the measurement result of FIG. 3, when the HBs antigen concentration is 100 IU / ml or more, the amount of change of the fluorescence intensity with respect to the antigen concentration becomes small. For this reason, the preferable range for the measurement is 100 IU / ml or less only by the measurement result of the fluorescence intensity.
Therefore, it is possible to measure 100 IU / ml or more by performing the following data processing using the result of the change in absorbance together with the measurement result of the fluorescence intensity.
[0062]
Measurement method 1: A method for obtaining a wide measurement range by utilizing the degree of change in absorbance in addition to the result of fluorescence measurement.
From the data in Table 1, FIG. 4 shows the amount of change ΔAbs (λ₇₀₀)_ABWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less only with the fluorescence intensity, but when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, ΔAbs (λ₇₀₀)_ABBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to around 20000 IU / ml.
[0063]
Measurement method 2: A method of calculating a reaction rate from a change in absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and obtaining a wide measurement range using the degree.
From the data in Table 1, FIG. 5 shows the change in the fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the reaction rate V (λ₇₀₀)_ABWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less with only the fluorescence intensity. However, when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, V (λ₇₀₀)_ABBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to around 20000 IU / ml.
[0064]
Measurement method 3: A method of obtaining a ratio of absorbance (transmitted light intensity) from a plurality of measured values by using absorbance measurement results in addition to fluorescence measurement results.
From the data in Table 3, FIG. 6 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the ratio of absorbance ΔAbs (λ₇₀₀)_AB/ ΔAbs (λ₇₀₀)_ACWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less with only fluorescence intensity. However, when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, ΔAbs (λ₇₀₀)_AB/ ΔAbs (λ₇₀₀)_ACBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to 100,000 IU / ml or more.
[0065]
Measurement method 4: A method of taking the difference in absorbance from a plurality of measured values by using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement.
From the data in Table 3, FIG. 7 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the difference ΔAbs (λ₇₀₀)_AC−ΔAbs (λ₇₀₀)_ABWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less with only the fluorescence intensity, but when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, ΔAbs (λ₇₀₀)_AC−ΔAbs (λ₇₀₀)_ABBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to around 4000 IU / ml.
[0066]
Measurement method 5: A method of obtaining a reaction rate ratio from a plurality of measurement values by using an absorbance measurement result in addition to a fluorescence measurement result.
From the data of Table 3, FIG. 8 shows the ratio of the fluorescence intensity to the antigen concentration and the reaction rate ratio V (λ₇₀₀)_AB/ V (λ₇₀₀)_ACWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less only with the fluorescence intensity, but when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, V (λ₇₀₀)_AB/ V (λ₇₀₀)_ACBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to 100,000 IU / ml or more.
[0067]
Measurement method 6: A method of obtaining a difference in reaction rate from a plurality of measured values by using a measurement result of absorbance (transmitted light intensity) in addition to a result of fluorescence measurement.
From the data in Table 3, FIG. 9 shows the change in fluorescence intensity and the difference in absorbance V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₇₀₀)_ACWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less with only the fluorescence intensity, but when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₇₀₀)_ACBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to around 20000 IU / ml.
[0068]
Measurement method 7: A method of performing a two-wavelength measurement using the absorbance measurement result in addition to the fluorescence measurement result, and taking the difference or ratio of the absorbance between the two wavelengths in the same manner as in the above-described measurement methods 3 and 4.
From the data in Table 3, FIG. 10 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the difference ΔAbs (λ₇₀₀)_AB−ΔAbs (λ₈₀₀)_ABWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less with only the fluorescence intensity, but when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, ΔAbs (λ₇₀₀)_AB−ΔAbs (λ₈₀₀)_ABBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to around 20000 IU / ml.
In addition to this result, two-wavelength measurement is performed using the absorbance measurement result, and the absorbance ratio ΔAbs (λ₇₀₀)_AC/ ΔAbs (λ₈₀₀)_ACThe measurement range can be expanded to 400000 IU / ml by adding the measurement of 20000 IU / ml or more using the change of (see FIG. 11).
[0069]
Measurement method 8: A method of performing two-wavelength measurement using the measurement result of absorbance in addition to the result of fluorescence measurement, and taking the difference or ratio of the reaction speed between the two wavelengths in the same manner as the above-described measurement methods 5 and 6.
From the data in Table 3, FIG. 12 shows the change in fluorescence intensity with respect to the antigen concentration and the difference in reaction rate V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₈₀₀)_ABWas plotted. As shown in FIG. 3, the measurement range is 100 IU / ml or less with only the fluorescence intensity, but when the antigen concentration is 100 IU / ml or more, V (λ₇₀₀)_AB−V (λ₈₀₀)_ABBy utilizing this change, the measurement range can be expanded to around 20000 IU / ml.
In addition to this result, two wavelengths are measured using the measurement result of absorbance (transmitted light intensity), and the reaction rate ratio V (λ₇₀₀)_AC/ V (λ₈₀₀)_ACThe measurement range can be expanded to 400000 IU / ml by adding the measurement of 20000 IU / ml or more using the change of (see FIG. 13).
[0070]
[Table 3]

