JP3676803B2

JP3676803B2 - Oligosaccharides derived from antigenic polysaccharides obtained from pathogens

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Publication number: JP3676803B2
Application number: JP50669093A
Authority: JP
Inventors: モロー，モニク
Original assignee: パストウール・メリユー・セロム・エ・ヴアクサン
Priority date: 1991-10-10
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 2005-07-27
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: DK0562107T3; NO932102L; DE69232585D1; FI110164B; FI932626A0; CA2098105A1; AU2946992A; NO306905B1; HUT70298A; FR2682388A1; WO1993007178A1; EP0562107A1; HU219672B; FI932626A; US6007818A; NO932102D0; FR2682388B1; ATE217015T1; KR100249709B1; US6045805A

Abstract

An oligoside derived from an antigen polyoside obtained from a pathogenic agent, a method for its preparation, and its use particularly as a vaccinal agent. The oligoside is prepared by oxidation-reduction depolymerisation reaction.

Description

本発明は病原体（pathogenic agent）から得られる抗原多糖（antigenic polysaccharide）から誘導されたオリゴ糖、その製造方法、及び、特に、そのワクチン製剤（vaccinal agent）としての使用に関する。
バクテリア及び酵母のごときカビ（fungi）はその表面構造中に多糖を含有している。即ち、大部分のバクテリアは、多かれ少なかれ強固にバクテリアに結合しているが、厳密にいえば、包膜（envelope）ではない多糖質の滲出物（exudate）で被覆されている。この滲出物は莢膜（capsule）又は糖衣（glycocalyx）と呼ばれている。更に、グラム陰性バクテリアの外膜（outer membrane）は、特に、リポ多糖（LPS）からなる。最後に、多糖はカビの細胞壁（wall）にも存在する。これらの多糖は、実際には、感染哺乳動物において免疫応答（immunological response）を誘発する表面抗原（surface antigen）である。
かかる多糖は、その構成成分と結合が明確に規定されている（define）、かつ、各々、考慮しているカビ又はバクテリア種の特性である反復単位に基づいて形成されている。これらの反復単位はエピトープ（epitope）、即ち、抗原性決定構造体（antigenicitydetermining structures）を含有している。例示として、莢膜状（capsular）多糖又はリポ多糖から得られる種々の形式の反復単位が図１に示されている。反復単位は、しばしば、例えば、分子の骨格中又は分岐した位置中に存在するホスフェート官能基並びに０−アセチル基及びピルビン酸基（pyruvate group）のごとき非常に不安定な（labile）官能基を含有している。
多糖は、実際には、一つの分子から他の分子へと変動し得る量のグリコシド単位を含有する重合体分子の組合せからなる。従って、多糖は平均分子量のみによる分子量によって記載し得る。ホモ多糖の場合にはグリコシド単位は単糖である。ヘテロ多糖の場合にはグリコシド単位は一定の方法で連結された構成成分の鎖を形成している。
多糖の平均分子量に関して、これはゲル濾過（gel filtration）によって決定し得る。この場合、分子量はGranath等によりJ.Chrom.(1967)28:69に記載の方法に従って、溶離定数（elution constant）（K_D）又はデキストラン当量（dextran equivalent）（DE_q）で表される；この方法は以下のごとく要約し得る：
多糖溶液を、構成成分をその分子量に従って分離する拡散−排除ゲルクロマトグラフィー（exclusion-diffusion gel chromatography）カラム上で分析する。この種のゲルは例えばセファデックス（Sephadex）（Pharmacia）、バイオ−ゲル（Bio-Gel）（Bio-Rad）、フラクトゲル（Fractogel）（東洋ソーダ）、セファロース（Sepharose）（Pharmacia）及びセファリル（Sephacryl）（Pharmacia）の商品名で商業的に入手される。ゲルの分画（fractionation）の領域は、分析すべき分子母集団（molecular population）内で表される分子量の範囲に適合させるべきであることは明らかである。例えば、ゲル濾過カラムセファロース2BCL、4BCL及び6BCLは、デキストラン当量で測定して、それぞれ、20,000,000〜100,000；5,000,000〜20,000及び1,000,000〜10,000の分画の領域を有する。一般的には、塩溶液、例えば、0.2M塩化ナトリウム溶液が溶離剤として使用される。溶離定数は下記の式：
Ve−Vo
Vt−Vo
［式中のVeは、考慮されている溶液（preparation）の溶離容量（elution vilume）であり、Vtはカラムの全容量であり、Voはカラムの死容量（dead volume）である］に基づいて計算される。
例えば、図2a及び2bは、それぞれ、セファロース4BCLカラム上でのサルモネラチフィ（Salmonella typhi）及びストレプトコカスプニュウモニアエ（Streptococcus pneumoniae）1型の多糖の溶離図（elution profile）を示している。従って、S.チフィの多糖はセファロース4BCL上では最大分子量を決定し得ない重合体からなる。同様に、S.プニュウモニアエ1型の多糖は分子量が0〜0.45のK_Dの範囲で変動する重合体から本質的になる。定義により、多糖の平均溶離定数は溶離図のスロープの接線（tangent）の交差点において；又は、概略的には、溶離図の頂点において決定される。従って、図2a及び2bにおいて示される多糖の平均溶離定数は、それぞれ、0及び0.04である。
デキストランを使用して作成した検量線（calibration series）に基づいて、溶離定数をDE_qで表わされる分子量に変換し得る。例えば、図3は検量線の一例を示す。
病原体、例えば、バクテリア又はカビの表面抗原である多糖は、その抗原性（antigenicity）のために、ワクチン剤として良好な候補者である。実際に、多糖抽出物からなるワクチンは成人においては効果があることが証明されている。しかしながら、このことは小児については適用されない。この重要な問題を排除するために、多糖を蛋白質に共有結合させ、それによって、かく得られる分子にT−依存特性（T-dependent character）を付与し、その免疫原性（immunogenicity）を増大させることが提案され、成功している。
多糖に基づくワクチンとしては、従来、ネイセリアメニンギチジス（Neisseria meningitidis）A,C,Y又はW135群、ストレプトコカスプニュウモニアエ、ハエモフィルスインフルエンザエ（Haemophilus influenzae）B型及びサルモネラチフィによって惹起される感染に対するワクチンがある。
病原体の抗原多糖は免疫原（immunogen）として潜在的に有利なものであるが、数百万デキストラン当量という大きさであり得る、その大きな分子量のために、その使用が困難である。特に、これを複合体（conjugate）の形、即ち、蛋白質とカップルさせた形で使用することを希望する場合には、解決することが困難な技術的な問題に遭遇する。カップリング工程中に、ゲル又は凝集物質が形成され、このことが、複合体を濾過により殺菌することを困難にしている。
この問題を排除するために、多糖の大きさを減少させ、その取扱いを容易にすることが既に提案されている。この目的のために種々の開裂（分解）（cleavage）方法が提案されている。即ち、例えば、これらの方法は超音波による断片化（フラグメント化）（fragmentation）又は酸性、塩基性又は酵素媒体中でのアルカリ性加水分解による断片化である。しかしながら、これらの断片化は全く満足し得ないものである。実際に、これらの方法においては抗原特異性（antigen specificity）に必要な化学的官能基が失われることにより、特徴的なエピトープが全体的に或いは部分的に破壊される。
例えば、S.チフィ又はN.メニンギチジスA群の莢膜状多糖の酸性又はアルカリ性加水分解により、多糖の抗原特異性に必要なアセチル基が除去される。更に、アルカリ性加水分解によって得られた断片の正確な再アセチル化（reacetylation）は、不可能ではないにしても、極めて困難である。
更に、アルカリ性加水分解による断片化法については、比較的均一な寸法の断片を得ることは必ずしも可能ではなく、一方、医薬の製造においては一定なかつ標準化された均一な製品が要求される。
超音波による断片化においては、例えば、H．インフルエンザエB型の多糖の末端ホスフェート基が超音波処理により失われることが示されている。このことにより、多糖鎖の分岐した位置にあるホスフェート基がかかる処理中に除去される恐れが生じ得る。
更に、超音波を使用することにより比較的均一な大きさの断片を得ることができるが、超音波法により十分に小さい寸法の断片を製造するためには非常に長い処理時間を必要とし、これにより他の不利益、即ち，装置の急速な劣化を生じ得る。その効率は限定されており、工業的な規模での超音波の適用は回避すべきである。
最後に、多糖の酵素解重合の使用は適当な酵素が知られている多糖に限定される。しかしながら、この重大な不利益は酵素のその基質（substrate）に対する高度の特異性に固有のもの（inherent）である。
従って、ワクチンの分野においては、重要な技術的なかつ経済的な進歩は、従来の方法の種々の不利益をもはや生ずるこのない解重合法を提供し得るものでなければならない。換言すれば、特に、有利な性質を組合せて有する、抗原多糖の解重合法を提供し得ることが必要である；その理由は下記の通りである：
−この方法は減少した数のグリコシド単位を有するオリゴ多糖であって、しかも、断片されるべき多糖の少なくとも1個のエピトープの必須の構造決定因子（structural determinant）を保存しているオリゴ多糖を得ることを可能にする。
−この方法は意図する任意の抗原多糖構造体に使用し得る。
−この方法は十分に均一な寸法の断片を得ることを可能にする。
−この方法は安価でありかつその使用が極めて簡単である。
驚くべきことに、今般、これらの目的は酸化−還元解重合反応によって達成されることが見出だされた。
今日まで、英語においては、しばしば、ORDの略号で記載されるこの方法は、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン及びDNAを断片化するために、かつ、本発明によって達成される目的とは全く異なる目的のために使用されていた。その目的は例えば生成物の粘度を低下させること、或いは、ヘパリンのごとき線状分子の場合には異なる抗凝集活性（anticoagulant activity）を有することが知られている、寸法のより小さい断片を得ることであった。勿論、この方法を適用した物質は免疫学的に重要なものではないので、得られた断片の反復単位の結合性（integrity）の研究は行われなかった。
更に、ORD反応はホスフェート基を破壊する（destructive）か又は炭水化物環の炭素−炭素結合の開裂（cleavage）により炭水化物環を破壊すると記載している多数の公知刊行物、例えば、K.Uchida,Carbohydrate Research,(1988)173：89-99;H．Uchiyama,Journal of Biological Chemistry,(1990)265：7753-7759；S.W.Green,The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB；Academic Press(1980);1132；A.Herp,The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB；Academic Press(1980):1276；Kochetkov等，Radiation Chemistry of Carbohydrates，Pergammon Press,Oxford,(1979)が存在する。
この分野の従来の状態から受ける全体的な印象は、ORD反応は一般的に破壊的（destructive）であると認識されていたということである。
従って、所望の目的、即ちエピトープの保存という目的のために、ORD反応は例えばアルカリ加水分解又は超音波処理を使用する方法より良好であり得るということを示唆するものは存在しなかった。
従って、本発明以前においては、個体（individual）の免疫防御性（immune defence）を強化することを可能にする活性化剤としてオリゴ糖を製剤中で使用することを可能にするために、特徴的な反復単位構造が保存されているオリゴ糖をそれぞれの多糖の酸化−還元断片により得ることが可能であることは明らかにされていなかったことである。
今般、原料多糖の抗原決定基の少なくとも1個が保存されているオリゴ糖を得るのにORD法を使用し得ることが発見された。
更に、酸化−還元解重合法は、抗原多糖に適用した場合には、ORD反応は多糖を不規則な方法で開裂せる遊離基生成反応であるという事実にも拘らず、寸法の均一性の観点から完全に満足し得る断片を好ましい条件下で製造することを可能にすることが認められた。
従って、本発明によれば、病原体の表面抗原から誘導される多糖であって、その反復単位が少なくとも１個の不安定な化学的官能基、即ち、多糖を超音波を使用する断片化又は酸性又は塩基性加水分解による解重合にかけたとき、抗原性を減少させる変性を受ける官能基を含有している多糖を、上記不安定な官能基を含有する反復単位の構造を保持しながら解重合することによりオリゴ糖を製造する方法において、(i)上記の多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、ついで、(ii)かく得られたオリゴ糖を回収することを特徴とするオリゴ糖の製造方法が提供される。
“オリゴ糖”は分子の組合せを意味すると理解される；各分子は原料多糖と比較して、減少した数のグリコシド単位を有しており、例えば、４〜500個のグリコシド単位を含有している。
オリゴ糖の平均分子量は多糖について前記した規則に従って定義される。一般的には、本発明のオリゴ糖は0.3〜0.9、特に、0.4〜0.8、例えば、0.6〜0.7の、セファロース4BCLカラム上での平均溶離定数を有し得る。換言すれば、かかるオリゴ糖は200,000〜2,000DE_q、特に150,000〜10,000DE_q、特に60,000〜30,000DE_qの平均分子量を有する。
本発明の好ましい要旨によれば、抗原多糖は、カビ（Fungus）並びに、特に、スタフィロコカス（Staphylococcus）属、ストレプトコカス（Streptococcus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、サルモネラ（Salmonella）属、エシエリシア（Escherichia）属、ネイセリア（Neisseria）属、シゲラ（Shigella）属及びハエモフィルス（Haemophilus）属のグラム陰性又はグラム陽性バクテリアであり得る病原体から得られる表面抗原である。
バクテリア性病原体（bacterial pathogenic agent）は、例えば、ストレプトコカスプニュウモニアエ、ネイセリアメニンギチジス、サルモネラチフィ又はハエモフィルスインフルエンザエである。
カビ性病原体（fungal pathogenic agent）は酵母、又は、特に、カンジダ（Candida）属、クリプトコカス（Cryptococcus）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、リポミセス（Lipomyces）属、リンコクラジエラ（Rhincocladiella）属及びロードトルラ（Rhodotorula）属から選ばれ得る。
本発明の目的のためには、酸化−還元反応は、特に、チオール、例えば、グルタチオン、システイン；酸素；ヒドロキノン；多価金属のイオン、例えば、鉄及び銅のイオン；アスコルビン酸、過酸化水素；から選ばれ得る酸化−還元系の少なくとも1種の存在下で行われる；最後の二つが好ましい．
