JP3688585B2

JP3688585B2 - A novel method for diagnosing, monitoring and staging lung cancer

Info

Publication number: JP3688585B2
Application number: JP2000549766A
Authority: JP
Inventors: ヤン，フェイ; マシナ，ロベルト・エイ; スン，ヨンミン
Original assignee: ダイアデクスアス・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2019-05-12
Also published as: EP1082459A1; WO1999060160A1; JP2002515262A; EP1082459A4; CA2328138A1

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、部分的に、癌、特に肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための、新たに開発されたアッセイに関する。
発明の背景
原発肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、および中皮腫を含む、３つの主な種類に分かれる。小細胞肺癌はまた、「オートムギ細胞」肺癌とも呼ばれるが、これは該癌細胞が特有のオートムギの形状であるためである。同様のパターンの振る舞い、および小細胞肺癌とは異なる、治療に対する反応に基づき、共に分類される、３種類の非小細胞肺癌がある。非小細胞肺癌の３種は、扁平上皮細胞癌腫、腺癌および巨大細胞癌腫である。扁平上皮細胞癌腫は、肺癌の最も一般的な種類である。該癌腫は、気道を裏打ちする細胞から発展する。腺癌もまた、気道を裏打ちする細胞から発展するが、腺癌は、粘液（ｍｕｃｕｓ、ｐｈｌｅｇｍ）を産生する特定の種類の細胞から発展する。巨大細胞肺癌において、該細胞は、顕微鏡下で見ると、巨大でそして丸く見える。中皮腫は、まれな種類の癌であり、肺を被覆する胸膜に影響を及ぼす。中皮腫は、しばしばアスベストに曝露されることにより、引き起こされる。
【０００２】
続発肺癌は、体の別の場所（例えば、乳房または腸（ｂｏｗｅｌ））で始まり、そして肺に広まった癌である。治療選択は、どこで癌が始まったかに依存する。例えば、乳房から広まった癌は、乳癌治療に反応するはずであり、そして腸から広まった癌は、腸癌治療に反応するはずである。癌の病期は、どのくらい癌が広まっているかに関する情報を提供する。癌の治療はしばしばその病期に基づき決定されるため、病期決定は重要である。病期決定は、小細胞肺癌に比べ非小細胞肺癌に対しては異なる。
【０００３】
非小細胞癌は、４つの病期に分かれる。病期Ｉは、非常に局在している癌であり、リンパ節には癌がない。病期ＩＩでは、癌は影響を受けている肺の最上部のリンパ節に広まっている。病期ＩＩＩでは、癌が始まった場所の近くに癌が広まっている。これは胸壁、肺被覆（胸膜）、胸中央（中隔膜）または他のリンパ節であってもよい。病期ＩＶの癌は、体の別の部分に広まっている。
【０００４】
小細胞肺癌は、２つの群に分かれる。これは、小細胞肺癌は、しばしば、非常に初期に広まるためである。癌の広まりがスキャンで見られない場合であっても、ある程度の癌細胞が剥がれ、そして血流またはリンパ系を通じて移動しているであろう可能性がある。したがって、いかなる続発癌が見られてもまたは見られなくても、小細胞肺癌は、あたかも広まっているかのように、治療するのがしばしば好ましい。
【０００５】
小細胞肺癌の２つの病期は、限定された疾患、すなわち１つの肺および近傍のリンパ節にのみ見ることが可能である癌、および広まった疾患、すなわち、肺の外部の、胸または体の他の部分へ広まっている癌である。ごく初期の症例を除き、小細胞癌を治療するのに、通常、手術は用いないため、病期決定は、いくつかの他の種類の癌の場合ほど重要ではない。小細胞肺癌の治療には、通常、放射療法を伴うまたは伴わない化学療法が好ましい。最初のスキャンおよび試験を、後のスキャンおよび試験と比較するのに用い、患者がどの程度、治療に反応しているかを見る。
【０００６】
肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するために用いられる方法は、患者の結果に非常に重要である。例えば、初期肺癌と診断された患者は、一般的に、遠隔転移肺癌と診断された患者の生存率に比べ、はるかに高い５年生存率を有する。明らかに、初期肺癌を検出するための、より感度が高くそして特異的な新規診断法が必要である。
【０００７】
肺癌患者はまた、最初の療法後、そして補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）療法中、療法に対する反応を測定し、そして転移の持続または再発疾患を検出するため、綿密にモニターしなければならない。肺癌再発を検出するのに、より感度が高くそして特異的な肺癌マーカーが、明らかに必要である。
【０００８】
肺癌を管理する、別の重要な段階は、疾患の病期を決定することである。病期決定は、予後判定に有用である可能性があり、そして最適な療法を設計するための規準を提供する。一般的に、病理学的な病期決定は、より正確な予後を提供するため、肺癌の病理学的な病期決定が、臨床的な病期決定より好ましい。しかし、臨床的な病期決定は、病理学的評価のための組織を得る侵襲処置に依存しないため、臨床的な病期決定が少なくとも病理学的な病期決定と同程度に正確であれば、臨床的病理決定が好ましいであろう。肺癌の病期決定は、細胞、組織または体液において、侵襲の異なる病期の間を区別することが可能な新規マーカーを検出することにより、改善されるであろう。
【０００９】
本発明において、６つの肺特異的遺伝子（ＬＳＧ）を介し、肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための方法が提供される。これらの６つのＬＳＧは、とりわけ、配列番号１、２、３、４、５または６のいかなるものでもよいポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される天然タンパク質を指す。あるいは、本明細書において、６つのＬＳＧにより、配列番号１、２、３、４、５または６の配列のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子によりコードされる天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子のレベルを意味する。
【００１０】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。しかし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示されることが理解されなければならない。開示される発明の精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の説明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかになるであろう。
発明の概要
これらの、そして他の目的に向け、患者における肺癌の存在を診断するための方法であって、患者由来の細胞、組織または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを測定し、そしてＬＳＧの該測定レベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＬＳＧレベルに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、肺癌と関連する、ことを含む前記方法を提供するのが、本発明の目的である。
【００１１】
本発明の別の目的は、患者における転移性肺癌を診断する方法であって、患者由来の細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧレベルを測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＬＳＧレベルに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、患者における肺癌を病期決定する方法であって、肺癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルと比較することを含む前記方法を提供することである。コントロールにおけるＬＳＧレベルに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連する可能性があり、一方、コントロールに対する患者における測定ＬＳＧの減少したまたは同等のレベルは、後退または緩解している癌と関連する可能性がある。
【００１３】
本発明の別の目的は、転移の開始に関し、患者における肺癌をモニターする方法を提供することである。該方法は、転移していることが知られていない肺癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを定期的に測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＬＳＧレベルに対する測定ＬＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、患者における肺癌の病期の変化をモニターする方法であって、肺癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを定期的に測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＬＳＧレベルに対する測定ＬＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連し、そしてコントロールＬＳＧレベルに対する測定ＬＳＧレベルの減少は、後退または緩解している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。しかし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示されることが理解されなければならない。開示される発明の精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の説明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、ＬＳＧレベルを健常ヒトコントロールにおけるＬＳＧレベルと比較することにより、癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための、定量的かつ定性的な診断アッセイおよび方法に関する。本明細書において、「ＬＳＧレベル」により、配列番号１、２、３、４、５または６のいかなるものでもよいポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される天然タンパク質のレベルを意味する。あるいは、本明細書において、「ＬＳＧレベル」により、配列番号１、２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子によりコードされる天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子のレベルを意味する。こうしたレベルは、好ましくは、少なくとも１つの細胞、組織および／または体液で測定され、正常および異常レベルの決定を含む。したがって例えば、正常なコントロール体液、細胞、または組織試料に比較した、ＬＳＧタンパク質の過剰発現を診断するため、本発明に一致した診断アッセイを用い、肺癌を含む癌の存在を診断してもよい。本発明の方法において、６つのＬＳＧのいずれを単独で測定してもよいし、あるいは６つをすべて共にまたはいかなる組み合わせで測定してもよい。
【００１６】
「コントロール」により、癌でないヒト患者および／または該患者由来の非癌性試料を意味し、また、本明細書において、健常ヒトコントロールも指す；転移に関し診断するまたはモニターするための方法において、コントロールはまた、信頼できる方法により、転移していない肺癌を有すると決定されたヒト患者由来の試料も含んでもよい。
【００１７】
本発明の方法はすべて、所望により、ＬＳＧと共に他の癌マーカーのレベルを測定することを含んでもよい。ＬＳＧに加え、本発明に有用な他の癌マーカーは、試験される癌に依存するであろうし、そして当業者に知られる。
【００１８】
診断アッセイ
本発明は、ヒト健常コントロール由来の、好ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルと比較した、細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルの変化に関し解析することにより、肺癌の存在を診断する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧレベルの増加は、肺癌の存在と関連する、ための方法を提供する。
