EA044044B1

EA044044B1 - IMMUNOGENIC COMPOSITIONS CONTAINING POLYPEPTIDE-ANTIGEN CONJUGATES WITH NON-NATURAL AMINO ACIDS

Info

Publication number: EA044044B1
Application number: EA201991559
Authority: EA
Inventors: Джеффри Фэирмен; Йон Хайнрихс; Вэй Чань
Original assignee: Ваксайт, Инк.
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2023-07-19

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США 62/441115 (поданной 30 декабря 2016 г.), предварительной заявке на патент США 62/530803 (поданной 10 июля 2017 г.), предварительной заявке на патент США 62/568201 (поданной 4 октября 2017 г.) и предварительной заявке на патент США 62/591160 (поданной 27 ноября 2017 г.), содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.This application claims priority to US Provisional Patent Application 62/441115 (filed December 30, 2016), US Provisional Patent Application 62/530803 (filed July 10, 2017), US Provisional Patent Application 62/568201 (filed 4 October 2017) and US Provisional Patent Application 62/591160 (filed November 27, 2017), each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Уровень техникиState of the art

Вакцины на основе выделенных антигенных макромолекул (например, вакцины первого поколения на основе полисахаридов менингококка, пневмококка и Haemophilus) значительно лучше, чем более ранние вакцинные составы, основанные на вакцинах из живых ослабленных или инактивированных организмов.Vaccines based on isolated antigenic macromolecules (eg, first-generation vaccines based on meningococcal, pneumococcal, and Haemophilus polysaccharides) are significantly better than earlier vaccine formulations based on vaccines from live attenuated or inactivated organisms.

Очищенные макромолекулы значительно проще в изготовлении, имеют улучшенный профиль безопасности и могут вызывать более продуктивный специфический иммунный ответ (например, они могут быть направлены против антигена, который является более консервативным или важным для патогенеза). Кроме того, они обеспечивают упрощенную матрицу для получения вакцины, когда иммунный ответ может быть направлен против конкретного сайта или конкретного организма только за счет обеспечения надлежащего иммуногена. Однако одним из недостатков данной стратегии является то, что не каждая макромолекула вызывает сильный иммунный ответ. Многие липиды, полисахариды и определенные белковые антигены (и большинство небольших молекул) вызывают иммунные ответы, которые по своей природе являются слабыми, кратковременными и/или имеют недостатки в определенных популяциях пациентов (примеры которых включают детей или пожилых людей). Полагают, что эти слабые иммунные ответы возникают из-за антигенных структур, которые в первую очередь активируют В-клетки или неспособны в других отношениях активировать пути, зависящие от Т-клеток, которые участвуют в иммунологической памяти и созревании антител.Purified macromolecules are significantly easier to manufacture, have an improved safety profile, and can induce a more productive specific immune response (for example, they can be directed against an antigen that is more conserved or important for pathogenesis). In addition, they provide a simplified matrix for vaccine production where the immune response can be directed against a specific site or a specific organism only by providing the appropriate immunogen. However, one of the disadvantages of this strategy is that not every macromolecule elicits a strong immune response. Many lipids, polysaccharides, and certain protein antigens (and most small molecules) induce immune responses that are inherently weak, short-lived, and/or deficient in certain patient populations (examples of which include children or the elderly). These weak immune responses are thought to arise from antigenic structures that primarily activate B cells or otherwise fail to activate T cell-dependent pathways that are involved in immunological memory and antibody maturation.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Настоящее изобретение относится к способам, композициям и методикам получения иммуногенных композиций, содержащих неприродную аминокислоту. Биортогональные химические структуры для прикрепления, включенные (встроенные) в неприродные аминокислоты, обеспечивают более эффективную и активную презентацию антигена иммунной системе, упрощенную очистку и более строго определенную структуру этих полусинтетических иммуногенов.The present invention relates to methods, compositions and techniques for producing immunogenic compositions containing a non-natural amino acid. Biorthogonal chemical attachment structures incorporated into non-natural amino acids provide more efficient and active antigen presentation to the immune system, simplified purification and more strictly defined structure of these semi-synthetic immunogens.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен конъюгат, содержащий полипептид и антиген, причем указанный полипептид представляет собой белок-носитель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, или нпАК, при этом указанный антиген конъюгирован с нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель содержит по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, из белка, выбранного из группы, состоящей из токсина Corynebacterium diphtheriae, тетаноспазмина Clostridium tetani (также известного как столбнячный токсин), белка D Haemophilus influenzae (PD, HiD), комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) и CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет лизин в нативном белке-носителе. Например, белок-носитель содержит CRM197, в котором по меньшей мере 2 (например, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 6) из 39 остатков лизина в нативном CRM197 были заменены нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет фенилаланин в нативном белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК заменяют лизин в нативном белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК заменяют фенилаланин в нативном белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК заменяют лизин, фенилаланин или как лизин, так и фенилаланин в природном белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность белка-носителя по меньшей мере на 80% идентична белку, выбранному из группы, состоящей из дифтерийного токсина (DT), столбнячного токсина (ТТ),According to one embodiment of the present invention, there is provided a conjugate comprising a polypeptide and an antigen, wherein said polypeptide is a carrier protein containing at least one T cell activating epitope and at least one unnatural amino acid, or nNAA, wherein said antigen conjugated to npAK. In another embodiment of the present invention, the carrier protein comprises at least one T cell activating epitope from a protein selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae toxin, Clostridium tetani tetanospasmin (also known as tetanus toxin), Haemophilus influenzae protein D ( PD, HiD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC) and CRM197. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAAs . According to another embodiment of the present invention, at least one npAK replaces lysine in the native carrier protein. For example, the carrier protein contains CRM197 in which at least 2 (eg, at least 3, at least 4, at least 5, or at least 6) of the 39 lysine residues in native CRM197 have been replaced by npAA. According to another embodiment of the present invention, at least one nPAA replaces phenylalanine in the native carrier protein. According to another embodiment of the present invention, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAAs replace lysine in the native carrier protein. According to another embodiment of the present invention, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAAs replace phenylalanine in the native carrier protein. According to another embodiment of the present invention, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAAs replace lysine, phenylalanine or both lysine and phenylalanine in a natural carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the npAA is selected from 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3 -(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6(azidomethyl)pyridin- 3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the sequence of the carrier protein is at least 80% identical to a protein selected from the group consisting of diphtheria toxin (DT), tetanus toxin (TT),

- 1 044044 белка D Haemophilus influenzae (PD) и CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность белка-носителя по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, получен из CRM197 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 или K527 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере две нпАК заменяют K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет K265 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет K386 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет K265 и K386 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с нпАК за счет триазольного соединяющего фрагмента. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой по лисахарид.- 1,044,044 Haemophilus influenzae protein D (PD) and CRM197. In another embodiment of the present invention, the sequence of the carrier protein is at least 80% identical to SEQ ID NO: 1. In another embodiment of the present invention, at least one T cell activating epitope is derived from CRM197 in accordance with SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, at least one NAAK replaces K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, or K527 from SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention at least one NAAA replaces F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, or F532 from SEQ ID NO: 1. In another embodiment of the present invention, at least two NAAAs replace K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532 of SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention at least one uAK replaces K265 of SEQ ID NO: 1. In another embodiment of the present invention, at least one uAK replaces K386 of SEQ ID NO: 1. In another embodiment of the present invention, at least one uAK replaces K265 and K386 of SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, the nPAA is selected from 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF) , 2-amino-3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-( 6(azidomethyl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is conjugated to the nAA via a triazole linking moiety. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a lysaccharide.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (в частности, типа b, т.е. Hib), Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6).According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (particularly type b, i.e. Hib), Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6).

Согласно связанному варианту реализации настоящего изобретения конъюгат содержит полипептид и антиген, причем указанный полипептид представляет собой белок-носитель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере одну, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК, при этом указанный антиген конъюгирован с по меньшей мере одной нпАК и при этом также по меньшей мере одна нпАК представляет собой 2,3-дизамещенную пропановую кислоту, содержащую амино-заместитель в положении 2 и азидосодержащий заместитель, 1,2,4,5-тетразинилсодержащий заместитель или этинилсодержащий заместитель в положении 3. Согласно другому связанному варианту реализации настоящего изобретения конъюгат содержит полипептид и антиген, причем указанный полипептид представляет собой белок-носитель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере один, и предпочтительно по меньшей мере два, остаток нпАК, при этом указанный антиген конъюгирован с нпАК и при этом также остаток нпАК соответствует аминокислоте, имеющей структуру формулы XIIAccording to a related embodiment of the present invention, the conjugate comprises a polypeptide and an antigen, wherein said polypeptide is a carrier protein containing at least one T cell activating epitope and at least one, and preferably at least two, nPAA, wherein said antigen is conjugated to at least one nPAA, and wherein at least one nPAA is also a 2,3-disubstituted propanoic acid containing an amino substituent at position 2 and an azide-containing substituent, a 1,2,4,5-tetrazinyl-containing substituent, or an ethynyl-containing substituent at position 3. According to another related embodiment of the present invention, the conjugate contains a polypeptide and an antigen, wherein said polypeptide is a carrier protein containing at least one T cell activating epitope and at least one, and preferably at least at least two, an npAK residue, wherein said antigen is conjugated to npAK and wherein the npAK residue also corresponds to an amino acid having the structure of formula XII

где Ar содержит 5-членное или 6-членное ароматическое кольцо, необязательно содержащее по меньшей мере один гетероатом;where Ar contains a 5-membered or 6-membered aromatic ring, optionally containing at least one heteroatom;

W⁵ выбран из C₁-С₁₀-алкилена, -NH-, -О- и -S-;W ⁵ is selected from C ₁ -C ₁₀ -alkylene, -NH-, -O- and -S-;

Q1 равен нулю или 1 иQ1 is zero or 1 and

W⁶ выбран из азидо, 1,2,4,5-тетразинила, необязательно С-замещенного низшей алкильной группой, и этинила,W ⁶ is selected from azido, 1,2,4,5-tetrazinyl, optionally C-substituted with a lower alkyl group, and ethynyl,

- 2 044044- 2 044044

так что остаток нпАК в полипептиде имеет структуру формулы XIII w⁶ so that the npAA residue in the polypeptide has the structure of formula XIII w ⁶

I (™%1I(™%1

О АгOh Ag

R³ ΗΝ_χR⁴ (XIII) где R³ представляет собой ОН или остаток аминокислоты белка-носителя, и R⁴ представляет собой Н или остаток аминокислоты белка-носителя.R ³ ΗΝ _χ R ⁴ (XIII) where R ³ represents OH or an amino acid residue of a carrier protein, and R ⁴ represents H or an amino acid residue of a carrier protein.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере одну нпАК, заменяющую природную аминокислоту в нативном полипептиде в соответствии с SEQ ID NO: 1, при этом по меньшей мере одна нпАК заменяет K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 или K527 из SEQ ID NO: 1, при этом нпАК содержит соединяющий фрагмент. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере одну нпАК, заменяющую природную аминокислоту в нативном полипептиде в соответствии с SEQ ID NO: 1, при этом по меньшей мере одна нпАК заменяет F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1, причем нпАК содержит соединяющий фрагмент. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере две нпАК, заменяющие природную аминокислоту в нативном полипептиде в соответствии с SEQ ID NO: 1, при этом по меньшей мере одна нпАК заменяет K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1, причем нпАК содержит соединяющий фрагмент. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заменен K265 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заменен K386 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заменены K265 и K386 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3-(4азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации.According to one embodiment of the present invention, there is provided a polypeptide comprising at least one nPAA that replaces a naturally occurring amino acid in a native polypeptide in accordance with SEQ ID NO: 1, wherein at least one nPAA replaces K25, K34, K38, K40, K213, K215 , K228, K245, K265, K386, K523, or K527 of SEQ ID NO: 1, wherein npAK contains a connecting moiety. According to another embodiment of the present invention, there is provided a polypeptide comprising at least one nPAA that replaces a natural amino acid in a native polypeptide in accordance with SEQ ID NO: 1, wherein at least one nPAA replaces F13, F54, F124, F128, F141, F168 , F251, F390, F531 or F532 of SEQ ID NO: 1, wherein the npAK contains a connecting moiety. According to another embodiment of the present invention, there is provided a polypeptide comprising at least two nPAAs that replace a natural amino acid in the native polypeptide in accordance with SEQ ID NO: 1, wherein at least one nPAA replaces K25, K34, K38, K40, K213, K215 , K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532 of SEQ ID NO: 1, wherein npAK contains a connecting moiety. According to another embodiment of the present invention, the npAA is selected from 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3 -(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl)pyridine -3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof. In another embodiment of the present invention, K265 of SEQ ID NO: 1 is replaced. In another embodiment, K386 of SEQ ID NO: 1 is replaced. In another embodiment, K265 and K386 of SEQ ID NO: 1 are replaced. implementation of the present invention, the polypeptide contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8 or at least 9 npAA. According to another embodiment of the present invention, the npAA is selected from 2-amino-3-(4azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3- (5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl)pyridin-3- yl)propanoic acid, 2-amino-5azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof.

Согласно связанному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК в полипептиде представляет собой 2,3-дизамещенную пропановую кислоту, содержащую амино-заместитель в положении 2 и азидосодержащий заместитель, 1,2,4,5тетразинилсодержащий заместитель или этинилсодержащий заместитель в положении 3.According to a related embodiment of the present invention, at least one, and preferably at least two, nPAA in the polypeptide is a 2,3-disubstituted propanoic acid containing an amino substituent at position 2 and an azide-containing substituent, a 1,2,4,5-tetrazinyl-containing substituent or an ethynyl-containing substituent at position 3.

Согласно другому связанному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК в полипептиде имеет структуру формулы XIIAccording to another related embodiment of the present invention, at least one, and preferably at least two, npAA in the polypeptide has the structure of formula XII

W⁶I (W^Q!W ⁶ I (W^Q!

О АгOh Ag

^NH2 (XII) где Ar содержит 5-членное или 6-членное ароматическое кольцо, необязательно содержащее по меньшей мере один гетероатом; ^NH 2 (XII) where Ar contains a 5-membered or 6-membered aromatic ring, optionally containing at least one heteroatom;

Q1 равен нулю или 1 иQ1 is zero or 1 and

W⁶ выбран из азидо, 1,2,4,5-тетразинила, необязательно С-замещенного низшей алкильной группой, и этинила.W ⁶ is selected from azido, 1,2,4,5-tetrazinyl, optionally C-substituted with a lower alkyl group, and ethynyl.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая конъюгаты полипептид-антиген, причем указанный полипептид представляет собой белок-носитель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере одну нпАК, иAccording to one embodiment of the present invention, there is provided a composition comprising polypeptide-antigen conjugates, wherein said polypeptide is a carrier protein containing at least one T cell activating epitope and at least one nPAA, and

- 3 044044 при этом указанный антиген конъюгирован с нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полипептид-антиген поперечно сшиты за счет связей белок-антиген-белок. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композиция содержит несколько конъюгатов белок-носитель-антиген, причем каждый конъюгат содержит отличающийся антиген (например, капсульные полисахариды из разных серотипов пневмококков). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антигены происходят из разных серотипов (например, для пневмококка) или серогрупп (например, для менингококка) одного и того же организма. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (например, Hib), Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19f, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композиция содержит конъюгат белок-носитель-антиген, описанный в настоящем документе, причем она содержит по меньшей мере 14, 20, 21, 24 или 25 различных конъюгатов белок-носитель-капсульный полисахарид, где каждый конъюгат содержит отличающийся капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение полисахарида и белканосителя (мас./мас.) превышает 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3-(4азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность белканосителя по меньшей мере на 80% идентична белку, выбранному из дифтерийного токсина (DT), столбнячного токсина (ТТ), белка D Haemophilus (PD), комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) и CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность белка-носителя по меньшей мере на 80% идентична CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность белка-носителя по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность белка-носителя по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1, при этом также по меньшей мере одна нпАК заменяет природную аминокислоту, присутствующую в нем. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК заменяет аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 или K527 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК заменяет аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК заменяет аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с нпАК за счет соединяющего фрагмента. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с нпАК за счет триазольного соединяющего фрагмента.- 3 044044 wherein said antigen is conjugated to npAK. According to another embodiment of the present invention, polypeptide-antigen conjugates are cross-linked through protein-antigen-protein linkages. According to another embodiment of the present invention, the composition contains several carrier protein-antigen conjugates, each conjugate containing a different antigen (eg, capsular polysaccharides from different pneumococcal serotypes). According to another embodiment of the present invention, the antigens are derived from different serotypes (eg, pneumococcus) or serogroups (eg, meningococcus) of the same organism. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (eg, Hib), Streptococcus pyogenes, or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6). According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19f, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the composition contains a carrier protein-antigen conjugate described herein, wherein it contains at least 14, 20, 21, 24 or 25 different carrier protein-capsular polysaccharide conjugates, wherein each conjugate contains a different capsular polysaccharide. polysaccharide of Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C , 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F. According to another embodiment of the present invention, the ratio of polysaccharide to carrier protein (w/w) is greater than 1. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8 or at least 9 npAK. According to another embodiment of the present invention, the npAA is selected from 2-amino-3-(4azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3- (5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl)pyridin-3- yl)propanoic acid, 2-amino-5azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof. In another embodiment of the present invention, the carrier protein has at least 80% sequence identity to a protein selected from diphtheria toxin (DT), tetanus toxin (TT), Haemophilus protein D (PD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), and CRM197 . According to another embodiment of the present invention, the sequence of the carrier protein is at least 80% identical to CRM197. In another embodiment of the present invention, the sequence of the carrier protein is at least 80% identical to SEQ ID NO: 1. In another embodiment of the present invention, the sequence of the carrier protein is at least 80% identical to SEQ ID NO: 1, while also at least one nPAA replaces the natural amino acid present in it. According to another embodiment of the present invention, at least one nPAA replaces an amino acid selected from the group consisting of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, or K527 from SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, at least one, and preferably at least two, npAA replaces an amino acid selected from the group consisting of F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532 from SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, at least one, and preferably at least two, npAA replaces an amino acid selected from the group consisting of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532 from SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, the antigen is conjugated to the npAK through a connecting moiety. According to another embodiment of the present invention, the antigen is conjugated to the nAA via a triazole linking moiety.

Согласно связанному варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полипептидантиген в композиции содержат, в качестве полипептида, белок-носитель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере одну, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК, причем указанный антиген конъюгирован с нпАК и при этом также по меньшей мере одна нпАК представляет собой 2,3-дизамещенную пропановую кислоту, содержащую амино-заместитель в положении 2 и азидосодержащий заместитель, 1,2,4,5-тетразинилсодержащий заместитель или этинилсодержащий заместитель в положении 3. Согласно другому связанному варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полипептид-антиген в композиции содержат, в качестве полипептида, белокноситель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере одну, и предпочтительно по меньшей мере две, нпАК, причем указанный антиген конъюгирован с нпАК и при этом также по меньшей мере одна нпАК в полипептиде имеет структуру формулы XIIAccording to a related embodiment of the present invention, the polypeptide antigen conjugates in the composition comprise, as a polypeptide, a carrier protein containing at least one T cell activating epitope and at least one, and preferably at least two, npAA, wherein said antigen conjugated to nPAA and wherein at least one nPAA is also a 2,3-disubstituted propanoic acid containing an amino substituent at position 2 and an azide-containing substituent, a 1,2,4,5-tetrazinyl-containing substituent or an ethynyl-containing substituent at position 3. According to another related embodiment of the present invention, the polypeptide-antigen conjugates in the composition contain, as a polypeptide, a protein carrier containing at least one T-cell activating epitope and at least one, and preferably at least two, nPAA, wherein said the antigen is conjugated to a npA and also at least one npA in the polypeptide has the structure of formula XII

- 4 044044- 4 044044

Q1 равен нулю или 1 иQ1 is zero or 1 and

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата, включающий: (а) обеспечение активированного антигена, содержащего множество функциональных групп, содержащих первую химическую ручку, способную конъюгироваться со второй химической рукояткой нпАК; (b) комбинирование активированного антигена с полипептидом, содержащим по меньшей мере одну из нпАК, в условиях, при которых первая и вторая химические рукоятки реагируют с образованием конъюгата антиген-полипептид, причем полипептид содержит по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки; и (с) выделение композиции, содержащей конъюгат. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (например, Hib), Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген подвергали взаимодействию с первым реагентом, выбранным из группы, состоящей из CDAP, CDI или периодата, при получении активированного антигена. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первый реагент представляет собой периодат, концентрация которого ниже 1 М. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения множество функциональных групп содержит гидроксильные группы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения множество функциональных групп содержит альдегидную группу. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген подвергали взаимодействию со вторым реагентом, содержащим функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из пропаргила, DIFO, DBCO и DBCO(PEG)n-NH2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген подвергали взаимодействию со вторым реагентом, содержащим DBCONH2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первая химическая рукоятка содержит алкиновую группу. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вторая химическая рукоятка содержит азидогруппу. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение антигена и полипептида конъюгата в композиции (мас./мас.) превышает 1. Согласно связанному варианту реализации настоящего изобретения способ получения конъюгата включает: (а) активацию антигена для включения (с включением) в него по меньшей мере одной первой химической рукоятки, причем первая химическая рукоятка способна конъюгироваться со второй химической рукояткой нпАК в полипептиде; (b) комбинирование активированного антигена с полипептидом, содержащим по меньшей мере одну из нпАК, в условиях, при которых первая и вторая химические рукоятки реагируют с образованием конъюгата антиген-полипептид, при этом полипептид содержит по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки; и (с) выделение композиции, содержащей конъюгат. Согласно одному аспекту этого варианта реализации активация антигена предусматривает включение (встраивание) в антиген по меньшей мере одной алкинильной группы в качестве первой химической рукоятки. Согласно другому связанному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата полипептид-антиген, включающий активацию антигена с помощью включения в него по меньшей мере одной алкинильной группы в качестве первой химической рукоятки и взаимодействие антигена с полипептидом, содержащим по меньшей мере одну нпАК, и предпочтительно по меньшей мере две нпАК, несущую азидогруппу в качестве второй химической рукоятки, что позволяет осуществить некаталитическую реакцию ковалентной биоконъюгации полипептида и антигена. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения алкинильная группа ограничена для повышения реакционной способности, например, в кольцевой структуре, такой как диарил-напряженный циклооктин.According to one embodiment of the present invention, there is provided a method of producing a conjugate, comprising: (a) providing an activated antigen comprising a plurality of functional groups comprising a first chemical handle capable of conjugating to a second chemical handle of the npAK; (b) combining the activated antigen with a polypeptide containing at least one of the npAKs under conditions in which the first and second chemical handles react to form an antigen-polypeptide conjugate, wherein the polypeptide contains at least one T cell activating epitope; and (c) isolating a composition containing the conjugate. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (eg, Hib), Streptococcus pyogenes, or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6). According to another embodiment of the present invention, the antigen is reacted with a first reagent selected from the group consisting of CDAP, CDI, or periodate to produce an activated antigen. According to another embodiment of the present invention, the first reagent is a periodate, the concentration of which is less than 1 M. According to another embodiment of the present invention, the plurality of functional groups contains hydroxyl groups. According to another embodiment of the present invention, the plurality of functional groups contains an aldehyde group. According to another embodiment of the present invention, the antigen is reacted with a second reagent containing a functional group selected from the group consisting of propargyl, DIFO, DBCO and DBCO(PEG)n-NH2. According to another embodiment of the present invention, the antigen is reacted with a second reagent containing DBCONH2. According to another embodiment of the present invention, the first chemical handle contains an alkyne group. According to another embodiment of the present invention, the second chemical handle contains an azido group. According to another embodiment of the present invention, the ratio of antigen to polypeptide conjugate in the composition (wt/wt) is greater than 1. According to a related embodiment of the present invention, a method for producing a conjugate includes: (a) activating an antigen to incorporate at least one first chemical handle, wherein the first chemical handle is capable of conjugating with a second chemical handle of the npAK in the polypeptide; (b) combining the activated antigen with a polypeptide containing at least one of the npAKs under conditions wherein the first and second chemical handles react to form an antigen-polypeptide conjugate, wherein the polypeptide contains at least one T cell activating epitope; and (c) isolating a composition containing the conjugate. In one aspect of this embodiment, activation of the antigen involves the inclusion (incorporation) of at least one alkynyl group into the antigen as a first chemical handle. According to another related embodiment of the present invention, there is provided a method of producing a polypeptide-antigen conjugate, comprising activating the antigen by including at least one alkynyl group as a first chemical handle and reacting the antigen with a polypeptide containing at least one npAA, and preferably by at least two npAA carrying an azido group as a second chemical handle, which allows for a non-catalytic reaction of covalent bioconjugation of the polypeptide and antigen. In a preferred embodiment of the present invention, the alkynyl group is limited to enhance reactivity, for example, in a ring structure such as a diaryl-strained cyclooctine.

- 5 044044- 5 044044

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ обеспечения (индукции) иммунозащитного антительного ответа на антиген у субъекта, включающий введение указанному субъекту конъюгата, описанного в настоящем документе, во вспомогательном веществе, подходящем для парентерального введения.According to one embodiment of the present invention, there is provided a method of providing (inducing) an immunoprotective antibody response to an antigen in a subject, comprising administering to the subject a conjugate described herein in an excipient suitable for parenteral administration.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ обеспечения иммунозащитного антительного ответа на антиген у субъекта, включающий введение указанному субъекту композиции, описанной в настоящем документе, во вспомогательном веществе, подходящем для парентерального введения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ синтеза полипептида, содержащего по меньшей мере 2 неприродные аминокислоты (нпАК), в смеси для бесклеточной экспрессии, поддерживаемой при температуре от примерно 10 до примерно 30°С, причем полученный полипептид содержит как растворимую, так и нерастворимую фракции, и при этом соотношение растворимой фракции и нерастворимой фракции составляет по меньшей мере 30% (мас./мас.). Например, в 100 г общего полипептида нерастворимая фракция будет составлять 70 г или менее, и растворимая фракция будет составлять 30 г или более. Согласно другому варианту реализации температура превышает приблизительно 20°C. Согласно другому варианту реализации температура ниже приблизительно 20°C. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения температура составляет от приблизительно 14 до приблизительно 18°C. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей подавляющий кодон. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения смесь для бесклеточной экспрессии содержит ортогональную пару тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаза, специфичную для нпАК. Согласно другому варианту реализации концентрация тРНК составляет по меньшей мере 20 мкМ (т.е. концентрация ортогональной тРНК). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения концентрация нпАК составляет менее приблизительно 2 мМ, и концентрация аминоацил-тРНК-синтетазы составляет менее приблизительно 5 мкМ (т.е. концентрация ортогональной синтетазы). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ включает конъюгирование полипептида с активным фрагментом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения активный фрагмент выбран из группы, состоящей из гаптена, бактериального антигена, вирусного антигена, пептидного токсина, макролида, простого полиэфира и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения смесь для экспрессии содержит клеточный экстракт Е. coli, зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения смесь для экспрессии содержит по меньшей мере 30% клеточного экстракта. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из группы, состоящей из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полученный полипептид содержит как растворимую, так и нерастворимую фракции, и при этом соотношение растворимой фракции и нерастворимой фракции составляет по меньшей мере 60% (мас./мас.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полученный полипептид содержит как растворимую, так и нерастворимую фракции, и при этом соотношение растворимой фракции и нерастворимой фракции составляет по меньшей мере 80% (мас./мас.). Например, в 100 г общего полипептида нерастворимая фракция будет составлять 20 г или менее, и растворимая фракция будет составлять 80 г или более. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен улучшенный способ получения белковой конъюгированной вакцины, в которой антиген конъюгирован с белком-носителем, который обеспечивает иммунный ответ, зависимый от Т-клеток, улучшение заключается в применении в качестве белка-носителя полипептида, содержащего по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, при этом неприродная аминокислота содержит биоортогональный реакционноспособный фрагмент, за счет которого антиген конъюгирован с полипептидом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой бактериальный полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере две неприродные аминокислоты, содержащие биоортогональный реакционноспособный фрагмент, за счет которого антиген конъюгирован с полипептидом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, который не содержит неприродную аминокислоту, содержащую биоортогональный реакционноспособный фрагмент, за счет которого антиген конъюгирован с полипептидом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения эпитоп, активирующий Т-клетки, получен из белка, выбранного из группы, состоящей из токсина Corynebacterium diphtheriae, тетаноспазмина Clostridium tetani, белка D Haemophilus influenzae (PD, HiD), комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) иAccording to one embodiment of the present invention, there is provided a method of providing an immunoprotective antibody response to an antigen in a subject, comprising administering to said subject a composition described herein in an excipient suitable for parenteral administration. According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for synthesizing a polypeptide containing at least 2 unnatural amino acids (nnAA) in a cell-free expression mixture maintained at a temperature of from about 10 to about 30° C., wherein the resulting polypeptide contains both soluble and insoluble amino acids. fraction, and wherein the ratio of soluble fraction to insoluble fraction is at least 30% (w/w). For example, in 100 g of total polypeptide, the insoluble fraction will be 70 g or less, and the soluble fraction will be 30 g or more. In another embodiment, the temperature is greater than about 20°C. In another embodiment, the temperature is below about 20°C. According to another embodiment of the present invention, the temperature is from about 14 to about 18°C. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide is encoded by a nucleic acid containing a suppression codon. According to another embodiment of the present invention, the cell-free expression mixture contains an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair specific for npAK. In another embodiment, the tRNA concentration is at least 20 μM (ie, the orthogonal tRNA concentration). According to another embodiment of the present invention, the concentration of npAA is less than about 2 mM, and the concentration of aminoacyl-tRNA synthetase is less than about 5 μM (ie, the concentration of the orthogonal synthetase). According to another embodiment of the present invention, the method includes conjugating a polypeptide to an active moiety. According to another embodiment of the present invention, the active moiety is selected from the group consisting of a hapten, a bacterial antigen, a viral antigen, a peptide toxin, a macrolide, a polyether, and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the expression mixture contains a cell extract of E. coli, wheat germ or rabbit reticulocytes. According to another embodiment of the present invention, the expression mixture contains at least 30% cell extract. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAAs. According to another embodiment of the present invention, the npAA is selected from the group consisting of 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6 -(azidomethyl)pyridin-3yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the resulting polypeptide contains both soluble and insoluble fractions, and the ratio of soluble fraction to insoluble fraction is at least 60% (w/w). According to another embodiment of the present invention, the resulting polypeptide contains both soluble and insoluble fractions, and the ratio of soluble fraction to insoluble fraction is at least 80% (w/w). For example, in 100 g of total polypeptide, the insoluble fraction will be 20 g or less, and the soluble fraction will be 80 g or more. According to one embodiment of the present invention, an improved method for producing a protein conjugate vaccine is provided, in which the antigen is conjugated to a carrier protein that provides a T-cell dependent immune response, the improvement being the use of a polypeptide containing at least one an unnatural amino acid, wherein the unnatural amino acid contains a bioorthogonal reactive fragment due to which the antigen is conjugated to the polypeptide. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a bacterial polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains at least two unnatural amino acids containing a bioorthogonal reactive moiety by which the antigen is conjugated to the polypeptide. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains at least one T cell activating epitope that does not contain a non-natural amino acid containing a bioorthogonal reactive moiety by which the antigen is conjugated to the polypeptide. According to another embodiment of the present invention, the T cell activating epitope is derived from a protein selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae toxin, Clostridium tetani tetanospasmin, Haemophilus influenzae protein D (PD, HiD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC) ) And

- 6 044044- 6 044044

CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой бактериальный полисахарид, и бактерия выбрана из группы, состоящей из Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (например, Hib), Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна из неприродных аминокислот выбрана из группы, состоящей из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты и 2амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты.CRM197. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a bacterial polysaccharide, and the bacterium is selected from the group consisting of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (eg, Hib), Streptococcus pyogenes, and Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, at least one of the unnatural amino acids is selected from the group consisting of 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl) propanoic acid (pAMF), 2-amino-3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino 3-(6-(azidomethyl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения белка-носителя, содержащего множество неприродных аминокислот в своей структуре, включающий: (а) обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-носитель, причем нуклеиновая кислота содержит множество подавляющих кодонов; (b) создание реакционной смеси путем комбинирования нуклеиновой кислоты с бесклеточным бактериальным экстрактом, содержащим неприродные аминокислоты, тРНК, комплементарную подавляющим кодонам, и аминоацил-тРНК-синтетазу; и (с) инкубацию реакционной смеси согласно (b) в условиях, достаточных для селективного встраивания неприродной аминокислоты в сайт, соответствующий каждому подавляющему кодону, в белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения неприродная аминокислота представляет собой 4-азидометилфенилаланин (pAMF). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения этап (с) включает инкубацию реакционной смеси при температуре ниже 20°С. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает очистку белка-носителя непосредственно после (с). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения подавляющий кодон селективно заменен в кодоне 25, 34, 38, 40, 213, 215, 228, 245, 265, 386, 52з или 527 из SEQ ID NO: 2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения реакционная смесь в (b) дополнительно содержит биологические компоненты, необходимые для синтеза белка. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения тРНК в (b) способна нагружаться pAMF. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминоацил-тРНК-синтетаза в (b) предпочтительно аминоацилирует тРНК с pAMF по сравнению с 20 природными аминокислотами.According to one embodiment of the present invention, there is provided a method of producing a carrier protein containing a plurality of unnatural amino acids in its structure, comprising: (a) providing a nucleic acid encoding a carrier protein, wherein the nucleic acid contains a plurality of suppression codons; (b) creating a reaction mixture by combining the nucleic acid with a cell-free bacterial extract containing unnatural amino acids, tRNA complementary to suppression codons, and aminoacyl-tRNA synthetase; and (c) incubating the reaction mixture according to (b) under conditions sufficient to selectively insert the unnatural amino acid into the site corresponding to each suppressive codon in the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the unnatural amino acid is 4-azidomethylphenylalanine (pAMF). According to another embodiment of the present invention, step (c) includes incubating the reaction mixture at a temperature below 20°C. According to another embodiment of the present invention, the method further comprises purifying the carrier protein immediately after (c). In another embodiment of the present invention, the suppression codon is selectively replaced at codon 25, 34, 38, 40, 213, 215, 228, 245, 265, 386, 523, or 527 of SEQ ID NO: 2. In another embodiment of the present invention, the reaction mixture in (b) additionally contains biological components necessary for protein synthesis. According to another embodiment of the present invention, the tRNA in (b) is capable of loading with pAMF. According to another embodiment of the present invention, the aminoacyl-tRNA synthetase in (b) preferentially aminoacylates tRNA with pAMF over 20 naturally occurring amino acids.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая по меньшей мере 14, 20, 21, 24 или 25 различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген, причем антиген представляет собой капсульный полисахарид, и: (а) капсульный полисахарид в каждом различающемся конъюгате белок-носитель-антиген получен из разного серотипа Streptococcus pneumoniae; (b) белок-носитель из конъюгатов белок-носитель-антиген содержит полипептид, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере две неприродные аминокислоты (нпАК); и (с) капсульные полисахариды конъюгированы с нпАК. В предпочтительных модификациях этого варианта реализации по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, получен из CRM197 в соответствии с SEQ ID NO: 1; последовательность полипептида по меньшей мере на 80% или 95% идентична SEQ ID NO: 1; и: (i) полипептид содержит 2-9 нпАК; (ii) полипептид содержит 4-6 нпАК; и/или (iii) по меньшей мере одна нпАК заменяет аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из (а) K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527 из CRM197, (b) F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1, или (с) K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SEQ ID NO: 1. Предпочтительные модификации предыдущих вариантов реализации включают композиции, содержащие по меньшей мере 14, 20, 21, 24 или 25 различающихся конъюгатов белокноситель-антиген, причем каждый различающийся конъюгат белок-носитель-антиген содержит антиген, выбранный индивидуально из капсульных полисахаридов серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F; композиции из по меньшей мере 24 различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген, в которых капсульный полисахарид из 24 различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген получен из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F; композиции, содержащие по меньшей мере 25 различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген, в которых капсульный полисахарид по меньшей мере одного из различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген получен из серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 6С, 7С, 13, 15А, 15С, 16, 16F, 23А, 23В, 24F, 31, 34, 35В, 33F, 35F, 37 и 38; и композиции, содержащие по меньшей мере 25 различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген, в которых капсульный полисахарид по меньшей мере одного из различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген получен из серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 15А и 35В, или в другом варианте из группы, состоящей из 20А, 20В и 24В.According to another embodiment of the present invention, there is provided a composition containing at least 14, 20, 21, 24, or 25 different protein-carrier-antigen conjugates, wherein the antigen is a capsular polysaccharide, and: (a) the capsular polysaccharide in each different protein-antigen conjugate the carrier antigen is derived from a different serotype of Streptococcus pneumoniae; (b) the carrier protein of carrier protein-antigen conjugates comprises a polypeptide containing at least one T cell activating epitope and at least two unnatural amino acids (nnAAs); and (c) capsular polysaccharides are conjugated to npAA. In preferred modifications of this embodiment, at least one T cell activating epitope is derived from CRM197 according to SEQ ID NO: 1; the polypeptide sequence is at least 80% or 95% identical to SEQ ID NO: 1; and: (i) the polypeptide contains 2-9 npAA; (ii) the polypeptide contains 4-6 npAA; and/or (iii) at least one nPAA replaces an amino acid residue selected from the group consisting of (a) K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527 from CRM197, (b) F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532 from SEQ ID NO: 1, or (c) K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265 , K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, or F532 from SEQ ID NO: 1. Preferred modifications of the previous embodiments include compositions containing at least 14, 20, 21 , 24 or 25 different carrier protein-antigen conjugates, wherein each different carrier protein-antigen conjugate contains an antigen selected individually from the capsular polysaccharides of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F; compositions of at least 24 different protein-carrier-antigen conjugates, wherein the capsular polysaccharide of 24 different protein-carrier-antigen conjugates is derived from Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F; compositions containing at least 25 different protein-carrier-antigen conjugates, wherein the capsular polysaccharide of at least one of the different protein-carrier-antigen conjugates is derived from a serotype of Streptococcus pneumoniae selected from the group consisting of 6C, 7C, 13, 15A , 15C, 16, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 34, 35B, 33F, 35F, 37 and 38; and compositions containing at least 25 different protein-carrier-antigen conjugates, wherein the capsular polysaccharide of at least one of the different protein-carrier-antigen conjugates is derived from a serotype of Streptococcus pneumoniae selected from the group consisting of 15A and 35B, or another option from the group consisting of 20A, 20B and 24B.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая по меньшей мере 14, 20, 21, 24 или 25 различающихся конъюгатов белок-носитель-антиген, в которых антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, причем (а) капсульный полисахарид в каждом различающемся конъюгате белок-носитель-антиген получен из разного сероAccording to one embodiment of the present invention, there is provided a composition comprising at least 14, 20, 21, 24, or 25 distinct carrier protein-antigen conjugates, wherein the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, wherein (a) the capsular polysaccharide in each distinct conjugate antigen carrier protein derived from different sero

- 7 044044 типа Streptococcus pneumoniae; (b) белок-носитель из конъюгатов белок-носитель-антиген представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере две неприродные аминокислоты (нпАК), и капсульные полисахариды конъюгированы с нпАК, (с) присутствует различающийся конъюгат белок-носитель-антиген, содержащий капсульный полисахарид для каждого из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, и (d) присутствует по меньшей мере один дополнительный различающийся конъюгат белок-носительантиген, содержащий капсульный полисахарид из серотипов Streptococcus pneumoniae, выбранных из группы, состоящей из серотипов 2, 6С, 8, 9N, 10A, 12F, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 20, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 24F, 24В, 31, 33F, 34, 35В, 35F и 38. Например, композиция может содержать (i) по меньшей мере 20 или 21 различающийся конъюгат белок-носитель-антиген, включая конъюгат для каждого из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, или (ii) по меньшей мере 24 различающихся конъюгата белок-носитель-антиген, причем присутствует различающийся конъюгат белок-носитель-антиген, содержащий капсульный полисахарид для каждого из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F.- 7 044044 type Streptococcus pneumoniae; (b) the carrier protein of carrier protein-antigen conjugates is a polypeptide containing at least one T cell activating epitope and at least two unnatural amino acids (nnAAs), and capsular polysaccharides are conjugated to nnAAs, (c) a different carrier protein-antigen conjugate containing a capsular polysaccharide is present for each of Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F and 23F, and (d) is present at at least one additional different protein-carrier antigen conjugate containing a capsular polysaccharide from serotypes of Streptococcus pneumoniae selected from the group consisting of serotypes 2, 6C, 8, 9N, 10A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20, 20A , 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 24B, 31, 33F, 34, 35B, 35F and 38. For example, the composition may contain (i) at least 20 or 21 different carrier protein-antigen conjugates, including a conjugate for each of Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F and 33F, or (ii) by at least 24 different protein-carrier-antigen conjugates, wherein there is a different protein-carrier-antigen conjugate containing a capsular polysaccharide for each of Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен конъюгат полипептидантиген, в котором полипептид содержит 3 или более остатков нпАК, и конъюгат имеет молекулярную массу по меньшей мере 500 кДа. Полипептид может представлять собой CRM197 (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, как обсуждается в разделе 5 а ниже), содержащий 3 или более остатков нпАК (например, 3-9 или 3-8, или 3-7, или 3-6 остатков нпАК). Антиген может представлять собой бактериальный полисахарид, такой как пневмококковый капсульный полисахарид. Конъюгат может иметь молекулярную массу по меньшей мере 600 кДа, по меньшей мере 800 кДа, по меньшей мере 900 кДа или по меньшей мере 1 МДа, например, 1-5 МДа. Как обсуждается далее в настоящем документе, несколько препаратов таких конъюгатов, где все препараты получены с пневмококковым капсульным полисахаридом из разных серотипов Streptococcus pneumoniae, можно комбинировать в композиции согласно настоящему изобретению, которые можно применять в качестве поливалентных вакцин. Предпочтительные группы серотипов Streptococcus pneumoniae, представленных в таких конъюгатах, также обсуждаются в настоящем документе ниже.According to one embodiment of the present invention, there is provided a polypeptide antigen conjugate, wherein the polypeptide contains 3 or more npAA residues and the conjugate has a molecular weight of at least 500 kDa. The polypeptide may be CRM197 (e.g., containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of SEQ ID NO: 1, as discussed in section 5a below) containing 3 or more npAA residues (e.g., 3-9 or 3 -8, or 3-7, or 3-6 npAA residues). The antigen may be a bacterial polysaccharide, such as pneumococcal capsular polysaccharide. The conjugate may have a molecular weight of at least 600 kDa, at least 800 kDa, at least 900 kDa, or at least 1 MDa, for example 1-5 MDa. As discussed later herein, multiple formulations of such conjugates, all of which are derived from pneumococcal capsular polysaccharide from different serotypes of Streptococcus pneumoniae, can be combined into compositions of the present invention that can be used as multivalent vaccines. Preferred groups of Streptococcus pneumoniae serotypes presented in such conjugates are also discussed below herein.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен конъюгат полипептидантиген, в котором полипептид содержит 4 или более остатков нпАК. Полипептид может представлять собой CRM197 (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, как описано в разделе 5а ниже), содержащий 4 или более остатков нпАК (например, 4-9 или 4-8, или 4-7, или 4-6 остатков нпАК). Антиген может представлять собой бактериальный полисахарид, такой как пневмококковый капсульный полисахарид. Конъюгат может иметь молекулярную массу по меньшей мере 500 кДа, (например, по меньшей мере 600 кДа, по меньшей мере 800 кДа, по меньшей мере 900 кДа или по меньшей мере 1 МДа, например, 1 -5 МДа). Как обсуждается далее в настоящем документе, несколько препаратов таких конъюгатов, где все препараты получены с пневмококковым капсульным полисахаридом из разных серотипов Streptococcus pneumoniae, можно комбинировать в композиции согласно настоящему изобретению, которые можно применять в качестве поливалентных вакцин. Предпочтительные группы серотипов Streptococcus pneumoniae, представленных в таких конъюгатах, также обсуждаются в настоящем документе далее.According to one embodiment of the present invention, a polypeptide antigen conjugate is provided, wherein the polypeptide contains 4 or more npAA residues. The polypeptide may be CRM197 (eg, containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of SEQ ID NO: 1, as described in section 5a below), containing 4 or more npAA residues (eg, 4-9 or 4- 8, or 4-7, or 4-6 npAA residues). The antigen may be a bacterial polysaccharide, such as pneumococcal capsular polysaccharide. The conjugate may have a molecular weight of at least 500 kDa, (eg, at least 600 kDa, at least 800 kDa, at least 900 kDa, or at least 1 MDa, eg, 1 -5 MDa). As discussed later herein, multiple formulations of such conjugates, all of which are derived from pneumococcal capsular polysaccharide from different serotypes of Streptococcus pneumoniae, can be combined into compositions of the present invention that can be used as multivalent vaccines. Preferred groups of Streptococcus pneumoniae serotypes presented in such conjugates are also discussed further herein.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен белок, подходящий для получения иммуногенного конъюгата полисахарид-белок, в котором указанный белок (i) содержит по меньшей мере одну нпАК и (ii) имеет растворимость по меньшей мере 50 мг/л при 20°С в трис-буфере с рН 7,4. Полипептид содержит по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки (как обсуждается выше); например, это может быть CRM197 (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, как обсуждается в разделе 5а ниже), содержащий 2 или более остатков нпАК, например, 3-9 или 4-9, или 3-8, или 4-8, или 3-7, или 4-7, или 3-6, или 4-6 остатков нпАК. Белок может быть конъюгирован с бактериальным полисахаридом, таким как пневмококковый капсульный полисахарид, для получения конъюгата. Растворимость может составлять по меньшей мере 100 мг/л, по меньшей мере 200 мг/л или даже по меньшей мере 250 мг/л. Как обсуждается далее в настоящем документе, несколько препаратов таких конъюгатов, где все препараты получены с пневмококковым капсульным полисахаридом из разных серотипов Streptococcus pneumoniae, можно комбинировать в композиции согласно настоящему изобретению, которые можно применять в качестве поливалентных вакцин. Предпочтительные группы серотипов Streptococcus pneumoniae, представленных в таких конъюгатах, также обсуждаются далее в настоящем документе.According to one embodiment of the present invention, there is provided a protein suitable for the preparation of an immunogenic polysaccharide-protein conjugate, wherein the protein (i) contains at least one nPAA and (ii) has a solubility of at least 50 mg/L at 20°C in Tris -buffer with pH 7.4. The polypeptide contains at least one T cell activating epitope (as discussed above); for example, it could be CRM197 (e.g., containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of SEQ ID NO: 1, as discussed in section 5a below), containing 2 or more npAA residues, for example, 3-9 or 4 -9, or 3-8, or 4-8, or 3-7, or 4-7, or 3-6, or 4-6 npAA residues. The protein can be conjugated to a bacterial polysaccharide, such as pneumococcal capsular polysaccharide, to form a conjugate. The solubility may be at least 100 mg/L, at least 200 mg/L, or even at least 250 mg/L. As discussed later herein, multiple formulations of such conjugates, all of which are derived from pneumococcal capsular polysaccharide from different serotypes of Streptococcus pneumoniae, can be combined into compositions of the present invention that can be used as multivalent vaccines. Preferred groups of Streptococcus pneumoniae serotypes presented in such conjugates are also discussed later herein.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

Признаки и преимущества вариантов реализации, описанных в настоящем документе, дополнительно поясняются со ссылкой на следующее подробное описание и прилагаемые чертежи, на которых изложены иллюстративные варианты реализации.The features and advantages of the embodiments described herein are further explained with reference to the following detailed description and the accompanying drawings, in which illustrative embodiments are set forth.

На фиг. 1 показан выход eCRM, содержащего 6 нпАК, полученного при 30, 25 или 20°С в реакциях CFPS, необязательно дополненных повышающимися количествами тРНК (О-тРНК) или нпАК/aaRS- 8 044044 синтетазы (нпАК). В каждом столбике показаны два столбца, представляющие выход общей и растворимой фракций.In fig. 1 shows the yield of eCRM containing 6 npAK, obtained at 30, 25 or 20°C in CFPS reactions, optionally supplemented with increasing amounts of tRNA (O-tRNA) or npAK/aaRS-8 044044 synthetase (npAK). Each bar shows two bars representing the yield of total and soluble fractions.

На фиг. 2 показано изображение геля после окрашивания Кумасси (2А) и флуоресцентное изображение геля (2В), демонстрирующие относительный выход синтезированного белка (2А) и способность pAMF, включенной в eCRM, вступать в реакцию с DBCO-флуоресцеином (2В) для односайтного eCRM, полученного в реакциях бесклеточного белкового синтеза (CFPS). На фиг. 2А маркеры молекулярной массы показывают, сверху вниз, 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 и 250 кДа. На фиг. 2В флуоресцентные маркеры находятся на уровне 25 и 75 кДа. Дорожки соответствуют следующим: L = маркеры молекулярной массы; W = дикий тип; С = С-концевой TAG; затем в дорожках 1-12 TAG заменяет Lys в положениях 11, 25, 34, 38, 40, 52, 60, 77, 83, 91, 96 и 103, соответственно.In fig. Figure 2 shows a Coomassie-stained gel image (2A) and a fluorescence image of the gel (2B) demonstrating the relative yield of protein synthesized (2A) and the ability of pAMF included in the eCRM to react with DBCO-fluorescein (2B) for the single-site eCRM prepared in cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. In fig. 2A molecular mass markers indicate, from top to bottom, 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, and 250 kDa. In fig. 2B fluorescent markers are at the level of 25 and 75 kDa. Lanes correspond to the following: L = molecular weight markers; W = wild type; C = C-terminal TAG; then in lanes 1–12, TAG replaces Lys at positions 11, 25, 34, 38, 40, 52, 60, 77, 83, 91, 96, and 103, respectively.

На фиг. 3 показана опсонофагоцитарная (ОРА) активность (GMT) у мышей после введения моновалентных конъюгатов пневмококковый полисахарид-eCRM. Серотипы показаны на оси X. Белые столбцы представляют добавленные в качестве адъюванта полисахариды, тогда как черные столбцы представляют добавленные в качестве адъюванта конъюгаты.In fig. Figure 3 shows opsonophagocytic (OPA) activity (GMT) in mice following administration of monovalent pneumococcal polysaccharide-eCRM conjugates. Serotypes are shown on the x-axis. White bars represent polysaccharides added as an adjuvant, whereas black bars represent conjugates added as an adjuvant.

На фиг. 4 показаны ответы IgG (GMT) у мышей после введения моновалентных конъюгатов пневмококковый полисахарид-eCRM. Серотипы показаны на оси X. Белые столбцы представляют добавленные в качестве адъюванта, но неконъюгированные полисахариды; черные столбцы представляют добавленные в качестве адъюванта конъюгаты.In fig. Figure 4 shows IgG (GMT) responses in mice following administration of monovalent pneumococcal polysaccharide-eCRM conjugates. Serotypes are shown on the x-axis. White bars represent adjuvanted but unconjugated polysaccharides; black bars represent conjugates added as adjuvant.

На фиг. 5 показаны ответы IgG (GMT) у кроликов после введения поливалентных пневмококковых вакцин. Каждый серотип (ось X) имеет данные для 24-валентной конъюгированной вакцины согласно настоящему изобретению (слева), Prevnar-13™ (в центре) и 24-валентной неконъюгированной вакцины (справа). Данные представляют среднее значение ± 95% доверительный интервал.In fig. Figure 5 shows IgG (GMT) responses in rabbits following administration of multivalent pneumococcal vaccines. Each serotype (x-axis) has data for the 24-valent conjugate vaccine of the present invention (left), Prevnar-13™ (center), and 24-valent unconjugate vaccine (right). Data represent mean ± 95% confidence interval.

Фиг. 6 сходна с фиг. 5, но на ней показаны ответы ОРА (GMT).Fig. 6 is similar to FIG. 5, but it shows OPA responses (GMT).

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

В белковых конъюгированных вакцинах иммунный ответ на слабый антиген усиливается за счет прикрепления к известному сильному белковому антигену. В этих полусинтетических биомолекулах белки, которые вызывают сильные, длительные иммунные ответы, зависящие от Т-клеток (зависящие от Т-клеток антигены), обычно прикреплены к слабому антигену с помощью неспецифических химических реакций окисления/восстановления. Конструктивные особенности на этих иммуногенных белках, активирующие Т-клетки, привлекают хелперные Т-клетки к В-клеткам, которые распознают прикрепленный слабый антиген, что обеспечивает сильный, длительный иммунный ответ на слабоиммуногенную в других отношениях молекулу.In protein conjugate vaccines, the immune response to a weak antigen is enhanced by attachment to a known strong protein antigen. In these semisynthetic biomolecules, proteins that elicit strong, long-lasting T-cell-dependent immune responses (T-cell-dependent antigens) are typically attached to a weak antigen through nonspecific chemical oxidation/reduction reactions. Design features on these immunogenic proteins that activate T cells attract helper T cells to B cells, which recognize the attached weak antigen, allowing a strong, long-lasting immune response to the otherwise weakly immunogenic molecule.

Современные способы и структурные элементы, применяемые для получения белковых конъюгированных вакцин, препятствуют более широкому применению конъюгированных вакцин для лечения и предотвращения заболеваний. Во-первых, относительно небольшое количество сильных белковых антигенов являются химически устойчивыми, нетоксичными и достаточно масштабируемыми для применения в качестве носителей в конъюгированных вакцинах. Во-вторых, химические реакции окисления/восстановления, обычно применяемые для получения конъюгированной вакцины, затрудняют сохранение эпитопов на носителе и антигене, необходимых для максимальной иммуногенности. В-третьих, относительно низкая эффективность этих реакций окисления/восстановления усложняет контроль качества и очистку, в частности, в промышленном масштабе.Current methods and structures used to produce protein conjugate vaccines hinder the wider use of conjugate vaccines for the treatment and prevention of diseases. First, relatively few potent protein antigens are chemically stable, nontoxic, and scalable enough to be used as carriers in conjugate vaccines. Second, the oxidation/reduction chemistry typically used to produce a conjugate vaccine makes it difficult to retain the epitopes on the carrier and antigen needed for maximum immunogenicity. Third, the relatively low efficiency of these oxidation/reduction reactions makes quality control and purification difficult, particularly on an industrial scale.

Получение рекомбинантного белка позволяет оптимизировать антигенность и нетоксичность белков-носителей, но существующие белки-носители трудно получать в рекомбинантных клетках, и полностью модифицированные белки трудно получать с высокими выходами. Реакции конъюгации Гентлера позволяют свести к минимуму денатурацию/обструкцию эпитопов носителя и антигена, но более низкая эффективность этих реакций приводит к меньшей нагрузке антигена на белок-носитель и более сложным схемам очистки. Важно отметить, что относительно более низкое количество антигена по отношению к носителю приводит к более высокой вероятности иммунных помех в результате гуморального ответа на сам белок-носитель или к установленному явлению индуцированного носителем подавления эпитопа.Recombinant protein production allows optimization of the antigenicity and nontoxicity of carrier proteins, but existing carrier proteins are difficult to produce in recombinant cells, and fully modified proteins are difficult to produce in high yields. Gentler conjugation reactions minimize denaturation/obstruction of carrier and antigen epitopes, but the lower efficiency of these reactions results in lower antigen loading on the carrier protein and more complex purification schemes. It is important to note that the relatively lower amount of antigen relative to the carrier leads to a higher likelihood of immune interference as a result of a humoral response to the carrier protein itself or to the established phenomenon of carrier-induced epitope suppression.

Соответственно, было установлено, что существует потребность в стратегиях и реагентах, которые позволяют комбинировать эти технологии для получения конъюгированных вакцин с более высокой иммуногенностью и более легким изготовлением. Соответственно, в настоящем документе описаны, помимо прочего, (1) полипептиды, включая улучшенные белки-носители, содержащие неприродные аминокислоты; (2) антигены, которые подходят для конъюгирования с полипептидами, включая улучшенные белки-носители, содержащие неприродные аминокислоты; (3) конъюгаты полипептид-антиген по п. (1) и п. (2), включая антигены, конъюгированные с улучшенными белками-носителями, содержащими неприродные аминокислоты; (4) вакцинные композиции, содержащие указанное выше; и (5) способы получения и применения указанного выше.Accordingly, it has been determined that there is a need for strategies and reagents that allow these technologies to be combined to produce conjugate vaccines with higher immunogenicity and easier manufacture. Accordingly, disclosed herein are, among other things, (1) polypeptides, including improved carrier proteins, containing unnatural amino acids; (2) antigens that are suitable for conjugation to polypeptides, including improved carrier proteins containing non-natural amino acids; (3) polypeptide-antigen conjugates according to claim (1) and claim (2), including antigens conjugated to improved carrier proteins containing unnatural amino acids; (4) vaccine compositions containing the above; and (5) methods for obtaining and using the above.

1. Определения.1. Definitions.

Термин подавляющий кодон относится к нуклеотидному триплету, который введен в полинуклеотид в заранее определенном положении и распознается специфической тРНК, которая может распо- 9 044044 знавать стоп-кодон (например, стоп-кодон амбер, охра или опал) и обеспечивает трансляцию с прочтением кодона для получения белка, подавляя тем самым стоп-кодон.The term suppress codon refers to a nucleotide triplet that is introduced into a polynucleotide at a predetermined position and is recognized by a specific tRNA that can recognize a stop codon (for example, an amber, ocher, or opal stop codon) and allows translation to read the codon for obtaining the protein, thereby suppressing the stop codon.

Неприродная аминокислота (нпАК) относится к аминокислоте, которая не является ни одной из 20 распространенных аминокислот, ни пиролизином, ни селеноцистеином; другие термины, которые используются как синонимы термина неприродная аминокислота, включают не кодируемая в природе аминокислота, ненатуральная аминокислота, не встречающаяся в природе аминокислота и различные их варианты, разделенные дефисом или не разделенные. Неприродные аминокислоты с биоортогональными химически реакционноспособными боковыми цепями можно применять в качестве химической рукоятки для конъюгации различных полезных грузов с дискретными сайтами в белке.A non-natural amino acid (nnAA) refers to an amino acid that is not one of the 20 common amino acids, neither pyrolysine nor selenocysteine; other terms that are used interchangeably with the term non-natural amino acid include non-naturally occurring amino acid, non-natural amino acid, non-naturally occurring amino acid, and various variants thereof, whether hyphenated or not. Unnatural amino acids with bioorthogonal chemically reactive side chains can be used as chemical handles to conjugate various payloads to discrete sites in a protein.

Термин идентичность последовательности или процент идентичности, применительно к двум или более последовательностям нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения, согласно результатам измерения с использованием алгоритма сравнения последовательностей (например, BLASTP для аминокислотных последовательностей). Для целей настоящего документа процент идентичности определяется по всей длине последовательности, такой как эталонная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1. Способ вычисления идентичности последовательности, представленный в настоящем документе, представляет собой программу BLASTP, имеющую значения по умолчанию, установленные как длина слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и оценочная матрица BLOSUM62 (см., например, Henikoff & Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). Например, инструмент для выравнивания BLAST доступен на веб-сайте blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi или в другом месте.The term sequence identity or percentage identity, when applied to two or more nucleic acid or polypeptide sequences, refers to two or more sequences that are the same or have a certain percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same, when compared and aligned for maximum fit in a window comparisons as measured using a sequence comparison algorithm (eg BLASTP for amino acid sequences). For the purposes of this document, the percent identity is determined over the entire length of a sequence, such as the reference sequence presented in SEQ ID NO: 1. The method for calculating sequence identity presented herein is a BLASTP program having default values set to word length ( W) 3, expectation (E) 10 and the scoring matrix BLOSUM62 (see, for example, Henikoff & Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). For example, the BLAST alignment tool is available at blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi or elsewhere.

Термин антиген относится к любой молекуле или линейному молекулярному фрагменту, который может распознаваться очень вариабельными антигенными рецепторами (В-клеточные рецепторы, Тклеточные рецепторы или оба типа рецепторов) адаптивной иммунной системы. Неограничивающие примеры антигенов включают полисахариды или гликаны (например, бактериальные капсульные полисахариды), полинуклеотиды, полиаминокислоты, липиды и небольшие молекулы (например, гаптены, лекарственные препараты, вызывающие лекарственную зависимость).The term antigen refers to any molecule or linear molecular fragment that can be recognized by the highly variable antigen receptors (B cell receptors, T cell receptors, or both) of the adaptive immune system. Non-limiting examples of antigens include polysaccharides or glycans (eg, bacterial capsular polysaccharides), polynucleotides, polyamino acids, lipids, and small molecules (eg, haptens, drugs of abuse).

Термин эпитоп, активирующий Т-клетки относится к структурной единице молекулярной структуры, которая способно индуцировать Т-клеточный иммунитет. Функция белков-носителей, которые содержат эпитопы, активирующие Т-клетки, хорошо известна и документально подтверждена для конъюгатов. Безотносительно к какой-либо теории, эпитоп, активирующий Т-клетки, в белке-носителе обеспечивает процессинг ковалентно прикрепленного антигена антигенпрезентирующими клетками и презентирование CD4^+ve Т-клеткам для индукции иммунологической памяти против антигена.The term T cell activating epitope refers to a molecular entity that is capable of inducing T cell immunity. The function of carrier proteins that contain T cell activating epitopes is well known and documented for conjugates. Without being bound by any theory, a T cell activating epitope in a carrier protein mediates processing of covalently attached antigen by antigen presenting cells and presentation to CD4 ^+ve T cells to induce immunological memory against the antigen.

Термин В-клеточный эпитоп относится обычно к тем признакам макромолекулярной структуры, которые способны индуцировать В-клеточный ответ. В отличие от Т-клеточного эпитопа В-клеточный эпитоп не обязательно должен содержать пептид, поскольку для активации В-клеток не требуется процессинг антигенпрезентирующими клетками и загрузка на связывающую пептид щель ГКГС.The term B cell epitope generally refers to those features of macromolecular structure that are capable of inducing a B cell response. Unlike a T cell epitope, a B cell epitope does not need to contain a peptide because B cell activation does not require processing by antigen presenting cells and loading onto the MHC peptide binding cleft.

В настоящем документе термин белок-носитель относится к нетоксичному или детоксифицированному полипептиду, содержащему эпитоп, активирующий Т-клетки, который может быть прикреплен к антигену (например, полисахариду) для усиления у субъекта гуморального ответа на конъюгированный антиген. Термин включает любой из бактериальных белков, применяемых в качестве носителей эпитопа в вакцинах, одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США. (FDA). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белок-носитель представляет собой токсин Corynebacterium diphtheriae, тетаноспазмин Clostridium. tetani, белок D Haemophilus influenzae (PD, HiD), комплекс белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС), CRM197 или специфический поверхностный белок оокинета малярийного плазмодия Pfs25. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белокноситель представляет собой ВВ, происходящий из белка G штамма Streptococcus G148. Нативный белокноситель содержит только природные аминокислоты. Улучшенный белок-носитель содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, заменяющую природную аминокислоту в белке-носителе.As used herein, the term carrier protein refers to a non-toxic or detoxified polypeptide containing a T cell activating epitope that can be attached to an antigen (eg, a polysaccharide) to enhance a humoral response in a subject to the conjugated antigen. The term includes any of the bacterial proteins used as epitope carriers in vaccines approved by the US Food and Drug Administration. (FDA). In some embodiments of the present invention, the carrier protein is a Corynebacterium diphtheriae toxin, Clostridium tetanospasmin. tetani, Haemophilus influenzae protein D (PD, HiD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), CRM197 or the specific ookinete surface protein of the falciparum plasmodium Pfs25. According to another embodiment of the present invention, the protein carrier is an EV derived from the G protein of Streptococcus strain G148. The native protein carrier contains only natural amino acids. The improved carrier protein contains at least one non-natural amino acid that replaces the naturally occurring amino acid in the carrier protein.

В настоящем документе термин иммуногенный полипептид относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, причем Т-клеточный эпитоп происходит из белка, способного индуцировать иммунологическую память у животных.As used herein, the term immunogenic polypeptide refers to a polypeptide containing at least one T cell activating epitope, wherein the T cell epitope is derived from a protein capable of inducing immunological memory in animals.

Термины eCRM или улучшенный CRM, используемые взаимозаменяемо в настоящем документе, относятся к модифицированной версии варианта кодона G52E дифтерийного токсина, причем по меньшей мере один из остатков природных аминокислот заменен неприродной аминокислотой и полипептид сохраняет по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки.The terms eCRM or enhanced CRM, used interchangeably herein, refer to a modified version of the diphtheria toxin codon variant G52E, wherein at least one of the naturally occurring amino acid residues is replaced by a non-naturally occurring amino acid and the polypeptide retains at least one T cell activating epitope.

В настоящем документе термины модифицированный, замененный, улучшенный и замещенный считаются синонимами при применении для описания остатков полипептида, и во всех случаях относятся к замене природной аминокислоты неприродной аминокислотой в полипептидной цепи.As used herein, the terms modified, substituted, improved, and substituted are considered synonymous when used to describe polypeptide residues, and in all cases refer to the replacement of a naturally occurring amino acid with a non-naturally occurring amino acid in a polypeptide chain.

В настоящей заявке термин Т-независимый антиген относится к антигену, который индуцирует признаки иммунитета, опосредуемого В-клетками, или который не индуцирует процессы, связанные сAs used herein, the term T-independent antigen refers to an antigen that induces features of B cell-mediated immunity or that does not induce processes associated with

- 10 044044 иммунитетом, опосредуемым хелперными Т-клетками, такие как переключение изотипа или иммунологическая память.- 10 044044 helper T cell-mediated immunity, such as isotype switching or immunological memory.

В настоящем документе термин полисахарид используется в его обычном смысле, включая, но не ограничиваясь ими, сахариды, содержащие множество повторяющихся звеньев, включая, но не ограничиваясь ими, полисахариды, имеющие 50 или более повторяющихся звеньев, и олигосахариды, имеющие 50 или менее повторяющихся звеньев. Как правило, полисахариды имеют от приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95 повторяющихся звеньев до приблизительно 2000 или более повторяющихся звеньев и необязательно от приблизительно 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 повторяющихся звеньев до приблизительно 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 или 1900 повторяющихся звеньев. Олигосахариды, как правило, имеют от приблизительно 6, 7, 8, 9 или 10 повторяющихся звеньев до приблизительно 15, 20, 25, 30 или от 35 до приблизительно 40 или 45 повторяющихся звеньев.As used herein, the term polysaccharide is used in its ordinary sense, including, but not limited to, saccharides containing multiple repeating units, including, but not limited to, polysaccharides having 50 or more repeating units and oligosaccharides having 50 or fewer repeating units . Typically, polysaccharides have from about 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 or 95 repeat units to about 2000 or more repeat units and optionally from about 100, 150, 200, 250, 300, 350 , 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 repeat units to approximately 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 or 1900 repeat units. Oligosaccharides typically have from about 6, 7, 8, 9 or 10 repeat units to about 15, 20, 25, 30 or 35 to about 40 or 45 repeat units.

В настоящем документе термин гликан относится к любому линейному или разветвленному полимеру, состоящему из моносахаридных (например, глюкозных) остатков, связанных друг с другом гликозидными связями. Примеры гликанов включают гликоген, крахмал, гиалуроновую кислоту и целлюлозу. Другие примеры гликанов включают бактериальные капсульные полисахариды.As used herein, the term glycan refers to any linear or branched polymer consisting of monosaccharide (eg, glucose) residues linked to each other by glycosidic bonds. Examples of glycans include glycogen, starch, hyaluronic acid and cellulose. Other examples of glycans include bacterial capsular polysaccharides.

В настоящем документе термин молекулярная масса полисахарида или конъюгата белокноситель-полисахарид относится к молекулярной массе, рассчитанной с помощью гель-проникающей хроматографии (SEC) в комбинации с многоугловым рассеянием лазерного излучения (MALS).As used herein, the term molecular weight of a polysaccharide or carrier protein-polysaccharide conjugate refers to the molecular weight calculated using gel permeation chromatography (SEC) in combination with multi-angle laser scattering (MALS).

В настоящем документе термин низший алкил, и если не указано иное, относится к насыщенному линейному или разветвленному углеводороду, содержащему от одного до шести атомов углерода, т.е. C1С₆-алкилу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения низшая алкильная группа представляет собой первичный, вторичный или третичный углеводород. Термин включает как замещенные, так и незамещенные фрагменты; см. также US-2014/0066598. Термин низший алкилен относится к алкиленовому радикалу низшего алкила.As used herein, the term lower alkyl, and unless otherwise indicated, refers to a saturated linear or branched hydrocarbon containing from one to six carbon atoms, i.e. C1C ₆ -alkyl. In some embodiments of the present invention, the lower alkyl group is a primary, secondary, or tertiary hydrocarbon. The term includes both substituted and unsubstituted moieties; see also US-2014/0066598. The term lower alkylene refers to a lower alkyl alkylene radical.

Соединения согласно различным вариантам реализации, раскрытым в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемые соли, которые содержат один или более асимметричных центров и дают энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые определены, касательно абсолютной стереохимии, как (R) или (S) либо как (D) или (L) для аминокислот. Предполагается, что настоящее изобретение охватывает все такие изомеры, а также их рацемические и оптически чистые формы. нпАК, применяемые в настоящем документе, обычно представляют собой α-аминокислоты с хиральным центром у альфа-углерода, и они предпочтительно являются (L) изомерами.Compounds according to various embodiments disclosed herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, that contain one or more asymmetric centers and give enantiomers, diastereomers and other stereoisomeric forms that are defined, with respect to absolute stereochemistry, as (R) or (S) or as (D) or (L) for amino acids. The present invention is intended to cover all such isomers, as well as their racemic and optically pure forms. The nPAAs used herein are typically α-amino acids with a chiral center at the alpha carbon, and they are preferably (L) isomers.

Протокол номенклатуры химических веществ и структурные схемы, применяемые в настоящем документе, представляют собой модифицированную форму системы номенклатуры IUPAC с использованием программного обеспечения ACD/Name, версия 9.07, и/или программы присвоения имен ChemDraw Ultra, версия 11.0.1 (CambridgeSoft). За исключением случаев, описанных ниже, в настоящем документе указаны все химические связи на диаграммах химических структур, за исключением всех химических связей на некоторых атомах углерода, которые, как предполагают, связаны с достаточным количеством атомов водорода для заполнения валентности.The chemical nomenclature protocol and structural diagrams used in this document are a modified form of the IUPAC nomenclature system using ACD/Name software, version 9.07, and/or the ChemDraw Ultra naming program, version 11.0.1 (CambridgeSoft). Except as described below, all chemical bonds in chemical structure diagrams are indicated herein, with the exception of all chemical bonds on some carbon atoms that are assumed to be bonded to enough hydrogen atoms to fill the valence.

2. Общие способы.2. General methods.

Если не указано иное, значение всех технических и научных терминов, используемых в настоящем документе, соответствует общепринятому. В частности, практические специалисты могут найти определения и термины в Green & Sambrook (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4 изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), и Ausubel, F.M., et al, Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, New York (2012), и Plotkin, S.A., Orenstein, W.A., & Offit, P.A., Vaccines, 6 изд., Elsevier, London (2013), которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Стандартные способы также описаны в Bindereif, Schon, & Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Germany, где описаны подробные способы манипуляции и анализа РНК и который включен в настоящий документ посредством ссылки. Примеры молекулярных методик, подходящих для получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, и инструкции для многих процедур клонирования можно найти в Green & Sambrook (Id); Ausubel, F. M., et al., (Id.); Berger & Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1987); и PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, San Diego, Calif. 1990), которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Примеры биоорганических методик, подходящих для активации и дериватизации биомолекул с помощью химических ручек, и инструкции по разработке таких синтезов можно найти в Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, 2 изд., Elsevier, London (2008). Практикующие специалисты могут найти примеры методик и компонентов, необходимых для парентерального введения биомолекул, описанных в настоящем документе, в Remington, Essentials of Pharmaceutics, Pharmaceutical Press, London (2012). Способы очистки белка, хроматографии, электрофореза, центрифугирования и кристаллизации описаны в Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York. Способы бесклеточного синтеза описаны в Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Germany. Способы включения неприрод- 11 044044 ных аминокислот в белки с применением бесклеточного синтеза описаны в Shimizu et al. (2006) FEBSUnless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning as generally accepted. In particular, practitioners can find definitions and terms in Green & Sambrook (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), and Ausubel, F.M., et al, Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, New York (2012), and Plotkin, S.A., Orenstein, W.A., & Offit, P.A., Vaccines, 6 ed., Elsevier, London (2013), which are incorporated herein by reference. Standard methods are also described in Bindereif, Schon, & Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Germany, which describes detailed methods for manipulating and analyzing RNA and which is incorporated herein by reference. Examples of molecular techniques suitable for producing recombinant nucleic acids and instructions for many cloning procedures can be found in Green & Sambrook (Id); Ausubel, F. M., et al., (Id.); Berger & Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1987); and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, San Diego, Calif. 1990), which are incorporated herein by reference. Examples of bioorganic techniques suitable for the activation and derivatization of biomolecules using chemical handles, and instructions for developing such syntheses, can be found in Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, 2nd ed., Elsevier, London (2008). Practitioners can find examples of the techniques and components required for parenteral administration of the biomolecules described herein in Remington, Essentials of Pharmaceutics, Pharmaceutical Press, London (2012). Methods for protein purification, chromatography, electrophoresis, centrifugation and crystallization are described in Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York. Cell-free synthesis methods are described in Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Germany. Methods for incorporating unnatural amino acids into proteins using cell-free synthesis are described in Shimizu et al. (2006) F.E.B.S.

Journal, 273, 4133-4140 и также в Chong (2014) Curr Protoc Mol Biol. 108:16.30.1-11.Journal, 273, 4133-4140 and also in Chong (2014) Curr Protoc Mol Biol. 108:16.30.1-11.

