JP3686917B2 - Incubator for trace samples - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNA関連分野において汎用されているPCR法のようなプログラマブル・インキュベーターにおいて、反応容器(インキュベーター)の温度の制御をより容易かつ正確に行えるインキュベーターに関する。
【0002】
【従来の技術と発明の背景】
酵素反応等の化学反応を行う上で、その温度を正確に制御することは、最適な反応条件を保ち、その最適な反応収量、反応効率を達成する上で非常に重要なことである。そのため、至適温度条件を経時的に変化させる場合、コンピューターで温度制御されたインキュベーターを使用して反応の初めから温度条件とそれを達成する時間を予めセットしておくことが多い。特に最近では、PCRによるDNAの増幅が盛んに行われ、その需要が益々増加している。さらに、遺伝子診断やゲノムプロジェクトにおいて、コストやスペースさらには労働量を上げずに、反応数を大幅に増やす必要性が増している。そのため、反応混合物(検体)の容量を減らして、より多数のサンプルを同時に処理できる方法に対する要望がある。
【0003】
多数の微量検体の温度制御を並行して行うには以下のような問題がある。
(1)反応温度を比較的高温にする必要がある場合、検体の量が微量であるため、検体中の溶媒(通常は水)が蒸発して反応がそれ以上進行しなくなることがある。これは、検体を収納しているテストチューブの上部の温度が検体の温度より低いため、テストチューブの上部の壁面に蒸発した水蒸気が液化してしまうためである。
(2)そこで検体からの水の蒸発を防止するために、ミネラルオイル等を検体上に重層することが行われる。しかるに、検体の量がより微量になると、ミネラルオイルの下の検体をサンプリングすることが困難になる。
【0004】
このような問題を解決する手段として、検体を収納しているテストチューブの上部の温度を水の沸点以上の温度に維持して、テストチューブの上部の壁面への液化を防止することが提案されている。図2に示すように、テストチューブ30内の検体を加熱するためのヒーター32以外にテストチューブの上部を加熱するヒーター32(ホットボンネット)を備えたインキュベーター33が知られている(DNA engine、MJ research 社製) 。具体的には、テストチューブの上部を加熱するヒーター32は約105℃に維持されている。
このインキュベーター33は、通常500μlのテストチューブを用い、かつ約50μlの検体について良好に使用されている。
しかるに、前述のように、より少ない検体量でより多数の検体を一度に処理しようとする場合、検体量を上記50μlより少ない量、例えば、0.5〜25μl程度とすることが望まれる。
さらに、多数の検体を一度に並行して処理する場合、テストチューブの使用は煩雑であり、テストチューブ以外の多数の検体を一度に並行して処理できる反応容器の使用が望まれる。
【0005】
そこで本発明者らは、一定の厚みのプレートに一定の深さの孔(ウエル)を多数設けたマイクロタイタープレートを用いたインキュベーターの作成を試みた。その結果、上記テストチューブを用いる場合には、個々のテストチューブの温度を独立に制御することが可能であるが、マイクロタイタープレート全体について、しかも各孔中の検体の温度をむらなく正確に制御することが必要であることが判明した。即ち、マイクロタイタープレート中の各孔中の検体の温度が正確に制御されないと、孔によって所望の反応が進行しないという問題があることが判明した。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、マイクロタイタープレートを用いたインキュベーターであって、検体の温度を正確に制御することが可能なインキュベーターを提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明のインキュベーターは、反応混合物を収納するための複数の孔を有する基板からなる反応容器と
前記反応容器の温度を変化させるための少なくとも1つの温度コントローラーを有し、
前記孔に収納された反応混合物の温度を経時に変化させて前記反応混合物の反応を進行させるためのインキュベーターであって、
前記反応容器と前記温度コントローラーとの間に、前記反応容器と前記温度コントローラーとの間の熱の伝導を促進する手段を介在させることを特徴とするインキュベーターに関する。
【0008】
本発明のインキュベーターの1つの実施態様として、
温度コントローラーが1対の温度コントローラー(1)及び温度コントローラー(2)からなり、
温度コントローラー(1)は反応容器の孔に収納される反応混合物の温度(1)を制御し、
温度コントローラー(2)は、反応容器の孔の開口を封鎖する部材の孔の内壁であって、かつ前記反応容器に収納される反応混合物の液面と対向する面の温度(2)を制御するものであり、
熱伝導促進手段を温度コントローラー(1)と反応容器との間、温度コントローラー(2)と反応容器との間、または温度コントローラー(1)及び温度コントローラー(2)と反応容器とのそれぞれの間に設けるインキュベーターを挙げることができる。
