JP3691363B2

JP3691363B2 - Method for removing polymerase reaction inhibitor

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Publication number: JP3691363B2
Application number: JP2000225218A
Authority: JP
Inventors: 源河野; 浩章井上; 正行梶谷
Original assignee: アクアス株式会社
Priority date: 2000-07-26
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2020-07-26
Also published as: JP2002034570A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の原生生物（原核原生生物および真核原生生物）（本発明では「微生物」と云う）の核酸の一部をポリメラーゼを用いて合成・増幅する（本発明では「ポリメラーゼ反応」と云う）際に、その阻害物質を除去するために、前処理としておこなうポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８５年のＤＮＡポリメラーゼの伸張反応を利用したポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」とも云う）に関するＫ．Ｍｕｌｌｉｓ等による最初の報告以来、その非常に高い感度と特異性が着目され、微生物研究分野や臨床検査分野等において、微生物検出へのＰＣＲ技術の応用が盛んに進められて来た。
【０００３】
このポリメラーゼ連鎖反応技術を応用して、空調冷却水等の環境試料や食品、尿、血液等の生物試料等の検体から微生物検出をおこなう場合、このような試料中にはＰＣＲに使用されるポリメラーゼによる合成反応を阻害する物質（本発明において「ポリメラーゼ反応阻害物質」と云う）が含まれている場合が多く、ターゲット核酸が存在するにもかかわらず、ＰＣＲが陰性（偽陰性）となる誤った結果が得られる場合がある。
【０００４】
このようなポリメラーゼ反応阻害物質としてどのような物質があるかについてはいまだ完全には解明されていないが、ポリメラーゼ反応阻害物質の除去には種々の異なる方法が提案されている。例えば、試料中の阻害物質が水溶性であれば、試料を遠心分離して微生物を沈殿させ、洗浄操作を繰り返すことにより、上清画分に存在する阻害物質を簡単に除去できる。また、阻害物質が不溶性の無機金属である場合は、核酸抽出後の試料を塩酸酸性にして、核酸を沈殿させ、そのときの上清画分の無機金属成分を除去することができる。
【０００５】
一方、阻害物質が既知のものであればその濃度を測定し、ポリメラーゼ反応阻害を受けない程度の濃度となるまで試料を希釈してＰＣＲを利用した微生物検出をおこなうことができる。また、試料中のターゲット核酸を有機溶媒処理により阻害を受けない程度までに精製してＰＣＲを利用した微生物検出をおこなう方法もある。
【０００６】
しかしながら、ポリメラーゼ反応を応用した微生物検出において、空調冷却水等の環境水や食品、尿、血液等の生物試料等を検体として用いる場合、水溶性のポリメラーゼ反応阻害物質のみならず、不溶性のポリメラーゼ反応阻害物質が同時に含まれることが多い。
【０００７】
この場合、従来の物理的方法のみでは、微生物と不溶性阻害物質を分離することが困難なため、先ず遠心分離等で水溶性の阻害物質を除去し、その沈澱画分からＤＮＡ抽出液を調製した後、ポリメラーゼ反応阻害物質を除去することが必要であった。
【０００８】
しかし、これら不溶性のポリメラーゼ反応阻害物質はＤＮＡと同じ挙動を示すものが多い。すなわち、ＤＮＡ抽出前は不溶性でありながらＤＮＡ抽出後には可溶性画分に移行してＰＣＲによる微生物検出を阻害する。そのため上記の除去操作を組み合わせてＤＮＡを精製することが困難であった。また、不溶性の阻害物質を除去する操作では、核酸の回収率が低下し、ＰＣＲによる微生物検出の結果が偽陰性となる等の問題もあった。
【０００９】
このように、試料中の微生物をＰＣＲにより検出する方法において、正確な測定結果を得るため、試料中に含まれるポリメラーゼ反応阻害物質除去が不可欠であるにもかからず、このような阻害物質を除去できる簡便な方法は知られていなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、試料中に含まれるポリメラーゼ反応阻害物質を磁気分離という簡単な操作で除去できる精度の高いポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記従来の問題点について鋭意検討をおこなったところ、微生物が磁性体粒子に吸着するのにもかかわらず、不溶性のポリメラーゼ反応阻害物質は磁性体粒子に吸着しないことを見出し本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明のポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法は上記課題を解決するため、請求項１に記載の通り、微生物が存在する試料中のポリメラーゼ反応阻害物質を除去し、該微生物を生菌として回収するポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法であって、微生物を磁性体粒子に吸着させ、磁石を利用した磁気分離により試料中の非吸着画分に存在するポリメラーゼ反応の阻害物質を除去する吸着・磁気分離工程、塩化物イオン、硝酸イオンおよび硫酸イオンの少なくとも１種を有し、かつ、これらの塩化物イオン、硝酸イオンおよび硫酸イオンの濃度の和が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である塩溶液を用いて微生物を吸着した磁性体粒子を洗浄する洗浄工程、及び、上記磁性体粒子に吸着した微生物をリン酸塩溶液を脱離処理液として用いて該磁性体粒子から生存した状態で脱離させる脱離工程を有するポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法である。
【００１３】
このような本願発明特有の構成により、従来、ＰＣＲによる微生物の検出において、不溶性のポリメラーゼ反応阻害物質の存在のため偽陰性となりやすかった試料であっても正確な検出が可能となり、かつ、容易におこなうことができる。また、ＰＣＲによる微生物検出に限らず、試料中の原生生物の核酸をポリメラーゼを用いて合成、増幅する際にポリメラーゼ反応の阻害物質を容易に除去することが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法において、用いる磁性体粒子の粒径は小さい程、相対的に磁性体粒子重量当りの微生物に対する吸着面積が増えて好ましいが、０．１μｍ以下では磁石への吸着力が低下するため、０．１μｍ以上、１００μｍ以下であることが好ましい。
このような磁性体粒子としてはフェライト粒子があるが、その中で、特に四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）が入手しやすく、取り扱いが容易である。
【００１５】
