JP3683246B2

JP3683246B2 - Method for extending and fixing DNA

Info

Publication number: JP3683246B2
Application number: JP2002289855A
Authority: JP
Inventors: 敏郎大谷; 滋杉山; 智之吉野; めぐみ佐宗
Original assignee: 独立行政法人食品総合研究所; 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
Priority date: 2002-10-02
Filing date: 2002-10-02
Publication date: 2005-08-17
Anticipated expiration: 2022-10-02
Also published as: JP2004125601A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡを伸長、固定する方法に関し、詳しくはＤＮＡを基板上に配向、伸長して固定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを直線状に引き延ばし基板上に固定することは、ＤＮＡ上の遺伝子や特定塩基配列の位置を決定するために有用であり、生物学的・医学的に非常に重要な意味を持つ。
また、ＤＮＡは、ナノエレクトロニクスの分野においてもナノメートルレベルの自己組織化可能な配線材料として注目されており、ＤＮＡを基板上に配向させて固定することは、その基盤技術となる可能性が示唆されている。
最近、ナノメートルレベルの分解能を持つ原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope, AFM）や走査型近接場光プローブ顕微鏡（Scanning Near-field Optical/Atomic Force Microscope, SNOM/AFM ）などを用いて、DNA や遺伝子の位置を高分解能で検出したり、ナノメートルレベルの操作を行うことが可能になっている。
これらの技術を基板上に固定されたＤＮＡに適用するためには、原子レベルで平坦な表面が必要なため、多くの場合、劈開した雲母板が基板として使われている。
【０００３】
劈開した雲母基板表面および溶液中のＤＮＡ分子の双方とも負電荷を有するため、そのままではＤＮＡは雲母基板上には少量しか固定されない。そこで、従来は、ＤＮＡを雲母基板上に固定するために、基板表面をマグネシウムイオン（Mg²⁺）で処理したり、正電荷を有するアミノプロピルトリエトキシシラン（APS)などのシラン化合物を被覆するなどの手法（Langmuir 11 (1995), 655-659）がとられていた。また、ＤＮＡ含有溶液の液滴を置き、遠心力によりＤＮＡを引き伸ばして固定する方法（スピンコート法）も行われていた（Analytical Chemistry, 73 (2001), 5984-5991) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法ではMg²⁺処理またはAPS 被覆雲母基板表面とＤＮＡ分子の相互作用が強すぎるため、ＤＮＡは基板に屈曲した状態で固定されてしまい、直線状に伸長させることは困難であった。
また、スピンコート法では、ＤＮＡはある程度伸長されるが、固定位置が不定でかつ固定量が少ないため、ＤＮＡの位置を走査範囲の狭いAFM やSNOM/AFMにより捜すのは困難であるという問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明は、ＤＮＡを雲母基板上の広い範囲に渡って直線状に引き伸ばして固定する方法を提供することを目的とする。
請求項１記載の本発明は、ＤＮＡを雲母基板上に伸長固定する方法において、電荷を有しないアルキル基またはアリール基および１個以上３個以内のメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基を有するシラン化合物により表面を被覆した雲母基板上にＤＮＡ含有溶液を置き、ＤＮＡの末端を該被覆基板表面に付着させ、溶液の流れまたは気液界面の移動によりＤＮＡを配向、伸長させることを特徴とするＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項２記載の本発明は、シラン化合物の有するアルキル基が炭素数１〜４個の低級アルキル基であり、アリール基がフェニル基またはベンジル基であり、アルキル基を有するシラン化合物においてはアルキル基が１個以上３個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下１個以上であり、またアリール基を有するシラン化合物においてはアリール基が１個以上２個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下２個以上であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項３記載の本発明は、アルキル基を有するシラン化合物がメトキシトリメチルシラン、エトキシトリメチルシランまたはプロピルトリメトキシシランであり、アリール基を有するシラン化合物がフェニルトリメトキシシランであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項４記載の本発明は、シラン化合物で被覆した雲母基板がシラン化合物の蒸気により雲母基板の表面を被服し、必要に応じて該被覆基板を加熱して固定したものであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項５記載の本発明は、溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段が、重力、遠心力、電気泳動またはポンプによる送液または吸い上げであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡを基板上に配向、伸長して固定する方法である。本発明の対象とされるＤＮＡに制限はなく、あらゆる生物のゲノムまたはプラスミド、ファージ（ウイルス）、人工染色体などのベクターに由来するものでよく、長さも限定されない。
ＤＮＡを分散させる溶液は、例えばＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７〜８）、トリス緩衝液、蒸留水などが用いられ、これらの中ではＴＥ緩衝液が好ましい。
【０００７】
雲母基板の表面を被覆するために用いるシラン化合物としては、アルキル基またはアリール基とメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基の合計が最大４個になるすべての組み合わせが可能である。詳しくは、炭素数１〜４個の低級アルキル基（メチル基、エチル基など）またはアリール基（フェニル基、ベンジル基など）を有し、アルキル基を有するシラン化合物においてはアルキル基が１個以上３個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下１個以上であり、またアリール基を有するシラン化合物においてはアリール基が１個以上２個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下２個以上であるシラン化合物がある。なお、アリール基はアミノ基、ヒドロキシル基などの置換基を有していてもよい。具体的には、メトキシトリメチルシラン、エトキシトリメチルシラン、フェニルトリメトキシシランなどを挙げることができる。
シラン化合物を雲母基板の表面に被覆する方法としては、例えばシラン化合物を蒸気法、すなわちシラン化合物の蒸気にて該基板を被覆し、必要に応じて加熱処理を施して強固に被覆させることができる。
【０００８】
ＤＮＡを含む溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段としては、例えば重力、遠心力、電気泳動、ポンプ（電動等の自動または手動）などによる送液や吸い上げが挙げられる。いずれの方法でもＤＮＡを伸長することは可能であるが、ポンプによる一定速度での吸い上げ法が望ましい。
【０００９】
以下に、本発明を図面に基づいて詳しく説明する。
図１は、本発明によるＤＮＡの伸長、固定の操作手順を示したフローチャートである。工程１にて雲母板を劈開して新鮮な劈開面を露出させ、工程２で劈開した雲母基板をシラン化合物の溶液とともに密閉容器中に置く。シラン化合物量は容器容積１Ｌあたり１０〜１０００μＬが適当である。また、容器中には窒素などの不活性ガスを充填しても良い。工程３で４℃〜６０℃にて１時間乃至１週間、好ましくは１５〜３０℃にて４時間乃至６日間放置し、雲母基板表面をシラン化合物により被覆する。
【００１０】
工程４で基板を容器から取り出し、必要に応じて６０℃〜１２０℃にて５分間乃至１時間程度、望ましくは１００℃で１５分間以上加熱する。これにより、雲母表面へシラン化合物を強固に被覆することができる。加熱処理をしない場合は速やかに容器から取り出し、その上にＤＮＡ溶液（５〜２０μＬ）を滴下する。