Способы амплификации ПЦР описаны, например, в Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, Calif., 1990 и Domingues (ed.) PCR: Methods and Protocols ISBN 1493970593 (2017). Реакция амплификации, как правило, включает ДНК, которая должна быть амплифицирована, термостабильную ДНК-полимеразу, два олигонуклеотидных праймера, дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ), реакционный буфер и магний. Как правило, желательное количество тепловых циклов составляет от 1 до 25. Способы конструирования праймеров и оптимизации условий ПЦР можно найти в учебниках по молекулярной биологии, таких как Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 5 изд., Wiley, 2002 и Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, 1990. Компьютерные программы полезны при разработке праймеров с требуемой специфичностью и оптимальными свойствами амплификации (например, Oligo, версия 5.0 (National Biosciences)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения праймеры для ПЦР дополнительно содержат сайты распознавания рестрикционных эндонуклеаз для облегчения вставки амплифицированного фрагмента ДНК в специфические сайты рестрикционных ферментов в векторе. Если сайты рестрикции должны быть добавлены к 5'-концу праймеров для ПЦР, предпочтительно включать несколько (например, два или три) дополнительных 5'оснований, чтобы обеспечить более эффективное расщепление ферментом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения праймеры для ПЦР также содержат сайт промотора РНКполимеразы, такой как Т7 или SP6, чтобы обеспечить последующую транскрипцию в условиях in vitro. Способы транскрипции в условиях in vitro можно найти в таких источниках, как Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1663-1667, 1990; Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3010-3014, 1992.PCR amplification methods are described, for example, in Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, Calif., 1990 and Domingues (ed.) PCR: Methods and Protocols ISBN 1493970593 (2017). An amplification reaction typically includes the DNA to be amplified, a thermostable DNA polymerase, two oligonucleotide primers, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), a reaction buffer, and magnesium. Typically, the desired number of thermal cycles is from 1 to 25. Methods for designing primers and optimizing PCR conditions can be found in molecular biology textbooks such as Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Wiley, 2002 and Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, 1990. Computer programs are useful in designing primers with the desired specificity and optimal amplification properties (eg, Oligo, version 5.0 (National Biosciences)). In some embodiments of the present invention, the PCR primers further comprise restriction endonuclease recognition sites to facilitate insertion of the amplified DNA fragment into specific restriction enzyme sites in the vector. If restriction sites are to be added to the 5' end of the PCR primers, it is preferable to include several (eg two or three) additional 5' bases to allow for more efficient enzyme digestion. In some embodiments, the PCR primers also contain an RNA polymerase promoter site, such as T7 or SP6, to allow subsequent transcription under in vitro conditions. In vitro transcription methods can be found in sources such as Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1663-1667, 1990; Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3010-3014, 1992.

Молекулярную массу полисахарида или конъюгата белок-носитель-полисахарид измеряют с помощью гель-проникающей хроматографии (SEC) в комбинации с многоугловым рассеянием лазерного излучения (MALS). Установка SEC MALS-UV-RI состоит из Agilent HPLC 1100 (включая дегазатор, насос для нагнетания четырехкомпонентных смесей, автоматический пробоотборник с регулируемой температурой, отсек колонки с регулируемой температурой и детектор с диодной матрицей UV-VIS) в комбинации с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения DAWN-HELEOS и дифференциальным рефракционным интерферометром Optilab T-rEX (Wyatt Technology, Санта-Барбара, Калифорния, США) для детектирования элюируемых частиц. С этой системой совместимы следующие серии колонок: TSKgel Guard PWXL, внутренний диаметр 6,0 мм х длина 4,0 см, частицы 12 мкм; TSKgel 6000 PWXL, внутренний диаметр 7,8 мм х длина 30 см, частицы 13 мкм; и TSKgel 3000 PWXL, внутренний диаметр 7,8 мм х длина 30 см, частицы 7 мкм. Температура в отсеке колонок установлена на 25°С, и температура в отсеке для образцов установлена на 4°С. Подвижная фаза, состоящая из 1 х ФСБ, профильтрованного через фильтр с размером пор 0,2 мкм, и 5% об./об. ацетонитрила, применяется при скорости потока 0,5 мл/мин. Образцы впрыскивают в диапазоне концентраций 0,2-1,5 мг/мл полисахарида, и впрыскиваемый объем корректируют так, чтобы получить общую впрыснутую массу 30-40 мкг. Программное обеспечение Agilent Open Lab используется для контроля ВЭЖХ, и программное обеспечение Wyatt Astra 7 используется для сбора и анализа данных. Методика позволяет выявить распределение абсолютных молекулярных масс для конъюгатов в образце, и результаты для популяции выражают как среднее значение.The molecular weight of the polysaccharide or carrier protein-polysaccharide conjugate is measured using gel permeation chromatography (SEC) in combination with multi-angle laser scattering (MALS). The SEC MALS-UV-RI setup consists of an Agilent HPLC 1100 (including degasser, quaternary injection pump, temperature-controlled autosampler, temperature-controlled column compartment, and UV-VIS diode array detector) combined with a laser multi-angle detector DAWN-HELEOS and an Optilab T-rEX differential refractive interferometer (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) for detection of eluting particles. The following column series are compatible with this system: TSKgel Guard PWXL, 6.0 mm i.d. x 4.0 cm length, 12 µm particles; TSKgel 6000 PWXL, internal diameter 7.8 mm x length 30 cm, particles 13 µm; and TSKgel 3000 PWXL, internal diameter 7.8 mm x length 30 cm, particles 7 µm. The column compartment temperature is set to 25°C and the sample compartment temperature is set to 4°C. Mobile phase consisting of 1 x PBS filtered through a 0.2 μm pore size filter and 5% v/v. acetonitrile, applied at a flow rate of 0.5 ml/min. Samples are injected at a concentration range of 0.2-1.5 mg/ml polysaccharide and the injected volume is adjusted to obtain a total injected mass of 30-40 μg. Agilent Open Lab software is used for HPLC control, and Wyatt Astra 7 software is used for data acquisition and analysis. The technique reveals the distribution of absolute molecular weights for the conjugates in a sample, and the results for the population are expressed as the average value.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенные капсульные полисахариды S. pneumoniae получают непосредственно из бактерий с применением процедуры выделения, известной обычному специалисту в данной области техники (см, например, способы, описанные в публикациях заявок на патенты США 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, а также 2008/0102498 и WO 2008/118752). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения выделенные капсульные полисахариды S. pneumoniae получают из коммерческого источника (например, АТСС).In some embodiments of the present invention, isolated S. pneumoniae capsular polysaccharides are obtained directly from bacteria using an isolation procedure known to one of ordinary skill in the art (see, for example, the methods described in US Patent Application Publications 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, as well as 2008/0102498 and WO 2008/118752). In other embodiments of the present invention, the isolated S. pneumoniae capsular polysaccharides are obtained from a commercial source (eg, ATCC).

3. Полипептиды.3. Polypeptides.

В настоящем документе описаны полипептиды, содержащие по меньшей мере один остаток нпАК. Подходящие полипептиды включают любой биологически активный полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид представляет собой иммуногенный полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК заменяет нативные остатки указанного полипептида. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК добавлен до, добавлен после или вставлен в пределах последовательности указанного полипептида. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 остатков нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 остатков нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит 2-9 остатков нпАК и предпочтительно 4-6 остатков нпАК. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид содержит 2 или более остатков нпАК, которые отличаются химически.Described herein are polypeptides containing at least one npAA residue. Suitable polypeptides include any biologically active polypeptide. In some embodiments of the present invention, the polypeptide is an immunogenic polypeptide. According to some embodiments of the present invention, the npAK residue replaces native residues of the specified polypeptide. According to other embodiments of the present invention, the npAK residue is added before, added after, or inserted within the sequence of the specified polypeptide. According to additional embodiments of the present invention, the polypeptide contains at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least at least 9 npAA residues. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 nPAA residues. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains 2-9 npAA residues and preferably 4-6 npAA residues. According to additional embodiments of the present invention, the polypeptide contains 2 or more npAA residues that are chemically different.

- 12 044044- 12 044044

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен иммуногенный полипептид, содержащий остаток нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 остатков нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере два остатка неприродных аминокислот содержат по меньшей мере две разные неприродные аминокислоты. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере две разные неприродные аминокислоты выбраны из группы, состоящей из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты или 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит эпитоп, активирующий Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид представляет собой белокноситель. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК не находится в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК заменяет остаток лизина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид конъюгирован с антигеном. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген содержит независимый от Т-клеток антиген, выбранный из группы, состоящей из гаптена, бактериального капсульного полисахарида, бактериального липополисахарида или гликана опухолевого происхождения. Согласно другому варианту реализации антиген содержит бактериальный некапсульный полисахарид, такой как экзополисахарид, например экзополисахарид S.aureus.According to one embodiment of the present invention, an immunogenic polypeptide is provided that contains an npAA moiety. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAA residues. According to another embodiment of the present invention, the at least two unnatural amino acid residues contain at least two different unnatural amino acids. According to another embodiment of the present invention, at least two different unnatural amino acids are selected from the group consisting of 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid acid (pAMF), 2-amino-3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino -3-(6-(azidomethyl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid or 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains a T cell activating epitope of a carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide is a protein carrier. According to another embodiment of the present invention, npAK is not located in the T-cell activating epitope of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, npAK replaces the lysine residue. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide is conjugated to an antigen. According to another embodiment of the present invention, the antigen is conjugated to the npAK. According to another embodiment of the present invention, the antigen comprises a T cell independent antigen selected from the group consisting of a hapten, a bacterial capsular polysaccharide, a bacterial lipopolysaccharide, or a tumor-derived glycan. In another embodiment, the antigen comprises a bacterial non-capsular polysaccharide, such as an exopolysaccharide, such as S. aureus exopolysaccharide.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен белок-носитель, содержащий остаток нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 остатков нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения неприродная аминокислота выбрана из группы, состоящей из 2-амино-3-(4азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты или 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК заменяет остаток лизина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения остаток нпАК находится в положении, которое не находится в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения замена выбрана из группы, состоящей из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 и K527, а также любой их комбинации из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения замена содержит комбинацию K25, K213, K245, K265, K386 и K523 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель содержит антиген. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген содержит независимый от Т-клеток антиген, выбранный из группы, состоящей из гаптена, бактериального капсульного полисахарида, бактериального липополисахарида или гликана опухолевого происхождения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид способен вызывать иммунный ответ, зависящий от Т-клеток.According to one embodiment of the present invention, a carrier protein is provided that contains an npAK residue. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 residues npAK. According to another embodiment of the present invention, the unnatural amino acid is selected from the group consisting of 2-amino-3-(4azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino -3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl )pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid or 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, npAA replaces the lysine residue. According to another embodiment of the present invention, the npAK residue is located at a position that is not found in a T cell activating epitope of the carrier protein. In another embodiment of the present invention, the replacement is selected from the group consisting of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 and K527, and any combination thereof from SEQ ID NO: 1. In another embodiment implementation of the present invention, the replacement contains a combination of K25, K213, K245, K265, K386 and K523 from SEQ ID NO: 1. In another embodiment of the present invention, the carrier protein comprises an antigen. According to another embodiment of the present invention, the antigen comprises a T cell independent antigen selected from the group consisting of a hapten, a bacterial capsular polysaccharide, a bacterial lipopolysaccharide, or a tumor-derived glycan. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide is capable of inducing a T-cell dependent immune response.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен белок, содержащий антиген, конъюгированный с остатком аминокислоты белка-носителя, причем ни один антиген не конъюгирован с остатком природной аминокислоты белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения ни один антиген не конъюгирован с остатком лизина белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминокислота не находится в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген содержит независимый от Т-клеток антиген, выбранный из группы, состоящей из гаптена, бактериального капсульного полисахарида, бактериального липополисахарида или гликана опухолевого происхождения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации.According to one embodiment of the present invention, there is provided a protein comprising an antigen conjugated to an amino acid residue of a carrier protein, wherein neither antigen is conjugated to a natural amino acid residue of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, no antigen is conjugated to a lysine residue of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the amino acid is not located in the T cell activating epitope of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the antigen comprises a T cell-independent antigen selected from the group consisting of a hapten, a bacterial capsular polysaccharide, a bacterial lipopolysaccharide, or a tumor-derived glycan. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide from a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof.

В оптимальном случае белок-носитель должен иметь растворимость по меньшей мере 50 мг/л (например, по меньшей мере 100 мг/л, по меньшей мере 150 мг/л, по меньшей мере 200 мг/л или по меньшей мере 250 мг/л) при экспрессии в системе бесклеточного синтеза белка.Optimally, the carrier protein should have a solubility of at least 50 mg/L (e.g., at least 100 mg/L, at least 150 mg/L, at least 200 mg/L, or at least 250 mg/L ) when expressed in a cell-free protein synthesis system.

- 13 044044- 13 044044

В случае если носитель содержит более одного остатка нпАК, предпочтительно включать только один вид нпАК (например, единственной нпАК в носителе является pAMF). Это позволяет использовать одну и ту же химическую реакцию конъюгации одновременно на каждой нпАК. Если желательно прикрепить два разных антигена к одной молекуле носителя, это может быть достигнуто путем применения разных видов нпАК в одном носителе и конъюгирования каждого антигена с разной нпАК, но предпочтительным является конъюгирование с одним видом нпАК в носителе. Более того, если композиция содержит несколько различных конъюгатов (например, различные серотипы пневмококка), каждый конъюгат предпочтительно содержит один идентичный вид нпАК. Кроме того, если композиция содержит несколько разных конъюгатов (например, различные серотипы пневмококка), каждый конъюгат предпочтительно содержит один и тот же белок-носитель.In the event that the carrier contains more than one nPAA residue, it is preferable to include only one type of nPAA (eg, the only nPAA in the carrier is pAMF). This allows the same conjugation chemistry to be used simultaneously on each npAK. If it is desired to attach two different antigens to a single carrier molecule, this can be achieved by using different species of nPAA in the same carrier and conjugating each antigen to a different nPAA, but conjugation to a single species of nPAA in the carrier is preferred. Moreover, if the composition contains several different conjugates (eg, different serotypes of pneumococcus), each conjugate preferably contains one identical type of npAK. In addition, if the composition contains several different conjugates (eg, different serotypes of pneumococcus), each conjugate preferably contains the same carrier protein.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид, описанный в настоящем документе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, описанный в настоящем документе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии.According to another embodiment of the present invention, there is provided a polynucleotide encoding a polypeptide described herein. According to another embodiment of the present invention, there is provided an expression vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide described herein. According to another embodiment of the present invention, a host cell containing an expression vector is provided.

4. Неприродные аминокислоты.4. Unnatural amino acids.

Остаток нпАК необязательно содержит любую из неприродных аминокислот, описанных в настоящей заявке, или другие, которые были идентифицированы как совместимые с клеточным или бесклеточным синтезом белка (см., например, Schultz et al. Annu Rev Biochem. 2010; 79:413-44, в частности, pp. 418-420; и Chin et al. Annu Rev Biochem. 2014;83:5.1-5.30, которые включены в настоящий документ посредством ссылки).The npAA moiety optionally contains any of the unnatural amino acids described herein or others that have been identified as compatible with cellular or cell-free protein synthesis (see, e.g., Schultz et al. Annu Rev Biochem. 2010; 79:413-44, in particular, pp. 418-420; and Chin et al. Annu Rev Biochem. 2014;83:5.1-5.30, which are incorporated herein by reference).

Примеры неприродных аминокислот, которые можно применять в способах вариантов реализации, включают неприродный аналог аминокислоты тирозин; неприродный аналог глутаминовой аминокислоты; неприродный аналог аминокислоты фенилаланин; неприродный аналог аминокислоты серин; неприродный аналог аминокислоты треонин; алкил, арил, ацил, азидо, циано, галоген, гидразин, гидразид, гидроксил, алкенил, алкинил, простой эфир, тиол, сульфонил, селено, сложный эфир, тиокислоту, борат, боронат, фосфо, фосфоно, фосфин, гетероцикло, енон, имин, альдегид, гидроксиламин, кето или аминозамещенную аминокислоту или любую их комбинацию; аминокислоту с фотоактивируемым поперечно сшивающим агентом; спин-меченую аминокислоту; флуоресцентную аминокислоту; аминокислоту с новой функциональной группой; аминокислоту, которая ковалентно или нековалентно взаимодействует с другой молекулой; связывающую металл аминокислоту; содержащую металл аминокислоту; радиоактивную аминокислоту; фотозапертую и/или фотоизомеризуемую аминокислоту; аминокислоту, содержащую биотин или аналог биотина; гликозилированную или модифицированную углеводом аминокислоту; кетосодержащую аминокислоту; аминокислоты, содержащие полиэтиленгликоль или простой полиэфир; аминокислоту, замещенную атомом тяжелого элемента; химически расщепляемую или фоторасщепляемую аминокислоту; аминокислоту с удлиненной боковой цепью; аминокислоту, содержащую токсичную группу; замещенную сахаром аминокислоту, например, замещенный сахаром серин или тому подобное; соединенную за счет углерода сахаросодержащую аминокислоту; активную в окислительновосстановительных реакциях аминокислоту; α-гидроксисодержащую кислоту; аминокислоту, содержащую аминотиокислоту; α,α-дизамещенную аминокислоту; β-аминокислоту; циклическую аминокислоту, отличную от пролина, и т.д.Examples of non-natural amino acids that can be used in the methods of embodiments include the non-natural amino acid analogue tyrosine; unnatural analogue of glutamic amino acid; an unnatural analogue of the amino acid phenylalanine; an unnatural analogue of the amino acid serine; an unnatural analogue of the amino acid threonine; alkyl, aryl, acyl, azido, cyano, halogen, hydrazine, hydrazide, hydroxyl, alkenyl, alkynyl, ether, thiol, sulfonyl, selenium, ester, thioacid, borate, boronate, phospho, phosphono, phosphine, heterocyclo, enone, an imine, aldehyde, hydroxylamine, keto or amino amino acid, or any combination thereof; an amino acid with a photoactivatable cross-linker; spin-labeled amino acid; fluorescent amino acid; an amino acid with a new functional group; an amino acid that interacts covalently or non-covalently with another molecule; metal binding amino acid; metal-containing amino acid; radioactive amino acid; photolocked and/or photoisomerizable amino acid; an amino acid containing biotin or a biotin analogue; glycosylated or carbohydrate-modified amino acid; ketogenic amino acid; amino acids containing polyethylene glycol or polyether; an amino acid replaced by an atom of a heavy element; a chemically cleavable or photocleavable amino acid; an amino acid with an extended side chain; an amino acid containing a toxic group; a sugar-substituted amino acid, for example, a sugar-substituted serine or the like; a carbon-linked sugar-containing amino acid; amino acid active in redox reactions; α-hydroxy acid; an amino acid containing an amino thioacid; α,α-disubstituted amino acid; β-amino acid; a cyclic amino acid other than proline, etc.

Особенно предпочтительными нпАК для применения с настоящим изобретением являются те, которые могут быть включены во время трансляции (в клеточную или бесклеточную систему) и которые обеспечивают функциональную группу, которая не встречается ни в одной из 20 природных аминокислот. Известны различные методики включения таких аминокислот в полипептиды, например, см. Young & Schultz (2010) J Biol Chem 285:11039-44, Maza et al. (2015) Bioconjugate Chem. 26:1884-9 и Zimmerman et al. (2014) Bioconjugate Chem. 25:351-61.Particularly preferred nPAAs for use with the present invention are those that can be incorporated during translation (in a cellular or cell-free system) and that provide a functional group that does not occur in any of the 20 naturally occurring amino acids. Various techniques are known to incorporate such amino acids into polypeptides, for example see Young & Schultz (2010) J Biol Chem 285:11039-44, Maza et al. (2015) Bioconjugate Chem. 26:1884-9 and Zimmerman et al. (2014) Bioconjugate Chem. 25:351-61.

В частности, остаток нпАК необязательно содержит химическую группу, подходящую для реакции клик-химии с соответствующей группой на отдельной молекуле антигена или гаптена. Химические группы, подходящие для клик-химии включают, но не ограничиваются ими, азидную (N3), алкиновуюIn particular, the npAA residue optionally contains a chemical group suitable for a click chemistry reaction with the corresponding group on a single antigen or hapten molecule. Chemical groups suitable for click chemistry include, but are not limited to, azide (N3), alkyne

(С=С), алкеновую (С=С) и 1,2,4,5-тетразиновую ( ^N-N ) группы.(C=C), alkene (C=C) and 1,2,4,5-tetrazine ( ^NN ) groups.

Конъюгат содержит полипептид и антиген, причем указанный полипептид представляет собой белок-носитель, содержащий по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере одну нпАК, предпочтительно по меньшей мере две нпАК, при этом указанный антиген конъюгирован с по меньшей мере одной нпАК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК представляет собой 2,3-дизамещенную пропановую кислоту, содержащую амино-заместитель в положении 2 и азидосодержащий заместитель, 1,2,4,5-тетразинилсодержащий заместитель или этинилсодержащий заместитель в положении 3.The conjugate contains a polypeptide and an antigen, wherein said polypeptide is a carrier protein containing at least one T-cell activating epitope and at least one sAA, preferably at least two sAA, wherein said antigen is conjugated to at least one NPAK. In some embodiments, the at least one nPAA is a 2,3-disubstituted propanoic acid containing an amino substituent at the 2-position and an azide-containing substituent, a 1,2,4,5-tetrazinyl-containing substituent, or an ethynyl-containing substituent at the 3-position.

Согласно другому связанному варианту реализации настоящего изобретения конъюгат содержит полипептид и антиген, причем указанный полипептид представляет собой белок-носитель, содержащийAccording to another related embodiment of the present invention, the conjugate contains a polypeptide and an antigen, wherein said polypeptide is a carrier protein containing

- 14 044044 по меньшей мере один эпитоп, активирующий Т-клетки, и по меньшей мере один остаток нпАК, при этом указанный антиген конъюгирован с нпАК и при этом также остаток нпАК соответствует аминокислоте, имеющей структуру формулы XII- 14 044044 at least one T-cell activating epitope and at least one npAK residue, wherein said antigen is conjugated to npAK and wherein the npAK residue also corresponds to an amino acid having the structure of formula XII

W⁵ выбран из С₁-С₁₀- алкилена, -NH-, -О- и -S-;W ⁵ is selected from C ₁ -C ₁₀ - alkylene, -NH-, -O- and -S-;

Q1 равен нулю или 1 иQ1 is zero or 1 and

W⁶ выбран из азидо, 1,2,4,5-тетразинила, необязательно С-замещенного низшей алкильной группой, и этинила, так что остаток нпАК в полипептиде имеет структуру формулы XIII W⁶ W ⁶ is selected from azido, 1,2,4,5-tetrazinyl, optionally C-substituted with a lower alkyl group, and ethynyl, such that the npAA residue in the polypeptide has the structure of formula XIII W ⁶

II

О АгOh Ag

R³ ΗΝ_χ R ³ ΗΝ _χ

R⁴ (XIII) где R³ представляет собой ОН или остаток аминокислоты белка-носителя, и R⁴ представляет собой Н или остаток аминокислоты белка-носителя.R ⁴ (XIII) where R ³ represents OH or an amino acid residue of a carrier protein, and R ⁴ represents H or an amino acid residue of a carrier protein.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере одну нпАК, которая заменяет природную аминокислоту в нативном полипептиде в соответствии с SEQ ID NO: 1, причем по меньшей мере одна нпАК заменяет K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 или К527 из SEQ ID NO: 1, при этом нпАК содержит соединяющий фрагмент. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заменен K265 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заменен K386 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заменены K265 и K386 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из 2-амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты и 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановой кислоты или любой их комбинации.According to one embodiment of the present invention, there is provided a polypeptide comprising at least one nPAA that replaces a naturally occurring amino acid in a native polypeptide in accordance with SEQ ID NO: 1, wherein at least one nPAA replaces K25, K34, K38, K40, K213, K215 , K228, K245, K265, K386, K523 or K527 from SEQ ID NO: 1, wherein npAK contains a connecting fragment. According to another embodiment of the present invention, the nPAA is selected from 2-amino-3(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3 -(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl)pyridine -3-yl)propanoic acid, 2-amino-5azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof. In another embodiment of the present invention, K265 of SEQ ID NO: 1 is replaced. In another embodiment, K386 of SEQ ID NO: 1 is replaced. In another embodiment, K265 and K386 of SEQ ID NO: 1 are replaced. implementation of the present invention, the polypeptide contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8 or at least 9 npAA. According to another embodiment of the present invention, the npAA is selected from 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3 -(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl)pyridine -3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid or any combination thereof.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК в полипептиде представляет собой 2,3-дизамещенную пропановую кислоту, содержащую амино-заместитель в положении 2 и азидосодержащий заместитель, 1,2,4,5-тетразинилсодержащий заместитель или этинилсодержащий заместитель в положении 3. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения заместитель в положении 3 представляет собой азидосодержащий заместитель, и в более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения азидосодержащий заместитель содержит концевую азидогруппу, связанную с атомом углерода в положении 3 за счет соединяющей группы. Например, соединяющая группа может содержать ариленовый фрагмент, который необязательно замещен и необязательно содержит гетероатом. Например, соединяющая (линкерная) группа может содержать 5- или 6членный ариленовый фрагмент, содержащий от 0 до 4 гетероатомов и от 0 до 4 неводородных кольцевых заместителей.In another embodiment, the npAA in the polypeptide is a 2,3-disubstituted propanoic acid containing an amino substituent at position 2 and an azide substituent, a 1,2,4,5-tetrazinyl substituent, or an ethynyl substituent at position 3. In a preferred embodiment In embodiments of the present invention, the substituent at position 3 is an azido-containing substituent, and in a more preferred embodiment of the present invention, the azido-containing substituent contains a terminal azido group linked to the carbon atom at position 3 by a connecting group. For example, the connecting group may contain an arylene moiety, which is optionally substituted and optionally contains a heteroatom. For example, the connecting (linker) group may contain a 5- or 6-membered arylene moiety containing from 0 to 4 heteroatoms and from 0 to 4 non-hydrogen ring substituents.

- 15 044044- 15 044044

В более предпочтительном варианте реализации нпАК имеет структуру формулы XIIIn a more preferred embodiment, nPAA has the structure of formula XII

W⁶ W ⁶

I (W^QII(W^QI

N^H2 (ХИ) где Ar содержит 5-членное или 6-членное ароматическое кольцо, необязательно содержащее по меньшей мере один гетероатом;N ^H 2 (CI) where Ar contains a 5-membered or 6-membered aromatic ring, optionally containing at least one heteroatom;

W⁵ выбран из C₁-C_1o- алкилена, -NH-, -О- и -S-;W ⁵ is selected from C ₁ -C _1o - alkylene, -NH-, -O- and -S-;

Q1 равен нулю или 1 иQ1 is zero or 1 and

Следует понимать, что в этом случае соответствующий остаток нпАК в полипептиде имеет структуру формулы XIIIIt should be understood that in this case the corresponding npAA residue in the polypeptide has the structure of formula XIII

W⁶ W ⁶

II

О АгOh Ag

⁴R⁴ (XIII) где R³ представляет собой ОН или остаток аминокислоты белка-носителя, и R⁴ представляет собой Н или остаток аминокислоты белка-носителя. ⁴ R ⁴ (XIII) where R ³ represents OH or an amino acid residue of a carrier protein, and R ⁴ represents H or an amino acid residue of a carrier protein.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Ar не содержит какие-либо гетероатомы, причем в этом случае предпочтительный линкер представляет собой незамещенную фениленовую группу (т.е. Ar представляет собой -C6H4-). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения Ar содержит гетероатом азота и по меньшей мере один дополнительный гетероатом, выбранный из N, О и S. Примерные азотсодержащие гетероциклы описаны ниже, и Ar может представлять собой, например, пиридин или пиридазин. Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения Q1 равен 1, W представляет собой низший алкилен, и W представляет собой азидо.In some embodiments, Ar does not contain any heteroatoms, in which case the preferred linker is an unsubstituted phenylene group (ie, Ar is -C6H4-). In other embodiments, Ar contains a nitrogen heteroatom and at least one additional heteroatom selected from N, O, and S. Exemplary nitrogen-containing heterocycles are described below, and Ar may be, for example, pyridine or pyridazine. According to a particularly preferred embodiment of the present invention, Q1 is 1, W is lower alkylene, and W is azido.

Азидосодержащие аминокислоты.Azide-containing amino acids.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит азидосодержащую нпАК. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит азидосодержащую нпАК формулы IIn some embodiments of the present invention, the npAA moiety comprises an azide-containing npAK. In specific embodiments of the present invention, the nPAA moiety comprises an azide-containing nPAA of Formula I

где D представляет собой -Ar-W3- или -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-;where D represents -Ar-W3- or -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-;

Ar представляет собой каждый из W1, W2 и W3 независимо представляет собой одинарную химическую связь или низший алкилен;Ar represents each of W1, W2 and W3 independently represents a single chemical bond or lower alkylene;

каждый X1 независимо представляет собой -NH-, -О- или -S-;each X1 independently represents -NH-, -O- or -S-;

каждый Y1 независимо представляет собой одинарную химическую связь, -NH- или -О-;each Y1 independently represents a single chemical bond, -NH- or -O-;

каждый Y2 независимо представляет собой одинарную химическую связь, -NH-, -О- или Nсоединенный или С-соединенный пирролидинилен и один из Z1, Z2 и Z₃ представляет собой -N- и другие из Z1, Z2 и Z₃ независимо представляют собойeach Y2 is independently a single chemical bond, -NH-, -O- or N-linked or C-linked pyrrolidinylene and one of Z1, Z2 and Z ₃ is -N- and the others of Z1, Z2 and Z ₃ are independently

-СН-.-SN-.

- 16 044044- 16 044044

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит азидосодержащую аминокислоту формулы IIIn other embodiments of the present invention, the npAA moiety comprises an azide-containing amino acid of formula II

где W4 представляет собой C₁-С₁₀-алкилен.where W4 represents C ₁ -C ₁₀ -alkylene.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит азидосодержащую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 2- амино-3-(4-азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4- (азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5(азидометил)пиридин-2- ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2- амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5-азидопентановой кислоты или 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты и любой их комбинации. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит 2-амино-3-(4(азидометил)фенил)пропановую кислоту (pAMF). pAMF обеспечивает очень благоприятную кинетику реакции для получения конъюгатов (например, намного более быструю, чем при применении pAF в реакции с алкинсодержащим углеводным антигеном в методе SPAAC).According to one embodiment of the present invention, the npAA moiety comprises an azido-containing amino acid selected from the group consisting of 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid acid (pAMF), 2-amino-3-(5(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino- 3-(6-(azidomethyl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid or 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid and any combination thereof. According to a further embodiment of the present invention, the npAA moiety comprises 2-amino-3-(4(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF). pAMF provides very favorable reaction kinetics for the preparation of conjugates (eg, much faster than using pAF in the reaction with an alkyne-containing carbohydrate antigen in the SPAAC method).

Получение азидосодержащих аминокислот в соответствии с формулами I и II может быть найдено, например, в Stafford et al. US2014-0066598A1, в частности абзацы [0331]-[0333], которые включены посредством ссылки. Способ включает замену хлоридом гидроксильных групп на производных соответствующих ариламинокислот с применением тионилхлорида с последующим нуклеофильным замещением хлорида азидом. Подходящие аминокислоты, содержащие арильную боковую цепь, также могут быть приобретены коммерчески.The preparation of azide-containing amino acids according to formulas I and II can be found, for example, in Stafford et al. US2014-0066598A1, particularly paragraphs [0331]-[0333], which are incorporated by reference. The method involves replacing hydroxyl groups on derivatives of the corresponding arylamino acids with chloride using thionyl chloride, followed by nucleophilic substitution of the chloride with an azide. Suitable amino acids containing an aryl side chain can also be purchased commercially.

1,2,4,5-Тетразинилсодержащие аминокислоты.1,2,4,5-Tetrazinyl-containing amino acids.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения неприродный остаток аминокислоты содержит нпАК, содержащую 1,2,4,5-тетразин. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения неприродная аминокислота содержит нпАК, содержащую 1,2,4,5-тетразин, формулы III где Ar представляет собойAccording to some embodiments of the present invention, the non-natural amino acid residue comprises an nPAA containing 1,2,4,5-tetrazine. In specific embodiments of the present invention, the unnatural amino acid comprises a 1,2,4,5-tetrazine-containing nPAA of formula III wherein Ar is

V представляет собой простую химическую связь, низший алкилен или -W1-W2-;V represents a single chemical bond, lower alkylene or -W1-W2-;

один из W1 и W2 отсутствует или представляет собой низший алкилен, и другой представляет собой -NH-, -О- или -S-;one of W1 and W2 is absent or lower alkylene, and the other is -NH-, -O- or -S-;

каждый из Z1, Z₂ и Z₃ представляет собой -СН- или -N-, и каждый из других Z1, Z₂ и Z₃ независимо представляет собой -СН-; и X1 независимо представляет собой -NH-, -О- или -S-;each of Z1, Z ₂ and Z ₃ is -CH- or -N-, and each of the other Z1, Z ₂ and Z ₃ is independently -CH-; and X1 is independently -NH-, -O- or -S-;

R представляет собой низший алкил;R represents lower alkyl;

и необязательно если Ar представляет собой и V представляет собой -NH-, то один из Z1, Z2 иand optionally if Ar is and V is -NH-, then one of Z1, Z2 and

Z3 представляет собой -N-, при условии, что неприродная аминокислота не является:Z3 is -N-, provided that the unnatural amino acid is not:

Получение 1,2,4,5-тетразинсодержащих аминокислот в соответствии с формулой III можно найти, например, в Yang et al. US2016-0251336A1, в частности, абзацы [0341]-[0377], который включен посредством ссылки. Способ включает реакцию Негиши для связывания амино/карбоксил-защищенного производного (R)-2-амино-3-йодпропановой кислоты с аминопиридилбромидом для введения Ar с последующей реакцией с метилтио-производным 1,2,4,5-тетразина для введения тетразинового фрагмента в аминокислоту.The preparation of 1,2,4,5-tetrazine-containing amino acids according to formula III can be found, for example, in Yang et al. US2016-0251336A1, particularly paragraphs [0341]-[0377], which is incorporated by reference. The method involves a Negishi reaction to couple an amino/carboxyl-protected derivative of (R)-2-amino-3-iodopropanoic acid with aminopyridyl bromide to introduce Ar, followed by a reaction with a methylthio derivative of 1,2,4,5-tetrazine to introduce a tetrazine moiety into amino acid.

- 17 044044- 17 044044

Алкинсодержащие аминокислоты.Alkine-containing amino acids.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит алкинсодержащую нпАК. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения это пропаргильная группа. Различные пропаргилсодержащие аминокислоты, включая их синтез, можно найти в Beatty et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7364-7; Beatty et al. J. Am. Chem. Soc. 2005(127): 14150-1; Nguyen et al. J Am Chem Soc. 2009(13l1):8720-1. Такие пропаргилсодержащие аминокислоты пригодны для включения в качестве нпАК в белки с применением систем на основе клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК содержит пропаргилсодержащую нпАК, выбранную из группы, состоящей из гомопропаргилглицина, этинилфенилаланина и N6-[(2-пропинилокси)карбонил]L-лизина.In some embodiments of the present invention, the npAA moiety comprises an alkyne-containing npAA. According to one embodiment of the present invention, this is a propargyl group. Various propargyl-containing amino acids, including their synthesis, can be found in Beatty et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7364-7; Beatty et al. J. Am. Chem. Soc. 2005(127): 14150-1; Nguyen et al. J Am Chem Soc. 2009(13l1):8720-1. Such propargyl-containing amino acids are suitable for incorporation as nPAAs into proteins using cell-based systems. In some embodiments of the present invention, the npAA moiety comprises a propargyl-containing npAA selected from the group consisting of homopropargylglycine, ethynylphenylalanine, and N6-[(2-propynyloxy)carbonyl]L-lysine.

5. Модифицированные белки-носители.5. Modified carrier proteins.

Согласно одному аспекту полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток нпАК, представляет собой модифицированный вариант нативного белка-носителя (например, eCRM) или полипептид, содержащий один или множество эпитопов, активирующих Т-клетки, нативного белка-носителя. Белки-носители, пригодные для такой модификации, включают, но не ограничиваются ими, белки, применяемые в конъюгированных вакцинах, такие как токсин Corynebacterium diphtheriae, тетаноспазмин Clostridium tetani, белок D Haemophilus influenzae (PD, HiD), комплекс белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) или CRM197.In one aspect, the polypeptide comprising at least one npAK residue is a modified version of a native carrier protein (eg, eCRM) or a polypeptide containing one or more T cell activating epitopes of the native carrier protein. Carrier proteins suitable for such modification include, but are not limited to, proteins used in conjugate vaccines such as Corynebacterium diphtheriae toxin, Clostridium tetani tetanospasmin, Haemophilus influenzae protein D (PD, HiD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMRS) or CRM197.

Аминокислотные или нуклеиновые последовательности многих нативных белков-носителей общедоступны. Однако, как отмечено, такие немодифицированные (или нативные) белки-носители имеют ограничения, включая недискриминационное конъюгирование антигена с любой аминокислотой, экспонируемой на поверхности. В результате этого активирующие Т-клетки эпитопы часто являются сайтами, в которых происходит конъюгация антигена. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения иммуногенный полипептид представляет собой белок-носитель, модифицированный за счет включения по меньшей мере одного остатка нпАК для применения в качестве сайта конъюгации. Как обсуждалось выше, нпАК может заменять нативный остаток или может быть добавлена к полипептиду за счет добавления перед, добавления после или вставки в пределах последовательности полипептида. Применение неприродных аминокислот, как описано в настоящем документе, позволяет селективно размещать неприродные аминокислоты для конъюгации, в результате этого можно избежать вовлечения эпитопов, активирующих Т-клетки, улучшенного белка-носителя при конъюгации антигена.The amino acid or nucleic acid sequences of many native carrier proteins are publicly available. However, as noted, such unmodified (or native) carrier proteins have limitations, including non-discriminatory conjugation of the antigen to any surface-exposed amino acid. As a result, T cell-activating epitopes are often the sites at which antigen conjugation occurs. In a preferred embodiment of the present invention, the immunogenic polypeptide is a carrier protein modified to include at least one npAA residue for use as a conjugation site. As discussed above, an npAK can replace a native residue or can be added to a polypeptide by adding before, adding after, or inserting within the sequence of the polypeptide. The use of unnatural amino acids, as described herein, allows the selective placement of unnatural amino acids for conjugation, thereby avoiding the involvement of T cell activating epitopes of the improved carrier protein during antigen conjugation.

В табл. 1 показаны аминокислотные и нуклеиновые последовательности (SEQ ID NO: 1 и 2) примерного нативного белка-носителя: CRM197. Специалисты в данной области техники распознают добавление N-концевого метионина к аминокислотной последовательности обычного CRM197, полученного с помощью ферментации C.diphtheriae, и как следствие добавление 1 к обычной нумерации положений остатков аминокислот. Метионин присутствует из-за включения стартового кодона в способе бесклеточного синтеза белка, который применяли для получения этих носителей согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым аспектам последовательность улучшенного белка-носителя, содержащего остатки нпАК, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична последовательности гомологичного нативного или нетоксичного белканосителя, применяемого в конъюгированной вакцине.In table 1 shows the amino acid and nucleic acid sequences (SEQ ID NOs: 1 and 2) of an exemplary native carrier protein: CRM197. Those skilled in the art will recognize the addition of an N-terminal methionine to the amino acid sequence of conventional CRM197 produced by C. diphtheriae fermentation, and the resulting addition of 1 to the usual numbering of amino acid residue positions. Methionine is present due to the inclusion of a start codon in the cell-free protein synthesis method used to produce these carriers according to the present invention. In some aspects, the sequence of the improved carrier protein containing npAK residues is at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% identical to the sequence of a homologous native or non-toxic carrier protein used in conjugate vaccine.

Белки-носители, последовательности которых идентичны SEQ ID NO: 1 (CRM197), включают другие мутантные белки дифтерийного токсина, такие как нетоксичный двойной мутант К51Е/Е148К, который также применяется в качестве белка-носителя в конъюгатах (Pecetta et al. 2016 Vaccine 34:1405-11). Во всех этих вариантах SEQ ID NO: 1 отсутствует природная токсичность дифтерийного токсина дикого типа (за счет мутации G52E в CRM197, или мутаций К51Е/Е148К согласно Pecetta et al.).Carrier proteins with sequence identity to SEQ ID NO: 1 (CRM197) include other mutant diphtheria toxin proteins, such as the non-toxic double mutant K51E/E148K, which is also used as a carrier protein in conjugates (Pecetta et al. 2016 Vaccine 34 :1405-11). All of these variants of SEQ ID NO: 1 lack the inherent toxicity of wild-type diphtheria toxin (due to the G52E mutation in CRM197, or the K51E/E148K mutations according to Pecetta et al.).

В табл. 1 также показана аминокислотная последовательность белка D (SEQ ID NO: 8) из H.influenzae. Последовательность улучшенного белка-носителя, содержащего остатки нпАК, может быть по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 8. По меньшей мере один остаток Lys в SEQ ID NO: 8 может быть заменен нпАК. В SEQ ID NO: 8 содержится 36 остатков Lys, поэтому некоторые из них могут быть заменены нпАК и затем могут применяться для конъюгации.In table 1 also shows the amino acid sequence of protein D (SEQ ID NO: 8) from H. influenzae. The sequence of the improved carrier protein containing npAK residues may be at least 80% identical to SEQ ID NO: 8. At least one Lys residue in SEQ ID NO: 8 can be replaced by npAK. SEQ ID NO: 8 contains 36 Lys residues, so some of them can be replaced by npAA and then used for conjugation.

В случае если идентичность последовательности определяется относительно дифтерийного или столбнячного токсина, ее следует определять относительно подвергнутой процессингу последовательности тяжелой цепи, например, относительно аминокислот 226-567 из Р00588-1 или аминокислот 458-1315 из Р04958-1 (последовательности UniProt).If sequence identity is determined relative to diphtheria or tetanus toxin, it should be determined relative to the processed heavy chain sequence, for example, relative to amino acids 226-567 of P00588-1 or amino acids 458-1315 of P04958-1 (UniProt sequence).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения улучшенный белок-носитель, содержащий остатки нпАК, содержит неполную нативную последовательность белка-носителя и вместо этого содержит по меньшей мере один или множество эпитопов, активирующих Т-клетки, из токсина Corynebacterium diphtheriae, тетаноспазмина Clostridium tetani, белка D Haemophilus influenzae (PD, HiD), комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС), CRM197, Pfs25 или другого пригодного нативного или нетоксичного белка-носителя. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения токсичность улучшенного белка-носителя ограничивается обработкой параформальдегидом (или обработкой формальдегидом или глутаровым альдегидом) и затем нейтрализующимAccording to some embodiments of the present invention, an improved carrier protein containing npAK residues contains a partial native sequence of the carrier protein and instead contains at least one or a plurality of T cell activating epitopes from Corynebacterium diphtheriae toxin, Clostridium tetani tetanospasmin, protein D Haemophilus influenzae (PD, HiD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), CRM197, Pfs25, or other suitable native or non-toxic carrier protein. In some embodiments of the present invention, the toxicity of the improved carrier protein is limited by treatment with paraformaldehyde (or treatment with formaldehyde or glutaraldehyde) and then neutralizing

- 18 044044 агентом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения улучшенный белок-носитель, содержащий остатки нпАК, представляет собой полипептид, содержащий множество эпитопов, активирующих Т-клетки, нативного CRM197.- 18 044044 agent. According to one embodiment of the present invention, the improved carrier protein containing npAK residues is a polypeptide containing multiple T cell activating epitopes of native CRM197.

Таблица 1Table 1

Нативные аминокислотные и нуклеиновые последовательности CRM197 и NTHi-DNative amino acid and nucleic acid sequences of CRM197 and NTHi-D

Аминокислотная Amino acid >4АЕ1_В MGADDWDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEF YSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTE PLMEQVGTEEFIKRFGDGASRWLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRG KRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKM SESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVI DSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVG ELVDIGFAAYNFVESIINLFQWHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIR TGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDG DVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNS klslffeiks (SEQ Ш NO: 1) >4AE1_B MGADDWDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEF YSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTE PLMEQVGTEEFIKRFGDGASRWLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRG KRGQDAMYEYMAQACAGNR VRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKM SESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVI DSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVG ELVDIGFAAYNFVESIINLFQWHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDG YAVSWNTVEDSIIR TGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDG DVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNS klslffeiks (SEQ Ш NO: 1) Нуклеиновая Nucleic >KU521393.1 Клон синтетической конструкции pUC57CRM197, ген токсина CRM197 (CRM197), полная кодирующая последовательность ATGGGCGCAGACGATGTTGTGGACTCAAGTAAATCATTTGTCATGGAAAACTTC TCCTCATATCACGGCACGAAACCGGGCTACGTTGATAGCATTCAGAAAGGTATCCAAAA ACCGAAATCTGGCACGCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAAGAATTCTACAGCACCG ACAACAAATATGATGCGGCCGGTTACTCAGTCGACAACGAAAATCCGCTGTCGGGCAAA GCCGGCGGTGTGGTTAAAGTGACGTATCCGGGCCTGACCAAAGTCCTGGCCCTGAAAGT GGATAATGCAGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGAGCCTGACGGAACCGCTGATGG AACAGGTTGGCACCGAAGAATTTATCAAACGCTTCGGCGATGGTGCCAGTCGTGTCGTG CTGTCCCTGCCGTTCGCAGAAGGTAGCTCTAGTGTGGAATATATTAACAATTGGGAACA AGCGAAAGCCCTGTCCGTTGAACTGGAAATCAACTTTGAAACCCGCGGCAAACGTGGTC AGGATGCGATGTATGAATACATGGCACAAGCTTGCGCGGGTAATCGCGTTCGTCGCAGC GTCGGCTCCTCACTGTCTTGTATCAACCTGGACTGGGATGTTATCCGTGATAAAACCAA AACGAAAATCGAAAGTCTGAAAGAACATGGCCCGATCAAAAACAAAATGAGCGAATCTC >KU521393.1 Clone of the synthetic construct pUC57CRM197, CRM197 toxin gene (CRM197), complete coding sequence ATGGGCGCAGACGATGTTGTGGACTCAAGTAAATCATTTGTCATGGAAAACTTC TCCTCATATCACGGCACGAAACCGGGCTACGTTGATAGCATTCAGAAAGGTATCCAAAA ACCGAAATCTGGCACGCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAAGAATTCTACAGCACCG ACAACAAATATGATGCGGCCGGTTACTCAGTCGACAACGAAAATCCGCTGTCGGGCAAA GCCGGCGGTGTGGTTAAA GTGACGTATCCGGGCCTGACCAAAGTCCTGGCCCTGAAAGT GGATAATGCAGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGAGCCTGACGGAACCGCTGATGG AACAGGTTGGCACCGAAGAATTTATCAAACGCTTCGGCGATGGTGCCAGTCGTGTCGTG CTGTCCCTGCCGTTCGCAGAAGGTAGCTCTAGTGTGGAATATATTAACAATTGGGAACA AGCGAAAGCCCTGTCCG TTGAACTGGAAATCAACTTTGAAACCCGCGGCAAACGTGGTC AGGATGCGATGTATGAATACATGGCACAAGCTTGCGCGGGTAATCGCGTTCGTCGCAGC GTCGGCTCCTCACTGTCTTGTATCAACCTGGACTGGGATGTTATCCGTGATAAAACCAA AACGAAAATCGAAAGTCTGAAAGAACATGGCCCGATCAAAAACAAAATGAGCGAATCTC CGAATAAAACGGTGTCCGAAGAAAAAGCTAAACAGTATCTGGAAGAATTCCACCAAACC GCACTGGAACATCCGGAACTGTCAGAACTGAAAACCGTGACGGGTACCAACCCGGTTTT TGCCGGCGCAAATTACGCAGCTTGGGCTGTGAACGTTGCGCAAGTGATTGACTCGGAAA CGGCCGATAATCTGGAAAAAACCACGGCGGCCCTGAGTATTCTGCCGGGCATCGGTTCC GTTATGGGTATTGCCGACGGCGCAGTCCATCACAACACCGAAGAAATTGTGGCCCAGTC TATCGCACTGTCGAGCCTGATGGTTGCTCAAGCGATTCCGCTGGTTGGCGAACTGGTTG ATATCGGCTTTGCAGCTTACAACTTCGTGGAAAGTATTATCAACCTGTTTCAGGTTGTC CACAACTCATATAATCGCCCGGCCTACTCGCCGGGTCACAAAACCCAACCGTTCCTGCA TGACGGCTACGCGGTTAGCTGGAATACGGTCGAAGATTCTATTATCCGTACCGGCTTTC AGGGTGAATCTGGCCACGACATTAAAATCACGGCTGAAAACACCCCGCTGCCGATTGCA GGTGTTCTGCTGCCGACGATCCCGGGTAAACTGGATGTTAACAAATCAAAAACCCATAT CTCGGTCAACGGTCGCAAAATTCGTATGCGCTGCCGTGCGATCGACGGCGATGTGACCT TCTGTCGTCCGAAAAGCCCGGTCTATGTGGGCAACGGTGTCCATGCTAATCTGCACGTG GCGTTTCATCGCTCTAGTTCCGAAAAAATCCATAGTAACGAAATCTCATCGGATTCCAT TGGTGTGCTGGGCTACCAGAAAACCGTGGACCATACCAAAGTGAATAGCAAACTGAGCC TGTTCTTCGAAATCAAATCGTAA (SEQ Ш NO:2) CGAATAAAACGGTGTCCGAAGAAAAAGCTAAACAGTATCTGGAAGAATTCCACCAAACC GCACTGGAACATCCGGAACTGTCAGAACTGAAAACCGTGACGGGTACCAACCCGGTTTT TGCCGGCGCAAATTACGCAGCTTGGGCTGTGAACGTTGCGCAAGTGATTGACTCGGAAA CGGCCGATAATCTGGAAAAAACCACGGCGGCCCTGAGTATTCTGCCGGGCATCGGTTCC GTTATG GGTATTGCCGACGGCGCAGTCCATCACAACACCGAAGAAATTGTGGCCCAGTC TATCGCACTGTCGAGCCTGATGGTTGCTCAAGCGATTCCGCTGGTTGGCGAACTGGTTG ATATCGGCTTTGCAGCTTACAACTTCGTGGAAAGTATTATCAACCTGTTTCAGGTTGTC CACAACTCATATAATCGCCCGGCCTACTCGCCGGGTCACAAACCCAACGTTCCTGCA TGACGG CTACGCGGTTAGCTGGAATACGGTCGAAGATTCTATTATCCGTACCGGCTTTC AGGGTGAATCTGGCCACGACATTAAAATCACGGCTGAAAACACCCCGCTGCCGATTGCA GGTGTTCTGCTGCCGACGATCCCGGGTAAACTGGATGTTAACAAATCAAAACCCATAT CTCGGTCAACGGTCGCAAAATTCGTATGCGCTGCCGTGCGATCGACGGCGATGTGACCT TCTGTC GTCCGAAAAGCCCGGTCTATGTGGGCAACGGTGTCCATGCTAATCTGCACGTG GCGTTTCATCGCTCTAGTTCCGAAAAAATCCATAGTAACGAAATCTCATCGGATTCCAT TGGTGTGCTGGGCTACCAGAAAACCGTGGACCATACCAAAGTGAATAGCAAACTGAGCC TGTTCTTCGAAATCAAATCGTAA (SEQ Ш NO:2) Аминокислотная Amino acid >ААА24998.1 белок D Haemophilus influenzae CSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAM TKDGRLWIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETKDGK QAQVYPNRFPLWKSHFRIHTFEDEIEFIQGLEKSTGKKVGIYPEIKAPWFHHQNGKDIA AETLKVLKKYGYDKKTDMVYLQTFDFNELKRIKTELLPQMGMDLKLVQLIAYTDWKETQ EKDPKGYWVNYNYDWMFKPGAMAEWKYADGVGPGWYMLVNKEESKPDNIVYTPLVKEL AQYNVEVHPYTVRKDALPEFFTDVNQMYDALLNKSGATGVFTDFPDTGVEFLKGIK (SEQIDNO:8) >AAA24998.1 protein D of Haemophilus influenzae CSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAM TKDGRLWIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETKDGK QAQVYPNRFPLWKSHFRIHTFEDEIEFIQGLEKSTGKKVGIYPEIKAPWFHHQNGKDIA AETLKVLKKYGYD KKTDMVYLQTFDFNELKRIKTELLPQMGMDLKLVQLIAYTDWKETQ EKDPKGYWVNYNYDWMFKPGAMAEWKYADGVGPGWYMLVNKEESKPDNIVYTPLVKEL AQYNVEVHPYTVRKDALPEFFTDVNQMYDALLNKSGATGVFTDFPDTGVEFLKGIK (SEQIDNO:8)

а. нпАК-содержащий CRM197.A. nPAA-containing CRM197.

Как указано выше, в табл. 1 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) CRM197. CRM197 (перекрестно реагирующий материал 197; также известный как CRM197) является нетоксичным мутантом дифтерийного токсина, который применяется во многих одобренных гликоконъюгированных вакцинах (например, см. Broker et al. (2011) Biologicals 39:195-204). Предпочтительные белкиносители для применения с настоящим изобретением содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Например, белокноситель может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением присутствия одной или более нпАК (которые могут быть вставлены в SEQ ID NO: 1 или могут заменять один или более остатков аминокислот в SEQ ID NO: 1, например, заменять Lys и/или Phe).As indicated above, in table. 1 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of CRM197. CRM197 (cross-reacting material 197; also known as CRM197) is a non-toxic mutant of diphtheria toxin that is used in many approved glycoconjugate vaccines (for example, see Broker et al. (2011) Biologicals 39:195-204). Preferred carrier proteins for use with the present invention contain an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of SEQ ID NO: 1. For example, a protein carrier may contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, except for the presence of one or more nAAAs (which may be inserted into SEQ ID NO: 1 or may replace one or more amino acid residues in SEQ ID NO: 1, for example, replace Lys and/or Phe).

- 19 044044- 19 044044

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один остаток Lys и/или по меньшей мере один остаток Phe в SEQ ID NO: 1 заменен остатком нпАК. Предпочтительно более одного остатка в SEQ ID NO: 1 заменены нпАК, и в наилучшем случае только один вид остатка в SEQ ID NO: 1 заменен нпАК, например, заменены только остатки Lys. Если в SEQ ID NO: 1 более одного остатка заменено нпАК, предпочтительно в каждом положении применяют одну и ту же нпАК, например, pAMF в каждом заменяемом положении.According to some embodiments of the present invention, at least one Lys residue and/or at least one Phe residue in SEQ ID NO: 1 is replaced by an npAA residue. Preferably, more than one residue in SEQ ID NO: 1 is replaced by npAK, and in the best case, only one type of residue in SEQ ID NO: 1 is replaced by npAK, for example, only Lys residues are replaced. If more than one residue is replaced by an npAK in SEQ ID NO: 1, preferably the same npAK is used at each position, for example, pAMF at each position replaced.

Белки-носители с 2-9 остатками нпАК в SEQ ID NO: 1 являются предпочтительными и в наилучшем случае с 4-9, 4-8 или 4-6 остатками нпАК, например, 4, 5 или 6 остатками нпАК. Это обеспечивает более значительное прикрепление антигенов к носителю, чем при применении одной нпАК, что увеличивает соотношение антиген:носитель и при этом позволяет избежать чрезмерного нарушения нативной последовательности и структуры, что может привести к нерастворимости.Carrier proteins with 2-9 nPAA residues in SEQ ID NO: 1 are preferred and at best with 4-9, 4-8 or 4-6 nPAA residues, for example, 4, 5 or 6 nPAA residues. This allows for greater attachment of antigens to the carrier than with NSAA alone, increasing the antigen:carrier ratio while avoiding excessive disruption of the native sequence and structure that can lead to insolubility.

Исследования CRM197 выявили Т-клеточные эпитопы в остатках Р272-О291, V322-G384 и Q412-I458. Соответственно, предпочтительно избегать введения нпАК в эти области SEQ ID NO: 1. Эти области включают F274, F356, F361, F369, K420, K441, K446, K448 и K457, т.е это остатки Phe и Lys, которые менее предпочтительны для замены нпАК в CRM197. Предпочтительными остатками Lys для замены нпАК в SEQ ID NO: 1 являются K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 или K527. Другими подходящими остатками Lys для замены нпАК являются K11, K38, K83, K104, K105, K126, K158, K173, K222, K237, K243, K475 и K499. Предпочтительными остатками Phe для замены нпАК являются F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532.Studies of CRM197 identified T cell epitopes at residues P272-O291, V322-G384, and Q412-I458. Accordingly, it is preferable to avoid introducing npAAs into these regions of SEQ ID NO: 1. These regions include F274, F356, F361, F369, K420, K441, K446, K448 and K457, i.e. these are Phe and Lys residues that are less preferred for substitution NPAK in CRM197. The preferred Lys residues for the npAK substitution in SEQ ID NO: 1 are K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, or K527. Other suitable Lys residues for npAK replacement are K11, K38, K83, K104, K105, K126, K158, K173, K222, K237, K243, K475, and K499. Preferred Phe residues to replace npAA are F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532.

Структурные исследования CRM197 выявили две общие трехмерные области: первая область распространяется от N-конца до Asn-374; и вторая область распространяется от Ser-375 до С-конца. В наилучшем случае носитель, применяемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере одну нпАК в первой области и по меньшей мере одну нпАК во второй области, например, по меньшей мере 2 нпАК в каждой области или по меньшей мере 3 нпАК в каждой области. Это позволяет пространственно разделить конъюгированные антигены при прикреплении к носителю. Можно применять носитель с 3 нпАК в первой области и 3 нпАК во второй области.Structural studies of CRM197 reveal two general three-dimensional regions: the first region extends from the N-terminus to Asn-374; and the second region extends from Ser-375 to the C-terminus. In the best case scenario, the carrier used in the present invention contains at least one nPAA in the first region and at least one nPAA in the second region, for example, at least 2 nPAA in each region or at least 3 nPAA in each region. This allows for spatial separation of conjugated antigens upon attachment to the carrier. A vehicle with 3 nPAA in the first region and 3 nPAA in the second region can be used.

Первая область содержит 27 остатков Lys, и вторая область содержит 12 остатков Lys. Соответственно, один или более (например, 3) остатков Lys в пределах N-концевой последовательности из 374 аминокислот и один или более (например, 3) остатков Lys в С-концевой последовательности из 162 аминокислот из SEQ ID NO: 1 могут быть заменены нпАК, например, pAMF.The first region contains 27 Lys residues, and the second region contains 12 Lys residues. Accordingly, one or more (e.g., 3) Lys residues within the N-terminal 374 amino acid sequence and one or more (e.g., 3) Lys residues within the C-terminal 162 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be replaced by npAA , for example pAMF.

Предпочтительные варианты реализации нпАК-содержащих носителей на основе CRM197 имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой один или более из остатков K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 и/или K527 заменены нпАК. Одна из таких последовательностей представляет собой SEQ ID NO: 9, в которой каждый X представляет собой нпАК (предпочтительно одинаковые нпАК, такие как pAMF)Preferred embodiments of CRM197-based nPAA carriers have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, in which one or more of residues K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 and/or K527 replaced by NPAK. One such sequence is SEQ ID NO: 9, in which each X is a npAK (preferably the same npAK, such as pAMF)

MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNMGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN

ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVI RDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYA AWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGE LVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIK ITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS(SEQ ID NO: 9)ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVI RDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELS ELXTVTGTNPVFAGANYA AWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGE LVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIK ITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDG DVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS(SEQ ID NO: 9)

Было обнаружено, что этот белок-носитель очень хорошо экспрессируется в системе бесклеточного синтеза белка, сохраняя при этом хорошую растворимость и обеспечивая хорошие иммуногенные ответы при конъюгации с пневмококковыми капсульными полисахаридами.This carrier protein was found to express very well in a cell-free protein synthesis system while maintaining good solubility and providing good immunogenic responses when conjugated to pneumococcal capsular polysaccharides.

Согласно настоящему изобретению также предложены композиции, содержащие несколько различных конъюгатов (например, разные серотипы пневмококка), в которых каждый конъюгат содержит белок-носитель, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (в которой в наилучшем случае каждый остаток X представляет собой одну и ту же нпАК, предпочтительно pAMF).The present invention also provides compositions containing several different conjugates (for example, different serotypes of pneumococcus), in which each conjugate contains a carrier protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 (in which, at best, each X residue is the same same npAK, preferably pAMF).

SEQ ID NO: 1 содержит N-концевой метионин (который, как правило, будет формилирован), который не присутствует в CRM197 дикого типа, но включен для инициации трансляции без необходимости в полной нативной лидерной последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белок-носитель, применяемый в настоящем изобретении, не содержит N-концевой метионин, например, N-кон9цевой метионин SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 9 может отсутствовать. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белок-носитель на основе CRM197 не содержит природные аминокислоты (и более предпочтительно вообще не содержит аминокислоты) перед N-концом SEQ ID NO: 1 или после С-конца SEQ ID NO: 1.SEQ ID NO: 1 contains an N-terminal methionine (which will typically be formylated) that is not present in wild-type CRM197, but is included to initiate translation without the need for the full native leader sequence. In some embodiments, the carrier protein used in the present invention does not contain an N-terminal methionine, for example, the N-terminal methionine of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 9 may be absent. In some embodiments of the present invention, the CRM197-based carrier protein does not contain naturally occurring amino acids (and more preferably does not contain any amino acids) before the N terminus of SEQ ID NO: 1 or after the C terminus of SEQ ID NO: 1.

Эти нпАК-содержащие белки-носители CRM197 являются особенно подходящими для конъюгирования с пневмококковыми капсульными полисахаридами. Эти конъюгаты можно комбинировать для образования поливалентных композиций, как обсуждается в другом месте данного документа.These npAK-containing CRM197 carrier proteins are particularly suitable for conjugation to pneumococcal capsular polysaccharides. These conjugates can be combined to form multivalent compositions, as discussed elsewhere in this document.

Согласно настоящему изобретению также предложен белок для получения иммуногенного конъюгата полисахарид-белок, причем указанный белок имеет аминокислотную последовательность, котораяThe present invention also provides a protein for producing an immunogenic polysaccharide-protein conjugate, said protein having an amino acid sequence that

- 20 044044 по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 (например, по меньшей мере на- 20 044044 is at least 80% identical to the sequence of SEQ ID NO: 1 (for example, at least

85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%) и содержит по меньшей мере одну нпАК, при этом белок имеет N-концевой метионин. Согласно настоящему изобретению также предложен иммуногенный конъюгат полисахарид-белок, полученный с помощью конъюгирования полисахарида с по меньшей мере одной нпАК в белке.85%, at least 90% or at least 95%) and contains at least one nPAA, wherein the protein has an N-terminal methionine. The present invention also provides an immunogenic polysaccharide-protein conjugate obtained by conjugating a polysaccharide to at least one nPAA in a protein.

Согласно настоящему изобретению также предложен белок для получения иммуногенного конъюгата полисахарид-белок, причем указанный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением того, что по меньшей мере один (например, 2-9) остаток лизина представляет собой нпАК. В наилучшем случае нпАК представляет собой азидосодержащую нпАК (например, предпочтительно pAMF), 1,2,4,5-тетразинилсодержащую нпАК или алкенилсодержащую нпАК. Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат, содержащий такой белок, конъюгированный с полисахаридным антигеном за счет по меньшей мере одной из его нпАК.The present invention also provides a protein for producing an immunogenic polysaccharide-protein conjugate, wherein the protein contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, except that at least one (eg, 2-9) lysine residue is an npAA. In the best case scenario, the nPAA is an azide-containing nPAA (eg, preferably pAMF), a 1,2,4,5-tetrazinyl-containing nPAA, or an alkenyl-containing nPAA. The present invention also provides a conjugate containing such a protein conjugated to a polysaccharide antigen by at least one of its NSAAs.

Согласно настоящему изобретению также предложен иммуногенный конъюгат полисахарид-белок, причем указанный белок представляет собой CRM197, имеющий N-концевой метионин.The present invention also provides an immunogenic polysaccharide-protein conjugate, the protein being CRM197 having an N-terminal methionine.

Содержащие нпАК носители CRM197, как правило, присутствуют в мономерной форме при применении для получения конъюгатов, а не связаны с другими субъединицами CRM197 с образованием мультимеров CRM197.NPAA-containing CRM197 carriers are typically present in monomeric form when used to prepare conjugates rather than associated with other CRM197 subunits to form CRM197 multimers.

6. Способы получения белков-носителей.6. Methods for obtaining carrier proteins.

Общие способы получения полипептидов.General methods for obtaining polypeptides.

Улучшенный белок-носитель получают любым способом, описанным для получения полипептидов. Способы, подходящие для получения полипептидов, включают, но не ограничиваются ими, твердофазный химический синтез пептидов, экспрессию рекомбинантного белка в клетках (в Е. coli или нативном хозяине) и бесклеточную экспрессию белка и любую их комбинацию (например, лигирование экспрессируемого белка с использованием комбинации синтетических и рекомбинантных пептидных компонентов).The improved carrier protein is prepared by any method described for the production of polypeptides. Methods suitable for producing polypeptides include, but are not limited to, solid-phase chemical synthesis of peptides, expression of the recombinant protein in cells (in E. coli or a native host), and cell-free expression of the protein, and any combination thereof (e.g., ligation of the expressed protein using a combination synthetic and recombinant peptide components).

Согласно одному варианту реализации способа получения улучшенного белка-носителя несущий нпАК улучшенный белок-носитель получают способом, который включает переназначение кодонов. В одной модификации этого варианта реализации применяют нпАК, которые являются близкими структурными аналогами 20 канонических аминокислот (например, гомоаллилглицин, фторированный лейцин, азидогомоаланин). нпАК загружают на соответствующую им тРНК с использованием аминоацилтРНК-синтетазы дикого типа, и нпАК полностью заменяет одну из 20 канонических аминокислот, указанных в последовательности ДНК-матрицы. Чтобы предотвратить вмешательство нативной аминокислоты обычно требуется применение бактериального экспрессирующего штамма, который является ауксотрофным по отношению к заменяемой нативной аминокислоте. Эта стратегия является специфичной скорее в отношении аминокислоты, а не остатка, поскольку все остатки аминокислот определенного типа заменены нпАК.In one embodiment of a method for producing an improved carrier protein, the npAK-carrying improved carrier protein is produced by a method that involves codon reassignment. One modification of this embodiment uses nPAAs that are close structural analogues of 20 canonical amino acids (eg, homoallylglycine, fluorinated leucine, azihomoalanine). npAKs are loaded onto their corresponding tRNA using wild-type aminoacyl-tRNA synthetase, and npAKs completely replace one of the 20 canonical amino acids specified in the template DNA sequence. To prevent interference with the native amino acid, it is generally necessary to use a bacterial expression strain that is auxotrophic to the native amino acid being replaced. This strategy is amino acid specific rather than residue specific, since all amino acid residues of a particular type are replaced by npAA.

Согласно другому варианту реализации способа получения улучшенного белка-носителя несущий нпАК улучшенный белок-носитель получают с помощью стратегии, которая включает нонсенсподавление. В этом подходе неприродная аминокислота указывается в последовательности ДНКматрицы с помощью редкого или нонсенс кодона, который обычно не определяет аминокислоту в природе. Один из вариантов подхода нонсенс-подавления был впервые предложен Schultz (Noren et al. Science. 1989(244): 182-188.) и Chamberlin (Bain et al. J Am Chem Soc. 1989(111):8013-8014.) и включает применение редкого стоп-кодона TAG (амбер кодон; UAG в коде РНК) вместе с его тРНК и соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазой (aaRS) для включения нпАК в полипептид сайт-специфическим способом.In another embodiment of a method for producing an improved carrier protein, the npAK-carrying improved carrier protein is produced using a strategy that includes nonsense suppression. In this approach, an unnatural amino acid is specified in the DNA template sequence using a rare or nonsense codon that does not normally specify an amino acid in nature. One variant of the nonsense suppression approach was first proposed by Schultz (Noren et al. Science. 1989(244): 182-188.) and Chamberlin (Bain et al. J Am Chem Soc. 1989(111):8013-8014.) and involves the use of a rare TAG stop codon (amber codon; UAG in RNA code) together with its tRNA and corresponding aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) to incorporate nPAA into a polypeptide in a site-specific manner.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения подход нонсенс-подавления включает выделение пары тРНК/aaRS, модификацию антикодоновой петли тРНК для распознавания ортогонального кодона (например, амбер-кодона TAG, опал-кодона TGA или другого кодона или последовательности оснований, обычно не используемой для определения аминокислот при трансляции) и модификацию aaRS для сдвига предпочтения в сторону нпАК в сравнении с аминоацил-тРНК нативных аминокислот. Согласно некоторым модификациям этого варианта реализации пара тРНК/аминоацилтРНК-синтетаза получена из того же организма, как и механизм трансляции, применяемый для синтеза полипептидов. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения пара тРНК/аминоацилтРНК-синтетаза получена из вида, отличного от вида, к которому относится механизм трансляции, применяемый для синтеза полипептида. Описаны способы модификации антикодоновой петли тРНК и активного сайта aaRS, а также примеры модифицированных ортогональных пар тРНК/aaRS.According to one embodiment of the present invention, the nonsense suppression approach involves isolating a tRNA/aaRS pair, modifying the anticodon loop of the tRNA to recognize an orthogonal codon (e.g., an amber codon TAG, an opal codon TGA, or another codon or base sequence not typically used to identify amino acids during translation) and modification of aaRS to shift preference towards nPAA over aminoacyl-tRNA of native amino acids. In some modifications of this embodiment, the tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair is derived from the same organism as the translation machinery used to synthesize the polypeptides. In other embodiments of the present invention, the tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair is derived from a species different from the species to which the translation machinery used to synthesize the polypeptide belongs. Methods for modifying the anticodon loop of tRNA and the active site of aaRS are described, as well as examples of modified orthogonal tRNA/aaRS pairs.

Согласно другому варианту реализации подхода нонсенс-подавления получение улучшенного белка-носителя не включает применение модифицированной аминоацил-тРНК-синтетазы. В этом варианте реализации выделяют только ортогональную тРНК и модифицируют в антикодоновой петле для распознавания ортогонального кодона (например, амбер-кодона TAG или другого кодона или последовательности оснований, обычно не используемой для определения аминокислот при трансляции). Затем ортогональную модифицированную тРНК ацилируют в условиях in vitro с помощью подходящего хими- 21 044044 ческого способа (например, с помощью способа Heckler et al. Biochemistry. 1984 Mar 27; 23(7): 1468-73, который включает применение Т4 РНК-лигазы и мутантной тРНК-Phe), и добавляют в экстракт для бесклеточного синтеза белка. Поскольку в этом варианте реализации применяют химически ацилированные тРНК, он совместим только с бесклеточными способами синтеза белка.In another embodiment of the nonsense suppression approach, the production of an improved carrier protein does not involve the use of a modified aminoacyl-tRNA synthetase. In this embodiment, only the orthogonal tRNA is isolated and modified in the anticodon loop to recognize an orthogonal codon (eg, a TAG amber codon or other codon or base sequence not typically used to specify amino acids in translation). The orthogonal modified tRNA is then acylated in vitro using a suitable chemical method (for example, the method of Heckler et al. Biochemistry. 1984 Mar 27; 23(7): 1468-73, which involves the use of T4 RNA ligase and mutant tRNA-Phe) and added to the extract for cell-free protein synthesis. Because this embodiment uses chemically acylated tRNAs, it is only compatible with cell-free protein synthesis methods.

Бесклеточный синтез белка.Cell-free protein synthesis.

В особенно подходящем способе получения белков-носителей, содержащих нпАК, применяют бесклеточный синтез белка. В данной области техники известно несколько методик бесклеточной экспрессии белков, с помощью которых могут быть включены различные нпАК (например, см. табл. 1 в Quast et al. (2015) FEBS Letters 589:1703-12), избегая при этом потенциальных цитотоксических эффектов нпАК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения улучшенный белок-носитель получают с помощью синтеза белка на основе бесклеточных экстрактов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения бесклеточный экстракт содержит экстракт ретикулоцитов кролика, зародышей пшеницы или Е. coli. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения бесклеточный экстракт дополнен аминокислотами, источниками энергии, системами регенерации энергии или катионными кофакторами и любой их комбинацией. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экстракт содержит экзогенно дополненную мутантную тРНК или мутантную aaRS (аминоацил-тРНК-синтетазу) и любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экстракт содержит лизаты из штаммов Е. coli, генетически кодирующих мутантную тРНК или мутантную aaRS и любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения штаммы Е. coli, применяемые для лизатов, представляют собой ослабленные по RF-1 штаммы. Совместимые системы бесклеточного синтеза белка были описаны для вставки формул I, II и III в рекомбинантные полипептиды (например, US8715958B2, US20160257946A1 и US 20160257945A1).A particularly suitable method for producing carrier proteins containing npAKs uses cell-free protein synthesis. Several cell-free protein expression techniques are known in the art that can incorporate a variety of npAAs (e.g., see Table 1 in Quast et al. (2015) FEBS Letters 589:1703-12) while avoiding potential cytotoxic effects npAK. In some embodiments of the present invention, an improved carrier protein is produced using protein synthesis from cell-free extracts. In some embodiments, the cell-free extract comprises an extract of rabbit reticulocytes, wheat germ, or E. coli. In other embodiments of the present invention, the cell-free extract is supplemented with amino acids, energy sources, energy recovery systems, or cationic cofactors, and any combination thereof. In some embodiments, the extract contains an exogenously supplemented mutant tRNA or mutant aaRS (aminoacyl-tRNA synthetase) and any combination thereof. In some embodiments, the extract contains lysates from E. coli strains genetically encoding mutant tRNA or mutant aaRS, and any combination thereof. In some embodiments of the present invention, the E. coli strains used for the lysates are RF-1 attenuated strains. Compatible cell-free protein synthesis systems have been described for inserting formulas I, II and III into recombinant polypeptides (eg US8715958B2, US20160257946A1 and US20160257945A1).

В одном примере US8715958B2 продемонстрирована регенерирующая бесклеточная система на основе Е. coli, посредством которой пара тРНК ^Tyr/тирозинсинтетаза из Methanococcus jannaschii (Wang et al. (2001) Science 292(5516):498-500) применяется для введения неприродной аминокислоты п-азидо-Lфенилаланин (pAF) в рекомбинантную хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), ГМ-КСФ и TetA. С помощью этой системы пару тРНК/синтетаза либо добавляют в экстракт, либо трансформируют в бактерии, применяемые для получения экстракта.One example, US8715958B2, demonstrates an E. coli-based regenerating cell-free system whereby the tRNA ^Tyr /tyrosine synthetase pair from Methanococcus jannaschii (Wang et al. (2001) Science 292(5516):498-500) is used to introduce the unnatural amino acid p-azido -Lphenylalanine (pAF) into recombinant chloramphenicol acetyltransferase (CAT), GM-CSF and TetA. With this system, a tRNA/synthetase pair is either added to the extract or transformed into bacteria used to produce the extract.

