JP3682435B2

JP3682435B2 - γ-polyglutamic acid-degrading enzyme-deficient mutant and method for producing γ-polyglutamic acid using the mutant

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Publication number: JP3682435B2
Application number: JP2002030237A
Authority: JP
Inventors: 啓太郎木村; 義文伊藤
Original assignee: 独立行政法人食品総合研究所; 啓太郎木村; 義文伊藤
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2022-02-07
Also published as: JP2003230384A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株及び該変異株を用いたγ−ポリグルタミン酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、納豆菌を含むバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）等のγ−ポリグルタミン酸生産微生物を用いるγ−ポリグルタミン酸の製造においては、生産されたγ−ポリグルタミン酸が、当該微生物自身が作るγ−ポリグルタミン酸分解酵素によって分解されるため、収量や当該γ−ポリグルタミン酸の分子量が一定しないという問題があった。
ところで、γ−ポリグルタミン酸は納豆の糸引きの主成分であり、γ−ポリグルタミン酸の含量と分子量などの化学構造が納豆の糸引きや粘りを大きく左右する。また、消費者の納豆の粘りに対する要望は様々であり、粘りの強い納豆のニーズも高いが、これまではこれらに十分対応する製品が得られていない。
一方、最近、γ−ポリグルタミン酸に小腸からのカルシウムの吸収を促進する作用があることが発見（Tanimoto H, Mori M, Motoki M, Torii K, Kadowaki M,Noguchi T, Natto mucilage containing poly-gamma-glutamic acid increases soluble calcium in the rat small intestine. Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):516-21. ）され、γ−ポリグルタミン酸をカルシウム吸収促進剤として利用することについても検討されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、γ−ポリグルタミン酸生産微生物を用いるγ−ポリグルタミン酸の製造法は、生産されたγ−ポリグルタミン酸が分解されるため、その収量が少ないこと、γ−ポリグルタミン酸の分子量分布が広くなること等が避けられず、収量が不安定であることが問題となっていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、γ−ポリグルタミン酸の収量が多く、しかも得られるγ−ポリグルタミン酸の分子量分布が一定の範囲となり、γ−ポリグルタミン酸の安定な生産が可能なγ−ポリグルタミン酸生産微生物を提供すると共に、当該微生物を用いるγ−ポリグルタミン酸の製造法を提供することである。
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、納豆菌のγ−ポリグルタミン酸合成と分解に関する酵素及び遺伝子の生化学的・分子遺伝学的な研究を行ってきた。
その過程で、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、ＧＧＴと略記することもある。）を欠損する変異株がγ−ポリグルタミン酸をエキソ型に分解する活性を失うこと、さらにγ−ポリグルタミン酸をエンド型に分解する新規な酵素（γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ）の遺伝子を発見し、当該遺伝子をｐｇｈＡと命名した。
さらに、ＧＧＴ遺伝子及び／又はｐｇｈＡの転写・翻訳が正常に行われないように変異を誘起させる方法について検討し、γ−ポリグルタミン酸生産能を有する微生物の変異株を取得する方法を確立した。また、これらの変異株を培養してγ−ポリグルタミン酸を効率よく製造する方法も開発した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
すなわち、請求項１記載の本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入され、かつγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子にエリスロマイシン耐性遺伝子が挿入されたバチルス・ズブチリスＮＡＦＭ６１株（ＦＥＲＭＰ−１８６８８）である。
請求項２記載の本発明は、化学的変異処理もしくは物理的変異処理によりγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子に変異を誘起したバチルス・ズブチリスＮＡＦＭ５−００５株（ＦＥＲＭＰ−１８６９５）である。
【０００７】
請求項３記載の本発明は、請求項１または２に記載のγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株を培地に培養し、培養物からγ−ポリグルタミン酸を採取することを特徴とするγ−ポリグルタミン酸の製造法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１および請求項２に係るγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株は、γ−ポリグルタミン酸生産微生物において、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子が共に変異している微生物である。当該変異株は、γ−ポリグルタミン酸をエキソ型に分解するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ及びγ−ポリグルタミン酸をエンド型に分解するγ−ポリグルタミルハイドロラーゼの両者を欠損している。
当該変異株は、エキソ型及びエンド型のγ−ポリグルタミン酸分解酵素活性を持っていないため、γ−ポリグルタミン酸を大量に、かつ安定的に生産することができる。この変異株は、培養物中に分子量が約２００万ダルトン（２ＭＤａ）のγ−ポリグルタミン酸を蓄積し、その蓄積量は、野性株の最大生産量の１０倍に達する。
【０００９】
本発明者らの知見によると、上記の二重変異株は、最小培地（８％グリセロール、０．７％塩化アンモニウム、１．５％クエン酸ナトリウム、０．０５％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００３％塩化第二鉄、０．０１５％塩化カルシウム、０．０１％塩化マンガン、０．５ｍｇ／Ｌビオチンを含む）で１リットル当たり１０ｇのγ−ポリグルタミン酸を蓄積し、栄養培地（ＧＳＰ培地グルコース１．５％、Ｌ−グルタミン酸１．５％、フィトンペプトン１．５％）では、１リットル当たり３０ｇのγ−ポリグルタミン酸を蓄積する。なお、グリセロールやグルコース等の炭素源は、γ−ポリグルタミン酸の生産を増強する効果があり、その効果は０．５％以上で顕著である。
【００１０】
次に、γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株の取得方法について述べる。対象とされる微生物は、γ−ポリグルタミン酸生産能を有するもので、例えば納豆菌を含むバチルス・ズブチリスやバチルス・リケニホルミスなどを挙げることができる。これらの微生物において、上記の酵素遺伝子の転写・翻訳が正常に行われないように、変異を誘起させることによって、目的とする変異株を取得することができる。
納豆生産菌は、２種類のプラスミドを持っており（Nagai et al., Gen. Appl. Microbiol., 43:139-143, 1997)、内因性プラスミドの存在は形質転換体の解析の妨げとなる。そのため、本発明ではこれを除いたＮＡＦＭ５株を野性型納豆菌として用いている。現在納豆の製造に用いられている代表的な納豆菌は、宮城野菌、高橋菌、成瀬菌であるが、これらは共通の菌株に由来することが分子遺伝学的手法で確認されている（Nagai T., Phan Tran L.S., Inatsu Y., Itoh Y., J. Bacteriol., 182:2387-2392,2000）。
【００１１】
γ−ポリグルタミン酸分解酵素遺伝子に変異を誘起させる方法としては、当該酵素遺伝子に他の遺伝子や適当な塩基数を有する塩基配列を挿入する方法、当該遺伝子のすべて又は一部を欠損又は欠失させる方法及び化学的又は物理的変異処理によって塩基置換を起こさせる方法が挙げられる。
例えば、他の遺伝子を挿入する場合には、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及び／又はγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子をクローニングした後、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のStu I 部位にスペクチノマイシン耐性遺伝子を、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子のBcl I 部位にエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入することによって、当該分解酵素遺伝子の機能を失った変異株を取得することができる。
さらに、挿入する遺伝子を適宜選択することによって、変異株を取得する際にマーカーとして使用することもできる。また、当該遺伝子内又はプロモーター領域内にマーカー遺伝子の挿入部位を適宜選択することによって、当該遺伝子の機能や発現能を失った変異株を取得することができる。
γ−ポリグルタミン酸分解酵素遺伝子に変異を誘起させる方法としては、上記方法の他に、対象の微生物をエチルメタンスルフォネート（以下、ＥＭＳと略記することもある。）やニトロソグアニジンなどの変異誘起化学物質により化学的な変異処理や紫外線や放射線処理などの物理的な変異処理する方法もある。この化学的もしくは物理的な変異処理には、自然変異も含まれる。
【００１２】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ欠損変異株の取得方法の１例を以下に示す。まず、納豆菌バチルス・ズブチリスの培養上清から精製したγ−ポリグルタミルトランスペプチダーゼのＮ末端アミノ酸配列をもとにデザインしたオリゴＤＮＡプローブ（配列表の配列番号２）を用いて、λファージで構築したバチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡライブラリー（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press)から、オリゴヌクレオチドＥＣＬラベリングディテクションキット（アマーシャムバイオサイエンス社製）や５’末端を³²Ｐで標識する方法（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press)を用いたプラークハイブリダイゼーション法に従ってγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を選抜する。
このγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子の塩基配列をシークエンサー等の定法で解析したところ、配列表の配列番号３記載の塩基配列及びアミノ酸配列を有していた。
【００１３】
次に、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含むSsp I-Bgl II断片をプラスミドpUC 118 のHinc II-Bam HI部位にクローニングする。
クローニングしたγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のStu I 部位に、プラスミドpDG 1726 (A. M. Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167:335-336, 1995) から単離したスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むEco RV-Hinc II断片を挿入して、該遺伝子を破壊したプラスミドを構築する。