また、本発明における吸着・磁気分離工程において、微生物とともに磁性体粒子に付着したポリメラーゼ反応阻害物質を洗浄・除去する際には、吸着した微生物を脱離或いは死滅させない条件を選択する必要がある。そのため、洗浄には塩化物イオン、硝酸イオンおよび硫酸イオンの少なくとも１種を有し、かつ、これらの塩化物イオン、硝酸イオンおよび硫酸イオンの濃度の和が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である塩溶液を用いることが望ましく、洗浄に用いるこれら塩溶液には、後述するようなリン酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩などの、吸着した微生物を脱離させる物質が、含有されていないことが望ましく、微生物を脱離させる性質が発現する濃度より充分低いことが必要である。なお、洗浄に用いる塩溶液の陽イオンは磁性体粒子に吸着した微生物に影響がないように適宜選択する。
【００１６】
このように磁性体粒子に微生物を吸着させた後、磁石を利用して微生物を吸着した磁性体粒子を、その他の不溶性成分と分離（磁気分離）する。例えば、磁性体の入った容器の外側から磁石を近づけて容器内壁に微生物を吸着した磁性体を集めておいて、ピペットで液相を吸い取ることにより、容易に非吸着画分を除くことができる。
【００１７】
このように吸着・磁気分離工程により取り出した微生物を吸着した磁性体粒子から微生物を生存した状態（以後、「生菌」とも云う）で脱離させる生菌脱離工程を有することにより既に死んでいる菌のＤＮＡを生菌のものとしてカウントする誤差の発生のおそれもなく、ＰＣＲによる微生物検出を精度良く容易におこなうことができる。
【００１８】
このような生菌脱離工程で、磁性体粒子に吸着した微生物を生菌として脱離させる際には、リン酸塩溶液、硫酸イオンを含有する塩溶液、エチレンジアミン四酢酸塩溶液などを用いることができるが、なかでもリン酸塩溶液を脱離処理液として用いることにより、特異的に極めて回収率の高い脱離が可能となる。このときの脱離処理液中のリン酸塩濃度は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であると充分な脱離が可能となるが、特に１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であると非常に高い回収率での脱離が可能となる。リン酸塩濃度の上限としては、検出目的の微生物が死滅しない濃度であることが必要である。
なお、上記脱離処理液のｐＨは５．５以上８．５以下であることが好ましく、特に好ましい範囲は６．５以上７．５以下である。
【００１９】
このようにして上記の吸着・磁気分離工程および生菌脱離工程操作により微生物を脱離させた後は、たとえば、通常の操作に従い、核酸抽出をおこなって試料中の核酸をポリメラーゼを用いて合成・増幅することが可能であり、ＰＣＲによる微生物の検出をおこなうことにより、試料中の目的とする微生物を検出できる。
【００２０】
なお、吸着・磁気分離工程に先だって、従来おこなわれていた可溶性ポリメラーゼ反応阻害物質除去をおこなっても良いが、これら可溶性ポリメラーゼ反応阻害物質が磁性体粒子に吸着しないことが明らかな場合には可溶性ポリメラーゼ反応阻害物質の除去工程を省くことができる。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明のポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法についてＰＣＲの例を挙げて具体的に説明する。
【００２２】
〔従来技術による比較例〕
Ａ．まず、試料作成・ＰＣＲ条件について示す。
（試料の採取・前処理）
空調用冷却塔から採取した試料水４００ｍＬを６０００ｒｐｍ・３０分間の条件で遠心分離して、得られた沈殿を４ｍＬの滅菌蒸留水に懸濁させ、ＰＣＲによる微生物検出の試料（以下、「微生物検出試料」と略す）とした。
【００２３】
（ＤＮＡ抽出）
微生物検出試料からのＤＮＡ抽出は、以下の操作方法でおこなった。
（１）微生物検出試料１ｍＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブにとり、１２０００ｒｐｍ・１５分間の条件で遠心分離し、上清９５０μＬを捨てる。
（２）５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ＮａＯＨ水溶液を５０μＬ添加し、ポルテックスミキサーで良く攪拌する。
（３）沸騰水浴中で１５分間、加熱する。
（４）１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１０μＬ添加し、中和する。
【００２４】
（ＰＣＲによる検出）
ＰＣＲの操作は、常法に従い下記の手順でおこなった。
（１）ＰＣＲ用チューブに以下の組成で反応液を調製した。
【００２５】
【表１】
────────────────────────────────────
蒸留水：５．５μＬ
１０ｘＰＣＲバッファー：２．０μＬ
ｄＮＴＰストック溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ・ストック）：１．６μＬ
プライマー１（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：０．４μＬ
プライマー２（１０ｐｍｏｌ／μＬ）：０．４μＬ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）：０．１μＬ
ＤＮＡ抽出液（上記方法で調整したもの）：１０．０μＬ
────────────────────────────────────プライマー１：ＬＥＧ４４８−Ａ（５’−ＧＡＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧ
ＧＴＴＡＡＧＡＧＣ−３’）（配列番号１）
プライマー２：ＬＥＧ８５４−Ｂ（５’−ＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＡＴ
ＣＧＣＧＴＴＴＧＣＴ−３’）（配列番号２）
【００２６】
（２）ＰＣＲ条件
表２にその条件を簡単に示す。
【００２７】
【表２】
──────────────────
熟変性：９４℃×３０秒
↓
アニーリング：６５℃×３０秒
↓
伸長反応：７２℃×１分
サイクル数：４０サイクル
──────────────────
【００２８】
（３）ＰＣＲ生成物の分析
アガロースゲル電気泳動によった。
【００２９】
Ｂ．結果および考察
空調用冷却塔から採取した試料３１検体について、レジオネラ属細菌を検出するため、上記の（１）〜（３）に示した方法に従い、ＰＣＲによる検出をおこなった。
【００３０】
レジオネラ属細菌の検出プライマーとして、１６Ｓリボソーム遺伝子の塩基配列を持つ２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれの塩基配列は、配列表の配列番号１及び２参照）を使用した。なお、対照として、ＷＹＯα培地でレジオネラ属細菌のコロニー数を計測した。
その結果を表３および表４に示した。コロニー計測によりレジオネラ属細菌が検出された検体の中で、８検体の試料がＰＣＲの結果が陰性、すなわち偽陰性であった。
【００３１】
【表３】