【0009】
【発明の実施の態様】
本発明のインキュベーターにおいては、反応容器と温度コントローラーとの間に、反応容器と温度コントローラーとの間の熱の伝導を促進する「熱伝導促進手段」を介在させることが特徴である。反応容器と温度コントローラーとは、通常密着させることが難しく、両者の密着が不良であると、反応容器の検体の温度制御が良好に行われず、その結果、所望の反応生成物が得られなくなる。本発明では、両者の間に「熱伝導促進手段」を介在させることで上記問題を解決している。
【0010】
「熱伝導促進手段」としては、例えば、柔軟性でかつ熱伝導性のシートを挙げることができる。柔軟性を有することにより、反応容器と温度コントローラーとの密着を維持できる。また、熱伝導性であることで、反応容器と温度コントローラーとの間の熱の移動を促進し、検体(反応混合物)の温度制御をより正確に行うことができる。
【0011】
「柔軟性でかつ熱伝導性のシート」としては、例えば、熱伝導性樹脂製シートを挙げることができ、熱伝導性樹脂製シートとしては、例えば、が熱伝導性シリコーンシートを挙げることができる。熱伝導性シリコンシートは、例えば、放熱ゴムシートとして信越シリコーンから市販されており、電子部品の放熱材料として使用されている柔軟性と高い熱伝導性とを有するものである。また、「柔軟性でかつ熱伝導性のシート」として、柔軟性グラファイトシートを挙げることもできる。柔軟性グラファイトシートは、松下電器産業からパナソニックグラファイトシートとして市販されているもので、柔軟性と高い熱伝導性とを有するものである。
【0012】
以下本発明のインキュベーターを図1に基づいて説明する。図1に示すインキュベーターは、1対の温度コントローラーを有し、かつ一方の温度コントローラーと反応容器との間に熱伝導促進手段を有する態様である。
本発明のインキュベーター1は、反応混合物(検体)10を収納するための複数の孔11を有する基板12からなる反応容器13と前記反応容器13の温度を変化させるための少なくとも1つの温度コントローラーを有する。図1においては、1対の温度コントローラー(1)及び(2)21、22を有する。
【0013】
複数の孔を有する基板12が金属製であることが、コントローラーの温度を反応混合物(検体)10に反映させやすく、反応の制御がより正確にできるという観点から好ましい。但し、反応混合物、特に酵素活性に対する金属の阻害作用を防止したり、或いは内壁の濡れ特性を改質する目的で、前記孔の内壁は、ポリマー等で表面コートすることもできる。
【0014】
また、基板12に形成されている孔は、底が封鎖されていて反応用の空間を形成しているものであることができる。またそれ以外に、基板12に形成されている孔が基板12を貫通していて、基板12と積層する温度コントローラー(1)で直接、または温度コントローラー(1)との間に介在させる熱伝導促進手段または適当な中間シートやフィルムによって、底を形成して反応用の空間を形成するものであることもできる。前記孔が貫通孔である場合、貫通孔を有する基板を反応媒体や試薬等含む溶液に浸漬することで、前記溶液を多数の孔に一度に供給することができるという利点がある。
【0015】
本発明のインキュベーターは、検体の量が少なくても良好に反応を行うことができるものであり、従って、容量の少ない反応に特に好ましく使用できる。しかし、容量の大きい範囲においても同様に適用できるものであり、反応容器に設けられる孔の容量に何ら制限はない。但し、微量検体向け(少量の検体を多数処理する)という観点からは、反応容器の容量が1〜100μlの範囲、好ましくは1〜50μlの範囲〔その中に収納される反応混合物(検体)の容量は0.5〜50μlの範囲、好ましくは0.5〜20μlの範囲〕であることが適当である。但し、反応容器の容量及び反応混合物(検体)の容量はさらに減少させて小型化することも可能であり、例えば、反応容器及び反応混合物(検体)をマイクロチップ化してnl(ナノリットル)オーダーで行うインキュベーターを作成することも可能である。
【0016】
温度コントローラー(1)21は、1つまたは複数の部分からなることができ、例えば、ペルチェ素子を用いることができる。温度コントローラー(1)21は、前記反応容器13の孔に収納される反応混合物10の温度(1)を制御する。図1においては、温度コントローラー(1)21は、熱伝導促進手段であるシートを介して反応容器13と接触している。
温度コントローラー(2)22は、1つまたは複数の部分からなることができ、例えば、ペルチェ素子を用いることができる。温度コントローラー(2)22は、前記反応容器13の孔の開口14を封鎖する部材(図示せず)の孔の内壁を構成する液面の温度(2)を制御するように前記反応容器13と接している。
尚、前記反応容器13の孔11の開口14を封鎖する部材は、例えば、複数の孔を同時に封鎖できるという観点から、シートまたはフィルムであることが適当である。また、温度コントローラー(2)22と反応容器13との間に熱伝導促進手段であるシートを介在させる場合、孔11の開口14を前記熱伝導促進手段であるシートにより封鎖することもできる。
【0017】