このプラスミドを用いて、定法によりバチルス・ズブチリスを形質転換させ(L. S. P. Tran, T. Nagai and Y. Itoh, Molecular Microbiol., 37(5), 1159-1171, 2000) 、形質転換体を得る。
得られた形質転換体をＬＢ培地にて３０〜４０℃、好ましくは３５〜３７℃で１２〜２４時間、好ましくは１８時間培養し（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press)、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を指標として、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株を選抜する。
【００１４】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性の測定は、発色基質であるγ−グルタミルパラニトロアニリドの分解を指標として行うことができる。すなわち培養液５０ｍＬを遠心分離（６０００ｒｐｍ）して得た培養上清を試料として用い、以下の反応系を調製し、これを３７℃で３０分間保持した後、反応液の吸光度を波長４１０ｎｍで測定することによって行う。
ここで、パラニトロアニリドの分子吸光係数を８８００として、１分間に１μモルのパラニトロアニリドを遊離する活性を１Ｕとする。
【００１５】
培養上清５０μＬ
１ｍＭ γ−グルタミルパラニトロアニリド２５０μＬ
１Ｍトリス塩酸緩衝液５０μＬ
滅菌脱イオン水２００μＬ
（合計５５０μＬ）
【００１６】
上記のγ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定することにより、該酵素の著しく低い又は活性を持たない菌株をγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株として選抜する。
【００１７】
次に、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株の取得方法の１例を以下に示す。まず、γ−グルタミル基を切断する様々な酵素の相同性を比較することによって得られるオリゴＤＮＡ−Ａ（配列表の配列番号４）をプローブとして、上記のバチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡライブラリーを検索する。その結果、オリゴＤＮＡ−Ａと交雑する３つのクローンが得られた。
得られたクローンの塩基配列をシークエンサー等の定法により決定し、ＤＤＢＪ等のデータベースを利用して既知の塩基配列との相同性を検索した結果、１つのクローンが完全長の新規な遺伝子を含むことが判明した。そこで、この新規な遺伝子をｐｇｈＡ、当該遺伝子によってコードされる酵素をγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼと、それぞれ命名した。
なお、上記の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加された、もしくは逆位を含む塩基配列であっても、同様の機能を有する限りγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子に包含される。
【００１８】
上記によって単離したγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ（ｐｇｈＡ）遺伝子のBcl I 部位にプラスミドpDG646(A. M. Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167:335-336, 1995)から単離したエリスロマイシン耐性遺伝子を含むBam HI断片を導入して、当該遺伝子を破壊したプラスミドを構築する。
このプラスミドを用いて、定法によりバチルス・ズブチリスを形質転換し、形質転換体を得る。得られた形質転換体をＬＢ培地にて３０〜３７℃、好ましくは３５〜３７℃で１２〜２４時間、好ましくは１８時間培養し、エリスロマイシン耐性とγ−ポリグルタミン酸の分解能を指標に、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株を選抜する。
【００１９】
γ−ポリグルタミン酸の分解能は、以下の方法で測定することができる。
変異処理したバチルス・ズブチリスを最小培地（８％グリセロール、０．７％塩化アンモニウム、１．５％クエン酸ナトリウム、０．０５％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００３％塩化第二鉄、０．０１５％塩化カルシウム、０．０１％塩化マンガン、０．５ｍｇ／Ｌビオチン）に接種し、４〜８日間、好ましくは７日間培養する。
培養終了後、培養物について遠心分離（６０００ｒｐｍ）を行い、培養上清を得る。得られた培養上清に、その１／５容の５Ｍ食塩水と２倍容のエタノールを加えて、生産されたγ−ポリグルタミン酸を沈殿させる(Nagai et al., J. Gne. Appl. Microbiol. 43, 139-143, 1997)。
【００２０】
得られたγ−ポリグルタミン酸を４００μＬのリン酸緩衝液に溶解し、１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動（２０Ｖ／ｃｍ、３０分）に供して、分子量で分画する。分画後、メチレンブルー（ｐＨ９．５の３０％エタノールに溶解）にて、アガロースゲル上に展開したγ−グルタミン酸を染色し、検出する。
γ−ポリグルタミン酸が分解されていれば、低分子化したγ−ポリグルタミン酸の移動度が大きくなることから容易に検出することができる。
電気泳動の結果から、γ−ポリグルタミン酸の分解能が著しく低下している菌株を、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株として選抜する。
【００２１】
また、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子が共に変異しているγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株の取得方法の１例を示すと、前述した遺伝子を破壊したプラスミド２種類を用いて、上記の方法にしたがって形質転換することによって取得することができる。γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子又はγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の欠損変異株を作成した後に、当該変異株を化学的又は物理的変異処理を行って、選抜することによっても得ることができる。化学的又は物理的手段によって変異処理して取得したγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子又はγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の欠損変異株を、さらに変異処理して両者の酵素活性を失った変異株を得ることもできる。なお、頻度は極めて低いが、人為的な変異処理を行わずに自然変異で生じた当該酵素欠損株を取得することも可能である。このようにして、選抜した微生物をＮＡＦＭ６１株、ＮＡＦＭ５−００５株と命名した。これら菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＦＥＲＭＰ−１８６８８、ＦＥＲＭＰ−１８６９５として寄託されている。
【００２２】
化学的もしくは物理的に変異を誘起する処理を行い変異株を取得する方法について、ＥＭＳを使用する場合を例として説明すると、納豆菌などのγ−ポリグルタミン酸生産菌の培養物にＥＭＳを加えて変異誘起処理を行う。その後、生理食塩水で希釈した培養液をＬＢ寒天培地などの固形培地に塗布して培養する。次いで、形成したコロニーを単離し、液体培地に接種して培養し、得られた培養物についてγ−グルタミルパラニトロアニリド等の基質を用いて酵素活性を測定し、活性が消失もしくは著しく低下している菌株を選抜する。γ−ポリグルタミン酸の分解活性は、アガロースゲル電気泳動で確かめることができる。このようにして、請求項１及び２に記載の変異株を取得することができる。
【００２３】
本発明に係る変異株を用いてγ−ポリグルタミン酸を製造するには、当該微生物が良く生育し得る培地に培養し、生産されたγ−ポリグルタミン酸を培養物から採取すればよい。この際に用いる培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マンニトール、キシロース、アラビノースなどの当該微生物が好む炭素源を含むものが好適である。培養は、３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で穏やかな振盪（１分間当たり１２０〜１５０回転）条件下で行う。また、グルタミン酸ナトリウムを適宜（０．５〜１．５％）添加することによって、γ−ポリグルタミン酸の生産を増大することができる。
【００２４】
次に、γ−ポリグルタミン酸の製造例を示す。γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株を、最小培地（８％グリセロール、０．７％塩化アンモニウム、１．５％クエン酸ナトリウム、０．０５％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００３％塩化第二鉄、０．０１５％塩化カルシウム、０．０１％塩化マンガン、０．５ｍｇ／Ｌビオチン）や栄養培地であるＧＳＰ培地（１．５％グルコース、１．５％Ｌ−グルタミン酸、１．５％フィトペプトン）に接種し、３０〜４５℃、好ましくは３７℃で、６０〜１６０時間、好ましくは１４０時間培養し、γ−ポリグルタミン酸の蓄積量が最大となった時点で培養を終了することによって、γ−ポリグルタミン酸を大量に生産させることができる。
【００２５】
本発明のγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株は、γ−ポリグルタミン酸を分解する酵素が活性を失っているので、生産されたγ−ポリグルタミン酸は分解されない。そのため、γ−ポリグルタミン酸の生産量が向上する上に、特定の分子量のものが得られる。また、当該変異株を用いて納豆を製造すると、糸引きの強い、粘りのある納豆が得られる。
培養物からのγ−ポリグルタミン酸の採取は、１Ｍとなるように食塩を加えた後、エタノールで沈殿させる等の定法を適用すればよく、これによって、γ−ポリグルタミン酸を大量に、かつ簡便に得ることができる。純度の高いγ−ポリグルタミン酸は、上記エタノール沈殿を繰り返すことや、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記することもある。）によるゲルろ過等の定法の精製法で得ることができる。
【００２６】
本発明により得られるγ−ポリグルタミン酸は、その機能性に着目して様々な用途に用いることができる。例えば、カルシウム吸収促進剤の他、微生物の培養に使用するバイオフィルム、食品や化粧品等のコーティング剤、水分吸収・保持剤、とろみを付けるための食品添加物等として利用することができる。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明を実施例等により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ欠損変異株の取得方法）
納豆菌バチルス・ズブチリス（宮城野株）の培養上清から精製したγ−グルタミルトランスペプチダーゼのＮ末端アミノ酸配列をもとにデザインしたオリゴＤＮＡプローブ（配列表の配列番号２）を用いて、λファージで構築したバチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡライブラリーからγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を定法（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press)に従って選抜した。
このγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子の塩基配列をシークエンサー等の定法により解析したところ、配列表の配列番号３記載の塩基配列及びアミノ酸配列を有していた。
次に、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含むSsp I-Bgl II断片をプラスミドpUC 118 （Toyobo社製）のHinc II-Bam HI部位にクローニングした。
【００２８】
クローニングしたγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のStu I 部位に、プラスミドpDG 1726 (A. M. Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167:335-336, 1995) から単離したスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むEco RV-Hinc II断片を挿入して、当該遺伝子を破壊したプラスミドを構築した。