В другом примере в US20160257946A1 продемонстрировано: (а) как вышеуказанную тирозинсинтетазу Methanococcus jannaschii адаптируют с применением мутагенеза так, что она преимущественно загружает п-азидометил-Е-фенилаланин (pAMF) на тРНК, распознающую амбер-кодон, и (b) как система бесклеточного синтеза, содержащая модифицированные пары синтетаза/тРНК применяется для селективного встраивания pAMF в антитела, например, трастузумаб.In another example, US20160257946A1 demonstrates: (a) how the above Methanococcus jannaschii tyrosine synthetase is adapted using mutagenesis so that it preferentially loads p-azidomethyl-E-phenylalanine (pAMF) onto a tRNA recognizing the amber codon, and (b) as a cell-free system synthesis, containing modified synthetase/tRNA pairs, is used to selectively incorporate pAMF into antibodies, for example, trastuzumab.

В дополнительном примере в US20160257945A1 продемонстрировано: (а) как вышеуказанная тирозинсинтетаза Methanococcus jannaschii адаптирована с применением мутагенеза так, что она преимущественно загружает (S)-2-амино-3-(5-((6-метил-1,2,4,5-тетразин-3-иламино)метил)пиридин-2-ил)пропановую кислоту (пиридилтетразиновое производное аминокислоты) на распознающую амбер-кодон тРНК, и (b) как система бесклеточного синтеза, содержащая модифицированную пару синтетаза/тРНК применяется для селективного встраивания (S)-2-амино-3-(5-((6-метил-1,2,4,5-тетразин-3-иламино)метил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты в рекомбинантный GFP.An additional example in US20160257945A1 demonstrates: (a) how the above Methanococcus jannaschii tyrosine synthetase is adapted using mutagenesis so that it preferentially loads (S)-2-amino-3-(5-((6-methyl-1,2,4, 5-tetrazin-3-ylamino)methyl)pyridin-2-yl)propanoic acid (pyridyltetrazine derivative of the amino acid) onto the amber codon-recognizing tRNA, and (b) as a cell-free synthesis system containing a modified synthetase/tRNA pair is used for selective insertion ( S)-2-amino-3-(5-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-ylamino)methyl)pyridin-2-yl)propanoic acid into recombinant GFP.

Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложены способы получения полипептидов в бесклеточном экстракте, содержащем 2 или более неприродных аминокислот. В этом варианте реализации полипептиды также обладают биологической активностью, сравнимой с нативным белком. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды имеют улучшенную или повышенную биологическую активность, сравнимую с нативным белком.According to an additional embodiment of the present invention, methods are provided for producing polypeptides in a cell-free extract containing 2 or more unnatural amino acids. In this embodiment, the polypeptides also have biological activity comparable to the native protein. In other embodiments of the present invention, the polypeptides have improved or increased biological activity comparable to the native protein.

Необязательно удельная активность белка в композиции может быть определена на основании уровня активности в функциональном количественном исследовании, путем определения количества присутствующего белка в нефункциональном количественном исследовании (например, иммунном окрашивании, ИФА, количественном определении в геле, окрашенном Кумасси или серебром, и т.д.) и путем определения соотношения биологически активного белка или неагрегированного белка и общего белка. Обычно удельная активность, определенная таким способом, будет составлять по меньшей мере приблизительно 5% от активности нативного белка, обычно по меньшей мере приблизительно 10% от активности нативного белка и необязательно составляет приблизительно 20%, приблизительно 40%, приблизительно 60% или более.Optionally, the specific activity of the protein in the composition can be determined based on the level of activity in a functional assay by determining the amount of protein present in a non-functional assay (e.g., immunostaining, ELISA, Coomassie or silver-stained gel assay, etc. ) and by determining the ratio of biologically active protein or non-aggregated protein to total protein. Typically, the specific activity determined in this manner will be at least about 5% of the activity of the native protein, typically at least about 10% of the activity of the native protein, and optionally about 20%, about 40%, about 60% or more.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способы получения полипептидов, содержащих нпАК, включают изменение концентраций нпАК-специфической тРНК, нпАКспецифической синтетазы, самой нпАК или температуры трансляции и любой их комбинации. Такие условия необязательно обеспечивают меньшее количество трансляционных ошибок, улучшенную скорость включения нпАК, улучшенную активность шаперонов, необходимых для сворачивания белка при включении нпАК, сниженную активность клеточных факторов, которые препятствуют включению нпАК, или любую комбинацию вышеупомянутых механизмов. Согласно некоторым вариантам реализа- 22 044044 ции способов получения улучшенного полипептида концентрация тРНК, специфичной для нпАК, увеличивается до концентрации выше приблизительно 20 мкМ, что приводит к увеличению доли растворимого или активного полипептида. В других модификациях этого варианта реализации концентрация тРНК увеличивается, в то время как концентрация нпАК поддерживается ниже приблизительно 2 мМ и концентрация нпАК-синтетазы поддерживается ниже приблизительно 5 мкМ.According to some embodiments of the present invention, methods for producing polypeptides containing npAK include changing the concentrations of npAK-specific tRNA, npAK-specific synthetase, npAK itself or translation temperature, and any combination thereof. Such conditions do not necessarily result in fewer translational errors, improved rates of npAK incorporation, improved activity of chaperones required for protein folding upon npAK incorporation, reduced activity of cellular factors that interfere with npAK incorporation, or any combination of the above mechanisms. In some embodiments of methods for producing an improved polypeptide, the concentration of npAK-specific tRNA is increased to a concentration greater than about 20 μM, resulting in an increased proportion of soluble or active polypeptide. In other modifications of this embodiment, the concentration of tRNA is increased while the concentration of npAK is maintained below about 2 mM and the concentration of npAK synthetase is maintained below about 5 μM.

Согласно некоторым вариантам реализации способов получения улучшенных полипептидов температура инкубации трансляционной смеси составляет от 20 до 30°С, приблизительно 20 или ниже 20°С. В некоторых вариантах эти модификации температуры независимо комбинируют с модификациями концентраций тРНК, специфичных для нпАК, концентраций нпАК или концентраций нпАК-синтетазы, описанных в предыдущем абзаце.In some embodiments of methods for producing improved polypeptides, the incubation temperature of the translation mixture is from 20 to 30°C, about 20°C, or below 20°C. In some embodiments, these temperature modifications are independently combined with modifications to npAK-specific tRNA concentrations, npAK concentrations, or npAK synthetase concentrations described in the previous paragraph.

7. Варианты последовательности.7. Sequence options.

Улучшенные белки-носители согласно настоящему изобретению содержат одну или более нпАК, замененных в любом положении в полипептиде, при условии, что сохраняется иммуногенная функция одного или более Т-клеточных эпитопов полипептида. Если улучшенный белок-носитель основан на известном носителе, обычно предпочтительно заменить существующие природные аминокислоты в известном носителе некоторыми или всеми нпАК, чтобы свести к минимуму вероятность нежелательного влияния на свойства носителя. Однако следует понимать, что нпАК могут быть вставлены внутри исходной последовательности носителя или на ее конце в качестве дополнений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна нпАК в улучшенном белке-носителе (например, eCRM) не присутствует в пределах одной или более из областей белка, которые содержат Т-клеточный эпитоп. Согласно другому варианту ни одна из нпАК в улучшенном иммуногенном полипептиде не присутствует в пределах одной или более областей белка, которые содержат Т-клеточный эпитоп.The improved carrier proteins of the present invention contain one or more nPAAs replaced at any position in the polypeptide, provided that the immunogenic function of one or more T cell epitopes of the polypeptide is retained. If the improved protein carrier is based on a known carrier, it is generally preferable to replace the existing natural amino acids in the known carrier with some or all nPAAs to minimize the likelihood of undesirable effects on the properties of the carrier. However, it should be understood that npAK can be inserted within the original sequence of the carrier or at its end as additions. In some embodiments of the present invention, at least one uPAA in the improved carrier protein (eg, eCRM) is not present within one or more regions of the protein that contain a T cell epitope. In another embodiment, none of the npAKs in the improved immunogenic polypeptide are present within one or more regions of the protein that contain a T cell epitope.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК заменяет одну или более из двадцати кодируемых в природе аминокислот, включая аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин. Согласно некоторым другим вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК заменяет один или более из конкретных классов остатков природных аминокислот, таких как алифатический, ароматический, кислый, основный, гидроксильный, сульфидсодержащий или амидный (содержащий амидную группу). В некоторых случаях только одна конкретная аминокислота (например, лизин) заменена нпАК в полипептиде в одном или более положениях. В других случаях две или более разных аминокислот (например, лизин, фенилаланин и т.д.) заменены нпАК в пределах полипептида в двух или более положениях. Лизин и фенилаланин являются предпочтительными для замены нпАК, поскольку (i) лизин часто применялся для конъюгации с существующими белками-носителями, поэтому нпАК-содержащий носитель может сохранять те же сайты связывания, и (ii) многие подходящие нпАК основаны на фенилаланине, поэтому носитель с нпАК может иметь минимальную структурную модификацию по сравнению с нативной последовательностью. Полипептиды, в которых нпАК заменяет только один вид аминокислоты, являются предпочтительными, например, в которых заменены только остатки Lys.In some embodiments of the present invention, an npAA residue replaces one or more of twenty naturally encoded amino acids, including alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine. In some other embodiments of the present invention, the npAA residue replaces one or more of specific classes of naturally occurring amino acid residues, such as aliphatic, aromatic, acidic, basic, hydroxyl, sulfide-containing, or amide (containing an amide group). In some cases, only one specific amino acid (eg, lysine) is replaced by npAA in the polypeptide at one or more positions. In other cases, two or more different amino acids (eg, lysine, phenylalanine, etc.) are replaced by npAA within the polypeptide at two or more positions. Lysine and phenylalanine are preferred replacements for nPAAs because (i) lysine has often been used to conjugate to existing carrier proteins, so an nPAA-containing carrier can retain the same binding sites, and (ii) many suitable nPAAs are based on phenylalanine, so a carrier with npAK may have minimal structural modification compared to the native sequence. Polypeptides in which npAK replaces only one amino acid species are preferred, for example, in which only Lys residues are replaced.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК заменяет по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 15 остатков природных аминокислот белка-носителя. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК заменяет по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 15 остатков природных аминокислот белка-носителя. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток нпАК заменяет по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 15 остатков природных аминокислот из SEQ ID NO: 1.In some embodiments of the present invention, the npAA residue replaces at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14 or at least 15 natural amino acid residues of the carrier protein. In some embodiments of the present invention, the npAA residue replaces at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14 or at least 15 natural amino acid residues of the carrier protein. In some embodiments of the present invention, the npAA residue replaces at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, or at least 15 natural amino acid residues from SEQ ID NO: 1.

В дополнительных аспектах нпАК заменяет один или более остатков аминокислот в белкеносителе. Конкретный остаток аминокислоты, который выбран для создания вариантов с одной или более заменами нпАК, описанных в настоящем документе, необязательно определяют путем разделения белка на субдомены и выбора для замены отдельной аминокислоты или группы аминокислотных остатков, которые не препятствуют стерически друг другу (например, так, чтобы между сайтами замены было расстояние в несколько ангстрем). Разделение CRM197 на две структурные области обсуждается ниже.In additional aspects, the npAK replaces one or more amino acid residues in the carrier protein. The specific amino acid residue that is selected to create the variants with one or more npAK substitutions described herein is optionally determined by dividing the protein into subdomains and selecting for replacement a single amino acid or group of amino acid residues that do not sterically interfere with each other (e.g., so that there is a distance of several angstroms between replacement sites). The division of CRM197 into two structural regions is discussed below.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нпАК заменяет остаток заряженной аминокислоты. Соответственно, нпАК может заменять остаток аминокислоты аспартат, глутамат, лизин, аргинин или гистидин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретенияIn some embodiments, npAK replaces a charged amino acid residue. Accordingly, npAK can replace the amino acid residue aspartate, glutamate, lysine, arginine or histidine. According to some embodiments of the present invention

- 23 044044 нпАК заменяет остаток отрицательно заряженной аминокислоты, например, остаток аспартата или глутамата. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нпАК заменяет остаток положительно заряженной аминокислоты, например, остаток лизина, аргинина или гистидина.- 23 044044 npAA replaces a negatively charged amino acid residue, for example an aspartate or glutamate residue. In some embodiments, the npAA replaces a positively charged amino acid residue, such as a lysine, arginine, or histidine residue.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нпАК заменяет один или более остатков лизина в иммуногенном полипептиде. Например, расширенную версию SEQ ID NO: 1 получают путем замены лизина нпАК следующим образом: 1) один остаток, выбранный из группы, состоящей из K25, K34, K38 и K40; 2) один остаток, выбранный из группы, состоящей из K213 и K215; и 3) от 2 до 4 остатков, выбранных из группы, состоящей из K228, K245, K265, K386, K523 и К527. Согласно другому дополнительному варианту реализации один или более из конкретного класса замененных остатков природных аминокислотных выбраны из группы, состоящей из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 и K527, а также любой их комбинации из SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения замена нпАК в SEQ ID NO: 1 выбрана из одного или более из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 и K527. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения замена нпАК содержит шесть остатков, состоящих из K25, K215, K228, K265, K386 и K523 из SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения замена нпАК в SEQ ID NO: 1 содержит K265. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения замена нпАК в SEQ ID NO: 1 содержит K386. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения замены нпАК в SEQ ID NO: 1 содержат K265 и K386. Согласно дополнительному варианту реализации нпАК заменяет фенилаланин. Предпочтительные остатки фенилаланина для замены включают F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 из SeQ ID NO: 1. Как правило, предпочтительно не заменяют F531 и F532 вследствие их близости.In some embodiments, the npAK replaces one or more lysine residues in an immunogenic polypeptide. For example, the extended version of SEQ ID NO: 1 is obtained by replacing the lysine with npAK as follows: 1) one residue selected from the group consisting of K25, K34, K38 and K40; 2) one residue selected from the group consisting of K213 and K215; and 3) 2 to 4 residues selected from the group consisting of K228, K245, K265, K386, K523 and K527. In another further embodiment, one or more of the particular class of substituted natural amino acid residues is selected from the group consisting of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 and K527, as well as any combination thereof from SEQ ID NO: 1. In other embodiments of the present invention, the npAK substitution in SEQ ID NO: 1 is selected from one or more of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, and K527. In one embodiment of the present invention, the npAK substitution contains six residues consisting of K25, K215, K228, K265, K386, and K523 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments of the present invention, the npAK substitution in SEQ ID NO: 1 contains K265. In other embodiments of the present invention, the nAA substitution in SEQ ID NO: 1 contains K386. According to another embodiment of the present invention, the npAK substitutions in SEQ ID NO: 1 contain K265 and K386. In a further embodiment, nPAA replaces phenylalanine. Preferred phenylalanine residues for replacement include F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 or F532 from SeQ ID NO: 1. In general, it is preferable not to replace F531 and F532 due to their proximity.

Связывающие эпитопы для человеческих CD4 клеток на дифтерийном токсине, которые распознаются большинством исследованных субъектов, охватывают остатки 271-290, 321-340, 331-350, 351-370, 411-430 или 431-450 (см., Raju et al., Eur J Immunol. 1995 Dec; 25(12):3207-14). Следовательно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 271-290, 321-340, 331-350, 351-370, 411-430 и/или 431-450 из SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 331-350 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 321-340 из SEQ ID NO: 1. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 431-450 из SEQ ID NO: 1.The binding epitopes for human CD4 cells on diphtheria toxin that are recognized by the majority of subjects studied span residues 271-290, 321-340, 331-350, 351-370, 411-430, or 431-450 (see, Raju et al., Eur J Immunol 1995 Dec;25(12):3207-14). Therefore, in some embodiments of the present invention, one or more nPAA substitutions are not located within residues 271-290, 321-340, 331-350, 351-370, 411-430, and/or 431-450 of SEQ ID NO: 1. According to one embodiment of the present invention, one or more uPAA substitutions are not located within residues 331-350 of SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, one or more uPAA substitutions are not located within residues 321-340 of SEQ ID NO: 1. According to another additional embodiment of the present invention, one or more uPAA substitutions are not located within residues 431-450 of SEQ ID NO: 1.

Связывающие эпитопы для человеческих CD4+ клеток на столбнячном токсине, которые распознаются всеми испытанными субъектами, включают остатки тяжелых цепей Н176-195, IDKISDVSTIVPYIGPALNI [SEQ ID NO:3] и Н491-510, NNFTVSFWLRVPKVSASHLE [SEQ ID NO:4] (см. Diethelm-Okita et al., J Infect Dis. 1997 Feb; 175(2):382-91). Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 176-195 и/или 491-510 пептидного компонента тяжелой цепи белка-предшественника столбнячного токсина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 176-195 пептидного компонента тяжелой цепи белка-предшественника столбнячного токсина. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в остатках 491-510 пептидного компонента тяжелой цепи белкапредшественника столбнячного токсина.Binding epitopes for human CD4+ cells on tetanus toxin that were recognized by all subjects tested include heavy chain residues H176-195, IDKISDVSTIVPYIGPALNI [SEQ ID NO:3] and H491-510, NNFTVSFWLRVPKVSASHLE [SEQ ID NO:4] (see Diethelm- Okita et al., J Infect Dis. 1997 Feb;175(2):382-91). Accordingly, in some embodiments of the present invention, one or more npAA substitutions are not located within residues 176-195 and/or 491-510 of the heavy chain peptide component of the tetanus toxin precursor protein. According to another embodiment of the present invention, one or more npAA substitutions are not located within residues 176-195 of the heavy chain peptide component of the tetanus toxin precursor protein. In another further embodiment of the present invention, one or more nPAA substitutions are not located at residues 491-510 of the heavy chain peptide component of the tetanus toxin precursor protein.

Связывающие эпитопы для человеческих CD4+ клеток на белке наружной мембраны Neisseria meningitidis (OMP или PorA), которые распознаются большинством испытанных субъектов, охватывают иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы, которые в основном расположены вне вариабельных областей и являются консервативными среди различных штаммов менингококков (и гонококков), например, соответствующие консервативным предполагаемым трансмембранным областям OMP (Wiertz et al. J Exp Med. 1992; 176(1): 79-88). Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах консервативной области ОМР.The binding epitopes for human CD4+ cells on the Neisseria meningitidis outer membrane protein (OMP or PorA) that are recognized by the majority of subjects tested involve immunodominant T cell epitopes that are mostly located outside the variable regions and are conserved among different strains of meningococci (and gonococci), for example, corresponding to the conserved putative transmembrane regions of OMP (Wiertz et al. J Exp Med. 1992; 176(1): 79-88). Accordingly, according to some embodiments of the present invention, one or more NPAA substitutions are not located within a conserved region of the OMP.

Связывающие эпитопы для человеческих CD4+ клеток на ВВ, белке-носителе, происходящем из белка G штамма Streptococcus G148, которые распознаются большинством испытанных субъектов, охватывают аминокислоты 25-40 (VSDYYKNLINNAKTVE [SEQ ID NO:5]), 63-78 (DGLSDFLKSPAQTEDT [SEQ ID NO:6]) и 74-89 (AEDTVKSIELAEAKVL [SEQ ID NO:7]) в последовательности ВВ (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jan; 10(1): 125-32). Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более замен нпАК не расположены в пределах остатков 25-40, 63-78 и/или 74-89 последовательности ВВ.The binding epitopes for human CD4+ cells on BB, a carrier protein derived from the G protein of Streptococcus strain G148, that are recognized by the majority of subjects tested span amino acids 25-40 (VSDYYKNLINNAKTVE [SEQ ID NO:5]), 63-78 (DGLSDFLKSPAQTEDT [SEQ ID NO:6]) and 74-89 (AEDTVKSIELAEAKVL [SEQ ID NO:7]) in the BB sequence (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jan; 10(1): 125-32). Accordingly, in some embodiments of the present invention, one or more npAK substitutions are not located within residues 25-40, 63-78, and/or 74-89 of the BB sequence.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуногенный полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток неприродной аминокислоты, дополнительно содержит по меньшей мере один антиген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуногенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, представляет собой улучшенный белок-носитель и дополнительно содержит по меньшей мере один антиген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуногенный полипептид, содержащий поAccording to some embodiments of the present invention, an immunogenic polypeptide comprising at least one non-natural amino acid residue further comprises at least one antigen. In some embodiments of the present invention, an immunogenic polypeptide comprising at least one unnatural amino acid is an improved carrier protein and further comprises at least one antigen. According to some embodiments of the present invention, an immunogenic polypeptide comprising

- 24 044044 меньшей мере одну неприродную аминокислоту, представляет собой улучшенный белок-носитель и дополнительно содержит по меньшей мере один антиген.- 24 044044 at least one non-natural amino acid, is an improved carrier protein and additionally contains at least one antigen.

8. Т-клеточные эпитопы.8. T-cell epitopes.

Т-клеточные эпитопы белка-носителя необязательно определяют любым из известных способов. Чтобы облегчить разработку улучшенных белков-носителей согласно настоящему изобретению, связывающие Т-клетки эпитопы в белках предсказывают с использованием алгоритмов, которые учитывают различные факторы, такие как профили амфипатичности белков, мотивы последовательностей, количественные матрицы (QM), искусственные нейронные сети (ANN), метод опорных векторов (SVM), количественные соотношения между структурой и активностью (QSAR) и моделирование молекулярной стыковки и т.д. (см. Desai et al. Methods Mol Biol. 2014; 1184:333-64). Например, связывающие Т-клетки эпитопы дифтерийного токсина/CRM были предсказаны с использованием алгоритма DeLisi & Berzofsky (см., Bixler et al. WO89/06974 и PNAS 82:7848, 1985). Предсказанные Т-клеточные эпитопы могут быть подтверждены экспериментально. Например, Т-клеточные эпитопы иммуногенного полипептида, представляющего интерес, могут быть экспериментально определены путем синтеза частично перекрывающихся пептидных фрагментов, соответствующих полной последовательности иммуногенного полипептида (или предсказанным областям) и проведения количественных исследований пролиферации линий клеток CD4+ (например, мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)) в присутствии каждого фрагмента. Этот общий подход применяли для картирования Т-клеточных эпитопов в дифтерийном токсине (Raju et al., Eur J Immunol. 1995 Dec; 25(12):3207-14), столбнячном токсине (Diethelm-Okita et al., J Infect Dis. 1997 Feb; 175(2):382-91), белке наружной мембраны Neisseria meningitidis (OMP) (J Exp Med. 1992 Jul 1; 176(1): 79-88) и ВВ, белке-носителе, происходящем из белка G штамма Streptococcus G148 (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jan; 10(1): 125-32). Также можно проводить непосредственный скрининг улучшенных белков-носителей согласно настоящему изобретению для оценки пролиферации CD4+ клеток и/или цитокинового ответа, чтобы установить присутствие Т-клеточного эпитопа, который не был инактивирован в присутствии одной или более нпАК.T cell epitopes of the carrier protein are optionally determined by any known method. To facilitate the development of improved carrier proteins according to the present invention, T cell binding epitopes in proteins are predicted using algorithms that take into account various factors such as protein amphipathicity profiles, sequence motifs, quantitative matrices (QM), artificial neural networks (ANN), support vector machine (SVM), quantitative structure-activity relationships (QSAR) and molecular docking modeling, etc. (See Desai et al. Methods Mol Biol. 2014;1184:333-64). For example, diphtheria toxin/CRM T cell binding epitopes were predicted using the DeLisi & Berzofsky algorithm (see, Bixler et al. WO89/06974 and PNAS 82:7848, 1985). Predicted T cell epitopes can be confirmed experimentally. For example, T cell epitopes of an immunogenic polypeptide of interest can be experimentally determined by synthesizing partially overlapping peptide fragments corresponding to the complete sequence of the immunogenic polypeptide (or predicted regions) and quantitative studies of the proliferation of CD4+ cell lines (eg, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) )) in the presence of each fragment. This general approach has been used to map T cell epitopes in diphtheria toxin (Raju et al., Eur J Immunol. 1995 Dec; 25(12):3207-14), tetanus toxin (Diethelm-Okita et al., J Infect Dis. 1997 Feb; 175(2):382-91), Neisseria meningitidis outer membrane protein (OMP) (J Exp Med. 1992 Jul 1; 176(1): 79-88) and BB, a carrier protein derived from the G protein strain Streptococcus G148 (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jan; 10(1): 125-32). It is also possible to directly screen the improved carrier proteins of the present invention to assess CD4+ cell proliferation and/or cytokine response to determine the presence of a T cell epitope that has not been inactivated by the presence of one or more npAKs.

9. Способы получения конъюгатов.9. Methods for obtaining conjugates.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ синтеза полипептида, содержащего нпАК, в смеси для бесклеточной экспрессии, поддерживаемой при температуре от приблизительно 10 до приблизительно 30°С. Согласно другому варианту реализации температура выше приблизительно 20°С. Согласно другому варианту реализации температура ниже приблизительно 20°С. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения температура составляет от приблизительно 14 до приблизительно 18°С. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей подавляющий кодон. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения смесь для бесклеточной экспрессии содержит ортогональную пару тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаза, специфичную для нпАК. Согласно другому варианту реализации концентрация тРНК составляет по меньшей мере 20 мкМ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения концентрация нпАК составляет менее приблизительно 2 мМ, и концентрация аминоацил-тРНК-синтетазы составляет менее приблизительно 5 мкМ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ включает конъюгирование полипептида с активным фрагментом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения активный фрагмент выбран из группы, состоящей из гаптена, бактериального антигена, вирусного антигена, гликана опухолевого происхождения, пептидного токсина, макролида, простого полиэфира и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста, фактора свертывания крови, белка плазмы, интерлейкина, внеклеточного домена Т-клеточного рецептора, внеклеточного домена фактора роста, бактериального антигена, вирусного антигена и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения смесь для экспрессии содержит клеточный экстракт Е. coli, зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения смесь для экспрессии содержит по меньшей мере 30% клеточного экстракта. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК выбрана из группы, состоящей из 2-амино-3-(4азидофенил)пропановой кислоты (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-5азидопентановой кислоты, 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановой кислоты и любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полученный полипептид содержит как растворимую, так и нерастворимую фракции, причем соотношение растворимой фракции и нерастворимой фракции составляет по меньшей мере 40% (мас./мас.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полученный полипептид содержит как растворимую, так и нерастворимую фракции, причем соотношение растворимой фракции и нерастворимой фракции составляет по меньшейAccording to one embodiment of the present invention, there is provided a method for synthesizing a polypeptide containing npAK in a cell-free expression mixture maintained at a temperature of from about 10 to about 30°C. In another embodiment, the temperature is above about 20°C. In another embodiment, the temperature is below about 20°C. According to another embodiment of the present invention, the temperature is from about 14 to about 18°C. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide is encoded by a nucleic acid containing a suppression codon. According to another embodiment of the present invention, the cell-free expression mixture contains an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair specific for npAK. In another embodiment, the tRNA concentration is at least 20 μM. According to another embodiment of the present invention, the concentration of npAA is less than about 2 mM, and the concentration of aminoacyl-tRNA synthetase is less than about 5 μM. According to another embodiment of the present invention, the method includes conjugating a polypeptide to an active moiety. According to another embodiment of the present invention, the active moiety is selected from the group consisting of a hapten, a bacterial antigen, a viral antigen, a tumor-derived glycan, a peptide toxin, a macrolide, a polyether, and any combination thereof. In another embodiment of the present invention, the polypeptide is selected from the group consisting of growth hormone, coagulation factor, plasma protein, interleukin, T-cell receptor extracellular domain, growth factor extracellular domain, bacterial antigen, viral antigen, and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the expression mixture contains a cell extract of E. coli, wheat germ or rabbit reticulocytes. According to another embodiment of the present invention, the expression mixture contains at least 30% cell extract. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 nPAAs. According to another embodiment of the present invention, npAA is selected from the group consisting of 2-amino-3-(4azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2- amino-3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl) pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5azidopentanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the resulting polypeptide contains both soluble and insoluble fractions, wherein the ratio of soluble fraction to insoluble fraction is at least 40% (w/w). According to another embodiment of the present invention, the resulting polypeptide contains both soluble and insoluble fractions, wherein the ratio of soluble fraction to insoluble fraction is at least

- 25 044044 мере 60% (мас./мас.). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид, полученный с помощью бесклеточной экспрессии, содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 нпАК, и соотношение растворимой фракции и нерастворимой фракции составляет по меньшей мере 20% (мас./мас.), по меньшей мере 30% (мас./мас.), по меньшей мере 40% (мас./мас.), по меньшей мере 50% (мас./мас.), по меньшей мере 60% (мас./мас.), по меньшей мере 70% (мас./мас.), по меньшей мере 80% (мас./мас.), по меньшей мере 90% (мас./мас.).- 25 044044 at least 60% (w/w). In one embodiment of the present invention, the cell-free expression polypeptide comprises at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 npAA, and the ratio of soluble fraction to insoluble fraction is at least 20% (w/w), at least 30% (w/w), at least 40% (w/w) .), at least 50% (w/w), at least 60% (w/w), at least 70% (w/w), at least 80% (w/w). /wt.), at least 90% (wt./wt.).

Антигены.Antigens.

В настоящем документе описаны иммуногенные антигены, которые необязательно дополнительно дериватизированы химической рукояткой, чтобы облегчить прикрепление к улучшенному белкуносителю. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антигенами являются любые очищенные природные, синтетические или полученные рекомбинантным способом макромолекулы или их фрагменты. Примеры включают, но не ограничиваются ими, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты или полипептиды и любую их комбинацию (например, гликопротеины, гликолипопротеины, гликолипиды). Например, гликолипид необязательно представляет собой гликофосфатидилинозитол. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой независимый от Т-клеток или активирующий Т-клетки антиген (обычно слабый активирующий Т-клетки антиген), выбранный из группы, состоящей из бактериального полисахарида, бактериального липополисахарида, гликана опухолевого происхождения или гаптена.Described herein are immunogenic antigens that are optionally further derivatized with a chemical handle to facilitate attachment to an improved protein carrier. According to one embodiment of the present invention, antigens are any purified natural, synthetic or recombinantly produced macromolecules or fragments thereof. Examples include, but are not limited to, lipids, polysaccharides, nucleic acids or polypeptides and any combination thereof (eg, glycoproteins, glycolipoproteins, glycolipids). For example, the glycolipid is not necessarily glycophosphatidylinositol. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a T cell independent or T cell activating antigen (typically a weak T cell activating antigen) selected from the group consisting of a bacterial polysaccharide, a bacterial lipopolysaccharide, a tumor-derived glycan, or a hapten.

Полисахариды бактериального происхождения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, содержит полисахарид бактериального происхождения, такой как капсульный полисахарид. Такие капсульные полисахариды представляют собой высокомолекулярные полимеры грамположительных или грамотрицательных бактерий, функция которых заключается в защите микроорганизмов от иммунных ответов, и как таковые представляют собой перспективные вакцинные мишени, когда целью является выработка нейтрализующих антител. Такие капсульные полисахариды обычно получают из лизатов целых клеток или культурального супернатанта соответствующей бактерии с помощью способов, которые включают диафильтрацию, удаление белка, осаждение этанолом, удаление нуклеиновой кислоты и лиофильную сушку. Примеры включают, но не ограничиваются ими, протокол Merieux (Institut Merieux (1980) Brevet Beige 80:26320) и протокол Yavordios (Yavordios et al. EP0071515A1(1983)).Polysaccharides of bacterial origin. In some embodiments of the present invention, the polysaccharide-containing antigen comprises a polysaccharide of bacterial origin, such as a capsular polysaccharide. Such capsular polysaccharides are high molecular weight polymers of gram-positive or gram-negative bacteria whose function is to protect microorganisms from immune responses, and as such represent promising vaccine targets when the goal is the production of neutralizing antibodies. Such capsular polysaccharides are typically prepared from whole cell lysates or culture supernatant of the appropriate bacterium by methods that include diafiltration, protein removal, ethanol precipitation, nucleic acid removal, and freeze drying. Examples include, but are not limited to, the Merieux protocol (Institut Merieux (1980) Brevet Beige 80:26320) and the Yavordios protocol (Yavordios et al. EP0071515A1(1983)).

Капсульные полисахариды S. pneumoniae. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид содержит капсульный полисахарид, происходящий из Streptococcus pneumoniae. Streptococcus pneumoniae представляет собой инкапсулированную грамположительную бактерию, которая может вызывать пневмонию, бактериемию и менингит. Существует 90 различных документально подтвержденных серотипов S. pneumoniae (описанных, например, в Kalin, M. Thorax 1998;53:159-162), которые несут капсульные полисахариды со специфическими для серотипа структурами из повторяющихся звеньев. Соответственно, в некоторых случаях антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, выбранный из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 7А, 7В, 7С, 8, 9А, 9L, 9N, 9V, 10F, 10А, 10В, 10С, 11F, 11А, 11В, 11С, 11D, 12F, 12А, 12В, 13, 14, 15F, 15А, 15В, 15С, 16F, 16А, 17F, 17А, 18F, 18А, 18В, 18С, 19F, 19А, 19В, 19С, 20, 21, 22F, 22А, 23F, 23А, 23В, 24F, 24А, 24В, 25F, 25А, 27, 28F, 28А, 29, 31, 32F, 32А, 33F, 33А, 33В, ЗЗС, 33D, 34, 35F, 35А, 35В, 35С, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41А, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47А и 48 (Henrichsen J Clin Microbiol 1995; 33:2759-2762). Однако бактериальную инфекцию обычно вызывает только подгруппа этих серотипов, которая включает серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F. Серотипы 6С, 1С, 15А, 15С, 16F, 23А, 23В, 31, 34, 35В, 35F, 37 и 38 также стали представлять клиническую проблему, как и серотипы 20А, 20В и 24В. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, выбранный из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, выбранный из серотипов 6С, 7С, 15А, 15С, 16F, 23А, 23В, 31, 34, 35В, 35F, 37 и 38. Варианты реализации, описанные в настоящем документе, также могут дополнительно включать один или более капсульных полисахаридов Streptococcus pneumoniae, выбранных из серотипов 20А, 20В и 24В.Capsular polysaccharides of S. pneumoniae. In some embodiments of the present invention, the capsular polysaccharide comprises a capsular polysaccharide derived from Streptococcus pneumoniae. Streptococcus pneumoniae is an encapsulated Gram-positive bacterium that can cause pneumonia, bacteremia, and meningitis. There are 90 different documented serotypes of S. pneumoniae (described, for example, in Kalin, M. Thorax 1998;53:159-162), which carry capsular polysaccharides with serotype-specific repeat unit structures. Accordingly, in some cases the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A . 9F , 19A, 19B, 19C, 20, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B , ZZS, 33D, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A and 48 (Henrichsen J Clin Microbiol 1995 ; 33:2759-2762). However, bacterial infection is usually caused by only a subset of these serotypes, which includes serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F , 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F. Serotypes 6C, 1C, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 31, 34, 35B, 35F, 37 and 38 have also become clinically problematic, as have serotypes 20A, 20B and 24B. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae selected from serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B , 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae selected from serotypes 6C, 7C, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 31, 34, 35B, 35F, 37 and 38. Embodiments described herein may further include one or more Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides selected from serotypes 20A, 20B and 24B.

Как упомянуто выше, композиции согласно настоящему изобретению могут включать конъюгаты капсульного полисахарида из по меньшей мере 14, 15, 20, 21, 24 или 25 различных серотипов пневмококка. Если композиция включает 14 или более серотипов, они предпочтительно включают 13 серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19A, 19F и 23F. В дополнение к этим 13 серотипам композиция предпочтительно содержит один или более из серотипов 2, 8, 9N, 10А, 11А, 12F, 15В, 17F, 20, 22F, и/или 33F. В другом варианте в дополнение к вышеуказанным 13 серотипам композиция предпочтительно содержит один или более серотипов 2, 6С, 8, 9N, 10A, 12F, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 20, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 24F, 24В, 31, 33F, 34, 35В, 35F и 38. Подходящая комбинация из 15 или более (например, 16 или более) серотипов содержит каждый из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, аAs mentioned above, the compositions of the present invention may include capsular polysaccharide conjugates from at least 14, 15, 20, 21, 24 or 25 different pneumococcal serotypes. If the composition includes 14 or more serotypes, they preferably include the 13 serotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F and 23F. In addition to these 13 serotypes, the composition preferably contains one or more of serotypes 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F, and/or 33F. In another embodiment, in addition to the above 13 serotypes, the composition preferably contains one or more serotypes 2, 6C, 8, 9N, 10A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 24B, 31, 33F, 34, 35B, 35F and 38. A suitable combination of 15 or more (e.g., 16 or more) serotypes contains each of serotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F and 33F, and

- 26 044044 также может содержать серотип 8. Подходящая комбинация из 20 или более (например, 21 или более) серотипов содержит каждый из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19A,- 26 044044 may also contain serotype 8. A suitable combination of 20 or more (for example, 21 or more) serotypes contains each of serotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F , 14, 15B, 18C, 19A,

19F, 22F, 23F и 33F. Подходящая комбинация из 24 или более серотипов содержит каждый из серотипов19F, 22F, 23F and 33F. A suitable combination of 24 or more serotypes contains each of the serotypes

1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F.1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F.

Структуры распространенных повторяющихся звеньев капсульных полисахаридов из серотипов S. pneumoniae описаны в Jones et al. (Jones C et al. An Acad Bras Cienc. 2005 Jun; 77(2):293-324)Structures of common repeat units of capsular polysaccharides from S. pneumoniae serotypes are described in Jones et al. (Jones C et al. An Acad Bras Cienc. 2005 Jun; 77(2):293-324)

Тип 1Type 1

[—>3)-D-AAT-a-Galp-(l—>4)-a-D-GalpA(2/3OAc)-(l—>3)-a-D-GalpA-(l—>][—>3)-D-AAT-a-Galp-(l—>4)-a-D-GalpA(2/3OAc)-(l—>3)-a-D-GalpA-(l—>]

Тип 2Type 2

[^4)-3-D-Glcp-(1^3)-[a-D-GlcpA-(1^6)-a-D-Glcp-(1^2)]-a-L-Rhap-(1^3)-a-LRhap-(l^-3)3-L-Rhap-(l^·][^4)-3-D-Glcp-(1^3)-[a-D-GlcpA-(1^6)-a-D-Glcp-(1^2)]-a-L-Rhap-(1^3)-a -LRhap-(l^-3)3-L-Rhap-(l^·]

Тип 3Type 3

[—>3)-P-D-GlcA-(l—>4)-P-D-Glcp-(l—>][—>3)-P-D-GlcA-(l—>4)-P-D-Glcp-(l—>]

Тип 4Type 4

[^3)-3-D-ManpNAc-(1^3)-a-L-FucpNAc-(1^3)-a-D-GalpNAc-(1^4)-a-DGalp2,3(S)Py-(l^][^3)-3-D-ManpNAc-(1^3)-a-L-FucpNAc-(1^3)-a-D-GalpNAc-(1^4)-a-DGalp2,3(S)Py-(l^ ]

Тип 5 [^4)-3-D-Glcp-(1^4)-[a-L-PnepNAc-(1^2)-3-D-GlcpA-(1^3)]-a-L-FucpNAc(l-3)-3-D-Sugp-(l-]Type 5 [^4)-3-D-Glcp-(1^4)-[a-L-PnepNAc-(1^2)-3-D-GlcpA-(1^3)]-a-L-FucpNAc(l-3 )-3-D-Sugp-(l-]

Тип 6BType 6B

H2)-a-D-Galp-(1^3)-a-D-Glcp-(1^3)-a-L-Rhap-(1^4)-D-Rib-oH^H2)-a-D-Galp-(1^3)-a-D-Glcp-(1^3)-a-L-Rhap-(1^4)-D-Rib-oH^

Тип 9NType 9N

[^4)-a-D-GlcpA-(1^3)-a-D-Glcp-(1^3)-3-D-ManpNAc-(1^4)-3-D-Glcp-(1^4)-aD-GlcpNAc-(l^][^4)-a-D-GlcpA-(1^3)-a-D-Glcp-(1^3)-3-D-ManpNAc-(1^4)-3-D-Glcp-(1^4)-aD -GlcpNAc-(l^]

Тип 9 V [^4)-a-D-GlcpA(2/3OAc)-(1^3)-a-D-Galp-(1^3)-3-D-ManpNAc(4/6OAc)-(1^4) -βD-Glcp-( 1 -^4)-a-D-GI cp-(l —>]Type 9 V [^4)-a-D-GlcpA(2/3OAc)-(1^3)-a-D-Galp-(1^3)-3-D-ManpNAc(4/6OAc)-(1^4) - βD-Glcp-( 1 -^4)-a-D-GI cp-(l ->]

Тип 12F [^4)-[a-D-Galp-(1^3)]a-L-FucpNAc-(l—>3)^-D-GlcNAc-(l—>4)-[a-D-Glc-(l—>2) -aD-Glc-(1^3)]-p-D-ManNAcA-(^]Type 12F [^4)-[a-D-Galp-(1^3)]a-L-FucpNAc-(l—>3)^-D-GlcNAc-(l—>4)-[a-D-Glc-(l—> 2) -aD-Glc-(1^3)]-p-D-ManNAcA-(^]

Тип 14Type 14

[^4)-3-D-Glcp-(1^6)-[3-D-Galp-(1^4)]-3-D-GlcpNAc-(1^3)-3-D-Galp-(l^][^4)-3-D-Glcp-(1^6)-[3-D-Galp-(1^4)]-3-D-GlcpNAc-(1^3)-3-D-Galp-( l^]

Тип 18C [^4)-3-D-Glcp-(1^4)-[a-D-Glcp(6OAc) (1^2)][Gro-(l^P^3)]-p-D-Galp-(1^4) -aD-Glcp-(1^3)-3-L-Rhap-(l^]Type 18C [^4)-3-D-Glcp-(1^4)-[a-D-Glcp(6OAc) (1^2)][Gro-(l^P^3)]-p-D-Galp-(1 ^4) -aD-Glcp-(1^3)-3-L-Rhap-(l^]

Тип 19FType 19F

[^4)-p-D-ManpNAc-(l ^4)-a-D-Glcp-( 1 ^2)-a-L-Rhap-( 1 ^P^][^4)-p-D-ManpNAc-(l ^4)-a-D-Glcp-( 1 ^2)-a-L-Rhap-( 1 ^P^]

Тип 23FType 23F

[^4)-3-D-Glcp-(1^4)-[a-L-Rhap-(1^2)]-[Gro-(2^P^3)]-3-D-Galp-(1^4)-p-LRhap-(l^][^4)-3-D-Glcp-(1^4)-[a-L-Rhap-(1^2)]-[Gro-(2^P^3)]-3-D-Galp-(1^ 4)-p-LRhap-(l^]

Более подробное обсуждение полисахаридов можно найти в Geno et al. (2015) Clin. Microbiol. Rev. 28:871-99, где в табл. 1 показаны структуры для 97 известных серотипов. В этой таблице также показана доля сахаридных остатков, которые ацетилированы, если ацетилирование неполное.A more detailed discussion of polysaccharides can be found in Geno et al. (2015) Clin. Microbiol. Rev. 28:871-99, where in table. Figure 1 shows structures for 97 known serotypes. This table also shows the proportion of saccharide residues that are acetylated when acetylation is incomplete.

Капсульный полисахарид необязательно О-ацетилирован. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид из серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F содержит сахарид, степень Оацетилирования которого составляет 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения степень О-ацетилирования составляет более 10%, более 20%, более 30%, более 40%, более 50%, более 60%, более 70%, более 80%, более 90% или приблизительно 100%. СтепеньThe capsular polysaccharide is optionally O-acetylated. In some embodiments of the present invention, a capsular polysaccharide from serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F contain a saccharide, the degree of Oacetylation of which is 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100 %, 70-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% or 80-90%. In other embodiments, the degree of O-acetylation is greater than 10%, greater than 20%, greater than 30%, greater than 40%, greater than 50%, greater than 60%, greater than 70%, greater than 80%, greater than 90%, or approximately 100% . Degree

- 27 044044- 27 044044

О-ацетилирования полисахарида необязательно определяют, например, с помощью протонного ЯМР (см., например, Lemercinier & Jones (1996) Carbohydrate Research 296:83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присутствие О-ацетильных групп определяют с помощью ионной ВЭЖХ. Обычно полисахарид в конъюгате будет сохранять уровни О-ацетилирования, наблюдаемые в исходном полисахариде, очищенном от бактерии.O-acetylation of the polysaccharide is optionally determined, for example, by proton NMR (see, for example, Lemercinier & Jones (1996) Carbohydrate Research 296:83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233- 1247). In some embodiments of the present invention, the presence of O-acetyl groups is determined using ionic HPLC. Typically, the polysaccharide in the conjugate will retain the levels of O-acetylation observed in the original polysaccharide purified from the bacterium.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид из серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F имеет молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1400 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант реализации настоящего изобретения.According to one embodiment of the present invention, a capsular polysaccharide from serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F have molecular weights ranging from 10 kDa to 4000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 4000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 1400 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 3500 kDa; from 50 kDa to 3000 kDa; from 50 kDa to 2500 kDa; from 50 kDa to 2000 kDa; from 50 kDa to 1750 kDa; from 50 kDa to 1500 kDa; from 50 kDa to 1250 kDa; from 50 kDa to 1000 kDa; from 50 kDa to 750 kDa; from 50 kDa to 500 kDa; from 100 kDa to 4000 kDa; from 100 kDa to 3500 kDa; from 100 kDa to 3000 kDa; from 100 kDa to 2500 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 1750 kDa; from 100 kDa to 1500 kDa; from 100 kDa to 1250 kDa; from 100 kDa to 1000 kDa; from 100 kDa to 750 kDa; from 100 kDa to 500 kDa; from 200 kDa to 4000 kDa; from 200 kDa to 3500 kDa; from 200 kDa to 3000 kDa; from 200 kDa to 2500 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 1750 kDa; from 200 kDa to 1500 kDa; from 200 kDa to 1250 kDa; from 200 kDa to 1000 kDa; from 200 kDa to 750 kDa; or from 200 kDa to 500 kDa. Any integer within any of the above ranges is considered an embodiment of the present invention.

Капсульный полисахарид необязательно химически модифицирован в сравнении с природным капсульным полисахаридом. Например, полисахарид необязательно де-О-ацетилирован (частично или полностью), де-N-ацетилирован (частично или полностью), N-пропионирован (частично или полностью) и т.д. Деацетилирование необязательно происходит до, во время или после конъюгации с химической рукояткой или полипептидом, но обычно происходит до конъюгации.The capsular polysaccharide is not necessarily chemically modified from the natural capsular polysaccharide. For example, the polysaccharide is optionally de-O-acetylated (partially or completely), de-N-acetylated (partially or completely), N-propionated (partially or completely), etc. Deacetylation does not necessarily occur before, during, or after conjugation to a chemical handle or polypeptide, but usually occurs before conjugation.

Полисахариды S. pyogenes. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, содержит полисахарид, полученный из S. pyogenes. S. pyogenes представляет собой грамположительную бактерию (также известную как стрептококк группы А или GAS), ответственную за широкий спектр инфекций у людей, включая фарингит, тонзиллит, скарлатину, целлюлит, рожистое воспаление, ревматическую лихорадку, постстрептококковый гломерулонефрит, некротический фасциит, мионекроз и лимфангит. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид S. pyogenes. Капсульный полисахарид S. pyogenes состоит из гиалуроновой кислоты, высокомолекулярного полимера, в котором повторяющееся звено имеет структуруPolysaccharides of S. pyogenes. In some embodiments of the present invention, the polysaccharide-containing antigen comprises a polysaccharide derived from S. pyogenes. S. pyogenes is a gram-positive bacterium (also known as group A streptococcus or GAS) responsible for a wide range of infections in humans, including pharyngitis, tonsillitis, scarlet fever, cellulitis, erysipelas, rheumatic fever, post-streptococcal glomerulonephritis, necrotizing fasciitis, myonecrosis and lymphangitis . According to one embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of S. pyogenes. The capsular polysaccharide of S. pyogenes consists of hyaluronic acid, a high molecular weight polymer in which the repeating unit has the structure

H4)-p-D-GlcUAp-(143)-p-D-GlcpNAc-(H которая, по-видимому, является инвариантной среди серотипов S. pyogenes.H4)-p-D-GlcUAp-(143)-p-D-GlcpNAc-(H which appears to be invariant among S. pyogenes serotypes.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид из S. pyogenes имеет молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант реализации настоящего изобретения.According to one embodiment of the present invention, the capsular polysaccharide from S. pyogenes has a molecular weight of 10 kDa to 4000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 4000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 3500 kDa; from 50 kDa to 3000 kDa; from 50 kDa to 2500 kDa; from 50 kDa to 2000 kDa; from 50 kDa to 1750 kDa; from 50 kDa to 1500 kDa; from 50 kDa to 1250 kDa; from 50 kDa to 1000 kDa; from 50 kDa to 750 kDa; from 50 kDa to 500 kDa; from 100 kDa to 4000 kDa; from 100 kDa to 3500 kDa; from 100 kDa to 3000 kDa; from 100 kDa to 2500 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 1750 kDa; from 100 kDa to 1500 kDa; from 100 kDa to 1250 kDa; from 100 kDa to 1000 kDa; from 100 kDa to 750 kDa; from 100 kDa to 500 kDa; from 200 kDa to 4000 kDa; from 200 kDa to 3500 kDa; from 200 kDa to 3000 kDa; from 200 kDa to 2500 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 1750 kDa; from 200 kDa to 1500 kDa; from 200 kDa to 1250 kDa; from 200 kDa to 1000 kDa; from 200 kDa to 750 kDa; or from 200 kDa to 500 kDa. Any integer within any of the above ranges is considered an embodiment of the present invention.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой некапсульный полисахарид из S. pyogenes. Некапсульные полисахариды включают полисахарид клеточной стенки стрептококка группы А, который содержит остов из поли-L-рамнопиранозильных звеньев, соединенных чередующимися связями a-L-(1^3) и a-L-(1 а2), к которым присоединены остатки Nацетuл-β-D-глюкозамина в положении 3 рамнозного остова.According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a non-capsular polysaccharide from S. pyogenes. Non-capsular polysaccharides include the cell wall polysaccharide of group A streptococcus, which contains a backbone of poly-L-rhamnopyranosyl units connected by alternating a-L-(1^3) and a-L-(1a2) bonds, to which are attached Nacetyl-β-D-glucosamine residues in position 3 of the rhamnose skeleton.

Согласно одному варианту реализации полисахарид клеточной стенки стрептококков группы А из S. pyogenes имеет молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500In one embodiment, the cell wall polysaccharide of group A streptococci from S. pyogenes has a molecular weight of 10 kDa to 4000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 4000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 3500 kDa; from 50 kDa to 3000 kDa; from 50 kDa to 2500 kDa; from 50 kDa to 2000 kDa; from 50 kDa to 1750 kDa; from 50 kDa to 1500 kDa; from 50 kDa to 1250 kDa; from 50 kDa to 1000 kDa; from 50 kDa to 750 kDa; from 50 kDa to 500 kDa; from 100 kDa to 4000 kDa; from 100 kDa to 3500

- 28 044044 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант реализации настоящего изобретения.- 28 044044 kDa; from 100 kDa to 3000 kDa; from 100 kDa to 2500 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 1750 kDa; from 100 kDa to 1500 kDa; from 100 kDa to 1250 kDa; from 100 kDa to 1000 kDa; from 100 kDa to 750 kDa; from 100 kDa to 500 kDa; from 200 kDa to 4000 kDa; from 200 kDa to 3500 kDa; from 200 kDa to 3000 kDa; from 200 kDa to 2500 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 1750 kDa; from 200 kDa to 1500 kDa; from 200 kDa to 1250 kDa; from 200 kDa to 1000 kDa; from 200 kDa to 750 kDa; or from 200 kDa to 500 kDa. Any integer within any of the above ranges is considered an embodiment of the present invention.

Капсульные полисахариды Streptococcus agalactiae. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, содержит капсульный полисахарид, происходящий из S. agalactiae. S. agalactiae (также называемый стрептококк группы В или GBS) является грамположительной бактерией, обычно условно-патогенной у млекопитающих, которая вызывает сепсис, пневмонию и менингит у иммунологически уязвимых людей и мастит крупного рогатого скота у молочных коров. Существует по меньшей мере 10 серотипов S. agalactiae с различными повторяющимися звеньями капсульных полисахаридов (Ia, Ib, II-IX); однако заболевание обычно вызывает только подгруппа серотипов. К ним относятся серотипы Ia, Ib, II, III и V, и могут быть получены конъюгаты капсульных полисахаридов из этих серотипов. Структуры повторяющихся звеньев капсульных полисахаридов обычных серотипов S. agalactiae определены и представляют собойCapsular polysaccharides of Streptococcus agalactiae. In some embodiments of the present invention, the polysaccharide-containing antigen comprises a capsular polysaccharide derived from S. agalactiae. S. agalactiae (also called group B streptococcus or GBS) is a Gram-positive bacterium, usually opportunistic in mammals, that causes septicemia, pneumonia, and meningitis in immunologically vulnerable humans and bovine mastitis in dairy cows. There are at least 10 serotypes of S. agalactiae with different capsular polysaccharide repeat units (Ia, Ib, II-IX); however, only a subset of serotypes usually cause disease. These include serotypes Ia, Ib, II, III and V, and capsular polysaccharide conjugates can be prepared from these serotypes. The structures of the repeating units of capsular polysaccharides of common S. agalactiae serotypes have been determined and represent

Тип 1аType 1a

[—>4)-3-D-Glcp-(l—>4)-3-D-Galp(l—>] ΐ 1 a-D-Neu/?NAc(2^3)p-D-GalX1^3)p-D-Gl^^[—>4)-3-D-Glcp-(l—>4)-3-D-Galp(l—>] ΐ 1 a-D-Neu/?NAc(2^3)p-D-GalX1^3)p-D- Gl^^

Тип1ЬType1b

H4)-3-D-Glcp-(1^4)-3-D-Galp(l^] ΐ 1 a-D-Neu/?NAc(2^3)p-D-GalX1^4)p-D-Gl^^H4)-3-D-Glcp-(1^4)-3-D-Galp(l^] ΐ 1 a-D-Neu/?NAc(2^3)p-D-GalX1^4)p-D-Gl^^

Тип IIType II

[^4)-3-D-GlcpNAc-(l—>3)-3-D-Galp(l—>4)-3-D-Glcp(l—>3)-3-D-Glcp(l—>2)-β-ϋGalp(l^] ΐΐ β-D-Galpα-DNeupNAc[^4)-3-D-GlcpNAc-(l—>3)-3-D-Galp(l—>4)-3-D-Glcp(l—>3)-3-D-Glcp(l— >2)-β-ϋGalp(l^] ΐΐ β-D-Galpα-DNeupNAc

- 29 044044- 29 044044

Type IIIType III

[^4)^-D-Glcp-(1^6)^-D-GlcpNAc-(1^3)^-D-Galp-(l^] ΐ[^4)^-D-Glcp-(1^6)^-D-GlcpNAc-(1^3)^-D-Galp-(l^] ΐ

β-D-Galp ΐβ-D-Galpΐ

α-D-NeupNacα-D-NeupNac

Тип VType V

[^4)-p-D-Glcp-(l ^4)-p-D-Galp(l ^4)-p-D-Glcp-( 1[^4)-p-D-Glcp-(l ^4)-p-D-Galp(l ^4)-p-D-Glcp-( 1

3 ΐ ΐ3 ΐ ΐ

1 β-D-Glc/tNAc β-D-Glcp ΐ 1 β-D-Galp 3 ΐ 2 α-D-NeupNAc1 β-D-Glc/tNAc β-D-Glcp ΐ 1 β-D-Galp 3 ΐ 2 α-D-NeupNAc

Капсульные полисахариды Haemophilus influenzae. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, содержит капсульный полисахарид, происходящий из Н. influenzae. H. influenzae представляет собой грамотрицательную, анаэробную патогенную бактерию, ответственную за широкий спектр локализованных и инвазивных инфекций, включая пневмонию, бактериемию, менингит, эпиглоттит, целлюлит и инфекционный артрит. Существует по меньшей мере 6 серотипов Н. influenzae с различными химическими структурами капсульных полисахаридов (типы a-f). Однако только типы а и b считаются штаммами Н. influenzae с высокой вирулентностью, и большая часть детских инфекций, как полагают, вызвана типом b (Jin et al. Infect. Immun. June 2007, vol. 75, no. 6, 2650-2654), который, соответственно, является предпочтительным типом полисахарида Н.influenzae для применения с настоящим изобретением. Структура повторяющегося звена капсульного полисахарида типа b была определена и представляет собойCapsular polysaccharides of Haemophilus influenzae. In some embodiments of the present invention, the polysaccharide-containing antigen comprises a capsular polysaccharide derived from H. influenzae. H. influenzae is a Gram-negative, anaerobic pathogenic bacterium responsible for a wide range of localized and invasive infections, including pneumonia, bacteremia, meningitis, epiglottitis, cellulitis, and infectious arthritis. There are at least 6 serotypes of H. influenzae with different chemical structures of capsular polysaccharides (types a-f). However, only types a and b are considered highly virulent strains of H. influenzae, and most childhood infections are thought to be caused by type b (Jin et al. Infect. Immun. June 2007, vol. 75, no. 6, 2650-2654 ), which is accordingly the preferred type of H. influenzae polysaccharide for use with the present invention. The structure of the type b capsular polysaccharide repeat unit has been determined and is

H3)-3-D-Rib/-(l^l)-D-Ribitol<^H3)-3-D-Rib/-(l^l)-D-Ribitol<^

Капсульные полисахариды Neisseria meningitidis: Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид содержит капсульный полисахарид, происходящий из N. meningitidis. N. meningitidis представляет собой грамотрицательную бактерию, которая является основным возбудителем менингита и менингококковой септической инфекции. Существуют по меньшей мере 13 серогрупп N. meningitidis с различными химическими структурами капсульного полисахарида (серогруппы А, В, С, Е-29, Н, I, K, L, W-135, X, Y, Z и Z' (29Е)). Однако считается, что только шесть серогрупп (А, В, С, W-135, X, Y) вызывают опасное для жизни заболевание. Структуры повторяющегося звена капсульного полисахарида для пяти основных опасных для жизни серогрупп, представляющих интерес для получения конъюгата, определены и представляют собойNeisseria meningitidis capsular polysaccharides: In some embodiments of the present invention, the polysaccharide-containing antigen comprises a capsular polysaccharide derived from N. meningitidis. N. meningitidis is a Gram-negative bacterium that is the main causative agent of meningitis and meningococcal septicemia. There are at least 13 serogroups of N. meningitidis with different chemical structures of the capsular polysaccharide (serogroups A, B, C, E-29, H, I, K, L, W-135, X, Y, Z and Z' (29E) ). However, only six serogroups (A, B, C, W-135, X, Y) are believed to cause life-threatening disease. The capsular polysaccharide repeat unit structures for the five major life-threatening serogroups of interest for conjugate preparation have been determined and are

- 30 044044- 30 044044

Тип АType A

H6)-a-D-ManpNAc(3/4OAc)-(I^OPO3^]H6)-a-D-ManpNAc(3/4OAc)-(I^OPO3^]

ТипСTypeC

[^9)-a-D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2^][^9)-a-D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2^]

Тип W-135Type W-135

[^6)-a-D-Galp-(l^4)-a-D-Neup5Ac(9OAc)-a-(2^][^6)-a-D-Galp-(l^4)-a-D-Neup5Ac(9OAc)-a-(2^]

ТипХTypeX

H4)-a-D-Glc/?NAc-(l ^ОРО₃^]H4)-aD-Glc/?NAc-(l ^ОРО ₃ ^]

Тип YType Y

[^6)-a-D-Glc/;-(l^4)-a-D-Neup5Ac(9OAc)-a-(2^][^6)-a-D-Glc/;-(l^4)-a-D-Neup5Ac(9OAc)-a-(2^]

Капсульные полисахариды Porphyromonas gingivalis. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6); см. Van Winkelhoff et al. (1993) Oral Microbiol. Immunol. 8:259-265; и Laine et al. (1996) J. Periodontal Res. 31: 278-84.Capsular polysaccharides of Porphyromonas gingivalis. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6); see Van Winkelhoff et al. (1993) Oral Microbiol. Immunol. 8:259-265; and Laine et al. (1996) J. Periodontal Res. 31: 278-84.

Капсульные полисахариды Salmonella typhi. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид Vi. Vi представляет собой капсульный полисахарид Salmonella typhi (ранее классифицированной как отдельный вид, но теперь упоминаемой как серовар typhi S.entericd). Vi также может быть обнаружен в других сероварах Salmonella (таких как серовар paratyphi С S.enterica или серовар dublin), а также у других бактерий, таких как Citrobacter (например, C.freundii и C.youngae). Полисахарид Vi представляет собой линейный гомополимер гексозаминоуроновой кислоты, α-1,4-N-ацетилгалактозаминоуроновой кислоты, которая ацетилирована на 60-90% в положении С-3. Замена О-ацетил на Vi является одним из факторов, лежащих в основе его способности вызывать защитный иммунный ответ. Иммуногенность Vi тесно связана со степенью его О-ацетилирования. Частичное де-О-ацетилирование может незначительно повысить иммуногенность; полное де-О-ацетилирование устраняет иммуногенность Vi. Полисахарид Vi, применяемый в настоящем изобретении, может быть химически модифицирован по сравнению с природным капсульным полисахаридом. Например, полисахарид Vi может быть частично де-О-ацетилирован, де-N-ацетилирован (частично или полностью), N-пропионирован (частично или полностью) и т.д. Деацетилирование может происходить до, во время или после конъюгации, но предпочтительно происходит до конъюгации. Эффект деацетилирования и т.д. можно оценить с помощью рутинных количественных исследований.Capsular polysaccharides of Salmonella typhi. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a Vi polysaccharide. Vi is a capsular polysaccharide of Salmonella typhi (previously classified as a separate species, but now referred to as serovar typhi S. entericd). Vi can also be found in other Salmonella serovars (such as serovar paratyphi C of S. enterica or serovar dublin), as well as in other bacteria such as Citrobacter (for example, C. freundii and C. youngae). Polysaccharide Vi is a linear homopolymer of hexosaminuronic acid, α-1,4-N-acetylgalactosaminuronic acid, which is 60-90% acetylated at the C-3 position. The replacement of O-acetyl by Vi is one of the factors underlying its ability to induce a protective immune response. The immunogenicity of Vi is closely related to the degree of its O-acetylation. Partial de-O-acetylation may slightly increase immunogenicity; complete de-O-acetylation eliminates the immunogenicity of Vi. The Vi polysaccharide used in the present invention may be chemically modified from the natural capsular polysaccharide. For example, the Vi polysaccharide may be partially de-O-acetylated, de-N-acetylated (partially or completely), N-propionated (partially or completely), etc. Deacetylation can occur before, during or after conjugation, but preferably occurs before conjugation. Effect of deacetylation, etc. can be assessed using routine quantitative studies.

Сахариды Staphylococcus aureus. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид из S.aureus. Полисахарид может представлять собой экзополисахарид S.aureus, который представляет собой поли-N-ацетилглюкозамин (PNAG) или капсульный полисахарид S.aureus, который может относиться, например, к типу 5, типу 8 или типу 336.Saccharides of Staphylococcus aureus. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide from S. aureus. The polysaccharide may be an S. aureus exopolysaccharide, which is poly-N-acetylglucosamine (PNAG), or a S. aureus capsular polysaccharide, which may be, for example, type 5, type 8, or type 336.

Поверхностный полисахарид Clostridium difficile: Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой поверхностный гликан из C.difficile, такой как PS-I или PS-II.Clostridium difficile surface polysaccharide: In another embodiment of the present invention, the antigen is a surface glycan from C. difficile, such as PS-I or PS-II.

Глюканы.Glucans.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой глюкан, содержащий в-1,3-связи и/или β-1,6-связи. Эти конъюгированные глюканы можно применять для стимуляции противогрибкового иммунного ответа, например, против Candida albicans. Глюканы представляют собой содержащие глюкозу полисахариды, обнаруженные, помимо прочего, в клеточных стенках грибков. β-глюканы содержат одну или более β-связей между субзвеньями глюкозы. Глюкан, применяемый в соответствии с настоящим изобретением, содержит β-связи и может содержать только β-связи (т.е. α-связи отсутствуют). Глюкан может содержать одну или более в-1,3-связей и/или одну или более в-1,6-связей. Он может также содержать одну или более в-1,2-связей и/или в-1,4-связей, но обычно единственными β-связями будут в-1,3-связи и/или в-1,6-связи. Глюкан может быть разветвленным или линейным. Глюкан может представлять собой грибковый глюкан. Грибковый глюкан обычно будет получен из грибка, но, если конкретная структура глюкана обнаруживается как в грибах, так и в организмах, отличных от грибков (например, в бактериях, низших растениях или водорослях), тогда организм, отличный от грибка, может применяться в качестве альтернативного источника. Соответственно, глюкан может происходить из клеточной стенки Candida, например, C.albicans, или из Coccidioides immitis, Trichophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis или Pythiumn insidiosum. Существуют различные источники грибковых β-глюканов. Например, чистые β-глюканы являются коммерчески доступными, например, пустулан (Calbiochem) представляет собой β-1,6-глюкан, очищенный из Umbilicaria papullosa. β-глюканы могут быть очищены из клеточных стенок грибков различными способами. Согласно некотоAccording to another embodiment of the present invention, the antigen is a glucan containing β-1,3 linkages and/or β-1,6 linkages. These conjugated glucans can be used to stimulate an antifungal immune response, for example against Candida albicans. Glucans are glucose-containing polysaccharides found, among other things, in the cell walls of fungi. β-Glucans contain one or more β-linkages between glucose subunits. The glucan used in accordance with the present invention contains β-linkages and may contain only β-linkages (ie, no α-linkages). The glucan may contain one or more β-1,3 linkages and/or one or more β-1,6 linkages. It may also contain one or more β-1,2 bonds and/or β-1,4 bonds, but typically the only β bonds will be β-1,3 bonds and/or β-1,6 bonds. Glucan can be branched or linear. The glucan may be a fungal glucan. A fungal glucan will usually be derived from a fungus, but if a particular glucan structure is found in both fungi and non-fungal organisms (such as bacteria, lower plants, or algae), then the non-fungal organism can be used as alternative source. Accordingly, the glucan may be derived from the cell wall of Candida, for example C. albicans, or from Coccidioides immitis, Trichophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis or Pythium insidiosum. There are various sources of fungal β-glucans. For example, pure β-glucans are commercially available, for example pustulan (Calbiochem) is a β-1,6-glucan purified from Umbilicaria papullosa. β-Glucans can be purified from fungal cell walls in a variety of ways. According to some

- 31 044044 рым вариантам реализации настоящего изобретения глюкан представляет собой в-1,3-глюкан с некоторым разветвлением β-1,6, которое наблюдают, например, в ламинаринах. Ламинарины встречаются в бурых водорослях и морских водорослях. Соотношения β(1-3):β(1-6) ламинаринов различаются среди различных источников, например, оно составляет всего лишь 3:2 в ламинарине Eisenia bicyclis и вплоть до 7:1 в ламинарине Laminaria digititata. Соответственно, глюкан, применяемый в настоящем изобретении, может иметь соотношение β(1-3): β(1-6) от 1,5:1 до 7,5:1, например, приблизительно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 или 7:1. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения глюкан имеет исключительно или преимущественно в-1,3-связи, как наблюдается в курдлане. Соответственно, глюкан может состоять исключительно из в-1,3-соединенных остатков глюкозы (например, линейные β-Dглюкопиранозы исключительно с 1,3-связями). Однако необязательно глюкан может содержать моносахаридные остатки, которые не являются в-1,3-соединенными остатками глюкозы, например, он может содержать в-1,6-соединенные остатки глюкозы. Соотношение в-1,3-соединенных остатков глюкозы и указанных других остатков должно быть по меньшей мере 8:1 (например, >9:1, >10:1, >11:1, >12:1, >13:1, >14:1, >15:1, >16:1, >17:1, >18:1, >19:1, >20:1, >25:1, >30:1, >35:1, >40:1, >45:1, >50:1, >75:1, >100:1 и т.д.).- 31 044044 In other embodiments of the present invention, the glucan is a β-1,3-glucan with some β-1,6 branching, which is observed, for example, in laminarins. Laminarins are found in brown algae and seaweed. The ratios of β(1-3):β(1-6) laminarins vary among different sources, for example, it is as low as 3:2 in Eisenia bicyclis laminarin and up to 7:1 in Laminaria digititata laminarin. Accordingly, the glucan used in the present invention may have a β(1-3):β(1-6) ratio of 1.5:1 to 7.5:1, for example about 2:1, 3:1, 4 :1, 5:1, 6:1 or 7:1. In other embodiments of the present invention, the glucan has exclusively or predominantly β-1,3 linkages, as observed in curdlan. Accordingly, a glucan may consist exclusively of β-1,3-linked glucose residues (e.g., linear β-Dglucopyranoses with exclusively 1,3-linkages). However, the glucan may optionally contain monosaccharide residues that are not β-1,3-linked glucose residues, for example, it may contain β-1,6-linked glucose residues. The ratio of β-1,3-linked glucose residues to specified other residues must be at least 8:1 (e.g., >9:1, >10:1, >11:1, >12:1, >13:1, >14:1, >15:1, >16:1, >17:1, >18:1, >19:1, >20:1, >25:1, >30:1, >35:1, >40:1, >45:1, >50:1, >75:1, >100:1, etc.).

Гликаны опухолевого происхождения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, содержит не соответствующий стадии развития поверхностный гликан, характерный для опухолевых клеток. Danishefsky (см. обзор в Zhu et al. Expert Rev Vaccines. 2009(10): 1399-1413), наряду с другими, открыл, что определенные олигосахаридные мотивы (специфичные для стадии развития эмбриональные антигены, SSEA) первоначально экспрессируются на клеточных поверхностях во время эмбриогенеза и повторно активируются в опухолях у взрослых. Поскольку они представляют собой короткие полисахариды, в основном они доступны за счет химического синтеза (см. обзор Zhu, выше). Среди этих олигосахаридов с канцерогенезом (например, раком предстательной железы и раком молочной железы) наиболее четко связаны Globo-H, Le^y, STn, TF и Tn.Glycans of tumor origin. According to some embodiments of the present invention, the polysaccharide-containing antigen contains a developmentally inappropriate surface glycan characteristic of tumor cells. Danishefsky (reviewed in Zhu et al. Expert Rev Vaccines. 2009(10): 1399-1413), among others, discovered that certain oligosaccharide motifs (stage-specific embryonic antigens, SSEA) are initially expressed on cell surfaces during during embryogenesis and are reactivated in adult tumors. Because they are short polysaccharides, they are mainly available through chemical synthesis (see review by Zhu, above). Among these oligosaccharides, those most clearly associated with carcinogenesis (eg, prostate cancer and breast cancer) are Globo-H, ^Ley , STn, TF, and Tn.

Гаптены: Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит гаптен: неполимерный синтетический фрагмент с молекулярной массой менее 1000 Да. Применение гаптенов в терапевтических белковых конъюгатах относится к гаптенам, которые имитируют лекарственные препараты, вызывающие зависимость, например, никотин или кокаин (см., например, Berkowitz & Spector. Science. 1972(178): 1290-1292 для морфина; Kosten et al. Vaccine. 2002(20): 1196-1204 для кокаина; и Hatsukami et al. Clin Pharmacol Ther. 2005(78):456-467). Конъюгирование слабоиммуногенных в других отношениях малых молекул с иммуногенными полипептидами позволяет стимулировать выработку специфических для лекарственного препарата антител, которые изолируют лекарственные препараты, вызывающие зависимость, от центральной нервной системы.Haptens: In some embodiments of the present invention, the antigen comprises a hapten: a non-polymeric synthetic fragment with a molecular weight of less than 1000 Da. The use of haptens in therapeutic protein conjugates refers to haptens that mimic drugs of abuse, such as nicotine or cocaine (see, for example, Berkowitz & Spector. Science. 1972(178): 1290-1292 for morphine; Kosten et al. Vaccine 2002(20): 1196-1204 for cocaine, and Hatsukami et al Clin Pharmacol Ther 2005(78):456-467). Conjugation of otherwise weakly immunogenic small molecules to immunogenic polypeptides allows the stimulation of drug-specific antibodies that isolate addictive drugs from the central nervous system.

Способы дериватизации и получения антигенов и полученные в результате композиции.Methods for derivatization and production of antigens and resulting compositions.

В настоящем изобретении описаны антигены, содержащие химическую рукоятку, которая способна вступать в реакцию с соответствующей группой, введенной в неприродную аминокислоту полипептида, как описано ранее в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка содержит группу, подходящую для реакции клик-химии с соответствующей группой на полипептиде. Химические группы, подходящие для клик-химии, включают, но не ограничиваются ими, азидную (-N₃), алкиновую (С=С), фосфиновую (например, -P(Ph)₂),The present invention describes antigens containing a chemical handle that is capable of reacting with a corresponding group introduced into a non-natural amino acid of the polypeptide, as described previously herein. In some embodiments of the present invention, the chemical handle contains a group suitable for a click chemistry reaction with a corresponding group on the polypeptide. Chemical groups suitable for click chemistry include, but are not limited to, azide ( _-N3 ), alkyne (C=C), phosphine (e.g. -P(Ph) ₂ ),

алкеновую (С=С) и 1,2,4,5-тетразиновую^ ^{N N} ^группы.alkene (C=C) and 1,2,4,5-tetrazine^ ^NN ^ groups.

Химическую рукоятку вводят с помощью общего способа, включающего 3 этапа: (а) активацию антигена; (b) необязательно взаимодействие антигена с линкером или нуклеофильной группой для придания реакционной способности, обычно не присутствующей в антигене; и (с) конъюгирование антигена с химической рукояткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения два или более этапов (а)-(с) являются одновременными, например, в том случае, когда химическая рукоятка модифицирована с помощью добавления реакционноспособного фрагмента, такого как Nгидроксисукцинимид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения два или более этапов (а)-(с) являются дискретными с необязательной очисткой антигена между этапами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения этап (а) дополнительно включает этап для удаления блокирующей группы на антигене так, что определенные функциональные группы (например, гидроксилы, амины, тиолы) становятся более доступными для активации.The chemical handle is administered using a general method involving 3 steps: (a) antigen activation; (b) optionally reacting the antigen with a linker or nucleophilic group to impart reactivity not normally present in the antigen; and (c) conjugating the antigen to a chemical handle. In some embodiments of the present invention, two or more steps (a)-(c) are simultaneous, for example, when the chemical handle is modified by the addition of a reactive moiety, such as Nhydroxysuccinimide. According to some embodiments of the present invention, two or more steps (a)-(c) are discrete, with optional antigen purification between steps. In some embodiments of the present invention, step (a) further includes the step of removing a blocking group on the antigen so that certain functional groups (eg, hydroxyls, amines, thiols) become more available for activation.

