JP3670030B2 - MDC protein and DNA encoding the same - Google Patents

Description

【０００７】
【表２】

【０００８】
【表３】

【０００９】
これらのマーカーの中から、個体によって制限酵素断片の長さが異なる性質（ＲＦＬＰ：Restriction Fragment Length Polymorphism：制限酵素断片長多型）を持つもの、すなわちＲＦＬＰマーカーを選び出した。表４〜６に、選ばれたマーカークローンと、使用する制限酵素名、およびそれによって検出される複数種の断片の具体的断片長を記載した。
【００１０】
【表４】

【００１１】
【表５】

【００１２】
【表６】

【００１３】
ＲＦＬＰマーカーは、これを用いることによって両親から受け継いだ２本の相同染色体を多型性の差により識別できる（ informative，ただし、両方が同じ多型パターンを示す場合には識別できない： not informative ）という特徴を有している。この２本の相同染色体の多型性パターンの差（ヘテロ接合性）が、正常組織で存在し、癌組織で消失している現象（ＬＯＨ：loss of heterozygosity) が検出されることは、片方の染色体でそのＲＦＬＰマーカー部位が欠失していることを意味する。また一般的に、一対の染色体のうち一方の欠失と他方の変異などによる両方の染色体上の癌抑制遺伝子の不活化が癌化につながるものと考えられており、多くの癌に共通して欠失している領域に癌抑制遺伝子が存在しているものと考えられている。
本発明者らは、このようにして得た詳細な染色体地図とＲＦＬＰマーカーを使用して、約３００例の乳癌と約１００例の卵巣癌について第１７番染色体のＬＯＨを調べた結果、ヘテロ接合性が識別可能なケースにおいて、１７ｑ２１付近のｃＣＩ１７−７０１とｃＣＩ１７−７３０の二つのコスミド・マーカーの間の領域（２．４ｃＭ）が高頻度に欠失していることが明らかとなった。
卵巣癌における第１７番染色体染色体長腕の部分的欠失を図２に示した。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
乳癌における第１７番染色体染色体長腕の部分的欠失を図３に示した。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
【００１４】
この領域は遺伝性乳癌の家系解析から原因遺伝子の存在が示唆されている領域と一部が重なりあっていた。両者の重なりあう領域の中のコスミド・クローンをプローブとして、６５０例の乳癌症例における変異を、サザンブロット解析によって調べたところ、２例において、上記で選別されたコスミド・クローンｃＣＩ１７−９０４に含まれるＤＮＡの一部の領域が数倍に増幅していることが明らかとなった。この異常について詳細に調べたところ、約６〜９Ｋｂの断片が４〜６コピー程度の異常な繰り返しとしてつながっていることが分かった。さらに、このコスミド・クローンの制限酵素断片のうち種を越えて保存されている配列を有する断片をプローブとして、ｃＤＮＡ（メッセンジャーＲＮＡから逆翻訳された相補配列ＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングした結果、新規な蛋白質をコードする遺伝子を単離した。この遺伝子の配列構造を決定し、乳癌についての遺伝子異常の有無を調べたところ、明らかな遺伝子変異が同定された。これらのことから、本蛋白質の欠損や異常およびこれをコードする遺伝子ＤＮＡの欠失や変異が乳癌・卵巣癌の発生に深く関与していることが明らかとなった。
上記の、マーカー群から該遺伝子の単離までの過程、さらに乳癌組織で遺伝子の異常が起きていた箇所を図４に示した。クローン名はクローン番号でのみ示してある。
【００１５】
本発明は、例えば本蛋白質の欠損や異常の有無あるいはそれをコードする遺伝子の欠失や変異の有無を調べることによって、少なくとも、乳癌・卵巣癌の一部についてのリスク診断、早期発見、経過観察、治療方針の決定、予後の推定などの困難な問題に対する解決方法と材料を提供し、この分野の技術を飛躍的に進歩させ得るという点できわめて重要である。
すなわち本発明は、（１）配列番号１、２、３または４に示されたアミノ酸配列を有する蛋白質の、全部または一部を含むものからなる蛋白質、（２）配列番号５、６、７、８または９に示された塩基配列を有するＤＮＡの全部または一部を含むものからなるＤＮＡ、（３）配列番号５、６、７、８または９に示された塩基配列を有するＤＮＡの、全部または一部を組み込んだプラスミド、該プラスミドで形質転換された宿主細胞および該宿主細胞培養物より発現産物を回収することを含む蛋白質の製造方法、（４）配列番号１、２、３または４で表される蛋白質の全部または一部を含むものを抗原とする抗体、（５）配列番号５、６、７、８または９で表されるＤＮＡ配列の一部を含むプライマー、プローブまたはマーカー、またはこれらを使用することを特徴とする遺伝子解析方法、からなる。これら蛋白質とＤＮＡに関しては、それと実質的に同等であるものも本発明に含まれる。
【００１６】
以下に本発明を詳細に説明する。
（１）ｃＤＮＡクローンの単離
ヒト第１７番染色体のコスミド・クローンは、例えばヒト第１７染色体だけを含むヒト−マウスの雑種細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、時野らの報告した方法(Tokino et al., Am.J.Hum.Genet., 48, 258-268, 1991) により、その染色体ＤＮＡ断片をｐＷＥＸ１５などのベクターに組み込むことにより作成することができる。この中から、全ヒトＤＮＡをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行って、ヒト染色体由来の挿入配列（インサート）を持つクローンを選び出すことができる。
こうして得られるヒト第１７染色体由来ＤＮＡを含む多数のコスミド・クローンについて、ＦＩＳＨ法により、染色体上の位置を決定してマーカーとし、詳細な物理的染色体地図を作成することができる。また、制限酵素を用いて切断した断片長のパターンからＲＦＬＰマーカーを選別することができる（Nakamura et al., Am.J.Hum.Genet.43, 854-859,1988) 。この地図とＲＦＬＰマーカーを利用して癌患者癌組織のＤＮＡについてＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）を調べ、癌組織における染色体上の共通欠失領域を第１７番染色体のｑ２１付近のきわめて小さい領域に限局化することができる。
この限局化された領域内に存在するコスミド・クローンをプローブとして癌組織ＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより、癌組織における遺伝子異常に関わっている配列を有するクローンを選択することができる。さらにコスミド・クローンの制限酵素断片をプローブとして、種々の哺乳動物の染色体ＤＮＡに対するサザンブロット法を行うことにより、種を越えて保存されている基本的な細胞機能に関わるＤＮＡ配列を含む断片を選択することができる。重要な蛋白質をコードしているＤＮＡ配列領域は種を越えて保存されていることが多く、実際、現在までに単離された遺伝性疾患の遺伝子はその多くが種を越えて保存されている（Call,K.M. et al. Cell, 60, 509-520, 1990）。
このようにして得られたＤＮＡ断片をプローブとして用いることにより、ヒト第１７番染色体のｑ２１付近の限局化された領域に存在する遺伝子のｃＤＮＡをクローニングすることができる。ｃＤＮＡの塩基配列は常法に従って決定することができる（Maniatis,J. et al. Molecular Cloning 2nd.ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.1989)。
このようにして得られた遺伝子ＤＮＡのクローンは、その配列についてのＳＳＣＰ法( Orita,M. et al, Genomics, 5, 874-879, 1984 )( Orita,M. et al. Cell, 60, 509-520, 1990 ) 、RNase Protection法( Winter, E., Perucho,M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575-7579, 1985 )( Myers,R.M., et al. Science, 230, 1242-1246, 1985 ) などを用いた癌患者での異常の有無、異常の出現頻度の検索により、目的の原因遺伝子のクローンであることを確かめることができる。
【００１７】
（２）遺伝子の全構造の確認
上記の方法により得られたｃＤＮＡは、配列番号６および７の新規なＤＮＡ配列であることが確認され、対応する配列番号２および３のアミノ酸配列が判明した。さらに５′ＲＡＣＥ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって、配列番号８に示されるＤＮＡ配列と対応する配列番号４に示されるアミノ酸配列が明らかにされた。さらに染色体ＤＮＡについては、もとのコスミドクローンｃＣＩ１７−９０４の塩基配列を解析し、ｃＤＮＡの塩基配列と比較することによって、イントロン−エクソン結合部が確認され、イントロン／エクソンを含む配列番号９の構造が明らかにされた。
本発明者らは、これらすべてに共通のアミノ酸配列であるところの配列番号１で示される配列の全部または一部を含む蛋白質をＭＤＣ蛋白質と命名し、以下ＭＤＣ蛋白質と記載する。同様に配列番号５には、ＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡに共通のＤＮＡ配列が示されている。
本発明のＤＮＡは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、遺伝子解析、診断に利用することができる。「一部」とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドが本発明のＤＮＡ配列と相補的な少なくとも約６個の塩基配列からなり、好ましくは少なくとも約８個の塩基配列、さらに好ましくは約１０〜１２個の、さらに好ましくは約１５〜２５個の塩基配列からなる対応するポリヌクレオチドを意味する。
このＤＮＡがコードするＭＤＣ蛋白質は全部または一部をエピトープとして用いて、抗体の作成およびその抗体を用いる研究用、診断用試薬として利用することができる。「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なくとも５個のアミノ酸で構成される。（例えば、６個のアミノ酸で構成されるポリペプチドが抗体と結合することは公知である。公表特許公報60-500684 号）ＭＤＣ蛋白質の一部とは、本発明のＭＤＣ蛋白質の連続するアミノ酸配列を有する少なくとも約３〜５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。また約２０個以上のアミノ酸からなるポリペプチドであっても使用できることは言うまでもない。
「実質的に同等である」とは、ＭＤＣ蛋白質およびその一部からなるものにおいて、それらのアミノ酸配列が１つまたは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入を伴うものであって、ＭＤＣ蛋白質を用いる研究、診断に同等の効果を奏するものを意味し、これら均等物も本発明に含まれる。また本発明のＤＮＡの場合も、「実質的に同等である」とは上記蛋白質の場合と同様の意味（ただし、１つまたは複数個の塩基配列の置換、欠失、挿入を伴うもの）を示すものである。
【００１８】
（３）組換え発現ベクターとその形質転換体
上記記載の方法により得られたヒトＭＤＣ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡあるいはその断片を適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入することにより形質転換体を得ることができる。これを常法により培養し培養物よりヒトＭＤＣ蛋白質を大量に生産することができる。さらに具体的には、ヒトＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡまたはその断片を、その発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組換え発現ベクターを作成することができる。使用できるベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミドｐＲＢ３２２，ｐＵＣ１８，枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０，酵母菌由来のプラスミドｐＲＢ１５，ファージベクタ−λｇｔ１０，λｇｔ１１あるいは動物ウイルス由来のベクタ−ＳＶ４０などが挙げられるが宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば特に限定されない。プロモーターおよびターミネーターに関してもヒトＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合わせも可能である。用いるＤＮＡはヒトＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れでも良く、配列番号１、２、３または４記載の塩基配列に限定されるものではなく、意図的であるか否かにかかわらず塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。また化学合成によって合成されたものでも良い。
【００１９】
このようにして得られた組換え発現ベクターはコンピテント細胞法（J. Mol. Biol., 53, 154, 1970）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物からのＭＤＣ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲルろ過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２０】
（４）抗体の作成
抗体は、ＭＤＣ蛋白質の全部あるいは一部分を抗原として、通常の方法で作成することができる。例えば、ポリクローナル抗体はマウス、モルモット、ウサギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離して作製する。なお、市販のアジュバントも使用できる。
モノクローナル抗体は、例えば、ＭＤＣ蛋白質で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から調製することができる。
抗原とするＭＤＣ蛋白質は必ずしも全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペプチド、その変異体、誘導体、あるいは他のペプチドとの融合ペプチドであってもよく、調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
これら抗体はヒト生体試料中のＭＤＣ蛋白質の同定や定量を可能とし癌診断試薬などに使用できる。
ＭＤＣ蛋白質の免疫学的測定法は、公知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施できる。
【００２１】
（５）ヒト癌組織の遺伝子解析
遺伝子解析される生体試料はヒト正常組織、各種ヒト癌組織をはじめヒト血液、体液、分泌液などを用いることができる。ＤＮＡの抽出・調製は、たとえば（Sato T., et al. Cancer Res., 50, 7184, 1990 ）の方法で行う。
本発明により提供されるヒトＭＤＣ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片をプローブとして、または該遺伝子ＤＮＡの中から適切な位置の塩基配列を適宜選択し、その合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより該遺伝子の変異の有無を解析することができる。
また、試料中の該遺伝子における挿入、欠失などの異常もこれらの解析により検知することができる。
選択する塩基配列の部位は該遺伝子のエクソン部分、イントロン部分あるいは両部分の結合部分など、いずれも選択し得る。また用いる塩基配列を人為的に改変したものを用いることができるのは言うまでもなく、これにより対応する遺伝子変異を検出することができる。
解析の方法としては、例えば選ばれた２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で部分配列を増幅させ、増幅産物の塩基配列を直接解析するか、あるいはこの増幅産物を前記と同様にプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することができる。あるいはまた、Ligase Chain Reaction 法(Wu et al., Genomics, 4, 560-569, 1989) 、さらに、変異配列特異的ＰＣＲ法(Ruano and Kidd, Nucleic Acid Research, 17, 8392, 1989) 、(C.R.Newton et al., Nucleic Acid Research, 17, 2503-2517, 1989) を利用することにより試料中の該遺伝子の特定の変異の有無を直接検出することができる。
また同様に、選ばれたＤＮＡ配列あるいはこれに由来するＲＮＡ配列を含むプローブを用いて、ＳＳＣＰ法、RNase-Protection法により点突然変異の検出を行うことができる。またこれらのプローブを用いることにより、サザンハイブリダイゼーション法での試料中の該遺伝子の変異の検出、ノーザンハイブリダイゼーション法での試料中の該遺伝子の発現量の異常を検出することができる。
【００２２】
なお、このＭＤＣ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドを保有するEscherichia coli DH5/pBR1 、Escherichia coli XL1-Blue MRF'Kan/pCR-5P2 、および該遺伝子の染色体ＤＮＡを含むコスミドを保有するEscherichia coli 490A/cCI 17-904は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託番号FERM BP-4286、FERM BP-4555、FERM BP-4287、として平成５年４月２８日、平成６年２月８日、平成５年４月２８日寄託された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の、ヒトＭＤＣ蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの、全部またはその一部を含むものは、癌の研究試薬、検査・診断試薬および治療薬として期待される。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）ヒト第１７番染色体特異的コスミド・クローンの単離と染色体地図の作成
時野らの方法(Tokino et al., Am.J.Hum.Genet., 48, 258-268, 1991) によりヒトの正常細胞とマウスの株化細胞とを融合させた雑種細胞の中から、ヒト染色体のうち第１７番染色体のみを保有するヒト・マウス雑種細胞株（ＧＭ１０３３１）を選択した。この雑種細胞株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで適度に切断し、断片の末端をｄＡＴＰとｄＧＴＰを用いた部分的フィルインによって処理した。このうち３５〜４２ｋｂのサイズの断片を分画し、予め制限酵素ＸｈｏＩで切断し同様に末端をｄＣＴＰとｄＴＴＰを用いた部分的フィルインによって処理したコスミドベクターｐＷＥＸ１５に挿入した。こうして得られたコスミド・クローンの中から、³²Ｐラベルしたヒト染色体ＤＮＡをプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法で、ヒトのＤＮＡ断片を含むクローンを選び出すことによって３４２個のヒト第１７番染色体特異的コスミド・クローンを単離した。
これらそれぞれのヒト第１７番染色体特異的コスミド・クローンについて、そのＤＮＡ断片がハイブリダイズする染色体上の位置をＦＩＳＨ法(Inazawa et al., Genomics, 10, 1075-1078, 1991) によって決定し、第１７番染色体の物理的染色体地図を作成した（表１〜３）（図１）。
染色体上の位置を決定したコスミド・クローン（コスミド・マーカー）について、ＲＦＬＰを検出しうるか否かを、６人の非血縁者のＤＮＡを用い、既知の方法(Nakamura et al., Am.J.Hum.Genet., 43, 854-859, 1988) によって検索した。制限酵素は、Ｍｓｐ I，Ｔａｑ I，ＢｇｌII，Ｐｓｔ I，ＰｖｕII，Ｒｓａ I，ＥｃｏＲ Iのいずれかを用いた。この結果４３個のクローンがＲＦＬＰを検出した（表４〜６）、すなわちＲＦＬＰマーカーとして使用可能であった。
【００２６】
（実施例２）卵巣癌および乳癌におけるヒト第１７番染色体長腕の共通欠失領域の検索
卵巣癌９４症例と乳癌２４６症例の手術材料より腫瘍組織を得た。対応する正常組織あるいは末梢血サンプルを各々の患者より得た。これらの組織、サンプルよりＤＮＡを既知の方法(Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) で抽出した。ＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに０．１Ｎ−ＮａＯＨ／０．１Ｍ−ＮａＣｌでサザントランスファーした(Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) 。
これらのメンブレンに対して、実施例１の方法で得られたヒト第１７番染色体長腕（１７ｑ）上に位置付けられたＲＦＬＰマーカーをプローブとしてサザンハイブリダイゼーション(Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) を行うことによりＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）を検索した。結果を表７に示す。
【００２７】
【表７】