但し、反応混合物から発生する水蒸気が容器外に流出することを実質的に防止しつつ行うことが、反応の進行に有利である場合、反応容器13の孔11の開口14は、反応混合物が実質的に密封された状態になるように封鎖することが好ましい。水蒸気の容器外への流出を防止することで、反応を良好に行うことができる。ある程度以上の水蒸気が容器外へ流出し、乾燥してしまうと、反応は停止してしまうことがある。
【0018】
上記本発明のインキュベーターを用いて、反応容器の孔に収納された反応混合物の温度を経時に変化させて前記反応混合物の反応を進行させることができる。但し、本発明のインキュベーターは、そこでインキュベートする反応混合物に含まれる成分やそこで進行する反応については全く制限はない。反応温度を経時に変化させる反応であれば良い。酵素反応等の生体系の反応を例示することができる。さらに、酵素反応の例としてPCR法を例示することができる。また、反応混合物の反応は、温度コントローラー(1)の温度の経時変化を周期的に行う反応であることができ、その例としてPCR法を挙げることができる。
【0019】
本発明のインキュベーターを用いて反応を行う場合、反応容器内の反応混合物の温度(1)と、前記空間に接する反応容器の内壁の少なくとも前記反応混合物の表面と対向する液面の温度(2)とを、温度(2)が温度(1)より高くなるように、かつ温度(1)と温度(2)が連動して変化するように制御することが、反応混合物(検体)の温度を正確に制御するという観点からより好ましい。即ち、温度(1)が上がれば、それに連動して、温度(2)も上がり、逆に温度(1)が下がれば、それに連動して、温度(2)も下がるように温度制御を行うことが好ましい。
【0020】
但し、温度(1)と温度(2)との温度差は、常に一定である必要はなく、ある幅をもってその範囲内にあれば良い。また、温度(1)と温度(2)との温度差が大きすぎると、温度(1)の制御が難しくなり(温度(1)が設定より高くなりすぎて)、反応を良好に進行させにくくなる。一方、温度(1)と温度(2)との温度差が小さいと、特に温度(1)が高温で、水蒸気圧が高くなると、検体中の水分の消失を招き易い。そこで、例えば、温度(1)と温度(2)とは、温度(1)と温度(2)との温度差が1〜30℃の範囲内、好ましくは2〜20℃の範囲内に維持されるように連動して変化させることが適当である。
【0021】
【実施例】
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
以下の実施例では、PCR反応を例にとり、図1に示す本発明のインキュベーター(RIKEN GS-384) を用いた。また、従来の機種として、MJ research 社製DNA engineを用いた。
実施例
PCR反応液
PCRは、鋳型DNAとしてヒト甲状腺刺激ホルモンのβ鎖のcDNAクローンであるBS750を用いた。インサートDNAのサイズは680bpである。反応液は、BS750を10pg、dNTP(dGTP、dCTP、dATP、dTTPそれぞれ)50μM、10x EXバッファー(25mMTAPS緩衝液、50mM KCl、2mM MgCl2 、1mM 2−メルカプトエタノール)1μl、プライマーL220とプライマー1211(L2205'TAACAATTTCACACAGGAAACA3'、1211:5'ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT3'、それぞれ)0.2pmole、EX Taq(5U/μl)を加え、滅菌蒸留水にて全量が10μlとなるように調製する。
【0022】
但し、RIKEN GS-384を使用する場合、反応容器は、アルミ板(厚み約4mm)に開けられた直径3mm、深さ3mmの孔(容量約21μl)として、上記PCR反応液を収納した。
DNA engine用には、PCR反応液の調製を5倍のスケールで行い、最終量が50μlとなるようにした。また、テストチューブとしては500μlの容量のものを用いた。
【0023】
PCRサイクルと電気泳動による増幅の検出
94℃、3分間インキュベートした後、〔94℃1分間−55℃1分間−72℃1分間〕を35サイクル繰り返す。その後、72℃10分間インキュベーションし、4℃で保存する。
【0024】
〔94℃1分間−55℃1分間−72℃1分間〕の温度調整の際、MJ research 社製 DNA engineでは、熱伝導促進手段を用いず、RIKEN GS-384の場合には、熱伝導促進手段を用いない場合と、熱伝導促進手段として熱伝導性シリコーンシート(放熱ゴムシートTC−Aタイプ、信越シリコーン製)または熱伝導性カーボングラファイトシート(パナソニックグラファイト、松下電器産業製)を反応容器13と温度コントローラー(1)21との間に介在させた場合(本発明のインキュベーター)の3通りを行った。
【0025】
さらに、表1に示すように、PCR反応液が鋳型DNAとプライマーとを含む場合(レーン1〜4)、PCR反応液が鋳型DNAを含まない場合(レーン5〜8)、PCR反応液がプライマーを含まない場合(レーン9〜12)についてそれぞれPCR反応を行い、反応後、PCR反応液を0.8%アガロースゲルを用いて1X TBEバッファー中にて電気泳動に供した。そのパターンを図3に図面に代わる写真として示す。
【0026】
