JP3675056B2 - ゲル電気泳動法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば末端塩基別に調製された核酸断片試料を電気泳動ゲルに注入して電気泳動させるゲル電気泳動法に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来より極微量のタンパクや核酸などを分析する場合ゲル電気泳動法が行われている。ゲル電気泳動法は、ゾーンの安定化をはかるために寒天や、分子ふるい効果のあるポリアクリルアミド、デンプンなどのゲルを支持体として泳動させるものである。このゲル電気泳動法により、例えば核酸の塩基配列を決定する場合には、先ずサンガー法により得られた末端塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）別の核酸断片試料を、溶液状態のままシリンジを用いてゲルの上部へ末端塩基別にマニュアルでローディングする。このとき、１回の泳動で７サンプルを処理する場合には、１サンプルにつき末端塩基Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４レーンがあるので、７×４＝２８レーン分をローディングする必要がある。これらを行うのには、熟練者がどんなに手早く行っても、１レーン当たり１５秒要し、合計２８×１５＝４２０秒＝７分かかり、一般の者では通常１０〜１５分かかっているのが現状である。
【０００３】
そして、ローディングが終了したら、直ちに電気泳動を行い、サンガー反応物（核酸断片試料）をゲル上端部に押し込み、サンガー反応物が立体構造を取らないようにしている。なお、“立体構造を取る”とは、ＤＮＡが非変性状態になることをいう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法では、実際はローディングされたサンガー反応物が室温で溶液状態となるため、一部のサンガー反応物が電気泳動が始まる前に立体構造をとっていた。その結果“コンプレッション（縮合）”という現象が起こり、その箇所については、正しいＤＮＡの塩基配列結果が得られないという課題が生じている。
そこで、本発明は、試料に悪影響を与えない新規な方法で電気泳動ゲルに試料をロードして、電気泳動を行う方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、試料を膜上に添加し、該試料が、立体構造を取る前に、変性状態になる温度条件にて乾燥後該膜を電気泳動ゲルにロードして電気泳動を行うことを特徴とするゲル電気泳動法を提供する。ここで、試料とは、例えばサンガー法やマキサムギルバード法により処理された核酸断片試料の他、通常の前処理操作を行った核酸、タンパク質などの試料が該当する。膜は、試料を吸着させるものならば何でもよく、例えばナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジブロリドなどを用いることができる。膜は、電気泳動ゲル上端部に密着するように、縦、横ともゲル断面より小さく作成することが好ましい。膜のサイズとしては、例えば縦０．２５ｍｍ、横１５ｃｍ、厚さ０．１ｍｍのものを用いることができる。試料を膜に添加するのは、マイクロシリンジ、ピペット等の公知の手法により行うことができる。添加する試料量は、試料の種類により異なるが、例えばサンガー反応物の場合は、２．０〜３．５μｌ添加する。
【０００６】
試料を添加した膜は、直ちに乾燥させる。乾燥は、試料がサンガー反応物の場合には、反応物（ＤＮＡ）が変性状態になる温度条件、例えば９５℃にて３〜５分間加熱して行う。そうすれば、膜上にサンガー反応物が変性状態のまま吸着されることになり、電気泳動の際サンガー反応物が立体構造をとることがない。
【０００７】
なお、「直ちに」というのは、試料がサンガー反応物の場合、立体構造をとる前という意味で、乾燥のための温度条件は、上記に限定されず、例えば８０〜９５℃で、３〜１０分加熱すれば良い。加熱手段としては、例えばヒートブロック、面ヒータ等の公知のものを用いることができる。また、サンガー反応物以外の試料の場合には、その試料の変性条件にあった温度で加熱する。
【０００８】
電気泳動ゲルとしては、例えば、寒天ゲル、デンプンゲル、ポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを用いることができるが、これらに限定されない。電気泳動ゲルに膜上の試料をロードするには、膜を電気泳動ゲル上端部に密着して短時間電気泳動を行うことにより行うことができる。