このプラスミドを用いて、バチルス・ズブチリスを形質転換させ(L. S. P. Tran, T. Nagai and Y. Itoh Molecular Microbiol. 37(5), 1159-1171, 2000) 、形質転換体を得た。
得られた形質転換体をＬＢ培地にて３７℃で１８時間培養し（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を指標として、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株を選抜した。
本菌をバチルス・ズブチリスＮＡＦＭ１３株（ＦＥＲＭＰ−１８６８７）と命名した。
【００２９】
γ−ポリグルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性の測定は、発色基質であるγ−グルタミルパラニトロアニリドの分解を指標として行った。すなわち、上記の培養液５０ｍＬを遠心分離（６０００ｒｐｍ）して得た培養上清を試料として用いて以下の反応系を調製し、これを３７℃で３０分間保持した後の吸光度を波長４１０ｎｍで測定することによって行った。結果を表１に示す。
なお、パラニトロアニリドの分子吸光係数を８８００として、１分間に１μモルのパラニトロアニリドを遊離する活性を１Ｕとする。活性の算出には、検量線としてパラニトロアニリドを用い、野生型納豆菌についても、同様にγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定した。
【００３０】
培養上清５０μＬ
１ｍＭ γ−グルタミルパラニトロアニリド２５０μＬ
１Ｍトリス塩酸緩衝液５０μＬ
滅菌脱イオン水２００μＬ
（合計５５０μＬ）
【００３１】
参考例２（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ欠損変異株の取得方法）
納豆菌バチルス・ズブチリスをＬＢ培地２ｍＬ（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press)にて３７℃で５時間培養した後、ＥＭＳ（SIGMA 社製）を２％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらに１５分間振盪培養し、変異誘起処理を行った。
変異誘起処理した後、生理食塩水で１万分の１となるように希釈した培養液を、ＬＢ寒天培地（Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press)に塗布し、これを３７℃で一夜培養した。
培養終了後、ＬＢ寒天培地上に形成したコロニーを単離し、２ｍＬのＬＢ培地に接種し、これを３７℃で１４時間培養した。培養物から遠心分離（６０００ｒｐｍ）により菌体を除去することによって得た培養上清について、参考例１と同様に、γ−グルタミルパラニトロアニリドを基質に用いて、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定した。結果を表１に示す。酵素活性が消失もしくは著しく低下している菌株を選抜し、この変異株をバチルス・ズブチリスＮＡＦＭ５−００１株（ＦＥＲＭＰ−１８６９４）と命名した。
【００３２】
【表１】
表１

【００３３】
表１から明らかなように、参考例１、２によって得られたγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子に変異を導入して得た変異株は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が検出限界以下である。このことから、いずれの変異誘起方法においても、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子に変異を誘起できることが示された。
【００３４】
参考例３（γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の調製）
γ−ポリグルタミル基を切断する様々な酵素の相同性の比較を行い、配列表の配列番号４のオリゴＤＮＡを含む数種類のオリゴＤＮＡプライマーを作成し、参考例１のバチルス・ズブチリスゲノムＤＮＡライブラリーを検索した。
その結果、配列表の配列番号４のオリゴＤＮＡ−Ａプローブと交雑する３つのクローンが得られた。
得られたクローンについて、ダイターミネータサイクルシークエンスキット（ＡＢＩ社製）を用いて塩基配列（配列表の配列番号１）を決定し、これをもとにＤＤＢＪのデータベースにて塩基配列の相同性を比較した結果、このものは新規な機能を有する遺伝子であることが判明した。そこで、この遺伝子をｐｇｈＡ遺伝子と名づけ、当該遺伝子によってコードされる酵素をγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼと命名した。
【００３５】
参考例４（γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ欠損変異株の取得方法）
参考例３で調製したγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ（ｐｇｈＡ）遺伝子のBcl I 部位にプラスミドpDG 646 (A. M. Guerout-Fleury, K. Shazard,N. Frandsen and P. Stragier Gene 167:335-336, 1995) から単離したエリスロマイシン耐性遺伝子を含むBam HI断片を導入して、当該遺伝子を破壊したプラスミドを構築した。
このプラスミドで納豆菌バチルス・ズブチリスを定法により形質転換し、エリスロマイシン耐性とγ−ポリグルタミン酸分解能を指標に、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ欠損変異株を取得した。
すなわち、形質転換したバチルス・ズブチリスをエリスロマイシン１μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地にて３７℃で１８時間培養した。その結果、培地上にコロニーを形成した菌株をエリスロマイシン耐性菌株として選抜した。
【００３６】
続いて、エリスロマイシン耐性菌株について、γ−ポリグルタミン酸の分解能を以下の方法で測定した。まず、当該変異納豆菌バチルス・ズブチリスを最小培地（８％グリセロール、０．７％塩化アンモニウム、１．５％クエン酸ナトリウム、０．０５％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００３％塩化第二鉄、０．０１５％塩化カルシウム、０．０１％塩化マンガン、０．５ｍｇ／Ｌビオチン）２ｍＬに接種し、７日間培養した。
培養後、遠心分離（６０００ｒｐｍ）を行い、培養上清を得た。こうして得た培養上清に、培養上清の１／５容の５Ｍ食塩水と２倍容のエタノールを加え、生産されたγ−ポリグルタミン酸を沈殿させた(Nagai et al., J. Gne. Appl. Microbiol. 43, 139-143, 1997)。
【００３７】
得られたγ−ポリグルタミン酸を４００μＬのリン酸緩衝液に溶解し、１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動（２０Ｖ／ｃｍ、３０分）に供する。泳動動、メチレンブルー（ｐＨ９．５の３０％エタノールに溶解）にて、アガロースゲル上に展開したγ−グルタミン酸を染色し、検出した。
電気泳動の結果から、γ−ポリグルタミン酸の分解能が著しく低下している菌株を、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株として選抜し、これをバチルス・ズブチリスＮＡＦＭ６０株（ＦＥＲＭＰ−１８６９６）と命名した。
また、参考例２と同様にＥＭＳを用いて変異誘起処理を行って得た変異株についても、同様の結果が得られた。
【００３８】
実施例１（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株の取得方法）
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の両者を欠損している変異株を、参考例１、３で調製した遺伝子を破壊したプラスミド２種類を用いて、納豆菌バチルス・ズブチリスを定法に従って形質転換することによって得た。また、参考例２と同様に、ＥＭＳによって変異処理して得た欠損変異株についても、同様に以下の操作を行った。
得られた形質転換体について、参考例１と同様に発色基質パラニトロアニリド分解活性を指標としてγ−グルタミルトランスペプチダーゼを、また参考例４と同様にアガロースゲル電気泳動によるγ−ポリグルタミン酸の分解能を指標としてγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼの有無を判定することによって目的とする変異株を選抜した。このようにして、二重変異株ＮＡＦＭ６１株（ＦＥＲＭＰ−１８６８８）及びＮＡＦＭ５−００５株（ＦＥＲＭＰ−１８６９５）を得た。結果を表２に示す。図１は、アガロースゲル電気泳動を行った電気泳動像を示したものである。
【００３９】
【表２】
表２

【００４０】
この結果、実施例１で得られた欠損変異株は、参考例１、２で得られた欠損変異株と同様に、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定して得られた結果から、酵素活性が検出限界以下であることが明らかとなった。また、アガロースゲル電気泳動の結果から、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼの活性が失われていることが明らかとなった。これらのことから、本発明の方法によって二重変異株が取得できることが分かった。
【００４１】
実施例２（γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株を用いたγ−ポリグルタミン酸の大量生産）
実施例１で得たγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株を、前記最小培地あるいはＧＳＰ培地１００ｍＬに接種し、３７℃で２〜７日間培養した。なお、比較のため野生型納豆菌及び参考例１で得たγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株についても、同様に試験を行った。
培養終了後、菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ）によって除去し、培養上清を得た。得られた培養上清に、２倍容のエタノールを加えてγ−ポリグルタミン酸を沈殿させた後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ）によって回収した。このエタノールによる沈殿操作を２回繰り返したのち、定法により減圧乾燥を行ってγ−ポリグルタミン酸を得た。
【００４２】
上記のγ−ポリグルタミン酸について、抗γ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）血清を用いた２次元免疫電気泳動法（Uchida et al., Mol. Microbiol., 9:487-496, 1993)を行い、分子量分布の分析を行った。２次元免疫電気泳動法において、１次元目は１．２％アガロースゲル、２次元目は１０％（ｖ／ｖ）の抗γ−ＰＧＡ血清（Uchida et al., Mol. Microbiol., 9:487-496, 1993)を含む１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。
電気泳動終了後、アガロースゲルを生理食塩水で洗浄した後、アミドブラックで染色し、泳動像を分析して培養期間中のγ−ポリグルタミン酸の分子量の変化を検討した。図２は、２次元免疫電気泳動終了後のγ−ポリグルタミン酸の泳動像である。
また、精製したγ−ポリグルタミン酸を試料としてＨＰＬＣに供し、生産されたγ−ポリグルタミン酸の濃度と分子量を求めた(Nagai et al., J. Gne. Appl.Microbiol. 43, 139-143, 1997) 。ＨＰＬＣで用いたカラムはAsahipack GAF-7M（昭和電工社製）であり、溶媒（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．８）、流速０．６ｍｌ／分の条件で実施した。
【００４３】
野生型納豆菌を用いて生産されたγ−ポリグルタミン酸は、当該納豆菌によって産生されるγ−ポリグルタミン酸分解酵素（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ）により分解されるため、得られるγ−ポリグルタミン酸量は極めて少ないだけでなく、最終的にはグルタミン酸にまで完全に分解されてしまうことが明らかとなった。