Химическую рукоятку необязательно вводят в разных местоположениях по отношению к антигену. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическую рукоятку вводят на конце (например, восстанавливающие и невосстанавливающие концы полисахарида, N- и С-концы полипептида или конец ацильной цепи глицерида). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическую рукоятку вводят во внутреннее местоположение (например, внутреннюю аминокислоту полипептида или внутренний гидроксил, амин или активированный гидроксил полисахарида). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическую рукояткуThe chemical handle is optionally introduced at different locations relative to the antigen. In some embodiments of the present invention, a chemical handle is introduced at the end (eg, the reducing and non-reducing ends of a polysaccharide, the N- and C-termini of a polypeptide, or the end of a glyceride acyl chain). In some embodiments of the present invention, the chemical handle is introduced into an internal location (eg, an internal amino acid of a polypeptide or an internal hydroxyl, amine, or activated hydroxyl of a polysaccharide). According to some embodiments of the present invention, a chemical handle

- 32 044044 вводят на одном или более концах в дополнение к внутреннему местоположению. Конкретный способ активации, применяемый для антигена, будет влиять на местоположения, активированные для конъюгации, и, следовательно, на конечное местоположение конъюгированной химической рукоятки на антигене. Предпочтительным является введение нескольких химических ручек в антиген так, чтобы он мог образовать несколько связей с носителями.- 32 044044 is inserted at one or more ends in addition to the internal location. The specific mode of activation applied to the antigen will influence the locations activated for conjugation and therefore the final location of the conjugated chemical handle on the antigen. It is preferable to introduce multiple chemical handles into the antigen so that it can form multiple bonds with the carriers.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ конъюгирования полипептида с антигеном за счет химических ручек заключается в следующем. Антиген активируют для включения в него по меньшей мере одной первой химической рукоятки, причем первая химическая рукоятка способна к конъюгации со второй химической рукояткой нпАК в полипептиде. Активированный антиген комбинируют с полипептидом, содержащим по меньшей мере одну нпАК, содержащую вторую рукоятку, в условиях, при которых первая и вторая химические рукоятки реагируют с образованием конъюгата антиген-полипептид. Осуществленная таким способом реакция представляет собой некаталитическую реакцию ковалентной биоконъюгации. Реактивные сайты на антигене, которые служат первой химической рукояткой, предпочтительно представляют собой алкинильные группы, причем алкинильные группы могут быть включены в молекулярное окружение, которое увеличивает реакционную способность. Например, алкинильные группы могут быть включены в кольцо, например, циклооктинильное кольцо, такое как диарил-напряженный циклооктин. Предпочтительные реакционноспособные сайты в полипептиде, т.е. вторая химическая рукоятка, которые обеспечены остатками нпАК, представляют собой азидогруппы. Как известно специалистам в данной области техники, в данном случае реакция представляет собой [3+2] циклоприсоединение, называемое в данной области техники облегченное напряжением азид-алкиновое циклоприсоединение (SPAAC), которое обсуждается более подробно ниже.According to a preferred embodiment of the present invention, a method for conjugating a polypeptide to an antigen using chemical handles is as follows. The antigen is activated to include at least one first chemical handle, wherein the first chemical handle is capable of conjugation with a second chemical handle of the npAK in the polypeptide. The activated antigen is combined with a polypeptide containing at least one npAK containing a second handle under conditions in which the first and second chemical handles react to form an antigen-polypeptide conjugate. The reaction carried out in this way is a non-catalytic covalent bioconjugation reaction. The reactive sites on the antigen that serve as the first chemical handle are preferably alkynyl groups, and the alkynyl groups may be included in a molecular environment that enhances reactivity. For example, alkynyl groups may be included on a ring, for example a cyclooctynyl ring such as a diaryl-strained cyclooctyn. Preferred reactive sites in the polypeptide, i.e. the second chemical handle, which is provided by npAA residues, are azido groups. As is known to those skilled in the art, the reaction in this case is a [3+2] cycloaddition, referred to in the art as stress-assisted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC), which is discussed in more detail below.

Активация антигенов.Activation of antigens.

Антиген необязательно активируют с применением любого химического способа, описанного для получения биоконъюгатов. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, окисление периодатом, снятие маскировки собственного альдегида (например, восстанавливающий конец полисахарида), активацию тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридина (CDAP) или активацию гидроксила с применением 1,Г-карбонилдиимидазола (CDI) с последующим нуклеофильным добавлением. Другие химические стратегии дериватизации сахаридов описаны в Hermanson (Hermanson, Greg. Bioconjugate Techniques (2008)). Для активации можно применять цианилирующие реагенты (такие как пнитрофенилцианат, CDAP или тетрафторборат N-цианотриэтиламмония), активные сложные эфиры, карбодиимиды, гидразиды, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU и т.д.The antigen is optionally activated using any chemical method described for the preparation of bioconjugates. Such methods include, but are not limited to, periodate oxidation, demasking of the intrinsic aldehyde (e.g., the reducing end of the polysaccharide), activation with 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP), or hydroxyl activation using 1,G-carbonyldiimidazole (CDI) with subsequent nucleophilic addition. Other chemical strategies for saccharide derivatization are described in Hermanson (Hermanson, Greg. Bioconjugate Techniques (2008)). Cyanylating reagents (such as pnitrophenyl cyanate, CDAP or N-cyanotriethylammonium tetrafluoroborate), active esters, carbodiimides, hydrazides, norborane, p-nitrobenzoic acid, N-hydroxysuccinimide, S-NHS, EDC, TSTU, etc. can be used for activation.

Согласно настоящему изобретению предложен антиген (в частности, полисахаридный антиген, описанный в настоящем документе, такой как пневмококковый капсульный полисахаридный антиген), который активирован в соответствии с любой из обсуждаемых ниже химических реакций, например, продукт реакции антигена с одной или более группами DBCO и DIFO, обсуждаемый ниже.The present invention provides an antigen (specifically, a polysaccharide antigen described herein, such as pneumococcal capsular polysaccharide antigen) that is activated by any of the chemical reactions discussed below, for example, the reaction product of the antigen with one or more DBCO and DIFO groups , discussed below.

Активация периодатом.Activation by periodate.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген активируют с помощью окисления периодатом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения окисление периодатом применяют для введения альдегидных групп в антиген, и его можно применять для добавления альдегидов к: 1) полисахаридам; и 2) N-концевым остаткам полипептидов для получения активированного антигена. Периодат расщепляет углерод-углеродные химические связи, которые имеют первичный или вторичный гидроксил или амин на любом конце, и активирует тем самым остатки углеводного сахара, несущие соседние гидроксилы, или аминокислоты, содержащие 2-амино спиртовой фрагмент (N-концевые остатки треонина или серина). Поскольку альдегидный фрагмент имеет длительный период полужизни, активированные этим способом антигены необязательно хроматографически очищают и/или лиофилизируют после активации.In some embodiments of the present invention, the antigen is activated by periodate oxidation. In some embodiments of the present invention, periodate oxidation is used to introduce aldehyde groups into an antigen and can be used to add aldehydes to: 1) polysaccharides; and 2) N-terminal residues of polypeptides to produce activated antigen. Periodate cleaves carbon-carbon chemical bonds that have a primary or secondary hydroxyl or amine at either end, thereby activating carbohydrate sugar residues bearing adjacent hydroxyls, or amino acids containing a 2-amino alcohol moiety (N-terminal threonine or serine residues) . Because the aldehyde moiety has a long half-life, antigens activated by this method are not necessarily chromatographically purified and/or lyophilized after activation.

Для периодатного окисления антигенов: (а) антигены растворяют в растворе; (b) источник периодата добавляют к антигену из концентрированного исходного раствора с образованием окислительной смеси; (в) реакционную смесь инкубируют; и (d) (необязательно) удаляют избыток периодата.For periodate oxidation of antigens: (a) antigens are dissolved in solution; (b) the periodate source is added to the antigen from a concentrated stock solution to form an oxidizing mixture; (c) the reaction mixture is incubated; and (d) (optionally) removing excess periodate.

Для реакции окисления необязательно применяют деионизированную воду или подходящий забуференный раствор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раствор на этапе (а) представляет собой деионизированную воду. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раствор на этапе (а) содержит эффективное количество буфера с рКа, приблизительно соответствующей физиологическому значению рН. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раствор на этапе (а) содержит эффективное количество буфера с рКа, приблизительно соответствующей физиологическому значению рН, причем указанный буфер не содержит аминогруппу. Примеры не содержащих аминогруппу буферов включают, но не ограничиваются ими, ацетат, формиат и фосфат.Optionally, deionized water or a suitable buffered solution is used for the oxidation reaction. In some embodiments of the present invention, the solution in step (a) is deionized water. According to some embodiments of the present invention, the solution in step (a) contains an effective amount of buffer with a pKa approximately corresponding to physiological pH. According to some embodiments of the present invention, the solution in step (a) contains an effective amount of a buffer with a pKa approximately corresponding to physiological pH, wherein said buffer does not contain an amino group. Examples of non-amine buffers include, but are not limited to, acetate, formate, and phosphate.

Источник периодата на этапе (b) необязательно выбирают из любого источника периодата с соответствующей стабильностью в водном растворе. Примеры источников периодата включают, но не ограничиваются ими, периодат натрия, периодат калия, (мета) периодат тетрабутиламмония, периодат бария,The periodate source in step (b) is optionally selected from any periodate source with suitable stability in aqueous solution. Examples of periodate sources include, but are not limited to, sodium periodate, potassium periodate, tetrabutylammonium (meta)periodate, barium periodate,

- 33 044044 тригидроортопериодат натрия, (пара) перйодат натрия и (мета) перйодат тетраэтиламмония.- 33 044044 sodium trihydroorthoperiodate, (para)sodium periodate and (meta)tetraethylammonium periodate.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровень добавления периодата и условия реакции корректируют для превращения в альдегиды всех доступных диолов на полисахариде. Например, большие избыточные количества периодата натрия (>1000-кратный избыток по отношению к молярной концентрации полисахарида или 10 мМ раствор периодата натрия) в комбинации с инкубацией при комнатной температуре способствуют полному превращению диолов в альдегиды.In some embodiments of the present invention, the periodate addition level and reaction conditions are adjusted to convert all available diols on the polysaccharide to aldehydes. For example, large excess amounts of sodium periodate (>1000-fold excess relative to the molar concentration of the polysaccharide or 10 mM sodium periodate solution) in combination with incubation at room temperature promote complete conversion of diols to aldehydes.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровень добавления периодата и условия реакции корректируют для введения низкого уровня окисления/образования альдегидов в полисахаридную цепь. Количество периодата натрия, которое ниже стехиометрического (например, <1,0 экв.), в реакции окисления способствует низкой степени окисления полисахаридной цепи. Например, бактериальный сахарид активируют с применением 0,001-0,7, 0,005-0,5, 0,01-0,5, 0,1-1,2, 0,1-0,5, 0,10,2, 0,5-0,8, 0,1-0,8, 0,3-1,0 или 0,4-0,9 молярных эквивалентов периодата (см. WO2011/110531). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения 0,4 молярного эквивалента периодата добавляют в раствор с рН 6,0, содержащий пневмококковый капсульный полисахарид, и инкубируют в течение 17 ч при 25°С (см. WO2011/110531).In some embodiments of the present invention, the level of periodate addition and reaction conditions are adjusted to introduce a low level of oxidation/aldehyde formation into the polysaccharide chain. An amount of sodium periodate that is below stoichiometric (eg, <1.0 eq.) in the oxidation reaction contributes to a low degree of oxidation of the polysaccharide chain. For example, a bacterial saccharide is activated using 0.001-0.7, 0.005-0.5, 0.01-0.5, 0.1-1.2, 0.1-0.5, 0.10.2, 0 .5-0.8, 0.1-0.8, 0.3-1.0 or 0.4-0.9 molar periodate equivalents (see WO2011/110531). According to another embodiment of the present invention, 0.4 molar equivalent of periodate is added to a pH 6.0 solution containing pneumococcal capsular polysaccharide and incubated for 17 hours at 25°C (see WO2011/110531).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения менее 0,001%, 0,01%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 30% или 50% вицинальных диолов бактериального сахарида окисляются во время активации периодатом (см. WO2011/110531), например, 5-10%. Низкие значения температуры реакции также способствуют снижению степени окисления полисахаридной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения низкие концентрации периодата (<0,1 экв.) комбинируют с реакциями в течение ночи при 4°С, чтобы свести к минимуму окисление полисахаридной цепи конкретных капсульных полисахаридов, таких как 19F S. pneumoniae.In one embodiment of the present invention, less than 0.001%, 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 30%, or 50% of the bacterial saccharide vicinal diols are oxidized during activation periodate (see WO2011/110531), for example 5-10%. Low reaction temperatures also help to reduce the degree of oxidation of the polysaccharide chain. In some embodiments of the present invention, low concentrations of periodate (<0.1 eq.) are combined with overnight reactions at 4°C to minimize polysaccharide chain oxidation of specific capsular polysaccharides, such as S. pneumoniae 19F.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровень добавления периодата и условия реакции корректируют для непосредственного расщепления полисахаридной цепи до выборочных сахаров. Например, 1 мМ NaIO₄ при 4°С применяют, согласно литературным данным, для селективного окисления остатков сиаловой кислоты при 7, 8 или 9 атомах углерода, в то время как 10 мМ NaIO4 при комнатной температуре применяют для окисления широкого спектра остатков сахаров, включая остатки сиаловой кислоты, галактозы и маннозы.In some embodiments of the present invention, the periodate addition level and reaction conditions are adjusted to directly cleave the polysaccharide chain to selective sugars. For example, 1 mM NaIO4 at ₄ °C is used, according to the literature, for the selective oxidation of sialic acid residues at 7, 8 or 9 carbon atoms, while 10 mM NaIO4 at room temperature is used for the oxidation of a wide range of sugar residues, including residues of sialic acid, galactose and mannose.

Для окисления N-концевых остатков серина или метионина в белковых антигенах обычно применяют более мягкие условия окисления (низкие концентрации периодата и меньшее время реакции), чтобы избежать окислительного повреждения внутренних боковых цепей антигенов. В одном варианте реализации этап (b) включает добавление периодата натрия до конечной концентрации 2,5 мМ, и этап (с) включает инкубацию реакционной смеси при 25°С в течение 3 мин.For the oxidation of N-terminal serine or methionine residues in protein antigens, milder oxidation conditions (low periodate concentrations and shorter reaction times) are usually used to avoid oxidative damage to the internal side chains of the antigens. In one embodiment, step (b) includes adding sodium periodate to a final concentration of 2.5 mM, and step (c) includes incubating the reaction mixture at 25°C for 3 minutes.

Поскольку избыточный не вступивший в реакцию периодат может вызывать более высокие, чем желательно, уровни окисления или повреждение иммуногенных фрагментов в антигене, избыточный периодат необязательно удаляют на этапе (d). Для больших антигенов (>10 кДа) избыток периодата, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, удаляют с помощью гель-фильтрации, диализа или диафильтрации против воды или буферного раствора с применением среды с подходящим пределом отсечения молекулярной массы или пределом исключения. Для небольших антигенов, для которых очистка на основе размера является неудобной (короткие пептиды или олигосахариды) удаление периодата на этапе (d) включает добавление нейтрализующего агента. Избыток периодата необязательно нейтрализуют добавлением глицерина (10% (об./об.)), добавлением молярного избытка сульфита натрия или добавлением молярного избытка N-ацетилметионина.Since excess unreacted periodate may cause higher than desirable levels of oxidation or damage to immunogenic moieties in the antigen, excess periodate is not necessarily removed in step (d). For large antigens (>10 kDa), excess periodate, according to some embodiments of the present invention, is removed by gel filtration, dialysis, or diafiltration against water or buffer using media with a suitable molecular weight cutoff or exclusion limit. For small antigens for which size-based purification is inconvenient (short peptides or oligosaccharides), periodate removal in step (d) involves the addition of a neutralizing agent. The excess periodate is optionally neutralized by adding glycerol (10% (v/v)), adding a molar excess of sodium sulfite, or adding a molar excess of N-acetylmethionine.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения с полисахаридного или белкового антигена снимают защиту, чтобы увеличить доступность гидроксильных или аминных групп для активации периодатом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения О-ацетильные или N-ацетильные группы на полисахаридах удаляют, чтобы повысить способность соседних гидроксилов реагировать с периодатом. В случае полисахаридных антигенов де-О-ацетилирование или де-Nацетилирование необязательно осуществляют путем инкубации в растворе слабой кислоты (например, с низкой концентрацией HCl) или щелочи (например, бикарбоната натрия) с последующим необязательным нагреванием и корректировкой рН для возвращения к физиологическому значению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обработку слабой кислотой (<0,1 М HCl или <0,2 М АсОН) с последующим нагреванием и нейтрализацией применяют для частичного гидролиза (доведение до требуемого размера) полисахаридов с высокой молекулярной массой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обработку слабой кислотой (например, <0,1 М HCl или <0,2 М АсОН) с последующим нагреванием (45-95°С) и нейтрализацией (до рН 5,5-6,0) применяют для одновременного частичного гидролиза (доведение до требуемого размера) полисахаридов с высокой молекулярной массой и снятия защиты с полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения серотипы 3, 4, 18С и 11А обрабатывают с помощью такого способа кислота/нагревание/нейтрализация для снятия защиты с полисахарида, доведения до требуемого размера полисахарида или и того, и другого. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисаIn some embodiments of the present invention, a polysaccharide or protein antigen is deprotected to increase the availability of hydroxyl or amine groups for activation by periodate. According to one embodiment of the present invention, O-acetyl or N-acetyl groups on the polysaccharides are removed to increase the ability of adjacent hydroxyls to react with the periodate. For polysaccharide antigens, de-O-acetylation or de-N-acetylation is optionally accomplished by incubation in a solution of a weak acid (eg, low concentration of HCl) or alkali (eg, sodium bicarbonate), followed by optional heating and pH adjustment to return to physiological values. In some embodiments of the present invention, treatment with a weak acid (<0.1 M HCl or <0.2 M AcOH) followed by heating and neutralization is used to partially hydrolyze (bring to the required size) high molecular weight polysaccharides. According to some embodiments of the present invention, treatment with a weak acid (for example, <0.1 M HCl or <0.2 M AcOH) followed by heating (45-95°C) and neutralization (to pH 5.5-6.0) is used for simultaneous partial hydrolysis (bringing to the required size) of polysaccharides with high molecular weight and deprotection of the polysaccharide. In some embodiments of the present invention, serotypes 3, 4, 18C, and 11A are treated with such an acid/heat/neutralization process to deprotect the polysaccharide, size the polysaccharide, or both. According to one embodiment of the present invention, the policy

- 34 044044 харид серотипа 3 S. pneumoniae обрабатывают 0,18 М уксусной кислотой с последующим нагреванием при 85°С в течение 1 ч. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисахарид серотипа 4 S. pneumoniae обрабатывают 0,01 М HCl с последующим нагреванием при 45°С в течение 1 ч. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисахарид 18С S. pneumoniae обрабатывают 0,18 М уксусной кислотой с последующим нагреванием при 95°С в течение 40 мин. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисахарид серотипа 11А S. pneumoniae обрабатывают 0,18 М уксусной кислотой с последующим нагреванием при 80°С в течение 1 ч.- 34 044044 S. pneumoniae serotype 3 polysaccharide is treated with 0.18 M acetic acid followed by heating at 85°C for 1 hour. In one embodiment of the present invention, the S. pneumoniae serotype 4 polysaccharide is treated with 0.01 M HCl followed by heating at 45°C for 1 hour. In one embodiment of the present invention, S. pneumoniae 18C polysaccharide is treated with 0.18 M acetic acid followed by heating at 95°C for 40 minutes. In one embodiment of the present invention, the S. pneumoniae serotype 11A polysaccharide is treated with 0.18 M acetic acid followed by heating at 80°C for 1 hour.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения N-формильные группы на очищенных белках удаляют/аминные группы деформилируют путем обработки формил-Ь-метионил-пептидамидогидролазой в деионизированной воде или физиологическом рН-забуференном растворе. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения N-формильные группы на очищенных белках удаляют путем обработки лиофилизированного белка безводными парами гидразина при -5°С (Miyataki et al. Em. J. Biochem. 212, 785-789 (1993)).According to another embodiment of the present invention, the N-formyl groups on purified proteins are removed/amine groups deformylated by treatment with formyl-L-methionyl-peptidedamidohydrolase in deionized water or physiological pH-buffered solution. According to another additional embodiment of the present invention, N-formyl groups on purified proteins are removed by treating the lyophilized protein with anhydrous hydrazine vapor at -5° C. (Miyataki et al. Em. J. Biochem. 212, 785-789 (1993)).

Активация CDAP.CDAP activation.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген активируют путем образования временного аддукта с тетрафторборатом циано-4-диметиламинопиридина (CDAP) (см., например, WO2011/110531 и US20120321658). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гидроксильные группы на белковом или полисахаридном антигене активируют с помощью реакции с CDAP с образованием временного цианато (-OCN) аддукта, который затем подвергают реакции с подходящим нуклеофилом на химической рукоятке или линкере с образованием карбамимидатной связи. В этом варианте реализации химические связи С-С на антигене не расщепляются (в отличие от активации периодатом). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конкретные капсульные полисахариды предпочтительно активируют с применением CDAP. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения капсульные полисахариды серотипа 3, 7F или 10А S. pneumoniae активируют с применением CDAP.In some embodiments, the antigen is activated by forming a transient adduct with cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) (see, for example, WO2011/110531 and US20120321658). In some embodiments, hydroxyl groups on a protein or polysaccharide antigen are activated by reaction with CDAP to form a transient cyanato (-OCN) adduct, which is then reacted with a suitable nucleophile on a chemical handle or linker to form a carbamidate bond. In this embodiment, the C-C chemical bonds on the antigen are not cleaved (unlike periodate activation). In some embodiments of the present invention, specific capsular polysaccharides are preferably activated using CDAP. In specific embodiments of the present invention, S. pneumoniae serotype 3, 7F, or 10A capsular polysaccharides are activated using CDAP.

Для активации антигенов CDAP: (а) антиген растворяют в подходящем растворителе; (b) CDAP добавляют к антигену из концентрированного раствора; (с) добавляют буферный агент.To activate CDAP antigens: (a) the antigen is dissolved in a suitable solvent; (b) CDAP is added to the antigen from a concentrated solution; (c) add a buffering agent.

Активацию с применением CDAP необязательно выполняют в любом подходящем растворителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель в (а) содержит дистиллированную воду. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения растворитель в (а) дополнительно содержит органический растворитель, такой как ДМСО или ацетонитрил. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения капсульные полисахариды серотипа 3, 7F или 10А S. pneumoniae активируют в воде.Activation using CDAP is optionally performed in any suitable solvent. According to some embodiments of the present invention, the solvent in (a) contains distilled water. According to other embodiments of the present invention, the solvent in (a) further comprises an organic solvent such as DMSO or acetonitrile. In specific embodiments of the present invention, S. pneumoniae serotype 3, 7F, or 10A capsular polysaccharides are activated in water.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для активации применяют супра- или субстехиометрические (по отношению к полисахариду) количества CDAP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для активации полисахарида применяют от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 экв. CDAP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для активации полисахарида применяют приблизительно 0,2-0,8 экв. CDAP. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид серотипа 3 S. pneumoniae активируют с применением 2,0 экв. CDAP. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид серотипа 10А S. pneumoniae активируют с применением 0,8 экв. CDAP.In some embodiments of the present invention, supra- or substoichiometric (relative to the polysaccharide) amounts of CDAP are used for activation. In some embodiments of the present invention, from about 0.1 to about 3 equivalents are used to activate the polysaccharide. CDAP. In some embodiments of the present invention, approximately 0.2-0.8 eq. is used to activate the polysaccharide. CDAP. In one embodiment of the present invention, the S. pneumoniae serotype 3 capsular polysaccharide is activated using 2.0 eq. CDAP. In one embodiment of the present invention, the S. pneumoniae serotype 10A capsular polysaccharide is activated using 0.8 eq. CDAP.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения добавление буферного агента в (с) применяют для значительного повышения эффективности активации CDAP (Lees et al. Vaccine. 1996 (14): 190-198). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения буферный агент в (с) представляет собой триэтаноламин (TEA). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в качестве буферного агента применяют от 1 до 4 экв. ТЭА (относительно полисахарида). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для реакции активации CDAP с участием полисахарида серотипа 7F S. pneumoniae в качестве буферного агента применяют от приблизительно 1 до приблизительно 4 экв. TEA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в качестве буферного агента применяют 2,5 экв. TEA. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для реакции активации CDAP с участием полисахарида серотипа 7F S. pneumoniae в качестве буферного агента применяют 2,5 экв. TEA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения буферный агент представляет собой борат натрия, карбонат натрия или гидроксид натрия и любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения буферный агент имеет рКа от приблизительно 8,0 до приблизительно 11,0, или буферный агент применяют для доведения рН реакционного раствора до значения от приблизительно 8,0 до приблизительно 11,0. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения буферный агент имеет рКа от приблизительно 9,0 до приблизительно 9,5, или буферный агент применяют для доведения рН реакционного раствора до значения от приблизительно 9,0 до приблизительно 9,5. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для реакции активации CDAP с участием полисахарида серотипа 3 S. pneumoniae значение рН доводят до 9,5 с помощью гидроксида натрия. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для реакции активации CDAP с участием полисахарида серотипа 10А S. pneumoniae значение рН доводят до 9,5 с помощью гидроксида натрия.In some embodiments of the present invention, the addition of a buffering agent in (c) is used to significantly increase the efficiency of CDAP activation (Lees et al. Vaccine. 1996 (14): 190-198). In some embodiments of the present invention, the buffering agent in (c) is triethanolamine (TEA). In some embodiments of the present invention, 1 to 4 eq. is used as a buffering agent. TEA (relative to polysaccharide). In one embodiment of the present invention, for the CDAP activation reaction involving S. pneumoniae serotype 7F polysaccharide, from about 1 to about 4 equiv is used as a buffering agent. TEA. According to some embodiments of the present invention, 2.5 eq. is used as a buffering agent. TEA. According to one embodiment of the present invention, for the CDAP activation reaction involving S. pneumoniae serotype 7F polysaccharide, 2.5 equiv is used as a buffering agent. TEA. In some embodiments of the present invention, the buffering agent is sodium borate, sodium carbonate, or sodium hydroxide, and any combination thereof. In some embodiments of the present invention, the buffering agent has a pKa of from about 8.0 to about 11.0, or the buffering agent is used to adjust the pH of the reaction solution to a value from about 8.0 to about 11.0. In some embodiments of the present invention, the buffering agent has a pKa of from about 9.0 to about 9.5, or the buffering agent is used to adjust the pH of the reaction solution to a value of from about 9.0 to about 9.5. In one embodiment of the present invention, the CDAP activation reaction involving S. pneumoniae serotype 3 polysaccharide is adjusted to pH 9.5 with sodium hydroxide. In one embodiment of the present invention, the CDAP activation reaction involving S. pneumoniae serotype 10A polysaccharide is adjusted to pH 9.5 with sodium hydroxide.

- 35 044044- 35 044044

Активация карбонилдиимидазолом (CDI)/карбонилдитриазолом (CDT).Activation by carbonyldiimidazole (CDI)/carbonylditriazole (CDT).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген активируют карбонилдиимидазолом (CDI) или карбонилдитриазолом (CDT). CDI и CDT, подобно CDAP, способны активировать гидроксильные группы на антигене с образованием временного реакционноспособного фраг-In some embodiments, the antigen is activated with carbonyldiimidazole (CDI) or carbonylditriazole (CDT). CDI and CDT, like CDAP, are capable of activating hydroxyl groups on the antigen to form a temporary reactive fragment.

для CDI и мента; в данном случае он представляет собой нестабильный карбамат (for CDI and ment; in this case it is an unstable carbamate (

для CDT), который затем необязательно подвергают взаимодействию с амином или тиолом на химической рукоятке или линкере с образованием карбаматной или карботиоатной связи. Активация должна проводиться в сухом органическом растворителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активацию CDI/CDT проводят в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активацию CDI/CDT проводят путем добавления молярного избытка CDI/CDT по отношению к антигену. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активацию CDI/CDT проводят путем добавления молярного количества CDI/CDT, приблизительно равного молярному количеству антигена.for CDT), which is then optionally reacted with an amine or thiol on a chemical handle or linker to form a carbamate or carbothioate bond. Activation must be carried out in a dry organic solvent. In some embodiments of the present invention, CDI/CDT activation is performed in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). In some embodiments of the present invention, activation of CDI/CDT is accomplished by adding a molar excess of CDI/CDT relative to the antigen. In other embodiments of the present invention, activation of CDI/CDT is accomplished by adding a molar amount of CDI/CDT approximately equal to the molar amount of antigen.

Нехимическая активация.Non-chemical activation.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эндогенные амины или другие нуклеофильные фрагменты (например, первичный амин), которые либо присутствуют в природе, либо являются результатом этапа снятия защиты (например, как обсуждалось выше), применяют для конъюгации конкретного полисахарида с химической рукояткой или белком-носителем. Такие нуклеофильные фрагменты можно удобно подвергать взаимодействию с различными обычными электрофильными реагентами для конъюгации, такими как производные сукцината (например, N-гидроксисукцинимид (NHS) или сложные эфиры сульфо-NHS). В таких вариантах реализации иногда предпочтительно проводить обработку с применением протокола для периодата, как в (i), чтобы стимулировать разрушение антигенных загрязнителей, таких как С-полисахарид S. pneumoniae. В этом варианте реализации после обработки периодатом применяют очень большой избыток борогидрида натрия для нейтрализации любых химически введенных альдегидных групп. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисахарид серотипа 1 S. pneumoniae обрабатывают от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,25 экв. периодата натрия при комнатной температуре в течение от приблизительно 12 до приблизительно 14 ч, после чего проводят обработку от приблизительно 5 экв. до приблизительно 15 экв. борогидрида натрия. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полисахарид серотипа 1 S. pneumoniae обрабатывают 0,15 экв. периодата натрия при комнатной температуре в течение 18 ч с последующей обработкой 10 экв. борогидрида натрия.In some embodiments of the present invention, endogenous amines or other nucleophilic moieties (eg, a primary amine) that are either naturally occurring or result from a deprotection step (eg, as discussed above) are used to conjugate a particular polysaccharide to a chemical handle or protein. carrier. Such nucleophilic moieties can be conveniently reacted with a variety of conventional electrophilic conjugation reagents, such as succinate derivatives (eg, N-hydroxysuccinimide (NHS) or sulfo-NHS esters). In such embodiments, it is sometimes preferable to perform the treatment using a periodate protocol as in (i) to promote the destruction of antigenic contaminants such as S. pneumoniae C-polysaccharide. In this embodiment, after periodate treatment, a very large excess of sodium borohydride is used to neutralize any chemically introduced aldehyde groups. In one embodiment of the present invention, the S. pneumoniae serotype 1 polysaccharide is treated with from about 0.05 to about 0.25 eq. sodium periodate at room temperature for about 12 to about 14 hours, followed by treatment with about 5 eq. up to approximately 15 eq. sodium borohydride. In one embodiment of the present invention, the S. pneumoniae serotype 1 polysaccharide is treated with 0.15 eq. sodium periodate at room temperature for 18 hours, followed by treatment with 10 eq. sodium borohydride.

Конъюгация с химической рукояткой.Conjugation with a chemical handle.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген конъюгируют с химической рукояткой с применением любого химического способа, совместимого со способами активации, описанными выше (Активация антигенов). Такие способы включают, но не ограничиваются ими, образование основания Шиффа с синтетическими антигенными альдегидами с последующим восстановительным аминированием, образованием гидразона, образованием оксима, прямым нуклеофильным присоединением и образованием основания Шиффа с нативными альдегидами антигена с последующим восстановительным аминированием. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения абсолютная концентрация полисахарида в реакции конъюгации с химической рукояткой важна для уменьшения до минимума агрегации или перекрестной реактивности полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения абсолютная концентрация полисахарида/антигена в реакции конъюгации с DBCO (дибензоциклооктином) или производным DBCO важна для полисахаридов, активированных периодатом или CDAP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения концентрация полисахарида в реакции конъюгации DBCO/производное DBCO составляет менее 2, менее 5, менее 7, менее 10, менее 15, менее 17,5 или менее 20 мкмоль/мл. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения концентрация полисахарида в реакции конъюгации DBCO/производное DBCO составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 17,5 мкмоль/мл.In some embodiments of the present invention, an antigen is conjugated to a chemical handle using any chemical method compatible with the activation methods described above (Antigen Activation). Such methods include, but are not limited to, Schiff base formation with synthetic antigenic aldehydes followed by reductive amination, hydrazone formation, oxime formation, direct nucleophilic addition, and Schiff base formation with native antigen aldehydes followed by reductive amination. In some embodiments of the present invention, the absolute concentration of the polysaccharide in the conjugation reaction with the chemical handle is important to minimize aggregation or cross-reactivity of the polysaccharide. In some embodiments of the present invention, the absolute concentration of the polysaccharide/antigen in the conjugation reaction with DBCO (dibenzocyclooctyne) or a DBCO derivative is important for periodate- or CDAP-activated polysaccharides. In some embodiments, the concentration of polysaccharide in the DBCO/DBCO derivative conjugation reaction is less than 2, less than 5, less than 7, less than 10, less than 15, less than 17.5, or less than 20 μmol/ml. In some embodiments of the present invention, the concentration of polysaccharide in the DBCO/DBCO derivative conjugation reaction is from about 1.5 to about 17.5 μmol/ml.

Реакции с антигенами, активированными периодатом.Reactions with antigens activated by periodate.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с полипептидным или полисахаридным антигеном, активированным, как описано выше (Активация антигенов), с применением периодата. В этих вариантах реализации химическую рукоятку, содержащую функциональную группу, которая образует стабильный или полустабильный аддукт с альдегидами, комбинируют с антигеном, активированным периодатом, с последующим необязательным восстановлением для превращения полустабильных аддуктов в стабильные аддукты (см., например, WO2014/111344; Wu et al. Vaccine 31(2013): 5623-2626; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition, 2008). Согласно некоторым модификациям этих вариантов реализации химическую рукоятку добавляют в большом молярном избытке по отношению к альдегидным группам на активированном антигене так, что в реакции конъюгации химическая рукоятка/антиген расходуются все альдегиды. В других модификациях этих вариантов реализации химическую рукоятку добавляют в более низкомIn some embodiments of the present invention, the chemical handle is conjugated to a polypeptide or polysaccharide antigen activated as described above (Antigen Activation) using periodate. In these embodiments, a chemical handle containing a functional group that forms a stable or semi-stable adduct with aldehydes is combined with a periodate-activated antigen, followed by optional reduction to convert semi-stable adducts to stable adducts (see, for example, WO2014/111344; Wu et al Vaccine 31(2013): 5623-2626; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition, 2008). In some modifications of these embodiments, the chemical handle is added in large molar excess relative to the aldehyde groups on the activated antigen such that all the aldehydes are consumed in the chemical handle/antigen conjugation reaction. In other modifications of these embodiments, the chemical handle is added at a lower

- 36 044044 молярном соотношении по отношению к альдегидным группам на активированном антигене, и избыток не вступивших в реакцию альдегидов на активированном антигене расходуется в последующей реакции с избытком недорогого альдегидреактивного нуклеофила (например, этаноламина) или при обработке восстановителем, достаточно сильным для восстановления альдегидов до гидроксильных групп (например, NaBH₄).- 36 044044 molar ratio relative to the aldehyde groups on the activated antigen, and the excess unreacted aldehydes on the activated antigen are consumed in subsequent reaction with an excess of an inexpensive aldehyde-reactive nucleophile (for example, ethanolamine) or by treatment with a reducing agent strong enough to reduce the aldehydes to hydroxyl groups (for example, NaBH ₄ ).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с антигеном за счет образования основания Шиффа с синтетическими антигенными альдегидами с последующим восстановительным аминированием. Этот вариант реализации позволяет получить конечный продукт, который имеет вторичную аминную связь между химической рукояткой и антигеном: непосредственную химическую связь N-C между амином химической рукоятки и атомом углерода на антигене. В этом варианте реализации химическая рукоятка содержит амин. В этом варианте реализации способ конъюгации включает: комбинирование аминсодержащей рукоятки с антигеном, активированным периодатом, в деионизированной воде или забуференном растворе, содержащем ДМСО; инкубацию с образованием основания Шиффа; восстановление основания Шиффа до вторичного амина с применением цианоборогидрида натрия (NaBH₃CN); и необязательно нейтрализацию не вступивших в реакцию альдегидов с помощью NaBH₄. Согласно некоторым вариантам реализации этого способа химическую рукоятку и антиген комбинируют в стехиометрическом соотношении 1: 1 или примерно равном ему. Согласно некоторым вариантам реализации этого способа химическую рукоятку и антиген комбинируют с молярным избытком химической рукоятки. Согласно некоторым вариантам реализации этого способа химическую рукоятку и антиген комбинируют с молярным избытком антигена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цианоборогидрид натрия заменяет другой восстановитель с аналогичной селективностью для восстановления химических связей C=N, такой как триацетоксиборогидрид натрия.According to one embodiment of the present invention, the chemical handle is conjugated to an antigen by forming a Schiff base with synthetic antigenic aldehydes followed by reductive amination. This embodiment produces a final product that has a secondary amine bond between the chemical handle and the antigen: a direct NC chemical bond between the amine of the chemical handle and a carbon atom on the antigen. In this embodiment, the chemical handle contains an amine. In this embodiment, the conjugation method includes: combining an amine handle with a periodate-activated antigen in deionized water or a buffered solution containing DMSO; incubation to form a Schiff base; reduction of the Schiff base to a secondary amine using sodium cyanoborohydride (NaBH ₃ CN); and optionally neutralizing unreacted aldehydes with NaBH ₄ . In some embodiments of this method, the chemical handle and the antigen are combined in a stoichiometric ratio of or approximately 1:1. In some embodiments of this method, the chemical handle and the antigen are combined with a molar excess of the chemical handle. In some embodiments of this method, the chemical handle and the antigen are combined with a molar excess of the antigen. In some embodiments of the present invention, sodium cyanoborohydride replaces another reducing agent with similar selectivity for reducing C=N chemical bonds, such as sodium triacetoxyborohydride.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с антигеном за счет образования гидразона. В этом варианте реализации химическая рукоятка содержит гидразидную (-C(=O)-NH-NH2) группу. Этот вариант реализации позволяет получить конечный продукт, который имеет гидразоновую (-C(=O)-NH-N=C-) или N'-алкилгидразидную (-C(=O)-NH-NH-C-) связь между химической рукояткой и углеродом антигена. В этом варианте реализации способ конъюгации включает: комбинирование молярного избытка гидразидсодержащей химической рукоятки с антигеном в растворе с рН 6,0-8,5 и инкубацию с образованием гидразона (-C(=O)-NH-N=C-). Согласно некоторым другим вариантам реализации этого способа цианоборогидрид натрия или триацетоксиборогидрид натрия включают в реакционную смесь для восстановления химической связи N=C с получением N'-алкилгидразида (-C(=O)-NH-NH-C-).According to one embodiment of the present invention, the chemical handle is conjugated to an antigen through the formation of a hydrazone. In this embodiment, the chemical handle contains a hydrazide (-C(=O)-NH-NH2) group. This embodiment produces a final product that has a hydrazone (-C(=O)-NH-N=C-) or N'-alkylhydrazide (-C(=O)-NH-NH-C-) linkage between the chemical handle and antigen carbon. In this embodiment, the conjugation method includes: combining a molar excess of a hydrazide-containing chemical handle with an antigen in a pH 6.0-8.5 solution and incubating to form a hydrazone (-C(=O)-NH-N=C-). In some other embodiments of this method, sodium cyanoborohydride or sodium triacetoxyborohydride is included in the reaction mixture to reduce the N=C chemical bond to produce N'-alkylhydrazide (-C(=O)-NH-NH-C-).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с антигеном за счет образования оксима. В этом варианте реализации химическая рукоятка содержит аминоокси (-O-NH2) группу. Этот вариант реализации позволяет получить конечный продукт, который имеет оксимную (-O-N=C-) связь между химической рукояткой и углеродом антигена. В этом варианте реализации способ конъюгации включает: комбинирование молярного избытка аминооксисодержащей химической рукоятки с антигеном в растворе с рН 6,0-8,5 и инкубацию с образованием оксимной связи (-O-N=C-). В некоторых других вариантах этого способа цианоборогидрид натрия или триацетоксиборогидрид натрия включают в реакционную смесь для восстановления химической связи N=C и улучшения стабильности; это приводит к образованию N'-алкилгидроксиламинной связи (-O-N-C-).According to one embodiment of the present invention, the chemical handle is conjugated to an antigen through the formation of an oxime. In this embodiment, the chemical handle contains an aminooxy (-O-NH2) group. This embodiment produces a final product that has an oxime (-O-N=C-) bond between the chemical handle and the antigen carbon. In this embodiment, the conjugation method includes: combining a molar excess of an aminooxy-containing chemical handle with an antigen in a pH 6.0-8.5 solution and incubating to form an oxime bond (-O-N=C-). In some other embodiments of this method, sodium cyanoborohydride or sodium triacetoxyborohydride is included in the reaction mixture to restore the N=C chemical bond and improve stability; this results in the formation of an N'-alkylhydroxylamine bond (-O-N-C-).

Реакции с CDAP-активированными антигенами.Reactions with CDAP-activated antigens.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с полипептидным или полисахаридным антигеном, активированным с применением CDAP, как описано выше (активация CDAP). В этих вариантах реализации временная цианато (-OCN) группа, полученная за счет активации CDAP, затем взаимодействует с аминосодержащей химической рукояткой с получением карбамимидатной связи (-NH-C(=NH)-O-) между химической рукояткой и углеродом антигена.In some embodiments of the present invention, the chemical handle is conjugated to a polypeptide or polysaccharide antigen activated using CDAP as described above (CDAP activation). In these embodiments, the transient cyanato (-OCN) group produced by CDAP activation is then reacted with an amine-containing chemical handle to produce a carbamidate bond (-NH-C(=NH)-O-) between the chemical handle and the carbon of the antigen.

Для конъюгации химических ручек с CDAP гидроксильные группы на антигене активируют, как описано выше (активация CDAP), и в активационную смесь дополнительно добавляют химическую рукоятку, содержащую амин. Поскольку цианатогруппа лабильна, химическую рукоятку обычно добавляют вскоре (в течение нескольких минут) после активации антигена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген добавляют через 2,5 мин после введения CDAP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения добавляют большой молярный избыток аминсодержащей химической рукоятки по отношению к активированным гидроксильным группам на антигене. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения химическую рукоятку добавляют в концентрации, близкой к молярному соотношению 1:1 по отношению к активированным гидроксильным группам на антигене, и избыток не вступивших в реакцию цианатных групп истощают путем добавления избытка недорогого амина (например, этаноламина или гександиамина).To conjugate chemical handles to CDAP, the hydroxyl groups on the antigen are activated as described above (CDAP activation), and an amine-containing chemical handle is further added to the activation mixture. Because the cyano group is labile, the chemical handle is usually added soon (within minutes) after antigen activation. In some embodiments, the antigen is added 2.5 minutes after CDAP administration. According to some embodiments of the present invention, a large molar excess of the amine-containing chemical handle is added relative to the activated hydroxyl groups on the antigen. In other embodiments of the present invention, the chemical handle is added at a concentration approaching a 1:1 molar ratio to the activated hydroxyl groups on the antigen, and excess unreacted cyanate groups are depleted by adding excess inexpensive amine (eg, ethanolamine or hexanediamine).

Реакции с CDI/CDT-активированными антигенами.Reactions with CDI/CDT-activated antigens.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с полипептидным или полисахаридным антигеном, активированным с применением CDI/CDT,In some embodiments of the present invention, the chemical handle is conjugated to a CDI/CDT activated polypeptide or polysaccharide antigen,

- 37 044044 как описано выше (активация карбонилдиимидазолом (CDI)/карбонилдитриазолом (CDT)). В этих вариантах нестабильный карбамат, полученный в результате активации антигенных гидроксильных групп с- 37 044044 as described above (activation with carbonyldiimidazole (CDI)/carbonylditriazole (CDT)). In these embodiments, the unstable carbamate resulting from the activation of antigenic hydroxyl groups with

П применением CDI/CDT ( ^о для CDI иUsing CDI/CDT ( ^for CDI and

для CDT), затем взаимодействует с первичным амином с получением стабильной карбаматной (-NH-C(=O)-O-) связи или с первичным тиолом с получением стабильной карботиоатной (-S-C(=O)-O-) связи между химической рукояткой и углеродом антигена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения добавляют большой молярный избыток амин/тиолсодержащей химической рукоятки по отношению к активированным гидроксильным группам на антигене. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения химическую рукоятку добавляют в концентрации, близкой к молярному соотношению 1:1 по отношению к активированным гидроксильным группам на антигене. В других вариантах реализации остаточный CDI/CDT в реакции затем инактивируют путем обработки тетраборатом натрия.for CDT), then reacts with a primary amine to produce a stable carbamate (-NH-C(=O)-O-) bond or with a primary thiol to produce a stable carbothioate (-S-C(=O)-O-) bond between the chemical handle and antigen carbon. In some embodiments, a large molar excess of the amine/thiol-containing chemical handle is added relative to the activated hydroxyl groups on the antigen. In other embodiments of the present invention, the chemical handle is added at a concentration approaching a 1:1 molar ratio relative to the activated hydroxyl groups on the antigen. In other embodiments, the residual CDI/CDT in the reaction is then inactivated by treatment with sodium tetraborate.

Реакции с неактивированными антигенами.Reactions with non-activated antigens.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка конъюгирована с эндогенным амином или другим нуклеофильным фрагментом (например, первичным амином), который либо присутствует в природе, либо является результатом этапа снятия защиты с полипептидного или полисахаридного антигена, как описано выше. Согласно одному варианту реализации вышеописанного электрофильную группу (например, NHS или сложный эфир сульфо-NHS) на химической рукоятке подвергают взаимодействию с первичной аминогруппой на антигене с получением амидной связи (-C(=Q)-NH-) между химической рукояткой и амином антигена. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбоксильную группу на химической рукоятке подвергают взаимодействию с первичной аминогруппой на антигене в присутствии стандартных реагентов для связывания пептидов и условий для получения амидной связи между химической рукояткой и амином антигена.In some embodiments of the present invention, the chemical handle is conjugated to an endogenous amine or other nucleophilic moiety (eg, a primary amine) that is either naturally occurring or results from a polypeptide or polysaccharide antigen deprotection step as described above. In one embodiment of the above, an electrophilic group (eg, NHS or sulfo-NHS ester) on the chemical handle is reacted with a primary amine group on the antigen to form an amide bond (-C(=Q)-NH-) between the chemical handle and the amine of the antigen. In another embodiment of the present invention, a carboxyl group on a chemical handle is reacted with a primary amine group on an antigen in the presence of standard peptide coupling reagents and conditions to form an amide bond between the chemical handle and the amine of the antigen.

Алкинсодержащие рукоятки.Alkine-containing handles.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка содержит фрагмент, который обеспечивает реакцию клик-химии с соответствующей группой на остатке нпАК полипептида. Один из таких фрагментов представляет собой алкиновую группу, которая способна вступать в реакцию с остатком нпАК, содержащим азидогруппу. В простейшем варианте реализации такой фрагмент представляет собой пропаргильную группу так, что алкиновая группа на антигене содержит структуру формулы IVAccording to some embodiments of the present invention, the chemical handle contains a moiety that enables a click chemistry reaction with an appropriate group on an npAK residue of the polypeptide. One of these fragments is an alkyne group, which is capable of reacting with an npAA residue containing an azido group. In the simplest embodiment, such a moiety is a propargyl group such that the alkyne group on the antigen contains the structure of formula IV

где L22 представляет собой С1-С₁₀-алкил иwhere L22 represents C1-C ₁₀ -alkyl and

U1 представляет собой по меньшей мере один фрагмент антигена.U1 represents at least one antigen fragment.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения алкиновая группа на антигене содержит структуру формулы IVaIn other embodiments of the present invention, the alkyne group on the antigen contains the structure of formula IVa

где L22 представляет собой -(CH₂CH₂Q)1.₁₀- иwhere L22 represents -(CH ₂ CH ₂ Q)1. ₁₀ - and

U₁ представляет собой по меньшей мере один фрагмент антигена.U ₁ represents at least one antigen fragment.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения алкиновая группа дополнительно содержит дополнительные признаки, которые ускоряют или облегчают реакцию алкина с азидогруппой. Примером одного такого признака является 8-членная кольцевая структура (например, циклооктин), так, что алкиновая группа на антигене дополнительно содержит группу DIFQ или DBCQ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения алкиновая группа на антигене содержит структуру формулы V, формулы VI или ViaAccording to some embodiments of the present invention, the alkyne group further contains additional features that accelerate or facilitate the reaction of the alkyne with the azido group. An example of one such feature is an 8-membered ring structure (eg, cyclooctyne) such that the alkyne group on the antigen additionally contains a DIFQ or DBCQ group. In some embodiments of the present invention, the alkyne group on the antigen contains a structure of Formula V, Formula VI, or Via

в которых L1 независимо представляет собой химическую связь, -NH-, -О-, -S-, -NH(L₁₂)-, -Q(L₁₂)-, или -S(L₁₂)-;wherein L1 independently represents a chemical bond, -NH-, -O-, -S-, -NH(L ₁₂ )-, -Q(L ₁₂ )-, or -S(L ₁₂ )-;

L2 независимо представляет собой химическую связь, -С(=О)-, -S(=Q)₂-, -C(=Q)L₁₂-, -S(=Q)₂L₁₂;L2 independently represents a chemical bond, -C(=O)-, -S(=Q) ₂ -, -C(=Q)L ₁₂ -, -S(=Q) ₂ L ₁₂ ;

L₁₂ независимо представляет собой L22 или L22NH-;L ₁₂ is independently L22 or L22NH-;

L22 независимо представляет собой С_1-1оалкил или -(CH₂CH₂Q)i.i₀- иL22 independently represents C _1-1 oalkyl or -(CH ₂ CH ₂ Q)ii ₀ - and

- 38 044044- 38 044044

U1 независимо представляет собой по меньшей мере один фрагмент антигена.U1 independently represents at least one antigen fragment.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения структуры формул V и VIa легко образуются из антигена, содержащего нуклеофильную группу (например, первичный амин), и NHS или сложный эфир сульфо-NHS соответствующих DIFO- или DBCO-карбоновых кислот из структур V и VIa. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения структуры формулы VI легко образуются из активированного антигена и производного DBCO, такого как DBCO-NH2 или DBCOPEGn-NH2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения DBCO-PEGn-NH2 представляет собой DBCO-PEG4-NH2.In some embodiments of the present invention, structures of formulas V and VIa are readily formed from an antigen containing a nucleophilic group (eg, a primary amine) and an NHS or sulfo-NHS ester of the corresponding DIFO or DBCO carboxylic acids from structures V and VIa. In some embodiments of the present invention, structures of Formula VI are readily formed from an activated antigen and a DBCO derivative, such as DBCO-NH2 or DBCOPEGn-NH2. In some embodiments of the present invention, DBCO-PEGn-NH2 is DBCO-PEG4-NH2.

Значение n в PEGn представляет собой количество повторяющихся звеньев оксиэтилена, например, в структуре, показанной выше, или в формуле VII, формуле VIIb, формуле XI или фрагменте А, или в полиалкилокси L22. Значение n находится в пределах диапазона 1-20, например, в пределах 218, 3-16 или 4-14. Таким образом, n может принимать любое значение, например, 4, 5, 11, 12 или 13.The n value in PEGn represents the number of repeating units of oxyethylene, for example in the structure shown above, or in Formula VII, Formula VIIb, Formula XI or fragment A, or in polyalkyloxy L22. The value of n is within the range of 1-20, such as 218, 3-16, or 4-14. So n can take any value, such as 4, 5, 11, 12 or 13.

Согласно некоторым вариантам реализации формул IV, V или VI фрагмент U₁ представляет собой по меньшей мере один полиол полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент U₁ представляет собой по меньшей мере один полиол липополисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент U₁ представляет собой по меньшей мере одну аминокислоту антигенного полипептида.In some embodiments of formulas IV, V, or VI, the U ₁ moiety is at least one polysaccharide polyol. In some embodiments of the present invention, the U ₁ moiety is at least one lipopolysaccharide polyol. In some embodiments of the present invention, the U ₁ fragment represents at least one amino acid of an antigenic polypeptide.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антиген, содержащий алкин, содержит структуру формулы VII или VIIaIn other embodiments of the present invention, the alkyne-containing antigen contains a structure of formula VII or VIIa

в которых X независимо представляет собой по меньшей мере один полиол полисахарида и n составляет по меньшей мере 1.wherein X independently represents at least one polysaccharide polyol and n is at least 1.

Если группа (например, X, Y или U1) описана как полиол, это может относиться к химическому прикреплению к полиолу в полисахариде (например, к моносахариду в полисахариде, причем указанный моносахарид представляет собой полиол). Прикрепление как таковое может происходить к любой подходящей функциональной группе (например, к альдегиду, который может возникнуть в результате окисления вицинального диола).If a group (eg, X, Y or U1) is described as a polyol, this may refer to a chemical attachment to a polyol in a polysaccharide (eg, a monosaccharide in a polysaccharide, wherein said monosaccharide is a polyol). Attachment as such can occur to any suitable functional group (for example, to an aldehyde, which may result from the oxidation of a vicinal diol).

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения алкинсодержащий антиген содержит структуру формулы VIIb или VIIcIn other embodiments of the present invention, the alkyne-containing antigen contains a structure of formula VIIb or VIIc

- 39 044044- 39 044044

(формула Vile) в которых X независимо представляет собой амин по меньшей мере одного аминосахара полисаха рида и n составляет по меньшей мере 1.(Vile formula) wherein X independently represents the amine of at least one amino sugar of the polysaccharide and n is at least 1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения алкинсодержащий антиген со держит полисахарид в соответствии с (A-X)z-Y, гдеIn some embodiments of the present invention, the alkyne-containing antigen comprises a polysaccharide according to (A-X)z-Y, wherein

А представляет собойA represents

X независимо представляет собой по меньшей мере один полиол;X independently represents at least one polyol;

Y независимо представляет собой по меньшей мере один полиол полисахарида;Y independently represents at least one polysaccharide polyol;

n составляет по меньшей мере 1 и z больше 1.n is at least 1 and z is greater than 1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит полисахарид, который дополнительно содержит группу DBCO и содержит по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 20% (мас./мас.) ковалентно прикрепленного DBCO. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит более приблизительно 1,5% (мас./мас.) DBCO. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит более 3% (мас./мас.) DBCO. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит не более 20%, не более 19%, не более 18%, не более 17%, не более 16%, не более 15%, не более 14%, не более 13%, не более 12%, не более 11%, не более 10%, не более 9%, не более 8%, не более 7%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3,5%, не более 3,0%, не более 2,5%, не более 2,0% или не более приблизительно 1,7% (мас./мас.) ковалентно прикрепленного DBCO. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит менее 20% (мас./мас.) ковалентно прикрепленного DBCO. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит менее 10% (мас./мас.) ковалентно прикрепленного DBCO. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит приблизительно от 1,5 до 20%, от 3% до 20%, от 3% до 18%, от 3% до 16%, от 3% до 14%, от 3% до 12%, от 3% до 10%, от 3% до 8%, от 3% до 6% или от 3% до 4%, или от 1,5 до 9% (мас./мас.) ковалентно прикрепленного DBCO.According to some embodiments of the present invention, the antigen contains a polysaccharide that further contains a DBCO group and contains at least 1.5%, at least 3%, at least 4%, at least 5%, at least 6%, at least 7%, at least 8%, at least 9%, at least 10%, at least 11%, at least 12%, at least 13%, at least 14%, at least 15%, at least 16%, at least 17%, at least 18%, at least 19%, or at least 20% (w/w) covalently attached DBCO. In some embodiments of the present invention, the antigen contains more than about 1.5% (w/w) DBCO. In some embodiments of the present invention, the antigen contains more than 3% (w/w) DBCO. In some embodiments, the antigen contains no more than 20%, no more than 19%, no more than 18%, no more than 17%, no more than 16%, no more than 15%, no more than 14%, no more than 13%, no more 12%, no more than 11%, no more than 10%, no more than 9%, no more than 8%, no more than 7%, no more than 6%, no more than 5%, no more than 4%, no more than 3.5%, no more than 3.0%, no more than 2.5%, no more than 2.0%, or no more than about 1.7% (w/w) of covalently attached DBCO. In some embodiments, the antigen contains less than 20% (w/w) covalently attached DBCO. In other embodiments of the present invention, the antigen contains less than 10% (w/w) covalently attached DBCO. In some embodiments, the antigen contains from about 1.5 to 20%, from 3% to 20%, from 3% to 18%, from 3% to 16%, from 3% to 14%, from 3% to 12 %, 3% to 10%, 3% to 8%, 3% to 6%, or 3% to 4%, or 1.5 to 9% (w/w) of covalently attached DBCO.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит полисахарид, который дополнительно содержит группу DBCO и содержит по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 20% молекул DBCO на 100 повторяющихся звеньев полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит более 3% молекул DBCO на 100 повторяющихся звеньев полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит не более 20%, не более 19%, не более 18%, не более 17%, не более 16%, не более 15%, не более 14%, не более 13%, не более 12%, не более 11%, не более 10%, не более 9%, не более 8%, не более 7%, не более 6%, не более 5%, не более 4% или не более 3,5% ковалентно прикрепленных молекул DBCO на 100 повторяющихся звеньев полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит менее 20% ковалентно прикрепленного DBCO на повторяющееся звено полисахарида. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит менее 10% ковалентно прикрепленных молекул DBCO на 100 повторяющихся звеньев полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген содержит от приблизительно 3% до 20%, от 3% до 18%, от 3% до 16%, от 3% до 14%, от 3% до 12%, от 3% до 10%, от 3% до 8%, от 3% до 6% или от 3% до 4% ковалентно прикрепленных молекул DBCO на 100 повторяющихся звеньев полисахарида.According to some embodiments of the present invention, the antigen contains a polysaccharide that further contains a DBCO group and contains at least 3%, at least 4%, at least 5%, at least 6%, at least 7%, at least 8%, at least 9%, at least 10%, at least 11%, at least 12%, at least 13%, at least 14%, at least 15%, at least 16% , at least 17%, at least 18%, at least 19%, or at least 20% DBCO molecules per 100 polysaccharide repeat units. In some embodiments, the antigen contains more than 3% DBCO molecules per 100 polysaccharide repeat units. In some embodiments, the antigen contains no more than 20%, no more than 19%, no more than 18%, no more than 17%, no more than 16%, no more than 15%, no more than 14%, no more than 13%, no more 12%, no more than 11%, no more than 10%, no more than 9%, no more than 8%, no more than 7%, no more than 6%, no more than 5%, no more than 4% or no more than 3.5% covalently attached DBCO molecules per 100 repeating polysaccharide units. In some embodiments, the antigen contains less than 20% covalently attached DBCO per polysaccharide repeat unit. In other embodiments, the antigen contains less than 10% covalently attached DBCO molecules per 100 polysaccharide repeat units. In some embodiments, the antigen contains from about 3% to 20%, from 3% to 18%, from 3% to 16%, from 3% to 14%, from 3% to 12%, from 3% to 10% , 3% to 8%, 3% to 6%, or 3% to 4% covalently attached DBCO molecules per 100 polysaccharide repeat units.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, необязательно представляет собой олигосахарид. Олигосахариды имеют низкое количество повторяющихся звеньев (обычно 5-15 повторяющихся звеньев), и их обычно получают синтетическим путем или путем гидролиза полисахаридов с более высокой молекулярной массой.According to one embodiment of the present invention, the polysaccharide-containing antigen is optionally an oligosaccharide. Oligosaccharides have a low number of repeat units (usually 5-15 repeat units) and are usually produced synthetically or by hydrolysis of higher molecular weight polysaccharides.

- 40 044044- 40 044044

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, имеет молекулярную массу от приблизительно 10 кДа до приблизительно 10000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 10000 кДа. В других таких вариантах реализации полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 10000 кДа; от 50 кДа до 9500 кДа; от 50 кДа до 9000 кДа; от 50 кДа до 8500 кДа; от 50 кДа до 8000 кДа; от 50 кДа до 7500 кДа; от 50 кДа до 7000 кДа; от 50 кДа до 6500 кДа; от 50 кДа до 6000 кДа; от 50 кДа до 5500 кДа; от 50 кДа до 5000 кДа; от 50 кДа до 4500 кДа; от 50 кДа до 4000 кДа; от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 10000 кДа; от 100 кДа до 9500 кДа; от 100 кДа до 9000 кДа; от 100 кДа до 8500 кДа; от 100 кДа до 8000 кДа; от 100 кДа до 7500 кДа; от 100 кДа до 7000 кДа; от 100 кДа до 6500 кДа; от 100 кДа до 6000 кДа; от 100 кДа до 5500 кДа; от 100 кДа до 5000 кДа; от 100 кДа до 4500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 9500 кДа; от 200 кДа до 9000 кДа; от 200 кДа до 8500 кДа; от 200 кДа до 8000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 7000 кДа; от 200 кДа до 6500 кДа; от 200 кДа до 6000 кДа; от 200 кДа до 5500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 4500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из вышеуказанных диапазонов предусмотрено как вариант реализации настоящего изобретения.According to one embodiment of the present invention, the polysaccharide-containing antigen has a molecular weight of from about 10 kDa to about 10,000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 10,000 kDa. In other such embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of from 50 kDa to 10,000 kDa; from 50 kDa to 9500 kDa; from 50 kDa to 9000 kDa; from 50 kDa to 8500 kDa; from 50 kDa to 8000 kDa; from 50 kDa to 7500 kDa; from 50 kDa to 7000 kDa; from 50 kDa to 6500 kDa; from 50 kDa to 6000 kDa; from 50 kDa to 5500 kDa; from 50 kDa to 5000 kDa; from 50 kDa to 4500 kDa; from 50 kDa to 4000 kDa; from 50 kDa to 3500 kDa; from 50 kDa to 3000 kDa; from 50 kDa to 2500 kDa; from 50 kDa to 2000 kDa; from 50 kDa to 1750 kDa; from 50 kDa to 1500 kDa; from 50 kDa to 1250 kDa; from 50 kDa to 1000 kDa; from 50 kDa to 750 kDa; from 50 kDa to 500 kDa; from 100 kDa to 10000 kDa; from 100 kDa to 9500 kDa; from 100 kDa to 9000 kDa; from 100 kDa to 8500 kDa; from 100 kDa to 8000 kDa; from 100 kDa to 7500 kDa; from 100 kDa to 7000 kDa; from 100 kDa to 6500 kDa; from 100 kDa to 6000 kDa; from 100 kDa to 5500 kDa; from 100 kDa to 5000 kDa; from 100 kDa to 4500 kDa; from 100 kDa to 4000 kDa; from 100 kDa to 3500 kDa; from 100 kDa to 3000 kDa; from 100 kDa to 2500 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 2000 kDa; from 100 kDa to 1750 kDa; from 100 kDa to 1500 kDa; from 100 kDa to 1250 kDa; from 100 kDa to 1000 kDa; from 100 kDa to 750 kDa; from 100 kDa to 500 kDa; from 200 kDa to 10000 kDa; from 200 kDa to 9500 kDa; from 200 kDa to 9000 kDa; from 200 kDa to 8500 kDa; from 200 kDa to 8000 kDa; from 200 kDa to 7500 kDa; from 200 kDa to 7000 kDa; from 200 kDa to 6500 kDa; from 200 kDa to 6000 kDa; from 200 kDa to 5500 kDa; from 200 kDa to 5000 kDa; from 200 kDa to 4500 kDa; from 200 kDa to 4000 kDa; from 200 kDa to 3500 kDa; from 200 kDa to 3000 kDa; from 200 kDa to 2500 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 2000 kDa; from 200 kDa to 1750 kDa; from 200 kDa to 1500 kDa; from 200 kDa to 1250 kDa; from 200 kDa to 1000 kDa; from 200 kDa to 750 kDa; or from 200 kDa to 500 kDa. Any integer within any of the above ranges is provided as an embodiment of the present invention.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, имеет молекулярную массу от приблизительно 50 кДа до приблизительно 1400 кДа. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген, содержащий полисахарид, имеет молекулярную массу от приблизительно 500 кДа до приблизительно 3000 кДа.According to one embodiment of the present invention, the polysaccharide-containing antigen has a molecular weight of from about 50 kDa to about 1400 kDa. According to one embodiment of the present invention, the polysaccharide-containing antigen has a molecular weight of from about 500 kDa to about 3000 kDa.

Азидосодержащие рукоятки.Azide-containing handles.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка содержит фрагмент, который обеспечивает реакцию клик-химии с соответствующей группой на остатке нпАК полипептида. Один из таких фрагментов представляет собой азидогруппу, которая способна вступать в реакцию с остатком нпАК, содержащим алкиновую группу или фосфин, на полипептиде. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения азидогруппа на антигене содержит структуру формулы VIII /^-NHAccording to some embodiments of the present invention, the chemical handle contains a moiety that enables a click chemistry reaction with an appropriate group on an npAK residue of the polypeptide. One such moiety is an azido group that is capable of reacting with an alkyne or phosphine-containing npAA moiety on the polypeptide. According to some embodiments of the present invention, the azido group on the antigen contains the structure of formula VIII / ^- NH

J-22 UiJ-22 Ui

N3 (VIII),N3 (VIII),

L₂₂ представляет собой связь, алкил или полиалкилокси иL ₂₂ represents a bond, alkyl or polyalkyloxy and

Алкенсодержащие рукоятки.Alkene-containing handles.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химическая рукоятка содержит фрагмент, который обеспечивает реакцию клик-химии с соответствующей группой на остатке нпАК полипептида. Один из таких фрагментов представляет собой алкеновую группу, которая способна вступать в реакцию с остатком нпАК, содержащим 1,2,4,5-тетразиновую группу. В простейших вариантах такой фрагмент представляет собой винильную группу. В одном таком варианте реализации алкеновая группа на антигене содержит структуру формулы IXAccording to some embodiments of the present invention, the chemical handle contains a moiety that enables a click chemistry reaction with an appropriate group on an npAK residue of the polypeptide. One of these fragments is an alkene group, which is capable of reacting with an npAA residue containing a 1,2,4,5-tetrazine group. In the simplest versions, such a fragment is a vinyl group. In one such embodiment, the alkene group on the antigen contains the structure of formula IX

где U₁ независимо представляет собой по меньшей мере один фрагмент антигена.where U ₁ independently represents at least one antigen fragment.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения алкеновая группа на антигене содержит структуру формулы IXaIn other embodiments of the present invention, the alkene group on the antigen contains the structure of formula IXa

где L22 представляет собой С_1-10алкил или -(CH₂CH2O)_1-10- иwhere L22 represents C _1-10 alkyl or -(CH ₂ CH2O) _1-10 - and

U₁ независимо представляет собой по меньшей мере один фрагмент антигена.U ₁ independently represents at least one antigen fragment.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения гликоконъюгата, включающий: (а) обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-носитель, причем указанная нуклеиновая кислота содержит подавляющий кодон; (b) создание реакционной смеси путем комбинирования нуклеиновой кислоты с бесклеточным бактериальным экстрактом, содержащим 4азидометилфенилаланин (pAMF), тРНК, комплементарную подавляющему кодону, и аминоацил-тРНКAccording to one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a glycoconjugate, comprising: (a) providing a nucleic acid encoding a carrier protein, said nucleic acid comprising a suppression codon; (b) creating a reaction mixture by combining the nucleic acid with a cell-free bacterial extract containing 4azidomethylphenylalanine (pAMF), tRNA complementary to the suppression codon, and aminoacyl-tRNA

- 41 044044 синтетазу; (с) инкубацию реакционной смеси (b) в условиях, достаточных для селективного встраивания pAMF в сайт, соответствующий подавляющему кодону, в белке-носителе; и (d) конъюгирование pAMF с полисахаридом с помощью [2+3] циклоприсоединения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения [2+3] циклоприсоединение включает реакцию между азидной и алкиновой группами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения этап (с) включает инкубацию реакционной смеси при температуре ниже 20°С. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает очистку белка-носителя сразу после (с). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения подавляющий кодон селективно заменен в кодоне 25, 34, 38, 40, 213, 215, 228, 245, 265, 386, 523 или 527 из SEQ ID NO: 2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения реакционная смесь в (b) дополнительно содержит биологические компоненты, необходимые для синтеза белка. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения тРНК в (b) способна нагружаться pAMF. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминоацил-тРНКсинтетаза в (b) предпочтительно аминоацилирует тРНК с pAMF по сравнению с 20 природными аминокислотами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения алкиновая группа содержит фрагмент DBCO, конъюгированный с полисахаридом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен гликоконъюгат, полученным способом, включающим этапы (a)-(d). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения pAMF конъюгируют с полисахаридом с получением конъюгата формулы X, Ха, XI или XIa. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая гликоконъюгат, полученный на этапах (a)-(d).- 41 044044 synthetase; (c) incubating the reaction mixture (b) under conditions sufficient to selectively insert pAMF into the site corresponding to the suppressive codon in the carrier protein; and (d) conjugating pAMF to the polysaccharide via [2+3] cycloaddition. According to another embodiment of the present invention, the [2+3] cycloaddition involves the reaction between an azide and an alkyne group. According to another embodiment of the present invention, step (c) includes incubating the reaction mixture at a temperature below 20°C. According to another embodiment of the present invention, the method further comprises purifying the carrier protein immediately after (c). In another embodiment of the present invention, the suppression codon is selectively replaced at codon 25, 34, 38, 40, 213, 215, 228, 245, 265, 386, 523, or 527 of SEQ ID NO: 2. In another embodiment of the present invention, the reaction mixture in (b) additionally contains biological components necessary for protein synthesis. According to another embodiment of the present invention, the tRNA in (b) is capable of loading with pAMF. According to another embodiment of the present invention, the aminoacyl-tRNA synthetase in (b) preferentially aminoacylates tRNA with pAMF over 20 naturally occurring amino acids. According to another embodiment of the present invention, the alkyne group contains a DBCO moiety conjugated to the polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F or any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6). According to another embodiment of the present invention, there is provided a glycoconjugate obtained by a method comprising steps (a)-(d). According to another embodiment of the present invention, pAMF is conjugated to a polysaccharide to form a conjugate of formula X, Xa, XI or XIa. According to one embodiment of the present invention, a vaccine is provided comprising the glycoconjugate obtained in steps (a)-(d).

Конъюгаты полипептид-антиген.Polypeptide-antigen conjugates.

В настоящем документе описаны конъюгаты полипептид-антиген, которые могут образовываться между иммуногенным полипептидом, описанным выше, и антигеном, описанным выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты полипептид-антиген содержат улучшенный белок-носитель и антиген, причем указанный антиген соединен с нпАК в улучшенном белкеносителе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген не соединен с природной аминокислотой иммуногенного полипептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген не соединен с лизином в иммуногенном полипептиде. Например, антиген не соединен с лизином в SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген соединен только с одной или более нпАК иммуногенного полипептида. Одна или более нпАК необязательно расположены на N-конце, С-конце или в любом местоположении между N- и С-концевыми частями иммуногенного полипептида. В некоторых случаях антиген соединен только с одной или более pAMF в иммуногенном полипептиде. Например, антиген соединен только с одной или более pAMF в SEQ ID NO: 1.Described herein are polypeptide-antigen conjugates that can be formed between an immunogenic polypeptide as described above and an antigen as described above. In some embodiments of the present invention, the polypeptide-antigen conjugates comprise an improved carrier protein and an antigen, wherein said antigen is coupled to a nPAA in the improved carrier protein. In one embodiment of the present invention, the antigen is not linked to a naturally occurring amino acid of the immunogenic polypeptide. According to another embodiment of the present invention, the antigen is not linked to a lysine in the immunogenic polypeptide. For example, the antigen is not coupled to a lysine in SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, the antigen is coupled to only one or more NAAs of an immunogenic polypeptide. The one or more npAKs are optionally located at the N-terminus, C-terminus, or any location between the N- and C-terminal portions of the immunogenic polypeptide. In some cases, the antigen is associated with only one or more pAMFs in the immunogenic polypeptide. For example, the antigen is linked to only one or more pAMFs in SEQ ID NO: 1.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один антиген соединен с аминокислотой, расположенной вне Т-клеточного эпитопа иммуногенного полипептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения ни один антиген не соединен с аминокислотой, расположенной в Т-клеточном эпитопе иммуногенного полипептида.According to another embodiment of the present invention, the at least one antigen is linked to an amino acid located outside the T cell epitope of the immunogenic polypeptide. According to another embodiment of the present invention, no antigen is linked to an amino acid located in the T cell epitope of the immunogenic polypeptide.