図3の電気泳動写真から、PCR反応液が鋳型DNAまたはプライマーを含まないレーン5〜12については、PCR増幅産物のスポットが見られない。また、熱伝導促進手段を用いないRIKEN GS-384の場合(レーン2)には、PCR増幅産物のスポットが見られず、反応の進行が良好に行われなかったことを示す。
それに対して、反応液量か10μlであるにも係わらず、熱伝導性シリコーンシートまたは熱伝導性カーボングラファイトシートを用いてPCRを行ったレーン3及び4(本発明の方法の実施例)では、5倍量のPCR反応液を用いたDNA engineの場合(レーン1)と同様のPCR増幅産物のスポットが見られ、良好にPCR反応が進行していることが分かる。
【0027】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明のインキュベーターの概略図。
【図2】 従来のインキュベーターの概略図。
【図3】 実施例のPCR産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代わる写真。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an incubator capable of more easily and accurately controlling the temperature of a reaction vessel (incubator) in a programmable incubator such as a PCR method widely used in DNA-related fields.
[0002]
[Background Art and Background of the Invention]
In conducting a chemical reaction such as an enzymatic reaction, accurately controlling the temperature is very important for maintaining the optimum reaction conditions and achieving the optimum reaction yield and reaction efficiency. For this reason, when the optimum temperature condition is changed over time, the temperature condition and the time for achieving the temperature condition are often set in advance from the beginning of the reaction using an incubator temperature-controlled by a computer. Recently, in particular, amplification of DNA by PCR has been actively performed, and the demand has been increasing. In addition, there is an increasing need to increase the number of reactions in genetic diagnosis and genome projects without increasing costs, space, and labor. Therefore, there is a need for a method that can reduce the volume of the reaction mixture (analyte) and process a larger number of samples simultaneously.
[0003]
There are the following problems in performing temperature control of a large number of trace samples in parallel.
(1) When the reaction temperature needs to be relatively high, since the amount of the sample is very small, the solvent (usually water) in the sample may evaporate and the reaction may not proceed further. This is because the water vapor evaporated on the upper wall surface of the test tube is liquefied because the temperature at the top of the test tube containing the sample is lower than the temperature of the sample.