また、参考例１で得たγ−グルタミルトランスペプチダーゼ欠損変異株ＮＡＦＭ１３（ＦＥＲＭＰ−１８６８７）によって生産されるγ−ポリグルタミン酸は、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ活性の影響を受けて分解し、平均分子量が１０万ダルトン（０．１ＭＤａ）のγ−ポリグルタミン酸となることが明らかとなった。
【００４４】
実施例１で得たγ−グルタミルトランスペプチダーゼ及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の欠損変異株ＮＡＦＭ６１株（ＦＥＲＭＰ−１８６８８）及びＮＡＦＭ５−００５株（ＦＥＲＭＰ−１８６９５）によって生産されるγ−ポリグルタミン酸は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼの両酵素活性が殆ど残存していないため、平均分子量が２００万ダルトン（２ＭＤａ）のγ−ポリグルタミン酸が蓄積していることが明らかとなった。
これに対して、γ−グルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株によって生産されるγ−ポリグルタミン酸は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性が残存しているため、分子量が５００万ダルトン（５ＭＤａ）から５０００ダルトン（５ｋＤａ）という広い範囲に分布していることが分かった。
【００４５】
図２から明らかなように、野生型納豆菌では、培養期間を通してγ−ポリグルタミン酸の蓄積量は少なく、培養期間が長くなるほど、γ−ポリグルタミン酸が分解されて分子量が小さくなる傾向であった。
また、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株では、培養２日目には、５００万ダルトン（５ＭＤａ）のγ−ポリグルタミン酸が生産されているが、培養７日目になると、１０万ダルトン（０．１ＭＤａ）のものが平均となり、かつ生産量も野生型納豆菌に比べ、大量に蓄積することが判明した。
さらに、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株では、培養７日目には分子量が５００万ダルトン（５ＭＤａ）のγ−ポリグルタミン酸が存在し、平均分子量が２００万ダルトン（２ＭＤａ）を示している。このことから、野生型納豆菌やγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株と比べて、分子量の大きいγ−ポリグルタミン酸が大量に得られることが明らかとなった。
【００４６】
参考例５（γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株の変異遺伝子の同定法）
参考例１〜４で得られたγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の変異に起因することを、当該遺伝子を使った相補性試験で確認した。
すなわち、参考例１で調製したバチルス・ズブチリスのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子（Ssp I-Bgl II断片）及び参考例３で調製したγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子（Hind III断片）を、pDG 1662等のインテグレーション用プラスミドベクターに常法によりクローニングし、プラスミド（図３）を得た。
【００４７】
このプラスミドを用いて、γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株のアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）座位に定法（Anne-Marie et al., Gene, 180:57-61, 1996）を用いて組み込み、形質転換したバチルス・ズブチリスを得た。
こうして得た形質転換体のバチルス・ズブチリスのγ−ポリグルタミン酸の分解能を評価することによって、γ−ポリグルタミン酸分解酵素の欠損が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子あるいはγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の変異を原因とすることを判定する。
【００４８】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株の相補性試験は、参考例１と同様に培養して得た培養上清について、γ−グルタミルパラニトロアニリドの分解を指標として、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性を測定することにより行った。このとき、形質転換株の当該酵素活性が、野生型納豆菌と同等のレベルに回復している場合、当該変異はγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子の変異であることが証明できる。
【００４９】
次に、γ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異の相補性試験は、参考例３と同様に、エタノール沈殿させたγ−ポリグルタミン酸についてアガロースゲル電気泳動法により行った。アガロースゲル電気泳動を行って得た泳動像において、野生型納豆菌と同等にγ−ポリグルタミン酸が分解されていれば、当該変異がγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子に由来することが証明できる。
【００５０】
また、相補性試験は、pHB 201(Bacillus genetic stock center Ohio, U.S.A)等の大腸菌−納豆菌シャトルベクターを用いても行った。プラスミドpHB 201 のマルチクローニングサイトに、納豆菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子（Ssp I-Bgl II断片）及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子（Hind III断片）を定法によりクローニングし、これを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、該大腸菌をＬＢ培地で１８時間培養することによって該プラスミドを増殖させた。
【００５１】
増殖させた該プラスミドを用いて、γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株を形質転換した。すなわち、この操作により、γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株にγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子を再度導入することとなる。
これによってγ−ポリグルタミン酸の分解活性が野生型納豆菌の分解レベルと同等であれば、γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株の変異はγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子あるいはγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の変異であると特定できる。
【００５２】
以上の相補性試験の結果、いずれの場合もγ−ポリグルタミン酸の分解能は野生型納豆菌と同等のレベルに回復していたことから、本発明のγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株におけるγ−ポリグルタミン酸の生産量の増大は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子あるいはγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の変異に起因するものであることが判明した。
【００５３】
【発明の効果】
本発明に係るγ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株は、大量のγ−ポリグルタミン酸を安定的に生産することができる。しかも、糸引きが強く、粘りのあるため、納豆の製造に利用することができる。
本発明で開発された変異株は、γ−ポリグルタミン酸分解酵素活性を失っているため、当該微生物によって生産されたγ−ポリグルタミン酸は分解されない。従って、本発明の変異株を用いることによって、収量の安定したγ−ポリグルタミン酸の生産が可能となる。さらに、γ−ポリグルタミン酸が分解されないために、大幅な収量の増大も達成できる。また、平均分子量が２ＭＤａのγ−ポリグルタミン酸が得られるので、その性質に応じた用途に使用することができる。
【００５４】
γ−ポリグルタミン酸は、バイオフィルム、食品や化粧品等に使用するコーティング剤、水分吸収・保持剤、とろみを付けるための食品添加剤等の既知の用途の他に、カルシウム吸収促進作用等の機能性が着目されており、本発明は、かかる用途に関係する商品の開発に大きな効果をもたらすことが期待される。
【００５５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アガロースゲル電気泳動終了後のγ−ポリグルタミン酸の泳動像を示したものである。図中、Ａはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子の欠損変異株の培養液から精製したγ−ポリグルタミン酸試料（１０μＬ）を、Ｂはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株の培養液から精製したγ−ポリグルタミン酸試料（１０μＬ）を、Ｃは野生型納豆菌の培養液から精製したγ−ポリグルタミン酸試料（１０μＬ）を、それぞれ表す。
【図２】２次元免疫電気泳動終了後のγ−ポリグルタミン酸の泳動像を示したものである。図中、Ａは野生型納豆菌の培養物から得たγ−ポリグルタミン酸を、Ｂはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子欠損変異株の培養物から得たγ−ポリグルタミン酸を、Ｃはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子及びγ−ポリグルタミン酸ハイドロラーゼ遺伝子欠損変異株の培養物から得たγ−ポリグルタミン酸を、それぞれ表す。
【図３】相補性試験に用いるアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）座位インテグレーション用ベクターの模式図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to a γ-polyglutamic acid-degrading enzyme-deficient mutant and a method for producing γ-polyglutamic acid using the mutant.
[0002]
[Prior art]
  Conventionally, in the production of γ-polyglutamic acid using γ-polyglutamic acid-producing microorganisms such as Bacillus subtilis containing Bacillus natto and Bacillus licheniformis, γ-polyglutamic acid produced is There is a problem that the yield and the molecular weight of the γ-polyglutamic acid are not constant because they are degraded by the γ-polyglutamic acid-degrading enzyme produced by the microorganism itself.
  By the way, γ-polyglutamic acid is the main component of stringing of natto, and the chemical structure such as the content and molecular weight of γ-polyglutamic acid greatly affects the stringing and stickiness of natto. In addition, consumers have various demands for stickiness of natto and there is a high need for sticky natto.