【００１９】
本発明を限定することなく、典型的には、定量的な診断アッセイに関し、試験された患者が癌を有することを示す陽性の結果は、ＬＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織、または体液レベルが、健常ヒトコントロールの、好ましくは同じ細胞、組織、または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そして最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００２０】
本発明はまた、転移の開始に関し、まだ転移していない肺癌を有する患者において、転移性肺癌を診断する方法も提供する。本発明の方法において、転移している可能性がある（が、転移していることが既に知られていない）肺癌を有すると疑われるヒト癌患者が同定される。これは、当業者に知られる多様な手段により達成される。例えば、肺癌の場合、典型的には、患者は、伝統的な検出法の後、肺癌と診断される。
【００２１】
本発明において、細胞、組織、または体液におけるＬＳＧレベルの存在の決定は、転移していない肺癌および転移している肺癌の間を区別するのに、特に有用である。既存の技術では、転移している肺癌および転移していない肺癌の間を区別するのは困難であり、そして適切な治療選択は、しばしばこうした知識に依存する。
【００２２】
本発明において、こうした細胞、組織、または体液において測定される癌マーカーレベルは、ＬＳＧであり、そして健常ヒトコントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧレベルと比較される。すなわち、観察される癌マーカーが、血清中のＬＳＧのみである場合、本レベルは、好ましくは健常ヒト患者の血清におけるＬＳＧレベルと比較される。健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧの増加は、転移している肺癌に関連する。
【００２３】
本発明を限定することなく、典型的には、定量的な診断アッセイに関し、試験されるまたはモニターされる患者における癌が転移していることを示す陽性の結果は、ＬＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、健常患者の、好ましくは同じ細胞、組織、または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そして最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００２４】
病期決定
本発明はまた、ヒト患者における肺癌を病期決定する方法も提供する。
本方法は、こうした癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料を、ＬＳＧに関し、解析することを含む。その後、該方法は、こうした細胞、組織、または体液におけるＬＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液と比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連し、そしてＬＳＧのレベルの減少は、後退または緩解している癌と関連する。
【００２５】
モニター
さらに提供されるのは、転移の開始に関し、こうした癌を有するヒトにおける肺癌をモニターする方法である。該方法は、転移していることが知られていない癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料をＬＳＧに関し定期的に解析し；こうした細胞、組織、または体液における該ＬＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、ことを含む。
【００２６】
本発明にさらに提供されるのは、こうした癌を有するヒトにおける肺癌の病期の変化をモニターする方法である。該方法は、こうした癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料をＬＳＧに関し定期的に解析し；こうした細胞、組織、または体液における該ＬＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧレベルの増加は、病期が進行している癌と関連し、そしてＬＳＧのレベルの減少は、病期が後退または緩解している癌と関連する、ことを含む。
【００２７】
転移の開始に関する、こうした患者のモニターは、定期的であり、そして好ましくは、原則として年４回行われる。しかし、癌、特定の患者、および癌の病期に応じ、この頻度はより多くてもまたは少なくてもよい。
【００２８】
アッセイ技術
宿主由来の試料における、本発明のＬＳＧなどの、遺伝子発現のレベルを決定するのに用いてもよいアッセイ技術は、当業者に周知である。こうしたアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。とりわけ、ＥＬＩＳＡは、生物学的流体における遺伝子の発現タンパク質を診断するのに、しばしば好ましい。
【００２９】
商業的供給源から容易に入手可能でない場合、ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、ＬＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、一般的に、ＬＳＧに特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射能、蛍光または酵素的試薬、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼに付着している。
【００３０】
ＥＬＩＳＡを実行するため、ＬＳＧに特異的な抗体を、ポリスチレンプレートなど、抗体に結合する固体支持体上でインキュベーションする。その後、非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンとインキュベーションすることにより、プレート上のいかなる未結合のタンパク質結合部位も、被覆される。次に、解析しようとする試料を、プレート中でインキュベーションし、その間、ＬＳＧは、ポリスチレンプレートに付着している特異的抗体に結合する。未結合試料を緩衝液で洗い流す。ＬＳＧに特異的に向けられ、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合しているレポーター抗体をプレートに加え、その結果ＬＳＧに連結されているいかなるモノクローナル抗体に対してもレポーター抗体が結合する。その後、未結合レポーター抗体を洗い流す。その後、比色基質を含む、ぺルオキシダーゼ活性のための試薬をプレートに添加する。ＬＳＧ抗体に結合している固定化ペルオキシダーゼは、呈色反応産物を生じる。既定の期間に現れた色の量は、試料に存在するＬＳＧタンパク質の量に比例する。定量的結果は、典型的には、標準曲線に照合することにより、得られる。
【００３１】
競合アッセイを使用してもよく、該アッセイでは、ＬＳＧに特異的な抗体が、固体支持体に付着しており、そして標識ＬＳＧおよび宿主由来の試料を該固体支持体上に流す。すると、固体支持体に付着している、検出される標識の量は、試料におけるＬＳＧの量と相関し得る。
【００３２】
核酸法を用い、肺癌のマーカーとしてＬＳＧｍＲＮＡを検出してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＡＢＡ）を用い、多様な悪性腫瘍の診断およびモニターのため、悪性細胞を検出してもよい。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、何千もの他のｍＲＮＡ種の複合混合物における、特定のｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに用いることが可能な、強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、まず逆転写酵素を使用し、ｍＲＮＡ種を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し；その後ｃＤＮＡを標準的ＰＣＲ反応におけるように、増幅する。したがって、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることが可能である。したがって、ｍＲＮＡが該ｍＲＮＡを産生する細胞に非常に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲを用い、特定の種類の細胞の存在を同定することが可能である。
【００３３】
固体支持体上にアレー化されているクローンまたはオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション（すなわち、格子化（gridding））を用い、その遺伝子の発現を検出し、そしてかつ該遺伝子の発現レベルを定量化してもよい。本アプローチにおいて、ＬＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、支持体に固定されている。支持体は、限定されるわけではないが、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含む、いかなる適切な種類でもよい。ＬＳＧ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部は、支持体に付着し、そしてその後、目的の組織から単離されたＲＮＡでもまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーでもよい解析物とインキュベーションする。支持体結合ＤＮＡおよび解析物の間のハイブリダイゼーションを、限定されるわけではないが、解析物の放射能標識または蛍光標識、あるいはハイブリッドを検出するよう設計された二次分子を含む、いくつかの手段により、検出しそして定量化してもよい。遺伝子発現レベルの定量化は、解析物由来のシグナルの強度を、既知の標準から決定されるものと比較することにより、行ってもよい。標準は、標的遺伝子をｉｎｖｉｔｒｏ転写し、収量を定量化し、そしてその後その要素を用いて標準曲線を生成することにより、得てもよい。
【００３４】
上記の試験は、多様な患者細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジェネートまたは可溶化組織）、例えば組織生検および検死素材由来の試料に対し、行ってもよい。本発明に有用な体液には、血液、尿、唾液、またはいかなる他の体の分泌物またはその派生物も含まれる。血液には、全血、血漿、血清、またはいかなる血液派生物を含んでもよい。
【００３５】
【実施例】
本発明は、以下の実施例により、さらに説明される。これらの実施例は、特定の態様に言及することにより、もっぱら本発明を例示するためにのみ提供される。これらの例示は、本発明の特定の側面を例示するが、限定を表現せず、または開示される発明を制限しない。
実施例１：ＬＳＧ
ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州パロアルトから入手可能なＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースの一部として以下の検索ツールを用い、検索を行い、そしてＬＳＧを同定した：
１．ライブラリー比較（１つのライブラリーを他の１つのライブラリーと比較する）は、腫瘍で発現され、そして正常組織に存在しないまたは正常組織で、より低いレベルで発現されるクローンの同定を可能にする。
２．サブセット化（ｓｕｂｓｅｔｔｉｎｇ）は、ライブラリー比較と類似であるが、ライブラリーのプールで発現され、そして第二のライブラリーのプールに存在しないまたは第二のライブラリーのプールで、より低いレベルで発現されるクローンの同定を可能にする。
３．転写画像化は、存在量に基づき、単一のライブラリーまたはライブラリーのプールにおけるすべてのクローンをリストアップする。その後、電子ノーザン（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＮｏｒｔｈｅｒｎ）を用い、個々のクローンを調べ、その構成要素ＥＳＴの組織供給源を決定してもよい。
４．タンパク質機能：Ｉｎｃｙｔｅは、既知のタンパク質に対する相同性に基づき、タンパク質機能を持つ可能性があるＥＳＴのサブセットを同定してきている。本データベースのいくつかの例には、転写因子およびプロテアーゼが含まれる。その構成要素ＥＳＴが疾患特異性を示すクローンに関し、本データベースを検索することにより、いくつかのリード遺伝子（ｌｅａｄ）を同定した。
【００３６】
電子サブトラクション、転写画像化およびタンパク質機能検索を用い、その構成要素ＥＳＴが、特定の腫瘍由来のライブラリーでのみ、または該ライブラリーで、より頻繁に見られるクローンを同定した。各ＥＳＴが生じた場所を確かめることにより、個々の候補クローンを詳細に調べた。
【００３７】
表１：ＬＳＧ
【００３８】
【表１】