[0071]
[Table 4]

[0072]
[Table 5]

[0073]
【The invention's effect】
According to the present invention, in an antigen-antibody reaction using insoluble magnetic particles and insoluble fluorescently labeled particles, prozone determination can be performed, and antigens or antibodies in a wide range of concentrations can be quantified.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of a photometric mechanism incorporating a filter that can be used in the measurement method of the present invention. (A) is the top view, (b) is the sectional view in the A-A 'line.
FIG. 2 is a diagram showing an example of a diffraction grating built-in photometry mechanism that can be used in the measurement method of the present invention. (A) is the top view, (b) is the sectional view in the A-A 'line.
FIG. 3 is a graph showing a relationship between an absorbance parameter and an antigen concentration.
FIG. 4 is a diagram showing a relationship between an absorbance parameter and an antigen concentration.
FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
FIG. 6 is a diagram showing a relationship between an absorbance parameter and an antigen concentration.
FIG. 7 is a graph showing the relationship between absorbance parameters and antigen concentration.
FIG. 8 is a graph showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
FIG. 10 is a graph showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
FIG. 11 is a graph showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
FIG. 12 is a graph showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
FIG. 13 is a diagram showing the relationship between the absorbance parameter and the antigen concentration.
[Explanation of symbols]
10 Rotating table
12 reaction vessels
70 light source
71 half mirror
72 Filter for excitation light
73 Mirror
74 Fluorescence standard
75 Shutter with mirror
76 Filter for fluorescence
81 Fluorescence detector
82 Diffraction grating
83 Detection array for transmitted light
84 Filter for transmitted light
85 Detector for transmitted light
86 Filter plate rotation motor
87 Filter plate

Claims

In the method for quantitatively measuring an antigen or antibody in a liquid medium by the following steps (a) to (c), the intensity of transmitted light or scattered light accompanying the reaction in step (a) is measured. Method for measuring antigen or antibody.
(A) an antigen or antibody to be measured, a first reagent comprising insoluble magnetic particles carrying the antigen or the antibody against the antibody or the antigen, and an insoluble label carrying the antibody or the antigen against the antigen or the antibody Reacting a second reagent containing particles in a liquid medium.
(B) Separating unreacted insoluble magnetic particles and agglomerated particles containing insoluble magnetic particles from the reaction mixture by applying a magnetic field to the reaction mixture of step (a), and then separating the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles Removing.
(C) A step of quantitatively measuring the antigen or antibody by quantifying the amount of the insoluble labeled particles reacted with the remaining insoluble magnetic particles.

The method for measuring an antigen or antibody according to claim 1, wherein prozone determination is performed from the measured value of the intensity of transmitted light or scattered light in the step (a).

A calibration curve of the intensity of transmitted light or scattered light obtained by measuring a known concentration of antigen or antibody in advance when it is determined to be a region other than the prozone region by performing prozone determination, and insoluble labeled particles of based on the amount by using the calibration curve to quantify the concentration of the antigen or antibody, the measurement of step (c) in the region of change is large measurement results in the concentration is low step (c), the concentration is high step ( 3. The method for measuring an antigen or antibody according to claim 2 , wherein the measurement value of step (a) is adopted in a region where the change amount of the measurement result in c) is small .

Using insoluble fluorescently labeled particles as the insoluble labeled particles, the amount of insoluble fluorescently labeled particles in the step (c) is measured by fluorescence intensity, and a calibration curve of fluorescence intensity obtained by measuring an antigen or antibody at a known concentration in advance is used. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the antigen or antibody is quantified.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein a reaction rate is calculated from a change in transmitted light or scattered light accompanying the reaction in the step (a), and the degree is used.

Of the measured values of the change in transmitted light or scattered light accompanying the reaction in the step (a), the ratio or difference of scattered light is calculated from the measured values at a plurality of different reaction times, and the degree is used. 4. A method according to any one of claims 1-3.

A reaction rate is calculated from a change in transmitted light or scattered light accompanying the reaction in the step (a), a ratio or difference of reaction rates at a plurality of different reaction times is obtained, and the degree is used. Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3.

Changes in transmitted light or scattered light accompanying the reaction in the step (a) are measured at a plurality of different wavelengths, a ratio or difference of scattered light is calculated from the measurement results, and the degree is used. The method according to claim 1.

The change in transmitted light or scattered light accompanying the reaction in the step (a) is measured at a plurality of different wavelengths, the reaction rate is calculated from the measured values, and the ratio or the degree of difference is used. Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3.

In the step (a), a third reagent containing insoluble nonmagnetic unlabeled particles carrying an antibody or antigen against the antigen or antibody to be measured is used. The method described.

The method of claim 10, wherein the use an antibody to be supported on the insoluble label particles, the titer of different antibody as the antibody to be carried on the insoluble magnetic unlabelled particles.