  Recently, γ-polyglutamic acid was found to have an action to promote calcium absorption from the small intestine (Tanimoto H, Mori M, Motoki M, Torii K, Kadowaki M, Noguchi T, Natto mucilage containing poly-gamma- Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar; 65 (3): 516-21.), and the use of γ-polyglutamic acid as a calcium absorption promoter has also been studied.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
  As described above, the production method of γ-polyglutamic acid using a γ-polyglutamic acid-producing microorganism degrades the produced γ-polyglutamic acid, so that the yield is small, and the molecular weight distribution of γ-polyglutamic acid is wide. Inevitably, the yield is unstable.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
  An object of the present invention is to provide a γ-polyglutamic acid-producing microorganism that has a high yield of γ-polyglutamic acid and has a molecular weight distribution of the obtained γ-polyglutamic acid within a certain range and can stably produce γ-polyglutamic acid. And providing a method for producing γ-polyglutamic acid using the microorganism.
[0005]
  In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have conducted biochemical and molecular genetic studies on enzymes and genes related to γ-polyglutamic acid synthesis and degradation of Bacillus natto.
  In the process, a mutant lacking γ-glutamyltranspeptidase (hereinafter sometimes abbreviated as GGT) loses the activity of decomposing γ-polyglutamic acid into an exo form, and further, γ-polyglutamic acid is converted into an endo form. A gene for a novel enzyme (γ-polyglutamate hydrolase) that decomposes into γ-amino acids was discovered, and the gene was named pghA.
  Furthermore, a method for inducing mutation so that transcription and translation of GGT gene and / or pghA is not normally performed was examined, and a method for obtaining a mutant strain of a microorganism having γ-polyglutamic acid producing ability was established. In addition, a method for efficiently producing γ-polyglutamic acid by culturing these mutant strains has also been developed. The present invention has been completed based on these findings.
[0006]
  That is, claim 1The present invention described herein is a Bacillus subtilis NAF M61 strain (FERM P-18688) in which a spectinomycin resistance gene is inserted into a γ-glutamyl transpeptidase gene and an erythromycin resistance gene is inserted into a γ-polyglutamate hydrolase gene. It is.
  Claim2The described invention is a Bacillus subtilis NAF M5-005 strain (FERM P-18695) in which a mutation is induced in a γ-glutamyl transpeptidase gene and a γ-polyglutamate hydrolase gene by chemical mutation treatment or physical mutation treatment. is there.
[0007]
  Claim3The invention as described is claimed.1 or 2A method for producing γ-polyglutamic acid, comprising culturing the γ-polyglutamic acid-degrading enzyme-deficient mutant described in 1 above in a medium and collecting γ-polyglutamic acid from the culture.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  Claims of the invention1And claims2The γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant according to 1 is a microorganism in which both the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamate hydrolase gene are mutated in the γ-polyglutamate-producing microorganism. The mutant strain lacks both γ-glutamyl transpeptidase that degrades γ-polyglutamic acid into an exo-type and γ-polyglutamyl hydrolase that degrades γ-polyglutamic acid into an endo-type.
  Since the mutant strain does not have exo-type and endo-type γ-polyglutamic acid degrading enzyme activities, it can stably produce γ-polyglutamic acid in a large amount. This mutant strain accumulates γ-polyglutamic acid having a molecular weight of about 2 million daltons (2MDa) in the culture, and the accumulated amount reaches 10 times the maximum production of the wild strain.
[0009]
  According to the knowledge of the present inventors, the above double mutant strain is a minimal medium (8% glycerol, 0.7% ammonium chloride, 1.5% sodium citrate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0% 0.05g magnesium sulfate, 0.003% ferric chloride, 0.015% calcium chloride, 0.01% manganese chloride, containing 0.5mg / L biotin), accumulating 10g γ-polyglutamic acid per liter In a nutrient medium (GSP medium glucose 1.5%, L-glutamic acid 1.5%, phyton peptone 1.5%), 30 g of γ-polyglutamic acid is accumulated per liter. Carbon sources such as glycerol and glucose have an effect of enhancing the production of γ-polyglutamic acid, and the effect is remarkable at 0.5% or more.
[0010]
  Next, a method for obtaining a γ-polyglutamate degrading enzyme-deficient mutant is described. The target microorganism has γ-polyglutamic acid-producing ability, and examples thereof include Bacillus subtilis containing Bacillus natto and Bacillus licheniformis. In these microorganisms, a target mutant strain can be obtained by inducing a mutation so that transcription and translation of the enzyme gene is not normally performed.
  Natto-producing bacteria have two types of plasmids (Nagai et al., Gen. Appl. Microbiol., 43: 139-143, 1997), and the presence of endogenous plasmids hinders the analysis of transformants. . Therefore, in the present invention, the NAF M5 strain excluding this is used as wild-type natto. The representative natto bacteria currently used in the production of natto are Miyagino, Takahashi, and Naruse, which have been confirmed by molecular genetic techniques to be derived from a common strain (Nagai T., Phan Tran LS, Inatsu Y., Itoh Y., J. Bacteriol., 182: 2387-2392, 2000).
[0011]
  Methods for inducing mutations in the γ-polyglutamate degrading enzyme gene include inserting another gene or a base sequence having an appropriate number of bases into the enzyme gene, or deleting or deleting all or part of the gene. Examples thereof include a method and a method of causing base substitution by chemical or physical mutation treatment.
  For example, when inserting another gene, after cloning the γ-glutamyl transpeptidase gene and / or the γ-polyglutamate hydrolase gene, the spectinomycin resistance gene is inserted into the Stu I site of the γ-glutamyl transpeptidase gene. By inserting an erythromycin resistance gene into the Bcl I site of the γ-polyglutamate hydrolase gene, a mutant strain that has lost the function of the degrading enzyme gene can be obtained.
  Furthermore, it can also be used as a marker when obtaining a mutant strain by appropriately selecting a gene to be inserted. In addition, by appropriately selecting the insertion site of the marker gene within the gene or promoter region, a mutant strain that has lost the function or expression ability of the gene can be obtained.
  As a method for inducing mutations in the γ-polyglutamate degrading enzyme gene, in addition to the above method, the target microorganism may be mutagenized such as ethylmethanesulfonate (hereinafter sometimes abbreviated as EMS) or nitrosoguanidine. There are also methods of chemical mutation treatment and physical mutation treatment such as ultraviolet ray and radiation treatment with chemical substances. This chemical or physical mutation treatment includes natural mutation.
[0012]
  An example of a method for obtaining a γ-glutamyltranspeptidase-deficient mutant is shown below. First, constructed with λ phage using an oligo DNA probe (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) designed based on the N-terminal amino acid sequence of γ-polyglutamyltranspeptidase purified from the culture supernatant of Bacillus subtilis natto Bacillus subtilis genomic DNA library (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press), oligonucleotide ECL labeling detection kit (Amersham Biosciences) and 5 'end³²Labeling with P (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press), and the γ-glutamyl transpeptidase gene is selected according to the plaque hybridization method.
  When the base sequence of this γ-glutamyl transpeptidase gene was analyzed by a conventional method such as a sequencer, it had the base sequence and amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
[0013]
  Next, the Ssp I-Bgl II fragment containing the γ-glutamyl transpeptidase gene is cloned into the Hinc II-Bam HI site of the plasmid pUC 118.
  The spectinomycin isolated from the plasmid pDG 1726 (AM Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167: 335-336, 1995) was placed in the Stu I site of the cloned γ-glutamyl transpeptidase gene. An Eco RV-Hinc II fragment containing a resistance gene is inserted to construct a plasmid in which the gene is disrupted.
  Using this plasmid, Bacillus subtilis is transformed by a conventional method (L. S. P. Tran, T. Nagai and Y. Itoh, Molecular Microbiol., 37 (5), 1159-1171, 2000) to obtain a transformant.
  The obtained transformant is cultured in LB medium at 30 to 40 ° C., preferably 35 to 37 ° C. for 12 to 24 hours, preferably 18 hours (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press), γ-glutamyl transpeptidase gene-deficient mutants are selected using the enzyme activity of γ-glutamyl transpeptidase as an index.
[0014]
  The enzyme activity of γ-glutamyl transpeptidase can be measured using degradation of γ-glutamyl paranitroanilide, which is a chromogenic substrate, as an index. That is, using the culture supernatant obtained by centrifugation (6000 rpm) of 50 mL of the culture solution as a sample, the following reaction system was prepared and held at 37 ° C. for 30 minutes, and then the absorbance of the reaction solution was measured at a wavelength of 410 nm. By doing.
  Here, the molecular extinction coefficient of paranitroanilide is 8800, and the activity of releasing 1 μmol of paranitroanilide per minute is 1 U.
[0015]
50 μL of culture supernatant
1 mM γ-glutamylparanitroanilide 250 μL
1M Tris-HCl buffer 50μL
200μL of sterilized deionized water
            (Total 550 μL)
[0016]
  By measuring the enzyme activity of the above-mentioned γ-glutamyl transpeptidase, a strain having extremely low or no activity of the enzyme is selected as a γ-glutamyl transpeptidase gene-deficient mutant.To do.