Аминокислоты, отобранные для конъюгации в иммуногенном полипептиде, необязательно содержат один или более поверхностно-доступных остатков на основании кристаллической структуры (или другой трехмерной структуры, такой как структура по данным ЯМР) полипептида. Дополнительно или альтернативно, для иммуногенного полипептида проводят комплексную замену природных аминокислот нпАК с последующей конъюгацией, чтобы оценить полезность конкретных сайтов на полипептиде для конъюгации.The amino acids selected for conjugation into an immunogenic polypeptide optionally contain one or more surface accessible residues based on the crystal structure (or other three-dimensional structure, such as NMR structure) of the polypeptide. Additionally or alternatively, the immunogenic polypeptide is subjected to a complex substitution of natural amino acids with npAA followed by conjugation to evaluate the utility of specific sites on the polypeptide for conjugation.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген опосредовано конъюгирован с улучшенным белком-носителем (например, улучшенный белок-носитель или антиген сначала комбинируют с реакционноспособным линкером, и затем комбинируют аддукт улучшенный белок-носительлинкер или антиген-линкер с антигеном или улучшенным белком-носителем, соответственно). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген непосредственно конъюгирован с улучшенным белком-носителем (например, путем комбинирования двух компонентов, содержащих улучшенный белок-носитель и антиген, вместе в одной реакции). Если конъюгат содержит линкер, можно применять любую подходящую группу. Например, конъюгат может содержать линкер, выбранный из адипиновой кислоты, дигидразида адипиновой кислоты (ADH), β-пропионамидо, нитрофенилэтиламина, галоацил галидов, гликозидных связей, 6-аминокапроновой кислоты, N-сукцинимидил-3-(2- 42 044044 пиридилдитио)пропионата (SPDP), фрагментов С4-С12 и т.д. Также можно применять линкеры, полученные из групп DBCO и DIFO, обсуждавшихся выше, например, включая остаток диарилциклооктинового фрагмента, такой как диарилциклооктен. Линкер обычно будет прикреплен к антигену для конъюгации, а не прикреплен к носителю.In one embodiment of the present invention, the antigen is indirectly conjugated to an improved carrier protein (e.g., the improved carrier protein or antigen is first combined with a reactive linker, and the improved carrier protein-linker or antigen-linker adduct is then combined with the antigen or improved carrier protein, respectively ). According to another embodiment of the present invention, the antigen is directly conjugated to the improved carrier protein (eg, by combining two components containing the improved carrier protein and the antigen together in one reaction). If the conjugate contains a linker, any suitable group can be used. For example, the conjugate may contain a linker selected from adipic acid, adipic acid dihydrazide (ADH), β-propionamido, nitrophenylethylamine, haloacyl halides, glycosidic linkages, 6-aminocaproic acid, N-succinimidyl-3-(2-42 044044 pyridyldithio)propionate (SPDP), fragments C4-C12, etc. Linkers derived from the DBCO and DIFO groups discussed above can also be used, for example including a diarylcyclooctene moiety such as a diarylcyclooctene moiety. The linker will typically be attached to the antigen for conjugation rather than attached to the carrier.

Поскольку конъюгаты антиген-полипептид могут образовывать большие поперечно сшитые комплексы, непосредственное измерение или точное определение местоположения некоторых или всех конъюгаций и других физических признаков может быть невозможным при использовании имеющихся аналитических способов. Однако следует понимать, что такие местоположения или физические признаки могут быть надежно выведены из дизайна синтетической схемы, ее ожидаемого продукта и аналитических результатов, соответствующих этому ожиданию.Because antigen-polypeptide conjugates can form large cross-linked complexes, direct measurement or precise determination of the location of some or all of the conjugations and other physical features may not be possible using available analytical techniques. However, it should be understood that such locations or physical features can be reliably inferred from the design of the synthetic circuit, its expected product, and the analytical results consistent with that expectation.

Реакция конъюгации антиген-полипептид.Antigen-polypeptide conjugation reaction.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с улучшенным белком-носителем с применением любого химического способа, подходящего для конъюгирования неприродных аминокислот и химических ручек, описанных в настоящем документе. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, катализируемое медью (I) алкин-азидное циклоприсоединение (CuAAC), облегчаемое напряжением азид-алкиновое циклоприсоединение (SPAAC) и тетразиналкеновое лигирование. Поскольку все эти реакции относятся к клик-химии, они могут быть проведены в водном растворе. Также можно применять лигирование по Штаудингеру между фосфином и азидом.In some embodiments, the antigen is conjugated to an improved carrier protein using any chemical method suitable for conjugating non-natural amino acids and chemical handles described herein. Such methods include, but are not limited to, copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC), stress-facilitated azide-alkyne cycloaddition (SPAAC), and tetrazynalkene ligation. Since all these reactions are click chemistry, they can be carried out in aqueous solution. Staudinger ligation between phosphine and azide can also be used.

CuAAC.CuAAC.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с улучшенным белком-носителем с помощью катализируемого медью (I) алкин-азидного циклоприсоединения (CuAAC). В одной модификации этого варианта реализации улучшенный белок-носитель содержит пропаргилсодержащую нпАК, и антиген содержит азидогруппу. Согласно другой модификации этого варианта реализации улучшенный белок-носитель содержит азидосодержащую нпАК, и антиген содержит пропаргильную группу. Подходящие условия для CuAAC-конъюгации биомолекул могут быть найдены, например, в Presolski et al. Curr Protoc Chem Biol. 2011; 3(4): 153-162, все из которых включают добавление Cu²⁺. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию ускоряют путем добавления Cu-координирующего лиганда, такого как ТНРА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию ускоряют путем добавления восстанавливающего агента для поддержания окисленного состояния Cu²⁺. Подходящие восстанавливающие агенты включают аскорбат натрия, DTT или ТСЕР.In some embodiments of the present invention, the antigen is conjugated to an improved carrier protein via a copper(I) catalyzed alkyne azide cycloaddition (CuAAC). In one modification of this embodiment, the improved carrier protein contains a propargyl-containing nPAA and the antigen contains an azido group. According to another modification of this embodiment, the improved carrier protein contains an azide-containing nPAA and the antigen contains a propargyl group. Suitable conditions for CuAAC conjugation of biomolecules can be found, for example, in Presolski et al. Curr Protoc Chem Biol. 2011; 3(4): 153-162, all of which involve the addition of Cu ²⁺ . In some embodiments of the present invention, the reaction is accelerated by the addition of a Cu coordinating ligand such as THPA. In some embodiments of the present invention, the reaction is accelerated by adding a reducing agent to maintain the oxidized state of the Cu ²⁺ . Suitable reducing agents include sodium ascorbate, DTT or TCEP.

SPAAC.SPAAC.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с улучшенным белком-носителем за счет облегчаемого напряжением азид-алкинового циклоприсоединения (SPAAC). В одной модификации этих вариантов реализации улучшенный белок-носитель содержит азидосодержащую нпАК, и антиген содержит циклооктиновую группу. Согласно другой модификации этих вариантов реализации улучшенный белок-носитель содержит циклооктинсодержащую нпАК, и антиген содержит азидогруппу. Поскольку SPAAC не требует дополнительных катализаторов или кофакторов, эту реакцию можно проводить в дистиллированной воде, 0,9% солевом растворе, ФСБ или физиологическом забуференном растворе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения улучшенный белок-носитель и антиген комбинируют в массовом соотношении 1,20:1 (мас./мас.).In some embodiments of the present invention, the antigen is conjugated to an improved carrier protein via a stress-facilitated azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). In one modification of these embodiments, the improved carrier protein contains an azide-containing nPAA and the antigen contains a cyclooctyne group. In another modification of these embodiments, the improved carrier protein comprises a cyclooctine-containing nPAA and the antigen contains an azido group. Since SPAAC does not require additional catalysts or cofactors, this reaction can be carried out in distilled water, 0.9% saline, PBS or buffered saline. In one embodiment of the present invention, the improved carrier protein and antigen are combined in a weight ratio of 1.20:1 (w/w).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген соединен с азидосодержащей нпАК в улучшенном белке-носителе за счет структуры формулы X или ХаIn some embodiments of the present invention, the antigen is coupled to an azide-containing nPAA in an improved carrier protein through a structure of formula X or Xa

- 43 044044 где R1 независимо представляет собой Н, формил или по меньшей мере одну аминокислоту улучшенного белка-носителя;- 43 044044 wherein R1 independently represents H, formyl or at least one amino acid of an improved carrier protein;

R2 независимо представляет собой ОН или по меньшей мере одну аминокислоту улучшенного белка-носителя;R2 independently represents OH or at least one amino acid of an improved carrier protein;

D представляет собой -Ar-W3- или -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-;D is -Ar-W3- or -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-;

каждый Y2 независимо представляет собой одинарную химическую связь, -NH-, -О- или Nсоединенный или С-соединенный пирролидинилен;each Y2 independently represents a single chemical bond, -NH-, -O- or N-linked or C-linked pyrrolidinylene;

один из Z1, Z2 и Z3 представляет собой -N-, и другие из Z1, Z2 и Z3 независимо представляют собой -СН-;one of Z1, Z2 and Z3 is -N-, and the others of Z1, Z2 and Z3 are independently -CH-;

L22 независимо представляет собой связь, алкил или полиалкилокси иL22 independently represents a bond, alkyl or polyalkyloxy, and

X представляет собой по меньшей мере один полиол полисахарида.X represents at least one polysaccharide polyol.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген соединен с азидосодержащей нпАК в улучшенном белке-носителе за счет структуры формулы XI или XIaIn some embodiments of the present invention, the antigen is coupled to an azide-containing nPAA in an improved carrier protein through a structure of formula XI or XIa

(формула XIa) где R₁ независимо представляет собой Н, формил или по меньшей мере одну аминокислоту улучшенного белка-носителя;(formula XIa) wherein R ₁ independently represents H, formyl, or at least one amino acid of an improved carrier protein;

R₂ независимо представляет собой ОН или по меньшей мере одну аминокислоту улучшенного бел ка-носителя;R ₂ independently represents OH or at least one amino acid of an improved carrier protein;

W представляет собой С или N;W represents C or N;

у составляет по меньшей мере 1;y is at least 1;

n составляет по меньшей мере 1 иn is at least 1 and

X независимо представляет собой по меньшей мере один полиол капсульного полисахарида.X independently represents at least one capsular polysaccharide polyol.

Значение n обсуждалось выше в отношении PEGn. Значение у находится в пределах диапазона 1-10, в соответствии с формулой XII, и предпочтительно представляет собой низший алкилен, например, С1-С₄-алкилен.The value of n was discussed above in relation to PEGn. The value of y is within the range of 1-10, according to formula XII, and is preferably lower alkylene, for example C1- _C4 alkylene.

Тетразин-алкиновое лигирование.Tetrazine-alkyne ligation.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антиген конъюгирован с улучшенным белком-носителем с помощью тетразин-алкинового лигирования. В одной модификации этих вариантов реализации улучшенный белок-носитель содержит 1,2,4,5-тетразинсодержащую нпАК, и антиген содержит алкеновую группу. Сходно с реакциями SPAAC, тетразин-алкиновое лигирование происходит без добавления кофакторов, и эту реакцию можно проводить в дистиллированной воде, 0,9% солевом растворе, ФСБ или физиологическом забуференном растворе.In some embodiments of the present invention, the antigen is conjugated to an improved carrier protein via tetrazine-alkyne ligation. In one modification of these embodiments, the improved carrier protein contains a 1,2,4,5-tetrazine-containing nPAA and the antigen contains an alkene group. Similar to SPAAC reactions, tetrazine-alkyne ligation occurs without the addition of cofactors, and this reaction can be performed in distilled water, 0.9% saline, PBS, or saline.

- 44 044044- 44 044044

Характеристика конъюгации.Characteristics of conjugation.

Способы (гель-фильтрация, диафильтрация, диализ).Methods (gel filtration, diafiltration, dialysis).

После реакции конъюгации представляющие интерес конъюгаты антиген-улучшенный белокноситель необязательно очищают в соответствии со способами, которые включают, но не ограничиваются ими, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобного взаимодействия и гельпроникающую хроматографию), исключение по размеру молекулы (диализ, диафильтрацию, фильтрацию в тангенциальном потоке, глубинную фильтрацию), электрофоретические методики (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или электрофорез в ДСН-ПААГ (см., например, Protein Purification, J.С. Janson & Lars Ryden, редакторы, VCH Publishers, New York, 1989) для получения по существу чистых конъюгатов.After the conjugation reaction, the antigen-improved protein carrier conjugates of interest are optionally purified according to methods that include, but are not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic interaction, and gel permeation chromatography), molecular size exclusion (dialysis, diafiltration, filtration tangential flow, depth filtration), electrophoretic techniques (eg, preparative isoelectric focusing), differential solubility (eg, ammonium sulfate precipitation) or SDS-PAGE (see, for example, Protein Purification, J.C. Janson & Lars Ryden , editors, VCH Publishers, New York, 1989) to obtain substantially pure conjugates.

Конъюгированные белки, представляющие интерес, необязательно количественно определяют в соответствии со способами, которые включают, но не ограничиваются ими, микроструйный электрофорез, гель-электрофорез, Вестерн-блоттинг, иммуноанализы (например, ИФА) и другие количественные способы исследований, чтобы оценить активность конъюгированного белка.Conjugated proteins of interest are optionally quantified according to methods that include, but are not limited to, microfluidic electrophoresis, gel electrophoresis, Western blotting, immunoassays (eg, ELISA) and other quantitative assays to assess the activity of the conjugated protein. .

Примерные физические параметры.Approximate physical parameters.

Одним важным параметром для конъюгатов антиген-улучшенный белок-носитель является молекулярная масса конъюгата. Поскольку конъюгаты необязательно содержат вариабельные количества молекул антигена, конъюгированных с каждой молекулой белка, а также вариабельные поперечные сшивки высшего порядка (например, связи белок-антиген-белок), конечная молекулярная масса конъюгата необязательно может быть предсказана на основании входных молекулярных масс улучшенных белковносителей и антигенов. Во многих литературных источниках (например, Howard et al. Immunology. 1971(21): 535-545 и Kabat & Bezer. Arch Biochem Biophys. 1958(78) 306-18) указано, что размер антигенных частиц оказывает существенное влияние на иммуногенность. В Wessels et al. (1998) Infect Immun 66:2186-92 сообщается, что размер конъюгата и поперечное сшивание могут влиять на иммуногенность и защитную эффективность конъюгатов GBS типа III.One important parameter for antigen-enhanced carrier protein conjugates is the molecular weight of the conjugate. Because conjugates do not necessarily contain variable amounts of antigen molecules conjugated to each protein molecule, as well as variable higher order cross-links (e.g., protein-antigen-protein linkages), the final molecular weight of the conjugate cannot necessarily be predicted based on the input molecular weights of the improved carrier proteins and antigens . Many literature sources (eg, Howard et al. Immunology. 1971(21): 535-545 and Kabat & Bezer. Arch Biochem Biophys. 1958(78) 306-18) indicate that the size of the antigen particles has a significant impact on immunogenicity. In Wessels et al. (1998) Infect Immun 66:2186-92 reported that conjugate size and cross-linking may influence the immunogenicity and protective efficacy of GBS type III conjugates.

В целом конъюгаты могут быть получены путем соединения белка-носителя с антигеном, который имеет одну или более ручек на антиген. Если антиген содержит несколько ручек, то может образовываться поперечно сшитый конъюгат, содержащий связи белок-антиген-белок. Если антиген содержит одну рукоятку (например, концевую группу в полисахариде), то такая решетка конъюгата не образуется, поскольку один антиген не может связываться с несколькими молекулами белка-носителя. Поперечно сшитые конъюгаты являются предпочтительными согласно настоящему изобретению (в частности, для пневмококка), когда желательны более высокие молекулярные массы, и, соответственно, предпочтительными являются антигены с несколькими рукоятками.In general, conjugates can be prepared by combining a carrier protein with an antigen that has one or more handles on the antigen. If the antigen contains multiple handles, a cross-linked conjugate containing protein-antigen-protein bonds can be formed. If the antigen contains one handle (for example, the terminal group in a polysaccharide), then such a conjugate lattice is not formed, since one antigen cannot bind to several molecules of the carrier protein. Cross-linked conjugates are preferred according to the present invention (particularly for pneumococcus) when higher molecular weights are desired, and accordingly, multi-armed antigens are preferred.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антигенулучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу приблизительно 750 кДа, приблизительно 1000 кДа, приблизительно 1500 кДа, приблизительно 2000 кДа, приблизительно 2500 кДа, приблизительно 3000 кДа, приблизительно 3500 кДа, приблизительно 4000 кДа, приблизительно 4500 кДа, приблизительно 5000 кДа, приблизительно 5500 кДа, приблизительно 6000 кДа, приблизительно 6500 кДа, приблизительно 7000 кДа, приблизительно 7500 кДа или приблизительно 8000 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 750 кДа, по меньшей мере приблизительно 1000 кДа или по меньшей мере приблизительно 1500 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу от приблизительно 750 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу от приблизительно 800 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу от приблизительно 850 до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу от приблизительно 900 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу от приблизительно 950 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат антиген-улучшенный белок-носитель имеет молекулярную массу от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 2800 кДа.In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of about 750 kDa, about 1000 kDa, about 1500 kDa, about 2000 kDa, about 2500 kDa, about 3000 kDa, about 3500 kDa, about 4000 kDa, about 4500 kDa, about 5000 kDa, about 5500 kDa, about 6000 kDa, about 6500 kDa, about 7000 kDa, about 7500 kDa, or about 8000 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of at least about 750 kDa, at least about 1000 kDa, or at least about 1500 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of from about 750 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of from about 800 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of from about 850 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of from about 900 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of from about 950 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugate has a molecular weight of from about 1000 kDa to about 2800 kDa.

Другим важным параметром для конъюгированных вакцин согласно настоящему изобретению является соотношение антигена (например, полисахарида) и иммуногенного полипептидного носителя (например, белков-носителей согласно настоящему изобретению). Если использовать конъюгат полисахарид-белок-носитель в качестве иллюстрации общего принципа, то соотношение полисахарида и белка (PS:PC) очищенного конъюгата обычно выражено как соотношение масса-масса (мас./мас.). Такие соотношения обычно выражают как включающие любой свободный полисахарид, который очищен вместе с отдельными гликоконъюгатами. Более высокие соотношения PS:PC конъюгатов полисахарид-белокноситель позволяют доставлять больше полисахаридного антигена с меньшим количеством улучшенногоAnother important parameter for the conjugate vaccines of the present invention is the ratio of antigen (eg, polysaccharide) and immunogenic polypeptide carrier (eg, carrier proteins of the present invention). Using the polysaccharide-protein-carrier conjugate as an illustration of the general principle, the polysaccharide to protein (PS:PC) ratio of the purified conjugate is usually expressed as a mass-to-mass (w/w) ratio. Such ratios are usually expressed as including any free polysaccharide that is purified along with the individual glycoconjugates. Higher PS:PC ratios of polysaccharide-protein carrier conjugates allow the delivery of more polysaccharide antigen with less improved

- 45 044044 белка-носителя. Для пневмококковых конъюгированных вакцин это соотношение обычно находится в пределах диапазона 0,3-3,0, но оно может варьироваться в зависимости от серотипа и аспектов химических реакций конъюгации (приложение 2: рекомендации по получению и контролю пневмококковых конъюгированных вакцин; Серия технических докладов ВОЗ, № 927, 2005 г.). Соотношение для коммерческой вакцины Превнар-13 составляет 0,9 (см. вкладыш в упаковку для Превнар 13, версия М/2016, pg. 24; www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/vaccines/approvedproducts/ucm201669.pdf), это указывает на то, что предпочтительный диапазон составляет 1,0-3,0. При изготовлении вакцины с более чем 13 серотипами может быть предпочтительным достичь соотношения 1,5-3,0, и особенно предпочтительным является применение соотношения от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,0. Это может быть среднее соотношение для всех конъюгатов в композиции, которое может быть достигнуто за счет обеспечения того, что все индивидуальные конъюгаты имеют это соотношение, или за счет обеспечения того, чтобы любые конъюгаты вне этого диапазона с отклонением соотношения в одну сторону сбалансированы конъюгатом вне этого диапазона с отклонением соотношения в другую сторону.- 45 044044 carrier protein. For pneumococcal conjugate vaccines, this ratio is usually in the range of 0.3–3.0, but it may vary depending on the serotype and aspects of the conjugation chemistry (Annex 2: Recommendations for the production and control of pneumococcal conjugate vaccines; WHO Technical Report Series, No. 927, 2005). The ratio for the commercial vaccine Prevnar-13 is 0.9 (see package insert for Prevnar 13, version M/2016, pg. 24; www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/vaccines/approvedproducts/ucm201669.pdf), this indicates that the preferred range is 1.0-3.0. When making a vaccine with more than 13 serotypes, it may be preferable to achieve a ratio of 1.5 to 3.0, and it is especially preferred to use a ratio of about 1.5 to about 2.0. This may be the average ratio for all conjugates in the composition, which can be achieved by ensuring that all individual conjugates have this ratio, or by ensuring that any conjugates outside this range with a ratio deviation to one side are balanced by a conjugate outside this range with the ratio deviating in the other direction.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) полисахарида и улучшенного белка-носителя в конъюгате полисахарид-улучшенный белок-носитель составляет от 0,5 до 4,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0 приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительноAccording to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of polysaccharide to improved carrier protein in a polysaccharide-improved carrier protein conjugate is from 0.5 to 4.0 (e.g., about 0.5, about 0.6, approximately 0.7, approximately 0.8, approximately 0.9, approximately 1.0 approximately 1.1, approximately 1.2, approximately

1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно1.3, approximately 1.4, approximately 1.5, approximately 1.6, approximately 1.7, approximately

1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно1.8, approximately 1.9, approximately 2.0, approximately 2.1, approximately 2.2, approximately

2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно2.3, approximately 2.4, approximately 2.5, approximately 2.6, approximately 2.7, approximately

2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно2.8, approximately 2.9, approximately 3.0, approximately 3.1, approximately 3.2, approximately

3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно3.3, approximately 3.4, approximately 3.5, approximately 3.6, approximately 3.7, approximately

3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) PS:PC в конъюгате белка-носителя составляет от 0,7 до 2,8. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) PS:PC в конъюгате белка-носителя составляет от 1,0 до 2,8. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) PS:PC в конъюгате белка-носителя составляет по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 0,9, по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4 или по меньшей мере 1,5. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение полисахарида и улучшенного белка-носителя в конъюгате полисахаридулучшенный белок-носитель составляет более 0,9 (мас./мас.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение полисахарида и улучшенного белка-носителя в конъюгате полисахарид-улучшенный белок-носитель составляет от приблизительно 0,9 до приблизительно 3,0 (мас./мас.). В результате смешивания отдельных конъюгатов с такими соотношениями PS:PC может быть получена комбинация, имеющая желаемое общее соотношение PS:PC.3.8, approximately 3.9 or approximately 4.0). According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of PS:PC in the carrier protein conjugate is from 0.7 to 2.8. According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of PS:PC in the carrier protein conjugate is from 1.0 to 2.8. According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of PS:PC in the carrier protein conjugate is at least 0.8, at least 0.9, at least 1.0, at least 1.1 , at least 1.2, at least 1.3, at least 1.4 or at least 1.5. According to another embodiment of the present invention, the ratio of polysaccharide to improved carrier protein in the polysaccharide-improved carrier protein conjugate is greater than 0.9 (w/w). According to another embodiment of the present invention, the ratio of polysaccharide to improved carrier protein in a polysaccharide-improved carrier protein conjugate is from about 0.9 to about 3.0 (w/w). By mixing the individual conjugates at these PS:PC ratios, a combination having the desired overall PS:PC ratio can be obtained.

Присутствие загрязнений (свободный полисахарид, С-поли).Presence of contaminants (free polysaccharide, C-poly).

Важным параметром для конъюгатов полисахарид-улучшенный белок-носитель является уровень свободного полисахарида, который не конъюгирован ковалентно с улучшенным белком-носителем, но тем не менее присутствует в композиции конъюгата. Например, в некоторых случаях свободный полисахарид не связан ковалентно с конъюгатом полисахарид-улучшенный белок-носитель (т.е. не связан ковалентно, не адсорбирован в него или не захвачен в него, или не захвачен с ним). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты полисахарид-улучшенный белок-носитель, описанные в настоящем документе, содержат менее приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% или 10% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полисахарид-улучшенный белок-носитель, описанные в настоящем документе, содержат менее приблизительно 10% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полисахарид-улучшенный белок-носитель, описанные в настоящем документе, содержат менее приблизительно 25% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полисахарид-улучшенный белок-носитель, описанные в настоящем документе, содержат менее приблизительно 30% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгаты полисахарид-улучшенный белок-носитель, описанные в настоящем документе, содержат менее приблизительно 15% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. Свободный полисахарид необязательно измеряют с помощью любого подходящего способа, включая способ в Lei et al. (Dev Biol (Basel). 2000; 103:259-64), в котором для различения пулов полисахарида применяется метод осаждения на основе HCl/дезоксихолата. В предпочтительных композициях количество неконъюгированного бактериального полисахарида составляет менее 5% по массе от общего количества бактериального полисахарида в композиции. В композиции с несколькими пневмококковыми конъюгатами предпочтительно количество неконъюгированного бактериального полисахарида для каждого серотипа составляет менее 5 мас.% от общего количества бактериального полисахарида этого серотипа в композиции.An important parameter for polysaccharide-improved carrier protein conjugates is the level of free polysaccharide that is not covalently conjugated to the improved carrier protein but is nonetheless present in the conjugate composition. For example, in some cases, the free polysaccharide is not covalently bound to the polysaccharide-enhanced carrier protein conjugate (ie, not covalently bound to, adsorbed into, or entrapped into, or entrapped with it). In some embodiments of the present invention, the polysaccharide-improved carrier protein conjugates described herein contain less than about 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, or 10% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide-improved carrier protein conjugates described herein contain less than about 10% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide-improved carrier protein conjugates described herein contain less than about 25% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide-improved carrier protein conjugates described herein contain less than about 30% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide-improved carrier protein conjugates described herein contain less than about 15% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. Free polysaccharide is optionally measured using any suitable method, including the method in Lei et al. (Dev Biol (Basel). 2000; 103:259-64), which uses an HCl/deoxycholate precipitation method to distinguish polysaccharide pools. In preferred compositions, the amount of unconjugated bacterial polysaccharide is less than 5% by weight of the total amount of bacterial polysaccharide in the composition. In a composition with multiple pneumococcal conjugates, preferably the amount of unconjugated bacterial polysaccharide for each serotype is less than 5 wt.% of the total amount of bacterial polysaccharide of that serotype in the composition.

Важным параметром для конъюгатов пневмококкового капсульного полисахарида с улучшенным белком-носителем является уровень загрязнения С-полисахаридом, присутствующим в препаратахAn important parameter for conjugates of pneumococcal capsular polysaccharide with an improved carrier protein is the level of contamination with C-polysaccharide present in the preparations

- 46 044044 конъюгата. С-полисахарид является иммунологически непродуктивным, но высокоиммуногенным компонентом клеточной стенки S. pneumoniae, который пассивно присутствует во многих способах получения пневмококкового капсульного полисахарида. Поскольку иммунные ответы на С-полисахарид обычно не приводят к выработке нейтрализующих антител, загрязнение С-полисахаридом может препятствовать точным оценкам эффективности конъюгата антиген-улучшенный белок-носитель при введении животным.- 46 044044 conjugates. C-polysaccharide is an immunologically nonproductive but highly immunogenic component of the cell wall of S. pneumoniae that is passively present in many methods for producing pneumococcal capsular polysaccharide. Because immune responses to C-polysaccharide do not generally result in the production of neutralizing antibodies, C-polysaccharide contamination may prevent accurate assessments of the effectiveness of the antigen-enhanced carrier protein conjugate when administered to animals.

Уровень С-полисахарида необязательно показывают с помощью общего кислотного гидролиза препарата полисахаридного конъюгата, хроматографии гидролизата и кондуктометрического детектирования холина. Согласно другому варианту негидролизованный полисахарид анализируют с помощью ЯМР для определения холина. В методике ЯМР для расчета содержания С-полисахарида используют соотношение сигнала холина и сигнала метила рамнозы (для капсульных полисахаридов, содержащих рамнозу; или другого сигнала для других капсульных полисахаридов). В хроматографическом методе для расчета содержания С-полисахарида используют соотношение сигнала холина и либо содержания полисахарида, определенного с помощью количественного кондуктометрического исследования, либо одного из пиков капсульного полисахаридного компонента. В любом методе стандарты известных концентраций холина позволяют непосредственно рассчитать уровень холина, присутствующего в полисахаридном препарате, после установления концентрации холина концентрацию С-полисахарида в препарате полисахарида определяют, пользуясь теоретической повторяющейся структурой С-полисахарида [Hermans, et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 107, 600 (1988)].The level of C-polysaccharide is optionally indicated by total acid hydrolysis of the polysaccharide conjugate preparation, chromatography of the hydrolyzate and conductometric detection of choline. In another embodiment, the non-hydrolyzed polysaccharide is analyzed by NMR to determine choline. The NMR technique uses the ratio of the choline signal to the methyl rhamnose signal (for capsular polysaccharides containing rhamnose; or another signal for other capsular polysaccharides) to calculate the C-polysaccharide content. The chromatographic method uses the ratio of the choline signal to either the polysaccharide content determined by quantitative conductometry or one of the peaks of the capsular polysaccharide component to calculate the C-polysaccharide content. In either method, standards of known choline concentrations allow the level of choline present in the polysaccharide preparation to be directly calculated; once the choline concentration is established, the concentration of C-polysaccharide in the polysaccharide preparation is determined using the theoretical repeat structure of the C-polysaccharide [Hermans, et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 107, 600 (1988)].

Концентрации полисахаридов в образцах конъюгата полисахарид-улучшенный белок-носитель необязательно измеряют с помощью различных методик, например, общую концентрацию полисахарида необязательно определяют с помощью общего гидролиза полисахарида и измерения концентрации конкретного моносахарида. Степень загрязнения С-полисахаридом (мас./мас.) определяют, сравнивая концентрацию С-полисахарида с общей концентрацией полисахарида. Приемлемыми считаются уровни Сполисахарида ниже 3% (мас./мас.) от общего количества полисахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровни С-полисахарида ниже 1%.Polysaccharide concentrations in polysaccharide-improved carrier protein conjugate samples are optionally measured using different techniques, for example, total polysaccharide concentration is optionally determined using total polysaccharide hydrolysis and measuring the concentration of a specific monosaccharide. The degree of C-polysaccharide contamination (w/w) is determined by comparing the C-polysaccharide concentration to the total polysaccharide concentration. Spolysaccharide levels below 3% (w/w) of the total polysaccharide are considered acceptable. In some embodiments of the present invention, C-polysaccharide levels are below 1%.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен конъюгат, содержащий белок-носитель и антиген, причем указанный антиген соединен с нпАК в белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель сохраняет эпитоп связывания Т-клеток анатоксина дифтерии (DT), анатоксина столбняка (ТТ), белка D (PD) Haemophilus influenzae, комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) или CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК представляет собой 2-амино-3-(4азидофенил)пропановую кислоту (pAF), 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановую кислоту (pAMF), 2-амино-3-(5-(азидометил)пиридин-2-ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(4-(азидометил)пиридин-2ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(6-(азидометил)пиридин-3-ил)пропановую кислоту, 2-амино-5азидопентановую кислоту или 2-амино-3-(4-(азидометил)фенил)пропановую кислоту и любую их комбинацию. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК не находится в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК заменяет один или более остатков лизина в белке-носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения кажущаяся молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 900 кДа до приблизительно 5 МДа. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения один или более замененных остатков лизина выбраны из группы, состоящей из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 и K527, а также любой их комбинации из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК не находится в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген соединен с белком-носителем в соответствии с формулой XI или XIa (формула XI) (формула XIa) где R1 независимо представляет собой Н, формил или по меньшей мере одну аминокислоту белканосителя;According to one embodiment of the present invention, there is provided a conjugate comprising a carrier protein and an antigen, wherein said antigen is linked to a npAK in the carrier protein. In another embodiment of the present invention, the carrier protein retains the T cell binding epitope of diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), Haemophilus influenzae protein D (PD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), or CRM197. According to another embodiment of the present invention, npAA is 2-amino-3-(4azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid (pAMF), 2-amino-3- (5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(azidomethyl)pyridin-2yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(azidomethyl)pyridin-3- yl)propanoic acid, 2-amino-5azidopentanoic acid or 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid and any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, npAK is not located in the T-cell activating epitope of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, npAK replaces one or more lysine residues in the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the apparent molecular weight of the conjugate is from about 900 kDa to about 5 MDa. According to another embodiment of the present invention, the one or more replaced lysine residues are selected from the group consisting of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 and K527, and any combination thereof of SEQ ID NO: 1. According to another embodiment of the present invention, npAK is not located in the T-cell activating epitope of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the antigen is coupled to a carrier protein according to Formula XI or XIa (Formula XI) (Formula XIa) wherein R1 independently represents H, formyl, or at least one amino acid of the carrier protein;

- 47 044044- 47 044044

R2 независимо представляет собой ОН или по меньшей мере одну аминокислоту белка-носителя;R2 independently represents OH or at least one amino acid of a carrier protein;

W представляет собой С или N;W represents C or N;

у составляет по меньшей мере 1;y is at least 1;

n составляет по меньшей мере 1 иn is at least 1 and

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6).According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ выявления оптимального размещения антигена на белке-носителе для улучшения иммунного ответа хозяина, включающий: i) введение в белок-носитель замены нпАК; ii) конъюгирование полисахарида с нпАК с образованием гликоконъюгата; и iii) измерение кажущейся молекулярной массы гликоконъюгата. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения замена нпАК не находится в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель сохраняет эпитоп связывания Т-клеток анатоксина дифтерии (DT), анатоксина столбняка (ТТ), белка D (PD) Haemophilus influenzae, комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) или CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один или более полисахаридов конъюгированы с белком-носителем в соответствии с формулой XI или XIa (формула XI) (формула XIa) где R1 независимо представляет собой Н, формил или по меньшей мере одну аминокислоту белканосителя;According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for identifying optimal placement of an antigen on a carrier protein to improve the host immune response, comprising: i) introducing an NPAA replacement into the carrier protein; ii) conjugation of the polysaccharide with nPAA to form a glycoconjugate; and iii) measuring the apparent molecular weight of the glycoconjugate. According to another embodiment of the present invention, the npAK substitution is not in the T cell activating epitope of the carrier protein. In another embodiment of the present invention, the carrier protein retains the T cell binding epitope of diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), Haemophilus influenzae protein D (PD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), or CRM197. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, at least one or more polysaccharides are conjugated to a carrier protein according to Formula XI or XIa (Formula XI) (Formula XIa) wherein R1 independently represents H, formyl, or at least one amino acid of the carrier protein;

R2 независимо представляет собой ОН или по меньшей мере одну аминокислоту белка-носителя иR2 independently represents OH or at least one amino acid of the carrier protein and

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна или более замененных неприродных аминокислот представляют собой pAMF. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен белок-носитель с оптимальным расположением антигена, выявленным с помощью способа согласно i)-iii). Согласно другому варианту реализации замена введена по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 раз. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид бактерии. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения бактерия представляет собой Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae.According to another embodiment of the present invention, at least one or more of the replaced unnatural amino acids is pAMF. According to another embodiment of the present invention, a carrier protein with an optimal antigen location identified using the method according to i)-iii) is provided. According to another embodiment, the replacement is introduced at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 times. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a bacterium. According to another embodiment of the present invention, the bacterium is Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae.

- 48 044044- 48 044044

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения бактерия представляет собой Streptococcus pneumoniae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6).According to another embodiment of the present invention, the bacterium is Streptococcus pneumoniae. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6).

Модифицированные полипептиды и полисахариды.Modified polypeptides and polysaccharides.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен модифицированный полипептид, содержащий по меньшей мере одно соединение, или его соль, содержащее формулу XI или XIa (формула XI) (формула Х1а) где R1 независимо представляет собой Н, формил или по меньшей мере одну аминокислоту белканосителя;According to one embodiment of the present invention, there is provided a modified polypeptide containing at least one compound, or a salt thereof, containing formula XI or XIa (formula XI) (formula X1a) wherein R1 independently represents H, formyl, or at least one carrier protein amino acid;

X независимо представляет собой по меньшей мере один полиол полисахарида.X independently represents at least one polysaccharide polyol.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель сохраняет эпитоп связывания Т-клеток анатоксина дифтерии (DT), анатоксина столбняка (ТТ), белка D (PD) Haemophilus, комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) или CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид вида бактерий. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вид бактерий представляет собой Streptococcus pneumoniae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вид бактерий представляет собой Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения R1 и R2 не являются аминокислотами, которые встречаются в Т-клеточном эпитопе белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6).In another embodiment of the present invention, the carrier protein retains the T cell binding epitope of diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), Haemophilus protein D (PD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), or CRM197. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a bacterial species. According to another embodiment of the present invention, the bacterial species is Streptococcus pneumoniae. According to another embodiment of the present invention, the bacterial species is Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, R1 and R2 are not amino acids that occur in a T cell epitope of a carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен модифицированный полисахарид, содержащий по меньшей мере одно соединение, или его соль, содержащее формулу VII или VIIa.According to one embodiment of the present invention, there is provided a modified polysaccharide containing at least one compound, or a salt thereof, containing formula VII or VIIa.

- 49 044044- 49 044044

в которых X независимо представляет собой по меньшей мере один полиол капсульного полисаха рида и n составляет по меньшей мере 1.wherein X independently represents at least one capsular polysaccharide polyol and n is at least 1.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения модифицированный полисахарид формулы VII дополнительно конъюгирован с белком-носителем, содержащим по меньшей мере одну нпАК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения модифицированный полисахарид конъюгирован с помощью [2+3] циклоприсоединения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид происходит из вида бактерий. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вид бактерий представляет собой Streptococcus pneumoniae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вид бактерий представляет собой Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения молярное соотношение DBCO и повторяющегося звена капсульного полисахарида превышает 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид получен из серотипа Streptococcus pneumoniae, включающего 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9В, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любую их комбинацию. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6).According to another embodiment of the present invention, the modified polysaccharide of Formula VII is further conjugated to a carrier protein containing at least one nPAA. According to another embodiment of the present invention, the modified polysaccharide is conjugated via [2+3] cycloaddition. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is derived from a species of bacteria. According to another embodiment of the present invention, the bacterial species is Streptococcus pneumoniae. According to another embodiment of the present invention, the bacterial species is Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a bacterial capsular polysaccharide. In another embodiment of the present invention, the molar ratio of DBCO to the repeating unit of the capsular polysaccharide is greater than 1. In another embodiment of the present invention, the capsular polysaccharide is derived from Streptococcus pneumoniae serotype including 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9B, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен модифицированный полисахарид в соответствии с (A-X)z-Y, где А представляет собойAccording to one embodiment of the present invention, a modified polysaccharide according to (A-X)z-Y is provided, wherein A is

илиor

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид происходит из вида бактерий. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вид бактерий представляет собой Streptococcus pneumoniae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вид бактерий представляет собой Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения капсульный полисахарид представляет собой полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид дополнительно конъюгирован с белком-носителем. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид конъюгирован с белком-носителем за счет связи формулы II. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель сохраняет эпитоп связывания Т-клеток CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид конъюгирован с помощью [2+3] циклоприсоединения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель содержит одну или более неприродных аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель сохраняет эпитоп связывания Тклеток анатоксина дифтерии (DT), анатоксина столбняка (ТТ), белка D (PD) Haemophilus influenzae, комAccording to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is derived from a species of bacteria. According to another embodiment of the present invention, the bacterial species is Streptococcus pneumoniae. According to another embodiment of the present invention, the bacterial species is Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a bacterial capsular polysaccharide. According to another embodiment of the present invention, the capsular polysaccharide is a polysaccharide of Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13 , 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any combination thereof. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6). According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is further conjugated to a carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is conjugated to a carrier protein through a linkage of formula II. In another embodiment of the present invention, the carrier protein retains the T cell binding epitope CRM197. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is conjugated using [2+3] cycloaddition. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein contains one or more unnatural amino acids. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein retains the T cell binding epitope of diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), Haemophilus influenzae protein D (PD), com

- 50 044044 плекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) или CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель дополнительно конъюгирован с антигеном. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель конъюгирован с антигеном за счет связи формулы II. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) полисахарида и белка-носителя (PS:PC) составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 4.- 50 044044 outer membrane protein complex of meningococcus serogroup B (OMPC) or CRM197. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein is further conjugated to an antigen. According to another embodiment of the present invention, the carrier protein is conjugated to an antigen through a Formula II bond. According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide to carrier protein (PS:PC) ratio (w/w) is from about 1.5 to about 4.

Композиции конъюгатов полипептид-антиген.Compositions of polypeptide-antigen conjugates.

В настоящем документе описаны иммуногенные композиции, содержащие по меньшей мере один конъюгат улучшенный белок-носитель-антиген вместе с по меньшей мере одним вспомогательным веществом, причем указанный антиген конъюгирован с полипептидом за счет остатка нпАК в улучшенном белке-носителе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена вакцинная композиция, содержащая гликоконъюгат, описанный в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция конъюгированной вакцины, содержащая по меньшей мере один конъюгат улучшенный белок-носитель-антиген, описанный в настоящем документе, вызывает более низкое опосредуемое носителем подавление у субъекта по сравнению с композицией конъюгированной вакцины, содержащей нативный белок-носитель. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция конъюгированной вакцины, содержащая по меньшей мере один конъюгат улучшенный белок-носитель-антиген, описанный в настоящем документе, улучшает общий иммунный ответ и/или увеличивает зависимый от Т-клеток ответ у субъекта по сравнению с композицией конъюгированной вакцины, содержащей нативный белок-носитель.Disclosed herein are immunogenic compositions comprising at least one improved carrier protein-antigen conjugate together with at least one excipient, wherein said antigen is conjugated to a polypeptide by an nPAA moiety in the improved carrier protein. According to one embodiment of the present invention, a vaccine composition is provided comprising a glycoconjugate as described herein. In some embodiments of the present invention, a conjugate vaccine composition comprising at least one improved carrier protein-antigen conjugate described herein causes lower carrier-mediated suppression in a subject compared to a conjugate vaccine composition containing a native carrier protein. In some embodiments of the present invention, a conjugate vaccine composition comprising at least one improved carrier protein-antigen conjugate described herein improves the overall immune response and/or increases the T-cell dependent response in a subject compared to the conjugate vaccine composition containing the native carrier protein.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуногенная композиция содержит индивидуальный конъюгат белок-носитель-антиген (например, один серотип пневмококка). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуногенная композиция содержит несколько конъюгатов белок-носитель-антиген (например, несколько серотипов пневмококка). Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения несколько конъюгатов белок-носительантиген необязательно содержат: (а) несколько антигенов, конъюгированных с общим улучшенным белком-носителем; или (b) несколько антигенов, конъюгированных с различными улучшенными белкаминосителями. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения несколько конъюгатов улучшенный белок-носитель-антиген содержат антигены, происходящие из разных серотипов одного и того же организма (например, S. pneumoniae). Если композиция содержит несколько различных антигенов (например, капсульный полисахарид из нескольких серотипов пневмококка или из нескольких серогрупп менингококка), предпочтительно для каждого антигена применяют один и тот же тип белканосителя, например, каждый антиген индивидуально конъюгирован с одним и тем же нпАК-содержащим вариантом CRM197, и отдельные конъюгаты антиген-белок затем комбинируют для получения полиантигенной композиции.In some embodiments of the present invention, the immunogenic composition comprises an individual protein-carrier-antigen conjugate (eg, one serotype of pneumococcus). In some embodiments, the immunogenic composition comprises multiple protein-carrier-antigen conjugates (eg, multiple pneumococcal serotypes). In further embodiments of the present invention, the multiple carrier protein-antigen conjugates optionally comprise: (a) multiple antigens conjugated to a common improved carrier protein; or (b) multiple antigens conjugated to different improved carrier proteins. According to additional embodiments of the present invention, multiple improved carrier protein-antigen conjugates contain antigens derived from different serotypes of the same organism (eg, S. pneumoniae). If the composition contains several different antigens (for example, a capsular polysaccharide from several pneumococcal serotypes or from several meningococcal serogroups), preferably the same type of protein carrier is used for each antigen, for example, each antigen is individually conjugated to the same NSAA-containing variant of CRM197 , and the individual antigen-protein conjugates are then combined to produce a multiantigen composition.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения общее (мас./мас.) соотношение полисахаридов всех серотипов и белка-носителя (PS:PC) в поливалентной композиции конъюгатов, содержащих серотипические полисахариды, находится в определенном диапазоне. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) полисахарида и улучшенного белканосителя в конъюгате полисахарид-улучшенный белок-носитель (или в общей поливалентной композиции) составляет от 0,5 до 4,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5 приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) PS:PC в конъюгате белка-носителя (или в общей поливалентной композиции) составляет от 0,7 до 2,8. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) PS:PC в конъюгате белка-носителя (или в общей поливалентной композиции) составляет от 1,0 до 2,8. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение (мас./мас.) PS:PC в конъюгате белка-носителя (или в общей поливалентной композиции) составляет по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 0,9, по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4 или по меньшей мере 1,5 (мас./мас.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение полисахарида и улучшенного белка-носителя в конъюгате полисахарид-улучшенный белок-носитель (или в общей поливалентной композиции) составляет более 0,9 (мас./мас.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение полисахарида и улучшенного белка-носителя в конъюгате полисахаридулучшенный белок-носитель (или в общей поливалентной композиции) составляет от приблизительно 0,9 до приблизительно 3,0 (мас./мас.). Предпочтительная композиция содержит конъюгаты белоксахарид капсульных полисахаридов из нескольких пневмококковых серотипов с общим массовым из- 51 044044 бытком полисахарида по отношению к белку, например, соотношение белок:полисахарид составляет отIn some embodiments of the present invention, the total (wt/wt) ratio of polysaccharides of all serotypes to carrier protein (PS:PC) in a multivalent conjugate composition containing serotypic polysaccharides is within a certain range. According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of polysaccharide to improved carrier protein in the polysaccharide-improved carrier protein conjugate (or overall multivalent composition) is from 0.5 to 4.0 (for example, about 0.5. approximately 0.6, approximately 0.7, approximately 0.8, approximately 0.9, approximately 1.0, approximately 1.1, approximately 1.2, approximately 1.3, approximately 1.4, approximately 1.5, approximately 1.6, approximately 1.7, approximately 1.8, approximately 1.9, approximately 2.0, approximately 2.1, approximately 2.2, approximately 2.3, approximately 2.4, approximately 2.5, approximately 2.6, approximately 2.7, approximately 2.8, approximately 2.9, approximately 3.0, approximately 3.1, approximately 3.2, approximately 3.3, approximately 3.4, approximately 3.5 approximately 3.6, about 3.7, about 3.8, about 3.9 or about 4.0). According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of PS:PC in the carrier protein conjugate (or overall multivalent composition) is from 0.7 to 2.8. According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of PS:PC in the carrier protein conjugate (or overall multivalent composition) is from 1.0 to 2.8. According to another embodiment of the present invention, the ratio (w/w) of PS:PC in the carrier protein conjugate (or overall multivalent composition) is at least 0.8, at least 0.9, at least 1.0 , at least 1.1, at least 1.2, at least 1.3, at least 1.4 or at least 1.5 (w/w). According to another embodiment of the present invention, the ratio of polysaccharide to improved carrier protein in a polysaccharide-improved carrier protein conjugate (or overall multivalent composition) is greater than 0.9 (w/w). According to another embodiment of the present invention, the ratio of polysaccharide to improved carrier protein in a polysaccharide-improved carrier protein conjugate (or overall multivalent composition) is from about 0.9 to about 3.0 (w/w). The preferred composition contains protein-saccharide conjugates of capsular polysaccharides from several pneumococcal serotypes with a total mass excess of polysaccharide relative to protein, for example, the protein:polysaccharide ratio is from

1:1,1 до 1:2 (мас./мас.), например, от 1:1,5 до 1:1,9.1:1.1 to 1:2 (w/w), for example 1:1.5 to 1:1.9.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения общий диапазон молекулярной массы конъюгатов полисахаридов всех серотипов и белка-носителя в поливалентной композиции конъюгатов, содержащих серотипические полисахариды и белок-носитель, находится в пределах конкретного диапазона. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу приблизительно 750 кДа, приблизительно 1000 кДа, приблизительно 1500 кДа, приблизительно 2000 кДа, приблизительно 2500 кДа, приблизительно 3000 кДа, приблизительно 3500 кДа, приблизительно 4000 кДа, приблизительно 4500 кДа, приблизительно 5000 кДа, приблизительно 5500 кДа, приблизительно 6000 кДа, приблизительно 6500 кДа, приблизительно 7000 кДа, приблизительно 7500 кДа или приблизительно 8000 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 750 кДа, по меньшей мере приблизительно 1000 кДа или по меньшей мере приблизительно 1500 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу от приблизительно 750 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу от приблизительно 800 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу от приблизительно 850 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу от приблизительно 900 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу от приблизительно 950 кДа до приблизительно 2800 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгаты антиген-улучшенный белок-носитель имеют молекулярную массу от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 2800 кДа.In some embodiments of the present invention, the overall molecular weight range of all serotype polysaccharide and carrier protein conjugates in a multivalent conjugate composition comprising serotype polysaccharides and a carrier protein is within a specific range. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of about 750 kDa, about 1000 kDa, about 1500 kDa, about 2000 kDa, about 2500 kDa, about 3000 kDa, about 3500 kDa, about 4000 kDa, about 4500 kDa, about 5000 kDa, about 5500 kDa, about 6000 kDa, about 6500 kDa, about 7000 kDa, about 7500 kDa, or about 8000 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of at least about 750 kDa, at least about 1000 kDa, or at least about 1500 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of from about 750 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of from about 800 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of from about 850 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of from about 900 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of from about 950 kDa to about 2800 kDa. In some embodiments of the present invention, the antigen-enhanced carrier protein conjugates have a molecular weight of from about 1000 kDa to about 2800 kDa.

Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30 различных конъюгатов улучшенный белок-носитель-антиген.According to additional embodiments of the present invention, the immunogenic composition contains at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, according to at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29 or according at least 30 different improved carrier protein-antigen conjugates.

В любой композиции, которая содержит несколько конъюгатов (например, конъюгат для каждого из нескольких пневмококковых серотипов), в некоторых случаях может быть предпочтительным, чтобы белок-носитель в каждом конъюгате был идентичным. Согласно другому варианту реализации таких композиций с несколькими конъюгатами предпочтительным может быть применение более чем одного носителя. Несмотря на возможность конъюгации каждого антигена (например, капсульных полисахаридов из разных пневмококковых серотипов) с различным носителем, как правило, только 2-4 (например, 2 или 3) различных носителя будут представлены среди отдельных конъюгатов в таких композициях. В качестве иллюстрации, но не с целью ограничения, в композиции из 24 различных конъюгатов, каждый из которых содержит капсульные полисахариды из различного пневмококкового серотипа, некоторые, но не все из 24 конъюгатов, содержат первый белок-носитель (например, основанный на CRM197), и оставшиеся из 24 конъюгатов содержит второй белок-носитель (например, основанный на HiD). Соответственно, в качестве примера, но не с целью ограничения, 12, 13, 15 или 20 из 24 конъюгатов могут содержать первый белок-носитель, и 12, 11, 9 или 4, соответственно, остальных конъюгатов могут содержать второй белок-носитель.In any composition that contains multiple conjugates (eg, a conjugate for each of several pneumococcal serotypes), in some cases it may be preferable that the carrier protein in each conjugate be identical. In another embodiment of such multi-conjugate compositions, it may be advantageous to use more than one carrier. Although it is possible to conjugate each antigen (eg, capsular polysaccharides from different pneumococcal serotypes) to a different carrier, typically only 2-4 (eg, 2 or 3) different carriers will be present among the individual conjugates in such compositions. By way of illustration, and not by way of limitation, in a composition of 24 different conjugates, each containing capsular polysaccharides from a different pneumococcal serotype, some, but not all of the 24 conjugates, contain a first carrier protein (e.g., based on CRM197), and the remaining of the 24 conjugates contains a second carrier protein (eg, based on HiD). Accordingly, by way of example, and not by way of limitation, 12, 13, 15, or 20 of the 24 conjugates may contain a first carrier protein, and 12, 11, 9, or 4, respectively, of the remaining conjugates may contain a second carrier protein.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно вспомогательное вещество содержит компоненты, подходящие для парентерального введения.According to some embodiments of the present invention, at least one excipient contains components suitable for parenteral administration.

Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно вспомогательное вещество необязательно содержит буфер или агент, корректирующий рН. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения буфер или агент, корректирующий рН, выбраны из группы, состоящей из бората натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, сульфата аммония или сукцината и любой их комбинации. Другие примеры подходящих буферов включают кислоты, такие как уксусная, борная, лимонная, молочная, фосфорная и соляная кислоты; основания, такие как гидроксид натрия, ацетат натрия, лактат натрия и трис-гидроксиметиламинометан; и буферы, такие как цитрат/декстроза, бикарбонат натрия и хлорид аммония. Буферы на основе гистидина также можно применять в иммуногенных композициях.According to additional embodiments of the present invention, the at least one excipient optionally contains a buffer or pH adjusting agent. In specific embodiments of the present invention, the buffer or pH adjusting agent is selected from the group consisting of sodium borate, sodium phosphate, sodium citrate, ammonium sulfate or succinate, and any combination thereof. Other examples of suitable buffers include acids such as acetic, boric, citric, lactic, phosphoric and hydrochloric acids; bases such as sodium hydroxide, sodium acetate, sodium lactate and tris-hydroxymethylaminomethane; and buffers such as citrate/dextrose, sodium bicarbonate, and ammonium chloride. Histidine-based buffers can also be used in immunogenic compositions.

Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно вспомогательное вещество необязательно содержит корректирующий тоничность агент для доведения осмоляльности композиции до приемлемого диапазона. Согласно конкретным вариантам реализацииAccording to additional embodiments of the present invention, the at least one excipient optionally contains a tonicity-correcting agent to adjust the osmolality of the composition to an acceptable range. According to specific implementation options

- 52 044044 настоящего изобретения корректирующий тоничность агент выбран из группы, состоящей из хлорида натрия, декстрозы и глицерина и любой их комбинации. Другие примеры буферов, подходящих для парентерального введения, включают соли, содержащие катионы натрия, калия или аммония и анионы хлорида, цитрата, аскорбата, бората, фосфата, бикарбоната, сульфата, тиосульфата или бисульфита; подходящие соли включают хлорид калия, тиосульфат натрия, бисульфит натрия и сульфат аммония.- 52 044044 of the present invention, the tonicity-correcting agent is selected from the group consisting of sodium chloride, dextrose and glycerol and any combination thereof. Other examples of buffers suitable for parenteral administration include salts containing sodium, potassium or ammonium cations and chloride, citrate, ascorbate, borate, phosphate, bicarbonate, sulfate, thiosulfate or bisulfite anions; suitable salts include potassium chloride, sodium thiosulfate, sodium bisulfite and ammonium sulfate.

Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно вспомогательное вещество необязательно содержит поверхностно-активный агент (поверхностноактивное вещество). Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения поверхностно-активный агент представляет собой монолаурат полиоксиэтиленсорбитана (полисорбат 20 или твин 20), моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (полисорбат 80 или твин 80), Brij 35, тритон Х-10, плюроновую кислоту F127 или додецилсульфат натрия (ДСН). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от 0,0003 до 0,3% (мас./мас.).According to further embodiments of the present invention, the at least one excipient optionally contains a surface active agent (surfactant). In specific embodiments of the present invention, the surfactant is polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Polysorbate 20 or Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Polysorbate 80 or Tween 80), Brij 35, Triton X-10, pluronic acid F127, or sodium dodecyl sulfate (SDS). In some embodiments of the present invention, the surfactant is present at a concentration of 0.0003 to 0.3% (w/w).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одно вспомогательное вещество необязательно содержит адъювант, агент, который усиливает стимуляцию иммунной системы за счет усиления презентации антигена (депо-состав, системы для доставки) и/или обеспечения костимулирующих сигналов (иммуномодуляторы). Согласно некоторым модификациям этого варианта реализации адъювант основан на соли алюминия. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения адъювант представляет собой фосфат алюминия-калия, гидроксифосфатсульфат алюминия, гидроксид алюминия или фосфат алюминия и любую их комбинацию. В других вариантах адъювант представляет собой эмульсию типа масло-в-воде. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения адъювант представляет собой AS03, MF59 или AF03 и любую их комбинацию. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения адъювант представляет собой агонист TLR4. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения адъювант представляет собой RC529. Предпочтительными адъювантами для применения с настоящим изобретением являются соли алюминия, такие как адъювант на основе фосфата алюминия (например, адъювант на основе гидроксифосфата алюминия). Если композиция содержит адъювант на основе соли алюминия, предпочтительно концентрация Al³⁺ в композиции составляет <1,25 мг на дозу, например, <1,25 мг на 0,5 мл, и в оптимальном варианте <0,85 мг на дозу. Конъюгаты в композиции могут быть адсорбированы в адъювант на основе соли алюминия. В случае смешанной композиции конъюгаты могут быть адсорбированы в соль алюминия по отдельности и затем смешаны или могут быть добавлены к соли алюминия для достижения последовательной адсорбции с получением смешанной композиции конъюгатов.In some embodiments, the at least one excipient optionally contains an adjuvant, an agent that enhances stimulation of the immune system by enhancing antigen presentation (depot formulation, delivery systems) and/or providing co-stimulatory signals (immunomodulators). In some modifications of this embodiment, the adjuvant is based on an aluminum salt. In specific embodiments of the present invention, the adjuvant is aluminum potassium phosphate, aluminum hydroxyphosphate sulfate, aluminum hydroxide or aluminum phosphate, and any combination thereof. In other embodiments, the adjuvant is an oil-in-water emulsion. In specific embodiments of the present invention, the adjuvant is AS03, MF59, or AF03, and any combination thereof. In other embodiments of the present invention, the adjuvant is a TLR4 agonist. According to a specific embodiment of the present invention, the adjuvant is RC529. Preferred adjuvants for use with the present invention are aluminum salts, such as an aluminum phosphate adjuvant (eg, an aluminum hydroxyphosphate adjuvant). If the composition contains an aluminum salt adjuvant, preferably the concentration of Al ³⁺ in the composition is <1.25 mg per dose, for example <1.25 mg per 0.5 ml, and optimally <0.85 mg per dose. The conjugates in the composition can be adsorbed into an aluminum salt adjuvant. In the case of a mixed composition, the conjugates can be adsorbed into the aluminum salt separately and then mixed, or can be added to the aluminum salt to achieve sequential adsorption to produce a mixed conjugate composition.

Предпочтительная композиция содержит (i) один или более конъюгатов, определенных в настоящем документе, например, капсульный полисахарид из нескольких пневмококковых серотипов, конъюгированный с белками-носителями, содержащими нпАК, и (ii) адъювант на основе фосфата алюминия.A preferred composition contains (i) one or more conjugates as defined herein, for example, a capsular polysaccharide from several pneumococcal serotypes conjugated to nPAA carrier proteins, and (ii) an aluminum phosphate adjuvant.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ увеличения соотношения полисахарида и белка-носителя (мас./мас.) (PS:PC) иммуногенной композиции, включающий: (а) введение в белок-носитель одной или более замен нпАК; и (b) конъюгирование полисахарида с белком-носителем за счет одной или более замен неприродных аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения одна или более замен содержат по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 замен. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения замены нпАК не находятся в эпитопе, активирующем Т-клетки, белка-носителя. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нпАК представляет собой pAMF. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белок-носитель сохраняет эпитоп связывания Т-клеток анатоксина дифтерии (DT), анатоксина столбняка (ТТ), белка D (PD) Haemophilus, комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В (ОМРС) или CRM197. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения замены неприродной аминокислотой происходят в остатках лизина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения эти остатки лизина выбраны из группы, состоящей из K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 и К527, а также любой их комбинации из SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид конъюгирован с белком-носителем за счет связи формулы XI или XIaAccording to one embodiment of the present invention, there is provided a method of increasing the polysaccharide to carrier protein (w/w) ratio (PS:PC) of an immunogenic composition, comprising: (a) introducing one or more nPAA substitutions into the carrier protein; and (b) conjugating the polysaccharide to a carrier protein through one or more unnatural amino acid substitutions. According to another embodiment of the present invention, one or more substitutions comprise at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 replacement According to another embodiment of the present invention, the npAK substitutions are not in the T cell activating epitope of the carrier protein. According to another embodiment of the present invention, the npAK is pAMF. In another embodiment of the present invention, the carrier protein retains the T cell binding epitope of diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), Haemophilus protein D (PD), meningococcal serogroup B outer membrane protein complex (OMPC), or CRM197. According to another embodiment of the present invention, substitutions with a non-natural amino acid occur at lysine residues. According to another embodiment of the present invention, these lysine residues are selected from the group consisting of K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 and K527, as well as any combination thereof from SEQ ID NO: 1. According to In another embodiment of the present invention, the polysaccharide is conjugated to a carrier protein through a bond of formula XI or XIa

- 53 044044- 53 044044

где R1 независимо представляет собой Н, формил или по меньшей мере одну аминокислоту белканосителя;wherein R1 independently represents H, formyl, or at least one amino acid of the carrier protein;

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение PS:PC составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 4. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид серотипа Streptococcus pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 9N, 10А, 11А, 12F, 13, 14, 15В, 16, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 и 33F, а также любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антиген представляет собой капсульный полисахарид, происходящий из одного из шести серотипов Porphyromonas gingivalis (например, K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes или Streptococcus agalactiae. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен гликопротеин, полученный с помощью способа, включающего этапы (а)-(b).In another embodiment of the present invention, the PS:PC ratio is from about 1.5 to about 4. In another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of a Streptococcus pneumoniae serotype selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5 , 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 and 33F, as well as any their combinations. According to another embodiment of the present invention, the antigen is a capsular polysaccharide derived from one of six serotypes of Porphyromonas gingivalis (eg, K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6). According to another embodiment of the present invention, the polysaccharide is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes or Streptococcus agalactiae. According to another embodiment of the present invention, there is provided a glycoprotein obtained using a method comprising steps (a)-(b).

10. Стимуляция иммунных ответов.10. Stimulation of immune responses.

Согласно настоящему изобретению предложен способ обеспечения иммунозащитного антительного ответа на антиген у субъекта путем введения указанному субъекту конъюгата или композиции, описанных в настоящем документе. Конъюгат или композиция, как правило, будут комбинированы со вспомогательным веществом, подходящим для парентерального введения.The present invention provides a method of providing an immunoprotective antibody response to an antigen in a subject by administering to said subject a conjugate or composition described herein. The conjugate or composition will typically be combined with an excipient suitable for parenteral administration.

Согласно настоящему изобретению также предложены конъюгаты и композиции для применения при вызове иммунозащитного антительного ответа на антиген. Согласно настоящему изобретению также предложено применение конъюгатов и композиций для изготовления лекарственного средства для обеспечения иммунозащитного антительного ответа на антиген.The present invention also provides conjugates and compositions for use in eliciting an immunoprotective antibody response to an antigen. The present invention also provides the use of conjugates and compositions for the manufacture of a medicament to provide an immunoprotective antibody response to an antigen.

Иммунозащитный антительный ответ означает, что конъюгат и композиции можно применять, например, чтобы обеспечить активную иммунизацию для предотвращения инвазивного заболевания, вызванного S.pneumoniae, для предотвращения отита среднего уха, вызванного S.pneumoniae, для предотвращения пневмонии, вызванной S.pneumoniae, для активной иммунизации субъектов, подверженных риску воздействия N.meningitidis, для предотвращения инвазивного заболевания и т.д.An immunoprotective antibody response means that the conjugate and compositions can be used, for example, to provide active immunization to prevent invasive disease caused by S. pneumoniae, to prevent otitis media caused by S. pneumoniae, to prevent pneumonia caused by S. pneumoniae, for active immunization of subjects at risk of exposure to N. meningitidis to prevent invasive disease, etc.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Для специалистов в данной области техники будут очевидны многочисленные варианты, изменения и замены, не отступающие от сущности настоящего изобретения. Примеры осуществляют с применением общеизвестных и общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, если иное не описано подробно.The present invention is illustrated by the following examples. The materials, methods, and examples are illustrative only and are not intended to be limiting. Numerous variations, changes and substitutions will be apparent to those skilled in the art without departing from the spirit of the present invention. The examples are carried out using well-known and conventional techniques known to those skilled in the art, unless otherwise described in detail.

ПримерыExamples

Пример 1. Синтез фрагментов односайтного eCRM K11TAG, K25TAG, K34TAG, K38TAG, K40TAG, K52TAG, K60TAG, K77TAG, K83TAG, K91TAG, K96TAG и K103TAG.Example 1. Synthesis of single-site eCRM fragments K11TAG, K25TAG, K34TAG, K38TAG, K40TAG, K52TAG, K60TAG, K77TAG, K83TAG, K91TAG, K96TAG and K103TAG.

eCRM экспрессировали в экстракте для бесклеточного синтеза белка (CFPS), предоставленном Sutro Biopharma, Inc. (Южный Сан-Франциско, Калифорния, США). Особенности и получение такого экстракта описаны в других публикациях; в данном случае экстракт обычно получали, как описано в Zawada et al., 2011, Biotechnol. Bioeng., 108(7), 1570-1578 со следующими модификациями из US2016/0257946: (1) бесклеточный экстракт получали из чувствительного к OmpT штамма, ослабленного по RF-1 и модифицированного для сверхэкспрессии DsbC E. coli; (2) бесклеточный экстракт получали из аналогичногоeCRM was expressed in cell-free protein synthesis (CFPS) extract provided by Sutro Biopharma, Inc. (South San Francisco, California, USA). The characteristics and preparation of such an extract are described in other publications; in this case, the extract was usually prepared as described in Zawada et al., 2011, Biotechnol. Bioeng., 108(7), 1570-1578 with the following modifications from US2016/0257946: (1) cell-free extract was prepared from an OmpT-sensitive RF-1-attenuated strain modified to overexpress E. coli DsbC; (2) cell-free extract was obtained from a similar

- 54 044044 ослабленного по RF-1 штамма Е. coli, модифицированного для получения ортогональной тРНК, кодирующей CUA, для вставки неприродной аминокислоты в стоп-кодоне амбер; (3) бесклеточные экстракты из (1) и (2) смешивали (в соотношении 85:15) и обрабатывали 50 мкМ йодацетамидом в течение 30 мин при комнатной температуре (20°С); и (4) смешанные экстракты добавляли в предварительную смесь, содержащую все другие компоненты системы для бесклеточного синтеза белка, за исключением ДНК, кодирующей eCRM. Конечная концентрация в реакции для бесклеточного синтеза белка составила 30% (по объему) клеточного экстракта, 2 мМ пара-метилазидо-L-фенилаланина (pAMF) (RSP Amino Acids, Ширли, Массачусетс, США), 5 мкМ pAMF-специфичной тРНК-синтетазы (RS), 2 мМ GSSG (окисленного глутатиона), 8 мМ глутамата магния, 10 мМ глутамата аммония, 130 мМ глутамата калия, 35 мМ пирувата натрия, 1,2 мМ АМФ, 0,86 мМ каждого из ГМФ, УМФ и ЦМФ, 2 мМ аминокислот (за исключением 0,5 мМ для тирозина и фенилаланина), 4 мМ оксалата натрия, 1 мМ путресцина, 1,5 мМ спермидина, 15 мМ фосфата калия, 100 нМ Т7 РНК-полимеразы и 2,5 мкМ плазмиды eCRM, кодирующей варианты нпАК. Реакции бесклеточного синтеза инициировали путем добавления плазмидной ДНК, кодирующей eCRM.- 54 044044 RF-1 attenuated E. coli strain modified to produce an orthogonal tRNA encoding CUA to insert an unnatural amino acid at the amber stop codon; (3) cell-free extracts from (1) and (2) were mixed (85:15 ratio) and treated with 50 μM iodoacetamide for 30 min at room temperature (20°C); and (4) the mixed extracts were added to a premix containing all other components of the cell-free protein synthesis system except the DNA encoding the eCRM. The final reaction concentration for cell-free protein synthesis was 30% (v/v) cell extract, 2 mM para-methylazido-L-phenylalanine (pAMF) (RSP Amino Acids, Shirley, MA, USA), 5 μM pAMF-specific tRNA synthetase (RS), 2 mM GSSG (oxidized glutathione), 8 mM magnesium glutamate, 10 mM ammonium glutamate, 130 mM potassium glutamate, 35 mM sodium pyruvate, 1.2 mM AMP, 0.86 mM each of GMP, UMP and CMP, 2 mM amino acids (except 0.5 mM for tyrosine and phenylalanine), 4 mM sodium oxalate, 1 mM putrescine, 1.5 mM spermidine, 15 mM potassium phosphate, 100 nM T7 RNA polymerase and 2.5 μM eCRM plasmid, encoding npAK variants. Cell-free synthesis reactions were initiated by adding plasmid DNA encoding eCRM.

Реакционные смеси инкубировали в течение 14 ч на шейкере при 650 об./мин в 48-луночных планшетах с лунками в форме цветка (m2p-labs # MTP-48-B). После инкубационного периода реакцию поддерживали при 4°С до дальнейших манипуляций для очистки или анализа. После реакции бесклеточного синтеза белка смесь, содержащую pAMF-eCRM, переносили в 96-луночный планшет (DyNa Block™, 2 мл; Labnet, Эдисон, Нью-Джерси, США) и центрифугировали при 5000xg в течение 15 мин при 40°С.Reaction mixtures were incubated for 14 h on a shaker at 650 rpm in 48-well flower-shaped well plates (m2p-labs # MTP-48-B). After the incubation period, the reaction was maintained at 4°C until further manipulation for purification or analysis. After the cell-free protein synthesis reaction, the mixture containing pAMF-eCRM was transferred to a 96-well plate (DyNa Block™, 2 ml; Labnet, Edison, NJ, USA) and centrifuged at 5000xg for 15 min at 40°C.

Сначала проводили эксперимент по оптимизации для оценки наилучшей температуры и добавок для получения eCRM с помощью CFPS. Реакции CFPS проводили при 30, 25 и 20°С с дополнительным добавлением кодирующей CUA тРНК (0, 1, 2, 4, 8, 12% об./об.) и смеси нпАК/синтетаза (50, 100, 150, 200 мкг/мл) при каждой из трех температур. Образцы смеси CFPS до и после центрифугирования собирали и анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, и полосы количественно оценивали денситометрическим методом для оценки количества растворимого белка (образец после центрифугирования) от общего белка (образец перед центрифугированием), полученного при каждом условии.First, an optimization experiment was conducted to evaluate the best temperature and additives to produce eCRM using CFPS. CFPS reactions were carried out at 30, 25 and 20°C with additional addition of CUA-encoding tRNA (0, 1, 2, 4, 8, 12% v/v) and npAA/synthetase mixture (50, 100, 150, 200 μg /ml) at each of the three temperatures. Samples of the CFPS mixture before and after centrifugation were collected and analyzed by SDS-PAGE, and the bands were quantified by densitometry to estimate the amount of soluble protein (post-centrifugation sample) of the total protein (pre-centrifugation sample) obtained under each condition.

На фиг. 1 показан выход нпАК-eCRM, полученного при каждом условии, который количественно оценивали денситометрическим методом. В то время как реакции CFPS при 30° давали относительно небольшую фракцию растворимого белка (не более ~0,33 от общего количества во всех условиях), выход растворимого белка был повышен (>~0,40 растворимого/общего белка во всех условиях) при 25° и далее повышался (>~0,60 растворимого/общего белка во всех условиях) при 20°. При обоих условиях с низкими температурами выход растворимого белка дополнительно повышался за счет увеличения концентрации тРНК (1-12х концентрации увеличивали выход), в то время как увеличение концентрации нпАК/синтетазы оказывало нежелательное влияние на выход растворимого белка либо не оказывало влияния.In fig. Figure 1 shows the yield of npAA-eCRM obtained under each condition, which was quantified by densitometry. While CFPS reactions at 30° yielded a relatively small fraction of soluble protein (no more than ~0.33 of total in all conditions), soluble protein yield was increased (>~0.40 soluble/total protein in all conditions) at 25° and further increased (>~0.60 soluble/total protein in all conditions) at 20°. Under both low temperature conditions, soluble protein yield was further enhanced by increasing tRNA concentration (1-12x concentrations increased yield), while increasing npAA/synthetase concentration had an undesirable effect on soluble protein yield or had no effect.

На основании эксперимента согласно фиг. 1 температуры менее 20° и концентрация тРНК по меньшей мере 20 мкМ были выбраны для синтеза вариантов K11TAG, K25TAG, K34TAG, K38TAG, K40TAG, K52TAG, K60TAG, K77TAG, K83TAG, K91TAG, K96TAG и K103TAG.Based on the experiment according to FIG. 1 temperatures less than 20°C and a tRNA concentration of at least 20 µM were selected for the synthesis of variants K11TAG, K25TAG, K34TAG, K38TAG, K40TAG, K52TAG, K60TAG, K77TAG, K83TAG, K91TAG, K96TAG and K103TAG.

Реакции CFPS проводили, как указано выше. Для удобства очистки в этих предварительных экспериментах гистидиновую метку (GSGHHHHHH; SEQ ID NO: 10) гибридизовали с С-концом последовательности белка-носителя с помощью вектора экспрессии, и очистку вариантов eCRM из супернатанта после центрифугирования проводили с применением колонки PhyTip® IMAC (Phynexus, Сан-Хосе, Калифорния, США), содержащей 40 мкл смолы. Слой смолы предварительно уравновешивали в буфере для уравновешивания IMAC (1х ФСБ и 10 мМ имидазола), и очищенный супернатант пипетировали 10 раз вверх и вниз через уравновешенную PhyTip® IMAC при скорости потока 4,2 мкл/мин. Связанный белок промывали буфером для уравновешивания IMAC и затем элюировали 125 мкл буфера для элюирования IMAC (1х ФСБ и 0,5 М имидазола). Гистидиновая метка не является существенной, и ею пренебрегали для более крупномасштабной очистки.CFPS reactions were performed as above. To facilitate purification in these preliminary experiments, a histidine tag (GSGHHHHHH; SEQ ID NO: 10) was hybridized to the C-terminus of the carrier protein sequence using an expression vector, and purification of eCRM variants from the supernatant after centrifugation was performed using a PhyTip® IMAC column (Phynexus, San Jose, California, USA) containing 40 µl of resin. The resin layer was pre-equilibrated in IMAC equilibration buffer (1x PBS and 10 mM imidazole) and the cleared supernatant was pipetted 10 times up and down through the equilibrated PhyTip® IMAC at a flow rate of 4.2 µL/min. Bound protein was washed with IMAC equilibration buffer and then eluted with 125 μl of IMAC elution buffer (1x PBS and 0.5 M imidazole). The histidine tag is not essential and was neglected for larger scale purification.

