JP3649460B2

JP3649460B2 - Japanese cedar pollen allergen Cry j II epitope

Info

Publication number: JP3649460B2
Application number: JP29784094A
Authority: JP
Inventors: 敏雄曽根; 直樹小宮山; 光助紀
Original assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Current assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: JPH0847392A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、スギ花粉症の診断、予防もしくは治療に有用な、スギ花粉アレルゲンCry j IIのエピトープのT 細胞エピトープを含むペプチド、または該ペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スギ花粉症は、スギ花粉が飛散する春先にほぼ全国的に観察されるアレルギー性疾患であり、くしゃみや鼻汁、目のかゆみ等を伴うアレルギー症状を呈する。その患者数は、1970年以降急激に増加しており、現在全国民の10% 弱に当たる約一千万人がスギ花粉症に苦しめられている。
【０００３】
アレルギー性疾患を形成するアレルギー反応は、R. G. H. Gell とR. R. A. Coombs によりＩ型〜IV型の4 種に分類されており、スギ花粉症はＩ型に属する。
Ｉ型アレルギーの発症機序は以下の通りである。
【０００４】
アレルギー反応を引き起こす分子をアレルゲン（本明細書では抗原ともいう）というが、花粉の場合このアレルゲンがタンパク質抗原である。これらの外来タンパク質抗原が体内に侵入すると、抗原提示細胞（マクロファージ）に取込まれ、タンパク分解酵素によって分解されてペプチド断片になり、主要組織適合抗原複合体（Major Histocompatibility Complex: MHC ）クラスII分子（ヒトではHLA クラスII分子）と結合した状態で、細胞膜上に提示される。HLA クラスII分子は多型性を示すが、CD4 ⁺Ｔ細胞のレセプターは、HLA クラスII分子と結合した抗原ペプチドを、そのHLA クラスII分子の多型性を示す部分と共に認識し、抗原特異的に活性化される。活性化されたCD4 ⁺Ｔ細胞は、Th0 細胞、Th1 / Th2 細胞に分化し、種々のサイトカインを産生する。その際、それぞれの細胞のサイトカイン産生パターンは異なっており、Th1 はIL-2、IFN γを、Th2 はIL-4、IL-5、IL-10 等を、Th0 は両者のサイトカインを産生する。
【０００５】
一方、B 細胞は細胞表面にIgM あるいはIgD を表現しており、抗原を細胞内に取込むことによって活性化される。その際、Th2 から産生されるサイトカインの作用によって、活性化されたB 細胞は抗体産生細胞にまで分化増殖し、抗原特異的な免疫グロブリンE （IgE ）を産生する。このようにして産生されたIgE は、気道あるいは鼻粘膜組織中のマスト（肥満）細胞や血液中の好塩基球にIgE レセプターを介して強固に結合し、感作が成立した状態になる。
【０００６】
再び、アレルゲンが体内に侵入すると、1 分子のアレルゲンは、直ちにマスト細胞や好塩基球上の2 分子以上のIgE と結合し、架橋構造を形成する。その結果、IgE 分子と結合しているレセプター同士が会合し、これが引き金となって、細胞膜内の幾種類もの酵素が活性化され、ヒスタミンやプロスタグランジン、ロイコトリエンといった種々の化学伝達物質が細胞から放出される。これらの化学伝達物質が鼻粘膜や気道などの局所に作用して、色々なアレルギー症状を引き起こす。
【０００７】
なお、T 細胞によって認識されるエピトープをT 細胞エピトープ、B 細胞によって認識されるエピトープをB 細胞エピトープという。
【０００８】
アレルゲンのエピトープは、Ｉ型アレルギーの発症及び増悪に直接関与していると考えられるので、アレルゲンのエピトープを同定することは、Ｉ型アレルギーの診断、予防及び治療に有用である。
【０００９】
スギ花粉の主要アレルゲンは、安枝らによって単離精製され、Sugi Basic Protein（SBP ）と命名された（Yasueda, H., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 71, 77-86, 1983）。このSBP は、分子量が45〜50kDa で、WHO の命名法に従い現在Cry j I と呼ばれている。更にその後、Cry j I の分離精製の過程で、Cry j I とは抗原性の異なる、分子量が37kDa のCry j IIが分離された（Taniai, M. et al. FEBS Letters 239, 329-332,1988、Sakaguchi, M. et al. Allergy 45, 309-312,1990 ）。
【００１０】
これらの結果、Cry j I とCry j IIとは全く異なるタンパクであることが明らかとなったが、スギ花粉症患者では、Cry j I とCry j IIの両者が反応していることが報告された。すなわち、145 名のスギ花粉症患者血清中、134 名（92.4% ）の血清がCry j I 及びCry j IIと反応し、6 名（4.1%）の血清がCry j I とのみに反応し、5 名（3.4%）の血清がCry j IIとのみ反応することが判明した（1993年第43回日本アレルギー学会、橋本ら、日獣大、予研、国立相模原病院、林原生化研）。つまり、スギ花粉症の発症には、Cry j I 及びCry j IIのどちらも重要であることが示された。
【００１１】
Cry j I については、それをコードするcDNAがクローニングされ、その推定アミノ酸配列に基づき、T 細胞エピトープを含むペプチドが同定されている（WO94/01560、"ALLERGENIC PROTEINS AND PEPTIDES FROM JAPANESE CEDAR POLLEN")。Cry j IIについては、N 末端のアミノ酸配列のAla 、Ile 、Asn 、Ile 、Phe 、Asn 、Val 、Glu 、Lys 及びTyr の10アミノ酸残基が報告されている（Sakaguchi, M., et al., Allergy 45, 309-312, 1990）に過ぎない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、スギ花粉症の診断、予防及び治療に有用な、スギ花粉アレルゲンCry j II の T 細胞エピトープを含むペプチドおよび該ペプチドをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、上記課題を解決するために、
(1)Cry j IIをコードする cDNA のクローニングと推定アミノ酸配列の解明
(2)上記推定アミノ酸配列に基づき、該配列の全域をカバーするオーバーラップペプチドの作製
(3)Cry j IIを特異的に認識するT 細胞ラインを個人別に樹立
(4) 抗原提示細胞（B 細胞株）の樹立
(5)T細胞エピトープを含むペプチドの同定
を行い、本発明を完成した。すなわち、本発明は、
〔１〕スギ花粉アレルゲン Cry j II の少なくとも１つの T 細胞エピトープを含むペプチド、