【０００９】
また、「ロード」するとは、載せる、添加するという意味で、電気泳動法では慣用されている用語である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
図１は、本発明の方法を実施するためのゲル電気泳動装置の概略図を示しており、２は電気泳動ゲルである。電気泳動ゲル２は、例えばポリアクリルアミドゲルを一対のガラス板に挟持しており、電気泳動ゲル２の両端は電極槽４、６に浸され、電極槽４、６には、電解液、例えばTris-HCl緩衝液が収容されている。電極槽４、６の間には泳動電源８によって泳動電圧が印加される。
【００１１】
電気泳動ゲル２の一端には、後述する方法によりサンガー反応物を添加して乾燥させた膜１０を密着させる。泳動電源８が印加されると、試料は泳動バンドとなって泳動方向１４に時間とともに泳動ゲル２中を泳動して分離されていき、測定部に達する。
【００１２】
測定部には所定波長のレーザ光を発するアルゴンレーザ１８からの励起光を集光レンズ２０とミラー２１によって照射する励起系と、その励起光ビームが当たった所に泳動バンド１６があればその泳動バンド１６の蛍光物質から発せられた蛍光を対物レンズ２２で集め、干渉フィルタ２４、集光レンズ２６から光ファイバ束２７を経て光電子増倍管２８で検出する検出系が設けられている。また、集光レンズ２０、ミラー２１、対物レンズ２２、干渉フィルタ２４、集光レンズ２６及び光ファイバ束２７を含む励起・検出系を乗せ、励起光ビーム照射位置が泳動方向１４と直交する方向（走査方向２９）の測定ライン上を一定時間ごとに走査するように機械的に移動する走査ステージ３０が備えられている。
【００１３】
光電子増倍管２８の検出信号は、増幅器及びＡ／Ｄ変換器３２を経てマイクロコンピュータ３１に取り込まれる。マイクロコンピュータ３１には、また励起光ビームが泳動ゲル２上の測定部を照射するときに、その照射部の位置に対応した信号が走査データとして取り込まれる。この様にして、走査方向に走査して得られた全蛍光信号が場所情報とともにマイクロコンピュータ３１に取り込まれる。
以上の構成で、電気泳動は次のように行う。
試料として、例えば蛍光物質により標識化され、サンガー法により試料に応じて末端に塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃのいずれかがくるように処理されたＤＮＡ断片（サンガー反応物）を用いる。これら試料をナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジブロリドなどからなる膜１０に添加する。膜１０はゲル上端部に密着するように縦、横ともゲル断面より小さ目に切ってある。この膜１０を加熱したヒートブロック１１上に置く（この状態が図２(a) である）。
【００１４】
ヒートブロック１１により、９５℃にて３〜５分間加熱して膜１０上の試料を変性させた後、膜１０を電気泳動ゲル２のゲル上端部に密着させるようにおく（この状態が図２(b) である）。なお、膜１０をゲル上端部に密着させるときは、図１のゲル電気泳動装置の電極槽４は取り外してある。
【００１５】
電極槽４を取り付け、電気泳動を短時間、例えば３〜１０分行い、試料（サンガー反応物）をゲル上端部に押し込む（この状態が図２(c) である）。この後、膜片を取り除き、通常の電気泳動を再開する。試料は泳動バンド１６となって泳動方向１４に時間とともに泳動ゲル２中を泳動して分離されていき、測定部に達する。測定部で励起光ビームが当てられ、泳動バンドの蛍光物質から発せられた蛍光を対物レンズ２２で集め、干渉フィルタ２４、集光レンズ２６から光ファイバ束２７を経て光電子増倍管２８で検出される。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、例えばサンガー反応物が変性状態を保ったまま、電気泳動されるので、立体構造をとることがなく、コンプレッションが起こらない。その結果、正しいＤＮＡの塩基配列が解明される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のゲル電気泳動装置の概略図
【図２】試料をゲル電気泳動装置に投入する際の説明図
【符号の説明】
２…電気泳動ゲル ４，６…電極槽
１０…膜 １８…アルゴンレーザ
２８…光電子増倍管

Claims (1)

1. 試料を膜上に添加し、該試料が、立体構造を取る前に、変性状態になる温度条件にて乾燥後、該膜を電気泳動ゲルにロードして電気泳動を行うことを特徴とするゲル電気泳動法。

Images