(2) In order to prevent water evaporation from the specimen, mineral oil or the like is layered on the specimen. However, when the amount of the sample becomes smaller, it becomes difficult to sample the sample under the mineral oil.
[0004]
As a means to solve such problems, it has been proposed to maintain the temperature of the upper part of the test tube containing the specimen at a temperature higher than the boiling point of water to prevent liquefaction on the upper wall surface of the test tube. ing. As shown in FIG. 2, an incubator 33 having a heater 32 (hot bonnet) for heating the upper part of the test tube is known in addition to the
This incubator 33 normally uses a 500 μl test tube and is well used for about 50 μl of specimen.
However, as described above, when a larger number of samples are to be processed at a time with a smaller sample volume, it is desirable that the sample volume be less than 50 μl, for example, about 0.5 to 25 μl.
Furthermore, when a large number of samples are processed in parallel at the same time, the use of a test tube is complicated, and the use of a reaction container that can process a large number of samples other than the test tube at the same time is desired.
[0005]
Therefore, the present inventors tried to create an incubator using a microtiter plate in which a plate having a constant thickness was provided with a number of holes (wells) having a constant depth. As a result, when using the above test tubes, the temperature of each test tube can be controlled independently. However, the temperature of the sample in each hole can be accurately controlled for the entire microtiter plate. It turned out to be necessary. That is, it has been found that if the temperature of the specimen in each hole in the microtiter plate is not accurately controlled, a desired reaction does not proceed due to the hole.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide an incubator using a microtiter plate, which can accurately control the temperature of a specimen.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The incubator of the present invention has a reaction vessel comprising a substrate having a plurality of holes for containing a reaction mixture, and at least one temperature controller for changing the temperature of the reaction vessel,
An incubator for changing the temperature of the reaction mixture accommodated in the holes over time to advance the reaction mixture;
The present invention relates to an incubator characterized in that means for promoting heat conduction between the reaction vessel and the temperature controller is interposed between the reaction vessel and the temperature controller.
[0008]
As one embodiment of the incubator of the present invention,
The temperature controller consists of a pair of temperature controller (1) and temperature controller (2),
The temperature controller (1) controls the temperature (1) of the reaction mixture stored in the hole of the reaction vessel,
The temperature controller (2) controls the temperature (2) of the inner wall of the hole of the member that seals the opening of the hole of the reaction vessel and the surface facing the liquid level of the reaction mixture stored in the reaction vessel. Is,
The heat conduction promoting means is provided between the temperature controller (1) and the reaction vessel, between the temperature controller (2) and the reaction vessel, or between the temperature controller (1) and the temperature controller (2) and the reaction vessel. An incubator to be provided can be mentioned.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The incubator of the present invention is characterized in that a “heat conduction promoting means” for promoting heat conduction between the reaction vessel and the temperature controller is interposed between the reaction vessel and the temperature controller. The reaction vessel and the temperature controller are usually difficult to adhere to each other. If the adhesion between the reaction vessel and the temperature controller is poor, the temperature of the specimen in the reaction vessel cannot be controlled well, and as a result, a desired reaction product cannot be obtained. In the present invention, the above problem is solved by interposing “thermal conduction promoting means” between the two.
[0010]
Examples of the “heat conduction promoting means” include a flexible and heat conductive sheet. By having flexibility, adhesion between the reaction vessel and the temperature controller can be maintained. Moreover, by being heat conductive, heat transfer between the reaction vessel and the temperature controller can be promoted, and the temperature control of the specimen (reaction mixture) can be performed more accurately.
[0011]
Examples of the “flexible and thermally conductive sheet” include a thermally conductive resin sheet, and examples of the thermally conductive resin sheet include a thermally conductive silicone sheet. . The thermally conductive silicon sheet is commercially available from Shin-Etsu Silicone as a heat radiating rubber sheet, for example, and has flexibility and high thermal conductivity used as a heat radiating material for electronic components. Moreover, a flexible graphite sheet can also be mentioned as “a flexible and thermally conductive sheet”. The flexible graphite sheet is commercially available as a Panasonic graphite sheet from Matsushita Electric Industrial, and has flexibility and high thermal conductivity.