【００２８】
卵巣癌においては９４例中８４例で少なくとも１つのマーカーによりヘテロ接合性を識別可能(informative) であり、そのうち３３例（３９．３％）で少なくとも１つのマーカーによりＬＯＨが検出された。乳癌では２４６例中２１４例が少なくとも１つのマーカーについてヘテロ接合性が識別可能であり、そのうち８８例（４１．４％）で少なくとも１つのマーカーがＬＯＨを検出した。
【００２９】
上記の結果からヒト第１７番染色体長腕（１７ｑ）に部分的欠失があると判定できる例、すなわち２つ以上のマーカーでヘテロ接合性を識別可能(informative) であり、なおかつ欠失部分（ＬＯＨ検出）と保持部分（ＬＯＨ不検出）とを示す例を集めて解析した。
その結果、卵巣癌では８例で２つの共通欠失領域が見出された（図２）。１つはＣＩ１７−３１６（１７ｑ１２−２１．１）とＣＩ１７−５０７（１７ｑ２１．３）の２つのマーカー間の領域であり、もう一つはＣＩ１７−５１６（１７ｑ２５．１）マーカーより末端側の領域である。
同様に、乳癌では３５例で２つの共通欠失領域が見いだされた（図３）。１つは卵巣癌においても見いだされたＣＩ１７−７０１（１７ｑ２１．３）とＣＩ１７−７３０（１７ｑ２１．３）の２つのマーカー間の領域でありさらに狭い領域に限局化されている、もう１つはＣＩ１７−５１６（１７ｑ２５．１）マーカーより末端側の領域であり、これも卵巣癌で欠失の認められた領域である。
上記の欠失領域の解析(deletion mapping) で得られた２つの共通欠失領域のうち、ＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０の二つのマーカーの間の領域は、遺伝性乳癌および卵巣癌の家系解析(linkage mapping) の結果から発症と強く連関を示す領域１７ｑ２１（Hall et al., Am.J.Hum.Genet., 50, 1235-1242, 1992)に近いものであった。この領域の長さ（二つのマーカーの間の遺伝学的距離）はリンケージ解析法(Lathrop at al., Am.J.Hum.Genet., 37, 482-498, 1985 ;Donis-Keller et al., Cell, 51, 319-337, 1987)により２．４ｃＭと推定された。
【００３０】
（実施例３）最小限局領域に含まれるコスミド・クローンの単離
家系解析の結果から限局化された領域は１７ｑ２１上のＴＨＲＡ１とＭｆｄ１８８の２つのマーカー間の領域であることが示されている（Hall et al., Am.J.Hum.Genet., 50, 1235-1242, 1992) (Bowcock A.M. et al., Am.J.Hum.Genet., 52,718-22, 1933)ので、これらのマーカーとＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０マーカーの相対的順序を決定することにより２つの別々の戦略によって得られたマッピング情報を統合することを試みた。各マーカーの相対的順序の決定は、本発明者らが新たに開発した２色ＦＩＳＨ法（ 2-color Fish method )によって行った。この方法は、細胞の同調操作によって高度に伸展した染色体標本を作製して用いることにより精密度を増し、さらに異なる色の蛍光体で標識したプローブによっておこなうＦＩＳＨ法であり、これにより極めて近接したマーカーの相対的順序の決定が可能である。
【００３１】
その結果、Ｍｆｄ１８８マーカーはＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０のマーカーの中間に位置し、ＴＨＲＡ１マーカーはＣＩ１７−７０１よりもセントロメア側に位置することが見出された（図４ａ）。すなわち、家系解析によって限局化された遺伝性乳癌と連関する領域と、欠失領域の解析で限局化された散発性乳癌における共通欠失領域とは互いに重なり合っており、重なり合っている最小領域はＣＩ１７−７０１とＭｆｄ１８８の２つのマーカーにはさまれる領域であることを見出した（図４ａ）。パルスフィールドゲル電気泳動によりこの領域の物理的地図を作製したところ、重複領域の長さは約５００ｋｂと非常に限局化された。
さらに、実施例１の方法で得られたコスミド・クローンのうち１７ｑ２１．３に位置づけられた３７個のクローンと既知のマーカーＴＨＲＡ１、Ｍｆｄ１８８およびＰＰＹについて２色ＦＩＳＨ法による精密なマッピングを行った。その結果、ＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０の２つのマーカーに囲まれる領域に１５個のコスミド・クローンが位置づけられ、そのうち、上記重複領域上にはＣＩ１７−５２７とＣＩ１７−９０４の２つのコスミド・クローンが位置していることが判明した（図４ａ、ｂ）。
【００３２】
（実施例４）乳癌における遺伝子異常の検出
重複領域約５００ｋｂのうち約１５０ｋｂはすでに４つのコスミド・クローンＣＩ１７−７０１、ＣＩ１７−５２７、ＣＩ１７−９０４およびＭｆｄ１８８でカバ−されているので、まず６５０例の散発性乳癌組織のＤＮＡの制限酵素（ＳａｃＩ、ＰｖｕIIまたはＰｓｔＩ）断片に対してこれらのコスミド・クローンのＤＮＡあるいはその断片をプローブとしたサザンブロット解析によって、癌細胞に生じている欠失、重複、増幅、転座などの大きな構造的遺伝子異常、いわゆる遺伝子再構成を検出することを試みた。
その結果、ＣＩ１７−９０４のＤＮＡまたはその９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片（図４ｃ）をプローブとしたとき、２例の乳癌組織において遺伝子再構成が検出された（図５ａ，ｂ）。これらの遺伝子再構成は癌組織においてのみ起きており、正常組織では認められない、サイズの異なる余分のバンドが認められ、さらにいくつかのバンドの濃度が増大していた。すなわち、このプローブに対応する一定のＤＮＡ領域に遺伝子増幅が生じていた。２例のうち、１例においては、９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片（図４ｃ）と隣接するＥ−Ｈ５．２もしくはＨｉｎｄ６．１断片をプローブとして乳癌組織のＤＮＡＳａｃＩ断片に対してサザンブロット解析を行った時には遺伝子増幅は検出されなかった（図６、Case 1）。すなわち、この Case の遺伝子増幅は９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片に対応する領域内に起きており、４〜５倍に増幅していることが示された。
これを、より詳細に検討するため９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片内の６個のＳａｃＩ断片、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（図４ｃ）の各々をプローブとして乳癌組織のＤＮＡＳａｃI 断片に対してサザンブロット解析を行った。その結果、プローブＡ、Ｂで２．５ｋｂ、プローブＢ、Ｃ、Ｄで３．０ｋｂ、プローブＥ、Ｆで２．５ｋｂ、プローブＦで０．９ｋｂの異常サイズの増幅バンドが認められた（図７）。
【００３３】
他の１例においては、乳癌組織のＤＮＡＳａｃＩ断片に対してＥ−Ｈ５．２をプローブとした時に遺伝子増幅が検出された（図６、Case 2）が、Ｈｉｎｄ６．１断片をプローブとした時には検出されなかった（図６、Case 2）。この時、Ｅ−Ｈ５．２をプローブとした時にはサイズ異常を示すバンドは認められず、増幅のみが認められた。すなわち、この Case の遺伝子増幅は９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片に対応する領域内から E-H5.2 に対応する領域のさらに外側（テロミア側）にわたる範囲に起きていることが示された。
【００３４】
（実施例５）ｃＤＮＡの単離と構造決定
２例の乳癌組織において遺伝子再構成の認められた領域内あるいはその近傍から、発現されている遺伝子を単離するために、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４のＤＮＡ断片について、種を越えて保存されている基本的な細胞機能に関わるＤＮＡ配列を含むものの選択を行った。すなわち、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４のＤＮＡ断片の各々をプローブとして、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリのＤＮＡ断片のサザンブロットに対してハイブリダイゼーションを行った。その結果、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４の３．５ｋｂＨｉｎｄIII −ＫｓｐＩ断片（図４ｃ）がウシ、ブタ、マウス、ラットのＤＮＡとハイブリダイズし、種を越えてよく保存されていた。
この３．５ｋｂＨｉｎｄIII −ＫｓｐＩ断片をプローブとして乳腺、乳癌細胞株、胎児脳、大脳、小脳の５つの異なる臓器由来のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このうち、小脳ｃＤＮＡライブラリーから最長のｃＤＮＡがクローニングされた。このｃＤＮＡはコスミド・クローンＣＩ１７−９０４の３．５ｋｂＨｉｎｄIII −ＫｓｐＩ断片および隣接する複数の制限酵素断片とハイブリダイズし、その範囲は染色体上で２０ｋｂを超える領域に広がっていた。
このｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、２９２３ｂｐよりなり、２７ｂｐの５′非翻訳領域、１５７５ｂｐのコーディング領域、１３０６ｂｐの３′非翻訳領域および１５ｂｐのｐｏｌｙ（Ａ）テールを含む新規なＤＮＡ塩基配列であることを確認した（配列番号６）。このｃＤＮＡ配列に含まれるオープンリーディングフレームは、５２４アミノ酸よりなる新規な蛋白質（ＭＤＣ蛋白質：配列番号２）をコードしていた。オープンリーディングフレームの最初のＡＴＧのすぐ上流にはイン・フレームの停止コドンが存在した。ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡはポリアデニル化部位から約２０ｂｐ上流に認められた。
【００３５】
（実施例６）染色体ＤＮＡの構造決定
実施例５で得られたｃＤＮＡに対応する染色体ＤＮＡの構造を明らかにするために、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４について、このｃＤＮＡの塩基配列を含む部分とその周辺の塩基配列を決定し、両者の配列を比較することにより、エクソン−イントロン結合部を決定した。その結果、実施例５で得られたｃＤＮＡに対応する２５個のエクソンを含む新規な遺伝子ＤＮＡの配列構造が明らかとなった（配列番号９）。２５個のエクソンは比較的小さなサイズで、染色体上約２０ｋｂの領域にまたがって存在していることが示された。
【００３６】
（実施例７）乳癌における該遺伝子エクソン構造の異常の検出
実施例６で明らかとなったエクソン／イントロンを含む該遺伝子ＤＮＡの構造から、実施例４で２例の乳癌組織に共通して異常を検出したプローブ（コスミド・クローンＣＩ１７−９０４の９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片）の配列領域中に、第２、第３、第４エクソンが存在していることが明らかとなった。さらに、第２エクソンはプローブＥの配列領域中に存在し、第３、第４エクソンはプローブＦの配列領域中に存在する（図４ｃ）。従って、実施例４の９．５ｋｂのＨｉｎｄIII 断片領域を含む遺伝子再構成は該遺伝子の３つのエクソンを含む領域において正常なエクソン構造を破壊していると考えられる。このことを確認するために、第２、第３、第４エクソンに対応するＤＮＡ配列のプローブによって、上記２例の乳癌組織の染色体ＤＮＡに対するサザンブロット解析を行った結果、先に示したプローブＥあるいはプローブＦを用いて行った結果（図７）と同様の異常サイズの増幅バンドが認められた。
【００３７】
（実施例８）遺伝子発現の組織特異性
実施例５で得られたｃＤＮＡをプローブとして、種々のヒト組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、骨格筋、大腸、末梢血リンパ球、卵巣、小腸、脾臓、睾丸、胸腺）由来のｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析を行った結果、脳に最も強い発現が、心臓、卵巣、睾丸に弱い発現が認められた。
さらに、より微弱な発現を検出するためにＲＴ- ＰＣＲ(reverse-transcriptase PCR) による増幅での検出をおこなった。すなわち、種々のヒト組織由来のｍＲＮＡから逆転写酵素反応により、ランダムヘキサマーをプライマーとして１本鎖ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として実施例６で明らかとなったエクソン２１および２３の配列にそれぞれ由来するプライマーＢＣＯ９およびＢＣＯ１２を用いてＰＣＲをおこなった。その結果、期待される大きさのＰＣＲ産物は主に中枢神経系（大脳、小脳および胎児脳）と内分泌系または生殖系臓器（睾丸、卵巣、乳腺、副腎、胸腺および膵臓）に認められた。
用いたプライマーの配列は下記のとおりである。
ＢＣＯ９ 5'-GCACCTGCCCCGGCAGT-3'
( コーディング鎖、配列番号６の塩基番号 1764-1780に相当)
ＢＣＯ１２ 5'-CCAGGACAGCCCCAGCGATG-3'
( アンチセンス鎖、配列番号６の塩基番号 1976-1957に相当) 。
【００３８】
（実施例９）ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの直接塩基配列決定
ヒト胎児脳およびヒト睾丸ｍＲＮＡをもとに、エクソン１９上の配列に由来するプライマ−ＧＭＡ７０１とエクソン２１上の配列に由来するプライマ−ＧＭＢ７０４を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡの塩基配列をプライマーＧＭＡ７０２またはプライマーＧＭＢ７０３を用いて直接決定した。その結果、実施例５で得られた配列番号６の小脳由来の cＤＮＡ配列から１０塩基（塩基番号1512-1521 の欠失した配列が発見され、配列番号７のＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡが発現していることが明らかとなった。胎児脳、睾丸のいずれのｍＲＮＡでも同一の結果が得られた。配列番号７のｃＤＮＡ配列に含まれるオープンリーディングフレームは、６７０アミノ酸よりなるＭＤＣ蛋白質（配列番号３）をコードしていた。
これは配列番号９の染色体ＤＮＡ上のエクソン２０の開始が塩基番号６０７３番ではなく塩基番号６０８３番から始まる別のＲＮＡスプライシングによっているものと考えられた。このようなスプライシングのバリエーションは例えばＯｄａらの報告によっても知られている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 897-904 (1993)) 。これにより配列番号６のｃＤＮＡと配列番号７のｃＤＮＡのコードするアミノ酸配列（配列番号２と配列番号３）は、この部分以降で異なっている。すなわち配列番号６のｃＤＮＡではエクソン２０内の部分で停止コドンを生じるが、配列番号７のｃＤＮＡではリーディングフレームがシフトしてさらに下流までオープンリーディングフレームが続いている。
PCR および塩基配列決定に用いたプライマーの配列は下記のとおりである。
GMA701 5'-GGCTGCTGATCGCTTCTGCTAC-3'
( コーディング鎖、配列番号６の塩基番号 1413-1434に相当)
GMA702 5'-GAGAAGCTGAATGTGGAGGG-3'
( コーディング鎖、配列番号６の塩基番号 1435-1456に相当)
GMB703 5'-GTCAGAGCCGTCCGCCAGC-3'
( アンチセンス鎖、配列番号６の塩基番号 1675-1657に相当)
GMB704 5'-GCCATCCTCCACATAGCTCAGG-3'
( アンチセンス鎖、配列番号６の塩基番号 1696-1675に相当) 。
【００３９】
（実施例１０）ＲＡＣＥ法による５’末端配列の増幅
配列番号７のｃＤＮＡの全長ｃＤＮＡを得るため、５’−ｃＤＮＡ末端のＰＣＲ増幅（５’−ＲＡＣＥ；Frohman, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988 ；Belyavski, et al, Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1988 ）を行った。ヒト脳由来 poly A(+) RNA 2μg （Clontech社）をもとに特異的オリゴマーＳＧＮ０１２をプライマーとし市販の合成キットを使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡ末端にアンカーオリゴマーを結合する Edwards らの方法（Nucleic Acid Res. 19, 5227-5232, 1991 ）を応用した市販キットを用いて５’ＲＡＣＥを行った。キットのアンカーオリゴマーと特異的オリゴマーＳＧＮ０１２をプライマーとしてＰＣＲを行った結果、約５８０ｂｐの増幅産物を電気泳動法で検出した。
この増幅産物を電気泳動ゲルより抽出、精製し、プラスミドベクター pCR-Script （Stratagene 社）のSrf I 切断部位に挿入しクローニングした。各クローンよりプラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。そのうちの一つである pCR-5P2 はアンカーオリゴマーの配列に続いてＡＴＧから始まる５０１ｂｐのｃＤＮＡインサートを有し、その３１５番目以降の塩基配列は配列番号７の塩基番号４５（エクソン２の開始位置）以降の配列と、後述する１塩基を除いて、まったく一致した。さらに、 pCR-5P2 の最初のＡＴＧから始まるリーディングフレームは、配列番号７のｃＤＮＡのコードするポリペプチドとフレームが一致した。また、これによって得られたポリペプチド配列のＮ末端領域には疎水性に富むアミノ酸が連続するシグナルペプチドがコードされていた。