【００３２】
【表４】

【００３３】
ここで、上記の表３および表４で偽陰性を示した８検体の中に、ポリメラーゼ反応阻害物質が存在すると考え、ＤＮＡ抽出前の菌体を蒸留水で洗浄したが効果がなく、不溶性の成分が主たる阻害物質であることが判明した。
【００３４】
次にこれら８検体につき、抽出されたＤＮＡを常法に従い、フェノール／クロロホルム処理及びイソプロピルアルコール沈殿をおこなって精製した後、ＰＣＲによる検出をおこなった。
【００３５】
上記８検体中３検体はＰＣＲ陽性となったが、残りの５検体はＰＣＲ陰性となり、有機溶媒による処理によっても阻害物質を除去することができなかった。
さらに、塩酸溶液（０．１Ｎ）処理やＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）処理についても検討したが、すべて効果がなかった。
【００３６】
〔本発明による実施例〕
（微生物の磁性体粒子への吸着の確認）
磁性体粒子（キシダ化学（株）製「四三酸化鉄」、３２５メッシュ。以下、「マグネタイト」と略す）に対する各種細菌の吸着性を評価した。
（１）供試細菌：表５参照
【００３７】
【表５】

【００３８】
（２）実験方法：５０ｍＬ平底フラスコに、蒸留水３０ｍＬとマグネタイト６０ｍｇ（０．２％）を入れ、１２１℃・１５分条件でのオートクレーブ滅菌をおこない、上記供試菌株を培養して調製した菌体懸濁液を菌数が約１０⁴ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加して、振盪培養器（１６０ｒｐｍ、室温）で振盪し、磁気分離により経時的に非吸着画分を採取して、残存する細菌数を計測した。
【００３９】
（３）結果を図１に示したが、いずれの細菌も１０分間の接触で殆ど１００％吸着された。従って、マグネタイトへの細菌の吸着は、グラム陽性及び陰性の菌に共通の現象であることが認められた。（図１中Ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ）
【００４０】
（磁性体粒子からの生菌としての脱離の検討）
大腸菌を用いて、マグネタイトに吸着した細菌を生菌として回収する脱離処理液の組成について試験をおこなった。
【００４１】
（１）マグネタイトへの吸着：上記の実験方法に同じ。
（２）マグネタイトからの大腸菌の回収：大腸菌を吸着したマグネタイトを磁気分離により回収した後、蒸留水３０ｍＬで１回洗浄した。次に、３０ｍＬの脱離処理液を加え、充分に攪拌した後、磁気分離により非吸着画分を採取し、コロニー法にて生菌数を計測した。その結果を表６に示した。
【００４２】
【表６】