[0017]
  Next, an example of a method for obtaining a γ-polyglutamic acid hydrolase gene-deficient mutant is shown below. First, the above-mentioned genomic DNA library of Bacillus subtilis is searched using oligo DNA-A (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) obtained by comparing the homology of various enzymes that cleave the γ-glutamyl group. To do. As a result, three clones that hybridized with oligo DNA-A were obtained.
  As a result of determining the base sequence of the obtained clone by a conventional method such as a sequencer, and searching for homology with a known base sequence using a database such as DDBJ, one clone contains a novel full-length gene. There was found. Therefore, this novel gene was named pghA and the enzyme encoded by the gene was named γ-polyglutamate hydrolase, respectively.
  In addition, even if a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted, added, or includes an inversion in the above base sequence, the γ-polyglutamate hydrolase gene has the same function. Is included.
[0018]
  From the plasmid pDG646 (AM Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167: 335-336, 1995), the Bcl I site of the γ-polyglutamate hydrolase (pghA) gene isolated as described above was isolated. A Bam HI fragment containing the released erythromycin resistance gene is introduced to construct a plasmid in which the gene is disrupted.
  Using this plasmid, Bacillus subtilis is transformed by a conventional method to obtain a transformant. The obtained transformant was cultured in LB medium at 30 to 37 ° C., preferably 35 to 37 ° C. for 12 to 24 hours, preferably 18 hours, and γ-polyglutamic acid was used as an index with erythromycin resistance and γ-polyglutamic acid resolution as indices. A polyglutamate hydrolase gene-deficient mutant is selected.
[0019]
  The resolution of γ-polyglutamic acid can be measured by the following method.
  Mutated Bacillus subtilis in minimal medium (8% glycerol, 0.7% ammonium chloride, 1.5% sodium citrate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.003% Ferric chloride, 0.015% calcium chloride, 0.01% manganese chloride, 0.5 mg / L biotin) and culture for 4 to 8 days, preferably 7 days.
  After completion of the culture, the culture is centrifuged (6000 rpm) to obtain a culture supernatant. To the obtained culture supernatant, 1/5 volume of 5M saline and 2 volumes of ethanol are added to precipitate the produced γ-polyglutamic acid (Nagai et al., J. Gne. Appl. Microbiol 43, 139-143, 1997).
[0020]
  The obtained γ-polyglutamic acid was dissolved in 400 μL of phosphate buffer, and 10 μL was dissolved in 1% agarose.gelIt is subjected to electrophoresis (20 V / cm, 30 minutes) and fractionated by molecular weight. After fractionation, agarose was dissolved in methylene blue (dissolved in 30% ethanol at pH 9.5).gelThe γ-glutamic acid developed above is stained and detected.
  If γ-polyglutamic acid is decomposed, the mobility of γ-polyglutamic acid having a low molecular weight increases, so that it can be easily detected.
  Based on the results of electrophoresis, a strain with significantly reduced resolution of γ-polyglutamic acid was selected as a γ-polyglutamic acid hydrolase gene-deficient mutant.To do.
[0021]
  In addition, one example of a method for obtaining a γ-polyglutamate degrading enzyme deficient mutant in which both the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamate hydrolase gene are mutated is shown. Can be obtained by transformation according to the method described above. It can also be obtained by preparing a mutant mutant lacking the γ-glutamyl transpeptidase gene or the γ-polyglutamic acid hydrolase gene and then selecting the mutant strain by chemical or physical mutation treatment. To obtain mutants that have lost both enzyme activities by further mutating mutant mutants of γ-glutamyltranspeptidase gene or γ-polyglutamic acid hydrolase gene obtained by mutagenesis by chemical or physical means. You can also. In addition, although the frequency is very low, it is also possible to obtain the enzyme-deficient strain produced by natural mutation without performing artificial mutation treatment. Thus, the selected microorganism was named NAF M61 strain and NAF M5-005 strain. These strains are deposited under the accession numbers FERM P-18688 and FERM P-18695, respectively, at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0022]
  The method of obtaining a mutant strain by chemically or physically inducing a mutation will be described by taking EMS as an example. EMS is added to a culture of γ-polyglutamic acid-producing bacteria such as Bacillus natto. Perform mutagenesis. Thereafter, the culture solution diluted with physiological saline is applied to a solid medium such as LB agar medium and cultured. Next, the formed colonies are isolated, inoculated into a liquid medium and cultured, and the enzyme activity of the obtained culture is measured using a substrate such as γ-glutamylparanitroanilide, and the activity disappears or decreases significantly. Select the strains that are present. The degradation activity of γ-polyglutamic acid can be confirmed by agarose gel electrophoresis. In this way, the claim1 and 2The described mutant strains can be obtained.
[0023]
  In order to produce γ-polyglutamic acid using the mutant strain according to the present invention, the γ-polyglutamic acid may be collected from the culture by culturing in a medium in which the microorganism can grow well. As the medium used in this case, a medium containing a carbon source preferred by the microorganism, such as glycerol, glucose, fructose, mannitol, xylose, and arabinose is preferable. Culturing is carried out at 30 to 45 ° C., preferably 35 to 40 ° C. under mild shaking (120 to 150 revolutions per minute). Moreover, the production of γ-polyglutamic acid can be increased by appropriately adding sodium glutamate (0.5 to 1.5%).
[0024]
  Next, production examples of γ-polyglutamic acid are shown. γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant strain was added to a minimal medium (8% glycerol, 0.7% ammonium chloride, 1.5% sodium citrate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.003% ferric chloride, 0.015% calcium chloride, 0.01% manganese chloride, 0.5 mg / L biotin) and GSP medium (1.5% glucose, 1.5% L-) as nutrient medium Glutamic acid, 1.5% phytopeptone), and cultured at 30-45 ° C., preferably 37 ° C., for 60-160 hours, preferably 140 hours, and when the accumulated amount of γ-polyglutamic acid is maximized By terminating the culture, γ-polyglutamic acid can be produced in large quantities.
[0025]
  In the γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant of the present invention, the produced γ-polyglutamate is not degraded because the enzyme that degrades γ-polyglutamate has lost its activity. Therefore, the production amount of γ-polyglutamic acid is improved, and a product having a specific molecular weight is obtained. In addition, when natto is produced using the mutant strain, sticky natto with strong stringing can be obtained.
  The collection of γ-polyglutamic acid from the culture may be carried out by applying a conventional method such as adding sodium chloride to 1 M and then precipitating with ethanol. Can be obtained. High purity γ-polyglutamic acid can be obtained by a conventional purification method such as repeating the above ethanol precipitation or gel filtration by high performance liquid chromatography (hereinafter sometimes abbreviated as HPLC).
[0026]
  The γ-polyglutamic acid obtained by the present invention can be used for various applications by paying attention to its functionality. For example, in addition to calcium absorption promoters, it can be used as biofilms used for culturing microorganisms, coating agents for foods and cosmetics, moisture absorption / retention agents, food additives for thickening, and the like.
[0027]
【Example】
  The present invention will be described below with reference to examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
Reference example1 (Method for obtaining mutant mutant lacking γ-glutamyltranspeptidase)
  Using an oligo DNA probe (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) designed based on the N-terminal amino acid sequence of γ-glutamyltranspeptidase purified from the culture supernatant of Bacillus subtilis (Miyagino strain), From the constructed Bacillus subtilis genomic DNA library, a γ-glutamyl transpeptidase gene was prepared by a conventional method (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press).
  When the base sequence of this γ-glutamyl transpeptidase gene was analyzed by a conventional method such as a sequencer, it had the base sequence and amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  Next, the Ssp I-Bgl II fragment containing the γ-glutamyl transpeptidase gene was cloned into the Hinc II-Bam HI site of the plasmid pUC 118 (Toyobo).
[0028]
  The spectinomycin isolated from the plasmid pDG 1726 (AM Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167: 335-336, 1995) was inserted into the Stu I site of the cloned γ-glutamyl transpeptidase gene. An Eco RV-Hinc II fragment containing a resistance gene was inserted to construct a plasmid in which the gene was destroyed.
  Using this plasmid, Bacillus subtilis was transformed (L. S. P. Tran, T. Nagai and Y. Itoh Molecular Microbiol. 37 (5), 1159-1171, 2000) to obtain transformants.
  The obtained transformant was cultured in LB medium at 37 ° C. for 18 hours (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press), and γ-glutamyltranspeptidase gene-deficient mutants were selected using the enzyme activity of γ-glutamyltranspeptidase as an index.
  This bacterium was named Bacillus subtilis NAF M13 strain (FERM P-18687).
[0029]
  The enzyme activity of γ-polyglutamyltranspeptidase was measured using degradation of γ-glutamylparanitroanilide, which is a chromogenic substrate, as an index. That is, the following reaction system was prepared using the culture supernatant obtained by centrifuging (6000 rpm) of 50 mL of the above culture solution as a sample, and the absorbance after maintaining this at 37 ° C. for 30 minutes was measured at a wavelength of 410 nm Went by. The results are shown in Table 1.