【００４０】
以上の、５’ＲＡＣＥによって得られた、５’末端配列がｍＲＮＡ上で真に配列番号７の塩基番号４５以降の配列とつながっていることを確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。ヒトの脳、胎児脳、卵巣、および睾丸由来の poly A(+) RNA（Clontech社）をもとにランダムヘキサマーをプライマーとして一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで pCR-5P2 の最初の２０塩基の配列を有するオリゴマー（ＳＧＮ０１３）をセンスプライマー、ＳＧＮ０１１またはＳＧＮ０１２をアンチセンスプライマーとした。その結果、いずれの組織のＲＮＡを用いた場合においても、期待される増幅産物（ＳＧＮ０１３／ＳＧＮ０１１で約５００ｂｐ、ＳＧＮ０１３／ＳＧＮ０１２で約７５０ｂｐ）を電気泳動法で検出した。従って、 ５’ＲＡＣＥによって得られたpCR-5P2 の５’末端配列がｍＲＮＡ上で配列番号７の塩基番号４５以降の配列とつながっていることが確認され、配列番号８のｃＤＮＡが構成された。配列番号８のｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、７６９アミノ酸よりなるＭＤＣ蛋白質（配列番号４）をコードしている。
用いた特異的オリゴマーの配列は以下の通りである。
ＳＧＮ０１１ ５’-GATGTAAGTCAAGTTCCCATCAGAGA-３’
( アンチセンス鎖、配列番号７の塩基番号 231-206に相当)
ＳＧＮ０１２ ５’-AACAGCTGGTGGTCGTTGATCACAA- ３’
( アンチセンス鎖、配列番号７の塩基番号 485-461に相当)
ＳＧＮ０１３ ５’-ATGAGGCTGCTGCGGCGCTG-３’
( コーディング鎖、配列番号８の塩基番号 1-20 に相当)
なお、エクソン２の開始位置以降で配列番号８が配列番号６または７と相違している１塩基は、エクソン２の開始位置から４番目の塩基（配列番号８の 318番目のＣ、配列番号６および７の48番目のＡ）に当たり、コ−ドするアミノ酸は配列番号４の 106番目Ｈｉｓ、配列番号２および３の７番目Ｇｌｎである。これは多型を反映しているものと考えられる。
これら３つのＭＤＣ蛋白質（配列番号２、３および４）のバリエ−ションに共通なアミノ酸配列は、488 アミノ酸からなる配列（配列番号１）であり、この部分をコ−ドするＤＮＡ配列も共通の配列（配列番号５）である。
【００４１】
（実施例１１）既知蛋白質とのホモロジー
ＭＤＣ蛋白質のアミノ酸配列は、蛇毒の出血性毒素であるＨＲ１Ｂ(Takeya et al., J.Biol.Chem.,265,16068-16073,1990)、 Prorhodostomin (Au et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.,181,585-593,1991) 、Protrigramin(Neeper et al.,Nucleic Acid Res.,18,4255,1990) とホモロジーを有していた。また、モルモット精子表層蛋白であるＰＨ３０（Blobel et al., Nature, 356, 248-252,1992）、ラットまたはサル副睾丸の蛋白であるＥＡＰI （Perry et al., Biochem.J.,286,671-675,1992 ）ともホモロジーを有していた。ＭＤＣ蛋白質、配列番号２（524 アミノ酸）、配列番号４（769 アミノ酸）とのホモロジーの「一致％／対象領域アミノ酸数」は次のとおりであった。左が配列番号２について、右が配列番号４についての値である。
ＨＲ１Ｂ ３２．５／３３５ ３２．２／３７９
Prorhodostomin ２９．０／４２０ ２９．０／４２０
Protrigramin ２７．７／４３０ ２８．１／４３８
ＰＨ３０ｂ ３８．１／１４７ ３０．８／３０２
ＥＡＰ１ ｒａｔ ３６．０／３６４ ３３．１／４７５
ＥＡＰ１ monkey ３０．４／５０３ ２９．９／５９９。
【００４２】
（実施例１２）形質転換体の作製
ＭＤＣ蛋白質（配列番号２）をコードするＤＮＡ（配列番号６）を基質として、プライマーＳＧＮ００６とＳＧＮ００８を用いて、ＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＳＧＮ００６ ５’-CACAGATCTGGGGGCATATGCTCCCTG- ３’
( コーディング鎖、配列番号6 の塩基番号 766-783に相当)
ＳＧＮ００８ ５’-AACAAGCTTCTACTGATGTCTCCCACC- ３’
( アンチセンス鎖、配列番号6 の塩基番号 1602-1585に相当、下線は終止コドンを示す)
ベクター構築用に、プライマーの５’端にはそれぞれ Bgl II 、Hind III の切断部位配列を付加してある。
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分取し、 Bgl II と Hind III で切断した。こうして得られたＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片を、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pMAL-c2 (New England Biolabs 社製) ベクターに結合してプラスミド pMAL-MDC(C1) を構築した。
同様に、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pQE-13 (Diagen 社製) ベクターに結合してプラスミド pH6-MDC(C1) を構築した。
さらに、 pMAL-MDC(C1) のＭＤＣ蛋白質コーディング領域から BamH I 切断部位（配列番号6 の塩基番号 1483 ）以降を除き、ＭＤＣ蛋白質の２つのバリエーション（配列番号２および３）に共通する部分のコーディング領域となるようにした。すなわち pMAL-MDC(C1) を BamH I と Hind III で切断し、末端を平滑化したのち再結合して、プラスミド pMAL-MDC(dC1) を構築した。
【００４３】
pMAL-c2 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側にマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質はアミロースカラムによってアフィニティー精製した。また、 pQE-13 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側に６個のヒスチジン残基よりなるペプチド（His ６）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質は金属キレートカラムによってアフィニティー精製した。
各プラスミド pMAL-MDC(C1) pMAL-MDC(dC1) および pH6-MDC(C1) を用いて E.coli JM109 をトランスフォームし、アンピシリン耐性で選択してそれぞれの形質転換体を得た。
【００４４】
（実施例１３）組換えＭＤＣ蛋白質の発現と精製
実施例１２で得られたそれぞれの形質転換体を培養し、培養物より組換えＭＤＣ融合蛋白質を抽出、精製した。
すなわち、各形質転換体を 100ml のＬＢ培地 (1%ポリペプトン、 0.5% 酵母抽出物, 1%NaCl) で 37 ℃ 一夜振とう培養した。培養液を予め 37 ℃ に加温したＬＢ培地で１０倍に希釈したうえ、さらに３０分〜９０分培養して、対数増殖期の培養物を得た。培養物１リッタ−にＩＰＴＧ（ Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside ）を終濃度１ｍＭとなるように添加して３〜４時間培養した。培養物から遠心分離により菌体を集めた。
プラスミド pMAL-MDC(C1) 、pMAL-MDC(dC1) による形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのカラムバッファー（20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕した。組換えＭＤＣ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在したので、これを遠心分離して変性バッファー（8M 尿素、 20mM Tris-HCl pH8.5, 10mM ジチオスライト−ル）に溶解した。次いで、これをカラムバッファーに透析後、遠心分離して上清可溶画分を集めた。透析不溶性画分は、さらに変性、透析、遠心分離を繰返して上清可溶画分を回収した。集めた可溶性画分をアミロースカラム (New England Biolabs 社製) にかけ、カラムバッファーで洗浄後、１０ｍＭマルトースを含むカラムバッファーで溶出した。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画した。この結果、プラスミド pMAL-MDC(C1) および pMAL-MDC(dC1) による形質転換体のそれぞれで、期待される約６８ＫｄのＭＢＰ融合蛋白質が主要バンドとして検出される画分が得られた。収量はそれぞれ４６．４ｍｇ、１０．０ｍｇであった（ＯＤ280 ＝１のとき、１mg/ml としたとき）。これらの融合蛋白質を以下、それぞれ MBP-MDC(C1)、 MBP-MDC(dC1) と称する。
【００４５】
同様に、プラスミド pH6-MDC(C1) による形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのソニケーションバッファー（10mM リン 酸ナトリウム pH8.0, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕した。組換えＭＤＣ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在したので、これを遠心分離してバッファーＡ（6M塩酸グアニジン, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, pH8.0 ) に溶解し、遠心分離して上清可溶画分を集め、Ｎｉ−ＮＴＡカラム (Diagen社製) にかけ、バッファーＡ、次いでバッファーＢ（8M尿素, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, pH8.0 )で洗浄後、バッファーＣ（8M尿素, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, pH6.3 )、バッファーＤ（8M尿素, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, pH5.9 )、バッファーＥ（8M尿素, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, pH4.5 )およびバッファーＦ（6M塩酸グアニジン, 200ｍＭ酢酸) で段階的に溶出した。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画した。この結果、バッファーＦによる溶出液に、期待される約３４Ｋｄの His６融合蛋白質が単一バンドとして検出される画分が得られた。収量は５１．９ｍｇであった（ＯＤ280 ＝１のとき、１mg/ml としたとき）。この融合蛋白質を以下、His ６-MDC(C1)と称する。
【００４６】
（実施例１４）モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体の作製
実施例１３で得られた３種の組換え融合蛋白質、His ６-MDC(C1)、 MBP-MDC(dC1) 、および MBP-MDC(C1) を、それぞれ、免疫抗原、抗体精製・スクリーニング用抗原、測定用標準抗原として用いた。
抗ＭＤＣ蛋白特異的モノクローナル抗体は、His ６-MDC(C1) をマウスに免疫して作製した。すなわち、His ６-MDC(C1) の３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００μｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合しマウスの腹腔内に１００μｇ／匹にて２週間隔で４〜６回免疫を行った。免疫終了後、Ｐ３Ｕ１細胞とＢ細胞とのハイブリドーマをＰＥＧ１５００を用いて作製し、培養上清中の抗体価をモニターし、抗ＭＤＣ蛋白特異的抗体を産生するハイブリドーマの選択を行った。
抗体価の測定は、実施例１３で得た MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化（５μｇ／ｍｌ）したポリスチレン製カップに培養上清１００μｌを加え第一反応を行い、洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Horse-raddish peroxidase）を加え第二反応を行った。洗浄後、酵素基質溶液（過酸化水素水およびＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）混合液）を添加し、発色反応（第三反応）を行いモニターした。
ハイブリドーマを９６ウエルマルチプレートにて培養し、ＨＡＴ選択を行い、約２週間後に培養上清中の抗体価を測定し抗原と特異的に反応するクローンを選択した。更に、クローニング操作を行い、３クローン（Ｇ１−５Ａ２−２Ｃ８，Ｇ２−２Ｆ２−３Ｄ１１，Ｇ２−２Ｄ１０−３Ｆ５）を抗体産生ハイブリドーマとして樹立した。樹立したクローンの産生抗体のクラスおよびサブクラスは、Ｇ１−５Ａ２−２Ｃ８はＩｇＧ₁ ，Ｇ２−２Ｆ２−３Ｄ１１は、ＩｇＧ_2b、Ｇ２−２Ｄ１０−３Ｆ５はＩｇＭであった。各ハイブリドーマ細胞３００万個を、予め約１週間前に０.5ml のプリスタンを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウスの腹腔内に接種し、８〜１０日後に腹水を採取した。各腹水よりプロテインＧカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製した。
【００４７】
同様に、実施例１３で得られた His６-MDC(C1) を免疫抗原として、ウサギに免疫し、抗ＭＤＣ蛋白ポリクローナル抗体を作製した。
すなわち、マウスと同様、 His６-MDC(C1) の３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００μｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合し免疫を行った。免疫終了後、抗血清を得、実施例１３で得た MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化したポリスチレン製カップを用いて、抗体価を測定した。抗血清を５００倍から６４０００倍まで希釈し、その１００μｌをウエルに添加し、抗体価をヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検討したところ、６４０００倍まで検出が可能であった。また、免疫前の血清中には、 MBP-MDC(dC1) と反応する抗体が存在しなかったことから、ＭＤＣ蛋白質に特異的に反応する抗体が産生されていることが確認することができた。さらに、この抗血清を、プロテインＧカラムおよび MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化したセファロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００４８】
このようにして得られた精製モノクローナル抗体および精製ウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＭＤＣ蛋白質の定量法を確立した。
すなわち、ハイブリドーマ（Ｇ２−２Ｆ２−３Ｄ１１）由来の精製モノクローナル抗体を９６ウエルプレートに固相化し、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）でブロッキング後、精製 MBP-MDC(C1) 溶液を被検液として、0.156 〜5.00 ug/mlの範囲で 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させた。ウエルを洗浄後、精製ウサギポリクローナル抗体溶液（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させた。ウエルを洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させた。反応終了後２ｍＭアジ化ナトリウムを 100 ul ／ウエルずつ添加し、405nm と 490nm の吸光値を測定した。得られた差分吸光値は、被検液濃度とよく相関した値を示し、０〜２．５μｇ／ｍｌの間でほぼ直線的な関係であることが確かめられた（図８）。このことは、これらのモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ法がＭＤＣ蛋白質の定量法として充分に使用できることを示している。
【００４９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：４８８
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー

【００５０】
配列番号：2
配列の長さ：５２４
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー

【００５１】
配列番号：３
配列の長さ：６７０
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー

【００５２】
配列番号：４
配列の長さ：７６９
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー

【００５３】
配列番号：５
配列の長さ：１４６４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．１４６４
特徴を決定した方法：Ｅ

【００５４】
配列番号：６
配列の長さ：２９２３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：５’ＵＴＲ
存在位置：１．．２７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：１６００．．２９２３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２８．．１５９９
特徴を決定した方法：Ｅ

【００５５】
配列番号：７
配列の長さ：２９１３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：５’ＵＴＲ
存在位置：１．．２７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：２０３８．．２９１３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２８．．２０３７
特徴を決定した方法：Ｅ

【００５６】
配列番号：８
配列の長さ：３１８３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：２３０８．．３１８３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．２３０７
特徴を決定した方法：Ｅ

【００５７】
配列番号：９
配列の長さ：９２７８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：exon 1
存在位置：２８．．４４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 2
存在位置：３０８．．３７４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 3
存在位置：９０９．．９９４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 4
存在位置：１０８１．．１１５６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 5
存在位置：１５９１．．１６５７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 6
存在位置：１７２５．．１７９２
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 7
存在位置：２１８２．．２２５６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 8
存在位置：２３３９．．２４１０
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 9
存在位置：２５８８．．２７５４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 10
存在位置：３２４８．．３３３２
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 11
存在位置：３４４５．．３５３５
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 12
存在位置：３６４５．．３６９６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 13
存在位置：４０１４．．４１１３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 14
存在位置：４１９６．．４２６７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 15
存在位置：４３８６．．４４７８
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 16
存在位置：４９２０．．５０００
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 17
存在位置：５３４７．．５３９７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 18
存在位置：５５０１．．５５６４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 19
存在位置：５７６７．．５８６６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 20
存在位置：６０７３．．６２０２
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 21
存在位置：６３００．．６４６８
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 22
存在位置：６５５７．．６６７１
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 23
存在位置：６７５６．．６８４６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 24
存在位置：７８２９．．７８４６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 25
存在位置：８１６５．．９０３８
特徴を決定した方法：Ｅ

【図面の簡単な説明】
【図１】３４２個のコスミド・クローンの第１７番染色体上の位置を示した図である。クローン名はクローン番号のみで示してある。
【図２】卵巣癌における第１７番染色体長腕の部分的欠失を示した図である。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
【図３】乳癌における第１７番染色体長腕の部分的欠失を示した図である。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
【図４】第１７番染色体長腕２１．３領域に位置づけられたマーカーから該遺伝子の単離に至る過程、および乳癌組織で遺伝子再構成の起きている箇所（斜線の矩形）を示した図である。クローン名はクローン番号のみで示してある。
【図５】乳癌における遺伝子再構成のサザンブロットによる検出を示した図であり、Ｎは正常組織のＤＮＡ、Ｔは癌組織ＤＮＡを示す。
【図６】乳癌における遺伝子再構成のサザンブロットによる検出を示した図であり、Ｎは正常組織のＤＮＡ、Ｔは癌組織ＤＮＡを示す。
【図７】乳癌における遺伝子再構成のサザンブロットによる検出を示した図であり、Ｎは正常組織のＤＮＡ、Ｔは癌組織ＤＮＡを示す。
【図８】モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体でのＥＬＩＳＡ法によるＭＤＣ蛋白質の濃度測定検量線の図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an MDC protein, a gene DNA encoding the same, and a gene analysis method using the DNA, and is used in fields such as medicine and diagnosis.
[0002]
[Prior art]
The idea that cellular protein mutations play an important role in the development of cancer has long been known. Recent developments in genetic engineering have made it possible to amplify gene DNAs encoding specific proteins and to analyze gene mutations in cancer cells, leading to dramatic developments in the field of cancer research.
So far, analysis and identification of a gene (oncogene) encoding a protein that is thought to be involved in canceration of cells and abnormal growth of cancer cells has progressed, and the number thereof has reached several tens. On the other hand, the one that acts in the opposite direction (tumor suppressor gene) has been in the limelight for several years, and so far the Rb gene of retinoblastoma (Friend, SHet al., Proc. Natl. Acad) Sci. USA. 84, 9095, 1987), p53 gene of colorectal cancer (Lane, DP et al., Nature, 278, 261, 1979) and APC gene (Kenneth, WK, et al, Science 253, 661, 1991). ), The WT1 gene of Wilms tumor (Call, KM et al., Cell, 60, 509, 1990) has been discovered, and in the case of the p53 gene, there is an example in which the mutant gene is transmitted through the family (" Li-Fraumeni syndrome "(Makin, D. et al, Science 250, 1233, 1990; Srivastava, S. et al, Nature 348, 747, 1990)). In addition, it is becoming increasingly clear that not only one gene abnormality but also multiple gene abnormalities are involved in cancer development, progression malignancy, metastasis, etc., and more unidentified oncogenes, It is thought that a tumor suppressor gene exists. Their discovery and elucidation are expected by research and clinical experts as well as by people all over the world.
[0003]
Breast cancer is divided into hereditary (familial) breast cancer and non-hereditary (sporadic) breast cancer. Hereditary breast cancer is divided into early-onset and late-onset types according to the age of onset. Of these, at least in hereditary and early-onset breast cancers, pedigree analysis reveals a very high frequency of lack of a small portion of chromosome 17 (Hall, JM et al., Science, 250, 1684-1689, 1990). It has also been shown that this same site is frequently deleted in hereditary ovarian cancer (Narod, SA et al., Lancet, 338, 82-83, 1991).
Therefore, a tumor suppressor gene exists at this deletion site, and protein deficiency or abnormality caused by the deletion or mutation is considered to be one of the causes of breast cancer and ovarian cancer.
Also, in the occurrence of general (sporadic) breast cancer, protein abnormalities or defects due to acquired mutations or deletions of the gene at this site occur, and it is considered that the cells are involved in cancer. (Sato et al., Cancer Res., 51, 5794-5799, 1991). For this reason, isolating the causative gene present at this site and identifying the protein is now expected to be a serious problem not only for doctors and researchers around the world but also for the general public, especially in Europe and the United States, where there are many breast cancer patients. ing.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel protein related to breast cancer and ovarian cancer, a gene encoding the same, and a cancer testing method, a diagnostic method, and the like using them.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors made many cosmid clones into which a DNA fragment of human chromosome 17 was introduced. Furthermore, the position of the cosmid clone on the chromosome was determined by fluorescence in situ hybridization using the DNA fragment as a probe (FISH method; Inazawa et al., Genomics, 10, 1075-1078, 1991). did. A very detailed physical chromosome map for chromosome 17 was created by cosmid clones (cosmid markers) whose positions on these chromosomes were determined. Tables 1 to 3 and FIG. 1 show a list of clone names of each cosmid used as a probe and the determined positions on the chromosome. In FIG. 1, the clone name is indicated only by the clone number.
[0006]
[Table 1]