【００４３】
（３）結果：リン酸濃度として１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０）の濃度の希釈溶液を用いた場合、ほぼ全て生菌として回収できた。
一方、食塩（ＮａＣｌ）水溶液、或いは、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ₃）水溶液では濃度を５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ間で変化させても殆ど脱離せず、また硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）水溶液の場合、濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下では殆ど脱離しなかった。
【００４４】
また、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム水溶液の場合、濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌでは、約４０％が回収できたが、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度では逆に回収率が低下する傾向が見られた。これは、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）の濃度が高くなると、微生物の細胞膜や細胞壁の構成成分であるマグネシウムなどの金属がＥＤＴＡによって除去され、その結果生菌としての回収率が低下するものと考えられる。
【００４５】
これらの結果から、微生物を吸着したマグネタイトの洗浄には塩化物イオン、硝酸イオンおよび硫酸イオンの中から少なくとも一つの負イオンを有し、かつ、これらの塩化物イオン、硝酸イオンおよび硫酸イオンの濃度の和が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である塩溶液を用いるのが好ましく、一方、マグネタイトに吸着した微生物の脱離には１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のリン酸イオンを含む塩溶液が特に有効であることが判った。
【００４６】
なお、上記金属イオンを有する溶液とは別に、吸着した細菌を脱離させるのに有効と考えられる界面活性剤による細菌の脱離について検討した。
検討は界面活性剤のうち、最も細菌に対して影響が少ないと思われる非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate）をさまざまな濃度で希釈して検討したが、いずれの濃度であってもリン酸塩溶液に比して低い回収率であり、満足できる値ではなかった。
【００４７】
（ｐＨの影響の検討）
大腸菌を用いて、マグネタイトに吸着した細菌を生菌として回収する脱離処理液のｐＨの影響について試験した。
（１）マグネタイトへの吸着：上記の実験方法に同じ。
【００４８】
（２）マグネタイトからの大腸菌の回収：ｐＨ４．０〜８．５の１０ｍｍｏｌ／Ｌ・リン酸緩衝液を使用して、上記と同様にして、マグネタイトから脱離・回収される大腸菌の生菌数を計測した。
（３）結果：ｐＨが５．５以上８．５以下の場合で６０％以上の回収、ｐＨが６．５以上７．５以下でほぼ完全に生菌として回収された。
【００４９】
（レジオネラ属細菌での確認）
上記で大腸菌を用いて検討して得られたマグネタイトからの回収条件をレジオネラ属細菌で確認した。
ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｂｏｚｅｍａｎｉｉＧＩＦＵ９１４０（レジオネラボゼマニイ）をマグネタイトに吸着させて実験をおこなった結果、大腸菌と同様にリン酸濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のリン酸緩衝液でほぼ完全に生菌として回収できた。
【００５０】
（実際の空調用冷却水系水での確認）
空調用冷却塔から採取した試料水（冷却水）で、レジオネラ属細菌がコロニー法で検出され、かつ、従来の前処理方法を伴うＰＣＲによる検出で結果が偽陰性であった試料も含めて１０検体について、次のように磁性体吸着／洗浄／脱離の処理後、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによる検出をおこなった。
その結果を表７に示した。
【００５１】
【表７】