【００３９】
別に詳細に記載される場合を除き、当業者に周知でそして日常的な標準的技術を用い、以下の実施例を行った。以下の実施例の日常的な分子生物学的技術は、標準的な実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，第二版；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記載されるように行ってもよい。
実施例２：ＬＳＧ遺伝子発現の相対定量化
蛍光Ｔａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用した、定量化検出系である。該方法は、５’レポーター色素および下流の３’消光色素で標識された内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔａｑｍａｎ）を使用する。ＰＣＲ中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーターを放出し、その蛍光をその後、モデル７７００配列検出系（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）のレーザー検出装置により、検出してもよい。
【００４０】
内因性コントロールの増幅を用い、反応に添加された試料ＲＮＡの量を標準化し、そして逆転写酵素（ＲＴ）効率を正規化する。シクロフィリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）または１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかをこの内因性コントロールとして用いる。調べたすべての試料の間の相対定量化を計算するため、１つの試料に関する標的ＲＮＡレベルを、比較結果の基本として用いる（基準値（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ））。「基準値」に対し相対的な定量化は、標準曲線法または比較法を用い、得ることが可能である（ＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ＃２：ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列検出系）。
【００４１】
正常および癌組織において、各試料に関し、標的遺伝子の組織分布およびレベルを評価した。正常組織、癌組織から、そして癌および対応隣接組織から、総ＲＮＡを抽出した。続いて、逆転写酵素で第一鎖ｃＤＮＡを調製し、そして各標的遺伝子に特異的なプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列検出装置を用い、結果を解析した。無名数（ａｂｓｏｌｕｔｅｎｕｍｂｅｒ）は、基準値組織に比較した、特定の組織における標的遺伝子の相対発現レベルである。
【００４２】
比較例
比較例として、診断マーカーＰＳＡ（前立腺特異的抗原）およびＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）をコードする遺伝子に関する類似のｍＲＮＡ発現解析を行った。ＰＳＡは、臨床実験室で現在入手可能な、唯一の癌スクリーニングマーカーである。一連の正常組織のプールを解析した際、ＰＳＡは非常に高いレベルで前立腺に発現し、乳房および精巣では発現が非常に低かった。１４の異なる組織由来の５５以上の対応する試料を解析したデータにより、正常組織試料で見られる組織特異性が確認された。前立腺組織の１２の対応する試料に関し、癌および正常隣接組織におけるＰＳＡ発現を比較した。ＰＳＡの相対レベルは、１０の癌試料において、より高かった（８３％）。最近得られた臨床データにより、前立腺癌の病期が後期であることの病期決定マーカーとしてＰＬＡ２を利用することが支持される。我々のｍＲＮＡ発現データは、解析した１２の前立腺対応試料のうち８つでｍＲＮＡの過剰発現を示した（６６％）。ＰＬＡ２の組織特異性は、ＰＳＡに関し記載されるものほど、優れていなかった。前立腺に加え、小腸、肝臓および膵臓でも、高レベルのＰＬＡ２のｍＲＮＡ発現を示した。
【００４３】
配列番号１；クローン番号１２６７５８；遺伝子番号２９９９７（Ｌｎｇ１０１）の測定
表２に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬＳＧＬｎｇ１０１（配列番号１）の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。
【００４４】
表２：プール試料におけるＬｎｇ１０１発現の相対レベル
【００４５】
【表２】

