JP3672928B2 - 腫瘍増殖抑制剤 - Google Patents
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Description
腫瘍の増殖の抑制のためには次の医薬が知られている。
1.シス−ジクロロジアミノ白金。広い作用範囲を有し、種々の部位の固形癌の治療に使用される〔1,2〕が高い腎毒性を示す〔3〕。
2.腫瘍の光化学療法、この場合、光増感剤−遊離テトラピロール・マクロサイクルリガンド又はそれと金属との錯体、例えばスルホン化フタロシアニンのアルミニウム錯体Al〔Pc(So3 H)4〕−が使用される。これらの使用は、表面に位置する腫瘍の場合、さらに正確には−レーザープローブ〔4〕を近づけることができる場合にのみ可能である。
3.銅(II)とグリシルグリシルヒスチジントリペプチドとの錯体(〔Cu(GGH)〕Cl)とアスコルビン酸のナトリウム塩との1:10の比率から成る医薬が、提案されるものに最も近い医薬であり;エールリッヒ腹水癌を有するマウスの寿命の延長(ILS)を生じさせる〔5〕。
原型の欠点は、腫瘍に関する該錯体の低い選択性に関連する低い有効性及び生理的条件下でのその不安定性、並びに錯体の分解生成物による高い毒性である。
本発明の目的は、腫瘍増殖の抑制のためのより効果的で且つ低毒性の薬剤を見出すことである。
提案される発明の本質は、バイオゲニック・レラクタント(biogenic reructunt)及びコバルト又は鉄と置換フタロシアニン(I)又はナフタロシアニン(II)との錯体から成る薬剤を用いて腫瘍の増殖を抑制することである。
ここで、R=COONa,So3Na,CH2C5H5N▲+▼Cl-,CH2(NH2)2S▲+▼CCl-である。
本発明の科学的基礎は、テトラピロロマクロサイクル(tetrapyrolic macrocyclic)化合物及びその金属錯体の腫瘍組織への選択的蓄積〔4,b〕についての文献的データと、特にモデル化学系において、コバルト及び鉄のフタロシアニン錯体系の高い触媒活性を示すものを我々が確立したという事実である。
1)これらは、バイオゲニックレラクタント及びその超低体、例えばアスコルビン酸、ユビキノン及びシステインの自己酸化列の同質触媒である;
2)酸素の活性型の(中間形成−スーパオキサイドのアニオン基、過酸化水素及びヒドロキシル基、そしてこれらの他の生物学的活性はよく知られている)−はこの反応により行われる〔7〕;
3)この反応の条件において、提案される錯体は核酸の酸化的分解を生じさせる。
実験の方法及び結果
細胞毒性及び核−腫瘍活性についての提案される医薬の試験は腫瘍細胞の培養(インビボ)及び移植腫瘍を有するマウス(インビボ)に対して行われる。
腫瘍細胞の培養物に対する薬剤の活性の決定(インビトロ)
方法1.
インビトロ系におけるフタロシアニンとアスコルビン酸の組合せの触媒効果の評価方法は、ヒト睾丸癌(Cao V系)の腫瘍細胞の培養物に対して開発された。
細胞の培養物を、ウシ胎児性血清の10%溶液を含む培地199中で単層に増殖せしめた。
実験の最初に細胞を全体積2mlに100000/mlの密度で細胞を接種し、そして37℃にて24時間インキュベートした。次に、下記の方法で試験を行った。
1.対照
サンプルの増殖培地を新鮮な栄養培地で置換し、そして48時間インキュベートし、次に最終濃度1μCurie/mlで3H−チミジン(3H−T)をサンプルの培地に導入し、Hankの溶液で洗浄し、過塩素酸の2.5%溶剤で洗浄し、そして酸不溶性画分を5%過塩素酸5ml中で加水分解した。体積100mlの加水分解物を、シンチレーション液9F−8を知れたフラスコに移し、そしてサンプル中の放射能のレベルをRackBetn(スエーデン)液体シンチレーションカウンターで記録した。放射能レベルの平均値を計算した。
2.Cao V系の細胞の増殖に対するアスコルビン酸の効果を評価するため、サンプルの増殖培地を、1×10-4M濃度でアスコルビン酸を含む新鮮な培地で置換し、4時間キュベートし、そして次にパラグラフ1に記載した方法に従ってサンプルを処理した。
3.Cao V系の細胞の増殖に対するフタロシアニン金属錯体の効果を評価するため、サンプルの増殖培地を、所定の濃度で錯体を含む新鮮な培地で置換し、パラグラフ1に記載の方法に従った。
4.フタロシアニンとアスコルビン酸の組合せの静細胞効果を評価するため、錯体を含む増殖培地に、1:10に等しい濃度比で、アスコルビン酸を添加し、そしてパラグラフ1に記載の方法に従った。
試験サンプル中の3H−T含量の抑制を次の式に従って計算した。
サンプル分析法を用いて結果の統計処理を行った。
方法2.