次の工程５で１〜数分間放置する間に、ＤＮＡの末端とシラン化合物で被覆した基板表面との間の疎水性相互作用により、ＤＮＡの末端が疎水性シラン化合物で被覆した基板表面に付着する。
その後、工程６にて適当な吸引手段、例えばピペットまたはポンプにより緩やかに液滴を吸い上げて界面移動または水流を誘起し、ＤＮＡを基板上に伸長、固定する。
【００１１】
図２〜４は、実際に本発明の方法に基づいて雲母基板上に伸長、固定したＤＮＡの蛍光顕微鏡写真である。それぞれ、メトキシトリメチルシラン（図２）、エトキシトリメチルシラン（図３）またはフェニルトリメトキシシラン（図４）により被覆した雲母基板を使用している。
基板へのシラン化合物の被覆は、図１に示した方法に従い、窒素充填容器中で１６μＬ（容器容積１Ｌあたり）のシラン化合物を用いて行った。被覆反応の期間は１時間〜７日間が適当で、好適には４時間〜６日間である。フェニルトリメトキシシランの場合のみ、基板を１１０℃、２０分間加熱し、強固なシラン化を行った。その後、λファージＤＮＡ溶液（濃度５μｇ／ｍＬ）を５μＬ滴下し、１分間放置した後、ピペットで吸い上げた。図に示したように、いずれのシラン化合物によって基板表面を被覆した場合にも、多量のＤＮＡが伸長された状態で固定されていることがわかる。
その中でも被覆反応期間４日間のエトキシトリメチルシラン（図２）により被覆された雲母基板および被覆反応期間６日間で被覆した後、加熱により強化したフェニルトリメトキシシラン（図４）により被覆された雲母基板の場合に直線性が良いことがわかった。また、図には示さないが、これらシラン化合物被覆基板の表面荒さが１ｎｍ以下であり、伸長されたＤＮＡ１本がAFM 観察により観察可能なことがわかっている。
【００１２】
このように伸長、固定されたＤＮＡ上の遺伝子を蛍光色素ないしは微小金粒子などにより標識すれば、AFM やSNOM/AFMによりその位置をナノメートルレベルで逐次決定して行くことが可能である。
【００１３】
【発明の効果】
本発明によれば、原子レベルで平坦な雲母基板上に直線状に引き伸ばしたＤＮＡを多量に固定することができるので、AFM やSNOM/AFMによる遺伝子位置の決定や操作を簡便、かつ正確に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の操作手順の１態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明によりシラン化合物（エトキシトリメチルシラン）被覆雲母基板上に実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。
【図３】本発明によりシラン化合物（メトキシトリメチルシラン）被覆雲母基板上に実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。
【図４】本発明によりシラン化合物（フェニルトリメトキシシラン）被覆雲母基板上に実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for extending and fixing DNA, and more particularly to a method for fixing DNA by orientation and extension on a substrate.
[0002]
[Prior art]
Extending DNA in a straight line and fixing it on a substrate is useful for determining the position of a gene or a specific base sequence on DNA, and has a very important meaning in terms of biological and medical science.
DNA is also attracting attention as a nanometer-level self-organizing wiring material in the field of nanoelectronics, and it is suggested that DNA may be the basic technology for orientation and fixation on a substrate. Has been.
Recently, using an atomic force microscope (AFM) with a resolution of nanometer level or a scanning near-field optical probe microscope (Scanning Near-field Optical / Atomic Force Microscope, SNOM / AFM) It has become possible to detect the position of genes with high resolution and to perform nanometer-level operations.
In order to apply these techniques to DNA immobilized on a substrate, a flat surface at the atomic level is required, and in many cases, a cleaved mica plate is used as the substrate.
[0003]
Since both the cleaved mica substrate surface and the DNA molecules in the solution have a negative charge, only a small amount of DNA is immobilized on the mica substrate as it is. Therefore, conventionally, in order to immobilize DNA on a mica substrate, the substrate surface is treated with magnesium ions (Mg ²⁺ ) or coated with a silane compound such as aminopropyltriethoxysilane (APS) having a positive charge. (Langmuir 11 (1995), 655-659). In addition, a method (spin coating method) in which a DNA-containing solution droplet is placed and the DNA is stretched and fixed by centrifugal force (Analytical Chemistry, 73 (2001), 5984-5991) has also been performed.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the conventional method, the interaction between the Mg 2 ^{+ -treated} or APS-coated mica substrate and the DNA molecule is too strong, so the DNA is fixed in a bent state on the substrate, and it is difficult to extend it linearly. It was.
In addition, in the spin coating method, DNA is stretched to some extent, but because the fixing position is indefinite and the fixing amount is small, it is difficult to search for the DNA position by AFM or SNOM / AFM with a narrow scanning range. was there.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for fixing DNA by stretching it linearly over a wide range on a mica substrate.