反応の活動性（kinetics）に影響する種々の実験パラメーター（生成物濃度、pH、温度、反応時間）は、原料多糖の特性、選択された酸化−還元系及び取得することを希望する断片の平均寸法に従って当業者により容易に決定し得る。これらの断片が特にワクチンを目的とする場合には、適当な平均寸法を有する断片、即ち、良好な抗原性を保存しているかつ、適当な場合には、複合体の使用に適合する寸法を有する断片、例えば、前記で定義した大きさの程度を有する断片が得られるように種々のパラメーターを調節するために当業者により特に注意が払われるであろう。一般的には、最適な反応条件は日常試験により決定し得る。しかしながら、指針として、良好な結果を得ることを可能にする実験値は後記の実施例において特定されている。
本発明の方法に使用されるべき多糖は既知の方法、特に、アルコール又はセチルトリメチルアンモニウムブロマイドを用いる沈殿又はゲル濾過により抽出し、精製し得る。これらの方法についの文献としては、特に、R.I.Whistler,Method in Carbohydrate Chemistry,(1965)I:3-62を参照し得る。
多糖は5mg/mlの濃度の水溶液の形で調製することが有利である。有利な濃度は0.5〜50mg/ml、特に、0.5〜10mg/mlの範囲で変動させ得る。かかる水溶液を出発原料として使用し得る。
上記で定義した酸化−還元系は全部を一回で、又は、連続的な又は非連続的な方法で、かつ、酸化−還元系：多糖の最終重量比が0.01〜10、特に、0.1〜5、例えば、0.1〜1になる量で、多糖溶液（polysaccharide preparation）に添加される。
本発明の方法は3〜8.5、特に、3〜6.5のpHで使用し得る。同様に、反応媒体の温度は臨界的ではない；この温度は4〜60℃、特に、18〜40℃の間で変動し得る。
多糖の所望の断片化を達成するのに必要な時間は、特別な場合を除いて、一般的には、30分〜1時間である；例えば、S.チフィの多糖Viについては、反応時間は実質的により長い。反応時間は取得することを希望する断片の寸法に従って調節し得る。
特別な態様においては、0.5〜50mg/ml、特に、0.5〜10mg/mlの濃度を有する多糖の水溶液に、最終濃度が0.01〜25mg/ml、特に、0.1〜10mg/mlになるまでの量のアスコルビン酸を添加する。酸素は反応媒体中に本来溶解している量で十分である；もし不十分な場合には、反応媒体に酸素を更に吹込むことができる。反応を促進させるために、本発明の方法を種々の酸化状態の金属、例えば、鉄又は銅の可溶性塩の存在下で行い得る。金属塩は1μM〜100mM、特に、1〜10mMの濃度で添加し得る。
上記した態様の更に別の態様によれば、アスコルビン酸を過酸化水素で置換することができ、この過酸化水素は、場合により金属塩の存在下、0.1〜100mM、特に、0.5〜10mMまでの濃度で添加し得る。
多糖をORD解重合反応にかけることにより調製されたオリゴ糖は、このオリゴ糖を断片化により誘導するのに使用された多糖の平均溶離定数より低い平均溶離定数を有する分子の組合せからなる（この平均溶離定数の比較は明らかに同一のクロマトグラフィーカラムを使用して行われたものである）。オリゴ糖は慣用の方法、例えば、適当な沈殿剤、例えば、アセトン又はアルコールによる沈殿、適当な分離限界（separation threshold）を有する膜上での濾過、排除−拡散又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して単離し得る。ついで平均溶離定数に等しいか又はこれに近い溶離定数を有する分子を含有するある種のオリゴ糖フラクションだけを使用するために選択を行い得る。
本発明のオリゴ糖は、特に哺乳動物におけるオリゴ糖の免疫原性を増大させることのできる複合体（conjugate）を形成させるために、場合により、ペプチド又は蛋白質系の化合物又は他の有機重合体、例えば、ポリアクリレートと共有結合によりカップルさせ得る。複合体のパートナーは、特に、バクテリア蛋白質、例えば、トキシン、対応するアナトキシン又はマルチマー状（multimeric）トキシンのサブユニット並びに膜蛋白質、マルチマー状膜蛋白質のサブユニット又は細胞質蛋白質であり得る。例えば、ペルツシス（Pertussis）トキシン、コレラ（cholera）トキシン、テタナス（Tetanus）トキシン及びジフテリアトキシンが挙げられる。これらの蛋白質は元のバクテリアから抽出するか又は組換え法（recombinant route）により得ることができる。
ワクチンとして使用し得る複合体を得るためのオリゴ糖と複合体パートナーとの共有結合によるカップリング反応は慣用の方法を使用して行い得る。例えば、複合体パートナーの官能基と反応し得る官能基をオリゴ糖上に形成させ得る。二官能性カップリング剤をオリゴ糖と反応させ、ついで複合体パートナーと反応させるか、又はこの逆のことを行い得る。これらの種々のカップリング方法を検討するためには、特に、J.M.Cruse，R.E.Lewis,Jr.編、Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger(1989)10：48に掲載のConjugates Vaccinesと題するW.E.Dick及びM.Beurretの報文が参照される。更に、酸化−還元断片化法においては、特に、Ｓ.プニュウモニアエ6B型及び19F型、H.インフルエンザエ及びN.メニンギチジスA群の多糖から誘導されたオリゴ糖中に還元性基が導入される。従って、このことは、還元的アミノ化複合技術を使用することを可能にする。
本発明のオリゴ糖の免疫原性は担体リポソームを使用し、これにオリゴ糖を共有結合させることによっても増大させ得る。免疫原性は例えばシクロデキストリン、リポソーム及びISCOMSのごとき、イオン力又は疎水性力（hydrophobic force）による組込み（incorporation）によりオリゴ糖を保持するベクターによっても増大させ得る。
従って、本発明は種々の形、特に、複合体の形、担体リポソームとカップルさせた形又はベクター中に組込まれた形で提供されるオリゴ糖に関する。本発明の好ましい要旨によれば、オリゴ糖は複合体の形である。
本発明のオリゴ糖は、例えば、病原体によって誘発される感染、例えば、バクテリア感染又は真菌症（mycosis）の影響を排除又は減少させるために、哺乳動物、特に、ヒトの個体（individual）の免疫防御性（immune defence）を強化させるのに特に有用である。種々の抗原多糖から誘導される本発明のオリゴ糖の混合物並びに本発明のオリゴ糖と、本発明のオリゴ糖以外の活性成分との混合物も有用である。かかる混合物は多価ワクチン（polyvalent vaccine）を調製するのに適当である。
従って、本発明によれば、更に
−本発明のオリゴ糖の少なくとも１種を活性成分として含有する医薬組成物。この医薬組成物は特にワクチンである；
−本発明のオリゴ糖の治療における使用；
−個体の免疫防御性を強化させる方法、例えば、予防接種方法（vaccination）であって、本発明のオリゴ糖の少なくとも１種をかかる処置、例えば予防接種を必要とする対象者（subject）に治療の観点から十分な量投与することからなる、個体の免疫防御性の強化方法；
−個体の免疫防御性を強化させるための医薬組成物中における活性成分としての本発明のオリゴ糖の使用；
−(i)原料多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、(ii)所望ならば、得られたオリゴ糖を複合体パートナー又はリポソームとカップルさせるか、又は、上記のオリゴ糖をリポソーム、ISCOMS又はシクロデキストリン中に組込み、ついで、(iii)得られた生成物を適当な医薬の形にする、前記医薬組成物の製造方法；
が提供される。
好ましい医薬組成物は少なくとも１種のオリゴ糖を複合体の形で含有している。
本発明の医薬組成物は慣用の方法で調製し得る。特に、本発明のオリゴ糖を薬学的に許容される稀釈剤又は担体、例えば、発熱物質を含有していない（pyrogen-free）生理的食塩溶液と組合せる。更に、本発明の医薬組成物は緩衝液、保存剤又は安定化剤、補助薬及び適当な場合には凍結乾燥賦形剤のごとき慣用の成分を含有し得る。本発明のオリゴ糖は稀釈剤、担体又は前記したごとき成分の存在下で保存される、別法として、稀釈剤、担体又は成分は使用直前に添加し得る。
従って、本発明によれば、更に、
a)活性成分としての本発明のオリゴ糖の少なくとも１種から本質的になる医薬組成物；
b)薬学的に許容される稀釈剤又は担体、緩衝力（buffering power）を有する化合物、保存剤又は安定化剤及び補助薬から選ばれた少なくとも１種の成分からなる組成物；
c)上記a)及びb)の組成物の、例えば混合物の形での同時的投与（concomitant administration）のための取扱説明書（instructions）；
を含有するキット（kit）が提供される。
本発明の医薬組成物は任意の慣用の経路、特に、例えば注射可能な懸濁液の形で、皮下、筋肉内又は静脈内と投与するか又は経口投与し得る。投与は単一投与により、又は、ある時間間隔の後に一回又は数回反復して行い得る。適当な投与量は種々のパラメーター、例えば処置を受ける個体又は投与方法によって変動する。しかしながら、良好な結果は1〜200μｇのオリゴ糖を約0.5mlの容量で単位投与することにより得られ得る。
本発明を以下の実施例によりかつ図１〜４を参照して詳細に示す。
図１はS.プニュウモニアエ14型(a)、1型(b)、S.チフィ(c)、S.プニュウモニアエ6B型(d)、H.インフルエンザエB型(e)、S.プニュウモニアエ19F型(f)、N.メニンギチジスA群(g)、S.プニュウモニアエ18C型(h)、23F型(i)、クレブシエラオザエナエ（Klebsiella ozaenae）血清型（selotype）K4(j)、シゲラフレクスネリ（Shigella flexheri）血清型1b(k)及びクリプトコカスネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）菌株98(l)の莢膜状（capsular）多糖の反復単位の式を表わす。(a)は中性多糖に相当すること、(b)及び(c)は多糖鎖中にウロン酸を含有する多糖に相当すること、(d)〜(i)はリン酸化（phosphorylated）多糖に相当すること、(j)及び(k)は、それぞれ、アニオン性又は中性のリポ多糖に相当すること及び(l)はアニオン性カビ多糖に相当することが観察され得る。
図2a及び2bはセファロース4BCLカラム上でのｓ．チフィ(2a)及びS.プニュウモニアエ1型(2d)の溶離図を表わす。クロマトグラフィーの条件は下記の通りである：5mg/mlの多糖溶液2mlを、予め0.2M NaClを用いて平衡化したセファロースカラム上に負荷する。溶離は0.2M NaClを用いて42ml/hの速度で行われる。光学濃度を206nmで測定することにより溶離図を自動的に分析する。図2a及び2bにおいてカラムの死容量は76.56mlであり、全容量は201.84mlである。
図3はデキストランについての500,000〜20,000の検量線である。
図4aおよび4bはｓ．チフィ(4a)及びS.プニュウモニアエ1型(4b)の酸化−還元断片化により得られたオリゴ糖の、セファロース4BCLカラム上での溶離図である。クロマトグラフィーの条件は図2について述べたものと同一である。
実施例１：
アスコルビン酸の存在下でのＳ．チフィの多糖Viの断片化。
Prog.Immunobiol.Standard.(1972)5：485に記載のGotschlich等の方法に従って得られた多糖Viの乾燥粉末を、発熱物質を含まない水（pyrogen-free water）に1mg/mlの量で溶解させた。この多糖の平均分子量（MW）はセファロース4BCLカラム上での零のK_Dに相当する。
37℃に予熱したこの溶液500mlに、100mMのアスコルビン酸、10mMのCuSO₄および10mMのFeSO₄を含有する水溶液12.5mlを2時間にに亘って、連続的にゆっくり添加した；最終アスコルビン酸濃度は0.44mg/mlに相当する。かく得られた反応溶液のpHは約pH4であった。穏やかに攪拌しながら37℃で約3時間（反応剤の添加時間を含む）反応を行った。
ついで反応混合物を3K限外濾過膜（カットオッフ：3キロダルトン）上で濾過した。残留物（retentate）を0.5M NaCl溶液で一回洗浄しついで水で2回洗浄した。残留物を約100mlの水に溶解しついで凍結乾燥して保存した。
開裂（cleavage）の水準は、セファロース4BCLゲル上での濾過によって得られた曲線（図4a）の積算（integration）により計算して、95％程度である。更に、かく得られるオリゴ糖の平均MWをGranath等の方法（前記参照）により決定した。平均溶離定数として表される平均MWは0.6程度であり、これは60,000DE_qのMWと等量である（デキストランを参照として使用）。
NMR（核磁気共鳴）スペクトル分析によるオリゴ糖の分析は、多糖の反復単位に特有の構造は断片化後においても保持されていることを明らかに示した。特に、分岐した官能基、又は、糖（sugar）は多糖骨格から失われていなかった。
多糖Viの反復単位に特有の化学的官能基は比色分析法（colorimetric assay）により分析した。分岐した位置の０−アセチル基はBiol.Chem.(1949)188：249に記載のHestrinの方法により検定し、線状構造体のポリ酸（polyacid）はClin.J.Microbiol.(1988)28：719に記載のStone等の方法により検定した。検定は非断片化多糖Viと形成されたオリゴ糖とについて平行的に行った。
多糖とオリゴ糖とについて測定した［０−アセチル］/［ポリ酸］比は同一であった。このことは多糖の断片化法が移動し易い０−アセチル基の全てを保存することを可能にしていることを示している。
実施例２：
過酸化水素（H₂O₂）の存在下でのＳ．チフィの多糖Viの断片化。
Gotschlich等の方法（前記参照）に従って得られた多糖Viの乾燥粉末を、0.2Mリン酸塩緩衝液pH7.5に0.4mg/mlの量で溶解させた。この多糖のMWはセファロース4BCLカラム上で測定して、零のK_Dに相当する。
37℃に予熱したこの溶液100mlに、0.3mg/mlのH₂O₂を含有する水溶液11ml及び2.6mg/mlのCuSO₄溶液1.1mlを穏やかに攪拌しながらゆっくり添加した。穏やかに攪拌しながら37℃で約1時間反応を行った。
反応時間を1時間の代わりに2時間としたこと以外、同一の条件下で実験を繰返した。
両者の場合に、かく得られたオリゴ糖を回収し、実施例１と同様に精製した。
同様に、かく得られたオリゴ糖の特性を実施例１に記載の方法で測定した。その結果は下記の通りである：
−両者の場合において、多糖Viの開裂の水準は100％である。
−1時間および2時間後に形成されたオリゴ糖の平均MWは、それぞれ、0.7及び0.8のK_Dに相当する；これは、30,000及び10,000DE_qと等量である。
−両者の場合において、反復単位の構造に変化は認められなかった。
実施例３：
N.メニンギチジスA群の多糖の断片化。
Gotschlich等の方法（前記参照）に従って得られたN.メニンギチジスA群の多糖の乾燥粉末を、0.2Mリン酸塩緩衝液pH7.5に1mg/mlの量又は5mg/mlの量で溶解させた。この多糖の平均MWはセファロース4BCLカラム上で測定して、0.15のK_Dに相当する。
1mg/ml及び5mg/mlの溶液を37℃に予熱した。
3a)1mg/mlの溶液100mlに、100mMのアスコルビン酸、10mMのCuSO₄及び10mMのFeSO₄を含有する反応溶液0.75mlを添加した。攪拌しながら37℃で1時間30分反応を行った。ついで、上記反応溶液0.75mlを再び添加した；かくして、0.26mg/mlの最終アスコルビン酸濃度が得られた。反応を同一の条件下で更に1時間30分行った。
3d)5mg/mlの溶液100mlに、100mMのアスコルビン酸、10mMのCuSO₄及び10mMのFeSO₄を含有する反応溶液1.5mlを添加した；最終アスコルビン酸濃度は0.26mg/mlに等しかった。攪拌しながら37℃で1時間30分反応を行った。
3a)及び3b)で得られたオリゴ糖を実施例１に記載したごとき方法で回収し、精製した。同様に、実施例１に記載したごとき方法で分析を行った。両方の場合に、開裂の水準は100％であり、NMRにより分析した場合に、反復単位の構造の劣化は認められなかった。3a)で得られたオリゴ糖の平均MWは0.7のK_D（30,000DE_qと等量）に相当し、3d)で得られたオリゴ糖の平均MWは0.4のK_D（110,000DE_qと等量）に相当した。
これらの結果は、全体として、実験条件（多糖及び反応性酸化−還元剤濃度並びに反応剤の添加方法及び反応時間）を変化させることにより、実質的に異なる平均MWを有するオリゴ糖が得られるが、100％の開裂水準は保持されることを示している。
最後に、この実施例と実施例２は、この断片化は中性に近いpHで行われているので、断片化は酸化−還元によるものであって、酸又はアルカリ加水分解によるものではないことを実際に示している。
実施例４：
S.プニュウモニアエ1型及び19F型の多糖及びH.インフルエンザエB型の多糖の緩衝媒体中での断片化。
1982年6月18日発行のフランス特許出願FR 2,495,939号に記載の方法で得られたS.プニュウモニアエ1型及び19F型の多糖及びGotschlich等の方法（前記参照）に従って得られたH.インフルエンザエB型の多糖を使用して、実施例３（3a及び3b）を繰返した；
その結果は下記の通りである：