[0012]
Hereinafter, the incubator of the present invention will be described with reference to FIG. The incubator shown in FIG. 1 is an embodiment having a pair of temperature controllers and a heat conduction promoting means between one temperature controller and the reaction vessel.
The
[0013]
The
[0014]
Moreover, the hole formed in the board |
[0015]
The incubator of the present invention can perform a reaction satisfactorily even when the amount of the sample is small, and therefore can be particularly preferably used for a reaction with a small volume. However, the present invention can be similarly applied in a large capacity range, and there is no limitation on the capacity of the holes provided in the reaction vessel. However, from the viewpoint of a small amount of sample (a large amount of a small amount of sample is processed), the reaction container has a volume of 1 to 100 μl, preferably 1 to 50 μl [of the reaction mixture (sample) contained therein. The volume is suitably in the range of 0.5-50 μl, preferably in the range of 0.5-20 μl. However, the volume of the reaction vessel and the volume of the reaction mixture (specimen) can be further reduced to reduce the size. For example, the reaction vessel and the reaction mixture (specimen) can be made into microchips on the order of nl (nanoliter). It is also possible to create an incubator to do.
[0016]
The temperature controller (1) 21 can be composed of one or a plurality of parts, and for example, a Peltier element can be used. The temperature controller (1) 21 controls the temperature (1) of the
The temperature controller (2) 22 can be composed of one or a plurality of parts, and for example, a Peltier element can be used. The temperature controller (2) 22 is connected to the
The member for sealing the
[0017]
However, when it is advantageous for the progress of the reaction to substantially prevent the water vapor generated from the reaction mixture from flowing out of the container, the
[0018]
Using the incubator of the present invention, the reaction mixture can be reacted by changing the temperature of the reaction mixture accommodated in the holes of the reaction vessel over time. However, the incubator of the present invention has no limitation on the components contained in the reaction mixture incubated there and the reaction proceeding there. Any reaction that changes the reaction temperature over time may be used. Biological reactions such as enzymatic reactions can be exemplified. Furthermore, the PCR method can be illustrated as an example of the enzyme reaction. The reaction of the reaction mixture can be a reaction in which the temperature of the temperature controller (1) changes periodically with time, and an example thereof is a PCR method.
[0019]
When the reaction is carried out using the incubator of the present invention, the temperature (1) of the reaction mixture in the reaction vessel and the temperature (2) of the liquid level facing at least the surface of the reaction mixture on the inner wall of the reaction vessel in contact with the space. Is controlled so that the temperature (2) becomes higher than the temperature (1) and the temperature (1) and the temperature (2) change in conjunction with each other. It is more preferable from the viewpoint of control. That is, if the temperature (1) rises, the temperature (2) rises in conjunction with it, and conversely, if the temperature (1) falls, the temperature control (2) goes down accordingly. Is preferred.
[0020]
However, the temperature difference between the temperature (1) and the temperature (2) does not always have to be constant, and may be within a certain range. If the temperature difference between the temperature (1) and the temperature (2) is too large, it becomes difficult to control the temperature (1) (the temperature (1) becomes too higher than the setting), and it is difficult to proceed the reaction well. Become. On the other hand, when the temperature difference between the temperature (1) and the temperature (2) is small, particularly when the temperature (1) is high and the water vapor pressure is high, the moisture in the specimen is easily lost. Therefore, for example, the temperature difference between the temperature (1) and the temperature (2) is maintained within a range of 1 to 30 ° C., preferably within a range of 2 to 20 ° C. It is appropriate to change them in conjunction with each other.
[0021]
【Example】
The invention is further illustrated by the following examples.
In the following examples, the PCR reaction was taken as an example and the incubator (RIKEN GS-384) of the present invention shown in FIG. 1 was used. As a conventional model, DNA engine manufactured by MJ research was used.