〔２〕配列番号 6( ペプチド番号 1) 、配列番号 7( ペプチド番号 4) 、配列番号 8( ペプチド番号 5) 、配列番号 9( ペプチド番号 6) 、配列番号 10( ペプチド番号 7) 、配列番号 11( ペプチド番号 8) 、配列番号 12( ペプチド番号 9) 、配列番号 13( ペプチド番号 10) 、配列番号 14( ペプチド番号 14) 、配列番号 15( ペプチド番号 16) 、配列番号 16( ペプチド番号 17) 、配列番号 17( ペプチド番号 18) 、配列番号 18( ペプチド番号 25) 、配列番号 19( ペプチド番号 26) 、配列番号 20( ペプチド番号 27) 、配列番号 21( ペプチド番号 28) 、配列番号 22( ペプチド番号 29) 、配列番号 23( ペプチド番号 30) 、配列番号 24( ペプチド番号 31) 、配列番号 25( ペプチド番号 32) 、配列番号 26( ペプチド番号 33) 、配列番号 27( ペプチド番号 34) 、配列番号 28( ペプチド番号 37) 、配列番号 29( ペプチド番号 38) 、配列番号 30( ペプチド番号 41) 、配列番号 31( ペプチド番号 42) 、配列番号 32( ペプチド番号 44) 、配列番号 33( ペプチド番号 47) 、配列番号 34( ペプチド番号 48) 、配列番号 35( ペプチド番号 49) 、配列番号 36( ペプチド番号 50) 、配列番号 37( ペプチド番号 51) 、配列番号 38( ペプチド番号 52) 、配列番号 39( ペプチド番号 53) 、配列番号 40( ペプチド番号 54) 、配列番号 41( ペプチド番号 60) 、配列番号 42( ペプチド番号 61) 、配列番号 43( ペプチド番号 62) 、配列番号 44( ペプチド番号 63) 、配列番号 45( ペプチド番号 64) 、配列番号 46( ペプチド番号 65) 、配列番号 47( ペプチド番号 66) 、配列番号 48( ペプチド番号 68) 、配列番号 49( ペプチド番号 69) 、配列番号 50( ペプチド番号 70) 、配列番号 51( ペプチド番号 71) 、配列番号 52( ペプチド番号 72) 、配列番号 53( ペプチド番号 73) 、配列番号 54( ペプチド番号 74) 、配列番号 55( ペプチド番号 78) 、配列番号 56( ペプチド番号 79) 、配列番号 57( ペプチド番号 86) 、および配列番号 58( ペプチド番号 87) からなる群より選ばれる、〔１〕記載のペプチド、
〔３〕配列番号 14( ペプチド番号 14) 、配列番号 16( ペプチド番号 17) 、配列番号 22( ペプチド番号 29) 、配列番号 28( ペプチド番号 37) 、配列番号 29( ペプチド番号 38) 、配列番号 34( ペプチド番号 48) 、配列番号 48( ペプチド番号 68) 、配列番号 49( ペプチド番号 69) 、配列番号 50( ペプチド番号 70) 、および配列番号 51( ペプチド番号 71) からなる群より選ばれる、〔１〕記載のペプチド、
〔４〕スギ花粉アレルゲン Cry j II の少なくとも１つの T 細胞エピトープを含むペプチドをコードする DNA 、
〔５〕ペプチドが、配列番号 6( ペプチド番号 1) 、配列番号 7( ペプチド番号 4) 、配列番号 8( ペプチド番号 5) 、配列番号 9( ペプチド番号 6) 、配列番号 10( ペプチド番号 7) 、配列番号 11( ペプチド番号 8) 、配列番号 12( ペプチド番号 9) 、配列番号 13( ペプチド番号 10) 、配列番号 14( ペプチド番号 14) 、配列番号 15( ペプチド番号 16) 、配列番号 16( ペプチド番号 17) 、配列番号 17( ペプチド番号 18) 、配列番号 18( ペプチド番号 25) 、配列番号 19( ペプチド番号 26) 、配列番号 20( ペプチド番号 27) 、配列番号 21( ペプチド番号 28) 、配列番号 22( ペプチド番号 29) 、配列番号 23( ペプチド番号 30) 、配列番号 24( ペプチド番号 31) 、配列番号 25( ペプチド番号 32) 、配列番号 26( ペプチド番号 33) 、配列番号 27( ペプチド番号 34) 、配列番号 28( ペプチド番号 37) 、配列番号 29( ペプチド番号 38) 、配列番号 30( ペプチド番号 41) 、配列番号 31( ペプチド番号 42) 、配列番号 32( ペプチド番号 44) 、配列番号 33( ペプチド番号 47) 、配列番号 34( ペプチド番号 48) 、配列番号 35( ペプチド番号 49) 、配列番号 36( ペプチド番号 50) 、配列番号 37( ペプチド番号 51) 、配列番号 38( ペプチド番号 52) 、配列番号 39( ペプチド番号 53) 、配列番号 40( ペプチド番号 54) 、配列番号 41( ペプチド番号 60) 、配列番号 42( ペプチド番号 61) 、配列番号 43( ペプチド番号 62) 、配列番号 44( ペプチド番号 63) 、配列番号 45( ペプチド番号 64) 、配列番号 46( ペプチド番号 65) 、配列番号 47( ペプチド番号 66) 、配列番号 48( ペプチド番号 68) 、配列番号 49( ペプチド番号 69) 、配列番号 50( ペプチド番号 70) 、配列番号 51( ペプチド番号 71) 、配列番号 52( ペプチド番号 72) 、配列番号 53( ペプチド番号 73) 、配列番号 54( ペプチド番号 74) 、配列番号 55( ペプチド番号 78) 、配列番号 56( ペプチド番号 79) 、配列番号 57( ペプチド番号 86) 、および配列番号 58( ペプチド番号 87) からなる群より選ばれる、〔４〕記載の DNA 、
〔６〕ペプチドが、配列番号 14( ペプチド番号 14) 、配列番号 16( ペプチド番号 17) 、配列番号 22( ペプチド番号 29) 、配列番号 28( ペプチド番号 37) 、配列番号 29( ペプチド番号 38) 、配列番号 34( ペプチド番号 48) 、配列番号 48( ペプチド番号 68) 、配列番号 49( ペプチド番号 69) 、配列番号 50( ペプチド番号 70) 、および配列番号 51( ペプチド番号 71) からなる群より選ばれる、〔４〕記載の DNA 、
〔７〕スギ花粉アレルゲン Cry j II の少なくとも１つの T 細胞エピトープを含むペプチド、またはこれらの混合物を有効成分として含有するスギ花粉症の予防または治療剤、
〔８〕ペプチドが、配列番号 6( ペプチド番号 1) 、配列番号 7( ペプチド番号 4) 、配列番号 8( ペプチド番号 5) 、配列番号 9( ペプチド番号 6) 、配列番号 10( ペプチド番号 7) 、配列番号 11( ペプチド番号 8) 、配列番号 12( ペプチド番号 9) 、配列番号 13( ペプチド番号 10) 、配列番号 14( ペプチド番号 14) 、配列番号 15( ペプチド番号 16) 、配列番号 16( ペプチド番号 17) 、配列番号 17( ペプチド番号 18) 、配列番号 18( ペプチド番号 25) 、配列番号 19( ペプチド番号 26) 、配列番号 20( ペプチド番号 27) 、配列番号 21( ペプチド番号 28) 、配列番号 22( ペプチド番号 29) 、配列番号 23( ペプチド番号 30) 、配列番号 24( ペプチド番号 31) 、配列番号 25( ペプチド番号 32) 、配列番号 26( ペプチド番号 33) 、配列番号 27( ペプチド番号 34) 、配列番号 28( ペプチド番号 37) 、配列番号 29( ペプチド番号 38) 、配列番号 30( ペプチド番号 41) 、配列番号 31( ペプチド番号 42) 、配列番号 32( ペプチド番号 44) 、配列番号 33( ペプチド番号 47) 、配列番号 34( ペプチド番号 48) 、配列番号 35( ペプチド番号 49) 、配列番号 36( ペプチド番号 50) 、配列番号 37( ペプチド番号 51) 、配列番号 38( ペプチド番号 52) 、配列番号 39( ペプチド番号 53) 、配列番号 40( ペプチド番号 54) 、配列番号 41( ペプチド番号 60) 、配列番号 42( ペプチド番号 61) 、配列番号 43( ペプチド番号 62) 、配列番号 44( ペプチド番号 63) 、配列番号 45( ペプチド番号 64) 、配列番号 46( ペプチド番号 65) 、配列番号 47( ペプチド番号 66) 、配列番号 48( ペプチド番号 68) 、配列番号 49( ペプチド番号 69) 、配列番号 50( ペプチド番号 70) 、配列番号 51( ペプチド番号 71) 、配列番号 52( ペプチド番号 72) 、配列番号 53( ペプチド番号 73) 、配列番号 54( ペプチド番号 74) 、配列番号 55( ペプチド番号 78) 、配列番号 56( ペプチド番号 79) 、配列番号 57( ペプチド番号 86) 、および配列番号 58( ペプチド番号 87) からなる群より選ばれる、〔７〕記載の予防または治療剤、