【００５２】
（１）磁性体粒子吸着
１ｍＬの微生物検出試料（比較例と同様の方法で調製）を１．５ｍＬマイクロチューブにとり、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分）をおこなった後、沈殿に１ｍＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ・ＮａＣｌ水溶液を加えて懸濁させ、５０μＬのマグネタイト懸濁液（２００ｍｇ／ｍＬ蒸留水）を添加し、３０分間、充分に転倒混和させた。次いで、磁石を用いて磁気分離し、非吸着画分を捨て、該マグネタイトに１０ｍｍｏｌ／Ｌ・ＮａＣｌ水溶液ｌｍＬを加えて洗浄した。再度、磁気分離をおこない、非吸着画分を除去し、微生物を吸着させたマグネタイトにリン酸塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌになるよう希釈調整したリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを加え、良く攪拌し、微生物を脱離させた。磁気分離をおこない、得られた液（脱離した微生物が存在する液）は別のマイクロチューブに移した。マグネタイトにリン酸塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調整したリン酸緩衝液１ｍＬを加えて洗浄をおこない、脱離した微生物が存在する液と洗浄液を合わせ、ＤＮＡ抽出用試料を調製した。
【００５３】
（２）ＤＮＡ抽出
上記のＤＮＡ抽出用試料を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分）し、上清画分９５０μＬを取り除いた後、５０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ＮａＯＨ水溶液を添加、沸騰浴水中で１５分間保持し、ＤＮＡを抽出した。次いで、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０μＬを添加して中和した。このうち１０μＬをＰＣＲ用試料とした。
（３）ＰＣＲ：従来例同様の方法に従って、レジオネラ属細菌の検出をおこなった。
【００５４】
（４）結果：吸着・磁気分離工程により、ポリメラーゼ反応阻害物質が除去され、偽陰性を示した試料もすべてＰＣＲ陽性となり、コロニー法の結果と一致した。
なお、コロニー法では検出下限以下であったためレジオネラ属細菌が検出できなかった２検体からもＰＣＲによってレジオネラ属菌の存在が検出された。このことからも本発明にかかるポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法によれば、検出感度が著しく向上することが証明された。
【００５５】
なお、上記においては本発明のポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法をＰＣＲによる微生物検出について応用した例について説明したが、本発明はＰＣＲによる微生物検出のみならず、その他のポリメラーゼ反応を応用する技術、たとえば鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いる遺伝子増幅法（ＴｓｕｇｕｎｏｒｉＮｏｔｏｍｉ等：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓａｅｒｃｈ、２８（１２），２０００）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ合成、及びファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ鎖からのＲＮＡ合成（三浦謹一郎等編・著：「タンパク質工学」、Ｐ６０〜Ｐ８６、１９８８年発行、啓学出版）などに応用可能である。
【発明の効果】
本発明のポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法は、微生物を磁性体粒子に吸着させ、磁石を利用した磁気分離により試料中の非吸着画分に存在するポリメラーゼ反応阻害物質を除去する吸着・磁気分離工程を有するポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法であって、容易な操作で極めて精度の高い優れたポリメラーゼ反応阻害物質の除去方法である。
【００５６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】マグネタイトに対する各種細菌の吸着性を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention synthesizes and amplifies a part of nucleic acid of protists (prokaryotes and eukaryotes) (referred to as “microorganism” in the present invention) in a sample using a polymerase (in the present invention, “polymerase reaction”). It is related with the removal method of the polymerase reaction inhibitory substance performed as pre-processing in order to remove the inhibitory substance.
[0002]
[Prior art]
1985, a polymerase chain reaction (hereinafter also referred to as “PCR”) using an extension reaction of DNA polymerase. Since the first report by Mullis et al., Its extremely high sensitivity and specificity have attracted attention, and the application of PCR technology to microbial detection has been actively promoted in the field of microbial research and clinical testing.
[0003]
When using this polymerase chain reaction technology to detect microorganisms from specimens such as environmental samples such as air-conditioning cooling water and biological samples such as food, urine and blood, the polymerase used for PCR is included in such samples. In many cases, it contains a substance that inhibits the synthesis reaction due to (in the present invention, referred to as “polymerase reaction inhibitory substance”), and the PCR becomes negative (false negative) despite the presence of the target nucleic acid. Results may be obtained.
[0004]
Although what kind of substance is present as such a polymerase reaction inhibitor has not yet been fully elucidated, various different methods have been proposed for removing the polymerase reaction inhibitor. For example, if the inhibitory substance in the sample is water-soluble, the inhibitory substance present in the supernatant fraction can be easily removed by centrifuging the sample to precipitate microorganisms and repeating the washing operation. When the inhibitor is an insoluble inorganic metal, the sample after nucleic acid extraction can be acidified with hydrochloric acid to precipitate the nucleic acid, and the inorganic metal component of the supernatant fraction at that time can be removed.
[0005]
On the other hand, if the inhibitor is known, its concentration can be measured, and the sample can be diluted to a concentration at which the polymerase reaction is not inhibited, and microorganism detection using PCR can be performed. There is also a method for detecting microorganisms using PCR by purifying a target nucleic acid in a sample to an extent that it is not inhibited by treatment with an organic solvent.
[0006]
However, in the detection of microorganisms using the polymerase reaction, when using environmental water such as air-conditioning cooling water or biological samples such as food, urine, blood, etc. as samples, not only water-soluble polymerase reaction inhibitors but also insoluble polymerase reactions Inhibitors are often included at the same time.
[0007]
In this case, since it is difficult to separate microorganisms and insoluble inhibitors only by conventional physical methods, first, water-soluble inhibitors are removed by centrifugation or the like, and a DNA extract is prepared from the precipitated fraction. It was necessary to remove the polymerase reaction inhibitor.
[0008]
However, many of these insoluble polymerase reaction inhibitors exhibit the same behavior as DNA. That is, although it is insoluble before DNA extraction, it shifts to a soluble fraction after DNA extraction and inhibits microorganism detection by PCR. Therefore, it has been difficult to purify DNA by combining the above removal operations. Further, in the operation of removing insoluble inhibitory substances, there are problems such as a decrease in nucleic acid recovery rate and a false negative result of microorganism detection by PCR.
[0009]
Thus, in the method of detecting microorganisms in a sample by PCR, in order to obtain an accurate measurement result, removal of a polymerase reaction inhibitor contained in the sample is indispensable. A simple method that can be removed has not been known.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such problems of the prior art, and the object of the present invention is to have an accuracy capable of removing a polymerase reaction inhibitor contained in a sample by a simple operation of magnetic separation. It is to provide a method for removing a high polymerase reaction inhibitor.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on the above-mentioned conventional problems, the present inventors have found that insoluble polymerase reaction inhibitory substances do not adsorb to magnetic particles despite the fact that microorganisms adsorb to magnetic particles. It came to.
[0012]
That is, in order to solve the above problems, the method for removing a polymerase reaction inhibitor of the present invention removes a polymerase reaction inhibitor from a sample in which a microorganism is present, and collects the microorganism as a living bacterium as described in claim 1. A method for removing polymerase reaction inhibitors that adsorbs microorganisms to magnetic particles and removes inhibitors of polymerase reactions present in non-adsorbed fractions in samples by magnetic separation using magnets. And a microorganism using a salt solution having at least one kind of step, chloride ion, nitrate ion and sulfate ion, and the sum of the concentrations of chloride ion, nitrate ion and sulfate ion is 10 mmol / L or less. A washing step for washing the adsorbed magnetic particles, and the microorganisms adsorbed on the magnetic particles using a phosphate solution as a desorption treatment solution. A method of removing the polymerase reaction inhibiting substance having a desorption step of desorbing while surviving from the body particles.