The present invention according to claim 1 is a method for extending and fixing DNA on a mica substrate, wherein the silane compound has an alkyl group or an aryl group having no charge and at least one methoxy group, an ethoxy group, or a chloro group. A DNA-containing solution is placed on a mica substrate whose surface is coated by the method, DNA ends are attached to the surface of the coated substrate, and DNA is oriented and elongated by the flow of the solution or movement of the gas-liquid interface. It is a method of extending and fixing.
In the silane compound having an alkyl group, the alkyl group of the silane compound is a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, the aryl group is a phenyl group or a benzyl group, and the alkyl group has an alkyl group. In the silane compound having an aryl group, the methoxy group or the ethoxy group or the chloro group is 1 or more and 3 or less and the methoxy group or ethoxy group or the chloro group is 1 or more. The method for extending and fixing DNA according to claim 1, wherein the number of chloro groups is 3 or less and 2 or more.
The invention according to claim 3 is characterized in that the silane compound having an alkyl group is methoxytrimethylsilane, ethoxytrimethylsilane or propyltrimethoxysilane, and the silane compound having an aryl group is phenyltrimethoxysilane. A method for extending and fixing the DNA according to Item 1.
The present invention according to claim 4 is characterized in that the mica substrate coated with the silane compound coats the surface of the mica substrate with the vapor of the silane compound, and the coated substrate is heated and fixed as necessary. A method for extending and fixing the DNA according to claim 1.
The DNA according to claim 5, wherein the means for causing the flow of the solution or the movement of the gas-liquid interface is gravity, centrifugal force, electrophoresis or pumping or sucking the solution. It is a method of extending and fixing.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a method for fixing DNA by orientation, extension and fixation on a substrate. There is no restriction | limiting in DNA used as the object of this invention, It may originate from vectors, such as a genome or a plasmid, phage (virus), and an artificial chromosome of all living organisms, and length is not limited.
As a solution for dispersing DNA, for example, TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7-8), Tris buffer, distilled water and the like are used, and among these, TE buffer is preferable.
[0007]
As the silane compound used for coating the surface of the mica substrate, all combinations in which the total of the alkyl group or aryl group and the methoxy group, ethoxy group, or chloro group totals four are possible. Specifically, the silane compound having a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (such as a methyl group or an ethyl group) or an aryl group (such as a phenyl group or a benzyl group) and having an alkyl group has one or more alkyl groups. In a silane compound having 3 or less and 3 or less methoxy group, ethoxy group or chloro group, and aryl group having 1 to 2 aryl groups, methoxy group, ethoxy group or chloro group is There are silane compounds that are 3 or less and 2 or more. The aryl group may have a substituent such as an amino group or a hydroxyl group. Specific examples include methoxytrimethylsilane, ethoxytrimethylsilane, and phenyltrimethoxysilane.
As a method for coating the surface of the mica substrate with the silane compound, for example, the silane compound can be coated by a vapor method, that is, the substrate is coated with the vapor of the silane compound. .
[0008]
Examples of the means for causing the flow of the solution containing DNA or the movement of the gas-liquid interface include liquid feeding and sucking by gravity, centrifugal force, electrophoresis, pump (automatic or manual such as electric drive), and the like. Although any method can elongate DNA, a pumping method at a constant speed by a pump is desirable.
[0009]