〔９〕ペプチドが、配列番号 14( ペプチド番号 14) 、配列番号 16( ペプチド番号 17) 、配列番号 22( ペプチド番号 29) 、配列番号 28( ペプチド番号 37) 、配列番号 29( ペプチド番号 38) 、配列番号 34( ペプチド番号 48) 、配列番号 48( ペプチド番号 68) 、配列番号 49( ペプチド番号 69) 、配列番号 50( ペプチド番号 70) 、および配列番号 51( ペプチド番号 71) からなる群より選ばれる、〔７〕記載の予防または治療剤、からなる。
【００１４】
(1)Cry j II の全アミノ酸配列の解明
▲１▼ cDNAのクローニング
a. RNAの抽出
RNA を抽出する際、通常、初期段階で蛋白質を除去する。このため一般的な方法として、フェノール抽出方法、グアニジウム塩、界面活性剤、尿素などの蛋白質変性剤などを用いる方法がある。
【００１５】
スギ花粉からのRNA 抽出は、Breiteneder ら（Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 87: 19-24, 1988 ）の方法に改良を加えて行うことができる。
【００１６】
スギ花粉を、10〜20倍量の抽出緩衝液（100mM LiCl、10mMNa₂ＥＤＴＡ、1%SDS 、20% メルカプトエタノール、100mM Tris-HCl pH 9.0 ）に懸濁し、これに等量のフェノールとクロロホルムの混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝24：24：1 ）を加えホモジェナイズする。次いで遠心（10,000g 、10〜15分）し、フェノール・クロロホルム層と、水層の二層に分離する。このとき変性した蛋白質はフェノール・クロロホルム層に、核酸は水層に移行する。水層にフェノール・クロロホルム混液を加え、振盪し水層に残存している蛋白質などの不純物をフェノール・クロロホルム層に移行させ除去する。このような操作を２回繰り返す。
【００１７】
得られた水層からRNA を抽出するには、高濃度のLiCl(2〜4M) またはCH₃COO Na(3M)が存在するとDNA 及び蛋白質は上清に残り、tRNA以外のRNA は沈殿する性質を利用する。水層に同量の2 〜4MのLiClを添加し、RNA を沈殿させる。次いでこの水層を水に溶解し、0.1 〜0.3 容の冷エタノール（-20 ℃）を加え、RNA を沈殿させる（エタノール沈殿）。次いで遠心（10,000g 、30分）して沈殿を回収し、水に溶解して全RNA 分画を得る。
【００１８】
b. mRNA の調製とcDNAの合成
Cry j IIのmRNAは、3'末端にポリ(A) 鎖を持つので、これと相補するリガンドとして12〜18塩基のデオキシチミジン(dT)を結合したオリゴdTセルロースカラム(Clontech Laboratories Inc. 社製、CA、USA)にmRNAを吸着させる。スギ花粉RNA に緩衝液(3M NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl、pH7.4)を加えてmRNAをカラムに吸着させる。mRNAは、ベッド体積の2 〜3 倍量のNaClを含まない緩衝液(1mM EDTA 、10mM Tris-HCl 、pH7.4)で溶出する。
【００１９】
得られたmRNAからのcDNAライブラリーの作製は、現在市販されているファージをベクターに用いたcDNAライブラリー作製キット(Amersham International plc.社製、Buckinghamshare 、England)を用いて行うことが出来る。
【００２０】
c. Cry j II cDNAのスクリーニング
Cry j IIのN 末端アミノ酸10残基が既に判明しているが、このアミノ酸配列から推定した塩基配列を持つ合成DNA をプローブとして、Cry j II cDNA をスクリーニングすることができる。プローブに用いるDNA を合成する場合、可能性のあるコドンを含むオリゴヌクレオチドを全て合成するよりも、可能性のある複数のコドン配列に対してハイブリダイズするようなオリゴヌクレオチドを設計することが望ましい。この合成オリゴヌクレオチドプローブの5'末端を[ γ- ³²P]ATP とポリヌクレオチドキナーゼによって標識し、プラークハイブリダイゼーション法により、前記cDNAライブラリーから陽性クローンをスクリーニングする。
【００２１】
得られた陽性クローンよりファージDNA を調製し、挿入cDNA断片を分離し、pUC18 等のプラスミドにサブクローンする。必要に応じてオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、Sanger法等により塩基配列を決定し、クローンを同定する。本発明者らが単離したCry j II cDNA の全長の塩基配列を、配列番号５に示す。
【００２２】
Cry j IIをコードするcDNAは、全体で1733bpからなり、翻訳開始と想定されるコドン（45〜47位のヌクレオチドATG ）から終止コドン（1587〜1589位のヌクレオチドTAA ）に至るオープンリーディングフレームを含み、514 アミノ酸をコードしている。オープンリーディングフレーム部分の塩基配列を配列番号３に示し、また該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号３で示される塩基配列には、個体間での対立遺伝子変異による多型性（polymorphism) 及びその結果としてのアミノ酸配列の変異が考えられるがそのような変異を有するCry j IIの塩基配列及びアミノ酸配列も本発明に包含される。207 〜236 位のDNA 配列のコードするアミノ酸配列はAla 、Ile 、Asn 、Ile 、Phe 、Asn 、Val 、Glu 、Lys 、Tyr であり、成熟型Cry j IIのN 末端アミノ酸配列（Sakaguchi, M., et al., Allergy 45, 309-312, 1990）と一致する。N 末端の54アミノ酸は、他のシグナルペプチドに見られる疎水性アミノ酸に富み、また成熟型Cry j IIに含まれていないことからシグナルペプチドと考えられる。
【００２３】
配列番号 5 の207 位から終止コドン1587〜1589位までのDNA 配列がコードするCry j IIは、N 末端のAla からC 末端のPro まで460 個のアミノ酸残基からなり、成熟型Cryj IIと考えられる。該成熟型Cry j IIに対応する塩基配列を配列番号４に、該塩基配列にコードされる成熟型アミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるCry j IIの理論上の分子量は50,444Daである。一方、天然の成熟型Cry j IIは、還元条件下のSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）で45KDa の位置にそのバンドが現れる（Sakaguchi, M., et al., Allergy 45, 309-312, 1990）。このことから、Cry j IIのC 末端はプロセッシングを受けているものと考えられる。また成熟Cry j IIのアミノ酸配列の中には、N-グリコシド結合の可能性のあるAsn-X-Ser/Thr が3 ヶ所（配列番号 2 のアミノ酸配列の 375 〜 377 位、 406 〜 408 位および 418 〜 420 位）存在する。
【００２４】