被験薬剤の静細胞活性の測定は、細胞毒性剤の作用によるヒト肺アデノカルシノーマA−549の細胞の移植された培養物の増殖の阻害に基く生物試験を用いて行われた。
A−549系の細胞を培養するため、100μg/mlのヘプタマイシン及び加熱によりあらかじめ不活性化したウシ胎児血清の10%溶液を添加したイーグル培地を用いた。細胞の培養は標準条件:5%二酸化炭素を含有する湿雰囲気中37℃、のもとで行われた。
細胞毒性生物試験が開示される際、7.5×104細胞/mlの濃度のA−539の細胞の懸濁液100μmを、平らな96穴マイクロボード(“Sarstedt”、米国)の各穴に入れ、対数増殖期の初めに100μg/穴の体積で、被験薬剤を添加した。
被験薬剤の静細胞活性は、外から導入した可溶姓3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾールブロミド(MTT,Sigma Chemical Co.,米国)−を不溶姓の結晶ホルマザンにもどす生きた試験細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼの能力に基いて、比色法により評価した。この方法においては、5μg/mlの濃度のMTTの溶液20μlを、96穴マイクロボードの各穴に入れ、その後、細胞培養物を遠心分離し、培地の全体積を穴から除去した。変色した反応生成物(ホルマザンの結晶)の可溶化のため、ミクロボードの各穴に150μlのジメチルスルホキシド(Sigma)を導入し、そしてミクロボードを室温にてインキュベートし、そして連続振とうした。結果は、ミニリーダー「Dynatech」(FRG)上で波長550nmでの吸光度に基いて記録した。
静細胞活性を試験すべき薬剤による細胞培養物の増殖阻害のレベルは次の式に従って計算した。
ここで、IPは、増殖の阻害のレベルであり;
Ptは、試験(薬剤を伴う)における増殖のレベル:試験サンプルにおける色素の吸収;
Pcは、対照(薬剤を伴わない)における増殖のレベル:
試験サンプルにおける色素の吸収;
である。
48時間のインキュベーションの間の10-4Mに等しい活性CE50の所定の基準におけるCao V系及びMCF-7系の細胞に対するアスコルビン酸(AH2)それ自体及びフタロシアニン錯体の細胞毒性の不存在下でのデーターを表1に示す。
CE50(細胞中の3H−Tの含量を50%抑制する濃度、方法1を参照のこと)が、実験条件下で1×10-4Mの場合に、化合物は活性であると考えた。提示した結果から明らかなように、錯体Co〔Nc(CH2C5H5N▲+▼)2〕Cl- 2及び錯体Fe〔Pc(COONa)8〕は限定された活性を有し、他のすべての錯体及びAH2は不活性であった。
フタロシアニン及びアスコルビン酸を非細胞毒性条件下で一緒に使用した場合にインビトロでの腫瘍細胞の増殖の阻害の研究の間に得られたデーターを表2に示す。
移植腫瘍を有するマウスに対する薬剤の抗腫瘍活性の測定(インビボ)
試験は、腫瘍系:エールリッヒ腹水癌(実施例1)、腹水性肝癌22(実施例2,3)、図形孔アデノカルシノーマCa−755(実施例4)に対して行った。
錯体を無菌生理的溶液に、0.005〜1%の濃度が得られるまで溶解した。アスコルビン酸を蒸留水又は塩化ナトリウムの等張液に溶解して0.011〜2.2%の濃度とした。錯体及びアスコルビン酸は、腹腔内に、胸膜内に、静脈内に、又は腫瘍自体に投与される。
実施例1
腫瘍、すなわちエールリッヒ腹水癌をマウスの胸膜内に移植した。実験は実施例2と同様にして行った。
処理しない対照群のマウスは、腫傷性ろく膜炎を起こして9〜15日目に死んだ。
錯体Co〔Pc(COONa)8〕の75mg/kgの1回投与及びそれに続く165m/kgのアスコルビン酸を投与を受けたマウスは18〜40日間生存した。毒性による死は観察されなかった(表3)。
実施例2
マウス当り106細胞移植量で腫瘍、腹水性肝癌22を腹腔内に移植した。両性のマウスを使用した。各マウスの体重は18g以上であった。腫瘍を移植して48時間後に処理を始めた。処理しない対照マウスは19.3+1.7日間生存し、腹水の発生を伴って死んだ。錯体Co〔Pc(COONa)8〕を100mg/kgの量で1回投与され、次にアスコルビン酸(550mg/kg)を投与されたマウスの群においては、1匹のマウスが19日目に腹水を伴って死に、9匹のマウスの内残りの8匹は腫瘍の症状を伴わないで70日以上生存した。毒性による死は観察されなかった(表3)。
実施例3
実施例1と同様にして試験を行ったが、腫瘍、腹水性肝癌22をマウスに胸膜内に移植した。
処理しない対照群のマウスは5.7+1.6日間生存し、約2.0mlの体積の胸膜腔の浸潤を伴って死んだ。
錯体Co〔Pc(COONa)8〕の75mg/kgでの1回投与及びそれに続く165mg/kgのアスコルビン酸の投与により処理されたマウスの群においては、マウス腫瘍の症状を伴わないで70日以上生存した。毒性により死は観察されなかった(表3)。
実施例4
50mgの腫瘍組織を用いて、乳アデノカルシノーマCa−755をマウスに移植した。腫瘍を移植する48時間前又は9日後に処理を開始した。錯体及びアスコルビン酸を数日間、静脈内に、腹腔内に、又は腫瘍内に投与した(表4)。
腫瘍を有するマウスを用いて得た結果を、抗腫瘍の一般に認められた指標により評価し、この際抗腫瘍治療を受けなかったマウスを対照として使用した。
次の等式を用いて寿命の延長の計算を行った。
式中、Lは、寿命(日)である。
腫瘍増殖の阻害を固形癌について次の等式を用いて計算した。
式中、Vaverageは、3次元の積として計算して立方センチメートルとして表わした腫瘍の平均体積である。
腫瘍の退化は発生した固形アデノカルシノーマCa−755について測定し、退化の%を次の等式により計算した。
式中、Rは、退化の%であり;
Voは、腫瘍の最初の平均体積であり;
Vnは、n日間処理した後の腫瘍の平均体積、
である。
従って、提案される薬剤の使用が、広範囲の悪性腫瘍の増殖を効果的に抑制すること、特に癌細胞の増殖の抑制(インビトロ)並びにマウスにおける腫瘍の増殖の阻害(インビボ)及び寿命の実質的延長、例えば原型の使用と比較して、を達成することを可能にする。
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