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 is a flowchart showing an operation procedure for DNA elongation and fixation according to the present invention. In step 1, the mica plate is cleaved to expose a fresh cleaved surface, and the mica substrate cleaved in step 2 is placed in a sealed container together with the silane compound solution. The amount of the silane compound is suitably 10 to 1000 μL per liter of container volume. Further, the container may be filled with an inert gas such as nitrogen. In step 3, it is allowed to stand at 4 ° C. to 60 ° C. for 1 hour to 1 week, preferably at 15 to 30 ° C. for 4 hours to 6 days, and the mica substrate surface is coated with a silane compound.
[0010]
In step 4, the substrate is taken out of the container and, if necessary, heated at 60 ° C. to 120 ° C. for about 5 minutes to 1 hour, preferably at 100 ° C. for 15 minutes or more. Thereby, a silane compound can be firmly coat | covered on the mica surface. When heat treatment is not performed, the container is immediately removed from the container, and a DNA solution (5 to 20 μL) is dropped on the container.
During the next step 5 to stand for 1 to several minutes, the DNA ends adhere to the substrate surface coated with the hydrophobic silane compound due to the hydrophobic interaction between the DNA ends and the substrate surface coated with the silane compound. To do.
Thereafter, in Step 6, the droplets are gently sucked up by an appropriate suction means such as a pipette or a pump to induce interface movement or water flow, and the DNA is stretched and fixed on the substrate.
[0011]
2 to 4 are fluorescence micrographs of DNA actually stretched and fixed on a mica substrate based on the method of the present invention. Mica substrates coated with methoxytrimethylsilane (FIG. 2), ethoxytrimethylsilane (FIG. 3) or phenyltrimethoxysilane (FIG. 4) are used.
The substrate was coated with a silane compound according to the method shown in FIG. 1 using 16 μL (per 1 L of container volume) of the silane compound in a nitrogen-filled container. The period of the coating reaction is suitably 1 hour to 7 days, preferably 4 hours to 6 days. Only in the case of phenyltrimethoxysilane, the substrate was heated at 110 ° C. for 20 minutes to perform strong silanization. Thereafter, 5 μL of a λ phage DNA solution (concentration 5 μg / mL) was dropped, allowed to stand for 1 minute, and then sucked up with a pipette. As shown in the figure, it can be seen that a large amount of DNA is immobilized in a stretched state when the substrate surface is coated with any silane compound.
Among them, a mica substrate coated with ethoxytrimethylsilane (FIG. 2) with a coating reaction period of 4 days and a mica substrate coated with phenyltrimethoxysilane (FIG. 4) reinforced by heating after coating with a coating reaction period of 6 days In the case of, it was found that the linearity was good. Although not shown in the figure, it is known that the surface roughness of these silane compound-coated substrates is 1 nm or less, and one stretched DNA can be observed by AFM observation.
[0012]
If the gene on the DNA thus extended and fixed is labeled with a fluorescent dye or fine gold particles, the position can be sequentially determined at the nanometer level by AFM or SNOM / AFM.
[0013]
【The invention's effect】
According to the present invention, a large amount of linearly stretched DNA can be fixed on a flat mica substrate at the atomic level, so that gene position determination and manipulation by AFM or SNOM / AFM can be performed easily and accurately. It is possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a flowchart showing one embodiment of an operation procedure of the present invention.
FIG. 2 is a fluorescence image showing DNA actually stretched and immobilized on a silane compound (ethoxytrimethylsilane) -coated mica substrate according to the present invention.
FIG. 3 is a fluorescence image showing DNA actually stretched and immobilized on a silane compound (methoxytrimethylsilane) -coated mica substrate according to the present invention.
FIG. 4 is a fluorescence image showing DNA actually stretched and immobilized on a silane compound (phenyltrimethoxysilane) -coated mica substrate according to the present invention.