Cry j IIをコードするDNA の全長またはその一部を含むDNA は、螢光標識、放射性標識あるいは酵素標識等によって標識することにより、生化学検査または関連蛋白質若しくは類似の配列を含む蛋白質をコードするDNA のスクリーニング等のためのプローブ、プライマーとして使用できる。また発現ベクターに接続して、少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質またはペプチドを発現させることもできる。
【００２５】
▲２▼組換えCry j II（rCry j II ）の発現
rCry j II タンパク質または少なくとも一つのCry j IIのT 細胞エピトープを含むペプチドは、それぞれをコードするcDNAを発現ベクターに組込み、大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳動物に導入し、発現させることにより得ることができる。しかし、大腸菌などの原核細胞を使う発現系は、適切な糖鎖の付加(glycosylation) が行われないために、rCry j II の発現には酵母などの真核細胞を使用することが好ましい場合がある。
【００２６】
幾つかの発現システムの例を以下に示す。
【００２７】
a. 大腸菌での発現
T7ファージのプロモーターとRNA ポリメラーゼを用いる系(F. W. Studier, A. H. Rosenberg, J. J. Dunn, J. W. Dubendonff, "Methods in Enzymology", ed. by D. D. V. Goeddel, vol. 185, p. 60, Academic Press, New York, 1990)は、極めて発現の成功率が高いので、本発明に好適に使用できる。この系は、T7ファージのポリメラーゼ遺伝子を持つ大腸菌宿主BL21(DE3) に、T7ファージプロモーターの下流のマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を挿入した組換えプラスミドを導入して、IPTG存在下で、目的の遺伝子を発現させるシステムである。例えば発現ベクターとしてpGEMEX-1（Promega 社）などが使用できる。
【００２８】
また、目的の蛋白質を、大量発現可能な蛋白質と融合させて発現させる系が市販されており、これらの系は精製にアフィニティーカラムが使え、精製効率がよく、本発明に好適に使用できる。例えば、融合蛋白質にβ- ガラクトシダーゼを有する発現ベクターpUEX(Amersham)を用いると、rCry j II はβ- ガラクトシダーゼとの融合蛋白質として得られ、アフィニティカラムで効率よく精製することが出来る。また、グルタチオンS-トランスフェラーゼを有するpGEX(Pharmacia) や、マルトース結合蛋白質を用いたpMAL(New England Biolabs、Berverly, MA) などは、その融合部位に血液凝固因子Xaの切断部位が導入されており、Cry j IIを分離することができる。
【００２９】
b. 酵母での発現
酵母を宿主とする系は発現産物のグリコシレーションが可能であり、このことは糖蛋白質であるCry j IIの発現に好都合である。例えば酵母による異種蛋白質の発現系としては、ピキア酵母を宿主として用いる方法が知られており（特開昭61-108383 号公報、特開昭61-173781 号公報、特開昭63-44899号公報、特開平1-128790号公報等）、本発明に好適に使用できる。その他の酵母による発現系については、D. Emr Scott, "Methods in Enzymology", ed. by D. V. Goeddel, vol. 185, p.231, Academic Press, New York (1990) に詳述されており、本発明で使用できる。
【００３０】
c. 昆虫細胞での発現
昆虫細胞中を宿主とする系は発現産物のグリコシレーションが可能である。バキュロウイルスを用いた外来遺伝子発現システムは市販されており(PharMingen, San Diego, CA, USA)、本発明に好適に使用できる。このシステムについては、Luckow, V. A. らの Trends in the Development of Baculovirus Expression Vector, Bio/Technology （1987年9 月11日）に記載されている。
【００３１】
d. 哺乳動物細胞での発現
哺乳類プロモーター（例えばメタロチオネイン）、ウイルスプロモーター（例えばSV40初期プロモーター）等を持つ発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞に導入することにより高発現させることができる。
【００３２】
(2) オーバーラップペプチドの合成
花粉症患者のT 細胞が認識するCry j IIのT細胞エピトープを分子レベルで解明するために、配列番号２に記載のアミノ酸配列に基づき、N 末端のAlaからC 末端のPro に至る全460 アミノ酸残基をカバーするオーバーラップペプチドを作製する。これらのオーバーラップペプチドは、市販されているペプチド自動合成装置により容易に合成することができる。これらのオーバーラップペプチドの中から、少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを同定する。 T 細胞エピトープを同定するためには、花粉症患者の末梢血リンパ球から、Cry j IIを特異的に認識し増殖応答するT 細胞ラインを樹立する必要がある。一般に、患者毎に反応するT 細胞エピトープが異なるので、患者毎にT 細胞ラインを樹立することが望ましい。
【００３３】
(3)T細胞ラインの樹立
Cry j II抗原特異的なT 細胞ラインを樹立するには、通常患者の末梢血リンパ球をCry j II抗原の存在下、7 日間程度培養して抗原刺激によりT 細胞を活性化し、さらに、活性化T 細胞を、抗原と抗原提示細胞と共に7 日間培養することを数回繰り返して抗原刺激することにより、抗原特異的T 細胞ラインを作製することができる。しかしながら、T 細胞が増殖因子のIL-2の存在下でよく増殖している場合は、抗原刺激は最初だけにすることが望ましい。T 細胞ラインを数度抗原刺激すると、増殖率の高いT 細胞が選択的に取れ、T 細胞エピトープを含むペプチドを同定する場合において、エピトープによっては十分な増殖応答を示さない場合が生じる。
【００３４】
使用する抗原としては、原理的には天然型Cry j II抗原が望ましいが、極微量しかスギ花粉から抽出できないことから、組換えCry j II（rCry j II ）あるいはオーバーラップペプチドの混合物も好適に使用できる。rCry j II は、大腸菌で発現させ精製したものが利用できる。
【００３５】
(4) 抗原提示細胞（B 細胞株）の樹立
抗原提示細胞としては、T 細胞ラインと同一人の末梢血リンパ球を、マイトマイシンC 処理あるいは放射線照射して増殖能力を失わせたものが望ましい。しかし、採血回数が多くなるため、Epstein-Barr virus（EBV ）を自己のB リンパ球に感染させトランスフォーメーションを起こさせたものは、in vitroで増殖し続けリンパ芽球様細胞株（B 細胞株）となるので、このB 細胞株を抗原提示細胞として用いてもよい。B 細胞株の樹立方法は既に確立されている［組織培養の技術第二版、187-191 頁、日本組織学会編(1988.8.10) ］。
【００３６】
(5)T細胞エピトープを含むペプチドの同定