【００４６】
表２の相対発現レベルは、ＬＳＧＬｎｇ１０１（配列番号１）のｍＲＮＡ発現が、解析された他の正常組織すべてに比較し、肺（７２７１６）で非常に高いことを示す。相対発現レベル１の、基準値である精巣、心臓（１．５５）、および乳腺（２）だけが、Ｌｎｇ１０１のｍＲＮＡを発現する組織である。これらの結果は、Ｌｎｇ１０１ｍＲＮＡ発現は、肺に非常に特異的であることを立証した。
【００４７】
表２における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、表３−４における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能である。
【００４８】
表３−４に示される無名数は、４４対の対応する試料におけるＬｎｇ１０１の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。
【００４９】
表３−４：個々の試料におけるＬｎｇ１０１発現の相対レベル
【００５０】
【表３】

【００５１】
【表４】

【００５２】
０＝陰性
対応試料を解析した際、肺で発現レベルがより高く、本組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、一連の正常プール試料で得られた組織特異性結果（表２）が確認される。
【００５３】
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表３−４は、それぞれの正常隣接組織と比較した６つの肺癌組織（肺試料＃４、８、１０、１４、１６、および１８）におけるＬＳＧＬｎｇ１０１の過剰発現を示す。試験した肺対応試料の３０％に関し、癌組織における過剰発現が見られた（総数２０の肺対応試料）。
【００５４】
要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の３０％でのｍＲＮＡ過剰発現は、ＬＳＧＬｎｇ１０１（配列番号１）が、肺癌の診断マーカーであることを立証する。Ｌｎｇ１０１（配列番号１）にコードされるアミノ酸配列は、配列番号７に示される。
【００５５】
配列番号３；クローン番号３１０７３１２；遺伝子番号２４２８４２（Ｌｎｇ１０５）の測定
表５に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬＳＧＬｎｇ１０５（配列番号３）の相対発現レベルである。すべての値は、正常腎臓（基準値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。
【００５６】
表５：プール試料におけるＬｎｇ１０５発現の相対レベル
【００５７】
【表５】

【００５８】
表５の相対発現レベルは、ＬＳＧＬｎｇ１０５（配列番号３）のｍＲＮＡ発現が、二番目に高い発現組織（腎臓の５５８）に比較し、正常肺のプール（９２４８）で１６倍以上高いことを示す。解析された他のプール組織試料はすべて、Ｌｎｇ１０５（配列番号３）に関し非常に低いレベルの発現を示した。これらの結果は、ＬＳＧＬｎｇ１０５（配列番号３）のｍＲＮＡ発現は、肺に非常に特異的であることを立証する。
【００５９】
表５における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、表６−８における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能である。
【００６０】
表６−８に示される無名数は、６１対の対応する試料におけるＬｎｇ１０５（配列番号３）の相対発現レベルである。すべての値は、正常小腸（基準値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。
【００６１】
表６−８：個々の試料におけるＬｎｇ１０５発現の相対レベル
【００６２】
【表６】

【００６３】
【表７】

【００６４】
【表８】

【００６５】
０＝陰性
対応試料を解析した際、肺で発現レベルがより高く、肺組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、正常プール試料で得られた組織特異性結果（表５）が確認される。
【００６６】
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表６−８は、それぞれの正常隣接組織と比較した１３の肺癌組織（肺試料＃１、３、５、８、９、１０、１１、１２、２０、２１、２２、２４、および２５）におけるＬＳＧＬｎｇ１０５（配列番号３）の過剰発現を示す。試験した結腸対応試料の４６％に関し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２８の肺対応試料）。
【００６７】
要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料のほぼ半数でのｍＲＮＡ過剰発現は、Ｌｎｇ１０５（配列番号３）が、肺癌の診断マーカーであることを立証する。Ｌｎｇ１０５（配列番号３）によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号８に示される。
【００６８】
配列番号６；クローン番号５８６２７１；遺伝子番号２４２７４５（Ｌｎｇ１０７）の測定
表９に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬＳＧＬｎｇ１０７（配列番号６）の相対発現レベルである。すべての値は、正常乳腺（基準値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。
【００６９】
表９：プール試料におけるＬｎｇ１０７発現の相対レベル
【００７０】
【表９】

【００７１】
表９の相対発現レベルは、ＬＳＧＬｎｇ１０７（配列番号６）のｍＲＮＡ発現が、基準値乳腺（１）の発現レベルと比較して、正常肺のプール（２３）で２３倍高いことを示す。解析した他の組織はすべて、Ｌｎｇ１０７（配列番号６）に関し陰性だった。これらの結果は、Ｌｎｇ１０７ｍＲＮＡ発現は、肺に非常に特異的であることを立証する。
【００７２】
表９における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、表１０−１２における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能である。
【００７３】
表１０−１２に示される無名数は、５７対の対応する試料におけるＬＳＧＬｎｇ１０７（配列番号６）の相対発現レベルである。すべての値は、正常前立腺（基準値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。
【００７４】
表１０−１２：個々の試料におけるＬｎｇ１０７発現の相対レベル
【００７５】
【表１０】

【００７６】
【表１１】

【００７７】
【表１２】

【００７８】
０＝陰性
対応試料を解析した際、肺で発現レベルがより高く、本組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、正常プール試料で得られた組織特異性結果（表９）が確認される。
【００７９】
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表１０−１２は、それぞれの正常隣接組織と比較した１５の肺癌組織（肺試料＃１３、４、５、７、８、９、１０、１１、１４、１５、１８、１９、２０、および２２）におけるＬＳＧＬｎｇ１０７（配列番号６）の過剰発現を示す。試験した肺対応試料の５７％に関し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２６の肺対応試料）。
【００８０】
要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の半数以上でのｍＲＮＡ過剰発現は、Ｌｎｇ１０７が、肺癌の診断マーカーであることを立証する。Ｌｎｇ１０７によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号９に示される。