[0013]
Such a configuration peculiar to the present invention makes it possible to accurately detect even a sample that has been prone to false negatives due to the presence of an insoluble polymerase reaction inhibitor in the conventional detection of microorganisms by PCR. Can be done. In addition to detection of microorganisms by PCR, it is possible to easily remove an inhibitor of polymerase reaction when a protist nucleic acid in a sample is synthesized and amplified using a polymerase.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the method for removing a polymerase reaction inhibitor of the present invention, the smaller the particle size of the magnetic particles used, the more preferably the adsorption area for microorganisms per weight of the magnetic particles increases. Since adsorption power falls, it is preferred that it is 0.1 micrometer or more and 100 micrometers or less.
Such magnetic particles include ferrite particles. Among them, iron trioxide (Fe ₃ O ₄ ) is particularly easy to obtain and handle.
[0015]
Further, in the adsorption / magnetic separation step of the present invention, when washing and removing the polymerase reaction inhibitor adhering to the magnetic particles together with the microorganisms, it is necessary to select conditions that do not cause the adsorbed microorganisms to be detached or killed. Therefore, a salt solution having at least one kind of chloride ion, nitrate ion and sulfate ion and having the sum of the concentration of chloride ion, nitrate ion and sulfate ion of 10 mmol / L or less is used for washing. Desirably, these salt solutions used for washing do not contain substances that desorb adsorbed microorganisms, such as phosphates and ethylenediaminetetraacetate, which will be described later. It is necessary to be sufficiently lower than the concentration at which the property to be developed is expressed. The cation of the salt solution used for washing is appropriately selected so as not to affect the microorganisms adsorbed on the magnetic particles.
[0016]
After the microorganisms are adsorbed on the magnetic particles in this way, the magnetic particles on which the microorganisms are adsorbed are separated from other insoluble components (magnetic separation) using a magnet. For example, the non-adsorbed fraction can be easily removed by collecting the magnetic material adsorbing microorganisms on the inner wall of the container by bringing the magnet close to the outside of the container containing the magnetic material and sucking out the liquid phase with a pipette. .
[0017]
In this way, it has already survived by having a microbial detachment step of detaching the microorganisms from the magnetic particles adsorbed by the adsorption / magnetic separation process in a living state (hereinafter also referred to as “viable bacteria”). Detection of microorganisms by PCR can be performed easily and accurately without the risk of generating errors in counting the DNA of existing bacteria as viable bacteria.
[0018]
When detaching microorganisms adsorbed on magnetic particles as viable bacteria in such a viable detachment process, use a phosphate solution, a salt solution containing sulfate ions, an ethylenediaminetetraacetate solution, or the like. In particular, by using a phosphate solution as a desorption treatment solution, desorption with a particularly high recovery rate can be achieved. At this time, when the phosphate concentration in the desorption treatment solution is 0.1 mmol / L or more, sufficient desorption is possible. Particularly, when the concentration is 10 mmol / L or more, desorption with a very high recovery rate is possible. Is possible. The upper limit of the phosphate concentration is required to be a concentration at which the detection-target microorganism is not killed.
The pH of the desorption treatment solution is preferably 5.5 or more and 8.5 or less, and particularly preferably 6.5 or more and 7.5 or less.
[0019]
After the microorganisms are desorbed by the above-described adsorption / magnetic separation step and live cell desorption step operation in this way, for example, according to the normal operation, nucleic acid extraction is performed and the nucleic acid in the sample is synthesized using a polymerase. Amplification is possible, and the target microorganism in the sample can be detected by detecting the microorganism by PCR.
[0020]
Prior to the adsorption / magnetic separation step, conventional removal of soluble polymerase reaction inhibitory substances may be performed, but if it is clear that these soluble polymerase reaction inhibitory substances do not adsorb to magnetic particles, soluble polymerases are removed. The step of removing the reaction inhibiting substance can be omitted.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the method for removing a polymerase reaction inhibitor of the present invention will be specifically described with reference to PCR.
[0022]
[Comparative example using conventional technology]
A. First, sample preparation / PCR conditions will be described.
(Sample collection / pretreatment)
400 mL of sample water collected from the cooling tower for air conditioning is centrifuged at 6000 rpm for 30 minutes, and the resulting precipitate is suspended in 4 mL of sterilized distilled water, and a microorganism detection sample by PCR (hereinafter referred to as “microorganism detection”). Abbreviated as “sample”).
[0023]
(DNA extraction)
DNA extraction from the microorganism detection sample was performed by the following operation method.
(1) Take 1 mL of the microorganism detection sample in a 1.5 mL Eppendorf tube, centrifuge at 12000 rpm for 15 minutes, and discard 950 μL of the supernatant.
(2) Add 50 μL of 50 mmol / L NaOH aqueous solution and stir well with a portex mixer.
(3) Heat in a boiling water bath for 15 minutes.
(4) Add 10 μL of 1M Tris-HCl buffer (pH 7.0) and neutralize.
[0024]
(Detection by PCR)
The PCR operation was performed according to the following procedure according to a conventional method.
(1) A reaction solution was prepared in a PCR tube with the following composition.
[0025]
[Table 1]
────────────────────────────────────
Distilled water: 5.5 μL
10 × PCR buffer: 2.0 μL
dNTP stock solution (10 mmol / L · stock): 1.6 μL
Primer 1 (10 pmol / μL): 0.4 μL
Primer 2 (10 pmol / μL): 0.4 μL
Taq DNA polymerase (5 U / μL): 0.1 μL
DNA extract (prepared by the above method): 10.0 μL
──────────────────────────────────── Primer 1: LEG448-A (5'-GAG GGT TGA TAG
GTT AAG AGC-3 ′) (SEQ ID NO: 1)
Primer 2: LEG854-B (5′-CGG TCA ACT TAT
CGC GTT TGC T-3 ′) (SEQ ID NO: 2)
[0026]
(2) PCR conditions Table 2 briefly shows the conditions.
[0027]
[Table 2]
──────────────────
Ripening: 94 ° C x 30 seconds ↓
Annealing: 65 ° C x 30 seconds ↓
Elongation reaction: 72 ° C x 1 minute Number of cycles: 40 cycles ──────────────────
[0028]
(3) Analysis of PCR product Agarose gel electrophoresis was used.
[0029]
B. Results and Discussion In order to detect Legionella bacteria, 31 samples collected from the cooling tower for air conditioning were detected by PCR according to the methods shown in (1) to (3) above.
[0030]
As detection primers for Legionella bacteria, two types of synthetic oligonucleotide primers having the base sequence of the 16S ribosome gene (for the respective base sequences, see SEQ ID NOS: 1 and 2) were used. As a control, the number of colonies of Legionella bacteria was counted in a WYOα medium.
The results are shown in Tables 3 and 4. Among the samples in which Legionella bacteria were detected by colony counting, 8 samples had negative PCR results, that is, false negatives.
[0031]
[Table 3]