それぞれの患者固有のT 細胞ラインが認識する、T 細胞エピトープを含むペプチドは以下のようにして同定される。ここで「認識する」という意味は、T 細胞レセプターが抗原エピトープ（MHC 分子を含めて）と特異的に結合し、その結果、T 細胞が活性化されることを意味し、活性化の状態は、リンホカインの産生や、DNA の合成を [ 3Ｈ] チミジンの取込み量を指標として測定することにより観察される。すなわち、T細胞ラインとマイトマイシンC 処理した同一人のB 細胞株とを、96穴平底プレートに播種し、オーバーラップペプチドと共に混合培養し、 [ 3Ｈ] チミジンの取込み量（cpm ）を液体シンチレーションカウンターで測定する。その際、 [ 3Ｈ] チミジンの取込みは、個々の培養系で異なるため、例えば、個々のペプチドに対するT 細胞ラインの [ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm）を、抗原を添加していないコントロールの [ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm ）で除した数（stimulation index: SI ）が2 以上をT 細胞エピトープを含むペプチドと同定する。同定されたT 細胞エピトープを含むペプチドは、図４に列挙されている。
【００３７】
このようにして得られた本発明のCry j IIの少なくとも一つのT 細胞エピトープを含むペプチドについては以下のことが考えられる。HLA クラスII分子と結合して抗原提示されるペプチドの長さは、ペプチドの解析結果（Chicz, R. M. et al.: J. Exp. Med., 178: 27-47, 1993 ）から、およそ10〜34のアミノ酸残基からなるものと考えられるので、本発明のT 細胞エピトープを含むペプチドはこのような長さのペプチドも含まれる。また、本発明のペプチドにアミノ酸置換、欠失あるいは付加などの修飾を行い、これらの修飾ペプチドに対する患者毎のT 細胞ラインの増殖応答を測定することによって、本発明のCry j IIの少なくとも一つのT 細胞エピトープを含むペプチドと免疫学的に同機能を有する修飾ペプチドを容易に作製することは、当業者が容易に実施しうることであるので、これらの修飾ペプチドも本発明に包含される。
【００３８】
現在、減感作療法で使用されている減感作剤はスギ花粉から抽出された粗抗原であり、多量の多糖類を含んでいる。ロット差がかなりあり、一旦減感作療法を開始した後、ロットを変えるとアナフィラキシーを起こすことが稀にある。また、減感作の治療効果も、減感作治療が開始されて以来余り改善されておらず、減感作療法で著効と診断されるのは約30% の患者である。
【００３９】
本発明のT 細胞のエピトープを含むペプチドのうち、花粉症患者の半分以上のT 細胞ラインと反応する各々のペプチドは、これらの各ペプチドを単独もしくはいくつかを混合したペプチドを用いて減感作療法を行った場合には、治療した患者の半分以上で減感作が行える可能性がある。また、使用するペプチドは、化学的に合成されたペプチドであるため、アナフィラキシーのような副作用を生じる可能性は低くなると考えられる。例えば、図５は、18名の花粉症患者から樹立されたT 細胞ラインがそれぞれ認識するオーバーラップペプチドを、重要度指数［「平均刺激係数」（「オーバーラップペプチド刺激によるT 細胞ラインの [³Ｈ] チミジン取込み量(cpm) 」を「抗原を添加しない場合の [³Ｈ] チミジン取込み量(cpm) 」で割った値の平均値）と「出現頻度(%) 」（「試験した全T 細胞ライン」に対する「被験ペプチドをT 細胞エピトープとして認識したT 細胞ライン」の割合(%) ）とを乗じた値］で示したものであるが、図中の番号14、17、29、38、48、68、70および71のペプチドは平均刺激係数が約3.9 以上である上、重要度指数が200 を超えており、減感作治療に特に有効であると考えられる。
【００４０】
なお、本発明者が明らかにし、図５に示された少なくとも一つのT 細胞エピトープを含むペプチドの中には、後述のB 細胞エピトープを含むことが判明した２種類のペプチドと共通部分を有するペプチドは含まれていない。従って本発明のペプチドは、B 細胞エピトープを刺激しないと考えられるので、減感作剤として実用化可能であると考えられる。
【００４１】
また、本発明のT 細胞のエピトープを含むペプチドを経口投与して、経口免疫寛容を行うことも可能と考えられる。経口免疫寛容（経口減感作）は現在開発中の治療法であるが、効果を示す結果が報告され始めている。例えば、Myelin Basic ProteinのT 細胞エピトープ（ペプチド配列21-40 、71-90 ）をマウスに経口投与すると「Experimental Autoimmune Encephalomyelitis （略してEAE ）発症」を抑制したことが報告されている［上野川修一、久恒辰博、八村敏志、経口免疫寛容の分子生物学、蛋白質核酸酵素、39、2090-2101 （記載頁2098右、9-24行）1994年］。これらの例から、スギ花粉症においても、同定したT 細胞エピトープペプチドをそのまま経口投与するか、あるいは胃で消化されないように何らかのカプセルに封入する等の工夫を行って経口投与すれば、免疫寛容状態になる可能性がある。スギ花粉飛散時期の前、具体的には12〜1 月期に経口的にエピトープペプチドを投与し、免疫寛容状態を誘導しておく。この状態だとスギ花粉が飛散して鼻粘膜に花粉が付着しても、症状が出ないか、あるいは症状が軽くなることが期待される。
【００４２】
さらにまた、本発明のT 細胞のエピトープを含むペプチドに、アミノ酸置換、欠失あるいは付加などの修飾を加えたアナログペプチドを合成し、HLA クラスII分子には結合するが、T 細胞には情報が伝わらないアナログペプチドを同定する。これらのペプチドは、例えば点鼻薬として患者に使用すれば、天然のT 細胞エピトープを競合的に阻害するので、発症予防が期待される。
【００４３】
なお、Ｂ細胞エピトープの同定は、オーバーラップペプチドと患者血清IgE 抗体との反応性の測定、オーバーラップペプチドによる患者血清と抗原との結合の阻害の検出等の公知の方法によって行うことができる（特開平６−６９３３６号参照）。既に、１価のB 細胞エピトープは、アレルギー反応の抑制に有用であることが知られている。これは、１価のB 細胞エピトープは、肥満細胞または好塩基球上の対応するIgE 分子と結合し、多価エピトープによるIgE 分子架橋の形成を阻害することによるものと考えられている。本発明者らは、本発明のCry j IIの全アミノ酸配列をカバーするオーバーラップペプチドを合成し、これらのペプチドとスギ花粉症患者血清IgE 抗体との反応を酵素抗体法で測定した結果、ペプチド「Gln Cys Lys Trp Val Asn Gly Arg Glu Ile Cys （アミノ酸配列113〜123）」および「Cys Thr Ser Ala Ser Ala Cys Gln Asn（アミノ酸配列293〜301 ）」はB 細胞エピトープを含んでいることを明らかにした。このようなCry j IIのB 細胞エピトープを含むペプチドは、スギ花粉症の診断、予防及び治療に有用である。
【００４４】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００４５】
＜スギ花粉の採取＞
スギ花粉は静岡県及び神奈川県内で2 月に伐採されたスギの枝に着花した雄花から採取した。Cryj II 抗原性精製用のスギ花粉は-70 ℃で保存し、RNA 調製用のスギ花粉は液体窒素中で急速凍結した後、-70 ℃で保存した。
【００４６】
＜RNA の抽出＞
Breiteneder ら(Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 87:19-24 1988) の方法を基にして改良を加えることによりスギ花粉からRNA を抽出した。
【００４７】