  The molecular extinction coefficient of paranitroanilide is 8800, and the activity of releasing 1 μmol of paranitroanilide per minute is 1U. For the calculation of the activity, para-nitroanilide was used as a calibration curve, and the γ-glutamyl transpeptidase activity was similarly measured for wild-type Bacillus natto.
[0030]
50 μL of culture supernatant
1 mM γ-glutamylparanitroanilide 250 μL
1M Tris-HCl buffer 50μL
200μL of sterilized deionized water
            (Total 550 μL)
[0031]
Reference example2 (Method for obtaining mutant mutant lacking γ-glutamyltranspeptidase)
  Bacillus subtilis natto 2 mL of LB medium (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratry Press) at 37 ° C for 5 hours, then EMS (SIGMA) was added to 2% (v / v), and further cultured with shaking for 15 minutes to induce mutagenesis. Went.
  After the mutagenesis treatment, a culture solution diluted to 1 / 10,000 with physiological saline was added to an LB agar medium (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press) and cultured at 37 ° C. overnight.
  After completion of the culture, colonies formed on the LB agar medium were isolated, inoculated into 2 mL of LB medium, and cultured at 37 ° C. for 14 hours. About the culture supernatant obtained by removing the cells from the culture by centrifugation (6000 rpm),Reference exampleAs in 1, gamma-glutamyl transpeptidase activity was measured using gamma-glutamyl paranitroanilide as a substrate. The results are shown in Table 1. A strain having lost or markedly reduced enzyme activity was selected, and this mutant strain was named Bacillus subtilis NAF M5-001 strain (FERM P-18694).
[0032]
[Table 1]
                                Table 1

[0033]
  As is clear from Table 1,Reference exampleThe mutant strain obtained by introducing a mutation into the γ-glutamyl transpeptidase gene obtained in 1 and 2 has a γ-glutamyl transpeptidase activity below the detection limit. From this, it was shown that the mutation can be induced in the γ-glutamyl transpeptidase gene in any of the mutagenesis methods.
[0034]
Reference example3 (Preparation of γ-polyglutamate hydrolase gene)
  Comparison of the homology of various enzymes that cleave the γ-polyglutamyl group, and create several types of oligo DNA primers including the oligo DNA of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,Reference exampleOne Bacillus subtilis genomic DNA library was searched.
  As a result, three clones were obtained that crossed with the oligo DNA-A probe of SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing.
  For the obtained clone, the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) was determined using the dye terminator cycle sequence kit (ABI), and the homology of the nucleotide sequences was compared in the DDBJ database based on this. As a result, it was found that this gene has a novel function. Therefore, this gene was named pghA gene, and the enzyme encoded by the gene was named γ-polyglutamate hydrolase.
[0035]
Reference example4 (Method for obtaining mutant mutant lacking γ-polyglutamic acid hydrolase)
  Reference example 3Isolated from plasmid pDG 646 (AM Guerout-Fleury, K. Shazard, N. Frandsen and P. Stragier Gene 167: 335-336, 1995) at the Bcl I site of the γ-polyglutamate hydrolase (pghA) gene prepared in A Bam HI fragment containing the erythromycin resistance gene was introduced to construct a plasmid in which the gene was disrupted.
  Bacillus natto bacillus subtilis was transformed with this plasmid by a conventional method, and a γ-polyglutamate hydrolase-deficient mutant was obtained using erythromycin resistance and γ-polyglutamate resolution as indicators.
  That is, the transformed Bacillus subtilis was cultured at 37 ° C. for 18 hours in an LB medium supplemented with 1 μg / ml of erythromycin. As a result, strains that formed colonies on the medium were selected as erythromycin-resistant strains.
[0036]
  Then, about the erythromycin resistant strain, the resolution | decomposability of (gamma) -polyglutamic acid was measured with the following method. First, the mutant Bacillus natto Bacillus subtilis is added to a minimal medium (8% glycerol, 0.7% ammonium chloride, 1.5% sodium citrate, 0.05% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0% 0.003% ferric chloride, 0.015% calcium chloride, 0.01% manganese chloride, 0.5 mg / L biotin) was inoculated into 2 mL and cultured for 7 days.
  After culture, centrifugation (6000 rpm) was performed to obtain a culture supernatant. To the culture supernatant thus obtained, 1/5 volume of 5 M saline solution and 2 volumes of ethanol were added to precipitate the produced γ-polyglutamic acid (Nagai et al., J. Gne. Appl. Microbiol. 43, 139-143, 1997).
[0037]
  The obtained γ-polyglutamic acid was dissolved in 400 μL of phosphate buffer, and 10 μL was dissolved in 1% agarose.gelSubject to electrophoresis (20 V / cm, 30 minutes). Electrophoresis, agarose with methylene blue (dissolved in 30% ethanol at pH 9.5)gelThe γ-glutamic acid developed above was stained and detected.
  From the results of electrophoresis, a strain having a remarkably reduced resolution of γ-polyglutamic acid was selected as a γ-polyglutamic acid hydrolase gene-deficient mutant strain, which was selected as a Bacillus subtilis NAF M60 strain (FERM P-18696). Named.
  Also,Reference exampleSimilar results were obtained for mutant strains obtained by performing mutagenesis treatment using EMS as in 2.
[0038]
Example1(Method for obtaining γ-glutamyltranspeptidase and γ-polyglutamate hydrolase gene-deficient mutant)
  A mutant lacking both the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamate hydrolase gene,Reference exampleIt was obtained by transforming Bacillus natto bacillus subtilis according to a standard method using two types of plasmids in which the genes prepared in 1 and 3 were disrupted. Also,Reference exampleSimilarly to 2, the following operation was similarly performed for the defective mutant obtained by mutation treatment with EMS.
  About the obtained transformant,Reference exampleIn the same manner as in 1, γ-glutamyltranspeptidase was used with the chromogenic substrate paranitroanilide decomposition activity as an index,Reference example 4Similarly, the target mutant was selected by determining the presence or absence of γ-polyglutamate hydrolase using the resolution of γ-polyglutamate by agarose gel electrophoresis as an index. In this way, double mutant NAF M61 strain (FERM P-18688) and NAF M5-005 strain (FERM P-18695) were obtained. The results are shown in Table 2. Figure 1 shows agarosegelThe electrophoretic image which performed electrophoresis is shown.
[0039]
[Table 2]
                                Table 2

[0040]
  As a result, the example1The deficient mutant obtained inReference exampleSimilar to the defective mutants obtained in 1 and 2, the results obtained by measuring the γ-glutamyl transpeptidase activity revealed that the enzyme activity was below the detection limit. In addition, the results of agarose gel electrophoresis revealed that the activity of γ-polyglutamic acid hydrolase was lost. From these facts, it was found that double mutant strains can be obtained by the method of the present invention.
[0041]
Example2(Mass production of γ-polyglutamic acid using γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant)
  Example1The γ-glutamyltranspeptidase gene and γ-polyglutamate hydrolase gene-deficient mutant obtained in (1) were inoculated into 100 mL of the minimum medium or GSP medium and cultured at 37 ° C. for 2 to 7 days. For comparison, wild-type natto andReference exampleThe γ-glutamyl transpeptidase gene-deficient mutant obtained in 1 was also tested in the same manner.
  After completion of the culture, the cells were removed by centrifugation (6000 rpm) to obtain a culture supernatant. To the obtained culture supernatant, 2 volumes of ethanol was added to precipitate γ-polyglutamic acid, and then collected by centrifugation (12000 rpm). This ethanol precipitation was repeated twice, followed by drying under reduced pressure by a conventional method to obtain γ-polyglutamic acid.
[0042]
  The above γ-polyglutamic acid was subjected to two-dimensional immunoelectrophoresis (Uchida et al., Mol. Microbiol., 9: 487-496, 1993) using anti-γ-polyglutamic acid (PGA) serum, and molecular weight distribution Was analyzed. In the two-dimensional immunoelectrophoresis, the first dimension is 1.2% agarosegelThe second dimension is 1.2% agarose containing 10% (v / v) anti-γ-PGA serum (Uchida et al., Mol. Microbiol., 9: 487-496, 1993).gelWas used for electrophoresis.
  After completion of electrophoresis, the agarose gel was washed with physiological saline, stained with amide black, and the electrophoretic image was analyzed to examine changes in the molecular weight of γ-polyglutamic acid during the culture period. FIG. 2 is a migration image of γ-polyglutamic acid after completion of two-dimensional immunoelectrophoresis.
  The purified γ-polyglutamic acid was used as a sample for HPLC, and the concentration and molecular weight of the produced γ-polyglutamic acid were determined (Nagai et al., J. Gne. Appl. Microbiol. 43, 139-143, 1997 ) The column used in HPLC was Asahipack GAF-7M (manufactured by Showa Denko KK), and was carried out under the conditions of solvent (50 mM sodium phosphate, 100 mM sodium sulfate, pH 6.8), and a flow rate of 0.6 ml / min.