[0001]
Field of Invention
The present invention relates in part to newly developed assays for detecting, diagnosing, monitoring, staging and prognosing cancer, particularly lung cancer.
Background of the Invention
Primary lung cancer is divided into three main types, including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, and mesothelioma. Small cell lung cancer is also referred to as “oat cell” lung cancer because the cancer cells are in a unique oat shape. There are three types of non-small cell lung cancer that are grouped together based on similar pattern behavior and response to treatment, which is different from small cell lung cancer. Three types of non-small cell lung cancer are squamous cell carcinoma, adenocarcinoma and giant cell carcinoma. Squamous cell carcinoma is the most common type of lung cancer. The carcinoma develops from cells that line the airways. Adenocarcinoma also develops from cells lining the airways, but adenocarcinoma develops from certain types of cells that produce mucus, phlegm. In giant cell lung cancer, the cells appear giant and round when viewed under a microscope. Mesothelioma is a rare type of cancer that affects the pleura that covers the lungs. Mesothelioma is often caused by exposure to asbestos.
[0002]
Secondary lung cancer is cancer that begins elsewhere in the body (eg, breast or bowel) and has spread to the lungs. Treatment choice depends on where the cancer started. For example, cancer that has spread from the breast should respond to breast cancer treatment, and cancer that has spread from the intestine should respond to intestinal cancer treatment. The stage of cancer provides information on how far the cancer has spread. Staging is important because cancer treatment is often determined based on its stage. Staging is different for non-small cell lung cancer compared to small cell lung cancer.
[0003]
Non-small cell carcinoma is divided into four stages. Stage I is a highly localized cancer and there is no cancer in the lymph nodes. In stage II, cancer has spread to the lymph nodes at the top of the affected lung. In stage III, the cancer has spread near the place where it started. This may be the chest wall, lung covering (pleura), mid-thoracic (diaphragm) or other lymph nodes. Stage IV cancer has spread to other parts of the body.
[0004]
Small cell lung cancer is divided into two groups. This is because small cell lung cancer often spreads very early. Even if no cancer spread is seen on the scan, some cancer cells may have detached and may have migrated through the bloodstream or lymphatic system. Therefore, it is often preferred to treat small cell lung cancer as if it has spread, with or without any secondary cancer.
[0005]
The two stages of small cell lung cancer are limited disease, ie cancer that can only be seen in one lung and nearby lymph nodes, and widespread disease, ie outside the lung, breast or body Cancer that has spread to other parts. Staging is not as important as in some other types of cancer, because, except in very early cases, surgery is usually not used to treat small cell cancer. Chemotherapy with or without radiation therapy is usually preferred for the treatment of small cell lung cancer. The first scan and test are used to compare with later scans and tests to see how well the patient is responding to treatment.
[0006]
The methods used to detect, diagnose, monitor, stage and prognose lung cancer are critical to patient outcome. For example, patients diagnosed with early lung cancer generally have a much higher 5-year survival rate than the survival rate of patients diagnosed with distant metastatic lung cancer. Clearly, there is a need for new and more sensitive and specific diagnostic methods for detecting early lung cancer.
[0007]
Lung cancer patients must also be closely monitored after initial therapy and during adjuvant therapy to measure response to therapy and to detect metastatic persistence or recurrent disease. There is clearly a need for more sensitive and specific lung cancer markers to detect lung cancer recurrence.
[0008]
Another important step in managing lung cancer is determining the stage of the disease. Staging can be useful for prognosis and provides criteria for designing optimal therapies. In general, pathological staging of lung cancer is preferred over clinical staging because pathological staging provides a more accurate prognosis. However, clinical staging does not depend on invasive procedures to obtain tissue for pathological evaluation, so if clinical staging is at least as accurate as pathological staging Clinical pathological determination would be preferred. Lung cancer staging will be improved by detecting novel markers in cells, tissues or body fluids that can distinguish between different stages of invasiveness.
[0009]
In the present invention, a method is provided for detecting, diagnosing, monitoring, staging and prognosing lung cancer via six lung specific genes (LSG). These six LSGs refer, inter alia, to the natural protein expressed by a gene comprising a polynucleotide sequence that can be any of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6. Alternatively, as used herein, natural mRNA encoded by a gene comprising any of the polynucleotide sequences of the sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6 by six LSGs, or SEQ ID NO: It means the level of a gene including any of 1, 2, 3, 4, 5 or 6 polynucleotide sequences.
[0010]
Other objects, features, advantages and aspects of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the following description. However, it should be understood that the following description and specific examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are presented only by way of illustration. Various changes and modifications within the spirit and scope of the disclosed invention will become readily apparent to those skilled in the art from reading the following description and from reading the other parts of the disclosure.
Summary of the Invention
For these and other purposes, a method for diagnosing the presence of lung cancer in a patient, comprising measuring the level of LSG in a patient-derived cell, tissue or body fluid sample, and determining the measured level of LSG Providing said method, comprising comparing the LSG level in a control, preferably in the same type of cell, tissue or fluid, wherein the increase in measured LSG level in the patient relative to the LSG level in the control is associated with lung cancer It is an object of the present invention to do so.
[0011]
Another object of the present invention is a method for diagnosing metastatic lung cancer in a patient, wherein the LSG level in a sample of cells, tissues or body fluids from the patient is measured, and the measured LSG level is measured in a control, preferably Provides said method comprising comparing to the level of LSG in the same type of cell, tissue or fluid, wherein the increase in measured LSG level in the patient relative to the LSG level in the control is associated with metastatic cancer It is to be.
[0012]
Another object of the present invention is a method for staging lung cancer in a patient, comprising identifying a patient having lung cancer and measuring the level of LSG in a sample of cells, tissue or body fluid obtained from the patient, And providing said method comprising comparing the measured LSG level to the level of LSG in a control, preferably the same type of cell, tissue or body fluid. Increases in measured LSG levels in patients relative to LSG levels in controls may be associated with advanced cancer, while decreased or equivalent levels of measured LSGs in patients relative to controls are regressed or ameliorated. May be associated with cancer.
[0013]
Another object of the present invention is to provide a method for monitoring lung cancer in a patient for the initiation of metastasis. The method identifies a patient with lung cancer that is not known to have metastasized, periodically measures the level of LSG in a sample of cells, tissue, or body fluid obtained from the patient, and the measured LSG Comparing the level of LSG in a control, preferably in the same type of cell, tissue or body fluid, wherein an increase in measured LSG level relative to the control LSG level is associated with metastatic cancer It is to provide the method.
[0014]
Yet another object of the present invention is a method of monitoring changes in lung cancer stage in a patient, identifying a patient with lung cancer and the level of LSG in a sample of cells, tissue or fluid obtained from the patient Is measured periodically and the measured LSG level is compared to the level of LSG in a control, preferably the same type of cell, tissue, or body fluid, where the increase in the measured LSG level relative to the control LSG level is progressive A reduction in measured LSG levels relative to a control cancer and relative to a control LSG level is to provide the method comprising: relating to a cancer that is regressing or in remission.
[0015]
Other objects, features, advantages and aspects of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the following description. However, it should be understood that the following description and specific examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are presented only by way of illustration. Various changes and modifications within the spirit and scope of the disclosed invention will become readily apparent to those skilled in the art from reading the following description and from reading the other parts of the disclosure.
Detailed Description of the Invention
The present invention relates to a quantitative and qualitative diagnostic assay for detecting, diagnosing, monitoring, staging and prognosing cancer by comparing LSG levels to LSG levels in healthy human controls. And methods. As used herein, “LSG level” means the level of a natural protein expressed by a gene comprising a polynucleotide sequence that may be any of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6. Alternatively, as used herein, a natural mRNA encoded by a gene comprising any of the polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6 according to “LSG level” or SEQ ID NO: 1 Means the level of a gene comprising any of 2, 3, 4, 5 or 6 polynucleotide sequences. Such levels are preferably measured in at least one cell, tissue and / or body fluid and include determination of normal and abnormal levels. Thus, for example, a diagnostic assay consistent with the present invention may be used to diagnose the presence of cancer, including lung cancer, in order to diagnose overexpression of LSG protein compared to normal control body fluids, cells, or tissue samples. In the method of the present invention, any of the six LSGs may be measured alone, or all six may be measured together or in any combination.
[0016]
By “control” is meant a non-cancerous human patient and / or a non-cancerous sample derived from the patient and also referred to herein as a healthy human control; in a method for diagnosing or monitoring metastasis, a control May also include samples from human patients that have been determined by reliable methods to have non-metastatic lung cancer.
[0017]
All of the methods of the invention may optionally include measuring the level of other cancer markers along with LSG, if desired. In addition to LSG, other cancer markers useful in the present invention will depend on the cancer being tested and are known to those skilled in the art.
[0018]
Diagnostic assay