凍結保存したスギ花粉1gを氷冷した15mlの抽出緩衝液(100mM LiCl 、10mMNa₂EDTA、1%SDS 、20% 2-メルカプトエタノール、100mM Tris-HCl、pH 9.0)に懸濁し、さらに、15mlのフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール(24:24:1) を添加した。この懸濁液をテフロンホモジェナイザーに移し、テフロンペステルをモーターで最高回転で回しながら、20〜30ストロークホモジェナイズした。この後、遠心操作(10,000g、15分) で水層と有機層に分離して水層を得た。水層に同量のフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコールを加え、5 分間振蕩の後、遠心分離(10,000g、15分) で水層を得た。同様の操作を2 回繰り返し、さらに15mlのクロロフォルム：イソアミルアルコール(24:1)を用いて1 回行った。得られた水層に同量の4M LiCl を添加して-20 ℃で一晩放置した。凍結した溶液を室温で溶解し、遠心操作(20,000g、30分) で沈澱を得た。この沈澱を少量の滅菌蒸留水に溶解し、0.3 容の3M CH ₃COONa 、pH 5.2と2.5 容のエタノールを加え、-20 ℃で60分間放置した。遠心操作(10,000g、30分) により回収した沈渣を滅菌蒸留水に再溶解して全RNA 分画とした。
【００４８】
＜スギ花粉mRNAの調製とcDNAの合成＞
スギ花粉全RNA1mgを出発材料として同量の結合緩衝液(3M NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl 、pH 7.4) を添加した後、オリゴdTセルロースを事前にパックしたスパンカラム(CLONETECH Laboratories Inc.社製、CA、USA)に吸着させ、溶出緩衝液(1mM EDTA 、10mM Tris-HCl 、pH 7.4) で溶出することにより約10μg のmRNAを精製した(CLONETECH Lab. Inc.社添付プロトコールに従った）。続いて、精製mRNA 5μg からcDNA合成システムプラス(Amersham International plc.社製、Buckinghamshare 、England)を使用し、添付されているプロトコールに従ってcDNA約4 μg を合成した。
【００４９】
＜オリゴヌクレオチドプローブの合成＞
Cry j IIのN 末端から10残基のアミノ酸配列を図１Ａに示す。このアミノ酸配列から予想されるcDNAの配列は図１Ｂである。オリゴヌクレオチドプローブ（Oligo CJII）としてその配列に相補的に、また４カ所で２種類の塩基を用いているので、合計16種類の混合物として合成した（図１Ｃ）。混合物として種類を減らすためにG:T 塩基対を許容している。
【００５０】
＜Cry j II cDNA のクローニング＞
cDNAライブラリーの作製はcDNAクローニングシステムλgt10（Amersham International plc. 社製、Buckinghamshare 、England ）を使用し、添付されているプロトコールに従って行った。上述のcDNA 1μg をλgt10に組み込みcDNAライブラリーを作製した。約50万のライブラリーのうち約5,000 のクローンを直径150mm のプレート１枚にまいた。スクリーニングのためのプローブは上記のオリゴヌクレオチド（Oligo CJII）をT4 polynucleotide kinaseにより[ γ- ³²P]ATP （7,000Ci/mmol ICN Biochemicals, Inc. 社製）で標識して用いた。ファージDNA を固定化したニトロセルロースフィルターを5 ×SSPE（1 ×SSPE:0.18M NaCl 、10mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA）、5 ×FBP （1 ×FBP:0.02% Ficoll、0.02% 牛血清アルブミン、0.02% ポリビニルピロリドン）、0.3%SDS 、100 μg/ml tRNA を含む溶液に48℃1 時間以上浸すことによりプレハイブリダイズした。この後ニトロセルロースフィルターを新たに調製した同溶液に浸し、³²P ラベルしたプローブ（Oligo CJII）を加えて48℃で一晩ハイブリダイゼイションを行った。この後フィルターを6 ×SSC （1 ×SSC:0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）と0.1%SDS を含む溶液で室温30℃、48℃5 分洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。4 個の強いシグナルが検出され、そのうちの１つのファージDNA を抽出し、制限酵素EcoRI で切断したところ約1.7KbpのDNA 断片が挿入されていることが判明した。挿入断片をpUC118にサブクローニングし、キロシークエンスデレーションキット（宝酒造社製）を用いてデレーションミュータントを作製し全塩基配列の決定に用いた。塩基配列は合成プライマーと色素標識ジデオキシターミネイターを用いてプライマー伸長反応を行い、自動シークエンサー（モデル370A、Applied Biosystems、Japan ）で判読することにより決定した。決定されたcDNA全塩基配列を配列番号５に示す。また、オープンリーディングフレームのみの塩基配列を配列番号３に（該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１に）、成熟Cry j IIをコードする塩基配列を配列番号４に（該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に）示す。
【００５１】
＜組換えCry j IIの大腸菌での発現＞
Promega 社より市販されている大腸菌発現ベクターpGEMEX-1はT7プロモーター、T7 gene10 のコーディングシークエンスおよびT7ターミネーターをもち、オープンリーディングフレームをT7 gene10 の下流のマルチクローニングサイトに挿入してT7 RNAポリメラーゼを発現する大腸菌（例BL21(DE3) ）に導入することにより高発現を行うベクターである。Cry j II cDNA をBamHI （cDNAの両端に連結したアダプターはBamHI サイトを含む）で消化してcDNAフラグメントを切り出しpGEMEX-1のBamHI サイトに組み込みCry j IIの発現ベクターpEXCJII を構築した。pEXCIIはT7 gene10 発現産物（23kD）とCry j II蛋白質（50kD）との融合蛋白質（T7 Cry j II 、73kD）を発現し得る。pEXCIIを大腸菌BL21(DE3) に導入した形質転換体を培養しIPTGでT7 RNAポリメラーゼを誘導してCry j IIの発現を行った。発現した大腸菌の細胞抽出液をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。pEXCIIを保持するBL21(DE3) には、約73kDのT7 Cry j II と思われるバンドが見られた。しかし、対照のpGEMEX-1を保持するBL21(DE3) または親株BL21(DE3) には、これらのバンドは見られなかった。
【００５２】
＜Cry j IIとT7 gene10 との融合タンパク質（T7Cry j II）のスギ花粉症患者血清との反応性＞
T7 Cry j II を発現した大腸菌の抽出液を、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、Millipore 社製PVDF膜にウェスタンブロッティング（Western Blotting）し、スギ花粉症患者5 人、健常人3 人の血清との反応性を検討した。対照としてpGEMEX-1を保持するBL21およびT7 gene10 とCry j I との融合蛋白質（T7 Cry j I）を発現したBL21の抽出液、スギ花粉より精製した天然型Cry j I を同時にブロットして反応を調べた。図２に示すように、2 人の患者血清がT7 Cry j II と反応した。2 人の患者血清ともT7 Cry j II 、天然型 Cry j Iには反応しているがpGEMEX-1を保持するBL21抽出液およびT7 Cry j Iには反応していない。これらの結果からT7Cry j IIはスギ花粉症患者血清中のIgE と反応する抗原性を持っていることが確認された。
【００５３】
＜オーバーラップペプチドの合成＞