Example
In the PCR reaction solution PCR, BS750 which is a cDNA clone of β-chain of human thyroid stimulating hormone was used as a template DNA. The size of the insert DNA is 680 bp. The reaction solution was 10 pg of BS750, 1 μl of dNTP (dGTP, dCTP, dATP, dTTP) 50 μM, 10 × EX buffer (25 mM TAPS buffer, 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol), primer L220 and primer 1211 ( L2205′TAACAATTTCACACAGGAAACA3 ′, 1211: 5′ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT3 ′, respectively) 0.2 pmol, EX Taq (5 U / μl) are added, and the total amount is adjusted to 10 μl with sterile distilled water.
[0022]
However, when RIKEN GS-384 was used, the reaction vessel contained the PCR reaction solution as a hole (capacity: about 21 μl) having a diameter of 3 mm and a depth of 3 mm opened in an aluminum plate (thickness: about 4 mm).
For the DNA engine, the PCR reaction solution was prepared on a 5-fold scale so that the final volume was 50 μl. A test tube having a capacity of 500 μl was used.
[0023]
Detection of amplification by PCR cycle and electrophoresis After incubation at 94 ° C for 3 minutes, [94 ° C for 1 minute-55 ° C for 1 minute-72 ° C for 1 minute] is repeated 35 cycles. Thereafter, it is incubated at 72 ° C. for 10 minutes and stored at 4 ° C.
[0024]
When adjusting the temperature of [94 ° C. for 1 minute-55 ° C. for 1 minute-72 ° C. for 1 minute], MJ research's DNA engine does not use heat conduction promotion means, and RIKEN GS-384 uses heat conduction promotion. When no means is used, a heat conductive silicone sheet (heat radiation rubber sheet TC-A type, manufactured by Shin-Etsu Silicone) or a heat conductive carbon graphite sheet (Panasonic Graphite, manufactured by Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.) is used as the heat conduction promoting means. And the temperature controller (1) 21 were used in three ways (incubator of the present invention).
[0025]
Furthermore, as shown in Table 1, when the PCR reaction solution contains a template DNA and a primer (
[0026]
From the electrophoresis photograph of FIG. 3, spots of PCR amplification products are not seen in
On the other hand, in the
[0027]
[Table 1]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view of an incubator according to the present invention.
FIG. 2 is a schematic view of a conventional incubator.
FIG. 3 is a photograph instead of a drawing, showing an agarose gel electrophoresis pattern of the PCR product of Example.
Claims (9)
前記孔に収納された反応混合物の温度を経時に変化させて前記反応混合物の反応を進行させるためのインキュベーターであって、前記反応容器と前記温度コントローラーとの間に、前記反応容器と前記温度コントローラーとの間の熱の伝導を促進する手段(以下、熱伝導促進手段という)を介在させ、かつ、
前記温度コントローラーが1対の温度コントローラー(1)及び温度コントローラー(2)からなり、温度コントローラー(1)は反応容器の孔に収納される反応混合物の温度(1)を制御し、温度コントローラー(2)は、反応容器の孔の開口を封鎖する部材の孔の内壁であって、かつ前記反応容器に収納される反応混合物の液面と対向する面の温度(2)を制御するものであり、熱伝導促進手段を温度コントローラー(1)と反応容器との間、温度コントローラー(2)と反応容器との間、または温度コントローラー(1)及び温度コントローラー(2)と反応容器とのそれぞれの間に設けることを特徴とするインキュベーター。A reaction vessel comprising a substrate having a plurality of holes for containing the reaction mixture and at least one temperature controller for changing the temperature of the reaction vessel;
An incubator for changing the temperature of the reaction mixture accommodated in the hole over time to advance the reaction of the reaction mixture, the reaction vessel and the temperature controller between the reaction vessel and the temperature controller A means for promoting heat conduction between the two (hereinafter referred to as heat conduction promoting means), and
The temperature controller comprises a pair of temperature controller (1) and temperature controller (2). The temperature controller (1) controls the temperature (1) of the reaction mixture stored in the hole of the reaction vessel, and the temperature controller (2 ) Controls the temperature (2) of the inner wall of the hole of the member sealing the opening of the hole of the reaction vessel and facing the liquid level of the reaction mixture stored in the reaction vessel, The heat conduction promoting means is provided between the temperature controller (1) and the reaction vessel, between the temperature controller (2) and the reaction vessel, or between the temperature controller (1) and the temperature controller (2) and the reaction vessel. An incubator characterized by being provided .
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