The present invention diagnoses the presence of lung cancer by analyzing for changes in the level of LSG in cells, tissues or body fluids, preferably compared to the level of LSG in cells, tissues or body fluids derived from healthy human controls. Where an increase in LSG levels in patients relative to healthy human controls provides a method for correlating with the presence of lung cancer.
[0019]
Without limiting the present invention, typically with respect to quantitative diagnostic assays, a positive result indicating that the patient being tested has cancer is a cell, tissue or fluid level of a cancer marker such as LSG. A healthy human control, preferably at least 2-fold higher and most preferably at least 5-fold higher than in the same cell, tissue, or body fluid.
[0020]
The invention also relates to the initiation of metastasis and provides a method of diagnosing metastatic lung cancer in a patient with lung cancer that has not yet metastasized. In the methods of the invention, human cancer patients suspected of having lung cancer that may have metastasized (but are not already known to have metastasized) are identified. This is accomplished by various means known to those skilled in the art. For example, in the case of lung cancer, the patient is typically diagnosed with lung cancer after traditional detection methods.
[0021]
In the present invention, determination of the presence of LSG levels in cells, tissues, or body fluids is particularly useful in distinguishing between non-metastatic and metastatic lung cancer. With existing technology, it is difficult to distinguish between metastatic and non-metastatic lung cancer, and appropriate treatment choices often depend on such knowledge.
[0022]
In the present invention, the cancer marker level measured in such cells, tissues or body fluids is LSG and is compared to LSG levels in healthy human controls, preferably in the same type of cells, tissues or body fluids. That is, if the only cancer marker observed is LSG in serum, this level is preferably compared to the LSG level in serum of healthy human patients. The increase in LSG in patients relative to healthy human controls is associated with metastatic lung cancer.
[0023]
Without limiting the present invention, typically for quantitative diagnostic assays, a positive result indicating that the cancer in a patient being tested or monitored has metastasized is a cell of a cancer marker such as LSG The tissue or fluid level is at least 2-fold higher and most preferably at least 5-fold higher than that of a healthy patient, preferably in the same cell, tissue or fluid.
[0024]
Staging
The present invention also provides a method for staging lung cancer in a human patient.
The method includes identifying a human patient having such a cancer; analyzing a sample of cells, tissue, or body fluid from such patient for LSG. The method then compares the LSG level in such cells, tissues or body fluids to that of a healthy human control sample, preferably the same type of cells, tissues or body fluids, wherein the LSG level in the patient relative to the healthy human control. An increase is associated with an ongoing cancer, and a decrease in the level of LSG is associated with a cancer that is regressing or in remission.
[0025]
monitor
Further provided is a method for monitoring lung cancer in humans with such cancers with respect to the onset of metastasis. The method identifies a human patient with a cancer that is not known to have metastasized; periodically analyzes samples of cells, tissues, or body fluids from such patients for LSG; The LSG level in bodily fluid is compared to the level of LSG in a healthy human control sample, preferably in the same type of cell, tissue, or bodily fluid, where the increase in measured LSG level in a patient relative to a healthy human control is metastasized. Related to cancer.
[0026]
Further provided by the present invention is a method of monitoring changes in the stage of lung cancer in humans with such cancers. The method identifies human patients with such cancers; samples of cells, tissues, or body fluids from such patients are regularly analyzed for LSG; the LSG levels in such cells, tissues, or body fluids are determined by healthy humans. An increase in LSG level in a patient relative to a healthy human control, compared to the level of LSG in a control sample, preferably in the same type of cell, tissue or body fluid, is associated with a staged cancer, and A decrease in the level of LSG includes that the stage is associated with a cancer that has regressed or regressed.
[0027]
Such patient monitoring for the onset of metastasis is periodic and is preferably performed quarterly in principle. However, this frequency may be more or less depending on the cancer, the particular patient, and the stage of the cancer.
[0028]
Assay technology
Assay techniques that may be used to determine levels of gene expression, such as a LSG of the present invention, in a sample derived from a host are well-known to those of skill in the art. Such assay methods include radioimmunoassays, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) assays, immunohistochemical assays, in situ hybridization assays, competitive binding assays, Western blot analysis and ELISA assays. In particular, ELISA is often preferred for diagnosing gene expressed proteins in biological fluids.
[0029]
If not readily available from a commercial source, an ELISA assay first involves preparing an antibody specific to LSG, preferably a monoclonal antibody. In addition, generally a reporter antibody is prepared that specifically binds to LSG. The reporter antibody is attached to a detectable reagent, such as a radioactive, fluorescent or enzymatic reagent, such as horseradish peroxidase enzyme or alkaline phosphatase.
[0030]
To perform the ELISA, an antibody specific for LSG is incubated on a solid support that binds to the antibody, such as a polystyrene plate. Thereafter, any unbound protein binding sites on the plate are coated by incubation with a non-specific protein such as bovine serum albumin. The sample to be analyzed is then incubated in the plate, during which time LSG binds to specific antibodies attached to the polystyrene plate. Unbound sample is washed away with buffer. A reporter antibody specifically directed to LSG and bound to horseradish peroxidase is added to the plate so that the reporter antibody binds to any monoclonal antibody linked to LSG. Thereafter, unbound reporter antibody is washed away. Thereafter, reagents for peroxidase activity, including a colorimetric substrate, are added to the plate. Immobilized peroxidase bound to the LSG antibody produces a color reaction product. The amount of color that appears in a given period is proportional to the amount of LSG protein present in the sample. Quantitative results are typically obtained by matching to a standard curve.
[0031]
A competitive assay may be used, in which an antibody specific for LSG is attached to a solid support, and labeled LSG and a sample from the host are run over the solid support. The amount of label detected that is attached to the solid support can then correlate with the amount of LSG in the sample.
[0032]
A nucleic acid method may be used to detect LSG mRNA as a marker for lung cancer. Malignant cells may be detected for diagnosis and monitoring of various malignancies using polymerase chain reaction (PCR) and other nucleic acid methods such as ligase chain reaction (LCR) and nucleic acid sequence-based amplification (NASABA) . For example, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is a powerful technique that can be used to detect the presence of specific mRNA populations in a complex mixture of thousands of other mRNA species. In RT-PCR, first, reverse transcriptase is used to reverse transcribe the mRNA species into complementary DNA (cDNA); then the cDNA is amplified as in a standard PCR reaction. Therefore, RT-PCR can reveal the presence of a single species of mRNA by amplification. Thus, if the mRNA is very specific for the cell producing the mRNA, it is possible to use RT-PCR to identify the presence of a particular type of cell.
[0033]
Hybridization (ie, gridding) to clones or oligonucleotides arrayed on a solid support may be used to detect the expression of the gene and to quantify the expression level of the gene . In this approach, the cDNA encoding the LSG gene is immobilized on a support. The support can be of any suitable type, including but not limited to glass, nitrocellulose, nylon or plastic. At least a portion of the DNA encoding the LSG gene attaches to the support and is then incubated with an analyte that may be RNA isolated from the tissue of interest or a complementary DNA (cDNA) copy of the RNA. Hybridization between support-bound DNA and analyte includes, but is not limited to, several analytes, including radioactive or fluorescent labels on the analyte, or secondary molecules designed to detect hybrids. It may be detected and quantified by means. Quantification of gene expression levels may be performed by comparing the intensity of the signal from the analyte with that determined from known standards. A standard may be obtained by in vitro transcription of the target gene, quantifying the yield, and then using that element to generate a standard curve.
[0034]
The above tests may be performed on a variety of patient cells, body fluids and / or tissue extracts (homogenate or solubilized tissue), such as samples from tissue biopsy and autopsy material. Body fluids useful in the present invention include blood, urine, saliva, or any other body secretion or derivative thereof. The blood may include whole blood, plasma, serum, or any blood derivative.
[0035]
【Example】
The invention is further illustrated by the following examples. These examples are provided solely to illustrate the present invention by reference to specific embodiments. These illustrations illustrate certain aspects of the invention, but do not represent a limitation or limit the disclosed invention.
Example 1: LSG
A search was performed using the following search tool as part of the LIFESEQ® database available from Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif., And LSGs were identified:
1. Library comparison (compare one library with another library) allows identification of clones that are expressed in tumors and not present in normal tissue or expressed at lower levels in normal tissue To do.
2. Subsetting is similar to a library comparison, but is expressed in a pool of libraries and is not present in a pool of second libraries or expressed at a lower level in a pool of second libraries Allows identification of clones to be performed.
3. Transcription imaging lists all clones in a single library or pool of libraries based on abundance. Thereafter, an electronic Northern may be used to examine individual clones and determine the tissue source of its component EST.
4). Protein function: Incyte has identified a subset of ESTs that may have protein function based on homology to known proteins. Some examples of this database include transcription factors and proteases. By searching this database for clones whose component EST shows disease specificity, several lead genes were identified.
[0036]
Using electronic subtraction, transcriptional imaging and protein function search, we identified clones whose constituent ESTs were found more frequently only in or in a particular tumor-derived library. Individual candidate clones were examined in detail by ascertaining where each EST occurred.
[0037]
Table 1: LSG
[0038]
[Table 1]