オーバーペプチドの合成は、Peptide Synthesizer PSSM-8（島津製作所製）を用いて行なった。配列番号２に示すCry j IIの一次構造を基にして、N 末端側55番目のAla から始まり、C 末端のPro まで、10残基のオーバーラップ部分を含む15量体のオーバーラップペプチド90種類を合成した。図３〜６にアミノ酸の１文字コードを用いて、合成した全てのオーバーラップペプチドを示す。
【００５４】
＜B 細胞株の樹立＞
Ficoll-Paque比重遠心法で得た末梢血リンパ球（1 ×10⁶）を、約1 ×10⁶PFU （plaque forming units）のEpstein-Barr virus（EBV ）と共に37℃で1 時間インキュベートし、ウイルスを細胞に感染させた。このウイルス感染細胞を24ウェル培養プレートに移し、100ng/mlのサイクロスポリンA の存在下で2 週間前後培養すると、B 細胞コロニーが出現してくる。この時点で半分に分け、新しいウェルに植え継いだ。順次この操作を繰り返して継代培養を行っていくと、自己増殖可能なB 細胞が出現してくる場合がある。この自己増殖B 細胞を含むウェルの細胞をイクスパンド（expand）し、増殖を確認した後、25cm²培養フラスコに移して更に30〜50日間培養を行い、EBV によってトランスフォームされた（EBV-transformed ）B 細胞株を得た。B 細胞株の一部は凍結保存した。
【００５５】
＜Cry j II抗原特異的T 細胞ラインの樹立＞
スギ花粉症患者18名末梢血からリンパ球を通常用いられているFicoll-paque比重遠心法で単離し、使用するまで液体窒素中に保存した。スギ花粉症患者の末梢血リンパ球（4 ×106 個）を、2 mlの自己の血漿20% を添加したRPMI-1640 に懸濁し、10μg/mlの大腸菌で発現させ精製した組換えCry j II抗原と共に24穴培養プレート上で7-8 日間培養した。Cry j II抗原刺激を受けて活性化された（幼弱化反応、blastogenesis ）T 細胞が顕微鏡下で確認できた時点で5 Unit/ml のIL-2を添加し、一晩培養した。翌日からは、20 Unit/ml IL-2、20% ヒトAB型血清（市販品）を添加したRPMI-1640 で毎日培養液を代えながら、9日間培養した。この時点で、Cry j II抗原を特異的に認識する増殖したT 細胞ラインの一部を凍結保存した。さらにT 細胞ラインを上記培養液中で4 日間培養し、T 細胞エピトープの同定用の細胞とした。
【００５６】
＜T 細胞エピトープを含むペプチドの同定＞
18名の花粉症患者から樹立したT 細胞ラインについてそれぞれスギ花粉アレルゲンオーバーラップペプチドとともに培養し、Cry j II抗原特異的T 細胞エピトープを含むペプチドの同定を行った。
【００５７】
T 細胞ラインと同一の患者から樹立した培養B 細胞株を50μg/mlのマイトマイシンC で30分間処理し、細胞をRPMI-1640 で4 回洗浄した。このB 細胞を96穴平底プレート（96-well flat-bottomed plate ）に播種（5 ×10⁴/well ）した後、Cry j II（25μg/ml最終濃度）あるいは各オーバーラップペプチド（最終濃度0.5 μM ）を各々のウェルに添加し、約60〜90分間培養した。T 細胞ライン（2 ×10⁴/well ）を各ウェルに播種し、48時間培養の後、0.5 μl/Ci[ ³H]チミジンをウェルに添加し、さらに16時間培養した。細胞を細胞ハーベスターを用いてガラスフィルター上に捕集し、乾燥してから、細胞内に取込まれた[ ³H]チミジンのカウント（cpm ）を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００５８】
測定はtriplicate cultureで行い、結果は、オーバーラップペプチド刺激によるT 細胞ラインの[ 3 H]チミジン取込み量（cpm）を、抗原を添加しない場合（コントロール）の[ 3 H]チミジン取込み量（cpm ）で割った値である刺激係数（stimulation index; SI ）で算出し、SIが2 以上の値を示したオーバーラップペプチドを、少なくとも一つのT 細胞エピトープを含むペプチドと同定した（図７及び図８）。図９は、全てのオーバーラップペプチドの「平均刺激係数」（複数の実験によって得られた刺激係数の平均値）「出現頻度(%) 」「重要度指数」を示している。
【００５９】
【発明の効果】
本発明のCry j IIの少なくとも一つの T 細胞エピトープを含むペプチドは、スギ花粉症の診断、予防及び治療に有用である。
【００６０】
さらにまた、HLA クラス分子には結合するが、T 細胞には情報が伝わらないようなアナログペプチドを合成し、これらのペプチドを競争阻害によるスギ花粉症発症予防に用いることも可能である。
【００６１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】スギ花粉アレルゲンCry j IIのN 末端から10残基のアミノ酸配列(A) 。スギ花粉アレルゲンCry j IIのN 末端から10残基のアミノ酸配列から予想されるDNA 配列(B) 。スギ花粉アレルゲンCry j IIをコードするcDNAをスクリーニングするためのプローブのDNA配列(C) 。
【図２】 T7 Cry j II の抗原性を、2 名のスギ花粉症患者の血清を用いて、ウェスタンブロット法により同定した結果を示す。レーン１はpMGEMEX-1 （陰性対照）を保持するBL21(DE3) 、レーン２はT7 Cry j Iを発現したBL21(DE3) 、レーン３はT7Cry j II を発現したBL21(DE3) 、レーン４はスギ花粉より精製したCry j I をそれぞれ示す。A 、B は血清の由来する患者が異なるのみで、他は同じである。
【図３】成熟 Cry j II （配列番号 2 ）の全アミノ酸配列をカバーするオーバーラップペプチドを示す。
【図４】成熟 Cry j II （配列番号 2 ）の全アミノ酸配列をカバーするオーバーラップペプチドを示す。
【図５】成熟 Cry j II （配列番号 2 ）の全アミノ酸配列をカバーするオーバーラップペプチドを示す。
【図６】成熟 Cry j II （配列番号 2 ）の全アミノ酸配列をカバーするオーバーラップペプチドを示す。
【図７】 Cry j IIの少なくとも一つのT 細胞エピトープを含むペプチドを示す。
【図８】 Cry j IIの少なくとも一つのT 細胞エピトープを含むペプチドを示す。
【図９】 18名のスギ花粉症患者から樹立されたCry j IIアレルゲンに特異的なT 細胞ラインがそれぞれ認識するオーバーラップペプチドの重要度指数を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an epitope of cedar pollen allergen Cry j II useful for diagnosis, prevention or treatment of cedar pollinosis.ofT cell epitopePeptide containing or the peptideThe present invention relates to DNA encoding
[0002]
[Prior art]
Cedar pollinosis is an allergic disease observed almost nationwide in early spring when cedar pollen is scattered, and exhibits allergic symptoms accompanied by sneezing, nasal discharge, itchy eyes and the like. The number of patients has increased sharply since 1970, and about 10 million people, currently representing less than 10% of the total population, are suffering from cedar pollinosis.