Claims

In a method of extending and fixing DNA on a mica substrate, the surface of the mica substrate is coated with a silane compound having an alkyl group or aryl group having no charge and at least one methoxy group, an ethoxy group, or a chloro group. A method of extending and fixing DNA, comprising placing a DNA-containing solution, attaching DNA ends to the surface of the coated substrate, and orienting and extending the DNA by flowing the solution or moving the gas-liquid interface.

The alkyl group of the silane compound is a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, the aryl group is a phenyl group or a benzyl group, and in the silane compound having an alkyl group, the alkyl group has 1 to 3 alkyl groups. Group, ethoxy group or chloro group is 3 or less and 1 or more, and in the silane compound having aryl group, aryl group is 1 or more and 2 or less and methoxy group, ethoxy group or chloro group is 3 or less and 2 The method for extending and fixing the DNA according to claim 1, which is as described above.

2. The DNA according to claim 1, wherein the silane compound having an alkyl group is methoxytrimethylsilane, ethoxytrimethylsilane or propyltrimethoxysilane, and the silane compound having an aryl group is phenyltrimethoxysilane. how to.

2. The DNA according to claim 1, wherein the mica substrate coated with the silane compound coats the surface of the mica substrate with the vapor of the silane compound, and the coated substrate is heated and fixed as necessary. , How to fix.

2. The method for extending and fixing DNA according to claim 1, wherein the means for causing the flow of the solution or the movement of the gas-liquid interface is gravity, centrifugal force, electrophoresis or pumping or sucking.