[0007]
[Table 2]

[0008]
[Table 3]

[0009]
Among these markers, those having a property (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism), that is, a restriction fragment length polymorphism, was selected from individuals. Tables 4 to 6 list the selected marker clones, the names of the restriction enzymes used, and the specific fragment lengths of the multiple types of fragments detected thereby.
[0010]
[Table 4]

[0011]
[Table 5]

[0012]
[Table 6]

[0013]
The RFLP marker can be used to distinguish two homologous chromosomes inherited from parents by polymorphism differences (informative, but not both when both show the same polymorphic pattern: not informative) It has characteristics. The difference in polymorphism pattern (heterozygosity) between the two homologous chromosomes is detected in the normal tissue and disappeared in the cancer tissue (LOH: loss of heterozygosity). It means that the RFLP marker site is deleted in the chromosome. In general, inactivation of tumor suppressor genes on both chromosomes due to deletion of one of the pair of chromosomes and mutation of the other is thought to lead to canceration. It is considered that a tumor suppressor gene is present in the deleted region.
The present inventors examined the LOH of chromosome 17 in about 300 breast cancers and about 100 ovarian cancers using the detailed chromosome map and RFLP marker thus obtained. In the case where sex was identifiable, it was revealed that the region (2.4 cM) between the two cosmid markers cCI17-701 and cCI17-730 near 17q21 was frequently deleted.
The partial deletion of chromosome 17 long arm in ovarian cancer is shown in FIG. Black circles indicate loss of heterozygosity (LOH), and white circles indicate retention. Two common deletion regions are indicated by a side line.
The partial deletion of chromosome 17 long arm in breast cancer is shown in FIG. Black circles indicate loss of heterozygosity (LOH), and white circles indicate retention. Two common deletion regions are indicated by a side line.
[0014]
This region partially overlapped with the region where the presence of the causative gene was suggested by the family analysis of hereditary breast cancer. Using cosmid clones in the overlapping region as probes, mutations in 650 breast cancer cases were examined by Southern blot analysis, and 2 cases were included in the cosmid clone cCI17-904 selected above. It became clear that a partial region of DNA was amplified several times. When this abnormality was examined in detail, it was found that fragments of about 6-9 Kb were connected as abnormal repeats of about 4-6 copies. Furthermore, as a result of screening a cDNA (complementary sequence DNA reverse-translated from messenger RNA) library using a fragment having a sequence conserved across species among the restriction enzyme fragments of this cosmid clone, The gene encoding the protein was isolated. When the sequence structure of this gene was determined and examined for the presence or absence of a gene abnormality for breast cancer, a clear gene mutation was identified. From these facts, it has been clarified that the deficiency or abnormality of this protein and the deletion or mutation of the gene DNA encoding it are deeply involved in the development of breast cancer and ovarian cancer.
FIG. 4 shows the above-described process from the marker group to the isolation of the gene, as well as the location where the gene abnormality occurred in the breast cancer tissue. The clone name is indicated only by the clone number.
[0015]
The present invention, for example, by investigating the presence or absence of this protein deficiency or abnormality, or the presence or absence of a gene coding for it, or the presence or absence of a mutation, at least risk diagnosis, early detection, follow-up of a part of breast cancer / ovarian cancer It is extremely important in that it can provide solutions and materials for difficult problems such as decision making and prognosis, and can make significant progress in this field of technology.
That is, the present invention relates to (1) a protein comprising all or part of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4, (2) SEQ ID NO: 5, 6, 7, DNA comprising all or part of DNA having the base sequence shown in 8 or 9, (3) all DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 or 9 Or a plasmid incorporating a part thereof, a host cell transformed with the plasmid, and a method for producing a protein comprising recovering an expression product from the host cell culture, (4) in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 An antibody having an antigen containing all or a part of the protein represented as an antigen, (5) a primer, a probe or a marker comprising a part of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 or 9, or these Gene analysis method characterized by using, consisting of. As for these proteins and DNA, those substantially equivalent thereto are also included in the present invention.
[0016]
The present invention is described in detail below.
(1) Isolation of cDNA clone
A cosmid clone of human chromosome 17 can be obtained by, for example, extracting chromosomal DNA from a human-mouse hybrid cell containing only human chromosome 17, and using the method reported by Tokino et al., Am. J. Hum Genet., 48, 258-268, 1991) can be prepared by incorporating the chromosomal DNA fragment into a vector such as pWEX15. Among these, colony hybridization can be performed using total human DNA as a probe, and a clone having an insertion sequence (insert) derived from a human chromosome can be selected.
With respect to a large number of cosmid clones containing DNA derived from human chromosome 17 obtained in this way, a detailed physical chromosome map can be prepared by determining the position on the chromosome by using the FISH method as a marker. In addition, an RFLP marker can be selected from a fragment length pattern cleaved by using a restriction enzyme (Nakamura et al., Am. J. Hum. Genet. 43, 854-859, 1988). Using this map and the RFLP marker, LOH (loss of heterozygosity) is examined for the cancer tissue DNA of cancer patients, and the common deletion region on the chromosome in the cancer tissue is changed to a very small region near q21 of chromosome 17. Can be localized.
By performing Southern blot analysis of cancer tissue DNA using a cosmid clone present in this localized region as a probe, a clone having a sequence involved in gene abnormality in the cancer tissue can be selected. In addition, by using Southern blotting on chromosomal DNA of various mammals using restriction enzyme fragments of cosmid clones as a probe, fragments containing DNA sequences related to basic cellular functions conserved across species are selected. can do. DNA sequence regions that encode important proteins are often conserved across species, and in fact, many genetic disease genes isolated to date are conserved across species (Call, KM et al. Cell, 60, 509-520, 1990).
By using the DNA fragment thus obtained as a probe, cDNA of a gene present in a localized region near q21 of human chromosome 17 can be cloned. The base sequence of cDNA can be determined according to a conventional method (Maniatis, J. et al. Molecular Cloning 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY1989).
The clone of the gene DNA thus obtained was analyzed by the SSCP method (Orita, M. et al, Genomics, 5, 874-879, 1984) (Orita, M. et al. Cell, 60, 509). -520, 1990), RNase Protection method (Winter, E., Perucho, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575-7579, 1985) (Myers, RM, et al. Science, 230, 1242-1246, 1985), etc., can be confirmed to be a clone of the target causative gene by searching for the presence or absence of abnormality in cancer patients and the frequency of occurrence of the abnormality.
[0017]
(2) Confirmation of the entire structure of the gene
The cDNA obtained by the above method was confirmed to be a novel DNA sequence of SEQ ID NOs: 6 and 7, and the corresponding amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3 were found. Further, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 corresponding to the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 8 was clarified by 5′RACE method, RT-PCR method and the like. For chromosomal DNA, the base sequence of the original cosmid clone cCI17-904 was analyzed and compared with the base sequence of cDNA to confirm the intron-exon junction, and the structure of SEQ ID NO: 9 containing intron / exon Was revealed.
The present inventors named a protein containing all or part of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is an amino acid sequence common to all of them as an MDC protein, and hereinafter referred to as an MDC protein. Similarly, SEQ ID NO: 5 shows a DNA sequence common to DNA encoding MDC protein.
The DNA of the present invention can be used for gene analysis and diagnosis by using a part of the DNA as a primer or probe. “Partial” means that the oligonucleotide used as a primer or probe consists of at least about 6 base sequences complementary to the DNA sequence of the present invention, preferably at least about 8 base sequences, more preferably about 10 It means a corresponding polynucleotide consisting of ˜12, more preferably about 15-25 base sequences.
The whole or part of the MDC protein encoded by this DNA can be used as an epitope for the production of antibodies and for research and diagnosis using the antibodies. “Epitope” means an antigenic determinant of a polypeptide and generally consists of at least 5 amino acids. (For example, it is known that a polypeptide composed of 6 amino acids binds to an antibody. Published Patent Publication No. 60-500684) A part of the MDC protein is a continuous amino acid sequence of the MDC protein of the present invention. Means a polypeptide consisting of at least about 3-5 amino acids, preferably at least about 8-10 amino acids, more preferably at least about 11-20 amino acids. Needless to say, even a polypeptide comprising about 20 or more amino acids can be used.
“Substantially equivalent” means that an MDC protein and a part thereof, the amino acid sequence of which is accompanied by substitution, deletion or insertion of one or more amino acids, Means equivalent to research and diagnosis, and these equivalents are also included in the present invention. Also, in the case of the DNA of the present invention, “substantially equivalent” has the same meaning as in the case of the above protein (however, it involves substitution, deletion, or insertion of one or a plurality of base sequences). It is shown.
[0018]
(3) Recombinant expression vector and its transformant
A transformant can be obtained by incorporating the gene DNA encoding the human MDC protein obtained by the above-described method or a fragment thereof into an appropriate vector and transferring the vector into an appropriate host cell. This is cultured by a conventional method, and a large amount of human MDC protein can be produced from the culture. More specifically, a recombinant expression vector is prepared by recombining DNA encoding a human MDC protein or a fragment thereof by a known method using a restriction enzyme and DNA ligase downstream of the promoter suitable for the expression thereof. be able to. Examples of the vector that can be used include E. coli-derived plasmid pRB322, pUC18, Bacillus subtilis-derived plasmid pUB110, yeast-derived plasmid pRB15, phage vector-λgt10, λgt11, or animal virus-derived vector-SV40. The vector is not particularly limited as long as the vector can be replicated and amplified. The promoter and terminator are not particularly limited as long as they correspond to the host used for the expression of the DNA base sequence encoding the human MDC protein, and appropriate combinations are possible depending on the host. The DNA to be used may be any DNA that encodes human MDC protein, and is not limited to the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4, and the nucleotide sequence regardless of whether it is intentional or not. A part of the DNA may be a DNA having a base sequence substituted, deleted, inserted, or a combination thereof. Further, it may be synthesized by chemical synthesis.
[0019]
The recombinant expression vectors thus obtained are competent cell method (J. Mol. Biol., 53, 154, 1970), protoplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978). , Calcium phosphate method (Science, 221, 551, 1983), in vitro packaging method (Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975), viral vector method (Cell, 37, 1053, 1984), etc. To produce a transformant. As the host, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells and the like are used, and the obtained transformant is cultured in a suitable medium according to the host. The culture is usually carried out in the range of 20 ° C. to 45 ° C. and pH 5 to 8, and aeration and agitation are performed as necessary. Separation / purification of the MDC protein from the culture may be performed by appropriately combining known separation / purification methods. These known methods include salting out, solvent precipitation, dialysis gel filtration, electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography and the like.
[0020]
(4) Preparation of antibody
An antibody can be prepared by an ordinary method using all or part of the MDC protein as an antigen. For example, a polyclonal antibody is prepared by inoculating a mouse, a guinea pig, a rabbit, or other animal subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, or intravenously multiple times and then sufficiently immunizing, and then collecting blood and separating serum from the animal. Commercially available adjuvants can also be used.
The monoclonal antibody can be prepared from, for example, a hybridoma obtained by cell fusion of a mouse spleen cell immunized with MDC protein and a commercially available mouse myeloma cell, and then prepared from the hybridoma culture supernatant or the ascites fluid of the hybridoma-administered mouse. it can.
The MDC protein used as an antigen does not necessarily have the entire amino acid structure, and may be a peptide having a partial structure, a mutant, derivative thereof, or a fusion peptide with another peptide. Any chemical synthesis method may be used.
These antibodies enable identification and quantification of MDC proteins in human biological samples and can be used as cancer diagnostic reagents.
The immunological measurement method of MDC protein may be in accordance with a known method, and can be carried out by any method such as a fluorescent antibody method, a passive agglutination method, and an enzyme antibody method.
[0021]
(5) Genetic analysis of human cancer tissue
As a biological sample to be genetically analyzed, normal human tissues, various human cancer tissues, human blood, body fluids, secretions, and the like can be used. DNA extraction / preparation is performed, for example, by the method of (Sato T., et al. Cancer Res., 50, 7184, 1990).
By using the restriction enzyme fragment of the gene DNA encoding the human MDC protein provided by the present invention as a probe, or by appropriately selecting a base sequence at an appropriate position from the gene DNA, and using the synthetic oligonucleotide as a primer The presence or absence of mutation of the gene can be analyzed.
Abnormalities such as insertions and deletions in the gene in the sample can also be detected by these analyses.
As the site of the base sequence to be selected, any of exon part, intron part or binding part of both parts of the gene can be selected. Needless to say, artificially modified nucleotide sequences can be used, whereby the corresponding gene mutation can be detected.
As an analysis method, for example, a partial sequence is amplified by a PCR method using primers of two selected sequences, and the base sequence of the amplified product is directly analyzed, or the amplified product is incorporated into a plasmid as described above, Host cells can be transformed and cultured, and the base sequences of the resulting clones can be analyzed. Alternatively, the ligase chain reaction method (Wu et al., Genomics, 4, 560-569, 1989), and the mutant sequence-specific PCR method (Ruano and Kidd, Nucleic Acid Research, 17, 8392, 1989), (CRNewton et al., Nucleic Acid Research, 17, 2503-2517, 1989) can directly detect the presence or absence of a specific mutation of the gene in a sample.
Similarly, a point mutation can be detected by the SSCP method or the RNase-Protection method using a probe containing a selected DNA sequence or an RNA sequence derived therefrom. Further, by using these probes, it is possible to detect mutations in the gene in the sample by the Southern hybridization method, and to detect abnormalities in the expression level of the gene in the sample by the Northern hybridization method.
[0022]
Note that Escherichia coli DH5 / pBR1 and Escherichia coli XL1-Blue MRF'Kan / pCR-5P2 possessing a plasmid containing the gene DNA encoding this MDC protein, and Escherichia coli 490A possessing a cosmid containing the chromosomal DNA of the gene / cCI 17-904 was deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. Deposit was made on April 28, 1993.
[0023]
【The invention's effect】
The human MDC protein and the gene DNA encoding the protein of the present invention containing all or a part thereof are expected as cancer research reagents, test / diagnostic reagents and therapeutic agents.
[0024]
【Example】
The present invention will be described in detail and specifically by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0025]
(Example 1) Isolation of human chromosome 17-specific cosmid clone and preparation of chromosome map
From hybrid cells obtained by fusing human normal cells and mouse cell lines by the method of Tokino et al. (Tokino et al., Am. J. Hum. Genet., 48, 258-268, 1991) A human / mouse hybrid cell line (GM10331) having only chromosome 17 was selected from human chromosomes. The chromosomal DNA of this hybrid cell line was appropriately cut with the restriction enzyme Sau3AI, and the ends of the fragments were treated with partial fill-in using dATP and dGTP. Among these fragments, a fragment having a size of 35 to 42 kb was fractionated and inserted into a cosmid vector pWEX15 previously cut with a restriction enzyme XhoI and similarly treated with a partial fill-in using dCTP and dTTP. From the cosmid clones thus obtained, ³² 342 human chromosome 17 specific cosmid clones were isolated by selecting clones containing human DNA fragments by colony hybridization using P-labeled human chromosomal DNA as a probe.
For each of these human chromosome 17-specific cosmid clones, the position on the chromosome where the DNA fragment hybridizes was determined by the FISH method (Inazawa et al., Genomics, 10, 1075-1078, 1991). A physical chromosome map of chromosome 17 was created (Tables 1 to 3) (FIG. 1).
Whether or not RFLP can be detected for a cosmid clone (cosmid marker) whose position on a chromosome has been determined using DNA of 6 unrelated individuals (Nakamura et al., Am. J. Hum. Genet., 43, 854-859, 1988). As the restriction enzyme, any of Msp I, Taq I, Bgl II, Pst I, Pvu II, Rsa I, and EcoR I was used. As a result, 43 clones detected RFLP (Tables 4 to 6), that is, they could be used as RFLP markers.
[0026]
(Example 2) Search for common deletion region of long arm of human chromosome 17 in ovarian cancer and breast cancer
Tumor tissues were obtained from surgical materials of 94 cases of ovarian cancer and 246 cases of breast cancer. Corresponding normal tissue or peripheral blood samples were obtained from each patient. DNA was extracted from these tissues and samples by a known method (Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990). The DNA was cleaved with an appropriate restriction enzyme, subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, and Southern transferred to a nylon membrane with 0.1 N NaOH / 0.1 M NaCl (Sato et al., Cancer Res., 50 , 7184-7189, 1990).
Southern hybridization (Sato et al., Cancer Res., 50) was performed on these membranes using the RFLP marker positioned on the long arm (17q) of human chromosome 17 obtained by the method of Example 1 as a probe. , 7184-7189, 1990) to search for LOH (loss of heterozygosity). The results are shown in Table 7.
[0027]
[Table 7]