NMR（核磁気共鳴）スペクトル分析によるオリゴ糖の分析は、多糖の反復単位に特有の構造は断片化後においても保存されていることを明らかに示していた。
実施例５：
N.メニンギチジスA群の多糖及びS.プニュウモニアエ1型、14型、18C型、19F型及び23F型の多糖の非緩衝媒体中での断片化。
(i)5mg/mlの濃度の多糖溶液を発熱物質を含まない水中で調製したこと、(ii)反応溶液の全てを2.5mg/mlの最終濃度になるまで一回で添加したこと及び(iii)反応を1時間だけ行ったこと以外、実施例３及び４に記載の方法で多糖溶液の調製と反応を行った。
得られたオリゴ糖を実施例１に記載の方法で回収し、精製した。その特性を実施例１に記載の方法で調べた。多糖の各々についての開裂水準は100％であり、反復単位の構造の劣化は認められなかった。この最後の点は比色分析によっても示された：ヘキソースの分析はAnal.Chem.(1953)25：1650に記載のScott等の方法により、ヘキソースアミンの分析はAnal.Biochem.(1965)15:167に記載のGatt等の方法により、ラムノースの分析はJ.Biol.Chem.(1948)175：595に記載のDische等の方法により、そして、ホスフェートの分析はAnal.Chem.(1956)28:1756に記載のChen等の方法により行った。S.プニュウモニアエ14型の多糖と、断片化によりこれから誘導されるオリゴ糖の場合には、［ヘキソース］/［ヘキソースアミン］比は実質的に同一であった。このことは、S.プニュウモニアエ18C型及び23F型の場合における、それぞれ、［ラムノース］/［ヘキソース］比及び［ホスフェート］/［ヘキソース］比についてもあてはまった。
オリゴ糖のNMRスペクトル分析によっては反復単位の不均一性を示す信号は検出されず、オリゴ糖は変化していない（intact）反復単位からなることを示していた。
最後に、オリゴ糖の平均MWに関しては、その結果は下記の通りである：