Включение нпАК и реакционную способность оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и флуоресцентного анализа после реакции с DBCO- флуоресцеином (фиг. 2). 2-12 мкМ eCRM инкубировали с 50 мкМ DBCO-флуоресцеина в течение 16 ч, подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и визуализировали с применением Кумасси синего (видимый свет) и набора фильтров Sypro-ruby (флуоресцентный, флуоресцеин). На фиг. 2 показаны соответствующие изображения геля, окрашенного Кумасси (слева), и флуоресцентные изображения (справа) геля, показывающие способность pAMF, включенной в eCRM, вступать в реакцию с DBCO. Амбер-замены K25, K34, K38 и K40 показывают высокую эффективность экспрессии и конъюгации, в отличие от других.npAA incorporation and reactivity were assessed by SDS-PAGE and fluorescence analysis after reaction with DBCO-fluorescein (Fig. 2). 2–12 μM eCRM was incubated with 50 μM DBCO-fluorescein for 16 h, subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions, and visualized using Coomassie blue (visible light) and a Sypro-ruby filter set (fluorescent, fluorescein). In fig. Figure 2 shows corresponding images of a Coomassie-stained gel (left) and fluorescent images (right) of the gel showing the ability of pAMF included in the eCRM to react with DBCO. Amber substitutions K25, K34, K38 and K40 show high expression and conjugation efficiency, unlike others.

Пример 2. Дизайн нескольких нпАК eCRM.Example 2. Design of several eCRM software packages.

Несколько вариантов нпАК eCRM выбирали, как описано в подробном описании выше. Варианты синтезировали с помощью CFPS и испытывали в соответствии с примером 1.Several eCRM nAAC options were selected as described in the detailed description above. Variants were synthesized using CFPS and tested according to Example 1.

- 55 044044- 55 044044

Таблица 2table 2

лом было обнаружено, что большее количество замен привело к получению носителей, которые обеспечивали конъюгаты с более высокой молекулярной массой (например, для серотипа 14 увеличение массы составило от 998 кДа с 2 заменами до 1238 кДа с 3 заменами, до 1789 кДа с 4 заменами и до 2547 кДа с 5 заменами), но носители имели более низкую растворимость. Носители с шестью остатками pAMF обычно обеспечивали как хорошую растворимость (50 мг/мл), так и иммуногенность. Высокая растворимость была неожиданной, поскольку замена заряженных остатков Lys в нативной последовательности гидрофобными остатками pAMF увеличивала гидрофобность CRM197, который представляет собой белок, гидрофобность которого, как сообщалось, оказывала отрицательное влияние на его растворимость (Orr et al. 1999 Infect Immun 67:4290-4). Соответственно, эти результаты указывают на возможность сохранения тех же сайтов прикрепления, которые применяли в известных конъюгатах CRM197 (а именно остатки Lys), не вызывая нерастворимость при потере заряженных остатков.It was found that more substitutions resulted in vehicles that provided higher molecular weight conjugates (e.g., for serotype 14 the increase in mass ranged from 998 kDa with 2 substitutions to 1238 kDa with 3 substitutions to 1789 kDa with 4 substitutions and up to 2547 kDa with 5 substitutions), but the carriers had lower solubility. Six-residue pAMF carriers generally provided both good solubility (50 mg/mL) and immunogenicity. The high solubility was unexpected because replacement of charged Lys residues in the native sequence with hydrophobic residues of pAMF increased the hydrophobicity of CRM197, which is a protein whose hydrophobicity was reported to have a negative effect on its solubility (Orr et al. 1999 Infect Immun 67:4290-4 ). Accordingly, these results indicate that it is possible to retain the same attachment sites used in known CRM197 conjugates (namely Lys residues) without causing insolubility upon loss of charged residues.

Исследования CRM197 выявили Т-клеточные эпитопы в пределах остатков P272-D291, V322-G384 и Q412-I458 из SEQ ID NO: 1. Эти эпитопные области включают остатки Lys K420, K441, K446, K448 и K457, поэтому замена этих остатков лизина может разрушить Т-клеточные эпитопы, которые лежат в основе активности CRM197. Соответственно, предпочтительные остатки Lys для замещения нпАК в SEQ ID NO: 1 представляют собой K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 и К527, как показано в табл. 2 выше.CRM197 studies have identified T cell epitopes within residues P272-D291, V322-G384, and Q412-I458 of SEQ ID NO: 1. These epitope regions include Lys residues K420, K441, K446, K448, and K457, so substitution of these lysine residues may disrupt T cell epitopes that underlie CRM197 activity. Accordingly, the preferred Lys residues for npAK substitution in SEQ ID NO: 1 are K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 and K527, as shown in Table. 2 above.

Желательно, чтобы конъюгированные полисахариды не были локализованы слишком близко в одной области поверхности CRM197. Соответственно, в пределах близко расположенных остатков предпочтительно выбрать (i) только один из K25, K34, K38 и K40, и (ii) либо K213, либо K215. Кроме того, если выйти за рамки его первичной структуры, исследования трехмерной структуры CRM197 выявили две общие области (первая распространяется до Asn-374, и вторая распространяется от Ser-375), поэтому остатки предпочтительно должны быть выбраны в обеих этих областях, например, для 6 замен выбираютIt is desirable that the conjugated polysaccharides are not localized too close to one region of the CRM197 surface. Accordingly, within closely spaced residues, it is preferable to select (i) only one of K25, K34, K38 and K40, and (ii) either K213 or K215. Additionally, going beyond its primary structure, studies of the three-dimensional structure of CRM197 have revealed two general regions (the first extending to Asn-374, and the second extending from Ser-375), so residues should preferentially be selected in both of these regions, e.g. 6 replacements are chosen

- 56 044044 по 3 в каждой области. Эта общая рекомендация обеспечивает пространственное отделение полисахаридов при прикреплении к носителю CRM197.- 56 044044 3 in each region. This general recommendation ensures spatial separation of polysaccharides upon attachment to the CRM197 carrier.

Одна последовательность, которая была особенно подходящей при создании пневмококковых конъюгатов, представляет собой вариант 12 в табл. 2, в котором K34, K213, K245, K265, K386 и K527 заменены нпАК. Этот белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой каждый X представляет собой pAMF (предпочтительную нпАК). Этот белок применяли для получения конъюгатов, описанных ниже.One sequence that has been particularly useful in creating pneumococcal conjugates is variant 12 in Table. 2, in which K34, K213, K245, K265, K386 and K527 are replaced by NPAK. This protein has the amino acid sequence SEQ ID NO: 9, in which each X represents a pAMF (preferred npAK). This protein was used to prepare the conjugates described below.

Остатки лизина являются подходящими, поскольку они являются аминокислотами, которые применяли в известных конъюгатах CRM197, поэтому нпАК в этих положениях обеспечивают конъюгацию в тех же сайтах, которые, как уже известно, совместимы с CRM197. Однако, как указано выше, потеря заряженного лизина может привести к структурным изменениям, повышенной гидрофобности и меньшей растворимости. Модификация остатков фенилаланина на нпАК на основе фенилаланина (такие как параазидо-Phe, пара-азидометил-Phe, пара-фтор-Phe, пара-ацетил-Phe или пара-бензоил-Phe) приведет к уменьшению риска этих изменений. Соответственно, остатки F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 или F532 также отбирали для замены, отдельно или в комбинации. Испытывали замены до пяти остатков Phe pAMF, которые приводили к получению растворимых конъюгатов, но с тенденцией к снижению молекулярной массы конъюгатов по сравнению с аналогичным количеством нескольких замен Lys.Lysine residues are suitable because they are amino acids that have been used in known CRM197 conjugates, so nPAAs at these positions allow conjugation at the same sites already known to be compatible with CRM197. However, as stated above, loss of charged lysine can lead to structural changes, increased hydrophobicity and less solubility. Modification of phenylalanine residues to phenylalanine-based nPAAs (such as para-azido-Phe, para-azidomethyl-Phe, para-fluoro-Phe, para-acetyl-Phe, or para-benzoyl-Phe) will reduce the risk of these changes. Accordingly, residues F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, or F532 were also selected for replacement, alone or in combination. Substitutions of up to five Phe residues of pAMF were tested, which resulted in soluble conjugates, but with a tendency to reduce the molecular weight of the conjugates compared with a similar number of multiple Lys substitutions.

Вместо замены аминокислот в CRM197 нпАК также могут быть вставлены в последовательность CRM197. Например, кодон TAG, кодирующий pAMF, вставляли непосредственно после остатков лизина K34, K213, K245, K265, K386 и K527, либо по отдельности (для создания шеститочечных вставок), либо в комбинации (для вставки 2, 3, 4, 5 или 6 нпАК). Носители со вставленной нпАК, такие как упомянутые, можно применять для получения конъюгатов и поливалентных композиций, как описано выше.Instead of replacing amino acids in CRM197, npAAs can also be inserted into the CRM197 sequence. For example, the TAG codon encoding pAMF was inserted immediately after lysine residues K34, K213, K245, K265, K386, and K527, either individually (to create six-point insertions) or in combination (to create insertions 2, 3, 4, 5, or 6 npAK). NPAA-embedded carriers, such as those mentioned, can be used to prepare conjugates and multivalent compositions as described above.

Пример 3. Выявление Т-клеточных эпитопов в Pfs25.Example 3: Identification of T cell epitopes in Pfs25.

Эпитопы, активирующие Т-клетки, специфического поверхностного белка оокинета малярийного плазмодия Pfs25 определяли экспериментально в соответствии с методами, описанными, например, в Diethelm-Okita et al., JInfect Dis. 1997 Feb; 175(2):382-91. В общих чертах, пептидные фрагменты из 20 аминокислот и перекрывающиеся на 5 аминокислот синтезировали в соответствии с полной экспрессированной последовательностью Pfs25. CD8⁺-истощенные и CD4⁺-обогащенные лимфоциты периферической крови человека (ЛПК) получали от нескольких субъектов. ЛПК высевали с тремя повторами и культивировали с отдельными синтетическими пептидами, охватывающими последовательность Pfs25, которые служили в качестве экспериментальных стимулов. Пролиферацию ЛПК в ответ на каждый пептидный фрагмент измеряли путем импульсного введения [³Н]-тимидина в культуры и проводили сравнение культур, происходящих от разных индивидуумов. Было выявлено, что фрагменты Pfs25, которые стимулировали пролиферацию, содержат эпитоп Т-клеток. Фрагменты, которые стимулируют пролиферацию ЛПК от нескольких или всех субъектов, классифицировали как содержащие универсальный или иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп в Pfs25.T cell activating epitopes of the specific ookinete surface protein of the malaria plasmodium Pfs25 were determined experimentally according to methods described, for example, in Diethelm-Okita et al., JInfect Dis. Feb 1997; 175(2):382-91. In general, peptide fragments of 20 amino acids and overlapping by 5 amino acids were synthesized according to the complete expressed sequence of Pfs25. CD8 ⁺ -depleted and CD4 ⁺ -enriched human peripheral blood lymphocytes (HPL) were obtained from several subjects. PBLs were seeded in triplicate and cultured with individual synthetic peptides spanning the Pfs25 sequence, which served as experimental stimuli. PBL proliferation in response to each peptide fragment was measured by pulsing [ ³ H]-thymidine into cultures and comparing cultures from different individuals. The Pfs25 fragments that stimulated proliferation were found to contain a T cell epitope. Fragments that stimulate PBL proliferation from several or all subjects were classified as containing a universal or immunodominant T cell epitope in Pfs25.

Пример 4. Общий протокол для активации полисахарида мета-периодатом натрия.Example 4: General protocol for polysaccharide activation with sodium meta-periodate.

Серотипические полисахариды (~30 мкмоль) растворяли в водном растворе (10 мМ HCl). Затем раствор нагревали при 45°С в течение 30 мин и затем охлаждали, при этом добавляли раствор NaOH для доведения рН до 6,70. Реакционную смесь подвергали диализу с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа) против воды категории ВЭЖХ. Супернатант переносили в 50 мл пробирку Falcon, добавляли ацетатный буфер (рН 5,35) до конечной концентрации 25 мМ и добавляли 0,5 экв. NaIO₄. Смесь перемешивали при 25°С в течение 17 ч, по истечении этого времени окисленный образец необязательно обрабатывали избытком борогидрида натрия (10 экв.) и очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа), используя несколько замен воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного полисахарида.Serotypic polysaccharides (~30 μmol) were dissolved in an aqueous solution (10 mM HCl). The solution was then heated at 45°C for 30 min and then cooled while NaOH solution was added to adjust the pH to 6.70. The reaction mixture was dialyzed using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa) against HPLC grade water. The supernatant was transferred to a 50 mL Falcon tube, acetate buffer (pH 5.35) was added to a final concentration of 25 mM, and 0.5 eq. _NaIO4 . The mixture was stirred at 25°C for 17 hours, after which time the oxidized sample was optionally treated with an excess of sodium borohydride (10 eq.) and purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa), using several changes of HPLC grade water, to obtain a solution of the oxidized polysaccharide.

Пример 5. Общая процедура дериватизации полисахарида, окисленного периодатом, с применением DBCO.Example 5 General procedure for derivatization of periodate-oxidized polysaccharide using DBCO.

Окисленный полисахарид (~30 мкмоль) комбинировали с DBCO-PEG₄-NH₂ (~30 мкмоль) или DBCO-NH2 (~30 мкмоль) в 72 мМ фосфате натрия с рН 6,79, содержащем 16% ДМСО, при 25°С. Затем реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли раствор цианоборогидрида натрия (16 мг/мл в воде; 59,54 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение ночи-2 дней при 25°С. Затем реакционную смесь промывали 3 раза этилацетатом, переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа) и затем подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды, с получением раствора DBCO-производного полисахарида. DBCO-производное полисахарида затем смешивали с сахарозой в соотношении 10:1 (мас./мас.) и лиофилизировали с получением белого порошка для использования в следующей реакции конъюгации.Oxidized polysaccharide (~30 µmol) was combined with DBCO-PEG ₄ -NH ₂ (~30 µmol) or DBCO-NH2 (~30 µmol) in 72 mM sodium phosphate pH 6.79 containing 16% DMSO at 25°C . The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time a solution of sodium cyanoborohydride (16 mg/ml in water; 59.54 µmol, 20 eq.) was added and stirred overnight-2 days at 25°C . The reaction mixture was then washed 3 times with ethyl acetate, transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water to obtain a DBCO-derived polysaccharide solution. The DBCO derivative of the polysaccharide was then mixed with sucrose at a ratio of 10:1 (w/w) and lyophilized to obtain a white powder for use in the next conjugation reaction.

Пример 6. Общий протокол для активации полисахарида с применением CDAP.Example 6: General protocol for polysaccharide activation using CDAP.

Капсульный полисахарид (30 мг) (PS 3) растворяли в водном растворе (13,5 мл Н₂О с 1,5 мл 2 М уксусной кислоты). Смесь нагревали при 85°С в течение 1 ч и после охлаждения до температуры окру- 57 044044 жающей среды добавляли избыток хлорида магния из 1 М раствора. Полученный полисахарид очищали с помощью центрифуги Amicon при НОММ 30 кДа с использованием 6 замен воды.Capsular polysaccharide (30 mg) (PS 3) was dissolved in an aqueous solution (13.5 ml H ₂ O with 1.5 ml 2 M acetic acid). The mixture was heated at 85°C for 1 hour and after cooling to ambient temperature, excess magnesium chloride was added from a 1 M solution. The resulting polysaccharide was purified using an Amicon centrifuge at HOMM 30 kDa using 6 water changes.

Полученный полисахарид затем растворяли в воде с рН 7,0 и добавляли реагент для цианилирования, CDAP (тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридина в ацетонитриле). Затем рН раствора доводили до 9,5 или добавляли триметиламин (2,5 экв.). Затем к раствору добавляли DBCO-PEG₄-NH₂ или DBCO-NH2. Количество ДМСО в растворе доводили до 5% и перемешивали в течение ночи при 25°С. Раствор промывали 3 раза с применением 20 мл этилацетата и очищали с помощью блоков для диализа Amicon при НОММ 30 кДа, используя 7 замен 3% ДМСО, 20% этанола, 0,9% хлорида натрия и 3 замены воды. DBCO-производное полисахарида затем смешивали с сахарозой в соотношении 10:1 (мас./мас.) и лиофилизировали.The resulting polysaccharide was then dissolved in water at pH 7.0 and the cyanylation reagent, CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate in acetonitrile), was added. The pH of the solution was then adjusted to 9.5 or trimethylamine (2.5 eq.) was added. Then DBCO-PEG ₄ -NH ₂ or DBCO-NH2 was added to the solution. The amount of DMSO in the solution was adjusted to 5% and stirred overnight at 25°C. The solution was washed 3 times with 20 ml ethyl acetate and purified using Amicon dialysis units at HOMM 30 kDa using 7 changes of 3% DMSO, 20% ethanol, 0.9% sodium chloride and 3 changes of water. The DBCO derivative of the polysaccharide was then mixed with sucrose in a 10:1 (w/w) ratio and lyophilized.

Пример 7. Общая методика конъюгации полисахарида-DBCO с eCRM.Example 7: General procedure for polysaccharide-DBCO conjugation to eCRM.

Образец полисахарида-DBCO лиофилизировали и смешивали с сахарозой в соотношении 10:1 мас./мас., (полученный согласно методике примеров 4 или 5), растворяли в 0,9% NaCl и смешивали с eCRM в растворе с получением входного массового соотношения PS:eCRM равного 1:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением избытка раствора азида натрия. Смесь конъюгированного PS-eCRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу против 5 замен 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч. Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата PS-eCRM.The DBCO polysaccharide sample was lyophilized and mixed with sucrose at a 10:1 w/w ratio (prepared according to the procedure of Examples 4 or 5), dissolved in 0.9% NaCl and mixed with eCRM in solution to obtain the PS input mass ratio: eCRM equal to 1:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding excess sodium azide solution. The conjugated PS-eCRM mixture was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMM 300000) and then dialyzed against 5 changes of 0.9% sodium chloride solution for 24 hours. The dialyzed solution was filtered. through Millex-GP (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a PS-eCRM conjugate solution.

Пример 8. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 1 с eCRM из табл. 2.Example 8. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 1 with eCRM from table. 2.

1. Окисление..1. Oxidation..

Степень чистоты PS типа 1: 80% (уроновая кислота).PS type 1 purity: 80% (uronic acid).

Мол. масса: 625 г-моль^-1 (на повторяющееся звено).Mol. mass: 625 g-mol ^-1 (per repeat unit).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид (19,7 мг, скорректировано до 80%, 15,8 мг, 25,2 мкмоль) растворяли в 9,85 мл водного раствора (7,0 мл воды и 2,85 мл ацетатного буфера, 200 мМ, рН 5,5). К этому раствору добавляли 300 мкл раствора периодата натрия (104 мкг, 3,78 мкмоль, 0,15 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени добавляли большой молярный избыток борогидрида натрия (10 мол.экв.). Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-1.Native polysaccharide (19.7 mg, adjusted to 80%, 15.8 mg, 25.2 μmol) was dissolved in 9.85 ml of aqueous solution (7.0 ml of water and 2.85 ml of acetate buffer, 200 mM, pH 5 ,5). To this solution was added 300 μl of sodium periodate solution (104 μg, 3.78 μmol, 0.15 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time a large molar excess of sodium borohydride (10 mol.eq.) was added. Oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using at least 6 water changes to obtain a purified PS-1 solution.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 1 (мг) PS 1 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. уроновой кис. (мкМ) Quantity research uronic acid (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) Exit PS (%) Примечание Note 0,15 0.15 19,7 19.7 2,86 2.86 11040 11040 1,4 1.4 Не определяли Not determined 100 100 Нет No

2. Дериватизация с применением DBCO.2. Derivatization using DBCO.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS1-OX (15,8 мг, 25,2 мкмоль) растворяли в фосфатном буфере (3,6 мл, 50 мМ, рН 7,0), к которому был добавлен DBCO-PEG4-NHS сл. эфир (1,0 экв., 649,1 г-моль^-1 в ДМСО, 0,35 мл). Реакционную смесь перемешивали при 37°С в течение двух дней в термостатируемой водяной бане с последующей экстракцией этилацетатом (3x20 мл). DBCO-производное очищали с помощью блоков для центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 1. К этому раствору (2,20 мл, 9,59 мг) добавляли раствор сахарозы (96 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 3,18 мг 1-DBCO и 32 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.PS1-OX (15.8 mg, 25.2 μmol) was dissolved in phosphate buffer (3.6 ml, 50 mM, pH 7.0), to which DBCO-PEG4-NHS sl was added. ether (1.0 eq., 649.1 g-mol ^-1 in DMSO, 0.35 ml). The reaction mixture was stirred at 37°C for two days in a thermostatic water bath, followed by extraction with ethyl acetate (3x20 ml). The DBCO derivative was purified using centrifugal dialysis units (Amicon, HOMM 30 kDa) using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 1. To this solution ( 2.20 ml, 9.59 mg) sucrose solution (96 mg in 1 ml water) was added. The combined solution was divided into three equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 3.18 mg 1-DBCO and 32 mg sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный PS 1(мг) Oxidized PS 1(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. уроновой кис. (мкМ) Quantity research uronic acid (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 15,8 15.8 2,20 2.20 6976 6976 0,280x4 0.280x4 116,16 116.16 1,67 1.67 65 65 602 602

3. Конъюгация производного PS 1-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 1-DBCO with eCRM.

PS 1-DBCO: 3,18 мг (с 32 мг сахарозы) лиофилизированного порошка. %DBCO:1,67%.PS 1-DBCO: 3.18 mg (with 32 mg sucrose) lyophilized powder. %DBCO:1.67%.

Концентрация CRM: 6,5 мг/мл раствор.CRM concentration: 6.5 mg/ml solution.

PS: CRM (входное соотношение): 1:1.PS: CRM (input ratio): 1:1.

- 58 044044- 58 044044

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

1-DBCO растворяли в растворе функционализированного азидом eCRM (0,51 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS1:CRM равное 1:1 (мас./мас.). Дополнительное разбавление 0,9% раствором хлорида натрия (профильтрованным через фильтр с размером пор 0,22 мкм) до концентрации 1,0 мг-мл^-1 требовалось для того чтобы уменьшить образование геля. Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Конъюгат CRM переносили в две предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 1-CRM.1-DBCO was dissolved in azide-functionalized eCRM solution (0.51 mL) to provide an input PS1:CRM mass ratio of 1:1 (w/w). Additional dilution with 0.9% sodium chloride solution (filtered through a 0.22 µm filter) to a concentration of 1.0 mg mL ^-1 was required to reduce gel formation. The solution was mixed very gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The CRM conjugate was transferred into two prewashed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride for 24 hours (3 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 1-CRM conjugate solution.

PS 1DBCO (мг) PS 1DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD* Ratio PS:CRM CJD* Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 3,18 3.18 3,315 3.315 7,17 7.17 0,177 0.177 40 40 0,099 0.099 21 21 1,79:1 1.79:1 9,39 9.39 2,13 2.13

*CJD = диализированный конъюгат.*CJD = dialyzed conjugate.

Пример 9: Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 2 с eCRM из табл. 2.Example 9: Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 2 with eCRM from table. 2.

1. Окисление..1. Oxidation..

Степень чистоты PS типа 2: 80%.PS type 2 purity: 80%.

Мол. масса: 960,84 г-моль^-1.Mol. mass: 960.84 g-mol ^-1 .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид (25,5 мг, 26,5 мкмоль) растворяли в 12,75 мл водного раствора (9,24 мл воды и 3,51 мл ацетатного буфера, 200 мМ, рН 5,5). К этому раствору добавляли 216 мкл раствора периодата натрия (5,26 мг/мл, 0,20 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч с контролем по поглощению УФИ при 222 нм для NaIO₄. Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, HOMM 100 кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-2.Native polysaccharide (25.5 mg, 26.5 μmol) was dissolved in 12.75 ml of aqueous solution (9.24 ml of water and 3.51 ml of acetate buffer, 200 mM, pH 5.5). To this solution was added 216 μl of sodium periodate solution (5.26 mg/ml, 0.20 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours while monitoring the UV absorption at 222 nm for NaIO ₄ . Oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 100 kDa) using at least 6 water changes to obtain a purified PS-2 solution.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 2 (мг) PS 2 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) Exit PS (%) Примечание Note 0,20 0.20 25,5 25.5 2,28 2.28 9041 9041 22,8 22.8 5,4 5.4 78 78 Нет No

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS2-OX (18,1 мг, 18,8 мкмоль) в 2,14 мл воды разбавляли фосфатным буфером (1,95 мл, 200 мМ, рН 6,0), к которому был добавлен DBCO-PEG4-NH2 (9,85 мг, 1 экв., в ДМСО, 0,197 мл). Через 25 мин добавляли NaCNBH₃ (2,36 мг, 2 экв. 59 мкл из раствора в Н₂О). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение двух дней в термостатируемой водяной бане и затем добавляли фосфатный буфер (0,5 мл 200 мМ, рН 6). К этой смеси добавляли NaBH4 (60 мкл 10 мг/мл водного раствора, 1 экв.) После перемешивания в течение 30 мин смесь экстрагировали этилацетатом (4x5 мл). Остаточный этилацетат удаляли барботированием газообразным азотом, и смесь переносили в центрифужные фильтры Amicon с НОММ 100 кДа. DBCO-производное очищали с помощью центробежного диализа, используя 1 замену воды, затем 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 2. К этому раствору (2,14 мл, 14,3 мг) добавляли раствор сахарозы (100 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три практически равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка (4,96 мг, 4,96 мг и 4,4 мг).PS2-OX (18.1 mg, 18.8 µmol) in 2.14 ml of water was diluted with phosphate buffer (1.95 ml, 200 mmol, pH 6.0), to which DBCO-PEG4-NH2 (9, 85 mg, 1 eq., in DMSO, 0.197 ml). After 25 minutes, NaCNBH ₃ (2.36 mg, 2 eq. 59 μl from solution in H ₂ O) was added. The reaction mixture was stirred at 25°C for two days in a thermostatic water bath and then phosphate buffer (0.5 ml of 200 mM, pH 6) was added. NaBH4 (60 µl of 10 mg/ml aqueous solution, 1 eq.) was added to this mixture. After stirring for 30 min, the mixture was extracted with ethyl acetate (4x5 ml). Residual ethyl acetate was removed by bubbling nitrogen gas and the mixture was transferred to Amicon 100 kDa HOMM centrifuge filters. The DBCO derivative was purified by centrifugal dialysis using 1 change of water, followed by 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 2. To this solution (2.14 ml , 14.3 mg), a sucrose solution (100 mg in 1 ml of water) was added. The combined solution was divided into three substantially equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder (4.96 mg, 4.96 mg and 4.4 mg).

Окисленный PS 2(мг) Oxidized PS 2(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 18,1 18.1 2,14 2.14 1956 1956 0,848x4 0.848x4 315,5 315.5 4,03 4.03 89 89 375 375

3. Конъюгация производного PS 2-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 2-DBCO with eCRM.

PS 2-DBCO: 4,4 мг (с 32 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 2-DBCO: 4.4 mg (with 32 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 4,03%.%DBCO: 4.03%.

Концентрация CRM: 3,18 мг/мл раствор.CRM concentration: 3.18 mg/ml solution.

PS:CRM (входное соотношение): 1,5:1.PS:CRM (input ratio): 1.5:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS2-DBCO растворяли в 0,9% NaCl (3,01 мл) и добавляли ДМСО (0,44 мл). Затем добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,95 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношеPS2-DBCO was dissolved in 0.9% NaCl (3.01 ml) and DMSO (0.44 ml) was added. A solution of azide functionalized eCRM (0.95 mL) was then added to provide the input mass ratio

- 59 044044 ние PS2:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 100 мкл). Конъюгат CRM переносили в две предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (5 замен, каждая по 1000 мл). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 2-CRM.- 59 044044 PS2:CRM ratio equal to 1.5:1 (w/w). The solution was mixed very carefully by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 100 μl). The CRM conjugate was transferred into two prewashed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (5 changes, each 1000 ml). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 2-CRM conjugate solution.

PS 2DBCO (мг) PS 2DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) BCA (CRM) (мг/мл) B.C.A. (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 4,4 4.4 2,93 2.93 4,77 4.77 0,683 0.683 91 91 0,387 0.387 75 75 1,76:1 1.76:1 нпко npko 1,37 1.37

Пример 10. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 3 с eCRM из табл. 2.Example 10. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 3 with eCRM from table. 2.

1. Гидролиз.1. Hydrolysis.

Степень чистоты PS типа 3: 86% (антрон).PS type 3 purity: 86% (anthrone).

Мол. масса: 360,3 г-моль-¹.Mol. mass: 360.3 g-mol- ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид 3 (30,0 мг) растворяли в 15,0 мл водного раствора (13,5 мл воды и 1,5 мл уксусной кислоты, 2 М). Смесь нагревали при 85°С в течение 1 ч, по истечении этого времени после охлаждения до температуры окружающей среды добавляли раствор хлорида магния (1,5 мл, 1 М). Гидролизованный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-3, который затем лиофилизировали в двух равных аликвотах.Native polysaccharide 3 (30.0 mg) was dissolved in 15.0 ml of an aqueous solution (13.5 ml of water and 1.5 ml of acetic acid, 2 M). The mixture was heated at 85°C for 1 hour, after which time, after cooling to ambient temperature, a solution of magnesium chloride (1.5 ml, 1 M) was added. Hydrolyzed PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using at least 6 water changes to produce a solution of purified PS-3, which was then lyophilized in two equal aliquots.

PS 3 (мг) PS 3 (mg) Вода (мл) Water (ml) АсОН, 2 М (мл) AcOH, 2 M (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Выход PS (%) PS Output (%) MALS (кДа) MALS (kDa) 30,0 30.0 13,5 13.5 1,50 1.50 10477,22 10477.22 85 85 294 294

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Гидролизованный PS3 (12,75 мг, 35,4 мкмоль) растворяли в воде (6,4 мл), доводили до рН 7,0 с помощью раствора гидроксида натрия (0,2 М, 100 мкл). Затем по каплям добавляли реагент для цианилирования, CDAP (0,426 М в ацетонитриле, 0,2 экв., 16,7 мкл). Через 90 с раствор быстро доводили до рН 9,5 с помощью раствора гидроксида натрия (0,2 М, 300 мкл). DBCO-PEG4-NH2 (0,032 М в ДМСО, 0,1 экв., 523 г-моль-¹, 0,110 мл) добавляли немедленно по каплям. Добавляли дополнительное количество ДМСО с получением 5% (об./об.) ДМСО (0,320 мл). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение ночи в термостатируемой водяной бане с последующей фильтрацией через шприцевой PES-фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). DBCO-производное очищали с помощью блоков для центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя в общей сложности 7 замен 3% ДМСО, 20% этанола в воде, 0,9% хлорида натрия, затем 3 замены воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 3. Водный раствор затем фильтровали через шприцевой ПВДФ-фильтр с размером пор 0,45 мкм. К этому раствору (3,84 мл, 8,52 мг) добавляли 10-кратный массовый избыток сахарозы (85 мг в 0,85 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три части, которые лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Два образца содержали 5,0 мг 3-DBCO и 50 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации, при этом в оставшемся образце содержалось 8,5 мг, всего три.Hydrolyzed PS3 (12.75 mg, 35.4 μmol) was dissolved in water (6.4 ml), adjusted to pH 7.0 with sodium hydroxide solution (0.2 M, 100 μl). The cyanylation reagent, CDAP (0.426 M in acetonitrile, 0.2 eq, 16.7 μl), was then added dropwise. After 90 s, the solution was quickly adjusted to pH 9.5 with sodium hydroxide solution (0.2 M, 300 μL). DBCO-PEG4-NH2 (0.032 M in DMSO, 0.1 eq, 523 g-mol- ¹ , 0.110 ml) was added dropwise immediately. Additional DMSO was added to obtain 5% (v/v) DMSO (0.320 mL). The reaction mixture was stirred at 25°C overnight in a thermostatic water bath, followed by filtration through a 0.22 μm PES syringe filter. The filtrate was extracted with ethyl acetate (3x20 ml). The DBCO derivative was purified using centrifugal dialysis units (Amicon, HOMM 30 kDa) using a total of 7 changes of 3% DMSO, 20% ethanol in water, 0.9% sodium chloride, then 3 changes of water (each 12 ml ), to obtain DBCO derivative type 3. The aqueous solution was then filtered through a PVDF syringe filter with a pore size of 0.45 μm. To this solution (3.84 ml, 8.52 mg) was added a 10-fold mass excess of sucrose (85 mg in 0.85 ml water). The combined solution was divided into three parts, which were lyophilized to obtain three samples of white powder. Two samples contained 5.0 mg of 3-DBCO and 50 mg of sucrose for use in the next conjugation reaction, with the remaining sample containing 8.5 mg for a total of three.

Г идролизованный PS 3(мг) Hydrolyzed PS 3(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 12,8 12.8 4,04 4.04 2063,47 2063.47 1,095x3 1.095x3 102,64 102.64 5,0 5.0 70 70 409 409

3. Конъюгация производного PS 3-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 3-DBCO with eCRM.

PS 3-DBCO: 5,0 мг (с 50 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 3-DBCO: 5.0 mg (with 50 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 5,0%.%DBCO: 5.0%.

Концентрация CRM: 4,0 мг/мл раствор.CRM concentration: 4.0 mg/ml solution.

PS:CRM (входное соотношение): 1:1.PS:CRM (input ratio): 1:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

3-DBCO растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (6,39 мл, профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм), фосфатном буфере (рН 7,0, 0,5 М, 0,333 мл) и ДМСО (0,833 мл). Раствор функционализированного азидом eCRM (0,770 мл) добавляли по каплям, чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS3:CRM равное 1:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед3-DBCO was dissolved in 0.9% sodium chloride (6.39 ml, filtered through a 0.22 μm filter), phosphate buffer (pH 7.0, 0.5 M, 0.333 ml) and DMSO (0.833 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.770 mL) was added dropwise to provide an input mass ratio of PS3:CRM of 1:1 (w/w). The solution was mixed very carefully by hand before

- 60 044044 осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Конъюгат CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (4 замены, каждая по 1 л). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 3-CRM.- 60 044044 by gentle stirring on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The CRM conjugate was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (4 changes, each 1 L). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 3-CRM conjugate solution.

PS 3DBCO (мг) PS 3DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM С Л⁷*Ratio PS:CRM S L ⁷ * Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,0 5.0 5,0 5.0 3,63 3.63 0,402 0.402 70 70 0,423 0.423 74 74 0,95:1 0.95:1 2,55 2.55 3,2 3.2

*CJF = диализированный и профильтрованный конъюгат.*CJF = dialyzed and filtered conjugate.

Пример 11. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 3 с eCRM из табл. 2.Example 11. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 3 with eCRM from table. 2.

1. Окисление..1. Oxidation..

Мол. масса: 360,3 г-моль-¹.Mol. mass: 360.3 g-mol- ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид 3 (14,4 мг, скорректировано до 86%, 12,4 мг, 34,4 мкмоль) растворяли в 7,2 мл водного раствора (5,9 мл воды и 1,3 мл ацетатного буфера, 200 мМ, рН 5,5). К этому раствору добавляли 300 мкл раствора периодата натрия (1,10 мг, 5,16 мкмоль, 0,15 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч. Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS3-OX.Native polysaccharide 3 (14.4 mg, adjusted to 86%, 12.4 mg, 34.4 µmol) was dissolved in 7.2 ml aqueous solution (5.9 ml water and 1.3 ml acetate buffer, 200 mM, pH 5.5). To this solution was added 300 μl of sodium periodate solution (1.10 mg, 5.16 μmol, 0.15 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours. The oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using at least 6 water changes to obtain a purified PS3-OX solution.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 3 (мг) PS 3 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research antrona (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity research aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,15 0.15 14,4 14.4 1,84 1.84 15940,33 15940.33 3,9 3.9 0,8 0.8 73 73

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS3-OX (9,05 мг, 25,1 мкмоль) растворяли в фосфатном буфере (2,11 мл, 50 мМ, рН 6,7), к которому был добавлен DBCO-PEG4-NH2 (1,0 экв, 523 г-моль-¹ в ДМСО 0,40 мл). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 25 мин перед добавлением раствора цианоборогидрида натрия (2 экв., 44,5 мг/мл, 35 мкл) и перемешивали в течение двух дней. По истечении этого времени реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). DBCO-производное очищали с помощью блоков для центробежного диализа (Amicon, HOMM 30 кДа), используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 3. К этому раствору (3,20 мл, 8,60 мг) добавляли 10-кратный массовый избыток сахарозы (86 мг в 0,86 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на четыре части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Три образца содержали 2,0 мг 3-DBCO и 20 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации, при этом в оставшемся образце содержалось 2,6 мг, всего четыре.PS3-OX (9.05 mg, 25.1 μmol) was dissolved in phosphate buffer (2.11 ml, 50 mM, pH 6.7), to which DBCO-PEG4-NH2 (1.0 equiv, 523 g) was added -mol- ¹ in DMSO 0.40 ml). The reaction mixture was stirred at 25°C for 25 min before adding sodium cyanoborohydride solution (2 equiv., 44.5 mg/ml, 35 μl) and stirring for two days. After this time, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml). The DBCO derivative was purified using centrifugal dialysis units (Amicon, HOMM 30 kDa) using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), yielding DBCO derivative type 3. To this solution ( 3.20 ml, 8.60 mg) a 10-fold mass excess of sucrose (86 mg in 0.86 ml water) was added. The combined solution was divided into four parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Three samples contained 2.0 mg of 3-DBCO and 20 mg of sucrose for use in the next conjugation reaction, with the remaining sample containing 2.6 mg, for a total of four.

Окисленный PS 3(мг) Oxidized PS 3(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 15,8 15.8 2,76 2.76 2681,28 2681.28 0,683x3 0.683x3 64,47 64.47 2,3 2.3 95 95 304 304

PS 3-DBCO: 2,0 мг (с 20 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 3-DBCO: 2.0 mg (with 20 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 2,3%.%DBCO: 2.3%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

3-DBCO растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (0,400 мл, профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм) и ДМСО (0,100 мл). Раствор функционализированного азидом eCRM (0,330 мл) добавляли по каплям, чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS3:CRM равное 1:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 48 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Конъюгат CRM переносили в две предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диали- 61 044044 зу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (4 замены, каждая по 1 л). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 3-CRM.3-DBCO was dissolved in 0.9% sodium chloride (0.400 ml, filtered through a 0.22 μm filter) and DMSO (0.100 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.330 mL) was added dropwise to provide an input mass ratio of PS3:CRM of 1:1 (w/w). The solution was mixed very carefully by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 48 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The CRM conjugate was transferred into two pre-washed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (4 changes, each 1 l). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 3-CRM conjugate solution.

PS 3DBCO (мг) PS 3DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJF Ratio PS:CRM C.J.F. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 2,0 2.0 2,0 2.0 3,63 3.63 0,226 0.226 41 41 0,307 0.307 59 59 0,74:1 0.74:1 21,0 21.0 3,42 3.42

Пример 12. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 4 с eCRM из табл. 2.Example 12. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 4 with eCRM from table. 2.

1. Окисление..1. Oxidation..

Степень чистоты PS типа 4: 80% (антрон).PS type 4 purity: 80% (anthrone).

Мол. масса: 825,78.Mol. weight: 825.78.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 4 (27,5 мг, 33,30 мкмоль) растворяли в 13,75 мл водного раствора (12,38 мл воды и 1,37 мл 0,1 М HCl). Затем раствор нагревали при 45°С в течение 30 мин и затем охлаждали, после этого добавляли раствор NaOH (0,1 М, 1,37 мл) для доведения рН до 6,70. Реакционную смесь подвергали диализу с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 3 замены воды категории ВЭЖХ (каждая по 12 мл). Супернатант переносили в 50 мл пробирку Falcon с 9,84 мл воды. К этому раствору добавляли 3,43 мл 200 мМ ацетатного буфера (рН 5,35) и 632 мкл раствора NaIO₄ (3,56 мг, 16,65 мкмоль, 0,5 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 17 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-4.PS type 4 powder (27.5 mg, 33.30 μmol) was dissolved in 13.75 mL of aqueous solution (12.38 mL of water and 1.37 mL of 0.1 M HCl). The solution was then heated at 45°C for 30 min and then cooled, after which NaOH solution (0.1 M, 1.37 ml) was added to adjust the pH to 6.70. The reaction mixture was dialyzed using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) using 3 changes of HPLC grade water (12 ml each). The supernatant was transferred into a 50 ml Falcon tube with 9.84 ml of water. To this solution were added 3.43 ml of 200 mM acetate buffer (pH 5.35) and 632 μl of NaIO ₄ solution (3.56 mg, 16.65 μmol, 0.5 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 17 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS- 4.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 4 (мг) PS 4 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Antron (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,5 0.5 27,5 27.5 2,71 2.71 12078 12078 10,8 10.8 2,58 2.58 101 101

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 4 (24,58 мг, 29,77 мкмоль, 2,4 мл воды) добавляли буферный раствор (1,8 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,79), ДМСО (0,6 мл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (15 мг в 200 мкл ДМСО; 28,65 мкмоль, 9,6 эквивалента), все при 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 224 мкл раствора цианоборогидрида натрия (5,0 мг в 300 мкл воды; 59,54 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 225 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата) и затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), после этого подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением раствора DBCO-производного типа 4. К этому раствору (4,75 мл, 15,25 мг) добавляли раствор сахарозы (153 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Два образца содержали 5,35 мг 4 DBCO и 54 мг сахарозы, и один образец содержал 4,55 мг 4 DBCO и 45 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 4 (24.58 mg, 29.77 µmol, 2.4 ml water) was added a buffer solution (1.8 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.79), DMSO (0.6 mL) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (15 mg in 200 μL DMSO; 28.65 μmol, 9.6 equivalents), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 224 µl of sodium cyanoborohydride solution (5.0 mg in 300 µl water; 59.54 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 225 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 equiv.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate) and then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml), then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain a solution of DBCO derivative type 4. To this solution (4.75 ml, 15.25 mg) was added a solution of sucrose (153 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into three parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Two samples contained 5.35 mg 4 DBCO and 54 mg sucrose, and one sample contained 4.55 mg 4 DBCO and 45 mg sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный PS 4 (мг) Oxidized PS 4 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Antron (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) DBCO (%) DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 24,58 24.58 5,25 5.25 3897 3897 0,472x3 0.472x3 137,16 137.16 3,52 3.52 69 69 343 343

3. Конъюгация производного PS 4-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 4-DBCO with eCRM.

PS 4-DBCO: 5,35 мг (с 54 мг сахарозы) белого порошка.PS 4-DBCO: 5.35 mg (with 54 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 3,52%.%DBCO: 3.52%.

Концентрация CRM: 4 мг/мл раствор.CRM concentration: 4 mg/ml solution.

PS:CRM (входное соотношение): 1,20:1.PS:CRM (input ratio): 1.20:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Образец тип 4-DBCO (5,35 мг белого порошка с 54 мг сахарозы) растворяли в 0,67 мл 0,9% раствора NaCl и затем добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,74 мл). Через 10 мин добавляли еще одну порцию функционализированного азидом eCRM (0,37 мл), чтобы обеспечить входной массовое соотношение PS4:CRM равное 1,20:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивалиSample type 4-DBCO (5.35 mg white powder with 54 mg sucrose) was dissolved in 0.67 ml of 0.9% NaCl solution and then azide functionalized eCRM solution (0.74 ml) was added. After 10 min, another portion of azide-functionalized eCRM (0.37 mL) was added to provide an input PS4:CRM mass ratio of 1.20:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently

- 62 044044 вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 2 дней. Смесь конъюгированного PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (5 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) для получения раствора конъюгата PS типа 4-CRM.- 62 044044 by hand before mixing gently on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 2 days. The conjugated PS-CRM mixture was transferred into a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (5 changes each 800 ml each). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 4-CRM type PS conjugate solution.

PS 4DBCO (мг) PS 4DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,35 5.35 4,46 4.46 5,31 5.31 0,595 0.595 65 65 0,360 0.360 45 45 1,65:1 1.65:1 23,63 23.63 4,55 4.55

Пример 13. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 5 с eCRM из табл. 2.Example 13. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 5 with eCRM from table. 2.

1. Окисление..1. Oxidation..

Степень чистоты PS типа 5: 89% (уроновая кислота).PS type 5 purity: 89% (uronic acid).

Мол. масса: 919,32.Mol. weight: 919.32.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 5 (22,8 мг, 24,36 мкмоль) растворяли в 8,26 мл воды и 3,14 мл 200 мМ ацетатного буфера (рН 5,26) и 163 мкл раствора NaIO₄ (1,3 мг, 6,1 мкмоль, 0,25 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 100 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-5.PS type 5 powder (22.8 mg, 24.36 μmol) was dissolved in 8.26 ml of water and 3.14 ml of 200 mM acetate buffer (pH 5.26) and 163 μl of NaIO ₄ solution (1.3 mg, 6 .1 µmol, 0.25 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 100 kDa, 6-12 ml), using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water, to obtain a solution of oxidized PS- 5.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 5 (мг) PS 5 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Уроновая кислота (мкМ) Uronic acid (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,25 0.25 22,8 22.8 2,44 2.44 6735,97 6735.97 84,87 84.87 5,71 5.71 68 68

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 5 (6,25 мг, 6,68 мкмоль, 0,992 мл воды) добавляли буферный раствор (0,063 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,74), ДМСО (25 мкл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (3,5 мг в 100 мкл ДМСО; 6,68 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25 °С. Реакционную смесь затем перемешивали при 37°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 84 мкл раствора цианоборогидрида натрия (0,84 мг в 84 мкл воды; 13,36 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 24 ч при 37°С. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (6x10 мл). Экстракт переносили на ультрацентрифужный фильтр AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и затем подвергали диализу, используя 8 замен 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 5. К этому раствору (5,35 мл, 6,0 мг) добавляли раствор сахарозы (60 мг в 0,6 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Каждый образец содержал 3,0 мг 5-DBCO и 30 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 5 (6.25 mg, 6.68 µmol, 0.992 ml water) was added a buffer solution (0.063 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.74), DMSO (25 µl) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (3.5 mg in 100 μL DMSO; 6.68 μmol, 10 eq.), all at 25 °C. The reaction mixture was then stirred at 37°C for 30 minutes, after which time 84 μl of sodium cyanoborohydride solution (0.84 mg in 84 μl water; 13.36 μmol, 20 eq.) was added and stirred for 24 hours at 37 °C. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate (6x10 ml). The extract was transferred to an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 8 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml) followed by 3 changes of water (each 12 ml) to obtain DBCO -derivative type 5. To this solution (5.35 ml, 6.0 mg) was added a solution of sucrose (60 mg in 0.6 ml water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain two samples of white powder. Each sample contained 3.0 mg 5-DBCO and 30 mg sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный PS 5 (мг) Oxidized PS 5 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Уроновая кислота (мкМ) Uronic acid (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 6,25 6.25 5,38 5.38 1219,4 1219.4 0,688x3 0.688x3 63,044 63,044 5Д7 5D7 98 98 300 300

3. Конъюгация производного PS 5-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 5-DBCO with eCRM.

PS 5-DBCO: 3,0 мг (с 30 мг сахарозы) белого порошка.PS 5-DBCO: 3.0 mg (with 30 mg sucrose) white powder.

%DBCO: 5,17%.%DBCO: 5.17%.

Концентрация CRM: 3,25 мг/мл раствор.CRM concentration: 3.25 mg/ml solution.

PS:CRM (входное соотношение): 1:1.PS:CRM (input ratio): 1:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное типа 5 (3,0 мг белого порошка с 30 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (4,48 мл) и ДМСО (0,6 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,92 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS5:CRM равное 1:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 5 ч. Добавляли раствор азида натрия (20 мкл, 10 мг/мл в воде). Через 30 мин смесь конъюгированного PS-CRM переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, ката- 63 044044 ложный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (5 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 5 PS-CRM.DBCO derivative type 5 (3.0 mg white powder with 30 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (4.48 ml) and DMSO (0.6 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.92 mL) was added to provide an input mass ratio of PS5:CRM of 1:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 5 hours. Sodium azide solution (20 μL, 10 mg/mL in water) was added. After 30 min, the conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, cat. no. G235060, NOMM 300000) and then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (5 replacements, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a solution of PS-CRM conjugate 5.

PS 5DBCO (мг) PS 5DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Уроновая кислота (мг/мл) Uronic acid (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SEC- MALS (МДа) SEC- MALS (Yeah) 3,0 3.0 3,0 3.0 5,466 5,466 0,231 0.231 46 46 0,239 0.239 48 48 0,97 0.97 нпко npko 2,74 2.74

Пример 14. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 6A с eCRM из табл. 2.Example 14. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 6A with eCRM from table. 2.

1. Окисление..1. Oxidation..

Мол. масса PS типа 6А: 706.Mol. weight of PS type 6A: 706.

Раствор NaIO₄ в воде (10 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (10 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-6A (15 мг, 21,2 мкмоль) растворяли в 7,5 мл водного раствора (10 мМ раствора ацетата натрия, рН 4,5). К этому раствору добавляли 36,3 мкл раствора NaIO₄ (0,363 мг, 1,69 мкмоль, 0,08 экв.). Смесь перемешивали при 4°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235057, НОММ 20000) и затем подвергали диализу с применением 50 мМ РВ-буфера с рН 6,8 в течение 24 ч (4 замены, каждая по 600 мл) с получением раствора окисленного PS-6A. После диализа добавляли ДМСО с получением PS-6A в 10% ДМСО с 50 мМ РВ-буфера, рН 6,8.____________________PS-6A powder (15 mg, 21.2 μmol) was dissolved in 7.5 ml of aqueous solution (10 mM sodium acetate solution, pH 4.5). To this solution was added 36.3 μl of NaIO ₄ solution (0.363 mg, 1.69 μmol, 0.08 eq.). The mixture was stirred at 4°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235057, HOMM 20000) and then dialyzed using 50 mM PB- buffer with pH 6.8 for 24 hours (4 changes, each 600 ml) to obtain a solution of oxidized PS-6A. After dialysis, DMSO was added to obtain PS-6A in 10% DMSO with 50 mM RT buffer, pH 6.8.____________________

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 6А (мг) PS 6A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Выход PS (%) PS Output (%) 0,08 0.08 15 15 4 4 4780 4780 9,0 9.0 90 90

Конечная концентрация PS: 3,37 мг/мл.Final PS concentration: 3.37 mg/ml.

Конечная концентрация буфера: 10% ДМСО в 50 мМ РВ (рН 6,8).Final buffer concentration: 10% DMSO in 50 mM PB (pH 6.8).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 6А (13,5 мг, 19,1 мкмоль, 4 мл в 10% ДМСО, 50 мМ РВ, рН 6,8) добавляли раствор DBCO-PEG4-NH2 (10,01 мг в 100,1 мкл ДМСО; 19,1 мкмоль, 10 экв.) при 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 60 мин, по истечении этого времени добавляли раствор цианоборогидрида натрия (1,2 мг в 120 мкл воды; 19,1 мкмоль, 10 экв.) и продолжали перемешивать в течение 24 ч при 25°С. Затем реакционную смесь переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A- Lyzer G2, каталожный номер G235057, НОММ 20000) и затем подвергали диализу, используя 4 замены 20% этанола в 50 мМ РВ-буфере и затем 3 замены 50 мМ РВбуфера, с получением DBCO-производного типа 6А.To a solution of oxidized PS type 6A (13.5 mg, 19.1 µmol, 4 ml in 10% DMSO, 50 mM PB, pH 6.8) was added a solution of DBCO-PEG4-NH2 (10.01 mg in 100.1 µl DMSO; 19.1 µmol, 10 eq.) at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 60 minutes, after which time a solution of sodium cyanoborohydride (1.2 mg in 120 μl water; 19.1 μmol, 10 eq.) was added and continued stirring for 24 hours at 25° WITH. The reaction mixture was then transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235057, HOMM 20000) and then dialyzed using 4 changes of 20% ethanol in 50 mM RT buffer and then 3 changes of 50 mM RT buffer , producing DBCO-derived type 6A.

Окисленный PS 6А (мг) Oxidized PS 6A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- Exit PS- SEC- MALS SEC- MALS DBCO (%) DBCO (%) (кДа) (kDa) 13,5 13.5 8 8 1685 1685 148 148 8,78 8.78 70 70 193 193

3. Конъюгация производного PS 6A-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 6A-DBCO with eCRM.

PS 6A-DBCO: 7,1 мг (с 71 мг сахарозы) белого порошка.PS 6A-DBCO: 7.1 mg (with 71 mg sucrose) white powder.

DBCO: 9%.DBCO: 9%.

Концентрация CRM: 2,617 мг/мл раствор.CRM concentration: 2.617 mg/ml solution.

PS: CRM (входное соотношение): 2:1.PS: CRM (input ratio): 2:1.

Конечная концентрация PS: 5,2 мг/мл.Final PS concentration: 5.2 mg/ml.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (1,4 мл) добавляли к DBCO-производному типа 6А (7,1 мг белого порошка с 71 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS 6A:CRM равное 2:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (23°С) в течение 17 ч. Затем смесь помещали в инкубатор (37°С) на 3 ч. По окончании реакции смесь двукратно разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия и восстанавливали борогидридом натрия (1,9 мг в 191 мкл воды; 50,2 мкмоль, 50 экв.) в течение 3 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235072, НОММ 300000) и затем подвергали диализу против ФСБ, рН 7 в течение 24 ч (3 замены, каждая по 1000 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 6А PS-CRM.A solution of azide-functionalized eCRM (1.4 mL) was added to DBCO derivative type 6A (7.1 mg white powder with 71 mg sucrose) to provide a PS 6A:CRM mass ratio of 2:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (23°C) for 17 hours. The mixture was then placed in an incubator (37°C) for 3 hours. Once the reaction was complete, the mixture was diluted twice with 0.9% chloride solution sodium borohydride and reduced with sodium borohydride (1.9 mg in 191 μL water; 50.2 μmol, 50 eq.) for 3 h. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235072, NOMM 300000) and then dialyzed against PBS, pH 7 for 24 hours (3 replacements, each 1000 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain PS-CRM conjugate solution 6A.

- 64 044044- 64 044044

PS 6АDBCO (мг) PS 6ADBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 7,1 7.1 3,6 3.6 10 10 0,424 0.424 60 60 0,170 0.170 47 47 2,5:1 2.5:1 16,1 16.1 1,15 1.15

Пример 15. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 6B с eCRM из табл. 2.Example 15. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 6B with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 6В: 80% (антрон).PS type 6B purity: 80% (anthrone).

Мол. масса: 706,18.Mol. weight: 706.18.

Раствор NaIO₄ в воде (5,45 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (5.45 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-6B (27,28 мг, скорректировано до 80%, 21,82 мг, 30,9 мкмоль) растворяли в 14 мл водного раствора (9,5 мл воды и 4,5 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 145 мкл раствора NaIO₄ (0,79 мг, 3,71 мкмоль, 0,12 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью устройства для ультрацентрифугирования AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-6B.PS-6B powder (27.28 mg, adjusted to 80%, 21.82 mg, 30.9 µmol) was dissolved in 14 ml of aqueous solution (9.5 ml of water and 4.5 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5). To this solution was added 145 μl of NaIO ₄ solution (0.79 mg, 3.71 μmol, 0.12 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifugation device (HOMM 30 kDa, 6-12 ml), using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water, to obtain a solution of oxidized PS-6B.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 6В (мг) PS 6B (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity research aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,12 0.12 27,28 27.28 3,54 3.54 7783 7783 8Д 8D 7,33 7.33 89 89

Конечная концентрация PS: 3,5 мг/мл.Final PS concentration: 3.5 mg/ml.

Конечная концентрация буфера: 53 мкМ (рН 6,0).Final buffer concentration: 53 µM (pH 6.0).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 6В (18,4 мг, 27,6 мкмоль, 3,35 мл воды) добавляли буферный раствор (1,4 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,01), ДМСО (700 мкл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (14,43 мг в 295 мкл ДМСО; 27,6 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 75 мкл раствора цианоборогидрида натрия (9,39 мг в 200 мкл воды; 55,6 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 104 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата), затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и после этого подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением раствора DBCO-производного типа 6В. К этому раствору (2,96 мл, 20,1 мг) добавляли раствор сахарозы (200 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 6,7 мг 6В DBCO и 67 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 6B (18.4 mg, 27.6 µmol, 3.35 ml water) was added a buffer solution (1.4 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.01), DMSO (700 µl) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (14.43 mg in 295 µl DMSO; 27.6 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 75 µl of sodium cyanoborohydride solution (9.39 mg in 200 µl water; 55.6 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 104 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 eq.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate), then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain a solution of DBCO derivative type 6B. To this solution (2.96 ml, 20.1 mg) was added a solution of sucrose (200 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into three equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 6.7 mg of 6B DBCO and 67 mg of sucrose for use in the following conjugation reaction.

Окисленный PS 6В (мг) Oxidized PS 6B (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 18,4 18.4 3,11 3.11 9620 9620 0,796x4 0.796x4 311,17 311.17 3,2 3.2 115 115 403 403

3. Конъюгация производного PS 6B-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 6B-DBCO with eCRM.

PS 6B-DBCO: 6,7 мг (с 67 мг сахарозы) белого порошка.PS 6B-DBCO: 6.7 mg (with 67 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 3,2%.%DBCO: 3.2%.

PS:CRM (входное соотношение): 2:1.PS:CRM (input ratio): 2:1.

Конечная концентрация PS: 5,23 мг/мл.Final PS concentration: 5.23 mg/ml.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (1,28 мл) добавляли к DBCO-производному типа 6В (6,70 мг белого порошка с 67 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS6B:CRM равное 2:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч. Затем смесь помещали в печь (37°С) на 2 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235071, НОММ 100000) иA solution of azide-functionalized eCRM (1.28 mL) was added to DBCO derivative type 6B (6.70 mg white powder with 67 mg sucrose) to provide a PS6B:CRM mass ratio of 2:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 hours. The mixture was then placed in an oven (37°C) for 2 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235071, NOMM 100000) and

- 65 044044 затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 6В PS-CRM.- 65 044044 was then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain PS-CRM conjugate solution 6B.

PS 6ВDBCO (мг) PS 6ВDBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 6,70 6.70 3,35 3.35 6,18 6.18 0,68 0.68 67 67 0,347 0.347 67 67 1,96:1 1.96:1 8,72 8.72 1,30 1.30

Пример 16. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 7F с eCRM из табл. 2.Example 16. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 7F with eCRM from table. 2.

1. Активация CDAP и поперечная сшивка DBCO.1. Activation of CDAP and cross-linking of DBCO.

Степень чистоты PS 7F: не определено (%) (антрон) - предполагается 100%.PS 7F purity: undetermined (%) (anthrone) - assumed 100%.

Мол. масса: 1227 г-моль^-1 (повторяющееся звено).Mol. mass: 1227 g-mol ^-1 (repeating unit).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS7F (6,2 мг, 5,1 мкмоль) растворяли в воде (3,1 мл), к которой был добавлен CDAP (2,0 экв., 100 мг/мл в ацетонитриле, 24 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ) в течение 30 с. В это время добавляли триэтиламин (ТЭА, 2,5 экв., 0,2 М, 63 мкл), и реакционную смесь перемешивали в течение 120 с. Добавляли DBCO-PEG₄-NH₂ (1,0 экв., 28,7 мкмоль/мл в ДМСО, 180 мкл) вместе с боратным буфером (0,1 М, рН 8,5, 1,0 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. DBCO-дериватизированный PS7F очищали с помощью осаждения этанолом и центробежного диализа (Amicon, HOMM 100 кДа) с использованием 3 замен воды. После анализа методом УФабсорбционной спектроскопии, количественного исследования антрона и SEC этот раствор (3,61 мл, 3,05 мг) разбавляли раствором сахарозы (10-кратное массовое содержание, 100 мг/мл) и лиофилизировали с получением белого порошка.PS7F (6.2 mg, 5.1 μmol) was dissolved in water (3.1 ml) to which CDAP (2.0 eq., 100 mg/ml in acetonitrile, 24 μl) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature (RT) for 30 s. At this time, triethylamine (TEA, 2.5 eq., 0.2 M, 63 μl) was added and the reaction mixture was stirred for 120 s. Add DBCO-PEG ₄ -NH ₂ (1.0 eq, 28.7 µmol/ml in DMSO, 180 µl) along with borate buffer (0.1 M, pH 8.5, 1.0 ml) and stir at room temperature overnight. DBCO-derivatized PS7F was purified by ethanol precipitation and centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 100 kDa) using 3 water changes. After analysis by UV absorption spectroscopy, anthrone quantitation and SEC, this solution (3.61 ml, 3.05 mg) was diluted with sucrose solution (10 times the mass content, 100 mg/ml) and lyophilized to obtain a white powder.

PS 7F (мг) PS 7F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization DBCO, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC-MALS (кДа) SEC-MALS (kDa) 6,2 6.2 3,61 3.61 686,3 686.3 0,619 0.619 55,52 55.52 8,1 8.1 49 49 Не определяли Not determined

2. Конъюгация производного PS 7F-DBCO с eCRM.2. Conjugation of PS derivative 7F-DBCO with eCRM.

PS 7F-DBCO: 2,62 мг (с 26,2 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 7F-DBCO: 2.62 mg (with 26.2 mg sucrose) lyophilized powder.

%DBCO:8,1%.%DBCO:8.1%.

CRM: 5,0 мг/мл в ФСБ.CRM: 5.0 mg/ml in PBS.

PS:CRM (входное массовое соотношение): 1,73:1.PS:CRM (input mass ratio): 1.73:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Лиофилизированный 7F-DBCO растворяли в рассоле (0,9% (мас./об.), 0,938 мл), фосфатном буфере (0,5 М, рН 7,0, 58 мкл) и ДМСО (144 мкл), к которому был добавлен раствор CRM (0,300 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS7F:CRM равное 1,73:1,00 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч. Конъюгат CRM переносили в две предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор стерилизовали путем фильтрации через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 7F-CRM.Lyophilized 7F-DBCO was dissolved in brine (0.9% (w/v), 0.938 ml), phosphate buffer (0.5 M, pH 7.0, 58 μl) and DMSO (144 μl), to which was CRM solution (0.300 mL) was added to provide an input PS7F:CRM mass ratio of 1.73:1.00 (w/w). The solution was mixed very gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 hours. The CRM conjugate was transferred into two pre-washed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 replacements, each 800 ml). The dialyzed solution was sterilized by filtration through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 7F-CRM conjugate solution.

PS 7F- DBCO (мг) PS 7F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Соотн. PS:CRM CJF Ratio PS:CRM C.J.F. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 2,62 2.62 1,5 1.5 7,17 7.17 0,450 0.450 65 65 0,224 0.224 2,0:1,0 2.0:1.0 нпко (<21,4 мкг/мл) npc (<21.4 µg/ml) 1,95 1.95

Пример 17. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 8 с еСКМ из табл. 2.Example 17. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 8 with eBMSC from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 8: 84%.PS type 8 purity: 84%.

Мол. масса: 684,54 г-моль^-1.Mol. mass: 684.54 g-mol ^-1 .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид (42 мг, 61,3 мкмоль) растворяли в 21 мл водного раствора (14,7 мл воды и 6,3 мл ацетатного буфера, 200 мМ, рН 5,5). К этому раствору добавляли раствор периодата натрия (в рас- 66 044044 чете на 2,63 мг, 0,20 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч с контролем поглощения УФИ при 222 нм для NaIO₄. Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, HOMM кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-8.Native polysaccharide (42 mg, 61.3 μmol) was dissolved in 21 ml of aqueous solution (14.7 ml of water and 6.3 ml of acetate buffer, 200 mM, pH 5.5). To this solution was added a solution of sodium periodate (calculated as 2.63 mg, 0.20 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours while monitoring the UV absorption at 222 nm for NaIO ₄ . Oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM kDa) using at least 6 water changes to obtain a purified PS-8 solution.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 8 (мг) PS 8 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research antrona (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity research aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,20 0.20 42 42 3,26 3.26 15724 15724 8,96 8.96 2,28 2.28 84 84

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS8-OX (33,8 мг, 49,4 мкмоль) в 3,14 мл воды разбавляли фосфатным буфером (789 мкл, 0,5 М, рН 6,0), 1 мл Н2О и ДМСО (313 мкл), к которому был добавлен DBCO-PEG4-NH2 (25 мг, 1 экв., в ДМСО, 250 мкл). Через 10 мин добавляли NaCNBH₃ (6,2 мг, 2 экв. путем добавления 132 мкл из 9,43 мг в 200 мкл Н₂О). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение двух дней в термостатируемой водяной бане с последующим добавлением фосфатного буфера (0,5 мл 200 мМ, рН 6). К этой смеси добавляли NaBH₄ (1 экв.). После перемешивания в течение 30 мин смесь экстрагировали этилацетатом (3x5 мл). Остаточный этилацетат удаляли барботированием газообразным азотом, и смесь переносили в центрифужные фильтры Amicon с НОММ 100 кДа. DBCO-производное очищали с помощью центробежного диализа, используя 6 замен 20% EtOH и 3 замены воды (каждая по 12 мл), с получением DBCOпроизводного типа 8. К этому раствору (5,63 мл, 25 мг) добавляли раствор сахарозы и лиофилизировали.PS8-OX (33.8 mg, 49.4 µmol) in 3.14 ml water was diluted with phosphate buffer (789 µl, 0.5 M, pH 6.0), 1 ml H2O and DMSO (313 µl), to which DBCO-PEG4-NH2 (25 mg, 1 eq., in DMSO, 250 μl) was added. After 10 min NaCNBH ₃ (6.2 mg, 2 eq. by adding 132 µl of 9.43 mg in 200 µl H ₂ O) was added. The reaction mixture was stirred at 25°C for two days in a thermostatic water bath, followed by the addition of phosphate buffer (0.5 ml of 200 mM, pH 6). NaBH ₄ (1 eq.) was added to this mixture. After stirring for 30 min, the mixture was extracted with ethyl acetate (3x5 ml). Residual ethyl acetate was removed by bubbling nitrogen gas and the mixture was transferred to Amicon 100 kDa HOMM centrifuge filters. The DBCO derivative was purified by centrifugal dialysis using 6 changes of 20% EtOH and 3 changes of water (each 12 ml) to obtain DBCO derivative type 8. To this solution (5.63 ml, 25 mg) was added sucrose solution and lyophilized.

Окисленный PS 8(мг) Oxidized PS 8(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 33,8 33.8 5,63 5.63 6492 6492 0,813x3 0.813x3 232 232 3,57 3.57 74 74 392 392

3. Конъюгация производного PS 8-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 8-DBCO with eCRM.

PS 8-DBCO: 3,77 мг (с 38 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 8-DBCO: 3.77 mg (with 38 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 3,57%.%DBCO: 3.57%.

Концентрация CRM: 5,966 мг/мл раствор.CRM concentration: 5.966 mg/ml solution.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS8-DBCO растворяли в 0,9% NaCl (2,28 мл), добавляли фосфатный буфер (0,126 мл, 0,5 М, рН 7,0) и ДМСО (0,314 мл). Затем добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,42 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS8:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 1 ч и затем помещали в печь при 37°С на ночь. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 100 мкл). Конъюгат CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 1000 мл). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 8-CRM.PS8-DBCO was dissolved in 0.9% NaCl (2.28 ml), phosphate buffer (0.126 ml, 0.5 M, pH 7.0) and DMSO (0.314 ml) were added. A solution of azide-functionalized eCRM (0.42 mL) was then added to provide an input PS8:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The solution was stirred very gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 1 hour and then placed in an oven at 37°C overnight. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/mL, 100 μL). The CRM conjugate was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 1000 ml). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain an 8-CRM conjugate solution.

PS 8DBCO (мг) PS 8DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 3,77 3.77 2,51 2.51 7,13 7.13 0,372 0.372 70 70 0,237 0.237 67 67 1,57:1 1.57:1 11,53 11.53 1,2 1.2

Пример 18. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 9N с еСВМ из табл. 2.Example 18. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 9N with eCBM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 9N: 75%.PS type 9N purity: 75%.

Мол. масса: 928,29 г-моль-¹.Mol. mass: 928.29 g-mol- ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид (19,0 мг, 20,4 мкмоль) растворяли в 9,49 мл водного раствора (7,12 мл воды и 2,37 мл ацетатного буфера, 200 мМ, рН 5,5). К этому раствору добавляли раствор периодата натрия (1,31 мг, 0,30 экв., 56 мкл из 23,65 мг в 1,0 мл водного раствора). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч с контролем поглощения УФИ при 222 нм для NaIO₄. Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, HOMM 30 кДа), используя 4 замены воды, с получением раствора очищенного PS-9.Native polysaccharide (19.0 mg, 20.4 μmol) was dissolved in 9.49 ml of aqueous solution (7.12 ml of water and 2.37 ml of acetate buffer, 200 mM, pH 5.5). To this solution was added sodium periodate solution (1.31 mg, 0.30 eq., 56 μl of 23.65 mg in 1.0 ml aqueous solution). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours while monitoring the UV absorption at 222 nm for NaIO ₄ . Oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using 4 water changes to obtain a purified PS-9 solution.

- 67 044044- 67 044044

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 9N (мг) PS 9N (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) Exit PS (%) 0,30 0.30 19,0 19.0 1,643 1.643 9229 9229 7,0 7.0 Не определяли Not determined 71 71

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS9N-OX (12,6 мг, 13,6 мкмоль) в 1,643 мл воды разбавляли фосфатным буфером (0,945 мл, 200 мМ, рН 6,0, содержащим 94,5 мг сахарозы) и ДМСО (0,33 мл), к которому был добавлен DBCOPEG4-NH2 (7,2 мг, 1 экв., в ДМСО, 0,142 мл). Через 10 мин добавляли NaCNBH₃ (1,71 мг, 2 экв. путем добавления 47 мкл из 7,36 мг в 200 мкл Н₂О). Реакционную смесь перемешивали при 25 °С в течение двух дней в термостатируемой водяной бане с последующим добавлением фосфатного буфера (0,4 мл 200 мМ, рН 6). К этой смеси добавляли NaBH₄ (0,51 мг, 1 экв.). После перемешивания в течение 30 мин смесь экстрагировали этилацетатом (5x5 мл). Остаточный этилацетат удаляли путем барботирования газообразным азотом, и смесь переносили в центрифужные фильтры Amicon с НОММ 30 кДа. DBCOпроизводное очищали с помощью центробежного диализа, используя 3 замены воды (каждая по 12 мл), затем 6 замен 20% водного этанола (каждая по 12 мл) и, наконец, 3 замены воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 9N. К этому раствору (2,388 мл, 9,05 мг) добавляли раствор сахарозы и лиофилизировали.PS9N-OX (12.6 mg, 13.6 μmol) in 1.643 ml of water was diluted with phosphate buffer (0.945 ml, 200 mM, pH 6.0, containing 94.5 mg of sucrose) and DMSO (0.33 ml), to to which DBCOPEG4-NH2 (7.2 mg, 1 eq., in DMSO, 0.142 ml) was added. After 10 min NaCNBH ₃ (1.71 mg, 2 eq. by adding 47 µl of 7.36 mg in 200 µl H ₂ O) was added. The reaction mixture was stirred at 25 °C for two days in a thermostatic water bath, followed by the addition of phosphate buffer (0.4 ml of 200 mM, pH 6). NaBH ₄ (0.51 mg, 1 eq.) was added to this mixture. After stirring for 30 min, the mixture was extracted with ethyl acetate (5x5 ml). Residual ethyl acetate was removed by sparging with nitrogen gas, and the mixture was transferred to Amicon HOMM 30 kDa centrifugal filters. The DBCO derivative was purified by centrifugal dialysis using 3 changes of water (each 12 ml), then 6 changes of 20% aqueous ethanol (each 12 ml) and finally 3 changes of water (each 12 ml), to obtain the DBCO derivative type 9N. To this solution (2.388 ml, 9.05 mg) was added sucrose solution and lyophilized.

Окисленный PS 9Ν(μγ) Oxidized PS 9Ν(μγ) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 12,6 12.6 2,388 2,388 1485 1485 0,782 0.782 72,8 72.8 4,9 4.9 78 78 474 474

3. Конъюгация производного PS 9N-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 9N-DBCO with eCRM.

PS 9N-DBCO: 4,5 мг (с 45 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 9N-DBCO: 4.5 mg (with 45 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 4,9%.%DBCO: 4.9%.

Концентрация CRM: 3,0 мг/мл раствор PS: CRM (входное соотношение): 1,5:1 Порядок проведения реакций.CRM concentration: 3.0 mg/ml PS solution: CRM (input ratio): 1.5:1 Reaction order.

PS9N-DBCO растворяли в 0,9% NaCl (1,30 мл) вместе с фосфатным буфером с рН 7 (96 мкл 0,5 М) и добавляли ДМСО (0,24 мл). Затем добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,60 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 100 мкл). Конъюгат CRM переносили в две предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия, к которому было добавлено 3 мл буфера с рН 7, в течение 24 ч (7 замен, каждая по 1000 мл). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 9N-CRM.PS9N-DBCO was dissolved in 0.9% NaCl (1.30 mL) along with phosphate buffer pH 7 (96 μL 0.5 M) and DMSO (0.24 mL) was added. A solution of azide-functionalized eCRM (0.60 mL) was then added to provide an input PS:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The solution was mixed very carefully by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 100 μl). The CRM conjugate was transferred into two pre-washed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution to which 3 ml of pH 7 buffer was added for 24 h (7 replacements, each 1000 ml). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 9N-CRM conjugate solution.

PS 9NDBCO (мг) PS 9NDBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 4,5 4.5 3,0 3.0 5,28 5.28 0,77 0.77 90 90 0,407 0.407 72 72 1,89:1 1.89:1 10,9 10.9 1Д7 1D7

Пример 19. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 9V с eCRM из табл. 2.Example 19. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 9V with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 9V: 85% (антрон).PS type 9V purity: 85% (anthrone).

Мол. масса: 704 кДа (повторяющееся звено = 971,8 г/моль).Mol. mass: 704 kDa (repeat unit = 971.8 g/mol).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 9V (35,90 мг, 37,80 мкмоль) растворяли в 17,95 мл водного раствора (12,565 мл воды и 5,385 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом 50 мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 852 мкл раствора NaIO₄ (2,83 мг, 13,23 мкмоль, 0,35 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в водяную баню при 24°С. Смесь перемешивали при 24°С. Через 18 ч реакционную смесь подвергали диализу с применением трех центрифужных фильтрующих устройств AMICON® Ultra-15 (НОММ 30 кДа; 15 мл), используя 4 замены воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-9V.PS type 9V powder (35.90 mg, 37.80 μmol) was dissolved in 17.95 mL of aqueous solution (12.565 mL of water and 5.385 mL of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a 50 mL polystyrene sample tube with a stirrer. After dissolving the PS, 852 μl of NaIO ₄ solution (2.83 mg, 13.23 μmol, 0.35 mol.eq.) was added. The reaction tube was wrapped in foil and placed in a water bath at 24°C. The mixture was stirred at 24°C. After 18 h, the reaction mixture was dialyzed using three AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 30 kDa; 15 mL) using 4 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain an oxidized PS-9V solution.