[0028]
In ovarian cancer, 84 out of 94 cases were heterozygous with at least one marker, and 33 cases (39.3%) detected LOH with at least one marker. In breast cancer, 214 of 246 cases were discriminable for heterozygosity for at least one marker, of which 88 (41.4%) detected LOH.
[0029]
From the above results, it is possible to determine that there is a partial deletion in human chromosome 17 long arm (17q), that is, it is possible to identify heterozygosity with two or more markers (informative), and the deletion portion ( Examples showing LOH detection) and holding parts (LOH non-detection) were collected and analyzed.
As a result, two common deletion regions were found in 8 cases of ovarian cancer (FIG. 2). One is the region between the two markers, CI17-316 (17q12-21.1) and CI17-507 (17q21.3), and the other is the region distal to the CI17-516 (17q25.1) marker It is.
Similarly, two common deletion regions were found in 35 cases of breast cancer (FIG. 3). One is a region between two markers, CI17-701 (17q21.3) and CI17-730 (17q21.3), also found in ovarian cancer, and the other is localized to a narrower region, It is a region on the terminal side of the CI17-516 (17q25.1) marker, and this is also a region in which deletion was observed in ovarian cancer.
Of the two common deletion regions obtained by the above deletion mapping (deletion mapping), the region between the two markers CI17-701 and CI17-730 is a family analysis of hereditary breast cancer and ovarian cancer. From the result of (linkage mapping), it was close to the region 17q21 (Hall et al., Am. J. Hum. Genet., 50, 1235-1242, 1992) showing strong association with the onset. The length of this region (the genetic distance between the two markers) is determined by linkage analysis (Lathrop at al., Am. J. Hum. Genet., 37, 482-498, 1985; Donis-Keller et al. , Cell, 51, 319-337, 1987).
[0030]
(Example 3) Isolation of a cosmid clone contained in a minimal local region
The results of pedigree analysis indicate that the localized region is a region between two markers of THRA1 and Mfd188 on 17q21 (Hall et al., Am. J. Hum. Genet., 50, 1235). -1242, 1992) (Bowcock AM et al., Am. J. Hum. Genet., 52,718-22, 1933), so by determining the relative order of these markers and the CI17-701 and CI17-730 markers An attempt was made to integrate the mapping information obtained by two separate strategies. The relative order of each marker was determined by the 2-color Fish method newly developed by the present inventors. This method is a FISH method in which the precision is increased by preparing and using a chromosome specimen that is highly stretched by the synchronization operation of the cells, and further using a probe labeled with a phosphor of a different color. Can be determined.
[0031]
As a result, it was found that the Mfd188 marker is located between CI17-701 and CI17-730, and the THRA1 marker is located on the centromere side of CI17-701 (FIG. 4a). That is, the region associated with hereditary breast cancer localized by pedigree analysis and the common deletion region in sporadic breast cancer localized by analysis of the deletion region overlap each other, and the overlapping minimum region is CI17. It was found that the region was sandwiched between two markers -701 and Mfd188 (FIG. 4a). When a physical map of this region was prepared by pulse field gel electrophoresis, the length of the overlapping region was very limited to about 500 kb.
Further, among the cosmid clones obtained by the method of Example 1, 37 clones positioned at 17q21.3 and the known markers THRA1, Mfd188 and PPY were precisely mapped by the two-color FISH method. As a result, 15 cosmid clones are located in the region surrounded by the two markers, CI17-701 and CI17-730, of which two cosmid clones, CI17-527 and CI17-904, are located on the overlapping region. Was found to be located (FIGS. 4a, b).
[0032]
(Example 4) Detection of genetic abnormality in breast cancer
Since about 150 kb of the overlapping region of about 500 kb is already covered by four cosmid clones CI17-701, CI17-527, CI17-904, and Mfd188, DNA restriction enzymes (650 cases of sporadic breast cancer tissue) Large structural genes such as deletions, duplications, amplifications, translocations, etc. occurring in cancer cells by Southern blot analysis using the DNA of these cosmid clones or a fragment thereof as a probe for SacI, PvuII or PstI) fragments An attempt was made to detect abnormalities, so-called gene rearrangements.
As a result, gene rearrangement was detected in two breast cancer tissues when CI17-904 DNA or its 9.5 kb HindIII fragment (FIG. 4c) was used as a probe (FIGS. 5a and b). These gene rearrangements occurred only in cancer tissues, and extra bands of different sizes that were not observed in normal tissues were observed, and the concentrations of some bands were increased. That is, gene amplification occurred in a certain DNA region corresponding to this probe. Of the two cases, in one case, when a 9.5 kb HindIII fragment (FIG. 4c) and the adjacent E-H5.2 or Hind6.1 fragment were used as probes, the DNASacI fragment of breast cancer tissue was subjected to Southern blot analysis. Amplification was not detected (Figure 6, Case 1). That is, it was shown that gene amplification in this case occurred in the region corresponding to the 9.5 kb HindIII fragment and was amplified 4 to 5 times.
In order to examine this in more detail, the six SacI fragments within the 9.5 kb HindIII fragment, each of A, B, C, D, E, and F (FIG. 4c) were probed against the DNASacI fragment of breast cancer tissue. Blot analysis was performed. As a result, amplification bands of 2.5 kb for probes A and B, 3.0 kb for probes B, C and D, 2.5 kb for probes E and F, and 0.9 kb for probe F were observed (FIG. 5). 7).
[0033]
In another example, gene amplification was detected when E-H5.2 was used as a probe for the DNASacI fragment of breast cancer tissue (FIG. 6, Case 2), but detected when the Hind6.1 fragment was used as a probe. (Figure 6, Case 2). At this time, when E-H5.2 was used as a probe, no band showing size abnormality was observed, and only amplification was observed. That is, it was shown that gene amplification in this case occurred in a range extending from the region corresponding to the 9.5 kb HindIII fragment to the outer side (the telomere side) of the region corresponding to E-H5.2.
[0034]
(Example 5) Isolation and structure determination of cDNA
The cosmid clone CI17-904 DNA fragment was conserved across species in order to isolate the expressed gene from within or near the region where gene rearrangement was observed in two breast cancer tissues. Selection was made for those containing DNA sequences involved in basic cell function. That is, hybridization was performed on Southern blots of bovine, porcine, mouse, rat, and chicken DNA fragments using each of the DNA fragments of cosmid clone CI17-904 as a probe. As a result, the 3.5 kb HindIII-KspI fragment of cosmid clone CI17-904 (FIG. 4c) hybridized with bovine, porcine, mouse, and rat DNA and was well conserved across species.
Using this 3.5 kb HindIII-KspI fragment as a probe, a human cDNA library derived from 5 different organs of mammary gland, breast cancer cell line, fetal brain, cerebrum, and cerebellum was screened. Of these, the longest cDNA was cloned from a cerebellar cDNA library. This cDNA hybridized with the 3.5 kb HindIII-KspI fragment of cosmid clone CI17-904 and a plurality of adjacent restriction enzyme fragments, and the range spread over a region exceeding 20 kb on the chromosome.
As a result of analyzing the base sequence of this cDNA, it was found to be a novel DNA base sequence comprising 2923 bp, including a 27 bp 5 ′ untranslated region, a 1575 bp coding region, a 1306 bp 3 ′ untranslated region and a 15 bp poly (A) tail. It was confirmed (SEQ ID NO: 6). The open reading frame contained in this cDNA sequence encoded a novel protein consisting of 524 amino acids (MDC protein: SEQ ID NO: 2). There was an in-frame stop codon immediately upstream of the first ATG of the open reading frame. A polyadenylation signal AATAAA was found approximately 20 bp upstream from the polyadenylation site.
[0035]
(Example 6) Determination of structure of chromosomal DNA
In order to elucidate the structure of the chromosomal DNA corresponding to the cDNA obtained in Example 5, for the cosmid clone CI17-904, the portion containing the base sequence of this cDNA and the surrounding base sequence were determined. Exon-intron junctions were determined by comparing the sequences. As a result, the sequence structure of a novel gene DNA containing 25 exons corresponding to the cDNA obtained in Example 5 was clarified (SEQ ID NO: 9). Twenty-five exons were shown to be relatively small in size and span a region of about 20 kb on the chromosome.
[0036]
(Example 7) Detection of abnormality of the gene exon structure in breast cancer
From the structure of the gene DNA containing exons / introns clarified in Example 6, a probe (9.5 kb HindIII fragment of cosmid clone CI17-904 that detected an abnormality in common in two breast cancer tissues in Example 4) It has been clarified that the second, third and fourth exons are present in the sequence region. Furthermore, the second exon is present in the sequence region of probe E, and the third and fourth exons are present in the sequence region of probe F (FIG. 4c). Therefore, the gene rearrangement including the 9.5 kb HindIII fragment region of Example 4 is considered to disrupt the normal exon structure in the region containing three exons of the gene. In order to confirm this, Southern blot analysis was performed on the chromosomal DNA of the breast cancer tissues of the above two cases using probes having DNA sequences corresponding to the second, third, and fourth exons. Or the amplification band of the abnormal size similar to the result (FIG. 7) performed using the probe F was recognized.
[0037]
(Example 8) Tissue specificity of gene expression
Using the cDNA obtained in Example 5 as a probe, various human tissues (brain, heart, kidney, liver, lung, pancreas, placenta, skeletal muscle, large intestine, peripheral blood lymphocyte, ovary, small intestine, spleen, testis, thymus) As a result of Northern blot analysis of the mRNA derived from), the strongest expression was observed in the brain and weak expression was observed in the heart, ovary, and testis.
Furthermore, in order to detect weaker expression, detection by amplification by RT-PCR (reverse-transcriptase PCR) was performed. That is, single-stranded cDNA was synthesized from various human tissue-derived mRNAs by reverse transcriptase reaction using random hexamers as primers. Using this as a template, PCR was performed using primers BCO9 and BCO12 derived from the sequences of exons 21 and 23 clarified in Example 6, respectively. As a result, PCR products of the expected size were found mainly in the central nervous system (cerebrum, cerebellum and fetal brain) and endocrine or reproductive organs (testis, ovary, mammary gland, adrenal gland, thymus and pancreas).
The primer sequences used are as follows.
BCO9 5'-GCACCTGCCCCGGCAGT-3 '
(Coding strand, equivalent to base number 1764-1780 of SEQ ID NO: 6)
BCO12 5'-CCAGGACAGCCCCAGCGATG-3 '
(Antisense strand, corresponding to nucleotide numbers 1976-1957 of SEQ ID NO: 6).
[0038]
(Example 9) Direct nucleotide sequence determination of mRNA by RT-PCR
Based on human fetal brain and human testicular mRNA, RT-PCR was performed using primer-GMA701 derived from the sequence on exon 19 and primer-GMB704 derived from the sequence on exon 21, and the base of the amplified DNA The sequence was determined directly using primer GMA702 or primer GMB703. As a result, a cerebellum-derived cDNA sequence of SEQ ID NO: 6 obtained in Example 5 was found to have a 10 base-deleted sequence (base numbers 1512-1521), and mRNA corresponding to the DNA sequence of SEQ ID NO: 7 was expressed. The same results were obtained with both fetal brain and testis mRNA, and the open reading frame contained in the cDNA sequence of SEQ ID NO: 7 is an MDC protein consisting of 670 amino acids (SEQ ID NO: 3). ).
This was thought to be due to the start of exon 20 on the chromosomal DNA of SEQ ID NO: 9 by another RNA splicing starting from base number 6083 rather than base number 6073. Such splicing variations are also known, for example, from a report by Oda et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 897-904 (1993)). Thereby, the amino acid sequences (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) encoded by the cDNA of SEQ ID NO: 6 and the cDNA of SEQ ID NO: 7 are different from this part onward. That is, in the cDNA of SEQ ID NO: 6, a stop codon is generated in the portion within exon 20, but in the cDNA of SEQ ID NO: 7, the reading frame is shifted and the open reading frame continues further downstream.
The primer sequences used for PCR and sequencing were as follows.
GMA701 5'-GGCTGCTGATCGCTTCTGCTAC-3 '
(Coding strand, equivalent to base number 1413-1434 of SEQ ID NO: 6)
GMA702 5'-GAGAAGCTGAATGTGGAGGG-3 '
(Coding strand, equivalent to base number 1435-1456 of SEQ ID NO: 6)
GMB703 5'-GTCAGAGCCGTCCGCCAGC-3 '
(Antisense strand, corresponding to nucleotide numbers 1675-1657 of SEQ ID NO: 6)
GMB704 5'-GCCATCCTCCACATAGCTCAGG-3 '
(Antisense strand, corresponding to nucleotide numbers 1696-1675 of SEQ ID NO: 6).
[0039]
(Example 10) Amplification of 5 'terminal sequence by RACE method
PCR amplification of 5′-cDNA ends (5′-RACE; Frohman, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavski) , et al, Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1988). Single-stranded cDNA was synthesized based on 2 μg of human brain-derived poly A (+) RNA (Clontech) using a specific oligomer SGN012 as a primer and a commercially available synthesis kit. 5′RACE was performed using a commercially available kit to which the method of Edwards et al. (Nucleic Acid Res. 19, 5227-5232, 1991) for linking an anchor oligomer to the end of a single-stranded cDNA was applied. As a result of PCR using the kit's anchor oligomer and specific oligomer SGN012 as primers, an amplification product of about 580 bp was detected by electrophoresis.