実施例６：
S.チフィのオリゴ糖Vi/コレラトキシンのBサブユニット複合体の調製。
6a)オリゴ糖Vi中へのNH₂基の導入
実施例１で得られたオリゴ糖Viの凍結乾燥生成物をリン酸塩緩衝液pH8に10mg/mlの量で溶解した。この溶液にジアミノヘキサンとNaCNBH₂とを、各々、最終濃度が12.5mg/mlになるまでを溶解して添加した。室温で6日間反応を行った。ついで、反応溶液を水に対して透析し、凍結乾燥させた。Anal.Biochem.(1975)64:284に記載のShnyder等の方法に従って分析を行って、NH₂基が実際に導入されたことを確認した。同様に、Hestrinの分析方法により０−アセチル基が依然として保存されていることが示された。
6b)反応性官能基の導入
6a)で得られた凍結乾燥生成物を40mg/mlの量で溶解させた。この溶液20mlに、ジメチルスルホキシド（DMSO）中のジスクシンイミジルスベレート（disuccinimydyl suberate）（DSS）の40mg/mlの溶液80mlを添加した。室温で1時間反応を行った。ついで、生成物をDMSO/ジオキサン混合物中で沈殿させた。
6c)複合
6b)で得られた沈殿を0.5M NaCl溶液中に40mg/mlの量で溶解させた。これと平行的に、0.2Mリン酸塩緩衝液pH6.5中の、コレラトキシンのBサブユニットの10mg/mlの溶液を調製した（Tayot等，Eur.J.Biochem.(1981)113:249参照）。
かく調製した二つの溶液を混合した。オリゴ糖/蛋白質重量比は約1であった。室温で15時間反応を行った。
6d)精製
ついで、混合物を分離限界（separation threshold）が5・10⁴ダルトンの膜を取付けた限外濾過ミニカートリッジ（Millipore）上で濾過して、カップルしていない蛋白質とオリゴ糖を除去した。残留物を0.3M NaClで洗浄しついで、滅菌濾過を行った後、NaCl 1/1000、メルチオレート（merthiolate）1/10,000中に200μg/mlの量で、４℃で保存した。
実施例７：
オリゴ糖/テタナスアナトキシン複合体の調製
実施例５においてS.プニュウモニアエ14C型及び23F型の多糖から得たオリゴ糖及び実施例１においてS.チフィの多糖Viから得たオリゴ糖を複合させた；操作は実施例６に述べた方法と同様に行い、コレラトキシンのBサブユニットの代わりに、J.Bact.(1954)67:671に記載のMueller及びMillerの方法に従って調製したテタナスアナトキシンを使用した。
S.プニュウモニアエから得られた複合体を250μg/mlの量で保存した。
実施例８：
複合体の免疫原性の例証
OF1マウス（IFFA Credo）を8個のバッチに分割した。バッチからの各マウスに実施例６及び７で調製した溶液の一つを0.5mlを投与するか、又は、これと平行して、対応する天然多糖0.5mlを投与した。注射は皮下に行った。これらの注射を14後に繰返した。これと平行して、対照には生理的食塩水だけを投与した。
最初の注射から14日及び28日後に、第１の血液試料を採取し、抗多糖抗体（anti-polysaccharide antibody）IgGをELISA法によって滴定した（滴定プレートには非断片化多糖を被覆した）。14日及び28日後の抗体水準は複合体が免疫原性（immunogenic）であることを示した。上記複合体の各々において、抗体水準は対応する天然多糖によって誘発されるものより高かった。更に、T-依存性抗原の特徴である反発効果（rebound effect）も認められた。
実施例９：
活性成分として複合体を含有するワクチン製剤組成物。
実施例７で得られたS.チフィのオリゴ糖Vi/テタナスアナトキシン複合体を、ヒトの皮下に注射するための、0.5mlのワクチン投与剤に製剤した。単位投与剤当りの組成は下記の通りである：