- 68 044044- 68 044044

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 9V (мг) PS 9V (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,35 0.35 35,90 35.90 4,55 4.55 5213,14 5213.14 9,06 9.06 7,30 7.30 64 64

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 9V (21,64 мг, 22,78 мкмоль, 4,27 мл) добавляли буферный раствор (0,541 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 6,0), ДМСО (66 мкл) и раствор DBCO-PEG₄-NH₂ (11,9 мг в 475 мкл ДМСО; 22,78 мкмоль, 1 мол.экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 140 мкл раствора цианоборогидрида натрия (2,86 мг в 140 мкл воды; 45,56 мкмоль, 2 мол.экв.). Реакционную смесь оборачивали в алюминиевую фольгу и продолжали перемешивать в водяной бане, установленной на 25°С, в течение 2 дней. Реакцию останавливали на второй день добавлением 163 мкл раствора борогидрида натрия (1,72 мг в 163 мкл воды; 45,56 мкмоль, 2 мол.экв.). После перемешивания в течение 30 мин (после прекращения наблюдаемого образования пузырьков) реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (2x10 мл) и затем дихлорметаном (2x10 мл). Экстракт барботировали N2 в течение 20 мин для удаления остаточного дихлорметана и затем переносили в 2 центрифужных фильтрующих устройства AMICON® Ultra-15 (НОММ 50 кДа; 15 мл). Диализ осуществляли, выполняя три замены 3% раствора ДМСО (каждая по 15 мл), три замены 20% раствора этанола (каждая по 15 мл) и две замены воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением DBCOпроизводного 9V. К этому раствору (4,40 мл, 12,144 мг) добавляли раствор сахарозы (121,44 мг, 1,214 мл воды). Этот комбинированный раствор разделяли на три фракции (2x5 мг и 1x2,14 мг) и каждую лиофилизировали с получением мелкодисперсного белого порошка. Все фракции хранили при 4°С до тех пор, пока они не требовались для реакции конъюгации.To a solution of oxidized PS type 9V (21.64 mg, 22.78 µmol, 4.27 ml) was added a buffer solution (0.541 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 6.0), DMSO (66 µl) and a solution of DBCO- PEG ₄ -NH ₂ (11.9 mg in 475 µl DMSO; 22.78 µmol, 1 mol equiv.). The reaction mixture was stirred at 25°C for 30 min, after which time 140 μl of sodium cyanoborohydride solution (2.86 mg in 140 μl of water; 45.56 μmol, 2 mol.eq.) was added. The reaction mixture was wrapped in aluminum foil and continued to stir in a water bath set at 25°C for 2 days. The reaction was stopped on the second day by adding 163 μl of sodium borohydride solution (1.72 mg in 163 μl of water; 45.56 μmol, 2 mol equiv.). After stirring for 30 minutes (after bubble formation had ceased), the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (2x10 ml) and then with dichloromethane (2x10 ml). The extract was bubbled with N2 for 20 min to remove residual dichloromethane and then transferred to 2 AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 50 kDa; 15 ml). Dialysis was carried out by performing three changes of 3% DMSO solution (each 15 ml), three changes of 20% ethanol solution (each 15 ml) and two changes of HPLC grade water (each 15 ml), obtaining DBCO derivative 9V. To this solution (4.40 ml, 12.144 mg) was added a sucrose solution (121.44 mg, 1.214 ml water). This combination solution was divided into three fractions (2x5 mg and 1x2.14 mg) and each was lyophilized to obtain a fine white powder. All fractions were stored at 4°C until required for the conjugation reaction.

Окисленный PS 9V (мг) Oxidized PS 9V (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 21,6 21.6 4,40 4.40 949,00 949.00 0,341 0.341 28,00 28.00 3,0 3.0 56 56 267 267

3. Конъюгация производного PS 9V-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 9V-DBCO with eCRM.

PS 9V-DBCO: 5 мг (с 50 мг сахарозы) белого порошка.PS 9V-DBCO: 5 mg (with 50 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 3,0%.%DBCO: 3.0%.

Концентрация CRM: 6,009 мг/мл раствор.CRM concentration: 6.009 mg/ml solution.

PS: CRM (входное соотношение): 1,5:1.PS: CRM (input ratio): 1.5:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 9V (5,0 мг белого порошка с 50 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (0,881 мл), фосфатном буфере, рН 7 (0,067 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,167 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,555 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS9V:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч, затем в течение еще 2 ч при 37°С. По истечении общего времени реакции к смеси для конъюгации добавляли объем азида натрия (0,33 мг; 5,15 мкмоль). Затем реакционную смесь разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия (2,83 мл) и переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000). Образец подвергали диализу в 0,9% растворе хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 9V PS-CRM.DBCO derivative 9V (5.0 mg white powder with 50 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (0.881 ml), phosphate buffer, pH 7 (0.067 ml, 0.5 M) and DMSO (0.167 ml) . A solution of azide-functionalized eCRM (0.555 mL solution) was added to provide a PS9V:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours, then for another 2 hours at 37°C. After the total reaction time, a volume of sodium azide (0.33 mg; 5.15 μmol) was added to the conjugation mixture. The reaction mixture was then diluted with 0.9% sodium chloride solution (2.83 mL) and transferred to a pre-washed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMMM 300000). The sample was dialyzed in 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 9V PS-CRM conjugate solution.

PS 9VDBCO (мг) PS 9VDBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделен ие PS (%) PS allocation (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделен ие CRM (%) CRM Allocation (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свобо дный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,0 5.0 3,33 3.33 1,67 1.67 0,86 0.86 87 87 0,450 0.450 68 68 1,9 1.9 14,2 14.2 0,94 0.94

Пример 20. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 9V с eCRM из табл. 2.Example 20. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 9V with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 9V: 81% (антрон).PS type 9V purity: 81% (anthrone).

Мол. масса: 949,83.Mol. weight: 949.83.

Раствор NaIO₄ в воде (5,41 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (5.41 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-9V (21,15 мг, скорректировано до 81%, 17,13 мг, 18,04 мкмоль) растворяли в 10,57 мл водного раствора (7,4 мл воды и 3,17 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавлялиPS-9V powder (21.15 mg, corrected to 81%, 17.13 mg, 18.04 µmol) was dissolved in 10.57 ml aqueous solution (7.4 ml water and 3.17 ml 0.2 M acetate buffer , pH 5.5). To this solution was added

- 69 044044- 69 044044

214 мкл раствора NaIO₄ (1,16 мг, 5,41 мкмоль, 0,3 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 20 ч.214 µl of NaIO ₄ solution (1.16 mg, 5.41 µmol, 0.3 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 20 hours.

Окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифужного фильтра AMICON (НОММ 30 кДа,The oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 30 kDa,

6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-9V.6-12 ml) using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS-9V.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 9V (мг) PS 9V (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,30 0.30 21,15 21.15 2,49 2.49 7352 7352 7,4 7.4 9,6 9.6 82 82

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 9V (15,36 мг, 16,17 мкмоль, 2,20 мл воды) добавляли буферный раствор (1,4 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,01), ДМСО (500 мкл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (8,46 мг в 131 мкл ДМСО; 16,17 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 41 мкл раствора цианоборогидрида натрия (15,5 мг в 200 мкл воды; 32,34 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 62 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Экстракт переносили в ультрацентрифужный фильтр AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и затем подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 9V. К этому раствору (4,0 мл, 10,08 мг) добавляли раствор сахарозы (100 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,04 мг 9V DBCO и 50 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 9V (15.36 mg, 16.17 µmol, 2.20 ml water) was added a buffer solution (1.4 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.01), DMSO (500 µl) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (8.46 mg in 131 µl DMSO; 16.17 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 41 µl of sodium cyanoborohydride solution (15.5 mg in 200 µl water; 32.34 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 62 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 eq.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml). The extract was transferred to an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml) followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO - derived type 9V. To this solution (4.0 ml, 10.08 mg) was added a solution of sucrose (100 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 5.04 mg of 9V DBCO and 50 mg of sucrose for use in the following conjugation reaction.

Окисленный PS 9V (мг) Oxidized PS 9V (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 15,36 15.36 5,42 5.42 2642 2642 0,216x4 0.216x4 90,32 90.32 3,42 3.42 89 89 324 324

PS 9V-DBCO: 5,04 мг (с 50 мг сахарозы) белый порошок.PS 9V-DBCO: 5.04 mg (with 50 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 3,42%.%DBCO: 3.42%.

Концентрация CRM: 3,923 мг/мл раствор.CRM concentration: 3.923 mg/ml solution.

PS: CRM (входное соотношение): 1,11:1.PS: CRM (input ratio): 1.11:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (CRM в 0,1,156 мл раствора) добавляли к DBCOпроизводному 9V (5,04 мг белого порошка с 50 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS9V:CRM равное 1,11:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (5 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 9V PS-CRM.A solution of azide functionalized eCRM (CRM in 0.1.156 mL solution) was added to DBCO derivative 9V (5.04 mg white powder with 50 mg sucrose) to provide a PS9V:CRM mass ratio of 1.11:1 (w/w) . The reaction mixture was stirred gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, NOMM 300,000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (5 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 9V PS-CRM conjugate solution.

PS 9VDBCO (мг) PS 9VDBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,04 5.04 4,53 4.53 5,73 5.73 0,61 0.61 69 69 0,298 0.298 39 39 2,05:1 2.05:1 14,64 14.64 1,26 1.26

Пример 21. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 10А с eCRM из табл. 2.Example 21. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 10A with eCRM from table. 2.

Степень чистоты PS 10A: 77% (антрон).PS 10A purity: 77% (anthrone).

[Мол. масса: 1227 г-моль-¹ (повторяющееся звено).[Mol. mass: 1227 g-mol- ¹ (repeating unit).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS10A (18,7 мг, 15,2 мкмоль) растворяли в воде (7,9 мл), к которой был добавлен CDAP (0,8 экв., 100 мг/мл в ацетонитриле, 30 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ) в течение 30 с. В это время добавляли раствор гидроксида натрия (0,2 М, 200 мкл) до достижения рН 9,5,PS10A (18.7 mg, 15.2 μmol) was dissolved in water (7.9 ml) to which CDAP (0.8 eq., 100 mg/ml in acetonitrile, 30 μl) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature (RT) for 30 s. At this time, sodium hydroxide solution (0.2 M, 200 μl) was added until the pH reached 9.5,

- 70 044044 и реакционную смесь перемешивали в течение 150 с. После этого добавляли ДМСО (1,2 мл), затем DBCO-PEG4- NH₂ (0,5 экв., 32,0 мкмоль/мл в ДМСО, 238 мкл) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. DBCO-дериватизированный PS10A очищали с помощью экстракции растворителем и центробежного диализа (Amicon, HOMM 30 кДа) с использованием 3 замен 3% (об./об.) ДМСО, 2 замен 0,9% (об./об.) рассола и 3 замен воды. После анализа методом УФ-абсорбционной спектроскопии, количественного исследования антрона и SEC этот раствор (3,18 мл, 13,5 мг) разбавляли раствором сахарозы (10-кратное массовое содержание, 100 мг/мл) и лиофилизировали с получением белого порошка.- 70 044044 and the reaction mixture was stirred for 150 s. DMSO (1.2 ml) was then added followed by DBCO-PEG4-NH ₂ (0.5 eq, 32.0 µmol/ml in DMSO, 238 µl) and stirred at room temperature overnight. DBCO-derivatized PS10A was purified by solvent extraction and centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using 3 changes of 3% (v/v) DMSO, 2 changes of 0.9% (v/v) brine, and 3 water changes. After analysis by UV absorption spectroscopy, anthrone quantitation and SEC, this solution (3.18 ml, 13.5 mg) was diluted with sucrose solution (10 times the mass content, 100 mg/ml) and lyophilized to obtain a white powder.

PS 10А (мг) PS 10A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research antrona (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) DBCO Enable (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 18,7 18.7 3,18 3.18 1150,41 1150.41 1,081 1,081 101,26 101.26 8,8 8.8 72 72 579 579

2. Конъюгация производного PS 10A-DBCO с eCRM.2. Conjugation of PS derivative 10A-DBCO with eCRM.

PS 10A-DBCO: 5,00 мг (с 50,0 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 10A-DBCO: 5.00 mg (with 50.0 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 8,8%.%DBCO: 8.8%.

CRM: 5,0 мг/мл в ФСБ.CRM: 5.0 mg/ml in PBS.

PS:CRM (входное массовое соотношение): 1,75:1.PS:CRM (input mass ratio): 1.75:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Лиофилизированный 10A-DBCO растворяли в рассоле (0,9% (масс./об.), 3,759 мл), фосфатном буфере (0,5 М, рН 7,0, 200 мкл) и ДМСО (500 мкл), к которому был добавлен раствор eCRM (0,541 мл), чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS10A:CRM равное 1,75:1,00 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч. Конъюгат CRM переносили в две предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор стерилизовали путем фильтрации через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 10A-CRM.Lyophilized 10A-DBCO was dissolved in brine (0.9% (w/v), 3.759 mL), phosphate buffer (0.5 M, pH 7.0, 200 μL) and DMSO (500 μL), to which eCRM solution (0.541 mL) was added to provide an input PS10A:CRM mass ratio of 1.75:1.00 (w/w). The solution was mixed very gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 hours. The CRM conjugate was transferred into two pre-washed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 replacements, each 800 ml). The dialyzed solution was sterilized by filtration through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 10A-CRM conjugate solution.

PS 10АDBCO (мг) PS 10ADBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Соотн. PS:CRM CJF Ratio PS:CRM C.J.F. Свободный PS (%) Free PS (%) SEC- MALS (МДа) SEC- MALS (Yeah) 5,00 5.00 2,86 2.86 6,86 6.86 0,678 0.678 93 93 0,311 0.311 2,18:1,0 2.18:1.0 5,64 5.64 1,048 1,048

Пример 22. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 11A с eCRM из табл. 2.Example 22. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 11A with eCRM from table. 2.

1. Гидролиз.1. Hydrolysis.

Степень чистоты PS типа 11 А: 69% (антрон).PS type 11 A purity: 69% (anthrone).

Мол. масса: 908,7 г-моль¹.Mol. mass: 908.7 g-mol ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид 11А (35,0 мг) растворяли в 17,5 мл водного раствора (15,75 мл воды и 1,75 мл уксусной кислоты, 2 М). Смесь нагревали при 80°С в течение 1 ч, по истечении этого времени добавляли раствор гидроксида натрия до достижения рН 5,5 (3,2 мл, 1 М) после охлаждения до температуры окружающей среды. Гидролизованный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, HOMM 30 кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-3, который затем лиофилизировали как одну аликвоту.Native polysaccharide 11A (35.0 mg) was dissolved in 17.5 ml of an aqueous solution (15.75 ml of water and 1.75 ml of acetic acid, 2 M). The mixture was heated at 80°C for 1 hour, after which time sodium hydroxide solution was added to achieve pH 5.5 (3.2 ml, 1 M) after cooling to ambient temperature. Hydrolyzed PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using at least 6 water changes to produce a solution of purified PS-3, which was then lyophilized as a single aliquot.

PS НА(мг) PS NA(mg) Вода (мл) Water (ml) АсОН, 2М (мл) AcOH, 2M (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Выход PS (%) PS Output (%) MALS (кДа) MALS (kDa) 35,0 35.0 15,75 15.75 1,75 1.75 6294,58 6294.58 85 85 461 461

2. Окисление.2. Oxidation.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору гидролизованного полисахарида (5,027 мл, 28,75 мг, 31,6 мкмоль) дополнительно добавляли воду (5,75 мл) и ацетатный буфер (0,2 М, рН 5,5, 3,6 мл). К этому раствору по каплям добавляли 135 мкл раствора периодата натрия (1,35 мг, 6,32 мкмоль, 0,20 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч. Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, HOMM 100 кДа), используя по меньшей мере 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-11A-OX.To the hydrolyzed polysaccharide solution (5.027 ml, 28.75 mg, 31.6 µmol) additional water (5.75 ml) and acetate buffer (0.2 M, pH 5.5, 3.6 ml) were added. To this solution, 135 μl of sodium periodate solution (1.35 mg, 6.32 μmol, 0.20 eq.) was added dropwise. The mixture was stirred at 25°C for 18 hours. Oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 100 kDa) using at least 6 water changes to obtain a purified PS-11A-OX solution.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS ПА(мг) PS PA(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research antrona (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,20 0.20 28,75 28.75 2,42 2.42 9525,39 9525.39 10,2 10.2 4,82 4.82 73 73

- 71 044044- 71 044044

3. Дериватизация с применением DBCO.3. Derivatization using DBCO.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS11A-OX (22,0 мг, 24,2 мкмоль, 2,235 мл) добавляли в фосфатный буфер (1,37 мл, 200 мМ, рН 6,0), к которому был добавлен DBCO-PEG₄-NH₂ (1,0 экв., 523 г-моль-¹ в ДМСО, 100 мг/мл, 127 мкл) и дополнительное количество ДМСО (560 мкл). Реакционную смесь перемешивали при 25 °С в течение 25 мин перед добавлением раствора цианоборогидрида натрия (2 экв., 44,5 мг/мл, 68 мкл) и перемешивали в течение двух дней. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл) и фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм. DBCO-производное очищали с помощью блоков для центробежного диализа (Amicon, HOMM 100 кДа), используя 7 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 11А. К этому раствору (2,535 мл, 15,00 мг) добавляли раствор сахарозы (150 мг в 1,5 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,00 мг 11A-DBCO и 50 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.PS11A-OX (22.0 mg, 24.2 µmol, 2.235 ml) was added to phosphate buffer (1.37 ml, 200 mmol, pH 6.0), to which DBCO-PEG ₄ -NH ₂ (1. 0 eq., 523 g-mol- ¹ in DMSO, 100 mg/ml, 127 µl) and additional DMSO (560 µl). The reaction mixture was stirred at 25°C for 25 min before adding sodium cyanoborohydride solution (2 equiv., 44.5 mg/mL, 68 μL) and stirred for two days. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml) and filtered through a 0.45 μm syringe filter. The DBCO derivative was purified using centrifugal dialysis units (Amicon, HOMM 100 kDa) using 7 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (12 ml each) to obtain DBCO derivative type 11A. To this solution (2.535 ml, 15.00 mg) was added a solution of sucrose (150 mg in 1.5 ml water). The combined solution was divided into three equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 5.00 mg of 11A-DBCO and 50 mg of sucrose for use in the next conjugation reaction.

Г идролизованный PS ПА(мг) Hydrolyzed PS PA(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 22,0 22.0 3,44 3.44 1628,30 1628.30 1,000x4 1,000x4 93,93 93.93 5,77 5.77 93 93 543 543

4. Конъюгация производного PS 11A-DBCO с eCRM.4. Conjugation of PS derivative 11A-DBCO with eCRM.

PS 11 A-DBCO: 5,0 мг (с 50 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 11 A-DBCO: 5.0 mg (with 50 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 5,77%.%DBCO: 5.77%.

Концентрация CRM: 5,42 мг/мл раствор.CRM concentration: 5.42 mg/ml solution.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

11A-DBCO растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (7,656 мл, профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм), фосфатном буфере (рН 7,0, 0,5 М, 0,385 мл) и ДМСО (0,962 мл). Раствор функционализированного азидом eCRM (5,42 мг/мл, 0,617 мл) добавляли по каплям, чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS11A:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Конъюгат CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (4 замены, каждая по 1 л). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 11A-CRM.11A-DBCO was dissolved in 0.9% sodium chloride (7.656 ml, filtered through a 0.22 μm filter), phosphate buffer (pH 7.0, 0.5 M, 0.385 ml) and DMSO (0.962 ml) . A solution of azide-functionalized eCRM (5.42 mg/mL, 0.617 mL) was added dropwise to provide an input mass ratio of PS11A:CRM of 1.5:1 (w/w). The solution was stirred very gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The CRM conjugate was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (4 changes, each 1 L). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain the 11A-CRM conjugate solution.

PS 11А- DBCO (мг) PS 11A- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJF Ratio PS:CRM C.J.F. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,0 5.0 3,33 3.33 9,14 9.14 0,454 0.454 83 83 0,271 0.271 74 74 1,68:1 1.68:1 0,92 0.92 0,987 0.987

Пример 23. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 12F с eCRM из табл. 2.Example 23. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 12F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 12F: 82% (антрон).PS type 12F purity: 82% (anthrone).

Мол. масса: 1094 г-моль-¹.Mol. mass: 1094 g-mol- ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 12F (21,8 мг, 20 мкмоль) растворяли в 10,9 мл водного раствора (8,175 мл воды и 2,725 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом 50 мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 160 мкл раствора NaIO₄ (0,64 мг, 3 мкмоль, 0,15 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в водяную баню при 25 °С. Смесь перемешивали при 25°С. Через 18 ч реакционную смесь подвергали диализу с применением двух центрифужных фильтрующих устройств AMICON® Ultra-15 (30 кДа НОММ; 15 мл), используя 6 замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-12F.PS type 12F powder (21.8 mg, 20 μmol) was dissolved in 10.9 mL aqueous solution (8.175 mL water and 2.725 mL 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a 50 mL polystyrene sample tube with stirrer . After dissolving the PS, 160 μl of NaIO ₄ solution (0.64 mg, 3 μmol, 0.15 mol.eq.) was added. The reaction tube was wrapped in foil and placed in a water bath at 25 °C. The mixture was stirred at 25°C. After 18 h, the reaction mixture was dialyzed using two AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (30 kDa HOMM; 15 mL) using 6 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain a solution of oxidized PS-12F.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 12F (мг) PS 12F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research antrona (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,15 0.15 21,8 21.8 3,06 3.06 4462,11 4462.11 37 37 5,62 5.62 69 69

- 72 044044- 72 044044

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS12F-OX (13,1 мг, 12 мкмоль, 2,68 мл) добавляли в фосфатный буфер (1,00 мл, 200 мМ, рН 6,0), к которому был добавлен DBCO-PEG4-NH2 (1,0 экв., 523 г-моль-¹ в ДМСО, 33 мг/мл, 199 мкл) и дополнительное количество ДМСО (500 мкл). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 25 мин перед добавлением раствора цианоборогидрида натрия (2 экв., 52,5 мг/мл, 29 мкл) и перемешивали в течение двух дней. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл) и барботировали без растворителя. DBCO-производное дважды очищали с применением блоков для центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды каждый раз (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного 12F. К этому раствору (2,2 мл, 10,45 мг) добавляли раствор сахарозы (104,5 мг в 1,05 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,0 мг 12F-DBCO и 50 мг сахарозы для использования в реакции конъюгации.PS12F-OX (13.1 mg, 12 µmol, 2.68 ml) was added to phosphate buffer (1.00 ml, 200 mM, pH 6.0), to which DBCO-PEG4-NH2 (1.0 equiv) was added ., 523 g-mol- ¹ in DMSO, 33 mg/ml, 199 µl) and additional DMSO (500 µl). The reaction mixture was stirred at 25°C for 25 min before adding sodium cyanoborohydride solution (2 eq., 52.5 mg/ml, 29 μl) and stirring for two days. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml) and bubbled without solvent. The DBCO derivative was purified twice using centrifugal dialysis units (Amicon, HOMM 30 kDa) using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 water changes each time (12 ml each) to obtain DBCO derivative 12F. To this solution (2.2 ml, 10.45 mg) was added a solution of sucrose (104.5 mg in 1.05 ml water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 5.0 mg 12F-DBCO and 50 mg sucrose for use in the conjugation reaction.

PS 12Fох (мг) PS 12Fox (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (^кДа)SEC-MALS ( ^to Yes) 13,1 13.1 2,20 2.20 1447,92 1447.92 0,302x3 0.302x3 28,2 28.2 2,0 2.0 80 80 544 544

3. Конъюгация производного PS 12F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 12F-DBCO with eCRM.

PS 12F-DBCO: 5,0 мг (с 50 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 12F-DBCO: 5.0 mg (with 50 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 2,0%.%DBCO: 2.0%.

Концентрация CRM: 5,29 мг/мл раствор.CRM concentration: 5.29 mg/ml solution.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

12F-DBCO растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (6,542 мл, профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм), фосфатном буфере (рН 7,0, 0,5 М, 0,334 мл) и ДМСО (0,834 мл). Раствор функционализированного азидом eCRM (5,29 мг/мл, 0,630 мл) добавляли по каплям, чтобы обеспечить входное массовое соотношение PS12F:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Конъюгат CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (4 замены, каждая по 1 л). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением стерильного раствора конъюгата 12F-CRM.12F-DBCO was dissolved in 0.9% sodium chloride (6.542 ml, filtered through a 0.22 μm filter), phosphate buffer (pH 7.0, 0.5 M, 0.334 ml) and DMSO (0.834 ml) . A solution of azide-functionalized eCRM (5.29 mg/mL, 0.630 mL) was added dropwise to provide an input mass ratio of PS12F:CRM of 1.5:1 (w/w). The solution was stirred very gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The CRM conjugate was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (4 changes, each 1 L). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a sterile 12F-CRM conjugate solution.

PS 12F- DBCO (мг) PS 12F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJF Ratio PS:CRM C.J.F. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,0 5.0 3,33 3.33 8,06 8.06 0,547 0.547 88 88 0,200 0.200 48 48 2,73:1 2.73:1 13,3 13.3 0,931 0.931

Пример 24. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 14 с eCRM из табл. 2.Example 24. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 14 with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 14: 91% (антрон).PS type 14 purity: 91% (anthrone).

Мол. масса: 689,25.Mol. weight: 689.25.

Раствор NaIO₄ в воде (7,8 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (7.8 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-14 (28,3 мг, скорректировано до 80%, 25,75 мг, 37,36 мкмоль) растворяли в 14 мл водного раствора (10 мл воды и 4 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 110 мкл раствора NaIO₄ (0,86 мг, 4,05 мкмоль, 0,13 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 3 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с применением ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-14.PS-14 powder (28.3 mg, adjusted to 80%, 25.75 mg, 37.36 µmol) was dissolved in 14 ml of aqueous solution (10 ml of water and 4 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) . To this solution was added 110 μl of NaIO ₄ solution (0.86 mg, 4.05 μmol, 0.13 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 3 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml), using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water, to obtain a solution of oxidized PS- 14.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 14 (мг) PS 14 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity research aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,13 0.13 28,3 28.3 3,042 3,042 10189 10189 6,59 6.59 3,67 3.67 83 83

- 73 044044- 73 044044

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 14 (20,5 мг, 29,74 мкмоль, 2,92 мл воды) добавляли буферный раствор (1,3 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,8), ДМСО (550 мкл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (11,68 мг в 150 мкл ДМСО; 22,3 мкмоль, 0,75 эквивалента), все при 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 70 мкл раствора цианоборогидрида натрия (6,39 мг в 120 мкл воды; 59,48 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 100 мкл раствора борогидрида натрия (1,13 мг на 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата), затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и после этого подвергали диализу, используя 7 замен 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 14. К этому раствору (3,78 мл, 17,7 мг) добавляли раствор сахарозы (177 мг в 1,17 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,9 мг 14 DBCO и 59 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 14 (20.5 mg, 29.74 µmol, 2.92 ml water) was added a buffer solution (1.3 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.8), DMSO (550 µl) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (11.68 mg in 150 µl DMSO; 22.3 µmol, 0.75 equivalents), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 70 µl of sodium cyanoborohydride solution (6.39 mg in 120 µl water; 59.48 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 100 μl of a solution of sodium borohydride (1.13 mg per 10 eq.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate), then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 7 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml ) followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 14. To this solution (3.78 ml, 17.7 mg) was added a solution of sucrose (177 mg in 1.17 ml water). The combined solution was divided into three equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 5.9 mg of 14 DBCO and 59 mg of sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный PS 14 (мг) Oxidized PS 14 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 20,5 20.5 3,91 3.91 1694,06 1694.06 0,622x4 0.622x4 238 238 3,51 3.51 91 91 463 463

3. Конъюгация производного PS 14-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 14-DBCO with eCRM.

PS 6B-DBCO: 5,9 мг (с 59 мг сахарозы) в виде порошка.PS 6B-DBCO: 5.9 mg (with 59 mg sucrose) powder.

% DBCO: 3,5%.%DBCO: 3.5%.

Концентрация CRM: 5,06 мг/мл раствор.CRM concentration: 5.06 mg/ml solution.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (0,779 мл) добавляли к DBCO-производному 14 (5,9 мг белого порошка с 59 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS14:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-ALyzer G2, каталожный номер G235071, НОММ 100000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 14 PSCRM.A solution of azide-functionalized eCRM (0.779 mL) was added to DBCO derivative 14 (5.9 mg white powder with 59 mg sucrose) to provide a PS14:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-ALyzer G2, catalog number G235071, HOMM 100000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a solution of PSCRM conjugate 14.

PS 14DBCO (мг) PS 14DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделен не PS (%) Not allocated PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделен ие CRM (%) CRM Allocation (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свобо дный PS (%) Free PS (%) SEC- MALS (МДа) SEC- MALS (Yeah) 5,9 5.9 3,94 3.94 4,27 4.27 0,648 0.648 93 93 0,283 0.283 61 61 2,29:1 2.29:1 5,29 5.29 0,925 0.925

Пример 25. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 14 с eCRM из табл. 2.Example 25. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 14 with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 14:91% (антрон).PS type purity 14:91% (anthrone).

Мол. масса: 689,25.Mol. weight: 689.25.

Раствор NaIO₄ в воде (10,19 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (10.19 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-14 (23,5 мг, скорректировано до 80%, 21,38 мг, 31,02 мкмоль) растворяли в 11,75 мл водного раствора (8,2 мл воды и 3,55 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 97 мкл раствора NaIO₄ (0,95 мг, 4,03 мкмоль, 0,13 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-14.PS-14 powder (23.5 mg, corrected to 80%, 21.38 mg, 31.02 µmol) was dissolved in 11.75 ml of aqueous solution (8.2 ml of water and 3.55 ml of 0.2 M acetate buffer , pH 5.5). To this solution was added 97 μl of NaIO ₄ solution (0.95 mg, 4.03 μmol, 0.13 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS- 14.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 14 (мг) PS 14 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity research aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) Примечание Note 0,13 0.13 23,5 23.5 3,76 3.76 5994 5994 6,60 6.60 2,28 2.28 73 73 Нет No

- 74 044044- 74 044044

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 14 (14,3 мг, 20,75 мкмоль, 3,46 мл воды) добавляли буферный раствор (1,3 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,8), ДМСО (637 мкл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (10,86 мг в 263 мкл ДМСО; 20,75 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 51 мкл раствора цианоборогидрида натрия (10,2 мг в 200 мкл воды; 41,50 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 78 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата) и затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), и затем подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 14. К этому раствору (4,12 мл, 12,24 мг) добавляли раствор сахарозы (12 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на три равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 6,12 мг 14 DBCO и 6 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 14 (14.3 mg, 20.75 µmol, 3.46 ml water) was added a buffer solution (1.3 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.8), DMSO (637 µl) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (10.86 mg in 263 µl DMSO; 20.75 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 51 µl of sodium cyanoborohydride solution (10.2 mg in 200 µl water; 41.50 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 78 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 eq.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate) and then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml), and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml ) followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 14. To this solution (4.12 ml, 12.24 mg) was added a solution of sucrose (12 mg in 1 ml water). The combined solution was divided into three equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 6.12 mg of 14 DBCO and 6 mg of sucrose for use in the following conjugation reaction.

Окисленный PS 14 (мг) Oxidized PS 14 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) 14,3 14.3 4,43 4.43 4307 4307 0,621x3 0.621x3 190,14 190.14 4,42 4.42 92 92

PS 6B-DBCO: 6,12 мг (с 62 мг сахарозы) белого порошка.PS 6B-DBCO: 6.12 mg (with 62 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 4,42%.%DBCO: 4.42%.

PS: CRM (входное соотношение): 1,8:1.PS: CRM (input ratio): 1.8:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (1,3 мл) добавляли к DBCO-производному 14 (6,12 мг белого порошка с 62 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS14:CRM равное 1,8:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-ALyzer G2, каталожный номер G235071, НОММ 100000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор (1,5 мл) фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 14 PS-CRM.A solution of azide-functionalized eCRM (1.3 mL) was added to DBCO derivative 14 (6.12 mg white powder with 62 mg sucrose) to provide a PS14:CRM mass ratio of 1.8:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-ALyzer G2, catalog number G235071, HOMMM 100000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 changes, each 800 ml). The dialyzed solution (1.5 ml) was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a solution of PS-CRM conjugate 14.

PS 14DBCO (мг) PS 14DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выдел ение PS (%) PS release (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделе ние CRM (%) CRM Allocation (%) Соотн. PS:CR MCJD Ratio PS:CR MCJD Свобо дный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) № парт ИИ No. desk AI 6,12 6.12 3,4 3.4 4,85 4.85 1,24 1.24 98 98 0,472 0.472 67 67 2,63:1 2.63:1 3,48 3.48 2,5 2.5 CJD C.J.D. 6,12 6.12 3,4 3.4 2,31 2.31 0,24 0.24 0,094 0.094 2,55:1 2.55:1 Нет данны X No data X 1,56 1.56 CJF C.J.F.

Пример 26. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 15B с eCRM из табл. 2.Example 26. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 15B with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 15В: 71% (антрон).PS type 15B purity: 71% (anthrone).

Мол. масса: 1185 кДа (повторяющееся звено = 1069,80 г/моль).Mol. mass: 1185 kDa (repeat unit = 1069.80 g/mol).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 15В (14,6 мг, 13,65 мкмоль) растворяли в 7,30 мл водного раствора (5,1 мл воды и 2,2 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом 50 мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 160 мкл раствора NaICO₄ (0,59 мг, 2,75 мкмоль, 0,20 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в водяную баню для перемешивания при 24°С. Через 3,5 ч реакционную смесь подвергали диализу с помощью одного центрифужного фильтрующего устройства AMICON® Ultra-15 (НОММ 30 кДа; 15 мл), используя 6 замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-15B.PS type 15B powder (14.6 mg, 13.65 µmol) was dissolved in 7.30 ml of aqueous solution (5.1 ml of water and 2.2 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a polystyrene tube for 50 ml samples with a stirrer. After dissolving the PS, 160 μl of NaICO ₄ solution (0.59 mg, 2.75 μmol, 0.20 mol equiv.) was added. The reaction tube was wrapped in foil and placed in a water bath for stirring at 24°C. After 3.5 h, the reaction mixture was dialyzed using one AMICON® Ultra-15 centrifugal filter unit (HOMM 30 kDa; 15 mL) using 6 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain a solution of oxidized PS-15B.

- 75 044044- 75 044044

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 15В (мг) PS 15B (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, В С А) Oxidation (%, V C A) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,20 0.20 14,6 14.6 1,521 1.521 5560,34 5560.34 27,01 27.01 9,52 9.52 62 62

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 15В (7,56 мг, 7,07 мкмоль, 1,271 мл) добавляли буферный раствор (0,640 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 6,0), ДМСО (0,063 мл) и раствор DBCO-PEG₄-NH₂ (17 мг в 221 мкл ДМСО; 7,07 мкмоль, 1 мол.экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 мин, после этого добавляли 350 мкл раствора цианоборогидрида натрия (0,90 мг в 350 мкл воды, 2 мол.экв.). Реакционную смесь оборачивали в алюминиевую фольгу и продолжали перемешивать в водяной бане, установленной на 25°С, в течение 2 дней. Реакцию останавливали на второй день добавлением 163 мкл раствора борогидрида натрия (0,27 мг; 7,07 мкмоль, 2 мол.экв.). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (3x15 мл). Экстракт барботировали N2 в течение 20 мин для удаления остаточного дихлорметана и затем переносили в одно центрифужное фильтрующее устройство AMICON® Ultra-15 (НОММ 30 кДа; 15 мл). Диализ выполняли путем проведения трех замен 3% раствора ДМСО (каждая по 15 мл), трех замен 20% раствора этанола (15 мл) и трех замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением DBCO-производного 15В. К этому раствору (1,982 мл, 6,86 мг) добавляли раствор сахарозы (68,6 мг в 0,686 мл воды). Этот комбинированный раствор разделяли на две фракции и каждую лиофилизировали с получением мелкодисперсного белого порошка. Все фракции хранили при 4°С после лиофилизации до сухости до тех пор, пока они не потребовались для реакции конъюгации.To a solution of oxidized PS type 15B (7.56 mg, 7.07 µmol, 1.271 ml) was added a buffer solution (0.640 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 6.0), DMSO (0.063 ml) and a DBCO-PEG ₄ solution -NH ₂ (17 mg in 221 µl DMSO; 7.07 µmol, 1 mol equiv.). The reaction mixture was stirred at 25°C for 30 min, after which 350 μl of sodium cyanoborohydride solution (0.90 mg in 350 μl of water, 2 mol.eq.) was added. The reaction mixture was wrapped in aluminum foil and continued to stir in a water bath set at 25°C for 2 days. The reaction was stopped on the second day by adding 163 μl of sodium borohydride solution (0.27 mg; 7.07 μmol, 2 mol equiv.). After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with dichloromethane (3x15 ml). The extract was bubbled with N2 for 20 min to remove residual dichloromethane and then transferred to one AMICON® Ultra-15 centrifugal filter unit (HOMM 30 kDa; 15 ml). Dialysis was performed by performing three changes of 3% DMSO solution (15 mL each), three changes of 20% ethanol solution (15 mL) and three changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain DBCO derivative 15B. To this solution (1.982 ml, 6.86 mg) was added a solution of sucrose (68.6 mg in 0.686 ml water). This combination solution was separated into two fractions and each was lyophilized to obtain a fine white powder. All fractions were stored at 4°C after lyophilization to dryness until required for the conjugation reaction.

Окисленный PS 15B (мг) Oxidized PS 15B (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 7,56 7.56 1,982 1,982 1122,13 1122.13 0,732 0.732 66,71 66.71 5,9 5.9 91 91 Нет данных No data

3. Конъюгация производного PS 15B-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 15B-DBCO with eCRM.

PS 15B-DBCO: 3,85 мг (с 38,5 мг сахарозы) белого порошка.PS 15B-DBCO: 3.85 mg (with 38.5 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 5,9%.%DBCO: 5.9%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 15В (3,85 мг белого порошка с 38,5 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (4,302 мл), фосфатном буфере, рН 7 (0,220 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,550 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,467 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS15B:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч, затем еще в течение 2 ч при 37°С. Реакцию конъюгации останавливали добавлением азида натрия (0,23 мг; 3,60 мкмоль). Затем реакционную смесь разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия до конечного объема 7 мл и переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000). Образец подвергали диализу в 0,9% растворе хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 15В PS-CRM.DBCO derivative 15B (3.85 mg white powder with 38.5 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (4.302 ml), phosphate buffer, pH 7 (0.220 ml, 0.5 M) and DMSO (0.550 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.467 mL solution) was added to provide a PS15B:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The reaction mixture was gently stirred on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours, then for another 2 hours at 37°C. The conjugation reaction was stopped by adding sodium azide (0.23 mg; 3.60 μmol). The reaction mixture was then diluted with 0.9% sodium chloride to a final volume of 7 mL and transferred to a prewashed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMMM 300000). The sample was dialyzed in 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 15B PS-CRM conjugate solution.

PS 15BDBCO (мг) PS 15BDBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделен ие PS (%) PS allocation (%) BCA (CRM) (мг/мл) B.C.A. (CRM) (mg/ml) Выделен ие CRM (%) CRM Allocation (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свобо дный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 3,85 3.85 2,57 2.57 7,52 7.52 0,515 0.515 100 100 0,289 0.289 85 85 1,8:1 1.8:1 7,68 7.68 2,40 2.40

Пример 27. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 17F с eCRM из табл. 2.Example 27. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 17F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 17F: 84% (антрон).PS type 17F purity: 84% (anthrone).

Мол. масса: 1274 кДа (повторяющееся звено = 1203,00 г/моль).Mol. mass: 1274 kDa (repeat unit = 1203.00 g/mol).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 17F (28,50 мг, 23,69 мкмоль) растворяли в 14,25 мл водного раствора (9,925 мл воды и 4,275 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 53,8 мкл раствора NaICO₄ (0,65 мг,PS type 17F powder (28.50 mg, 23.69 µmol) was dissolved in 14.25 ml of aqueous solution (9.925 ml of water and 4.275 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a ml polystyrene sample tube with stirrer. After dissolving the PS, 53.8 μl of NaICO ₄ solution (0.65 mg,

- 76 044044- 76 044044

3,03 мкмоль, 0,128 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в водяную баню для перемешивания при 24°С. Через 1 ч реакционную смесь подвергали диализу с применением двух центрифужных фильтрующих устройств AMICON® Ultra-15 (HOMM 30 кДа; 15 мл), используя 5 замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-17F.3.03 µmol, 0.128 mol.eq.). The reaction tube was wrapped in foil and placed in a water bath for stirring at 24°C. After 1 h, the reaction mixture was dialyzed using two AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 30 kDa; 15 mL) using 5 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain a solution of oxidized PS-17F.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 17F (мг) PS 17F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Antron (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,128 0.128 28,50 28.50 2,63 2.63 7378,81 7378.81 12,60 12.60 6,81 6.81 82 82

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 17F (22,0 мг, 18,29 мкмоль, 2,48 мл) добавляли буферный раствор (1,31 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 6,0) и раствор DBCO-PEG₄-NH₂ (9,58 мг в 95,8 мкл ДМСО; 18,29 мкмоль, 1 мол.экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли раствор цианоборогидрида натрия (2,30 мг в 200 мкл воды; 36,60 мкмоль; 2 мол.экв.). Реакционную смесь оборачивали в алюминиевую фольгу и продолжали перемешивать в водяной бане, установленной на 25°С, в течение 2 дней. Реакцию останавливали на второй день добавлением раствора борогидрида натрия (0,48 мг; 18,29 мкмоль, 1 мол.экв.). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (3x15 мл). Экстракт барботировали N2 в течение 20 мин для удаления остаточного дихлорметана и затем переносили в одно центрифужное фильтрующее устройство AMICON® Ultra-15 (HOMM 30 кДа; 15 мл). Диализ осуществляли, выполняя пять замен 20% раствора этанола (15 мл) и три замены воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением DBCO-производного 17F. К этому раствору (3,27 мл, 11,58 мг) добавляли раствор сахарозы (115,8 мг в 1,158 мл воды). Этот комбинированный раствор делили на три фракции (2x5 мг; 1 x 1,58 мг) и каждую лиофилизировали с получением мелкодисперсного белого порошка. Все фракции хранили при 4°С после лиофилизации до сухости до тех пор, пока они не потребовались для реакции конъюгации.To a solution of oxidized PS type 17F (22.0 mg, 18.29 µmol, 2.48 ml) was added a buffer solution (1.31 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 6.0) and a DBCO-PEG ₄ -NH solution ₂ (9.58 mg in 95.8 µl DMSO; 18.29 µmol, 1 mol equiv.). The reaction mixture was stirred at 25°C for 30 min, after which time a solution of sodium cyanoborohydride (2.30 mg in 200 μl of water; 36.60 μmol; 2 mol.eq.) was added. The reaction mixture was wrapped in aluminum foil and continued to stir in a water bath set at 25°C for 2 days. The reaction was stopped on the second day by adding sodium borohydride solution (0.48 mg; 18.29 μmol, 1 mol equiv.). After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with dichloromethane (3x15 ml). The extract was bubbled with N2 for 20 min to remove residual dichloromethane and then transferred to one AMICON® Ultra-15 centrifugal filter unit (HOMM 30 kDa; 15 ml). Dialysis was carried out by performing five changes of 20% ethanol solution (15 ml) and three changes of HPLC grade water (each 15 ml) to obtain the DBCO derivative 17F. To this solution (3.27 ml, 11.58 mg) was added a solution of sucrose (115.8 mg in 1.158 ml water). This combination solution was divided into three fractions (2 x 5 mg; 1 x 1.58 mg) and each was lyophilized to obtain a fine white powder. All fractions were stored at 4°C after lyophilization to dryness until required for the conjugation reaction.

Окисленный PS 17F (мг) Oxidized PS 17F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 22 22 4,40 4.40 978,16 978.16 0,350 0.350 30,45 30.45 3,1 3.1 53 53 209 209

3. Конъюгация производного PS 17F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 17F-DBCO with eCRM.

PS 17F-DBCO: 5 мг (с 50 мг сахарозы) белого порошка.PS 17F-DBCO: 5 mg (with 50 mg sucrose) white powder.

%DBCO:3,1%.%DBCO:3.1%.

Концентрация CRM: 5,996 мг/мл раствор.CRM concentration: 5.996 mg/ml solution.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 17F (5 мг белого порошка с 50 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (3,742 мл), фосфатном буфере, рН 7 (0,200 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,500 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,558 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS17F:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 19 ч. Реакцию конъюгации останавливали добавлением азида натрия (0,27 мг; 4,16 мкмоль; 1 мол.экв.). Затем реакционную смесь разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия до конечного объема 8 мл и переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000). Образец подвергали диализу в 0,9% растворе хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 17F PS-CRM.DBCO derivative 17F (5 mg white powder with 50 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (3.742 ml), phosphate buffer, pH 7 (0.200 ml, 0.5 M) and DMSO (0.500 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.558 mL solution) was added to provide a PS17F:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The reaction mixture was gently stirred on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 19 hours. The conjugation reaction was stopped by adding sodium azide (0.27 mg; 4.16 μmol; 1 mol.eq.). The reaction mixture was then diluted with 0.9% sodium chloride to a final volume of 8 mL and transferred to a prewashed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMMM 300000). The sample was dialyzed in 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 17F PS-CRM conjugate solution.

PS 17FDBCO (мг) PS 17FDBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделен ие PS (%) PS allocation (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделен ие CRM (%) CRM Allocation (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свобо дный PS (%) Free PS (%) SEC- MALS (МДа) SEC- MALS (Yeah) 5 5 3,33 3.33 6,71 6.71 461,30 461.30 99 99 0,349 0.349 70 70 1,59:1 1.59:1 9,41 9.41 1,072 1,072

Пример 28. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 18C с eCRM из табл. 2.Example 28. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 18C with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 18С: 72% (антрон).PS type 18C purity: 72% (anthrone).

Мол. масса: 970,76.Mol. weight: 970.76.

- 77 044044- 77 044044

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 18С (61 мг, 62,84 мкмоль) растворяли в 30,5 мл водного раствора (27,45 мл воды и 3,05 мл 2 М уксусной кислоты). Затем раствор нагревали при 95°С в течение 40 мин и затем охлаждали, при этом добавляли раствор NaOH (1 н, 5,2 мл) для доведения рН до 6,0. Реакционную смесь подвергали диализу с помощью ультрацентрифуги Amicon (100 кДа НОММ, 6-12 мл), используя 3 замены воды (каждая по 12 мл). Супернатант переносили в 50 мл пробирку Falcon с 12,4 мл воды. К этому раствору добавляли 5,15 мл воды и 5,8 мл 200 мМ ацетатного буфера (рН 5,35) и 153 мкл раствора NaIO₄ (1,53 мг, 7,175 мкмоль, 0,15 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 3 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 100 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-18C.PS type 18C powder (61 mg, 62.84 μmol) was dissolved in 30.5 ml of aqueous solution (27.45 ml of water and 3.05 ml of 2 M acetic acid). The solution was then heated at 95°C for 40 min and then cooled while NaOH solution (1 N, 5.2 mL) was added to adjust the pH to 6.0. The reaction mixture was dialyzed using an Amicon ultracentrifuge (100 kDa HOMM, 6-12 ml) using 3 water changes (12 ml each). The supernatant was transferred into a 50 ml Falcon tube with 12.4 ml of water. To this solution were added 5.15 ml of water and 5.8 ml of 200 mM acetate buffer (pH 5.35) and 153 μl of NaIO ₄ solution (1.53 mg, 7.175 μmol, 0.15 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 3 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 100 kDa, 6-12 ml) using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS- 18C.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 18С (мг) PS 18C (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantitative research) aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,15 0.15 61 61 5,29 5.29 6480,2 6480.2 4,84 4.84 7,1 7.1 55 55

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемая степень окисления 10%) PS типа 18С (10,0 мг, 10,3 мкмоль, 1,55 мл воды) добавляли буферный раствор (0,211 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,74), ДМСО (141 мкл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (5,4 мг в 54 мкл ДМСО; 16,17 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 130 мкл раствора цианоборогидрида натрия (1,3 мг в 130 мкл воды; 20,6 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 37°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 80 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (2x10 мл) и затем этилацетатом (10 мл). Экстракт переносили в ультрацентрифужный фильтр AMICON (НОММ 100 кДа, 6-12 мл) и затем подвергали диализу, используя 4 замены 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 18С. К этому раствору (1,31 мл, 7,0 мг) добавляли раствор сахарозы (70 мг в 0,7 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Каждый образец содержал 3,5 мг 18С DBCO и 35 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.A buffer solution (0.211 ml of 200 mM phosphate buffer, pH 6.74), DMSO (141 µl) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (5.4 mg in 54 µl DMSO; 16.17 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 130 µl of sodium cyanoborohydride solution (1.3 mg in 130 µl water; 20.6 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 37 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 80 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 eq.) in water. After stirring for 30 minutes, the reaction mixture was extracted with dichloromethane (2x10 ml) and then ethyl acetate (10 ml). The extract was transferred to an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 100 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 4 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml) followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO -derived type 18C. To this solution (1.31 ml, 7.0 mg) was added a solution of sucrose (70 mg in 0.7 ml water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain two samples of white powder. Each sample contained 3.5 mg of 18C DBCO and 35 mg of sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный Oxidized Объем Volume Антрон Antron Дериватизация Derivatization Дериватизация Derivatization Включение Inclusion Выход Exit SEC- SEC- PS 18С (мг) PS 18C (mg) после очистки (мл) after cleaning (ml) (мкМ) (µM) DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO, absorbance at 309 nm DBCO (мкМ) DBCO (µM) DBCO (%) DBCO (%) PS- DBCO (%) PS- DBCO (%) MALS (кДа) MALS (kDa) 10,0 10.0 1,52 1.52 5469,4 5469.4 1,031x3 1,031x3 291 291 5,32 5.32 81 81 203 203

3. Конъюгация производного PS 18C-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 18C-DBCO with eCRM.

PS 18C-DBCO: 3,5 мг (с 35 мг сахарозы) в виде белого порошка.PS 18C-DBCO: 3.5 mg (with 35 mg sucrose) as white powder.

% DBCO: 5,32%.%DBCO: 5.32%.

Концентрация CRM: 2,76 мг/мл раствор.CRM concentration: 2.76 mg/ml solution.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 18С (3,5 мг белого порошка с 35 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (0,661 мл), фосфатном буфере, рН 7 (0,07 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,175 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,844 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS18C:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 2 ч. Затем реакционную смесь разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия (0,661 мл), фосфатным буфером рН 7 (0,07 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,175 мл), чтобы довести конечную концентрацию PS-18 до 1 мг/мл, и обеспечивали взаимодействие в течение 18 ч. Добавляли раствор азида натрия (23 мкл, 10 мг/мл в воде). Через 30 мин конъюгированную смесь PS-CRM переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с 0,9% раствором хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 18С PS-CRM.DBCO derivative 18C (3.5 mg white powder with 35 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (0.661 ml), phosphate buffer, pH 7 (0.07 ml, 0.5 M) and DMSO (0.175 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.844 mL solution) was added to provide a PS18C:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 2 hours. The reaction mixture was then diluted with 0.9% sodium chloride solution (0.661 ml), phosphate buffer pH 7 (0.07 ml, 0 .5 M) and DMSO (0.175 ml) to bring the final concentration of PS-18 to 1 mg/ml, and allowed to react for 18 hours. Sodium azide solution (23 µl, 10 mg/ml in water) was added. After 30 min, the conjugated PS-CRM mixture was transferred to a prewashed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 h (8 changes , each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 18C PS-CRM conjugate solution.

- 78 044044- 78 044044

PS 18С- DBCO (мг) PS 18C- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 3,5 3.5 2,33 2.33 4,11 4.11 0,287 0.287 34 34 0,168 0.168 29,6 29.6 1,7 1.7 13,7 13.7 1,97 1.97

Пример 29. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 18C с eCRM из табл. 2.Example 29. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 18C with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Мол. масса повторяющегося звена PS типа 18С: 1012.Mol. mass of repeating unit PS type 18C: 1012.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-18C (20 мг, 19,76 мкмоль) растворяли в 3 мл водного раствора (10 мМ раствор ацетата натрия, рН 4,5). К этому раствору добавляли 63,4 мкл раствора NaIO₄ (0,634 мг, 2,96 мкмоль, 0,15 экв.). Смесь перемешивали при 23 °С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235057, НОММ 20000) и затем подвергали диализу с применением 50 мМ РВ-буфера, рН 6,8, в течение 24 ч (4 замены, каждая по 600 мл) с получением раствора окисленного PS-18C. После диализа добавляли ДМСО с получением PS-18C в 10% ДМСО с 50 мМ РВ-буфера, рН 6,8.PS-18C powder (20 mg, 19.76 μmol) was dissolved in 3 ml of aqueous solution (10 mM sodium acetate solution, pH 4.5). To this solution was added 63.4 μl of NaIO ₄ solution (0.634 mg, 2.96 μmol, 0.15 eq.). The mixture was stirred at 23°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235057, HOMM 20000) and then dialyzed using 50 mM PB- buffer, pH 6.8, for 24 hours (4 changes, each 600 ml) to obtain a solution of oxidized PS-18C. After dialysis, DMSO was added to obtain PS-18C in 10% DMSO with 50 mM RT buffer, pH 6.8.

Мол. NaIO₄ Mol. NaIO ₄ ЭКВ. EQ. PS 18С (мг) PS 18C (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Выход (%) Exit (%) PS PS 0,15 0.15 20 20 4 4 3705 3705 7,05 7.05 75 75

Конечная концентрация PS: 3,75 мг/мл.Final PS concentration: 3.75 mg/ml.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 18С (15 мг, 14,8 мкмоль, 4,4 мл в 10% ДМСО 50 мМ РВ, рН 6,8) добавляли раствор DBCO-PEG4-NH2 (7,76 мг в 77,6 мкл ДМСО; 14,8 мкмоль, 10 экв.) при 25°С. Затем реакционную смесь перемешивали при 25 °С в течение 60 мин, по истечении этого времени добавляли раствор цианоборогидрида натрия (0,93 мг в 93 мкл воды; 14,8 мкмоль, 10 экв.) и продолжали перемешивание в течение 24 ч при 25 °С. Затем реакционную смесь переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A- Lyzer G2, каталожный номер G235057, НОММ 20000) и затем подвергали диализу, используя 4 замены 20% этанола в 50 мМ РВ-буфере с последующими 3 заменами 50 мМ РВ-буфера, с получением DBCO-производного типа 18С.To a solution of oxidized PS type 18C (15 mg, 14.8 µmol, 4.4 ml in 10% DMSO 50 mM PB, pH 6.8) was added a solution of DBCO-PEG4-NH2 (7.76 mg in 77.6 µl DMSO ; 14.8 µmol, 10 equiv.) at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25 °C for 60 min, after which time a solution of sodium cyanoborohydride (0.93 mg in 93 μl water; 14.8 μmol, 10 eq.) was added and stirring was continued for 24 h at 25 ° WITH. The reaction mixture was then transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235057, HOMM 20000) and then dialyzed using 4 changes of 20% ethanol in 50 mM PB buffer followed by 3 changes of 50 mM PB -buffer to obtain DBCO-derived type 18C.

Окисленный PS 18С (мг) Oxidized PS 18C (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 15 15 5 5 2460,4 2460.4 75,12 75.12 3,05 3.05 83 83 350 350

PS 18C-DBC0: 6 мг (с 60 мг сахарозы) белого порошка.PS 18C-DBC0: 6 mg (with 60 mg sucrose) white powder.

DBCO: 3%.DBCO: 3%.

Концентрация eCRM: 6,5 мг/мл.eCRM concentration: 6.5 mg/ml.

Конечная концентрация PS: 2 мг/мл.Final PS concentration: 2 mg/ml.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (0,615 мл) добавляли к DBCO-производному 18С (6 мг белого порошка, предварительно растворенного в 3 мл воды, 5,9 мкмоль), чтобы обеспечить массовое соотношение PS 18C:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (23°С) в течение 17 ч. Затем смесь помещали в инкубатор (37°С) на 3 ч. После реакции смесь разбавляли в 2 раза 0,9% раствором хлорида натрия и восстанавливали борогидридом натрия (1,12 мг в 112 мкл воды; 29,64 мкмоль, 50 экв.) в течение 3 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (Spectrum Lab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235072, НОММ 300000) и затем подвергали диализу против ФСБ с рН 7 в течение 24 ч (3 замены, каждая по 1000 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,45 мкм и 0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 18С PS-CRM.A solution of azide-functionalized eCRM (0.615 mL) was added to the DBCO derivative of 18C (6 mg white powder pre-dissolved in 3 mL water, 5.9 μmol) to provide a PS 18C:CRM mass ratio of 1.5:1 (wt. /wt.). The reaction mixture was stirred gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (23°C) for 17 hours. The mixture was then placed in an incubator (37°C) for 3 hours. After the reaction, the mixture was diluted 2 times with a 0.9% solution sodium chloride and reduced with sodium borohydride (1.12 mg in 112 μL water; 29.64 μmol, 50 eq.) for 3 h. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a prewashed dialysis tube (Spectrum Lab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235072, HOMM 300000) and then dialyzed against PBS with pH 7 for 24 hours (3 replacements, each 1000 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.45 μm and 0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 18C PS-CRM conjugate solution.

- 79 044044- 79 044044

PS 18С- DBCO (мг) PS 18C- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Соотн. PS: CRM CJD Ratio PS: CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SEC-MALS (МДа) (фильтрованный через 0,22 мкм фильтр) SEC-MALS (MDa) (filtered through 0.22 µm filter) 6 6 4 4 10 10 0,42 0.42 70 70 0,15 0.15 2,65:1 2.65:1 14,80 14.80 8,25 8.25

Пример 30: Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 19A с eCRM из табл. 2.Example 30: Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 19A with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 19А: 90% (антрон).PS type 19A purity: 90% (anthrone).

Мол. масса: 614,44.Mol. weight: 614.44.

Раствор NaIO₄ в воде (5,69 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (5.69 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-19A (22,10 мг, скорректировано до 90%, 19,89 мг, 32,37 мкмоль) растворяли в 11,05 мл водного раствора (7,73 мл воды и 3,32 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 304 мкл раствора NaIO₄ (1,73 мг, 8,09 мкмоль, 0,25 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (10 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-19A.PS-19A powder (22.10 mg, corrected to 90%, 19.89 mg, 32.37 µmol) was dissolved in 11.05 ml of aqueous solution (7.73 ml of water and 3.32 ml of 0.2 M acetate buffer , pH 5.5). To this solution was added 304 μl of NaIO ₄ solution (1.73 mg, 8.09 μmol, 0.25 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) using 6 changes (10 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS- 19A.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 19А (мг) PS 19A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Antron (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantitative research) aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,25 0.25 22,10 22.10 2,72 2.72 11148 11148 Н,5 N.5 6,1 6.1 99,39 99.39

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 19А (17,14 мг, 27,9 мкмоль, 2,50 мл воды) добавляли буферный раствор (1,0 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,01), ДМСО (0,4 мл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (14,61 мг в 190 мкл ДМСО; 27,9 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 70,2 мкл раствора цианоборогидрида натрия (15,6 мг в 313 мкл воды; 55,8 мкмоль, 20 экв.) и продолжали перемешивать в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 105 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата), затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и после этого подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 19А. К этому раствору (3,12 мл, 11,4 мг) добавляли раствор сахарозы (114 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,70 мг 19А DBCO и 57 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 19A (17.14 mg, 27.9 µmol, 2.50 ml water) was added a buffer solution (1.0 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.01), DMSO (0.4 ml) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (14.61 mg in 190 µl DMSO; 27.9 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 70.2 μl of sodium cyanoborohydride solution (15.6 mg in 313 μl of water; 55.8 μmol, 20 eq.) was added and continued stirring for 2 days at 25°C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 105 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 equiv.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate), then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 19A. To this solution (3.12 ml, 11.4 mg) was added a solution of sucrose (114 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain two samples of white powder. Each sample contained 5.70 mg of 19A DBCO and 57 mg of sucrose for use in the following conjugation reaction.

Окисленный PS 19А (мг) Oxidized PS 19A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Antron (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 17,14 17.14 4,87 4.87 5976 5976 0,482x4 0.482x4 197,76 197.76 3,31 3.31 105 105 139 139

3. Конъюгация производного PS 19A-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 19A-DBCO with eCRM.

PS 19A-DBCO: 5,7 мг (с 57 мг сахарозы) белого порошка.PS 19A-DBCO: 5.7 mg (with 57 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 3,31%.%DBCO: 3.31%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (0,49 мл) добавляли к DBCO-производному 19А (5,7 мг белого порошка с 57 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS19A:CRM равное 1,8:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-ALyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 19А PSCRM.A solution of azide-functionalized eCRM (0.49 mL) was added to DBCO derivative 19A (5.7 mg white powder with 57 mg sucrose) to provide a PS19A:CRM mass ratio of 1.8:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-ALyzer G2, catalog number G235060, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain PSCRM conjugate solution 19A.

- 80 044044- 80 044044

PS 19А- DBCO (мг) PS 19A- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,7 5.7 3,185 3.185 5,42 5.42 0,62 0.62 70 70 0,40 0.40 61 61 1,55:1 1.55:1 25,23 25.23 1 1

Пример 31. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 19А с eCRM из табл. 2.Example 31. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 19A with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Мол. масса: 614,44.Mol. weight: 614.44.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-19A (20,83 мг, скорректировано до 90%, 18,75 мг, 30,5 мкмоль) растворяли в 9,5 мл водного раствора (6,5 мл воды и 3 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 305 мкл раствора NaIO₄ (1,63 мг, 7,62 мкмоль, 0,25 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (10 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-19A.PS-19A powder (20.83 mg, adjusted to 90%, 18.75 mg, 30.5 µmol) was dissolved in 9.5 ml of aqueous solution (6.5 ml of water and 3 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5). To this solution was added 305 μl of NaIO ₄ solution (1.63 mg, 7.62 μmol, 0.25 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) using 6 changes (10 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS- 19A.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 19А (мг) PS 19A (mg) Объем после Volume after Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. Oxidation (%, quantity) Выход PS (%) PS Output (%) Примечание Note ОЧИСТКИ (мл) CLEANING (ml) иссл. альдегидов) research aldehydes) 0,25 0.25 20,83 20.83 2,95 2.95 9858 9858 7,2 7.2 4,2 4.2 95,32 95.32 Нет No

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 19А (17,57 мг, 28,59 мкмоль, 2,90 мл воды) добавляли буферный раствор (0,87 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,01), ДМСО (0,7 мл) и раствор DBCO-PEG4-NH2 (14,97 мг в 306 мкл ДМСО; 28,59 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 79 мкл раствора цианоборогидрида натрия (9,39 мг в 200 мкл воды; 57,2 мкмоль, 20 экв.) и продолжали перемешивать в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 110 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата), затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и после этого подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 19А. К этому раствору (3,56 мл, 11,9 мг) добавляли раствор сахарозы (120 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,95 мг 19А DBCO и 60 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 19A (17.57 mg, 28.59 µmol, 2.90 ml water) was added a buffer solution (0.87 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.01), DMSO (0.7 ml) and DBCO-PEG4-NH2 solution (14.97 mg in 306 µl DMSO; 28.59 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 79 μl of sodium cyanoborohydride solution (9.39 mg in 200 μl water; 57.2 μmol, 20 eq.) was added and continued stirring for 2 days at 25°C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 110 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 equiv.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate), then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 19A. To this solution (3.56 ml, 11.9 mg) was added a solution of sucrose (120 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain two samples of white powder. Each sample contained 5.95 mg of 19A DBCO and 60 mg of sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный PS 19А (мг) Oxidized PS 19A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 17,57 17.57 3,76 3.76 5424 5424 0,831x3 0.831x3 254,1 254.1 4,68 4.68 71 71 111 111

PS 19A-DBCO: 5,95 мг (с 60 мг сахарозы) белого порошка.PS 19A-DBCO: 5.95 mg (with 60 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 4,68%.%DBCO: 4.68%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (0,51 мл) добавляли к DBCO-производному 19А (5,95 мг белого порошка с 60 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS19A:CRM равное 1,8:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Затем смесь помещали в печь (37°С) на 2 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235071, НОММ 100000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 19А PS-CRM.A solution of azide-functionalized eCRM (0.51 mL) was added to DBCO derivative 19A (5.95 mg white powder with 60 mg sucrose) to provide a PS19A:CRM mass ratio of 1.8:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The mixture was then placed in an oven (37°C) for 2 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235071, HOMM 100000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain PS-CRM conjugate solution 19A.

- 81 044044- 81 044044

PS 19А- DBCO (мг) PS 19A- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,95 5.95 3,305 3.305 6,821 6,821 0,53 0.53 61 61 0,314 0.314 65 65 1,68:1 1.68:1 9,48 9.48 0,752 0.752

Пример 32. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 19F с eCRM из табл. 2.Example 32. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 19F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 19F: 90,7% (антрон).PS type 19F purity: 90.7% (anthrone).

Мол. масса: 614,44.Mol. weight: 614.44.

Раствор NaIO₄ в воде (5,21 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (5.21 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-19F (22,0 мг, 35,8 мкмоль) растворяли в 13,75 мл водного раствора (11 мл воды и 2,75 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 117 мкл раствора NaIO₄ (0,61 мг, 2,86 мкмоль, 0,08 экв.). Смесь перемешивали при 4°С в холодильнике в течение 17 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) 10 мМ фосфатного буфера, рН 6,7, с получением раствора окисленного PS-19F.PS-19F powder (22.0 mg, 35.8 μmol) was dissolved in 13.75 ml of aqueous solution (11 ml of water and 2.75 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5). To this solution was added 117 μl of NaIO ₄ solution (0.61 mg, 2.86 μmol, 0.08 eq.). The mixture was stirred at 4°C in the refrigerator for 17 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml), using 6 changes (12 ml) of 10 mM phosphate buffer, pH 6, 7 to obtain a solution of oxidized PS-19F.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 19F (мг) PS 19F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity research aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,08 0.08 22,0 22.0 2,89 2.89 8786,24 8786.24 5,56 5.56 Не данных No data 99,39 99.39

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 19F (13,7 мг, 22,3 мкмоль, 2,50 мл воды) добавляли буферный раствор (1,0 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,0), ДМСО (0,483 мл) и раствор DBCO-PEG-4-NH2 (11,68 мг в 117 мкл ДМСО; 22,3 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 70,2 мкл раствора цианоборогидрида натрия (2,8 мг в 280 мкл воды; 44,6 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение ночи при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (500 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 84 мкл раствора борогидрида натрия (0,01 мг/мкл, 10 экв.) в воде. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (5x12 мл этилацетата), затем переносили в ультрацентрифугу AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и после этого подвергали диализу, используя 5 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами 5 мМ фосфатного буфера с рН 7,0 (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 19F. К этому раствору (1,11 мл, 7,0 мг) добавляли раствор сахарозы (70 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две порции по 4 мг и 3 мг каждая и лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Эти лиофилизированные образцы 19F DBCO использовали в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 19F (13.7 mg, 22.3 µmol, 2.50 ml water) was added a buffer solution (1.0 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.0), DMSO (0.483 ml) and DBCO-PEG-4-NH2 solution (11.68 mg in 117 µl DMSO; 22.3 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 70.2 μl of sodium cyanoborohydride solution (2.8 mg in 280 μl of water; 44.6 μmol, 20 eq.) was added and stirred overnight at 25°C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (500 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 84 μl of sodium borohydride solution (0.01 mg/μl, 10 eq.) in water. After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (5x12 ml ethyl acetate), then transferred to an AMICON ultracentrifuge (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 5 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of 5 mM phosphate buffer pH 7.0 (12 ml each) to obtain DBCO derivative type 19F. To this solution (1.11 ml, 7.0 mg) was added a solution of sucrose (70 mg in 1 ml of water). The combination solution was divided into two portions of 4 mg and 3 mg each and lyophilized to obtain two samples of white powder. These lyophilized 19F DBCO samples were used in the following conjugation reaction.

Окисленный PS 19F (мг) Oxidized PS 19F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO(%) Inclusion DBCO(%) Выход PS- DBCO (%) Exit PS- DBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 13,7 13.7 1,92 1.92 1714 1714 0,920x4 0.920x4 1714 1714 5Д4 5D4 88 88 93 93

3. Конъюгация производного PS 19F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 19F-DBCO with eCRM.

PS 19F-DBCO: 4,0 мг (с 40 мг сахарозы) белого порошка.PS 19F-DBCO: 4.0 mg (with 40 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 5,14%.%DBCO: 5.14%.

Концентрация CRM: 5,0 мг/мл раствор.CRM concentration: 5.0 mg/ml solution.

PS: CRM (входное соотношение): 1,6:1.PS: CRM (input ratio): 1.6:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (0,5 мл) добавляли к DBCO-производному 19F (4,0 мг белого порошка с 40 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS19F:CRM равное 1,6:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч и дополнительно в течение 1 ч при 37°С. Добавляли 42 мкл азида натрия (0,42 мг, 1 эквивалент). Через 30 мин смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 2 дней (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 19F PS-CRM.A solution of azide-functionalized eCRM (0.5 mL) was added to DBCO derivative 19F (4.0 mg white powder with 40 mg sucrose) to provide a PS19F:CRM mass ratio of 1.6:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours and an additional 1 hour at 37°C. 42 μl of sodium azide (0.42 mg, 1 equivalent) was added. After 30 min, the conjugated PS-CRM mixture was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMM 300000) and then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution for 2 days (8 replacements, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 19F PS-CRM conjugate solution.

- 82 044044- 82 044044

PS 19F- DBCO (мг) PS 19F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM Ratio PS:CRM Свободный PS (%) Free PS (%) SEC- MALS (МДа) SEC- MALS (Yeah) 4,0 4.0 2,5 2.5 3,75 3.75 0,84 0.84 79 79 0,52 0.52 77 77 1,63: 1 1.63:1 16,55 16.55 1,89 1.89

Пример 33. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 19F с eCRM из табл. 2.Example 33. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 19F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Мол. масса PS типа 19F: 613.Mol. weight PS type 19F: 613.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-19F (10 мг, 16,31 мкмоль) растворяли в 2 мл водного раствора (10 мМ раствор ацетата натрия, рН 4,5). К этому раствору добавляли 34,9 мкл раствора NaIO₄ (0,349 мг, 1,63 мкмоль, 0,1 экв.). Смесь перемешивали при 4°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235057, НОММ 20000) и затем подвергали диализу против 50 мМ РВ-буфера с рН 6,8 в течение 24 ч (4 замены, каждая по 600 мл), с получением раствора окисленного PS-19F. После диализа добавляли ДМСО с получением PS-19F в 10% ДМСО с 50 мМ РВ-буфера, рН 6,8.___________________PS-19F powder (10 mg, 16.31 μmol) was dissolved in 2 ml of aqueous solution (10 mM sodium acetate solution, pH 4.5). To this solution was added 34.9 μl of NaIO ₄ solution (0.349 mg, 1.63 μmol, 0.1 eq.). The mixture was stirred at 4°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was transferred to a pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235057, HOMM 20000) and then dialyzed against 50 mM RT buffer with pH 6.8 for 24 hours (4 replacements, each 600 ml), to obtain a solution of oxidized PS-19F. After dialysis, DMSO was added to obtain PS-19F in 10% DMSO with 50 mM PB buffer, pH 6.8.___________________

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 19F (мг) PS 19F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (М) Antron (M) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Выход PS (%) PS Output (%) Примечание Note 0,1 0.1 10 10 2 2 6769 6769 9,0 9.0 83 83 Нет No

Конечная концентрация PS: 3,32 мг/мл.Final PS concentration: 3.32 mg/ml.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 19F (8,3 мг, 13,53 мкмоль, 2,5 мл в 10% ДМСО 50 мМ РВ, рН 6,8) добавляли раствор DBCO-PEG4-NH2 (7,08 мг в 70,84 мкл ДМСО; 13,53 мкмоль, 10 экв.) при 25°С. Затем реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 60 мин, по истечении этого времени добавляли раствор цианоборогидрида натрия (0,85 мг в 85 мкл воды; 13,53 мкмоль, 10 экв.) и продолжали перемешивание в течение 24 ч при 25°С. Затем реакционную смесь переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235057, НОММ 20000) и затем подвергали диализу, используя 4 замены 20% этанола в 50 мМ РВ-буфере с последующими 3 заменами 50 мМ РВ-буфера, с получением DBCO-производного типа 19F.A solution of DBCO-PEG4-NH2 (7.08 mg in 70.84 µl DMSO; 13.53 µmol, 10 eq.) at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 60 minutes, after this time a solution of sodium cyanoborohydride (0.85 mg in 85 μl of water; 13.53 μmol, 10 eq.) was added and stirring was continued for 24 hours at 25° WITH. The reaction mixture was then transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235057, HOMM 20000) and then dialyzed using 4 changes of 20% ethanol in 50 mM PB buffer followed by 3 changes of 50 mM PB -buffer to obtain DBCO-derived type 19F.

Окисленный PS 19F (мг) Oxidized PS 19F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 8,3 8.3 4 4 3385 3385 235,4 235.4 7,15 7.15 78 78 186 186

PS 19F-DBCO: 6 мг (с 60 мг сахарозы) белого порошка.PS 19F-DBCO: 6 mg (with 60 mg sucrose) white powder.

DBCO: 7%.DBCO: 7%.