[0043]
  Since γ-polyglutamic acid produced using wild-type Bacillus natto is degraded by γ-polyglutamate degrading enzymes (γ-glutamyl transpeptidase and γ-polyglutamate hydrolase) produced by the natto bacillus, It was revealed that not only the amount of γ-polyglutamic acid to be obtained is extremely small but also the final decomposition into glutamic acid.
  Also,Reference exampleThe γ-polyglutamic acid produced by the γ-glutamyltranspeptidase-deficient mutant NAF M13 (FERM P-18687) obtained in 1 was degraded under the influence of the γ-polyglutamic acid hydrolase activity, and the average molecular weight was 100,000. It became clear that it becomes gamma-polyglutamic acid of dalton (0.1 MDa).
[0044]
  Example1Γ-polyglutamic acid produced by the mutant mutant NAF M61 strain (FERM P-18688) and NAF M5-005 strain (FERM P-18695) of γ-glutamyltranspeptidase and γ-polyglutamic acid hydrolase gene obtained in Γ-glutamyltranspeptidase and γ-polyglutamate hydrolase have almost no residual enzyme activity, and it has been clarified that γ-polyglutamate having an average molecular weight of 2 million daltons (2 MDa) is accumulated. .
  In contrast, γ-polyglutamic acid produced by a mutant mutant lacking γ-glutamate hydrolase gene has a molecular weight of 5 million daltons (5 MDa) to 5000 daltons because the enzyme activity of γ-glutamyltranspeptidase remains. It was found to be distributed over a wide range of (5 kDa).
[0045]
  As apparent from FIG. 2, in the wild-type Bacillus natto, the accumulated amount of γ-polyglutamic acid was small throughout the culture period, and as the culture period became longer, γ-polyglutamic acid tended to be degraded and the molecular weight tended to decrease.
  Moreover, in the mutant lacking the γ-glutamyl transpeptidase gene, 5 million daltons (5 MDa) of γ-polyglutamic acid is produced on the second day of culture, but 100,000 daltons (0) on the seventh day of culture. .1 MDa) was the average, and the production amount was found to accumulate in large amounts compared to wild-type Bacillus natto.
  Furthermore, in the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamic acid hydrolase gene-deficient mutant, γ-polyglutamic acid having a molecular weight of 5 million daltons (5 MDa) is present on the 7th day of culture, and the average molecular weight is 2 million daltons. (2MDa) is shown. From this, it was revealed that γ-polyglutamic acid having a large molecular weight can be obtained in a large amount as compared with wild-type Bacillus natto and mutant mutants lacking the γ-glutamyl transpeptidase gene.
[0046]
Reference Example 5(Method for identifying mutant gene of γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant)
  Reference Examples 1-4It was confirmed by a complementation test using the gene that the γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant obtained in 1 was caused by mutations in the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamate hydrolase gene.
  That is,Reference exampleBacillus subtilis γ-glutamyltranspeptidase gene (Ssp I-Bgl II fragment) prepared in 1 andReference exampleThe γ-polyglutamate hydrolase gene (Hind III fragment) prepared in 3 was cloned into an integration plasmid vector such as pDG 1662 by a conventional method to obtain a plasmid (FIG. 3).
[0047]
  Using this plasmid, it was integrated and transformed into the amylase gene (amyE) locus of γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant using a standard method (Anne-Marie et al., Gene, 180: 57-61, 1996). Obtained Bacillus subtilis.
  By evaluating the resolution of γ-polyglutamic acid of Bacillus subtilis of the transformant thus obtained, the deficiency of γ-polyglutamate-degrading enzyme can cause mutation of γ-glutamyl transpeptidase gene or γ-polyglutamate hydrolase gene. Determine the cause.
[0048]
  Complementation test of γ-glutamyl transpeptidase gene deletion mutantReference exampleThe culture supernatant obtained by culturing in the same manner as in Example 1 was performed by measuring the activity of γ-glutamyl transpeptidase using degradation of γ-glutamylparanitroanilide as an index. At this time, when the enzyme activity of the transformed strain is restored to a level equivalent to that of wild-type Bacillus natto, it can be proved that the mutation is a mutation of the γ-glutamyl transpeptidase gene.
[0049]
  Next, the complementation test of γ-polyglutamate hydrolase gene deletion mutation is as follows:Reference exampleAs in 3, agarose was used for ethanol-precipitated γ-polyglutamic acid.gelThe electrophoresis was performed. AgarosegelIf γ-polyglutamic acid is degraded in the electrophoretic image obtained by electrophoresis in the same manner as wild-type Bacillus natto, it can be proved that the mutation is derived from the γ-polyglutamic acid hydrolase gene.
[0050]
  The complementation test was also performed using an E. coli-Natto shuttle shuttle vector such as pHB 201 (Bacillus genetic stock center Ohio, U.S.A). The γ-glutamyl transpeptidase gene (Ssp I-Bgl II fragment) and the γ-polyglutamate hydrolase gene (Hind III fragment) of Bacillus natto were cloned into the multi-cloning site of plasmid pHB 201 by a conventional method, and then E. coli was used. The DH5α strain was transformed and the plasmid was grown by culturing the E. coli in LB medium for 18 hours.
[0051]
  A γ-polyglutamate degrading enzyme-deficient mutant was transformed with the grown plasmid. That is, by this operation, the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamate hydrolase gene are reintroduced into the γ-polyglutamate degrading enzyme-deficient mutant.
  As a result, if the degradation activity of γ-polyglutamic acid is equivalent to the degradation level of wild-type Bacillus natto, the mutation of the γ-polyglutamic acid degrading enzyme-deficient mutant is the γ-glutamyl transpeptidase gene or γ-polyglutamic acid hydrolase gene. Can be identified as a mutation.
[0052]
  As a result of the above complementarity test, in all cases, the resolution of γ-polyglutamic acid was restored to the same level as that of wild-type Bacillus natto. Therefore, γ- in the γ-polyglutamate-degrading enzyme-deficient mutant of the present invention It was found that the increase in the production amount of polyglutamic acid was caused by mutations in the γ-glutamyl transpeptidase gene or the γ-polyglutamic acid hydrolase gene.
[0053]
【The invention's effect】
  The γ-polyglutamic acid degrading enzyme-deficient mutant according to the present invention can stably produce a large amount of γ-polyglutamic acid. Moreover, since stringing is strong and sticky, it can be used for the production of natto.
  Since the mutant strain developed in the present invention has lost γ-polyglutamate-degrading enzyme activity, γ-polyglutamate produced by the microorganism is not degraded. Therefore, by using the mutant strain of the present invention, it is possible to produce γ-polyglutamic acid with a stable yield. Furthermore, since γ-polyglutamic acid is not degraded, a significant increase in yield can also be achieved. The average molecular weight is2MDaSince γ-polyglutamic acid is obtained,Its natureIt can be used for applications according to
[0054]
  γ-polyglutamic acid has functions such as a calcium absorption promoting effect in addition to known uses such as biofilms, coating agents used in foods and cosmetics, moisture absorption / retention agents, food additives for thickening, etc. Therefore, the present invention is expected to have a great effect on the development of products related to such applications.
[0055]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
[Figure 1] AgarosegelThe electrophoretic image of (gamma) -polyglutamic acid after completion | finish of electrophoresis is shown. In the figure, A is a γ-polyglutamic acid sample (10 μL) purified from the culture solution of a mutant mutant of γ-glutamyl transpeptidase gene and γ-polyglutamic acid hydrolase gene, and B is a mutant mutant lacking γ-glutamyl transpeptidase gene. C represents a γ-polyglutamic acid sample (10 μL) purified from the culture solution of No. 1, and C represents a γ-polyglutamic acid sample (10 μL) purified from the culture solution of wild-type Bacillus natto.
FIG. 2 shows a migration image of γ-polyglutamic acid after completion of two-dimensional immunoelectrophoresis. In the figure, A is γ-polyglutamic acid obtained from the culture of wild-type Bacillus natto, B is γ-polyglutamic acid obtained from the culture of γ-glutamyltranspeptidase gene-deficient mutant, and C is γ-glutamyltrans. Γ-polyglutamic acid obtained from the culture of a peptidase gene and a γ-polyglutamic acid hydrolase gene-deficient mutant strain is shown, respectively.
FIG. 3 is a schematic diagram of an amylase gene (amyE) locus integration vector used for complementation testing.

Claims

Bacillus subtilis NAF M61 strain (FERM P-18688) in which a spectinomycin resistance gene is inserted into the γ-glutamyl transpeptidase gene and an erythromycin resistance gene is inserted into the γ-polyglutamate hydrolase gene.

Bacillus subtilis NAF M5-005 strain (FERM P-18695) in which mutation was induced in the γ-glutamyl transpeptidase gene and the γ-polyglutamic acid hydrolase gene by chemical mutation treatment or physical mutation treatment.

A method for producing γ-polyglutamic acid, comprising culturing the γ-polyglutamic acid-degrading enzyme-deficient mutant strain according to claim 1 or 2 in a medium and collecting γ-polyglutamic acid from the culture.