The present invention relates to an oligosaccharide derived from an antigenic polysaccharide obtained from a pathogenic agent, a process for its production and in particular its use as a vaccine agent.
Fungi such as bacteria and yeast contain polysaccharides in their surface structure. That is, most bacteria are more or less tightly bound to bacteria, but strictly speaking, they are coated with a polysaccharide exudate that is not an envelope. This exudate is called capsule or glycocalyx. Furthermore, the outer membrane of gram-negative bacteria consists in particular of lipopolysaccharide (LPS). Finally, polysaccharides are also present in mold cell walls. These polysaccharides are actually surface antigens that elicit an immune response in infected mammals.
Such polysaccharides are formed on the basis of repeating units that are well defined in their constituents and linkages and are each characteristic of the mold or bacterial species considered. These repeating units contain epitopes, ie antigenicity determining structures. Illustratively, various types of repeating units derived from capsular polysaccharides or lipopolysaccharides are shown in FIG. Repeat units often contain, for example, phosphate functional groups present in the backbone of the molecule or in branched positions and very labile functional groups such as 0-acetyl and pyruvate groups. doing.
A polysaccharide actually consists of a combination of polymer molecules containing an amount of glycoside units that can vary from one molecule to another. Thus, polysaccharides can be described by molecular weight based only on average molecular weight. In the case of a homopolysaccharide, the glycoside unit is a monosaccharide. In the case of heteropolysaccharides, glycoside units form a chain of constituents linked in a certain manner.
With respect to the average molecular weight of the polysaccharide, this can be determined by gel filtration. In this case, the molecular weight is determined by Granath et al., J. Chrom. (1967)28: Elution constant (K_D) Or dextran equivalent (DE_qThis method can be summarized as follows:
The polysaccharide solution is analyzed on an exclusion-diffusion gel chromatography column that separates the components according to their molecular weight. Such gels are, for example, Sephadex (Pharmacia), Bio-Gel (Bio-Rad), Fractogel (Toyo Soda), Sepharose (Pharmacia) and Sephacryl. Commercially available under the trade name (Pharmacia). Obviously, the region of gel fractionation should be adapted to the range of molecular weights represented within the molecular population to be analyzed. For example, the gel filtration columns Sepharose 2BCL, 4BCL and 6BCL have fractional areas of 20,000,000 to 100,000; 5,000,000 to 20,000 and 1,000,000 to 10,000, respectively, measured in dextran equivalents. In general, a salt solution, for example a 0.2M sodium chloride solution, is used as the eluent. The elution constant is:
Ve−Vo
Vt−Vo
Based on [where Ve is the elution volume of the preparation being considered, Vt is the total volume of the column, and Vo is the dead volume of the column] Calculated.
For example, Figures 2a and 2b show the elution profiles of Salmonella typhi and Streptococcus pneumoniae type 1 polysaccharides on Sepharose 4BCL columns, respectively. Therefore, the polysaccharide of S. typhi consists of a polymer whose maximum molecular weight cannot be determined on Sepharose 4BCL. Similarly, polysaccharides of S. pneumoniae type 1 have a molecular weight of 0 to 0.45 K_DIt consists essentially of a polymer that varies in the range of By definition, the average elution constant of a polysaccharide is determined at the intersection of the tangents of the slope of the elution diagram; or, generally, at the apex of the elution diagram. Thus, the average elution constants of the polysaccharides shown in FIGS. 2a and 2b are 0 and 0.04, respectively.
The elution constant is determined based on a calibration series created using dextran._qCan be converted into a molecular weight represented by: For example, FIG. 3 shows an example of a calibration curve.
Polysaccharides, which are surface antigens of pathogens such as bacteria or molds, are good candidates as vaccine agents because of their antigenicity. Indeed, vaccines consisting of polysaccharide extracts have proven effective in adults. However, this does not apply for children. To eliminate this important problem, the polysaccharide is covalently bound to the protein, thereby conferring a T-dependent character to the resulting molecule and increasing its immunogenicity. It has been proposed and succeeded.
Conventional polysaccharide-based vaccines include vaccines against infections caused by Neisseria meningitidis A, C, Y or W135, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae type B and Salmonella typhi .
Pathogen antigenic polysaccharides are potentially advantageous as immunogens, but are difficult to use because of their large molecular weight, which can be as high as millions of dextran equivalents. In particular, if one wishes to use this in the form of a conjugate, ie, coupled with a protein, a technical problem is encountered that is difficult to solve. During the coupling process, gels or aggregates are formed, which makes it difficult to sterilize the complex by filtration.
In order to eliminate this problem, it has already been proposed to reduce the size of the polysaccharide and facilitate its handling. Various cleavage methods have been proposed for this purpose. Thus, for example, these methods are fragmentation by ultrasonic fragmentation or fragmentation by alkaline hydrolysis in acidic, basic or enzymatic media. However, these fragmentations are completely unsatisfactory. In fact, in these methods, characteristic epitopes are totally or partially destroyed by the loss of chemical functional groups necessary for antigen specificity.
For example, acetyl groups necessary for antigen specificity of polysaccharides are removed by acidic or alkaline hydrolysis of capsular polysaccharides of S. typhi or N. meningitidis group A. Furthermore, accurate reacetylation of fragments obtained by alkaline hydrolysis is extremely difficult if not impossible.
Furthermore, with fragmentation methods by alkaline hydrolysis, it is not always possible to obtain fragments of relatively uniform size, while in the manufacture of pharmaceuticals, a uniform and standardized uniform product is required.
In fragmentation by ultrasonic waves, for example, H. et al. It has been shown that the terminal phosphate group of influenzae type B polysaccharide is lost by sonication. This may cause the phosphate group at the branched position of the polysaccharide chain to be removed during such treatment.
In addition, it is possible to obtain relatively uniform sized fragments by using ultrasonic waves, but it requires a very long processing time to produce sufficiently small sized fragments by the ultrasonic method. Can cause other disadvantages, i.e. rapid degradation of the device. Its efficiency is limited and the application of ultrasound on an industrial scale should be avoided.
Finally, the use of polysaccharide depolymerization is limited to polysaccharides for which appropriate enzymes are known. However, this significant disadvantage is inherent in the high degree of specificity of the enzyme for its substrate.
Thus, in the field of vaccines, significant technical and economic advances must be able to provide this depolymerization method that no longer results in the various disadvantages of conventional methods. In other words, it is necessary in particular to be able to provide a method for depolymerization of an antigen polysaccharide having a combination of advantageous properties, for the following reasons:
-This method yields oligopolysaccharides having a reduced number of glycoside units and preserving the essential structural determinant of at least one epitope of the polysaccharide to be fragmented Make it possible.
-This method can be used for any antigenic polysaccharide structure intended.
-This method makes it possible to obtain fragments of sufficiently uniform dimensions.
-This method is inexpensive and very easy to use.
Surprisingly, it has now been found that these objectives are achieved by an oxidation-reduction depolymerization reaction.
To date, in English, this method, often described by the abbreviation ORD, is used for fragmenting heparin, hyaluronic acid, dextran and DNA and for purposes that are quite different from those achieved by the present invention. Had been used for. The purpose is to reduce the viscosity of the product, for example, or to obtain smaller sized fragments known to have different anticoagulant activities in the case of linear molecules such as heparin. Was that. Of course, since the material to which this method was applied was not immunologically important, no study of the integrity of the repeating units of the resulting fragments was performed.
Furthermore, a number of known publications describing the ORD reaction as destructive or destroying the carbohydrate ring by cleavage of the carbon-carbon bond of the carbohydrate ring, such as K. Uchida, Carbohydrate. Research, (1988)173: 89-99; Uchiyama, Journal of Biological Chemistry, (1990)265: 7753-7759; S.W.Green, The Carbohydrates Chemistry and BiochemistryIBAcademic Press (1980); 1132; A. Herp, The Carbohydrates Chemistry and BiochemistryIBAcademic Press (1980): 1276; Kochetkov et al., Radiation Chemistry of Carbohydrates, Pergammon Press, Oxford, (1979).
The overall impression received from the conventional state of the field is that the ORD reaction was generally recognized as destructive.
Therefore, there was no suggestion that the ORD reaction could be better than methods using, for example, alkaline hydrolysis or sonication for the desired purpose, ie, the preservation of epitopes.
Thus, prior to the present invention, an oligosaccharide can be used in the formulation as an activator that makes it possible to enhance the immune defense of an individual. It has not been clarified that it is possible to obtain an oligosaccharide in which a repeating unit structure is conserved by an oxidation-reduction fragment of each polysaccharide.
It has now been discovered that the ORD method can be used to obtain oligosaccharides in which at least one of the antigenic determinants of the starting polysaccharide is conserved.
In addition, when the oxidation-reduction depolymerization method is applied to an antigenic polysaccharide, the ORD reaction is a free radical generation reaction that cleaves the polysaccharide in an irregular manner. It has been found that it is possible to produce completely satisfactory fragments from under favorable conditions.
Therefore, according to the present invention, a polysaccharide derived from a surface antigen of a pathogen, the repeating unit of which is at least oneunstableChemical functional groups,That is, when a polysaccharide is subjected to fragmentation using ultrasonic waves or depolymerization by acidic or basic hydrolysis, the polysaccharide containing a functional group that undergoes modification that reduces antigenicity is converted to the above unstable functional group. By depolymerizing while maintaining the structure of the repeating unitIn a method for producing an oligosaccharide, there is provided a method for producing an oligosaccharide characterized in that (i) the polysaccharide is subjected to an oxidation-reduction depolymerization reaction, and then (ii) the oligosaccharide thus obtained is recovered. The
“Oligosaccharide” is understood to mean a combination of molecules; each molecule has a reduced number of glycoside units compared to the starting polysaccharide, eg containing 4 to 500 glycoside units. Yes.
The average molecular weight of the oligosaccharide is defined according to the rules described above for polysaccharides. In general, the oligosaccharides of the present invention may have an average elution constant on a Sepharose 4BCL column of 0.3-0.9, in particular 0.4-0.8, such as 0.6-0.7. In other words, such oligosaccharides are 200,000-2,000 DE_q, Especially 150,000-10,000DE_q, Especially 60,000-30,000DE_qHaving an average molecular weight of
According to a preferred aspect of the present invention, the antigenic polysaccharide comprises fungi, and in particular, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia. Surface antigens obtained from pathogens that can be gram negative or gram positive bacteria of the genera Genus, Neisseria, Shigella and Haemophilus.
Bacterial pathogenic agents are, for example, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi or Haemophilus influenzae.
Fungal pathogenic agents are yeast or, in particular, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Lipomyces, Rincocladiella and Rhodotorula. Can be chosen from.
For the purposes of the present invention, the oxidation-reduction reaction is in particular a thiol, such as glutathione, cysteine; oxygen; hydroquinone; polyvalent metal ions, such as iron and copper ions; ascorbic acid, hydrogen peroxide; Carried out in the presence of at least one oxidation-reduction system which can be selected from: the last two are preferred.
The various experimental parameters (product concentration, pH, temperature, reaction time) that affect the kinetics of the reaction are the properties of the raw polysaccharide, the selected oxidation-reduction system and the average of the fragments desired to be obtained. It can be easily determined by one skilled in the art according to the dimensions. If these fragments are specifically intended for vaccines, they should be of a suitable average size, i.e. preserve the good antigenicity and, if appropriate, be of a size compatible with the use of the conjugate. Particular attention will be paid by those skilled in the art to adjust the various parameters so as to obtain fragments having, for example, fragments having the degree of size defined above. In general, optimal reaction conditions can be determined by routine testing. However, as a guide, experimental values that make it possible to obtain good results are specified in the examples below.
The polysaccharide to be used in the process of the invention can be extracted and purified by known methods, in particular by precipitation or gel filtration using alcohol or cetyltrimethylammonium bromide. Reference may be made in particular to R.I.Whistler, Method in Carbohydrate Chemistry, (1965) I: 3-62 for references to these methods.
The polysaccharide is advantageously prepared in the form of an aqueous solution with a concentration of 5 mg / ml. The advantageous concentration can vary from 0.5 to 50 mg / ml, in particular from 0.5 to 10 mg / ml. Such an aqueous solution can be used as a starting material.
The oxidation-reduction system defined above is all in one time or in a continuous or discontinuous manner, and the final weight ratio of oxidation-reduction system: polysaccharide is 0.01-10, in particular 0.1-5. For example, it is added to the polysaccharide preparation in an amount of 0.1-1.
The process according to the invention can be used at a pH of 3 to 8.5, in particular 3 to 6.5. Similarly, the temperature of the reaction medium is not critical; this temperature can vary between 4 and 60 ° C., in particular between 18 and 40 ° C.
The time required to achieve the desired fragmentation of the polysaccharide is typically 30 minutes to 1 hour, except in special cases; for example, for the polysaccharide Vi of S. typhi, the reaction time is Substantially longer. The reaction time can be adjusted according to the size of the piece desired to be obtained.
In a special embodiment, an aqueous solution of polysaccharide having a concentration of 0.5-50 mg / ml, in particular 0.5-10 mg / ml, is added in an amount up to a final concentration of 0.01-25 mg / ml, in particular 0.1-10 mg / ml. Add ascorbic acid. The amount of oxygen originally dissolved in the reaction medium is sufficient; if insufficient, oxygen can be further blown into the reaction medium. In order to accelerate the reaction, the process according to the invention can be carried out in the presence of soluble salts of metals of various oxidation states, for example iron or copper. The metal salt can be added at a concentration of 1 μM to 100 mM, in particular 1 to 10 mM.
According to yet another embodiment of the above embodiment, ascorbic acid can be replaced with hydrogen peroxide, which is optionally in the presence of a metal salt, 0.1-100 mM, in particular 0.5-10 mM. Can be added at a concentration.
An oligosaccharide prepared by subjecting a polysaccharide to an ORD depolymerization reaction consists of a combination of molecules having an average elution constant lower than the average elution constant of the polysaccharide used to derive the oligosaccharide by fragmentation (this The comparison of the average elution constant is clearly done using the same chromatography column). Oligosaccharides can be obtained using conventional methods such as precipitation with a suitable precipitating agent such as acetone or alcohol, filtration on a membrane with a suitable separation threshold, exclusion-diffusion or ion exchange chromatography. Can be isolated. A selection may then be made to use only certain oligosaccharide fractions containing molecules having an elution constant equal to or close to the average elution constant.
The oligosaccharides of the present invention are optionally peptide or protein based compounds or other organic polymers, in order to form a conjugate that can increase the immunogenicity of the oligosaccharide, particularly in mammals, For example, it can be covalently coupled to polyacrylate. The partner of the complex may in particular be a bacterial protein, for example a toxin, the corresponding anatoxin or multimeric toxin subunits as well as a membrane protein, a multimeric membrane protein subunit or a cytoplasmic protein. Examples include Pertussis toxin, cholera toxin, Tetanus toxin and diphtheria toxin. These proteins can be extracted from the original bacteria or obtained by a recombinant route.
Covalent coupling reactions between oligosaccharides and conjugate partners to obtain conjugates that can be used as vaccines can be performed using conventional methods. For example, functional groups that can react with the functional groups of the complex partner can be formed on the oligosaccharide. Bifunctional coupling agents can be reacted with oligosaccharides and then with complex partners, or vice versa. To examine these various coupling methods, in particular, J.M.Cruse, R.E.Lewis, Jr., Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger (1989).Ten: See W.E.Dick and M.Beurret reports titled Conjugates Vaccines on page 48. Further, in the oxidation-reduction fragmentation method, a reducing group is introduced into oligosaccharides derived from polysaccharides of S. pneumoniae types 6B and 19F, H. influenzae and N. meningitidis group A, in particular. This therefore makes it possible to use reductive amination complex technology.
The immunogenicity of the oligosaccharides of the present invention can also be increased by using carrier liposomes and covalently attaching the oligosaccharides thereto. Immunogenicity can also be increased by vectors that retain oligosaccharides by incorporation by ionic or hydrophobic forces, such as cyclodextrins, liposomes and ISCOMS.
The invention thus relates to oligosaccharides provided in various forms, in particular in the form of complexes, coupled with carrier liposomes or incorporated into a vector. According to a preferred aspect of the invention, the oligosaccharide is in the form of a complex.
The oligosaccharides of the present invention provide immune protection for mammals, particularly individual humans, in order to eliminate or reduce the effects of pathogen-induced infections such as bacterial infections or mycosis, for example. It is particularly useful for strengthening immune defence. Also useful are mixtures of the oligosaccharides of the invention derived from various antigenic polysaccharides and mixtures of the oligosaccharides of the invention with active ingredients other than the oligosaccharides of the invention. Such a mixture is suitable for preparing a polyvalent vaccine.
Therefore, according to the present invention, further
-A pharmaceutical composition comprising at least one of the oligosaccharides of the present invention as an active ingredient. This pharmaceutical composition is in particular a vaccine;
The use of the oligosaccharides of the invention in therapy;
A method for enhancing the immune defense of an individual, for example a vaccination method, wherein at least one of the oligosaccharides according to the invention is treated in such a subject, for example a subject in need of vaccination A method for enhancing the immune defense of an individual, comprising administering a sufficient amount from the viewpoint of
-Use of an oligosaccharide of the invention as an active ingredient in a pharmaceutical composition to enhance the immune defense of an individual;
-(I) subjecting the raw polysaccharide to an oxidation-reduction depolymerization reaction; (ii) if desired, couple the resulting oligosaccharides with complex partners or liposomes, or the above oligosaccharides into liposomes, ISCOMS or cyclohexanes. A process for preparing the pharmaceutical composition, which is incorporated into dextrin, and then (iii) the resulting product is in the form of a suitable medicament;
Is provided.
Preferred pharmaceutical compositions contain at least one oligosaccharide in the form of a conjugate.
The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared by conventional methods. In particular, the oligosaccharides of the present invention are combined with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, such as a pyrogen-free physiological saline solution. In addition, the pharmaceutical compositions of the invention may contain conventional ingredients such as buffers, preservatives or stabilizers, adjuvants and, where appropriate, lyophilized excipients. The oligosaccharides of the present invention are stored in the presence of diluents, carriers or ingredients as described above. Alternatively, the diluent, carrier or ingredients can be added just prior to use.
Therefore, according to the present invention,
a) a pharmaceutical composition consisting essentially of at least one of the oligosaccharides of the invention as an active ingredient;
b) a composition comprising at least one component selected from pharmaceutically acceptable diluents or carriers, compounds with buffering power, preservatives or stabilizers and adjuvants;
c) instructions for concomitant administration of the compositions of a) and b) above, eg in the form of a mixture;
A kit containing is provided.
The pharmaceutical compositions of the invention may be administered subcutaneously, intramuscularly or intravenously or orally, by any conventional route, in particular in the form of an injectable suspension. Administration can be by a single dose or repeated once or several times after a certain time interval. The appropriate dosage will vary depending on various parameters, such as the individual being treated or the method of administration. However, good results can be obtained by unit administration of 1-200 μg oligosaccharide in a volume of about 0.5 ml.
The invention is illustrated in detail by the following examples and with reference to FIGS.
Figure 1 shows S. pneumoniae type 14 (a), type 1 (b), S. typhi (c), S. pneumoniae type 6B (d), H. influenzae type B (e), S. pneumoniae type 19F ( f), N. meningitidis group A (g), S. pneumoniae type 18C (h), type 23F (i), Klebsiella ozaenae selotype K4 (j), Shigella flexheri serum 1 represents the formula for the repeating unit of the capsule capsule polysaccharide of type 1b (k) and Cryptococcus neoformans strain 98 (l). (a) corresponds to a neutral polysaccharide, (b) and (c) correspond to a polysaccharide containing uronic acid in the polysaccharide chain, and (d) to (i) correspond to phosphorylated polysaccharide. It can be observed that (j) and (k) correspond to anionic or neutral lipopolysaccharide and (l) correspond to an anionic mold polysaccharide, respectively.
2a and 2b show the s. On a Sepharose 4BCL column. Elution diagram of Tiffy (2a) and S. pneumoniae type 1 (2d). Chromatographic conditions are as follows: 2 ml of a 5 mg / ml polysaccharide solution is loaded onto a Sepharose column pre-equilibrated with 0.2 M NaCl. Elution is performed with 0.2 M NaCl at a rate of 42 ml / h. The elution diagram is automatically analyzed by measuring the optical density at 206 nm. In FIGS. 2a and 2b, the dead volume of the column is 76.56 ml and the total volume is 201.84 ml.
Figure 3 is a 500,000-20,000 calibration curve for dextran.
Figures 4a and 4b show s. It is an elution figure on the Sepharose 4BCL column of the oligosaccharide obtained by the oxidation-reduction fragmentation of Typhi (4a) and S. pneumoniae type 1 (4b). Chromatographic conditions are the same as described for FIG.
Example 1:
S. cerevisiae in the presence of ascorbic acid. Tiffy polysaccharide Vi fragmentation.
Prog.Immunobiol Standard. (1972)Five: The dry powder of polysaccharide Vi obtained according to the method of Gotschlich et al. The average molecular weight (MW) of this polysaccharide is zero K on a Sepharose 4BCL column._DIt corresponds to.
To 500 ml of this solution preheated to 37 ° C, add 100 mM ascorbic acid, 10 mM CuSO_FourAnd 10 mM FeSO_Four12.5 ml of an aqueous solution containing was slowly added continuously over 2 hours; the final ascorbic acid concentration corresponds to 0.44 mg / ml. The pH of the reaction solution thus obtained was about pH 4. The reaction was performed at 37 ° C. for about 3 hours (including the time for adding the reactants) with gentle stirring.
The reaction mixture was then filtered over a 3K ultrafiltration membrane (cutoff: 3 kilodaltons). The retentate was washed once with 0.5M NaCl solution and twice with water. The residue was dissolved in about 100 ml of water and then lyophilized and stored.
The level of cleavage is around 95%, calculated by integration of the curve obtained by filtration on Sepharose 4BCL gel (FIG. 4a). Furthermore, the average MW of the oligosaccharide thus obtained was determined by the method of Granath et al. (See above). The average MW expressed as the average elution constant is about 0.6, which is 60,000 DE_qIs equivalent to MW (using dextran as reference).
Analysis of oligosaccharides by NMR (nuclear magnetic resonance) spectral analysis clearly showed that the unique structure of the polysaccharide repeating unit was retained after fragmentation. In particular, branched functional groups or sugars were not lost from the polysaccharide skeleton.
Chemical functional groups unique to the repeating unit of polysaccharide Vi were analyzed by a colorimetric assay. The 0-acetyl group at the branched position is Biol. Chem. (1949)188： Tested by the method of Hestrin described in 249, the polyacid of the linear structure is Clin. J. Microbiol. (1988)28: Tested by the method of Stone et al. The assay was performed in parallel on the unfragmented polysaccharide Vi and the oligosaccharide formed.
The [0-acetyl] / [polyacid] ratios measured for polysaccharides and oligosaccharides were the same. This indicates that the polysaccharide fragmentation method makes it possible to preserve all of the easily movable 0-acetyl groups.
Example 2:
Hydrogen peroxide (H₂O₂S. in the presence of Tiffy polysaccharide Vi fragmentation.
Polysaccharide Vi dry powder obtained according to the method of Gotschlich et al. (See above) was dissolved in 0.2 M phosphate buffer pH 7.5 in an amount of 0.4 mg / ml. The MW of this polysaccharide was measured on a Sepharose 4BCL column and zero K_DIt corresponds to.
To 100 ml of this solution preheated to 37 ° C, 0.3 mg / ml H₂O₂Aqueous solution containing 11ml and 2.6mg / ml CuSO_Four1.1 ml of the solution was added slowly with gentle stirring. The reaction was carried out at 37 ° C. for about 1 hour with gentle stirring.
The experiment was repeated under the same conditions except that the reaction time was 2 hours instead of 1 hour.
In both cases, the oligosaccharide thus obtained was recovered and purified in the same manner as in Example 1.
Similarly, the properties of the oligosaccharide thus obtained were measured by the method described in Example 1. The results are as follows:
-In both cases, the level of cleavage of the polysaccharide Vi is 100%.
The average MW of the oligosaccharides formed after -1 hour and 2 hours is 0.7 and 0.8 K, respectively._DEquivalent to 30,000 and 10,000 DE_qIs the equivalent.
-In both cases, no change was observed in the structure of the repeating unit.
Example 3:
N. meningitidis group A polysaccharide fragmentation.
N. meningitidis group A polysaccharide dry powder obtained according to the method of Gotschlich et al. (See above) was dissolved in 0.2 M phosphate buffer pH 7.5 in an amount of 1 mg / ml or 5 mg / ml. . The average MW of this polysaccharide is 0.15 K measured on a Sepharose 4BCL column._DIt corresponds to.
The 1 mg / ml and 5 mg / ml solutions were preheated to 37 ° C.
3a) In 100 ml of 1 mg / ml solution, 100 mM ascorbic acid, 10 mM CuSO_FourAnd 10 mM FeSO_Four0.75 ml of a reaction solution containing was added. The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes with stirring. Then 0.75 ml of the reaction solution was added again; thus a final ascorbic acid concentration of 0.26 mg / ml was obtained. The reaction was carried out for an additional 1 hour 30 minutes under the same conditions.
3d) In 100 ml of 5 mg / ml solution, 100 mM ascorbic acid, 10 mM CuSO_FourAnd 10 mM FeSO_Four1.5 ml of a reaction solution containing was added; the final ascorbic acid concentration was equal to 0.26 mg / ml. The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes with stirring.
The oligosaccharides obtained in 3a) and 3b) were recovered and purified by the method as described in Example 1. Similarly, the analysis was performed as described in Example 1. In both cases, the level of cleavage was 100% and no structural deterioration of the repeating unit was observed when analyzed by NMR. The average MW of the oligosaccharide obtained in 3a) is K of 0.7_D(30,000DE_qThe average MW of the oligosaccharide obtained in 3d) is 0.4 K._D(110,000DE_qEquivalent).
Overall, these results show that oligosaccharides having substantially different average MWs can be obtained by varying the experimental conditions (polysaccharide and reactive oxidation-reducing agent concentration and method of addition of reactants and reaction time) 100% cleavage level is retained.
Finally, in this and Example 2, this fragmentation is performed at a near neutral pH, so that fragmentation is due to oxidation-reduction and not acid or alkaline hydrolysis. Actually shows.
Example 4:
Fragmentation of S. pneumoniae type 1 and 19F polysaccharides and H. influenzae type B polysaccharide in buffer medium.
Polysaccharides of S. pneumoniae type 1 and 19F obtained by the method described in French Patent Application FR 2,495,939 issued on June 18, 1982, and H. influenzae B obtained according to the method of Gotschlich et al. (See above) Example 3 (3a and 3b) was repeated using the type of polysaccharide;
The results are as follows:

Analysis of oligosaccharides by NMR (nuclear magnetic resonance) spectral analysis clearly showed that the unique structure of the polysaccharide repeating unit was preserved even after fragmentation.
Example 5:
Fragmentation of N. meningitidis group A polysaccharide and S. pneumoniae type 1, 14, 18C, 19F and 23F type polysaccharides in non-buffered media.
(i) that a polysaccharide solution with a concentration of 5 mg / ml was prepared in pyrogen-free water, (ii) that all of the reaction solution was added at once to a final concentration of 2.5 mg / ml and (iii ) A polysaccharide solution was prepared and reacted by the method described in Examples 3 and 4 except that the reaction was performed only for 1 hour.
The resulting oligosaccharide was recovered and purified by the method described in Example 1. The characteristics were examined by the method described in Example 1. The cleavage level for each of the polysaccharides was 100% and no degradation of the repeat unit structure was observed. This last point was also shown by colorimetric analysis: analysis of hexose was Anal.Chem. (1953)twenty five: Analysis of hexoseamine by the method of Scott et al. Described in 1650, Anal.Biochem. (1965)15The analysis of rhamnose by the method of Gatt et al. Described in 167: J. Biol. Chem. (1948)175: Analysis of phosphate by the method of Dische et al. Described in 595 and Anal. Chem. (1956)28: 1756 described by the method of Chen et al. In the case of S. pneumoniae type 14 polysaccharide and the oligosaccharide derived therefrom by fragmentation, the [hexose] / [hexoseamine] ratio was substantially the same. This was also true for the [rhamnose] / [hexose] and [phosphate] / [hexose] ratios for S. pneumoniae types 18C and 23F, respectively.
NMR spectrum analysis of oligosaccharides did not detect signals indicative of heterogeneity of repeat units, indicating that oligosaccharides consist of intact repeat units.
Finally, for the average MW of oligosaccharides, the results are as follows:

Example 6:
Preparation of B. subunit complex of S. typhi oligosaccharide Vi / cholera toxin.
6a) NH into oligosaccharide Vi₂Introduction of group
The lyophilized product of oligosaccharide Vi obtained in Example 1 was dissolved in phosphate buffer pH 8 in an amount of 10 mg / ml. To this solution diaminohexane and NaCNBH₂Were dissolved and added to a final concentration of 12.5 mg / ml. The reaction was performed at room temperature for 6 days. The reaction solution was then dialyzed against water and lyophilized. Anal.Biochem. (1975)64: Analyze according to the method of Shnyder et al.₂It was confirmed that the group was actually introduced. Similarly, the Hestrin analysis method showed that the 0-acetyl group was still conserved.
6b) Introduction of reactive functional groups
The lyophilized product obtained in 6a) was dissolved in an amount of 40 mg / ml. To 20 ml of this solution was added 80 ml of a 40 mg / ml solution of disuccinimydyl suberate (DSS) in dimethyl sulfoxide (DMSO). The reaction was performed at room temperature for 1 hour. The product was then precipitated in a DMSO / dioxane mixture.
6c) Composite
The precipitate obtained in 6b) was dissolved in a 0.5 M NaCl solution in an amount of 40 mg / ml. In parallel, a 10 mg / ml solution of the cholera toxin B subunit in 0.2 M phosphate buffer pH 6.5 was prepared (Tayot et al., Eur. J. Biochem. (1981).113: 249).
The two solutions thus prepared were mixed. The oligosaccharide / protein weight ratio was about 1. The reaction was carried out at room temperature for 15 hours.
6d) Purification
Then the separation threshold of the mixture is 5 · 10^FourUncoupled proteins and oligosaccharides were removed by filtration on an ultrafiltration mini-cartridge (Millipore) fitted with a Dalton membrane. The residue was washed with 0.3 M NaCl, sterilized, and then stored at 4 ° C. in NaCl 1/1000, merthiolate 1 / 10,000 in an amount of 200 μg / ml.
Example 7:
Preparation of oligosaccharide / tetanus anatoxin complex
In Example 5, the oligosaccharide obtained from the polysaccharides of S. pneumoniae type 14C and 23F and the oligosaccharide obtained from the polysaccharide Vi of S. typhi in Example 1 were combined; In the same manner, instead of the cholera toxin B subunit, J. Bact. (1954)67: Tetanus anatoxin prepared according to the method of Mueller and Miller described in 671.
The complex obtained from S. pneumoniae was stored in an amount of 250 μg / ml.
Example 8:
Illustration of the immunogenicity of the complex
OF1 mice (IFFA Credo) were divided into 8 batches. Each mouse from the batch received 0.5 ml of one of the solutions prepared in Examples 6 and 7, or in parallel, 0.5 ml of the corresponding natural polysaccharide. Injection was performed subcutaneously. These injections were repeated after 14 hours. In parallel, the control received only physiological saline.
At 14 and 28 days after the first injection, a first blood sample was taken and anti-polysaccharide antibody IgG was titrated by ELISA (the titration plate was coated with unfragmented polysaccharide). Antibody levels after 14 and 28 days indicated that the complex was immunogenic. In each of the complexes, the antibody level was higher than that induced by the corresponding natural polysaccharide. Furthermore, the rebound effect that is characteristic of T-dependent antigens was also observed.
Example 9:
A vaccine preparation composition containing the complex as an active ingredient.
The S. typhi oligosaccharide Vi / Tetanus anatoxin complex obtained in Example 7 was formulated into a 0.5 ml vaccine dose for subcutaneous injection in humans. The composition per unit dose is as follows:

Claims

A polysaccharide derived from a surface antigen of a pathogen, the repeating unit of which is at least one unstable chemical functional group, i.e., the polysaccharide is fragmented using ultrasound or depolymerized by acidic or basic hydrolysis A method for producing an oligosaccharide by depolymerizing a polysaccharide containing a functional group that undergoes denaturation that reduces antigenicity when subjected to dehydration while retaining the structure of the repeating unit containing the unstable functional group (I) A method for producing an oligosaccharide, wherein the polysaccharide is subjected to an oxidation-reduction depolymerization reaction, and (ii) the oligosaccharide thus obtained is recovered.

The method according to claim 1, wherein the oxidation-reduction depolymerization reaction is carried out in the presence of an oxidation-reduction agent that is ascorbic acid or hydrogen peroxide.

The method according to claim 2, wherein the oxidation-reduction depolymerization reaction is carried out in the presence of an iron or copper salt.

The method according to claim 2 or 3, wherein the oxidation-reduction depolymerization reaction is carried out at a pH of 3 to 8.5.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the oxidation-reduction depolymerization reaction is performed at a temperature of 4 to 60 ° C.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the unstable chemical functional group is selected from a phosphate group, an acetyl group and a pyruvate group.

The method according to claim 1, wherein the antigen polysaccharide is a capsule polysaccharide derived from a pathogen bacterium.

The method according to claim 7, wherein the pathogen bacterium is selected from the genus Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia, Neisseria and Haemophilus.

The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the obtained oligosaccharide contains 4 to 500 glycoside units.

Step oligosaccharides obtained in (ii) by the complex partners or carriers couples, further performs engineering as a (iii) where Ru is combined with either or carrier to obtain the oligosaccharide in the form of a complex, according to claim 1 10. The method according to any one of 9.

A depolymerized product obtained by the method according to claim 1.

12. A pharmaceutical composition for enhancing the immunoprotective properties of an individual, comprising as an active ingredient at least one of the depolymerized products according to claim 11 .

13. The pharmaceutical composition according to claim 12, for performing vaccination.