This amplified product was extracted from an electrophoresis gel, purified, inserted into the Srf I cleavage site of plasmid vector pCR-Script (Stratagene), and cloned. Plasmid DNA was purified from each clone and the nucleotide sequence was determined. One of them, pCR-5P2, has a 501 bp cDNA insert starting from ATG following the sequence of the anchor oligomer, and the base sequence after the 315 th is base number 45 of SEQ ID NO: 7 (exon 2 start position). Except for the subsequent sequence, it was completely identical except for one base described later. Furthermore, the reading frame starting from the first ATG of pCR-5P2 coincided with the polypeptide encoded by the cDNA of SEQ ID NO: 7. In addition, a signal peptide in which amino acids rich in hydrophobicity are continuous was encoded in the N-terminal region of the polypeptide sequence thus obtained.
[0040]
RT-PCR was performed in order to confirm that the 5 ′ terminal sequence obtained by the above 5 ′ RACE was truly connected to the sequence of SEQ ID NO: 7 and subsequent nucleotide numbers 45 on mRNA. Based on poly A (+) RNA (Clontech) derived from human brain, fetal brain, ovary, and testis, single-stranded cDNA was synthesized using random hexamer as a primer, and then the first 20 bases of pCR-5P2 The oligomer (SGN013) having the above sequence was used as a sense primer, and SGN011 or SGN012 was used as an antisense primer. As a result, the expected amplification product (about 500 bp for SGN013 / SGN011, about 750 bp for SGN013 / SGN012) was detected by electrophoresis even when RNA of any tissue was used. Therefore, it was confirmed that the 5 ′ end sequence of pCR-5P2 obtained by 5 ′ RACE was connected to the sequence after base number 45 of SEQ ID NO: 7 on mRNA, and the cDNA of SEQ ID NO: 8 was constructed. The open reading frame of the cDNA of SEQ ID NO: 8 encodes an MDC protein (SEQ ID NO: 4) consisting of 769 amino acids.
The sequence of the specific oligomer used is as follows.
SGN011 5'-GATGTAAGTCAAGTTCCCATCAGAGA-3 '
(Antisense strand, corresponding to nucleotide numbers 231-206 of SEQ ID NO: 7)
SGN012 5'-AACAGCTGGTGGTCGTTGATCACAA-3 '
(Antisense strand, corresponding to nucleotide numbers 485-461 of SEQ ID NO: 7)
SGN013 5'-ATGAGGCTGCTGCGGCGCTG-3 '
(Coding strand, equivalent to base numbers 1-20 of SEQ ID NO: 8)
Note that one base having SEQ ID NO: 8 different from SEQ ID NO: 6 or 7 after the start position of exon 2 is the fourth base from the start position of exon 2 (318th C of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 6). The amino acid to be coded is the 106th His of SEQ ID NO: 4 and the 7th Gln of SEQ ID NOS: 2 and 3. This is considered to reflect the polymorphism.
The amino acid sequence common to the variations of these three MDC proteins (SEQ ID NOs: 2, 3 and 4) is a sequence consisting of 488 amino acids (SEQ ID NO: 1), and the DNA sequence coding for this part is also common. It is a sequence (SEQ ID NO: 5).
[0041]
(Example 11) Homology with known protein
The amino acid sequence of MDC protein is HR1B (Takeya et al., J. Biol. Chem., 265, 16068-16073, 1990), Prorhodostomin (Au et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 585-593, 1991) and Protrigramin (Neeper et al., Nucleic Acid Res., 18, 4255, 1990). In addition, PH30 (Blobel et al., Nature, 356, 248-252, 1992), a guinea pig sperm surface protein, and EAPI (Perry et al., Biochem. J., 286, 671-675), a protein of rat or monkey epididymis. , 1992) also had homology. The homology “% match / number of amino acids in the target region” of MDC protein, SEQ ID NO: 2 (524 amino acids), SEQ ID NO: 4 (769 amino acids) was as follows. The values for SEQ ID NO: 2 on the left and for SEQ ID NO: 4 on the right.
HR1B 32.5 / 335 32.2 / 379
Prorhodostomin 29.0 / 420 29.0 / 420
Protrigramin 27.7 / 430 28.1 / 438
PH30b 38.1 / 147 30.8 / 302
EAP1 rat 36.0 / 364 33.1 / 475
EAP1 monkey 30.4 / 503 29.9 / 599.
[0042]
(Example 12) Production of transformant
Using a DNA (SEQ ID NO: 6) encoding MDC protein (SEQ ID NO: 2) as a substrate, a DNA fragment encoding a part of the MDC protein was amplified by PCR using primers SGN006 and SGN008. The primer sequences used are as follows.
SGN006 5'-CACAGATCTGGGGGCATATGCTCCCTG-3 '
(Coding strand, equivalent to base number 766-783 of SEQ ID NO: 6)
SGN008 5'-AACAAGCTT CTA CTGATGTCTCCCACC-3 '
(Antisense strand, corresponding to nucleotide numbers 1602-1585 of SEQ ID NO: 6, underlined indicates stop codon)
For the construction of the vector, Bgl II and Hind III cleavage site sequences were added to the 5 ′ end of the primer, respectively.
PCR amplification products were separated by agarose gel electrophoresis and cleaved with Bgl II and Hind III. The DNA fragment encoding a part of the MDC protein thus obtained was ligated to pMAL-c2 (New England Biolabs) vector previously cut with BamH I and Hind III and ligated to plasmid pMAL-MDC (C1). Built.
Similarly, the plasmid pH6-MDC (C1) was constructed by ligation to a pQE-13 (Diagen) vector that had been cleaved with BamHI and HindIII in advance.
Furthermore, except for the BamH I cleavage site (base number 1483 of SEQ ID NO: 6) and beyond from the MDC protein coding region of pMAL-MDC (C1), coding for the portion common to the two variations of the MDC protein (SEQ ID NO: 2 and 3) It became an area. That is, pMAL-MDC (C1) was cleaved with BamH I and Hind III, the ends were blunted, and recombined to construct plasmid pMAL-MDC (dC1).
[0043]
Since the fragment incorporated into the pMAL-c2 vector is expressed as a fusion protein having a maltose binding protein (MBP) on the N-terminal side, the fusion protein was affinity purified by an amylose column. In addition, since the fragment incorporated into the pQE-13 vector is expressed as a fusion protein having a peptide consisting of 6 histidine residues (His 6) on the N-terminal side, the fusion protein was affinity purified by a metal chelate column. .
Each plasmid pMAL-MDC (C1) pMAL-MDC (dC1) and pH6-MDC (C1) was used to transform E. coli JM109 and selected for ampicillin resistance to obtain each transformant.
[0044]
(Example 13) Expression and purification of recombinant MDC protein
Each transformant obtained in Example 12 was cultured, and recombinant MDC fusion protein was extracted from the culture and purified.
Specifically, each transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 100 ml of LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl). The culture solution was diluted 10-fold with LB medium preliminarily heated to 37 ° C., and further cultured for 30 to 90 minutes to obtain a logarithmic growth phase culture. IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) was added to 1 liter of the culture to a final concentration of 1 mM and cultured for 3 to 4 hours. Cells were collected from the culture by centrifugation.
In the case of transformants using plasmids pMAL-MDC (C1) and pMAL-MDC (dC1), 10 ml of column buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl) was added to the cells and disrupted by ultrasonic waves. Since the recombinant MDC fusion protein was present in the insoluble fraction of the disrupted solution, it was centrifuged and dissolved in a denaturing buffer (8 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mM dithiothrite). Subsequently, this was dialyzed against a column buffer and centrifuged to collect a supernatant soluble fraction. The dialysis-insoluble fraction was further subjected to denaturation, dialysis and centrifugation, and the supernatant soluble fraction was collected. The collected soluble fraction was applied to an amylose column (manufactured by New England Biolabs), washed with the column buffer, and eluted with a column buffer containing 10 mM maltose. The eluted fraction was analyzed and fractionated by absorbance at 280 nm and SDS polyacrylamide electrophoresis (Coomassie blue staining). As a result, in each of the transformants using the plasmids pMAL-MDC (C1) and pMAL-MDC (dC1), a fraction in which the expected MBP fusion protein of about 68 Kd was detected as the main band was obtained. Yields were 46.4 mg and 10.0 mg, respectively (when OD280 = 1, 1 mg / ml). These fusion proteins are hereinafter referred to as MBP-MDC (C1) and MBP-MDC (dC1), respectively.
[0045]
Similarly, in the case of a transformant using plasmid pH6-MDC (C1), 10 ml of sonication buffer (10 mM sodium phosphate pH 8.0, 200 mM NaCl) was added to the cells and disrupted by ultrasonic waves. Since the recombinant MDC fusion protein was present in the insoluble fraction of the disrupted solution, it was centrifuged and buffer A (6M guanidine hydrochloride, 100 mM NaH ₂ PO _Four , 10 mM Tris-HCl, pH 8.0), centrifuged and collected the supernatant soluble fraction, applied to a Ni-NTA column (Diagen), buffer A, then buffer B (8M urea, 100 mM NaH) ₂ PO _Four , 10 mM Tris-HCl, pH 8.0), then buffer C (8 M urea, 100 mM NaH ₂ PO _Four , 10mM Tris-HCl, pH6.3), buffer D (8M urea, 100mM NaH) ₂ PO _Four , 10 mM Tris-HCl, pH 5.9), buffer E (8 M urea, 100 mM NaH ₂ PO _Four , 10 mM Tris-HCl, pH 4.5) and buffer F (6M guanidine hydrochloride, 200 mM acetic acid). The eluted fraction was analyzed and fractionated by absorbance at 280 nm and SDS polyacrylamide electrophoresis (Coomassie blue staining). As a result, a fraction in which the expected His6 fusion protein of about 34 Kd was detected as a single band in the eluate with buffer F was obtained. The yield was 51.9 mg (when OD280 = 1, 1 mg / ml). Hereinafter, this fusion protein is referred to as His 6-MDC (C1).
[0046]
(Example 14) Production of monoclonal antibody and rabbit polyclonal antibody
The three types of recombinant fusion proteins obtained in Example 13, His 6-MDC (C1), MBP-MDC (dC1), and MBP-MDC (C1), were used as an immunizing antigen and an antigen for antibody purification / screening, respectively. And used as a standard antigen for measurement.
An anti-MDC protein-specific monoclonal antibody was prepared by immunizing mice with His 6-MDC (C1). Specifically, His 6-MDC (C1) 3M urea / PBS solution (500-1000 μg / ml) was mixed with complete adjuvant at a ratio of 1: 1, and 100 μg / mouse was intraperitoneally injected into the mouse at 4-week intervals. Six immunizations were performed. After completion of immunization, a hybridoma of P3U1 cells and B cells was prepared using PEG1500, the antibody titer in the culture supernatant was monitored, and a hybridoma producing an anti-MDC protein-specific antibody was selected.
The antibody titer was measured by adding 100 μl of the culture supernatant to a polystyrene cup on which the MBP-MDC (dC1) fusion protein obtained in Example 13 was solid-phased (5 μg / ml). Mouse IgG-HRP (Horse-raddish peroxidase) was added to carry out a second reaction. After washing, an enzyme substrate solution (hydrogen peroxide solution and ABTS (2,2′-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) mixed solution) is added, and a color reaction (third reaction) is performed. And monitored.
The hybridoma was cultured in a 96-well multiplate and subjected to HAT selection. After about 2 weeks, the antibody titer in the culture supernatant was measured to select a clone that reacts specifically with the antigen. Further, a cloning operation was performed, and 3 clones (G1-5A2-2C8, G2-2F2-3D11, G2-2D10-3F5) were established as antibody-producing hybridomas. The class and subclass of antibodies produced by the established clones are: G1-5A2-2C8 is IgG ₁ , G2-2F2-3D11 is IgG _2b G2-2D10-3F5 was IgM. Three million hybridoma cells were inoculated intraperitoneally into BALB / c mice that had been intraperitoneally administered with 0.5 ml of pristane about one week ago, and ascites was collected 8-10 days later. The antibody was purified from each ascites by affinity chromatography using a protein G column.
[0047]
Similarly, rabbits were immunized with His6-MDC (C1) obtained in Example 13 as an immunizing antigen, and anti-MDC protein polyclonal antibody was prepared.
That is, as in the case of mice, immunization was performed by mixing a 3M urea / PBS solution (500-1000 μg / ml) of His6-MDC (C1) at a ratio of 1: 1 with complete adjuvant. After completion of immunization, antiserum was obtained, and the antibody titer was measured using a polystyrene cup on which the MBP-MDC (dC1) fusion protein obtained in Example 13 was immobilized. The antiserum was diluted from 500 times to 64000 times, 100 μl thereof was added to the well, and the antibody titer was examined using goat anti-rabbit IgG-HRP. As a result, detection was possible up to 64000 times. In addition, since there was no antibody that reacts with MBP-MDC (dC1) in the serum before immunization, it was confirmed that an antibody that specifically reacts with MDC protein was produced. . Furthermore, this antiserum was purified by affinity chromatography using a Sepharose column on which a protein G column and MBP-MDC (dC1) fusion protein were immobilized.
[0048]
A method for quantifying MDC protein by ELISA using the purified monoclonal antibody and purified rabbit polyclonal antibody thus obtained was established.
Specifically, a purified monoclonal antibody derived from a hybridoma (G2-2F2-3D11) was immobilized on a 96-well plate, blocked with BSA (Bovine serum albumin), and purified MBP-MDC (C1) solution was used as a test solution. 100 ul / well was added in the range of 5.00 ug / ml and reacted at room temperature for 1 hour. After washing the wells, purified rabbit polyclonal antibody solution (5 ug / ml) was added at 100 ul / well and allowed to react for 1 hour at room temperature. After washing the wells, anti-rabbit IgG-HRP (5 ug / ml) was added at 100 ul / well and allowed to react for 1 hour at room temperature. After completion of the reaction, 2 mM sodium azide was added at 100 ul / well, and the absorbance values at 405 nm and 490 nm were measured. The obtained differential absorbance value showed a value well correlated with the test solution concentration, and it was confirmed that the difference was approximately linear between 0 and 2.5 μg / ml (FIG. 8). This indicates that the ELISA method using these monoclonal antibodies and rabbit polyclonal antibodies can be sufficiently used as a method for quantifying MDC protein.
[0049]
[Sequence Listing]
SEQ ID NO: 1
Sequence length: 488
Sequence type: amino acid
Sequence type: Protein
Topology: Linear
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library