[0039]
Except where otherwise described in detail, the following examples were performed using standard techniques well known to those of skill in the art and routine. Routine molecular biology techniques in the following examples are described in standard laboratory manuals such as Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) ).
Example 2: Relative quantification of LSG gene expression
Real-time quantitative PCR using a fluorescent Taqman probe is a quantified detection system that utilizes the 5'-3 'nuclease activity of Taq DNA polymerase. The method uses an internal fluorescent oligonucleotide probe (Taqman) labeled with a 5 'reporter dye and a downstream 3' quenching dye. During PCR, the 5′-3 ′ nuclease activity of Taq DNA polymerase releases a reporter whose fluorescence is then detected by a laser detector of a model 7700 sequence detection system (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.). May be.
[0040]
Endogenous control amplification is used to normalize the amount of sample RNA added to the reaction and normalize reverse transcriptase (RT) efficiency. Either cyclophilin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) or 18S ribosomal RNA (rRNA) is used as this endogenous control. To calculate the relative quantification between all the samples examined, the target RNA level for one sample is used as the basis for the comparison results (calibrator). Quantification relative to the “reference value” can be obtained using standard curve methods or comparison methods (User Bulletin # 2: ABI PRISM 7700 sequence detection system).
[0041]
Tissue distribution and levels of target genes were evaluated for each sample in normal and cancerous tissues. Total RNA was extracted from normal tissues, cancer tissues, and from cancer and corresponding adjacent tissues. Subsequently, first strand cDNA was prepared with reverse transcriptase, and polymerase chain reaction was performed using primers specific to each target gene and Taqman probe. Results were analyzed using an ABI PRISM 7700 sequence detector. The absolute number is the relative expression level of the target gene in a particular tissue compared to a reference value tissue.
[0042]
Comparative example
As a comparative example, similar mRNA expression analysis was performed on genes encoding diagnostic markers PSA (prostate specific antigen) and PLA2 (phospholipase A2). PSA is the only cancer screening marker currently available in clinical laboratories. When analyzing a series of normal tissue pools, PSA was expressed in the prostate at very high levels and very low in the breast and testis. Analysis of more than 55 corresponding samples from 14 different tissues confirmed the tissue specificity seen in normal tissue samples. PSA expression in cancer and normal adjacent tissues was compared for 12 corresponding samples of prostate tissue. The relative level of PSA was higher (83%) in 10 cancer samples. Recently obtained clinical data support the use of PLA2 as a staging marker for the late stage of prostate cancer. Our mRNA expression data showed mRNA overexpression in 8 of the 12 prostate matched samples analyzed (66%). The tissue specificity of PLA2 was not as good as that described for PSA. In addition to the prostate, the small intestine, liver and pancreas also showed high levels of PLA2 mRNA expression.
[0043]
SEQ ID NO: 1; clone no. 126758; measurement of gene no. 29997 (Lng101)
The anonymous numbers shown in Table 2 are relative expression levels of LSG Lng101 (SEQ ID NO: 1) in 12 normal different tissues. All values are relative to normal testis (reference value). These RNA samples are commercially available pools, generated by pooling samples of specific tissues from different individuals.
[0044]
Table 2: Rel101 expression relative levels in pool samples
[0045]
[Table 2]