[0032]
[Table 4]

[0033]
Here, it was considered that a polymerase reaction inhibitory substance was present in the 8 specimens that showed false negatives in Tables 3 and 4 above, and the cells before DNA extraction were washed with distilled water. The ingredient was found to be the main inhibitor.
[0034]
Next, for these 8 specimens, the extracted DNA was purified by phenol / chloroform treatment and isopropyl alcohol precipitation according to a conventional method, and then detected by PCR.
[0035]
Although 3 of the 8 samples were PCR positive, the remaining 5 samples were PCR negative, and the inhibitor could not be removed even by treatment with an organic solvent.
Furthermore, the hydrochloric acid solution (0.1N) treatment and the DMSO (dimethyl sulfoxide) treatment were also examined, but all had no effect.
[0036]
Example according to the present invention
(Confirmation of adsorption of microorganisms on magnetic particles)
The adsorptivity of various bacteria with respect to magnetic particles (“iron trioxide”, 325 mesh manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd., hereinafter abbreviated as “magnetite”) was evaluated.
(1) Test bacteria: see Table 5
[Table 5]

[0038]
(2) Experimental method: Bacteria prepared by placing 30 mL of distilled water and 60 mg (0.2%) of magnetite in a 50 mL flat-bottomed flask, autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes, and culturing the test strain The body suspension was added so that the number of bacteria was about 10 ⁴ CFU / mL, shaken with a shaking incubator (160 rpm, room temperature), and the non-adsorbed fraction was collected over time by magnetic separation. The number of bacteria to be counted was counted.
[0039]
(3) The results are shown in FIG. 1. All bacteria were almost 100% adsorbed after 10 minutes of contact. Therefore, it was recognized that the adsorption of bacteria to magnetite is a phenomenon common to Gram-positive and negative bacteria. (Reaction time in Fig. 1)
[0040]
(Examination of detachment from live magnetic particles)
Using Escherichia coli, the composition of a desorption treatment solution for recovering bacteria adsorbed on magnetite as viable bacteria was tested.
[0041]
(1) Adsorption onto magnetite: Same as the above experimental method.
(2) Recovery of E. coli from magnetite: Magnetite adsorbed with E. coli was recovered by magnetic separation and then washed once with 30 mL of distilled water. Next, 30 mL of the desorption treatment solution was added, and after sufficient stirring, the non-adsorbed fraction was collected by magnetic separation, and the number of viable bacteria was counted by the colony method. The results are shown in Table 6.
[0042]
[Table 6]

[0043]
(3) Results: When using a diluted solution of phosphate buffer (KH ₂ PO ₄ / Na ₂ HPO ₄ , pH 7.0) with a phosphate concentration of 10 mmol / L or more, almost all can be recovered as viable bacteria. It was.
On the other hand, a salt (NaCl) aqueous solution or a sodium nitrate (NaNO ₃ ) aqueous solution hardly desorbs even when the concentration is changed between 50 mmol / L and 250 mmol / L, and a sodium sulfate (Na ₂ SO ₄ ) aqueous solution. When the concentration was 10 mmol / L or less, almost no desorption occurred.
[0044]
In the case of an aqueous solution of tetrasodium ethylenediaminetetraacetate, about 40% could be recovered at a concentration of 10 mmol / L, but the recovery rate tended to decrease at a concentration of 50 mmol / L or more. It is thought that when the concentration of ethylenediaminetetraacetate (EDTA) increases, metals such as magnesium, which are constituents of cell membranes and cell walls of microorganisms, are removed by EDTA, resulting in a decrease in the recovery rate as viable bacteria. It is done.
[0045]
From these results, the magnetite adsorbed with microorganisms has at least one negative ion among chloride ions, nitrate ions and sulfate ions, and the concentration of these chloride ions, nitrate ions and sulfate ions. It is preferable to use a salt solution having a sum of 10 mmol / L or less, while a salt solution containing 10 mmol / L or more phosphate ions is particularly effective for desorption of microorganisms adsorbed on magnetite. .
[0046]
Separately from the above solution containing metal ions, the detachment of bacteria by a surfactant considered to be effective for detaching the adsorbed bacteria was examined.
The study was conducted by diluting Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate, which is a nonionic surfactant that seems to have the least effect on bacteria, at various concentrations. At any concentration, the recovery rate was lower than that of the phosphate solution, which was not a satisfactory value.
[0047]
(Examination of the effect of pH)
Using Escherichia coli, the influence of the pH of a desorption treatment solution for recovering bacteria adsorbed on magnetite as viable bacteria was tested.
(1) Adsorption onto magnetite: Same as the above experimental method.
[0048]
(2) Recovery of Escherichia coli from magnetite: The number of viable E. coli cells detached and recovered from magnetite in the same manner as described above using 10 mmol / L / phosphate buffer solution at pH 4.0 to 8.5 Was measured.
(3) Results: When the pH was 5.5 or more and 8.5 or less, 60% or more was recovered, and when the pH was 6.5 or more and 7.5 or less, the cells were almost completely recovered as viable bacteria.
[0049]
(Confirmation with Legionella bacteria)
The recovery conditions from magnetite obtained by examination using Escherichia coli as described above were confirmed with Legionella bacteria.
As a result of experiments conducted by adsorbing Legionella bozemanii GIFU 9140 (Regione labzemani) to magnetite, it was possible to recover almost completely viable bacteria with a phosphate buffer solution having a phosphate concentration of 10 mmol / L or more, as in E. coli.
[0050]
(Confirmation with actual cooling water for air conditioning)
The sample water (cooling water) collected from the cooling tower for air conditioning is 10 including the samples in which Legionella bacteria were detected by the colony method and the results were false negative by detection by PCR with the conventional pretreatment method. The sample was subjected to magnetic substance adsorption / washing / desorption treatment as described below, and then DNA was extracted and detected by PCR.
The results are shown in Table 7.
[0051]
[Table 7]