PS:CRM (входное соотношение): 2:1.PS:CRM (input ratio): 2:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (1,15 мл) добавляли к DBCO-производному 19F (6 мг белого порошка с 60 мг сахарозы, 9,7 мкмоль), чтобы обеспечить массовое соотношение PS 19F:CRM равное 2:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (23°С) в течение 17 ч. Затем смесь помещали в инкубатор (37°С) на 3 ч. После реакции смесь разбавляли в 2 раза 0,9% раствором хлорида натрия и восстанавливали борогидридом натрия (1,849 мг в 184,9 мкл воды; 48,9 мкмоль, 50 экв.) в течение 3 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235071, НОММ 100000) и затем подвергали диализу с применением ФСБ, рН 7, в течение 24 ч (3 замены, каждая по 1000 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 19F PS-CRM.A solution of azide-functionalized eCRM (1.15 mL) was added to the DBCO derivative of 19F (6 mg white powder with 60 mg sucrose, 9.7 μmol) to provide a PS 19F:CRM mass ratio of 2:1 (w/w). ). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (23°C) for 17 hours. The mixture was then placed in an incubator (37°C) for 3 hours. After the reaction, the mixture was diluted 2 times with a 0.9% solution sodium chloride and reduced with sodium borohydride (1.849 mg in 184.9 μL water; 48.9 μmol, 50 eq.) for 3 h. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a prewashed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2 , catalog number G235071, NOMM 100000) and then dialyzed using PBS, pH 7, for 24 hours (3 replacements, each 1000 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 19F PS-CRM conjugate solution.

- 83 044044- 83 044044

PS 19F- DBCO (мг) PS 19F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS: CRM CJD Ratio PS: CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 6 6 3 3 12 12 0,241 0.241 48 48 0,166 0.166 66 66 1,5:1 1.5:1 15,12 15.12 736 (1,05 МДа- 414 кДа) 736 (1.05 MDa- 414 kDa)

Пример 34. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 20 с eCRM из табл. 2.Example 34. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 20 with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 20: 68% (антрон).PS type 20 purity: 68% (anthrone).

Мол. масса: 1157,9 г-моль^-1.Mol. mass: 1157.9 g-mol ^-1 .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 20 (30,1 мг, 26 мкмоль) растворяли в 15,00 мл водного раствора (11,25 мл воды и 3,75 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом 50 мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 160 мкл раствора NaICO₄ (1,11 мг, 5,2 мкмоль, 0,20 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в водяную баню при 25°С. Смесь перемешивали при 25°С. Через 18 ч реакционную смесь подвергали диализу с применением трех центрифужных фильтрующих устройств AMICON® Ultra-15 (НОММ 30 кДа; 15 мл), используя 5 замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-20.PS type 20 powder (30.1 mg, 26 μmol) was dissolved in 15.00 mL of aqueous solution (11.25 mL of water and 3.75 mL of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a polystyrene sample tube with a volume of 50 ml with stirrer. After dissolving the PS, 160 μl of NaICO ₄ solution (1.11 mg, 5.2 μmol, 0.20 mol equiv.) was added. The reaction tube was wrapped in foil and placed in a water bath at 25°C. The mixture was stirred at 25°C. After 18 h, the reaction mixture was dialyzed using three AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 30 kDa; 15 mL) using 5 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain a solution of oxidized PS-20.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 20 (мг) PS 20 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колин. иссл. антрона (мкМ) Colin. research anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) Примечание Note 0,20 0.20 30,1 30.1 2,6 2.6 6254,57 6254.57 59,06 59.06 10,34 10.34 63 63 - -

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

PS20-OX (11,7 мг, 10,1 мкмоль, 1,61 мл) добавляли в фосфатный буфер (0,600 мл, 200 мМ, рН 6,0), к которому был добавлен DBCO-PEG4-NH2 (1,0 экв., 523 г-моль^-1 в ДМСО, 33 мг/мл, 160 мкл) и дополнительное количество ДМСО (207 мкл). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 25 мин перед добавлением раствора цианоборогидрида натрия (2 экв., 52,5 мг/мл, 24 мкл) и перемешивали в течение одного дня. После нейтрализации 1 экв. раствора борогидрида натрия реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл) и барботировали без растворителя. DBCO-производное дважды очищали с помощью блоков для центробежного диализа (Amicon, НОММ 30 кДа), используя 5 замен 20% этанола в воде с последующими 3 заменами воды каждый раз (каждая по 12 мл), с получением DBCOпроизводного типа 20. К этому раствору (2,09 мл, 13,65 мг) добавляли раствор сахарозы (136,5 мг в 1,37 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 6,0 мг 20-DBCO и 60 мг сахарозы для использования в реакции конъюгации.PS20-OX (11.7 mg, 10.1 µmol, 1.61 ml) was added to phosphate buffer (0.600 ml, 200 mM, pH 6.0), to which DBCO-PEG4-NH2 (1.0 equiv) was added ., 523 g-mol ^-1 in DMSO, 33 mg/ml, 160 µl) and additional DMSO (207 µl). The reaction mixture was stirred at 25°C for 25 min before adding sodium cyanoborohydride solution (2 equiv., 52.5 mg/ml, 24 μl) and stirring for one day. After neutralization 1 eq. sodium borohydride solution, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml) and bubbled without solvent. The DBCO derivative was purified twice using centrifugal dialysis units (Amicon, HOMM 30 kDa) using 5 changes of 20% ethanol in water followed by 3 changes of water each time (12 ml each) to obtain DBCO derivative type 20. To this solution (2.09 ml, 13.65 mg), a sucrose solution (136.5 mg in 1.37 ml water) was added. The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 6.0 mg 20-DBCO and 60 mg sucrose for use in the conjugation reaction.

PS 20ох (мг) PS 20ox (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS кДа SEC- MALS kDa И,7 I,7 2,09 2.09 1112,43 1112.43 0,336x4 0.336x4 29,04 29.04 2,6 2.6 123 123 610 610

3. Конъюгация производного PS 20-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 20-DBCO with eCRM.

PS 20-DBCO: 5,0 мг (с 50 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 20-DBCO: 5.0 mg (with 50 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 2,0%.%DBCO: 2.0%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

20-DBCO растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (2,684 мл, профильтрован через фильтр с размером пор 0,22 мкм), фосфатном буфере (рН 7,0, 0,5 М, 0,160 мл) и ДМСО (0,400 мл). Раствор азидоCRM (5,29 мг/мл, 0,756 мл) добавляли по каплям, чтобы обеспечить входное соотношение PS20:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 36 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Конъюгат CRM переносили в20-DBCO was dissolved in 0.9% sodium chloride (2.684 ml, filtered through a 0.22 μm filter), phosphate buffer (pH 7.0, 0.5 M, 0.160 ml) and DMSO (0.400 ml) . AzidoCRM solution (5.29 mg/mL, 0.756 mL) was added dropwise to provide a PS20:CRM input ratio of 1.5:1 (w/w). The solution was mixed very carefully by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 36 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The CRM conjugate was transferred to

- 84 044044 предварительно промытую пробирку для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (4 замены, каждая по 1 л). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением стерильного раствора конъюгата 20-CRM.- 84 044044 pre-washed dialysis tube (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (4 changes, each 1 L). The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a sterile solution of the 20-CRM conjugate.

PS 20DBCO (мг) PS 20DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJF Ratio PS:CRM C.J.F. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 6,0 6.0 4,0 4.0 7,00 7.00 0,640 0.640 75 75 0,366 0.366 64 64 1,75:1 1.75:1 нпко npko 1,224 1.224

Пример 35. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 22F с eCRM из табл. 2.Example 35. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 22F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 22F: 89% (антрон).PS type 22F purity: 89% (anthrone).

Мол. масса: 996,88.Mol. weight: 996.88.

Раствор NaIO₄ в воде (5 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (5 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 22F (30,2 мг, 30,3 мкмоль) растворяли в 10,5 мл воды и 4,5 мл 200 мМ ацетатного буфера (рН 5,26) и 132 мкл раствора NaIO₄ (0,65 мг, 3,03 мкмоль, 0,1 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч, по истечении этого времени окисленный образец очищали с помощью ультрацентрифуги AMICON (НОММ 100 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS-22F.PS type 22F powder (30.2 mg, 30.3 µmol) was dissolved in 10.5 ml water and 4.5 ml 200 mM acetate buffer (pH 5.26) and 132 µl NaIO ₄ solution (0.65 mg, 3 .03 µmol, 0.1 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours, after which time the oxidized sample was purified using an AMICON ultracentrifuge (HOMM 100 kDa, 6-12 ml), using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water, to obtain a solution of oxidized PS- 22F.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 22F (мг) PS 22F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,10 0.10 30,2 30.2 3,351 3.351 7389,41 7389.41 20,02 20.02 3,3 3.3 81,73 81.73

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 22F (7,0 мг, 7,02 мкмоль, 0,956 мл воды) добавляли буферный раствор (0,525 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,0), ДМСО (151 мкл) и раствор DBCO-PEG4-NH2 (3,67 мг в 112 мкл ДМСО; 7,02 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 17 мкл раствора цианоборогидрида натрия (0,88 мг в 17 мкл воды; 14,06 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь разбавляли фосфатным буфером (250 мкл 200 мМ раствора, рН 6) перед добавлением 9 мкл раствора борогидрида натрия (31 мг/мл, 10 экв.) в воде. Через 30 мин реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (4x5 мл). Экстракт переносили в ультрацентрифужный фильтр AMICON (НОММ 100 кДа, 6-12 мл) и затем подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл). Результаты SEC/ВЭЖХ указывали на присутствие свободного DBCO, поэтому образец подвергли повторному диализу, используя 3 замены 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 22F. К этому раствору (2,35 мл, 5,2 мг) добавляли раствор сахарозы (52 мг в 0,520 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две части и каждую лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Образец содержал 2,4 мг и 2,8 мг 22F DBCO и 24 мг и 28 мг сахарозы, соответственно, для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 22F (7.0 mg, 7.02 µmol, 0.956 ml water) was added a buffer solution (0.525 ml of 200 mM phosphate buffer, pH 6.0), DMSO (151 µl) and DBCO-PEG4-NH2 solution (3.67 mg in 112 μL DMSO; 7.02 μmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 17 µl of sodium cyanoborohydride solution (0.88 mg in 17 µl water; 14.06 µmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was diluted with phosphate buffer (250 μl of a 200 mM solution, pH 6) before adding 9 μl of a solution of sodium borohydride (31 mg/ml, 10 eq.) in water. After 30 min, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate (4x5 ml). The extract was transferred to an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 100 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml) followed by 3 changes of water (each 12 ml). The SEC/HPLC results indicated the presence of free DBCO, so the sample was dialyzed again using 3 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml) followed by 3 changes of water (each 12 ml), obtaining DBCO-derived type 22F. To this solution (2.35 ml, 5.2 mg) was added a solution of sucrose (52 mg in 0.520 ml water). The combined solution was divided into two parts and each was lyophilized to obtain two samples of white powder. The sample contained 2.4 mg and 2.8 mg of 22F DBCO and 24 mg and 28 mg of sucrose, respectively, for use in the following conjugation reaction.

Окисленный PS 22F (мг) Oxidized PS 22F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 7,0 7.0 2,53 2.53 739,74 739.74 0,144x3 0.144x3 27,57 27.57 1,24 1.24 80 80 844 844

3. Конъюгация производного PS 22F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 22F-DBCO with eCRM.

PS 22F-DBCO: 2,4 мг (с 24 мг сахарозы) белого порошка.PS 22F-DBCO: 2.4 mg (with 24 mg sucrose) white powder.

%DBCO:1,24%.%DBCO:1.24%.

PS:CRM (входное соотношение): 1,4:1.PS:CRM (input ratio): 1.4:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 22F (2,4 мг белого порошка с 24 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (0,075 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,142 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS22F:CRM равное 1,4:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной тем- 85 044044 пературе (20°С) в течение 48 ч. Добавляли раствор азида натрия (16 мкл, 10 мг/мл в воде). Через 30 мин смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (5 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 22F PS-CRM.DBCO derivative 22F (2.4 mg white powder with 24 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride solution (0.075 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.142 mL solution) was added to provide a PS22F:CRM mass ratio of 1.4:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 48 hours. Sodium azide solution (16 µl, 10 mg/ml in water) was added. After 30 min, the conjugated PS-CRM mixture was transferred to a prewashed dialysis device (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, cat. no. G235060, HOMM 300000) and then dialyzed using 0.9% sodium chloride solution for 24 h (5 replacements, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 22F PS-CRM conjugate solution.

PS 22F- DBCO (мг) PS 22F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 2,4 2.4 1,71 1.71 3,834 3.834 0,29 0.29 55 55 0,37 0.37 49 49 1,53 1.53 20,6 20.6 2,42 2.42

Пример 36. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 23F с eCRM из табл. 2.Example 36. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 23F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 23F: 85% (антрон).PS type 23F purity: 85% (anthrone).

Мол. масса: 792,62.Mol. weight: 792.62.

Раствор NaIO₄ в воде (5,86 мг/мл).A solution of NaIO ₄ in water (5.86 mg/ml).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS-23F (20,21 мг, скорректировано до 85%, 17,18 мг, 26,7 мкмоль) растворяли в 10 мл водного раствора (7,5 мл воды и 2,5 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5). К этому раствору добавляли 119 мкл раствора NaIO₄ (0,695 мг, 4,0 мкмоль, 0,15 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 4 ч. Окисленный образец затем очищали с помощью ультрацентрифужного фильтра AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл), используя 6 замен (12 мл) воды категории ВЭЖХ, с получением раствора окисленного PS- 23F.PS-23F powder (20.21 mg, adjusted to 85%, 17.18 mg, 26.7 µmol) was dissolved in 10 ml of aqueous solution (7.5 ml of water and 2.5 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5). To this solution was added 119 μl of NaIO ₄ solution (0.695 mg, 4.0 μmol, 0.15 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 4 hours. The oxidized sample was then purified using an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) using 6 changes (12 ml) of HPLC grade water to obtain a solution of oxidized PS-23F.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 23F (мг) PS 23F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) Примечание Note 0,15 0.15 20,21 20.21 2,41 2.41 7967 7967 4,11 4.11 3,51 3.51 88 88 Нет No

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 23F (13,51 мг, 17,0 мкмоль, 2,14 мл воды) добавляли буферный раствор (0,85 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,01), ДМСО (310 мкл) и раствор DBCO-PEG4-NH2 (8,93 мг в 170 мкл ДМСО; 17,0 мкмоль, 10 экв.), все при температуре 25°С. Реакционную смесь затем перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 42 мкл раствора цианоборогидрида натрия (6,1 мг в 120 мкл воды; 34,0 мкмоль, 20 экв.) и перемешивали в течение 2 дней при 25°С. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл этилацетата) и затем переносили в ультрацентрифужный фильтр AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и после этого подвергали диализу, используя 6 замен 20% этанола (каждая по 12 мл) в воде с последующими 3 заменами воды (каждая по 12 мл), с получением DBCO-производного типа 23F. К этому раствору (7,58 мл, 13,8 мг) добавляли раствор сахарозы (138 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением трех образцов белого порошка. Каждый образец содержал 6,9 мг 23F DBCO и 69 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 23F (13.51 mg, 17.0 µmol, 2.14 ml water) was added a buffer solution (0.85 ml 200 mM phosphate buffer, pH 6.01), DMSO (310 µl) and DBCO-PEG4-NH2 solution (8.93 mg in 170 µl DMSO; 17.0 µmol, 10 eq.), all at 25°C. The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 42 μl of sodium cyanoborohydride solution (6.1 mg in 120 μl water; 34.0 μmol, 20 eq.) was added and stirred for 2 days at 25 °C. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate (3x20 ml ethyl acetate) and then transferred to an AMICON ultracentrifugal filter (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 6 changes of 20% ethanol (each 12 ml) in water followed by 3 changes water (each 12 ml), to obtain DBCO derivative type 23F. To this solution (7.58 ml, 13.8 mg) was added a solution of sucrose (138 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain three samples of white powder. Each sample contained 6.9 mg of 23F DBCO and 69 mg of sucrose for use in the following conjugation reaction.

Окисленный Oxidized Объем Volume Антрон Antron Дериватизация Derivatization Дериватизация Derivatization Включение Inclusion Выход Exit SEC- SEC- PS 23F (мг) PS 23F (mg) после очистки (мл) after cleaning (ml) (мкМ) (µM) DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO, absorbance at 309 nm DBCO (мкМ) DBCO (µM) DBCO (%) DBCO (%) PSDBCO (%) PSDBCO (%) MALS (кДа) MALS (kDa) 13,51 13.51 7,61 7.61 2292 2292 0,601x2 0.601x2 116,98 116.98 5,1 5.1 102 102 361 361

3. Конъюгация производного PS 23F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 23F-DBCO with eCRM.

PS 23F-DBCO: 6,90 мг белого порошка с 69 мг сахарозы.PS 23F-DBCO: 6.90 mg white powder with 69 mg sucrose.

%DBCO: 5,1%.%DBCO: 5.1%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Раствор функционализированного азидом eCRM (1,32 мл раствора) добавляли к DBCOпроизводному 23F (6,90 мг белого порошка с 69 мг сахарозы), чтобы обеспечить массовое соотношение PS23F:CRM равное 2:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 17 ч.A solution of azide-functionalized eCRM (1.32 mL solution) was added to DBCO derivative 23F (6.90 mg white powder with 69 mg sucrose) to provide a PS23F:CRM mass ratio of 2:1 (w/w). The reaction mixture was stirred gently by hand before being gently mixed on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 17 h.

- 86 044044- 86 044044

Затем смесь помещали в печь (37°С) на 3 ч. Смесь конъюгированных PS-CRM переносили в предварительно промытый фильтр для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, каталожный номер G235071,The mixture was then placed in an oven (37°C) for 3 hours. The conjugated PS-CRM mixture was transferred to a pre-washed dialysis filter (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, catalog number G235071,

НОММ 100000) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 24 ч (3 замены, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через фильтр Millex-HV (0,45 мкм, мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 23F PS-CRM.HOMM 100,000) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 24 hours (3 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through a Millex-HV filter (0.45 μm, mm polyethersulfone) to obtain a 23F PS-CRM conjugate solution.

PS 23F- DBCO (мг) PS 23F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 6,90 6.90 3,45 3.45 5,65 5.65 0,87 0.87 71 71 0,422 0.422 69 69 2,06:1 2.06:1 23,62 23.62 1,4 1.4

Пример 37. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 33F с eCRM из табл. 2.Example 37. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 33F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 33F: 75% (антрон).PS type 33F purity: 75% (anthrone).

Мол. масса: 973.Mol. weight: 973.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 33F (34,0 мг, 35,0 мкмоль) растворяли в 17,0 мл водного раствора (12,0 мл воды и 5,0 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом 50 мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 59 мкл раствора NaIO₄ (1,49 мг, 7,0 мкмоль, 0,20 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в водяную баню при 4°С. Смесь перемешивали при 4°С. Через 18 ч реакционную смесь подвергали диализу с применением трех центрифужных фильтрующих устройств AMICON® Ultra-15 (НОММ 100 кДа; 15 мл), используя 4 замены воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-33F.PS type 33F powder (34.0 mg, 35.0 μmol) was dissolved in 17.0 mL aqueous solution (12.0 mL water and 5.0 mL 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a polystyrene test tube. 50 ml samples with a stirrer. After dissolving the PS, 59 μl of NaIO ₄ solution (1.49 mg, 7.0 μmol, 0.20 mol equiv.) was added. The reaction tube was wrapped in foil and placed in a water bath at 4°C. The mixture was stirred at 4°C. After 18 h, the reaction mixture was dialyzed using three AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 100 kDa; 15 mL) using 4 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain a solution of oxidized PS-33F.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 33F (мг) PS 33F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,20 0.20 34,0 34.0 2,74 2.74 4637,58 4637.58 47,90 47.90 7,62 7.62 36 36

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 33F (11,2 мг, 11,51 мкмоль, 2,49 мл) добавляли буферный раствор (0,114 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 6,0), раствор DBCO-PEG4-NH2 (6,039 мг в 200 мкл ДМСО; 6,33 мкмоль, 0,55 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 63 мкл раствора цианоборогидрида натрия (4,5 мг в 100 мкл воды; 34,54 мкмоль, 2,0 экв.). Реакционную смесь оборачивали в алюминиевую фольгу и продолжали перемешивать в водяной бане, установленной на 25°С, в течение 2 дней. Реакцию останавливали на второй день добавлением 44 мкл раствора борогидрида натрия (3,12 мг в 312 мкл воды; 11,51 мкмоль, 1,0 экв.). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (3x10 мл) и затем этилацетатом (3x10 мл). Экстракт барботировали N2 в течение 20 мин для удаления остаточного этилацетата и затем переносили в 2 центрифужных фильтрующих устройства AMICON® Ultra-15 (НОММ 100 кДа; 15 мл). Диализ осуществляли, выполняя три замены 3% раствора ДМСО (каждая по 15 мл), шесть замен 20% раствора этанола (каждая по 15 мл) и три замены воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением DBCO-производного 33F. К этому раствору (1,23 мл, 4,0 мг) добавляли раствор сахарозы (40 мг, 0,4 мл воды). Этот комбинированный раствор лиофилизировали с получением мелкодисперсного белого порошка. Образец PS33F DB хранили при 4°С до тех пор, пока он не потребовался для реакции конъюгации.To a solution of oxidized PS type 33F (11.2 mg, 11.51 µmol, 2.49 ml) was added a buffer solution (0.114 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 6.0), a solution of DBCO-PEG4-NH2 (6.039 mg in 200 µl DMSO; 6.33 µmol, 0.55 eq.). The reaction mixture was stirred at 25°C for 30 min, after which time 63 μl of sodium cyanoborohydride solution (4.5 mg in 100 μl of water; 34.54 μmol, 2.0 eq.) was added. The reaction mixture was wrapped in aluminum foil and continued to stir in a water bath set at 25°C for 2 days. The reaction was stopped on the second day by adding 44 μl of sodium borohydride solution (3.12 mg in 312 μl of water; 11.51 μmol, 1.0 eq.). After stirring for 30 minutes, the reaction mixture was extracted with dichloromethane (3x10 ml) and then ethyl acetate (3x10 ml). The extract was bubbled with N2 for 20 min to remove residual ethyl acetate and then transferred to 2 AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 100 kDa; 15 ml). Dialysis was carried out by performing three changes of 3% DMSO solution (each 15 ml), six changes of 20% ethanol solution (each 15 ml) and three changes of HPLC grade water (each 15 ml), to obtain the DBCO derivative 33F. To this solution (1.23 ml, 4.0 mg) was added a sucrose solution (40 mg, 0.4 ml water). This combination solution was lyophilized to obtain a fine white powder. The PS33F DB sample was stored at 4°C until required for the conjugation reaction.

Окисленный PS 33F (мг) Oxidized PS 33F (mg) Объем после очистки Volume after cleaning Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при Derivatization of DBCO, absorption at Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PS- DBCO Exit PS- DBCO SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) (мл) (ml) 309 нм 309 nm (%) (%) Н,2 N,2 2,44 2.44 1112,4 1112.4 0,390 0.390 32,85 32.85 3,0 3.0 71 71 1290 1290

3. Конъюгация производного PS 33F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 33F-DBCO with eCRM.

PS 33F-DBCO: 4 мг (с 40 мг сахарозы) белого порошка.PS 33F-DBCO: 4 mg (with 40 mg sucrose) white powder.

% DBCO: 3,0%.%DBCO: 3.0%.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 33F (4,0 мг белого порошка с 40 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (5,32 мл), фосфатном буфере с рН 7 (0,267 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,667 мл). Добавляли растворDBCO derivative 33F (4.0 mg white powder with 40 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (5.32 ml), phosphate buffer pH 7 (0.267 ml, 0.5 M) and DMSO (0.667 ml). Added solution

- 87 044044 функционализированного азидом eCRM (0,445 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS33F:CRM равное 1,5:1 (мас./мас.). Реакционную смесь осторожно перемешивали на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 19 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 50 мкл). Затем реакционную смесь разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия (7,0 мл) и переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab Float-ALyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000). Образец подвергали диализу в 0,9% растворе хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 33F PS-CRM.- 87 044044 azide functionalized eCRM (0.445 ml solution) to provide a PS33F:CRM mass ratio of 1.5:1 (w/w). The reaction mixture was gently stirred on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 19 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 50 μl). The reaction mixture was then diluted with 0.9% sodium chloride solution (7.0 mL) and transferred to a pre-washed dialysis device (SpectrumLab Float-ALyzer G2, catalog number G235060, HOMM 300000). The sample was dialyzed in 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 800 ml). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 33F PS-CRM conjugate solution.

PS 33F- DBCO (мг) PS 33F- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделен ие PS (%) PS allocation (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделен ие CRM (%) CRM Allocation (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свобо дный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 4,0 4.0 2,67 2.67 7,82 7.82 0,545 0.545 106 106 0,212 0.212 62 62 2,57 2.57 нпко npko 1,87 1.87

Пример 38. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 7F с eCRM из табл. 2.Example 38. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 7F with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 7F: 86% (антрон, CRB-21-20).PS type 7F purity: 86% (anthrone, CRB-21-20).

Мол. масса: 1227 г-моль¹.Mol. mass: 1227 g-mol ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид (19,5 мг, скорректировано до 86%, 16,8 мг, 13,7 мкмоль), растворяли в 3,9 мл воды. К этому раствору добавляли 4,58 мл воды и 0,293 мл натрий-ацетатного буфера (1,5 М, рН 5,4). Затем к перемешиваемому раствору добавляли 30 мкл раствора периодата натрия (300 мкг, 1,4 мкмоль, 0,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 22°С в течение 3 ч. Окисленный PS затем двукратно концентрировали с помощью центрифуги-концентратора (Amicon, HOMM 30 кДа). Затем буфер в концентрированном PS заменяли водой с применением колонок для гель-фильтрации (GE Healthcare PD-10, метод центрифугирования).Native polysaccharide (19.5 mg, adjusted to 86%, 16.8 mg, 13.7 µmol) was dissolved in 3.9 ml of water. To this solution were added 4.58 ml of water and 0.293 ml of sodium acetate buffer (1.5 M, pH 5.4). Then 30 μl of sodium periodate solution (300 μg, 1.4 μmol, 0.1 eq.) was added to the stirred solution. The reaction mixture was stirred at 22°C for 3 hours. The oxidized PS was then concentrated twice using a centrifuge concentrator (Amicon, HOMM 30 kDa). The buffer in concentrated PS was then replaced with water using gel filtration columns (GE Healthcare PD-10, centrifugation method).

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 7F (мг) PS 7F (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) Примечание Note ОД OD 16,8 16.8 4,0 4.0 3260 3260 6,2 6.2 Не определяли Not determined 95 95 Нет No

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К 7F-OX (1,9 мл 4,0 мг/мл; 7,6 мг, 6,2 мкмоль) добавляли 0,15 мл фосфата натрия (1 М, рН 6,3). Затем к перемешиваемому раствору добавляли 0,23 мл DBCO-PEG4-NH2 (27,1 мМ в ДМСО, партия 1730; 6,2 мкмоль, 1,0 экв.). После перемешивания в течение 5 мин к перемешиваемому раствору добавляли 0,039 мл NaCNBH₃ (20 мг/мл в воде; 12,4 мкмоль, 2,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 22°С в течение 40 ч. Затем к раствору добавляли 0,024 мл борогидрида натрия (10 мг/мл в воде; 6,3 мкмоль, 1,0 экв.). После перемешивания в течение 15 мин PS очищали путем замены буфера водой с помощью колонки для гель-фильтрации (колонки Thermo Zeba, HOMM 40 кДа).To 7F-OX (1.9 mL 4.0 mg/mL; 7.6 mg, 6.2 μmol) was added 0.15 mL sodium phosphate (1 M, pH 6.3). 0.23 mL of DBCO-PEG4-NH2 (27.1 mM in DMSO, lot 1730; 6.2 μmol, 1.0 eq.) was then added to the stirred solution. After stirring for 5 minutes, 0.039 mL of NaCNBH ₃ (20 mg/mL in water; 12.4 μmol, 2.0 eq.) was added to the stirred solution. The reaction mixture was stirred at 22°C for 40 hours. Then 0.024 ml of sodium borohydride (10 mg/ml in water; 6.3 µmol, 1.0 eq.) was added to the solution. After stirring for 15 min, PS was purified by buffer exchange with water using a gel filtration column (Thermo Zeba columns, HOMM 40 kDa).

Окисленный PS 7Р(мг) Oxidized PS 7P(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. антрона (мкМ) Quantity research anthrone (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм Derivatization of DBCO, absorption at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 7,6 7.6 2,3 2.3 2282 2282 0,14x2 0.14x2 111 111 4,8 4.8 85 85 175 175

3. Конъюгация производного PS 7F-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 7F-DBCO with eCRM.

PS 7F-DBCO: 2,8 мг (2,8 мг/мл в воде).PS 7F-DBCO: 2.8 mg (2.8 mg/ml in water).

% DBCO: 4,8%.%DBCO: 4.8%.

Концентрация CRM: 4,7 мг/мл раствор.CRM concentration: 4.7 mg/ml solution.

PS:CRM (входное соотношение): 1,6:1.PS:CRM (input ratio): 1.6:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К 7F-DBCO (1 мл 2,8 мг/мл в воде) в пробирке для центрифугирования объемом 5 мл добавляли 0,128 мл фосфата калия (0,5 М, рН 7,5). Затем к этому раствору добавляли 0,372 мл функционализированного азидом eCRM (4,7 мг/мл в 20 мМ фосфате калия, рН 7,1, 7,5% сахарозы) с получением входного массового соотношения 1,6:1 (мас./мас.). Раствор помещали на орбитальную качалку и качали (так, что раствор перемещался из конца в конец пробирки) в течение 16 ч при температуре 22°С. Затем конъюгат подвергали диализу в 0,9% хлориде натрия с применением диализной мембраны 300 кДа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, 1 мл) в течение 48 ч с заменами диализата (500 мл) через 1 ч и 4 ч. Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр (PallTo 7F-DBCO (1 mL 2.8 mg/mL in water) in a 5 mL centrifuge tube was added 0.128 mL potassium phosphate (0.5 M, pH 7.5). 0.372 mL of azide-functionalized eCRM (4.7 mg/mL in 20 mM potassium phosphate, pH 7.1, 7.5% sucrose) was then added to this solution to give an input mass ratio of 1.6:1 (w/w). ). The solution was placed on an orbital shaker and rocked (so that the solution moved from end to end of the tube) for 16 hours at a temperature of 22°C. The conjugate was then dialyzed in 0.9% sodium chloride using a 300 kDa dialysis membrane (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, 1 ml) for 48 h with dialysate changes (500 ml) after 1 h and 4 h. The dialyzed solution was filtered through a syringe filter (Pall

- 88 044044- 88 044044

Acrodisc Supor, 0,22 мкм, диаметром 13 мм) с получением раствора конъюгата 7F-CRM.Acrodisc Supor, 0.22 µm, 13 mm diameter) to obtain a 7F-CRM conjugate solution.

Пример 39. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 1 с eCRM из табл. 2.Example 39. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 1 with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Степень чистоты PS типа 1: 80% (количественное исследование уроновой кислоты).PS type 1 purity: 80% (uronic acid assay).

Мол. масса: 625 г-моль-¹.Mol. mass: 625 g-mol- ¹ .

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Нативный полисахарид (20,2 мг, 32,32 мкмоль) растворяли в 9,5 мл водного раствора (7,0 мл воды и 2,5 мл ацетатного буфера, 200 мМ, рН 5,24). К этому раствору добавляли 492 мкл раствора периодата натрия (3,45 мг, 16,16 мкмоль, 0,5 экв.). Смесь перемешивали при 25°С в течение 18 ч. Окисленный PS очищали с помощью центробежного диализа (Amicon, HOMM 30 кДа), используя 6 замен воды, с получением раствора очищенного PS-1.Native polysaccharide (20.2 mg, 32.32 μmol) was dissolved in 9.5 ml of aqueous solution (7.0 ml of water and 2.5 ml of acetate buffer, 200 mM, pH 5.24). To this solution was added 492 μl of sodium periodate solution (3.45 mg, 16.16 μmol, 0.5 eq.). The mixture was stirred at 25°C for 18 hours. Oxidized PS was purified by centrifugal dialysis (Amicon, HOMM 30 kDa) using 6 changes of water to obtain a solution of purified PS-1.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 1 (мг) PS 1 (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. уроновой кис. (мкМ) Quantity research uronic acid (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,50 0.50 20,2 20.2 2,61 2.61 10777,6 10777.6 2,3 2.3 2,16 2.16 87 87

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного (предполагаемый уровень окисления 10%) PS типа 1 (16 мг, 25,6 мкмоль, 2,4 мл воды) добавляли буферный раствор (0,424 мл 500 мМ фосфатного буфера, рН 6,74), ДМСО (572 мкл) и раствор DBCO-PEG4-NH2 (13,4 мг в 134 мкл ДМСО; 25,6 мкмоль, 10 экв.). Затем реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 32 мкл раствора цианоборогидрида натрия (3,2 мг в 32 мкл воды; 51,2 мкмоль, 20 экв.) и продолжали перемешивание в течение 3 дней при 25°С. Добавляли буферный раствор (0,300 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,0), затем борогидрид натрия (0,97 мг в 100 мкл, 25,6 мкмоль, 10 экв.) и перемешивали в течение 30 мин при 25°С. Реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (4x5 мл). Водный экстракт переносили в два ультрацентрифужных фильтра AMICON (НОММ 30 кДа, 6-12 мл) и затем подвергали диализу, используя 5 замен 20% этанола в воде (каждая по 12 мл) с последующими 3 заменами 3% ДМСО в воде (каждая по 12 мл), 3 заменами 0,9% хлорида натрия и 3 заменами воды, с получением DBCOпроизводного типа 1. К этому раствору (1,37 мл, 10,0 мг) добавляли раствор сахарозы (100 мг в 1 мл воды). Комбинированный раствор разделяли на две равные части и каждую лиофилизировали с получением двух образцов белого порошка. Каждый образец содержал 5,0 мг 1-DBCO и 50 мг сахарозы для использования в следующей реакции конъюгации.To a solution of oxidized (assumed oxidation level 10%) PS type 1 (16 mg, 25.6 µmol, 2.4 ml water) was added a buffer solution (0.424 ml 500 mM phosphate buffer, pH 6.74), DMSO (572 µl) and DBCO-PEG4-NH2 solution (13.4 mg in 134 μL DMSO; 25.6 μmol, 10 eq.). The reaction mixture was then stirred at 25°C for 30 min, after which time 32 μl of sodium cyanoborohydride solution (3.2 mg in 32 μl water; 51.2 μmol, 20 eq.) was added and stirring was continued for 3 days at 25°C. A buffer solution (0.300 ml of 200 mM phosphate buffer, pH 6.0) was added, followed by sodium borohydride (0.97 mg in 100 μl, 25.6 μmol, 10 eq.) and stirred for 30 min at 25°C. The reaction mixture was extracted with dichloromethane (4x5 ml). The aqueous extract was transferred to two AMICON ultracentrifugal filters (HOMM 30 kDa, 6-12 ml) and then dialyzed using 5 changes of 20% ethanol in water (each 12 ml) followed by 3 changes of 3% DMSO in water (each 12 ml), 3 changes of 0.9% sodium chloride and 3 changes of water, to obtain DBCO derivative type 1. To this solution (1.37 ml, 10.0 mg) was added a solution of sucrose (100 mg in 1 ml of water). The combined solution was divided into two equal parts and each was lyophilized to obtain two samples of white powder. Each sample contained 5.0 mg 1-DBCO and 50 mg sucrose for use in the next conjugation reaction.

Окисленный PS 1(мг) Oxidized PS 1(mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Колич. иссл. уроновой кис. (мкМ) Quantity research uronic acid (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 16 16 2,0 2.0 2909,0 2909.0 0,784x4 0.784x4 290,19 290.19 2,5 2.5 91 91 315 315

PS 1-DBCO: 5,0 мг (с 50 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 1-DBCO: 5.0 mg (with 50 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 2,5%.%DBCO: 2.5%.

Концентрация CRM: 4,86 мг/мл раствор.CRM concentration: 4.86 mg/ml solution.

PS:CRM (входное соотношение): 1,7:1.PS:CRM (input ratio): 1.7:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Лиофилизированный порошок тип 1 -DBCO (5 мг) растворяли в растворе фильтрованного 0,9% хлорида натрия (5,39 мл) и фосфатного буфера (250 мкл, 0,5 М, рН 7,0). Раствор функционализированного азидом eCRM (0,47 мл) добавляли, чтобы обеспечить массовое соотношения PS-1:CRM равное 1,7:1 (мас./мас.). Раствор очень осторожно перемешивали вручную перед осторожным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20°С) в течение 18 ч. Реакцию клик-химии останавливали добавлением раствора азида натрия (10 мг/мл, 52 мкл). Конъюгат CRM переносили в предварительно промытые пробирки для диализа (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, НОММ 300000, 10 мл) и затем подвергали диализу с применением 0,9% раствора хлорида натрия в течение 48 ч (8 замен, каждая по 800 мл). Диализированный раствор фильтровали через шприцевой фильтр Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 1-CRM.Lyophilized type 1 -DBCO powder (5 mg) was dissolved in a solution of filtered 0.9% sodium chloride (5.39 ml) and phosphate buffer (250 μl, 0.5 M, pH 7.0). A solution of azide-functionalized eCRM (0.47 mL) was added to provide a PS-1:CRM weight ratio of 1.7:1 (w/w). The solution was mixed very gently by hand before gently mixing on an orbital shaker at room temperature (20°C) for 18 hours. The click chemistry reaction was stopped by adding sodium azide solution (10 mg/ml, 52 μl). The CRM conjugate was transferred into pre-washed dialysis tubes (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, HOMM 300000, 10 ml) and then dialyzed with 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (8 changes, each 800 ml). . The dialyzed solution was filtered through a Millex-GP syringe filter (0.22 μm, 33 mm polyethersulfone) to obtain a 1-CRM conjugate solution.

- 89 044044- 89 044044

PS Ι- ΏΒ СО (мг) PS Ι- ΏΒ CO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Уроновая кислота (мг/мл) Uronic acid (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BSA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,0 5.0 2,94 2.94 6,47 6.47 0,56 0.56 72 72 0,283 0.283 62 62 1,98:1 1.98:1 8,25 8.25 1,02 1.02

Пример 40. Получение конъюгатов пневмококкового PS серотипа 10А с eCRM из табл. 2.Example 40. Preparation of conjugates of pneumococcal PS serotype 10A with eCRM from table. 2.

1. Окисление.1. Oxidation.

Партия PS серотипа 10А: 63662302 (АТСС).Lot PS serotype 10A: 63662302 (ATCC).

Мол. масса: 1013 кДа (повторяющееся звено = 1227 г/моль).Mol. mass: 1013 kDa (repeat unit = 1227 g/mol).

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

Порошок PS типа 10А (25,99 мг, 21,18 мкмоль) растворяли в 12,995 мл водного раствора (9,746 мл воды и 3,249 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5) в полистирольной пробирке для образцов объемом 50 мл с мешалкой. После растворения PS добавляли 135 мкл раствора NaIO₄ (0,27 мг, 1,26 мкмоль, 0,06 мол.экв.). Реакционную пробирку заворачивали в фольгу и помещали в холодильник для перемешивания при 4°С. Через 45 мин реакционную смесь подвергали диализу с применением трех центрифужных фильтрующих устройств AMICON® Ultra-15 (НОММ 30 кДа; 15 мл), используя 6 замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл), с получением раствора окисленного PS-10A.PS type 10A powder (25.99 mg, 21.18 μmol) was dissolved in 12.995 mL of aqueous solution (9.746 mL of water and 3.249 mL of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5) in a 50 mL polystyrene sample tube with stirrer . After dissolving the PS, 135 μl of NaIO ₄ solution (0.27 mg, 1.26 μmol, 0.06 mol equiv.) was added. The reaction tube was wrapped in foil and placed in a refrigerator for stirring at 4°C. After 45 min, the reaction mixture was dialyzed using three AMICON® Ultra-15 centrifugal filter units (HOMM 30 kDa; 15 mL) using 6 changes of HPLC grade water (15 mL each) to obtain an oxidized PS-10A solution.

Мол. экв. NaIO₄ Mol. eq. NaIO ₄ PS 10А (мг) PS 10A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Anthrone (µM) Окисление (%, ВСА) Oxidation (%, BCA) Окисление (%, колич. иссл. альдегидов) Oxidation (%, quantity of aldehydes) Выход PS (%) PS Output (%) 0,06 0.06 25,99 25.99 2,381 2,381 6757,20 6757.20 16,58 16.58 3,13 3.13 76 76

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

К раствору окисленного PS типа 10А (18,15 мг, 14,79 мкмоль, 3,371 мл) добавляли буферный раствор (0,259 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 6,0), ДМСО (0,145 мл) и раствор DBCO-PEG4-NH2 (7,7 мг в 154 мкл ДМСО; 14,79 мкмоль, 1 мол.экв.).To a solution of oxidized PS type 10A (18.15 mg, 14.79 µmol, 3.371 ml) was added a buffer solution (0.259 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 6.0), DMSO (0.145 ml) and a solution of DBCO-PEG4- NH2 (7.7 mg in 154 µl DMSO; 14.79 µmol, 1 mol equiv.).

Реакционную смесь перемешивали при 4°С в течение 30 мин, по истечении этого времени добавляли 101 мкл раствора цианоборогидрида натрия (1,9 мг в 101 мкл воды, 2 мол.экв.). Реакционную смесь оборачивали в алюминиевую фольгу и продолжали перемешивать в холодильнике при 4°С в течение 2 дней. Реакцию останавливали на второй день добавлением 85 мкл раствора борогидрида натрия (0,56 мг; 14,79 мкмоль, 1 мол.экв.). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (3x15 мл). Экстракт барботировали N2 в течение 15 мин для удаления остаточного дихлорметана и затем переносили в одно центрифужное фильтрующее устройство AMICON® Ultra-15 (HOMM 30 кДа; 15 мл). Диализ осуществляли путем проведения трех замен 3% раствора ДМСО (каждая по 15 мл), трех замен 20% раствора этанола (15 мл), двух замен 0,9% раствора хлорида натрия и двух замен воды категории ВЭЖХ (каждая по 15 мл) с получением DBCO-производного 10А. К этому раствору (3,371 мл, 15,06 мг) добавляли раствор сахарозы (150,6 мг в 1,506 мл воды). Этот комбинированный раствор разделяли на три равные фракции и каждую лиофилизировали с получением мелкодисперсного белого порошка. После лиофилизации все фракции хранили при 4°С до тех пор, пока они не понадобились для реакции конъюгации.The reaction mixture was stirred at 4°C for 30 min, after which time 101 μl of sodium cyanoborohydride solution (1.9 mg in 101 μl of water, 2 mol.eq.) was added. The reaction mixture was wrapped in aluminum foil and continued to stir in the refrigerator at 4°C for 2 days. The reaction was stopped on the second day by adding 85 μl of sodium borohydride solution (0.56 mg; 14.79 μmol, 1 mol equiv.). After stirring for 30 min, the reaction mixture was extracted with dichloromethane (3x15 ml). The extract was bubbled with N2 for 15 min to remove residual dichloromethane and then transferred to one AMICON® Ultra-15 centrifugal filter unit (HOMM 30 kDa; 15 ml). Dialysis was performed by performing three changes of 3% DMSO solution (15 mL each), three changes of 20% ethanol solution (15 mL), two changes of 0.9% sodium chloride solution, and two changes of HPLC grade water (15 mL each) with obtaining DBCO derivative 10A. To this solution (3.371 ml, 15.06 mg) was added a solution of sucrose (150.6 mg in 1.506 ml water). This combination solution was divided into three equal fractions and each was lyophilized to obtain a fine white powder. After lyophilization, all fractions were stored at 4°C until needed for the conjugation reaction.

Окисленный PS 10А (мг) Oxidized PS 10A (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мкМ) Antron (µM) Дериватизация DBCO, абсорбция при 309 нм DBCO derivatization, absorbance at 309 nm Дериватизация DBCO (мкМ) Derivatization DBCO (µM) Включение DBCO (%) Inclusion DBCO (%) Выход PSDBCO (%) Exit PSDBCO (%) SEC- MALS (кДа) SEC- MALS (kDa) 18,15 18.15 3,371 3.371 1290,30 1290.30 0,333 0.333 27,21 27.21 2,1 2.1 88 88 540 540

3. Конъюгация производного PS 10A-DBCO с eCRM.3. Conjugation of PS derivative 10A-DBCO with eCRM.

PS 10A-DBCO: 5,20 мг (с 52,0 мг сахарозы) лиофилизированного порошка.PS 10A-DBCO: 5.20 mg (with 52.0 mg sucrose) lyophilized powder.

% DBCO: 2,1%.%DBCO: 2.1%.

CRM: 4,962 мг/мл в 20 мМ гистидина, рН 7,1 (7,5% сахарозы).CRM: 4.962 mg/ml in 20 mM histidine, pH 7.1 (7.5% sucrose).

[PS:CRM (входное массовое соотношение): 1,25:1.[PS:CRM (input mass ratio): 1.25:1.

Порядок проведения реакций.Order of reactions.

DBCO-производное 10А (5,2 мг белого порошка с 52,0 мг сахарозы) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия (1,502 мл), фосфатном буфере с рН 7 (0,104 мл, 0,5 М) и ДМСО (0,156 мл). Добавляли раствор функционализированного азидом eCRM (0,838 мл раствора), чтобы обеспечить массовое соотношение PS10A:CRM равное 1,25:1 (мас./мас.). Реакционную смесь, при концентрации PS 2,0 мг/мл, осторожно перемешивали на орбитальном шейкере при комнатной температуре (22°С) в течение 2 ч. Затем реакционную смесь разбавляли доDBCO derivative 10A (5.2 mg white powder with 52.0 mg sucrose) was dissolved in 0.9% sodium chloride (1.502 ml), phosphate buffer pH 7 (0.104 ml, 0.5 M) and DMSO (0.156 ml). A solution of azide-functionalized eCRM (0.838 mL solution) was added to provide a PS10A:CRM mass ratio of 1.25:1 (w/w). The reaction mixture, at a PS concentration of 2.0 mg/ml, was gently stirred on an orbital shaker at room temperature (22°C) for 2 hours. The reaction mixture was then diluted to

- 90 044044- 90 044044

1,0 мг/мл и оставляли перемешиваться при 22°С в течение еще 20 ч. Реакцию конъюгации останавливали добавлением азида натрия (7,5 мг, 115 мкмоль). Реакционную смесь затем разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия до конечного объема 7 мл и переносили в предварительно промытое устройство для диализа (SpectrumLab FloatA-Lyzer G2, каталожный номер G235060, НОММ 300000). Образец подвергали диализу в 0,9% растворе хлорида натрия в течение 48 ч (2 замены, каждая по 1 л; 1 замена, 4 л). Диализированный раствор фильтровали через Millex-GP (0,22 мкм, 33 мм полиэфирсульфона) с получением раствора конъюгата 10APS-CRM.1.0 mg/ml and left to stir at 22°C for another 20 hours. The conjugation reaction was stopped by adding sodium azide (7.5 mg, 115 μmol). The reaction mixture was then diluted with 0.9% sodium chloride solution to a final volume of 7 ml and transferred to a pre-washed dialysis device (SpectrumLab FloatA-Lyzer G2, catalog number G235060, HOMM 300000). The sample was dialyzed in 0.9% sodium chloride solution for 48 hours (2 changes, each 1 L; 1 change, 4 L). The dialyzed solution was filtered through Millex-GP (0.22 μm, 33 mM polyethersulfone) to obtain a 10APS-CRM conjugate solution.

PS 10А- DBCO (мг) PS 10A- DBCO (mg) CRM (мг) CRM (mg) Объем после очистки (мл) Volume after cleaning (ml) Антрон (мг/мл) Antron (mg/ml) Выделение PS (%) Selection PS (%) ВСА (CRM) (мг/мл) BCA (CRM) (mg/ml) Выделение CRM (%) Selection CRM (%) Соотн. PS:CRM CJD Ratio PS:CRM C.J.D. Свободный PS (%) Free PS (%) SECMALS (МДа) SECMALS (MDa) 5,20 5.20 4,16 4.16 8,21 8.21 0,553 0.553 87 87 0,229 0.229 45 45 2,4:1 2.4:1 17,71 17.71 1,047 1.047

Пример 41. Оценка включения DBCO-PEG₄-амина и DBCO-амина в пневмококковые полисахариды.Example 41: Evaluation of incorporation of DBCO-PEG ₄ -amine and DBCO-amine into pneumococcal polysaccharides.

Различные пневмококковые полисахариды окисляли, как описано выше, и подвергали взаимодействию с DBCO-PEG₄-амином (DBCO или DB) или DBCO-амином (DBCA или DA) в одинаковых условиях, чтобы определить влияние линкера на эффективность включения. В таблице ниже показано, что во всех, за исключением одного, испытанных серотипах DBCO-амин включался с более высокой эффективностью по сравнению с DBCO-PEG₄-амином на 100 повторяющихся звеньев полисахарида.Various pneumococcal polysaccharides were oxidized as described above and reacted with DBCO-PEG ₄ -amine (DBCO or DB) or DBCO-amine (DBCA or DA) under the same conditions to determine the effect of the linker on incorporation efficiency. The table below shows that in all but one of the serotypes tested, DBCO-amine was incorporated at a higher efficiency than DBCO-PEG ₄ -amine per 100 polysaccharide repeat units.

Образец окисленного PS Oxidized sample PS Образец PS DB/DA Sample PS DB/DA Условия реакции DB/DA Reaction conditions DB/DA Включение DBCO/DBCA (%) Inclusion DBCO/DBCA (%) Выход DB/DA- PS (%) Exit DB/DA- PS (%) Размер DB/DA- PS (кДа) Size DB/DA- PS (kDa) 5-ОХ 5-OX 5-DB (15,5 мг) 5-DB (15.5 mg) 5 мг/мл, 1 экв. DBCO, 10% ДМСО, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,7, 25°С, 3 дня 5 mg/ml, 1 eq. DBCO, 10% DMSO, 50 mM phosphate buffer, pH=6.7, 25°C, 3 days 4,9 4.9 89 89 5-DA (15,5 мг) 5-DA (15.5 mg) 5 мг/мл, 1 экв. DBCA, 10% ДМСО, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,7, 25°С, 3 дня 5 mg/ml, 1 eq. DBCA, 10% DMSO, 50 mM phosphate buffer, pH=6.7, 25°C, 3 days 8,3 8.3 83 83 9V-OX 9V-OX 9V-DB(17,1 мг) 9V-DB(17.1 mg) 5,0 мг/мл, 2 дня, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,0, 1 мол. экв. 5.0 mg/ml, 2 days, 50 mM phosphate buffer, pH=6.0, 1 mol. eq. 3,9 3.9 56 56

- 91 044044- 91 044044

DBCO, 15% ДМСО, 25°С DBCO, 15% DMSO, 25°C 9V-DA(17,1 мг) 9V-DA(17.1 mg) 5,0 мг/мл, 2 дня, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,0, 1 мол. экв. DBCA, 15% ДМСО, 25°С 5.0 mg/ml, 2 days, 50 mM phosphate buffer, pH=6.0, 1 mol. eq. DBCA, 15% DMSO, 25°C 6 6 80 80 14-OX 14-OX 14-DB (15,65 мг) 14-DB (15.65 mg) 5,0 мг/мл, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,7, 1,0 мол. экв. DBCO, 15% ДМСО, 25°С, 48 ч 5.0 mg/ml, 50 mM phosphate buffer, pH=6.7, 1.0 mol. eq. DBCO, 15% DMSO, 25°C, 48 h 8 8 80 80 14-DA (15,65 мг) 14-DA (15.65 mg) 5,0 мг/мл, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,7, 1,0 мол. экв. DBCA, 15% ДМСО, 25°С, 48 ч 5.0 mg/ml, 50 mM phosphate buffer, pH=6.7, 1.0 mol. eq. DBCA, 15% DMSO, 25°C, 48 h 4,6 4.6 67 67 23F-OX 23F-OX 23F-DB (22,3 мг) 23F-DB (22.3 mg) 4 мг/мл, 48 ч, 100 мМ, рН=6,0, 0,8 экв. DBCO, 15% ДМСО, 25°С 4 mg/ml, 48 h, 100 mM, pH=6.0, 0.8 eq. DBCO, 15% DMSO, 25°C 5,5 5.5 68 68 23F-DA (22,3 мг) 23F-DA (22.3 mg) 4 мг/мл, 48 ч, 100 мМ, рН=6,0, 0,8 экв. DBCA, 15% ДМСО, 25°С 4 mg/ml, 48 h, 100 mM, pH=6.0, 0.8 eq. DBCA, 15% DMSO, 25°C 7,5 7.5 63 63 22F-OX 22F-OX 22F-DB (7,0 мг) 22F-DB (7.0 mg) 2 мг/мл, 1 экв. DBCO, 15% ДМСО, рН=6, 25°С, 48 ч 2 mg/ml, 1 eq. DBCO, 15% DMSO, pH=6, 25°C, 48 h 0,8 0.8 101 101 22F-DA (7,0 мг) 22F-DA (7.0 mg) 2 мг/мл, 1 экв. DBCA, 15% ДМСО, рН=6, 25°С, 48 ч, очистка полипептида 2 mg/ml, 1 eq. DBCA, 15% DMSO, pH=6, 25°C, 48 h, polypeptide purification 4,3 4.3 104 104 22F-OX 22F-OX 22F-DB (7,0 22F-DB (7.0 4 мг/мл, 1 экв. DBCO, 4 mg/ml, 1 eq. DBCO, 1,2 1.2 80 80 838 838

- 92 044044- 92 044044

мг) mg) 15% ДМСО, рН=6, 25°С, 48 ч 15% DMSO, pH=6, 25°C, 48 h 22F-DA (14,0 мг) 22F-DA (14.0 mg) 4 мг/мл, 1 экв. DBCA, 15% ДМСО, рН=6, 25°С, 48 ч, очистка полипептида 4 mg/ml, 1 eq. DBCA, 15% DMSO, pH=6, 25°C, 48 h, polypeptide purification 4,3 4.3 73 73 790 790 10А-ОХ 10A-OX 10A-DB (14,60 мг) 10A-DB (14.60 mg) 7 мг/мл, 10% ДМСО, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,0, 1 мол. экв. DBCO, 4°С, 2 дня 7 mg/ml, 10% DMSO, 50 mM phosphate buffer, pH=6.0, 1 mol. eq. DBCO, 4°C, 2 days 1,5 1.5 88 88 10A-DA (14,60 мг) 10A-DA (14.60 mg) 7 мг/мл, 10% ДМСО, 50 мМ фосфатный буфер, рН=6,0, 1 мол. экв. DBCA, 4°С, 2 дня 7 mg/ml, 10% DMSO, 50 mM phosphate buffer, pH=6.0, 1 mol. eq. DBCA, 4°C, 2 days 3,8 3.8 82 82 7F-OX 7F-OX 7F-DB (12 мг) 7F-DB (12 mg) 2,9 мг/мл, 1 экв. DBCO (партия № 1730), 99 мМ фосфат, рН=6,3, 21 ч при комнатной температуре, 10% ДМСО 2.9 mg/ml, 1 eq. DBCO (lot #1730), 99 mM phosphate, pH=6.3, 21 hours at room temperature, 10% DMSO 1,9 1.9 78 78 160 160 7F-DA (12 мг) 7F-DA (12 mg) 2,9 мг/мл 1 экв. DBCA (партия № 1818), 99 мМ фосфат, рН=6,3, 21 ч при комнатной температуре, 10% ДМСО 2.9 mg/ml 1 eq. DBCA (lot #1818), 99 mM phosphate, pH=6.3, 21 hours at room temperature, 10% DMSO 4,5 4.5 76 76 177 177

Пример 42. Сравнение конъюгации DBCO-PEG₄-амина и DBCO-амина с eCRM.Example 42 Comparison of DBCO-PEG ₄ -amine and DBCO-amine conjugation to eCRM.

Пневмококковые полисахариды, соединенные с DBCO-PEG₄-амином (DB) или DBCO-амином (DA), конъюгировали с одинаковым eCRM из табл. 2 в идентичных условиях реакции в соответствии с приведенными выше примерами, чтобы оценить влияние линкера на эффективность конъюгации. В таблице ниже показано, что конъюгаты, образованные с полисахаридом, соединенным с DBCO-амином, обычно приводили к меньшему количеству свободного полисахарида и большему размеру конъюгата.Pneumococcal polysaccharides coupled to DBCO-PEG ₄ -amine (DB) or DBCO-amine (DA) were conjugated to the same eCRM from Table. 2 under identical reaction conditions according to the examples above to evaluate the effect of the linker on the conjugation efficiency. The table below shows that conjugates formed with a polysaccharide coupled to a DBCO-amine generally resulted in less free polysaccharide and a larger conjugate size.

- 93 044044- 93 044044

DBC OPS DBC O.P.S. Масшта б PS (мг) Scale b PS (mg) Конц. PS (мг/мл ) Conc. PS (mg/ml) Конц, белка (мг/мл ) Conc, squirrel (mg/ml) Входно е соотн. Input ratio Условия реакции конъюгаци и Conditions conjugation reactions And Выхо Д PS (%) Exit D PS (%) Соотн. Р8:бело Ratio P8:white Свободны й PS % Available th PS % Размер конъюгат а(МДа) Conjugate size a(MDa) 22F- DB 22F- D.B. 2,4 2.4 3,2 3.2 2,3 2.3 1,4 1.4 3,2 мг/мл, 10% ДМСО, 48 ч, КТ, диализ 300 кДа, фильтр Millex-GP 3.2 mg/ml, 10% DMSO, 48 h, RT, dialysis 300 kDa, Millex-GP filter 53 53 1,5 1.5 20,5 20.5 3,6 3.6 22F- DA 22F- D.A. 2 2 3,2 3.2 2,3 2.3 1,4 1.4 3,2 мг/мл, 10% ДМСО, 48 ч, КТ, диализ 300 кДа, фильтр Millex-GP 3.2 mg/ml, 10% DMSO, 48 h, RT, dialysis 300 kDa, Millex-GP filter 37 37 1,7 1.7 нпко <9,2% npko <9.2% 6,2 6.2 7F- DB 7F- D.B. 4 4 2,6 2.6 1,6 1.6 1,6 1.6 2,6 мг/мл, 18 ч, КТ, диализ 300 кДа, фильтр Millex-MP 2.6 mg/ml, 18 h, CT, dialysis 300 kDa, Millex-MP filter 94 94 2 2 31 31 1,3 1.3 7F- DA 7F- D.A. 4 4 2,6 2.6 1,6 1.6 1,6 1.6 2,6 мг/мл, 18 ч, КТ, диализ 300 кДа, фильтр Millex-MP 2.6 mg/ml, 18 h, CT, dialysis 300 kDa, Millex-MP filter 84 84 2 2 14 14 1,8 1.8

Пример 43. Иммуногенность конъюгатов пневмококкового серотипического PS и eCRM.Example 43. Immunogenicity of pneumococcal serotype PS and eCRM conjugates.

Эксперименты проводили с целью определения общего IgG и ответов функциональных ОРАантител у мышей или кроликов после введения различных одновалентных конъюгатов пневмококковый полисахарид-eCRM, полученных в соответствии с настоящим изобретением. Количественные исследования опсонофагоцитарной активности (ОРА) использовали для измерения функциональных антител в сыворотке крови мышей, специфичных для различных серотипов S. pneumonia. Измерения ОРА были основаны на Moon H. Nahm & Robert L. Burton, Protocol for opsonophagocytic killing assay for antibodies against Group В Streptococcus (UAB GBS OPA), версия В.04, март 2016 (исходная версия А.01 опубликована в сентябре 2011) (www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-GBS-OPA.pdf) и Protocol for multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA) for antibodies against Streptococcus pneumoniae, версия Е.02, декабрь 2014 (www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf). На фиг. 3 показана опсонофагоцитарная (ОРА) активность у мышей после введения моновалентных конъюгатов пневмококковый полисахарид-eCRM. Общее количество антитела, связывающего полисахарид (IgG), специфичного для каждого пневмококкового полисахарида, также измеряли в соответствии со способами, описанными в Yu et al., Development of an Automated and Multiplexed Serotyping Assay for Streptococcus pneumoniae Clin Vaccine Immunol. 2011, 18(11): 1900-7. На фиг. 4 показаны ответы IgG у мышей после введения моновалентных конъюгатов пневмококкового полисахарида-eCRM.Experiments were conducted to determine total IgG and functional OPA antibody responses in mice or rabbits following administration of various monovalent pneumococcal polysaccharide-eCRM conjugates prepared in accordance with the present invention. Quantitative opsonophagocytic activity (QPA) assays were used to measure functional antibodies in mouse serum specific for different S. pneumonia serotypes. OPA measurements were based on Moon H. Nahm & Robert L. Burton, Protocol for opsonophagocytic killing assay for antibodies against Group B Streptococcus (UAB GBS OPA), version B.04, March 2016 (original version A.01 published September 2011) (www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-GBS-OPA.pdf) and Protocol for multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA) for antibodies against Streptococcus pneumoniae, version E.02, December 2014 (www.vaccine .uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf). In fig. Figure 3 shows opsonophagocytic (OPA) activity in mice following administration of monovalent pneumococcal polysaccharide-eCRM conjugates. The total amount of polysaccharide-binding antibody (IgG) specific for each pneumococcal polysaccharide was also measured according to the methods described in Yu et al., Development of an Automated and Multiplexed Serotyping Assay for Streptococcus pneumoniae Clin Vaccine Immunol. 2011, 18(11): 1900-7. In fig. Figure 4 shows IgG responses in mice following administration of monovalent pneumococcal polysaccharide-eCRM conjugates.

Согласно обобщенным данным в приведенных ниже таблицах, каждый испытанный конъюгат вызывал ответы IgG и ответы функциональных антител у мышей или кроликов, которые были сопоставимы или превосходили результаты ОРА и IgG, показанные на фиг. 3 и 4.As summarized in the tables below, each conjugate tested produced IgG responses and functional antibody responses in mice or rabbits that were comparable to or superior to the OPA and IgG results shown in FIG. 3 and 4.

- 94 044044- 94 044044

Типы PS PS types Иммуногенность у мышей Immunogenicity in mice Типы PS PS types Иммуногенность у мышей и кроликов Immunogenicity in mice and rabbits IgG IgG ОРА ORA IgG IgG ОРА ORA 1 1 Р R Р R 22F 22F 3 3 Р R Р R 33F 33F 4 4 Р R Р R 15В 15V Р R Р R 5 5 Р R Р R 2 2 Р R Р R 6А 6A Р R Р R 9N 9N Р R Р R 6В 6V Р R Р R ПА PA Р R 7F 7F Р R Р R 12F 12F Р R Р R 9V 9V Р R р R 20 20 Р R Р R 14 14 Р R р R 10А 10A Р R 18С 18C Р R р R 8 8 Р R 19А 19A Р R р R 17F 17F 19F 19F Р R р R 23F 23F

Комбинацию конъюгатов для каждого из 24 пневмококковых серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F получали с применением производного CRM197 из SEQ ID NO: 9 в качестве носителя в каждом конъюгате. Иммуногенность этой композиции испытывали с применением схемы с 3 дозами в группах по 7 кроликов. Ее также сравнивали с конъюгированной 13-валентной вакциной Prevnar™ и неконъюгированной 23-валентной вакциной Pneumovax™, к которой добавляли неконъюгированный полисахарид серотипа 6А, чтобы облегчить сравнение. Три композиции содержали эквивалентные дозы полисахарида на серотип (за исключением 6В, поскольку Prevnar™ содержит двойную дозировку), что включало разведение Prevnar™ и Pneumovax™. Все три композиции содержали 60 мкг адъюванта на основе фосфата алюминия на дозу, что включало добавление адъюванта к Pneumovax™ .A combination of conjugates for each of 24 pneumococcal serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F were prepared using the CRM197 derivative of SEQ ID NO: 9 as a carrier in each conjugate. The immunogenicity of this composition was tested using a 3-dose regimen in groups of 7 rabbits. It was also compared to the 13-valent conjugate Prevnar™ vaccine and the unconjugated 23-valent Pneumovax™ vaccine, to which an unconjugated serotype 6A polysaccharide was added to facilitate comparison. The three formulations contained equivalent doses of polysaccharide per serotype (except 6B because Prevnar™ contains double dosage), which included dilutions of Prevnar™ and Pneumovax™. All three formulations contained 60 μg of aluminum phosphate adjuvant per dose, which included the addition of the adjuvant to Pneumovax™.

Методики конъюгации, описанные в настоящем документе, позволили получить композицию с более низким количеством носителя CRM197, чем в одобренной вакцине Prevnar-13™, и при этом включить капсульные полисахариды из 11 дополнительных серотипов. Общее массовое соотношение капсульного полисахарида и CRM197 в конъюгированной 24-валентной композиции было приблизительно в два раза выше, чем в 13-валентной Prevnar™.The conjugation techniques described herein resulted in a formulation with lower amounts of CRM197 carrier than the approved Prevnar-13™ vaccine while incorporating capsular polysaccharides from 11 additional serotypes. The total mass ratio of capsular polysaccharide to CRM197 in the conjugated 24-valent formulation was approximately twice that of the 13-valent Prevnar™.

Ответы после введения третьей дозы показаны на фиг. 5 (ответы IgG) и фиг. 6 (ответы ОРА). Как и ожидалось, ответы при применении двух конъюгированных вакцин были намного больше, чем для неконъюгированной вакцины. Кроме того, ответы IgG и ОРА при применении 24-валентной вакцины были сопоставимы с ответами, полученными при использовании Prevnar-13™, в отношении серотипов, охватываемых одобренной вакциной, но в дополнение были лучше против 11 серотипов, которые не включены в Prevnar-13. Удивительным фактом явилось отсутствие признаков подавления эпитопа, вызванного носителем.Responses after the third dose are shown in FIG. 5 (IgG responses) and FIG. 6 (OPA answers). As expected, responses for the two conjugate vaccines were much greater than for the unconjugate vaccine. In addition, IgG and OPA responses with the 24-valent vaccine were comparable to those obtained with Prevnar-13™ for serotypes covered by the approved vaccine, but were in addition superior against 11 serotypes that are not included in Prevnar-13 . Surprisingly, there was no evidence of carrier-induced epitope suppression.

Пример 44. Получение конъюгированной вакцины от периодонтита.Example 44. Preparation of a conjugate vaccine against periodontitis.

Вакцину против Porphyromonas gingivalis получали путем конъюгирования капсульных полисахаридов (CPS) из серотипов P. gingivalis K1, K2, K3, K4, K5 и/или K6 с белком-носителем eCRM следующим образом.A vaccine against Porphyromonas gingivalis was prepared by conjugating capsular polysaccharides (CPS) from P. gingivalis serotypes K1, K2, K3, K4, K5 and/or K6 to an eCRM carrier protein as follows.

P. gingivalis выращивали и обрабатывали любым подходящим способом; см., например, Huang et al., Mol Oral Microbiol. 30:438-50 (2015). CPS очищали любым способом по выбору; см., например, Gonzalez et al., Infect. Immun. 71:2283-2287 (2003); Schifferle et al., J. Immunol. 143:3035-3042 (1989); Pantosti et al., Infect. Immun. 59:2075-2082 (1991). В общих чертах, Р. gingivalis собирали с помощью центрифугирования, промывали солевым раствором, суспендировали в воде и подвергали экстракции горячей смесью фенол-вода. Водную фазу собирали, экстрагировали простым эфиром и подвергали диализу против стеP. gingivalis was grown and processed by any suitable method; see, for example, Huang et al., Mol Oral Microbiol. 30:438-50 (2015). CPS was purified by any method of choice; see, for example, Gonzalez et al., Infect. Immun. 71:2283-2287 (2003); Schifferle et al., J. Immunol. 143:3035-3042 (1989); Pantosti et al., Infect. Immun. 59:2075–2082 (1991). In general, P. gingivalis was collected by centrifugation, washed with saline, suspended in water, and subjected to hot phenol-water extraction. The aqueous phase was collected, extracted with ether and dialyzed against

--

Claims

ril filtered water. The pH of the aqueous material was adjusted to 5.5 and digested overnight with a nuclease cocktail consisting of DNase I and RNase A (Sigma). The pH was adjusted to neutral, and proteinase K (1 mg/ml; Sigma) was added to the sample and incubated overnight at 37°C with gentle shaking. A second proteinase K digestion was then performed and the resulting carbohydrate was concentrated using a molecular weight cutoff membrane of 10,000. CPS was precipitated with cold ethanol, suspended in deoxycholate buffer and isolated using an S-400 gel filtration column (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Fractions containing high molecular weight CPS (as determined by SEC-MALS) were pooled, and fractions containing LPS were discarded. The combined fractions were concentrated, precipitated, dialyzed and lyophilized.

X molar equivalents (per polysaccharide repeat unit; X determined by screening) of 1-cyano-4dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP; from a 100 mg/mL solution in acetonitrile) were added to the buffered polysaccharide solution with vigorous stirring. Five minutes after the addition of CDAP, 0.5 mol equiv was added. dibenzocyclooctynamine linker (from a concentrated solution in DMSO). After another 1 hour, glycine was added to neutralize any unreacted cyanate esters. Alternatively, the CPS may be modified using periodate or TEMPO/NCS chemistry. The derivatized polysaccharide was then purified by dialysis or ultrafiltration/diafiltration (UF/DF). Polysaccharide concentration was measured using a quantitative anthrone colorimetric assay and dibenzocyclooctine concentration was measured by absorbance at 309 nm. These two values can be combined to estimate the percentage of polysaccharide derivatized with a dibenzicyclooctine functionality.

The conjugate was prepared by mixing the derivatized polysaccharide with a selected eCRM protein, such as those presented in Table. 2. After 18 hours of incubation, one molar equivalent of sodium azide was added to neutralize any unreacted dibenzocyclooctyne functionality. The conjugate was then purified by dialysis or UF/DF to remove unreacted eCRM protein. The conjugate was then assayed to determine polysaccharide concentration (colorimetric), protein concentration (colorimetric), and the percentage of free/unconjugated saccharide was calculated. Molecular weight was measured using SEC-MALS.

Polysaccharide:protein conjugates were precipitated by adding 1% deoxycholate solution (pH 6.8) and incubating on ice for 30 min. After incubation, 1 M HCl was added and the mixture was centrifuged for 20 min at 10,000 rpm. The remaining supernatant contained unconjugated polysaccharide. To determine the polysaccharide concentration, anthrone dissolved in sulfuric acid was added to the samples and heated to 95°C for 10 min. The mixture was cooled and absorbance was measured at 620 nm. The concentration was calculated using a standard curve of the monosaccharide components of the polysaccharide.

The embodiments described herein are presented by way of example only, and various alternative implementations are not excluded if the embodiments described herein are practiced.

CLAIM

1. An immunogenic composition comprising a plurality of carrier protein-antigen conjugates, wherein the plurality of carrier protein-antigen conjugates comprise at least 21 different carrier protein-antigen conjugates, wherein said antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, and where:

a) the capsular polysaccharide in each different carrier protein-antigen conjugate is derived from a different serotype of Streptococcus pneumoniae;

(b) said carrier protein of carrier protein-antigen conjugates contains a polypeptide containing at least one T-cell activating epitope and at least three unnatural amino acids (nNAAs) containing a reactive group suitable for click chemistry, substituted by natural amino acids in the polypeptide, where capsular polysaccharides are conjugated to npAA;

(c) for each of Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F and 33F there is a different carrier protein-antigen conjugate;

(d) at least one additional distinct carrier protein-antigen conjugate is present comprising a capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae serotypes selected from the group consisting of serotypes 2, 6C, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 20, 20A, 20B, 23A, 23B, 24F, 24B, 31, 34, 35B, 35F and 38; and (e) the total (w/w) ratio of polysaccharides of all serotypes to carrier protein in the composition is at least 0.8.

- 96 044044

2. An immunogenic composition containing at least 24 different carrier protein-antigen conjugates, where at least 24 different carrier protein-antigen conjugates contain:

(i) a different carrier protein-antigen conjugate containing a capsular polysaccharide for each of Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F.

3. The composition according to claim 1 or 2, characterized in that Streptococcus pneumoniae serotype 20 is serotype 20B.

4. The composition according to any one of claims 1 to 3, where the composition further comprises a different carrier protein-antigen conjugate, where the antigen is a capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae serotype 6C or 7C.

5. An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae are conjugated to npAK through a connecting fragment, where the capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae contain a cyclooctyne group and are conjugated to a reactive group suitable for click chemistry, wherein the reactive group is suitable for click chemistry, contains an azido group.

6. An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 5, where said nPAA in the polypeptide is selected from 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid (pAF), 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl )propanoic acid (pAMF), 2-amino-3-(5-(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(4(azidomethyl)pyridin-2-yl)propanoic acid, 2- amino-3-(6-(azidomethyl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 2-amino-5-azidopentanoic acid and 2-amino-3-(4-(azidomethyl)phenyl)propanoic acid.

7. An immunogenic composition according to claim 6, wherein the nPAA in the polypeptide is pAMF.

8. An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 7, wherein the carrier protein contains at least one T-cell activating epitope from a protein selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae toxin, Clostridium tetani tetanospasmin, Haemophilus influenzae protein D and CRM197.

9. An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 8, wherein the carrier protein has at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 1.

10. The immunogenic composition of claim 9, wherein the carrier protein has at least 90% or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 1.

11. An immunogenic composition according to claim 9 or 10, where the carrier protein contains at least three nPAAs replacing a natural amino acid within SEQ ID NO: 1, where the natural amino acid is selected from K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 or K527 from SEQ ID NO: 1.

12. The immunogenic composition of claim 11, wherein the carrier protein contains at least three nPAAs replacing a naturally occurring amino acid within SEQ ID NO: 1, wherein only one naturally occurring amino acid is selected from K25, K34, K38 and K40, and wherein one naturally occurring amino acid the amino acid is K213 or K215.

13. The composition according to claim 11 or 12, where the carrier protein contains npAA containing a reaction group suitable for click chemistry, replaced by lysine residues as follows: 1) one residue from the group consisting of K25, K34, K38 and K40; 2) one residue selected from the group consisting of K213 and K215; and 3) 2 to 4 residues selected from the group consisting of K228, K245, K265, K386, K523 and K527.

14. Immunogenic composition according to any one of claims 1 to 13, where the total (w/w) ratio of polysaccharides of all serotypes and carrier protein in the composition is at least 0.9, at least 1.0, at least 1.1, at least 1.2, at least 1.3, at least 1.4 or at least 1.5.

15. An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 14, where the carrier protein in carrier protein-antigen conjugates contains at least 4 nPAA or 4-6 nPAA.

16. Immunogenic composition according to any one of claims 1 to 15, where the antigen is combined with a carrier protein according to formula XI or XIa

(formula XIa) (formula XI)

-