[0046]
The relative expression levels in Table 2 indicate that mRNA expression of LSG Lng101 (SEQ ID NO: 1) is very high in lung (72716) compared to all other normal tissues analyzed. The reference levels of testis, heart (1.55), and mammary gland (2) with relative expression level 1 are the tissues that express Lng101 mRNA. These results demonstrated that Lng101 mRNA expression is very specific for the lung.
[0047]
The unnamed numbers in Table 2 were obtained by analyzing a pool of specific tissue samples from different individuals. These cannot be compared to the anonymous numbers generated from RNA obtained from single individual tissue samples in Tables 3-4.
[0048]
The anonymous numbers shown in Table 3-4 are relative expression levels of Lng101 in 44 pairs of corresponding samples. All values are relative to normal testis (reference value). A corresponding pair is formed by mRNA from a cancer sample of a particular tissue and mRNA from a normal adjacent sample of the same tissue of the same individual.
[0049]
Table 3-4: Rng101 expression relative levels in individual samples
[0050]
[Table 3]

[0051]
[Table 4]

[0052]
0 = negative
When the corresponding samples were analyzed, expression levels were higher in the lungs, indicating a high degree of tissue specificity for this tissue. These results confirm the tissue specificity results (Table 2) obtained with a series of normal pool samples.
[0053]
Furthermore, the mRNA expression level in the cancer sample derived from the same individual and the same type syngeneic normal adjacent tissue was compared. This comparison provides a measure of specificity for the cancer stage (eg, higher mRNA expression levels in cancer samples compared to normal adjacent samples). Table 3-4 shows LSG Lng101 overexpression in 6 lung cancer tissues (lung samples # 4, 8, 10, 14, 16, and 18) compared to each normal adjacent tissue. Overexpression in cancer tissues was seen for 30% of the lung counterparts tested (total 20 lung counterparts).
[0054]
In summary, in addition to the high level of tissue specificity, overexpression of mRNA in 30% of the lung counterparts tested demonstrates that LSG Lng101 (SEQ ID NO: 1) is a diagnostic marker for lung cancer. The amino acid sequence encoded by Lng101 (SEQ ID NO: 1) is shown in SEQ ID NO: 7.
[0055]
Measurement of SEQ ID NO: 3; Clone No. 3107312; Gene No. 242842 (Lng105)
The anonymous numbers shown in Table 5 are relative expression levels of LSG Lng105 (SEQ ID NO: 3) in 12 normal different tissues. All values are relative to normal kidney (reference value). These RNA samples are commercially available pools, generated by pooling samples of specific tissues from different individuals.
[0056]
Table 5: Rng105 expression relative levels in pooled samples
[0057]
[Table 5]

[0058]
The relative expression levels in Table 5 indicate that mRNA expression of LSG Lng105 (SEQ ID NO: 3) is more than 16 times higher in the normal lung pool (9248) compared to the second highest expressing tissue (kidney 558). . All other pooled tissue samples analyzed showed very low levels of expression for Lng105 (SEQ ID NO: 3). These results demonstrate that LSG Lng105 (SEQ ID NO: 3) mRNA expression is very specific for the lung.
[0059]
The anonymous numbers in Table 5 were obtained by analyzing a pool of samples of specific tissues from different individuals. It is impossible to compare these with the anonymous numbers generated from RNA from single individual tissue samples in Tables 6-8.
[0060]
The anonymous numbers shown in Tables 6-8 are relative expression levels of Lng105 (SEQ ID NO: 3) in 61 pairs of corresponding samples. All values are relative to the normal small intestine (reference value). A corresponding pair is formed by mRNA from a cancer sample of a particular tissue and mRNA from a normal adjacent sample of the same tissue of the same individual.
[0061]
Tables 6-8: Rng105 expression relative levels in individual samples
[0062]
[Table 6]

[0063]
[Table 7]

[0064]
[Table 8]

[0065]
0 = negative
When the corresponding samples were analyzed, the expression level was higher in the lung and showed a high degree of tissue specificity for lung tissue. These results confirm the tissue specificity results (Table 5) obtained with normal pool samples.
[0066]
Furthermore, the mRNA expression level in the cancer sample derived from the same individual and the same type syngeneic normal adjacent tissue was compared. This comparison provides a measure of specificity for the cancer stage (eg, higher mRNA expression levels in cancer samples compared to normal adjacent samples). Tables 6-8 show in 13 lung cancer tissues (lung samples # 1, 3, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 24, and 25) compared to each normal adjacent tissue FIG. 6 shows overexpression of LSG Lng105 (SEQ ID NO: 3). Overexpression in cancer tissue is seen for 46% of the colon-matched samples tested (total 28 lung-matched samples).
[0067]
In summary, in addition to the high level of tissue specificity, mRNA overexpression in nearly half of the lung counterparts tested demonstrates that Lng105 (SEQ ID NO: 3) is a diagnostic marker for lung cancer. The amino acid sequence encoded by Lng105 (SEQ ID NO: 3) is shown in SEQ ID NO: 8.
[0068]
Measurement of SEQ ID NO: 6; Clone No. 586271; Gene No. 242745 (Lng107)
The anonymous numbers shown in Table 9 are relative expression levels of LSG Lng107 (SEQ ID NO: 6) in 12 normal different tissues. All values are relative to normal mammary gland (reference value). These RNA samples are commercially available pools, generated by pooling samples of specific tissues from different individuals.
[0069]
Table 9: Rel107 expression relative levels in pooled samples
[0070]
[Table 9]

[0071]
The relative expression levels in Table 9 indicate that the mRNA expression of LSG Lng107 (SEQ ID NO: 6) is 23 times higher in the normal lung pool (23) compared to the expression level of the reference value mammary gland (1). All other tissues analyzed were negative for Lng107 (SEQ ID NO: 6). These results demonstrate that Lng107 mRNA expression is very specific for the lung.
[0072]
The unnamed numbers in Table 9 were obtained by analyzing a pool of specific tissue samples from different individuals. It is impossible to compare these with the anonymous numbers generated from RNA obtained from single individual tissue samples in Tables 10-12.
[0073]
The anonymous numbers shown in Tables 10-12 are relative expression levels of LSG Lng107 (SEQ ID NO: 6) in 57 pairs of corresponding samples. All values are relative to normal prostate (reference value). A corresponding pair is formed by mRNA from a cancer sample of a particular tissue and mRNA from a normal adjacent sample of the same tissue of the same individual.
[0074]
Table 10-12: Rng107 expression relative levels in individual samples
[0075]
[Table 10]

[0076]
[Table 11]

[0077]
[Table 12]

[0078]
0 = negative
When the corresponding samples were analyzed, expression levels were higher in the lungs, indicating a high degree of tissue specificity for this tissue. These results confirm the tissue specificity results (Table 9) obtained with normal pool samples.
[0079]
Furthermore, the mRNA expression level in the cancer sample derived from the same individual and the same type syngeneic normal adjacent tissue was compared. This comparison provides a measure of specificity for the cancer stage (eg, higher mRNA expression levels in cancer samples compared to normal adjacent samples). Tables 10-12 show 15 lung cancer tissues (lung samples # 13, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 20, and 22 compared to each normal adjacent tissue. ) Overexpression of LSG Lng107 (SEQ ID NO: 6). Overexpression in cancer tissues is seen for 57% of the lung counterparts tested (total 26 lung counterparts).
[0080]
In summary, in addition to the high level of tissue specificity, overexpression of mRNA in more than half of the lung counterparts tested demonstrates that Lng107 is a diagnostic marker for lung cancer. The amino acid sequence encoded by Lng107 is shown in SEQ ID NO: 9.

Claims

A method for detecting the presence of lung cancer in a sample obtained from a patient comprising:
(A) related cells obtained from a patient, to measure the level of more encoded protein in a sample tissue or body fluid Re polynucleotide or its SEQ ID NO: 3; and (b) of SEQ ID NO: 3 polynucleotide or its the measured level of protein that is more encoded Les, related cells obtained from healthy human control, but compared with the more encoded protein level in Re polynucleotide or its SEQ ID NO: 3 in a sample of tissue or fluid, wherein said method increases the measured level of protein comprises associated with the presence of lung cancer are more codes to Re polynucleotide or its SEQ ID NO: 3 in the patient with respect to the level in healthy human control.

The method of claim 1, wherein the polypeptide of SEQ ID NO: 8 encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 3 is measured.