[0052]
(1) Adsorption of magnetic particles 1 mL of a microorganism detection sample (prepared in the same manner as in the comparative example) is taken in a 1.5 mL microtube, centrifuged (10000 rpm, 15 minutes), and then 1 mL of 10 mmol / L is added to the precipitate. -Aqueous NaCl solution was added to suspend, 50 μL of magnetite suspension (200 mg / mL distilled water) was added, and the mixture was thoroughly inverted for 30 minutes. Next, magnetic separation was performed using a magnet, the non-adsorbed fraction was discarded, and 10 mL / L · NaCl aqueous solution (1 mL) was added to the magnetite for washing. Perform magnetic separation again, remove the non-adsorbed fraction, and add 1 mL of phosphate buffer (pH 7.0) diluted to a phosphate concentration of 10 mmol / L to the magnetite adsorbed with microorganisms. Agitation was performed to desorb the microorganisms. Magnetic separation was performed, and the obtained liquid (liquid containing detached microorganisms) was transferred to another microtube. Washing was performed by adding 1 mL of a phosphate buffer adjusted to a phosphate concentration of 10 mmol / L to magnetite, and the solution containing the detached microorganisms was combined with the cleaning solution to prepare a sample for DNA extraction.
[0053]
(2) DNA extraction The sample for DNA extraction is centrifuged (10000 rpm, 15 minutes), 950 μL of the supernatant fraction is removed, 50 μL of 50 mmol / L NaOH aqueous solution is added, and the sample is kept in boiling water for 15 minutes. DNA was extracted. Next, 10 μL of 1M Tris-HCl buffer (pH 7.0) was added to neutralize. Of this, 10 μL was used as a sample for PCR.
(3) PCR: Legionella bacteria were detected according to the same method as in the conventional example.
[0054]
(4) Result: The polymerase reaction inhibitor was removed by the adsorption / magnetic separation step, and all the samples showing false negatives were also PCR positive, which was consistent with the results of the colony method.
The presence of Legionella was also detected by PCR from two specimens in which the Legionella bacterium was not detected because the colony method was below the lower limit of detection. This also proves that the detection sensitivity is remarkably improved by the method for removing a polymerase reaction inhibitor according to the present invention.
[0055]
In the above description, the example in which the method for removing a polymerase reaction inhibitor of the present invention is applied to microorganism detection by PCR has been described. However, the present invention is not limited to microorganism detection by PCR, but other techniques that apply polymerase reaction, such as Gene amplification method using strand displacement type DNA polymerase (Tsugunori Notomi et al .: Nucleic Acids Research, 28 (12), 2000), DNA synthesis complementary to RNA strand using RNA-dependent DNA polymerase, and RNA polymerase of phage SP6 It can be applied to RNA synthesis from the DNA strand used (Shinichiro Miura et al., Edited by “Protein Engineering”, P60-P86, published in 1988, Keigaku Publishing).
【The invention's effect】
The method for removing a polymerase reaction inhibitor of the present invention is an adsorption / magnetic separation step in which a microorganism is adsorbed to magnetic particles and the polymerase reaction inhibitor is removed from a non-adsorbed fraction in a sample by magnetic separation using a magnet. It is a method for removing a polymerase reaction inhibitory substance having an excellent polymerase reaction inhibitory substance having an extremely high accuracy by an easy operation.
[0056]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the adsorptivity of various bacteria to magnetite.

Claims

A method for removing a polymerase reaction inhibitor that removes a polymerase reaction inhibitor in a sample containing microorganisms and collects the microorganism as a living cell,
An adsorption / magnetic separation process that adsorbs microorganisms to magnetic particles and removes the polymerase reaction inhibitor present in the non-adsorbed fraction of the sample by magnetic separation using a magnet
Microorganisms were adsorbed using a salt solution having at least one of chloride ion, nitrate ion and sulfate ion, and the sum of the concentration of chloride ion, nitrate ion and sulfate ion being 10 mmol / L or less. A cleaning step of cleaning the magnetic particles; and
Desorption step of desorbing microorganisms adsorbed on the magnetic particles in a living state using a phosphate solution as a desorption treatment liquid
A method for removing a polymerase reaction inhibitor, comprising:

The method for removing a polymerase reaction-inhibiting substance according to claim 1, wherein a phosphate concentration of the desorption treatment solution is 0.1 mmol / L or more.

The method for removing a polymerase reaction-inhibiting substance according to claim 1, wherein the desorption treatment solution has a phosphate concentration of 10 mmol / L or more.

The method for removing a polymerase reaction inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the pH of the desorption treatment liquid is 5.5 or more and 8.5 or less.

The method for removing a polymerase reaction inhibiting substance according to any one of claims 1 to 3, wherein the pH of the desorption treatment solution is 6.5 or more and 7.5 or less.