[0050]
SEQ ID NO: 2
Sequence length: 524
Sequence type: amino acid
Sequence type: Protein
Topology: Linear
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library

[0051]
SEQ ID NO: 3
Sequence length: 670
Sequence type: amino acid
Sequence type: Protein
Topology: Linear
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library

[0052]
SEQ ID NO: 4
Sequence length: 769
Sequence type: amino acid
Sequence type: Protein
Topology: Linear
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library

[0053]
SEQ ID NO: 5
Sequence length: 1464
Sequence type: Nucleic acid
Number of strands: double strand
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library
Sequence features
Symbols representing features: CDS
Location: 1. . 1464
Method for determining characteristics: E

[0054]
SEQ ID NO: 6
Sequence length: 2923
Sequence type: Nucleic acid
Number of strands: double strand
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library
Sequence features
Character representing the feature: 5 'UTR
Location: 1. . 27
Method for determining characteristics: E
Character representing the feature: 3'UTR
Location: 1600. . 2923
Method for determining characteristics: E
Symbols representing features: CDS
Location: 28. . 1599
Method for determining characteristics: E

[0055]
SEQ ID NO: 7
Sequence length: 2913
Sequence type: Nucleic acid
Number of strands: double strand
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human fetal brain cDNA library
Sequence features
Character representing the feature: 5 'UTR
Location: 1. . 27
Method for determining characteristics: E
Character representing the feature: 3'UTR
Location: 2038. . 2913
Method for determining characteristics: E
Symbols representing features: CDS
Location: 28. . 2037
Method for determining characteristics: E

[0056]
SEQ ID NO: 8
Sequence length: 3183
Sequence type: Nucleic acid
Number of strands: double strand
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human brain cDNA library
Sequence features
Character representing the feature: 3'UTR
Location: 2308. . 3183
Method for determining characteristics: E
Symbols representing features: CDS
Location: 1. . 2307
Method for determining characteristics: E

[0057]
SEQ ID NO: 9
Sequence length: 9278
Sequence type: Nucleic acid
Number of strands: double strand
Topology: Linear
Sequence type: Genomic DNA
origin
Name of organism: Homo sapiens
Direct origin
Library name: Human DNA cosmid library
Sequence features
Symbols for features: exon 1
Location: 28. . 44
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 2
Location: 308. . 374
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 3
Location: 909. . 994
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 4
Location: 1081. . 1156
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 5
Location: 1591. . 1657
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 6
Location: 1725. . 1792
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 7
Location: 2182. . 2256
Method for determining characteristics: E
Character representing the feature: exon 8
Location: 2339. . 2410
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 9
Location: 2588. . 2754
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 10
Location: 3248. . 3332
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 11
Location: 3445. . 3535
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 12
Location: 3645. . 3696
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 13
Location: 4014. . 4113
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 14
Location: 4196. . 4267
Method for determining characteristics: E
Character representing the feature: exon 15
Location: 4386. . 4478
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 16
Location: 4920. . 5000
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 17
Location: 5347. . 5397
Method for determining characteristics: E
Characteristic symbol: exon 18
Location: 5501. . 5564
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 19
Location: 5767. . 5866
Method for determining characteristics: E
Characteristic symbol: exon 20
Location: 6073. . 6202
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 21
Location: 6300. . 6468
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 22
Location: 6557. . 6671
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 23
Location: 6756. . 6846
Method for determining characteristics: E
Characteristic symbol: exon 24
Location: 7829. . 7846
Method for determining characteristics: E
Symbols for features: exon 25
Location: 8165. . 9038
Method for determining characteristics: E

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the positions of chromosomes of 342 cosmid clones on chromosome 17. The clone name is shown only by the clone number.
FIG. 2 shows a partial deletion of the long arm of chromosome 17 in ovarian cancer. Black circles indicate loss of heterozygosity (LOH), and white circles indicate retention. Two common deletion regions are indicated by a side line.
FIG. 3 shows a partial deletion of the long arm of chromosome 17 in breast cancer. Black circles indicate loss of heterozygosity (LOH), and white circles indicate retention. Two common deletion regions are indicated by a side line.
FIG. 4 is a diagram showing the process from the marker located in the long arm 21.3 region of chromosome 17 to the isolation of the gene, and the location where gene rearrangement occurs in breast cancer tissue (hatched rectangle) It is. The clone name is shown only by the clone number.
FIG. 5 shows detection of gene rearrangement in breast cancer by Southern blot, where N is normal tissue DNA and T is cancer tissue DNA.
FIG. 6 shows detection of gene rearrangement in breast cancer by Southern blot, where N is normal tissue DNA and T is cancer tissue DNA.
FIG. 7 shows detection of gene rearrangement in breast cancer by Southern blot, where N is normal tissue DNA and T is cancer tissue DNA.
FIG. 8 is a calibration curve for measuring the concentration of MDC protein by ELISA using a monoclonal antibody and a rabbit polyclonal antibody.

Claims (11)

An MDC protein comprising the entire protein shown in SEQ ID NO: 2. An MDC protein comprising the entire protein shown in SEQ ID NO: 3. DNA comprising all of the DNA shown in SEQ ID NO: 6. DNA comprising all of the DNA shown in SEQ ID NO: 7. A DNA comprising the entire DNA containing exons / introns as shown in SEQ ID NO: 9. A plasmid comprising the DNA according to claim 3, 4 or 5 . A transformant carrying the plasmid according to claim 6 . Protein The method according to any one of claims 1 or 2 by culturing the transformant of claim 7, and recovering the expression product. An antibody that binds to the protein according to claim 1 . A primer or probe comprising the DNA sequence according to claim 3, 4 or 5 . A gene analysis method comprising hybridizing the primer or probe according to claim 10 with a test DNA.

Images