[0003]
Allergic reactions that form allergic diseases are classified into four types of types I to IV by R. G. H. Gell and R. R. A. Coombs, and cedar pollinosis belongs to type I.
The pathogenesis of type I allergy is as follows.
[0004]
A molecule that causes an allergic reaction is called an allergen (also referred to herein as an antigen). In the case of pollen, this allergen is a protein antigen. When these foreign protein antigens enter the body, they are taken up by antigen-presenting cells (macrophages), decomposed by proteolytic enzymes into peptide fragments, and major histocompatibility complex (MHC) class II molecules. Presented on the cell membrane in a state of binding to (HLA class II molecules in humans). HLA class II molecules show polymorphism, but CD4⁺The T cell receptor recognizes an antigen peptide bound to an HLA class II molecule together with a portion showing the polymorphism of the HLA class II molecule, and is activated in an antigen-specific manner. Activated CD4⁺T cells differentiate into Th0 and Th1 / Th2 cells and produce various cytokines. At that time, cytokine production patterns of each cell are different, Th1 produces IL-2, IFNγ, Th2 produces IL-4, IL-5, IL-10, etc., and Th0 produces both cytokines.
[0005]
On the other hand, B cells express IgM or IgD on the cell surface, and are activated by taking antigens into the cells. At that time, activated B cells differentiate and proliferate to antibody-producing cells by the action of cytokines produced from Th2, and produce antigen-specific immunoglobulin E (IgE). IgE produced in this way binds strongly to mast (mast) cells in the respiratory tract or nasal mucosal tissue and basophils in the blood via IgE receptors, resulting in a state of sensitization.
[0006]
When allergens enter the body again, one molecule of allergen immediately binds to two or more molecules of IgE on mast cells and basophils to form a crosslinked structure. As a result, receptors bound to IgE molecules associate with each other, triggering activation of several enzymes in the cell membrane, and various chemical mediators such as histamine, prostaglandins, and leukotrienes from cells. Released. These chemical mediators act locally on the nasal mucosa and airways, causing various allergic symptoms.
[0007]
The epitope recognized by T cells is called T cell epitope, and the epitope recognized by B cells is called B cell epitope.
[0008]
Since allergen epitopes are thought to be directly involved in the onset and exacerbation of type I allergies, identifying allergen epitopes is useful in the diagnosis, prevention and treatment of type I allergies.
[0009]
The major allergen of Japanese cedar pollen was isolated and purified by Yasue et al. And named Sugi Basic Protein (SBP) (Yasueda, H., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 71, 77-86, 1983) . This SBP has a molecular weight of 45-50 kDa and is now called Cry j I according to the WHO nomenclature. Thereafter, Cry j II having a molecular weight of 37 kDa, which is different in antigenicity from Cry j I, was isolated in the process of separation and purification of Cry j I (Taniai, M. et al. FEBS Letters 239, 329-332, 1988, Sakaguchi, M. et al. Allergy 45, 309-312, 1990).
[0010]
These results revealed that Cry j I and Cry j II are completely different proteins. However, in cedar pollinosis patients, both Cry j I and Cry j II were reported to react. It was. That is, among 145 cedar pollinosis sera, 134 (92.4%) sera reacted with Cry j I and Cry j II, and 6 (4.1%) sera reacted only with Cry j I, It was found that five (3.4%) sera react only with Cry j II (1993, 43rd Annual Meeting of Japanese Society of Allergology, Hashimoto et al., Nissho Univ., Yoken, National Sagamihara Hospital, Hayashibara Biochemical Research Institute). That is, it was shown that both Cry j I and Cry j II are important for the development of cedar pollinosis.
[0011]
For Cry j I, the cDNA encoding it has been cloned, and a peptide containing a T cell epitope has been identified based on its deduced amino acid sequence (WO94 / 01560, “ALLERGENIC PROTEINS AND PEPTIDES FROM JAPANESE CEDAR POLLEN”). For Cry j II, 10 amino acid residues of Ala, Ile, Asn, Ile, Phe, Asn, Val, Glu, Lys and Tyr of the N-terminal amino acid sequence have been reported (Sakaguchi, M., et al. , Allergy 45, 309-312, 1990).
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a cedar pollen allergen useful for diagnosis, prevention and treatment of cedar pollinosis.Cry j II of T Peptides containing cellular epitopes and the peptidesAn object of the present invention is to provide a DNA that encodes.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have
(1) Cry j IICode cDNA Cloning and elucidation of deduced amino acid sequence
(2)Estimated aboveAmino acid sequenceBased on the entire area of the arrayOf overlapping peptides to cover
(3)Cry j IIA T cell line that specifically recognizes
(4) Establishment of antigen-presenting cells (B cell line)
(5) T cell epitopeContaining peptidesIdentification
To complete the present invention.That is, the present invention
[1] Cedar pollen allergen Cry j II At least one of T A peptide comprising a cellular epitope,
[2] SEQ ID NO 6 ( Peptide number 1) , SEQ ID NO 7 ( Peptide number Four) , SEQ ID NO 8 ( Peptide number Five) , SEQ ID NO 9 ( Peptide number 6) , SEQ ID NO Ten( Peptide number 7) , SEQ ID NO 11 ( Peptide number 8) , SEQ ID NO 12 ( Peptide number 9) , SEQ ID NO 13( Peptide number Ten) , SEQ ID NO 14( Peptide number 14) , SEQ ID NO 15 ( Peptide number 16) , SEQ ID NO 16 ( Peptide number 17) , SEQ ID NO 17 ( Peptide number 18) , SEQ ID NO 18 ( Peptide number twenty five) , SEQ ID NO 19 ( Peptide number 26) , SEQ ID NO 20 ( Peptide number 27) , SEQ ID NO twenty one( Peptide number 28) , SEQ ID NO twenty two( Peptide number 29) , SEQ ID NO twenty three( Peptide number 30) , SEQ ID NO twenty four( Peptide number 31) , SEQ ID NO twenty five( Peptide number 32) , SEQ ID NO 26 ( Peptide number 33) , SEQ ID NO 27 ( Peptide number 34) , SEQ ID NO 28 ( Peptide number 37) , SEQ ID NO 29 ( Peptide number 38) , SEQ ID NO 30 ( Peptide number 41) , SEQ ID NO 31 ( Peptide number 42) , SEQ ID NO 32 ( Peptide number 44) , SEQ ID NO 33 ( Peptide number 47) , SEQ ID NO 34 ( Peptide number 48) , SEQ ID NO 35 ( Peptide number 49) , SEQ ID NO 36 ( Peptide number 50) , SEQ ID NO 37 ( Peptide number 51) , SEQ ID NO 38 ( Peptide number 52) , SEQ ID NO 39 ( Peptide number 53) , SEQ ID NO 40 ( Peptide number 54) , SEQ ID NO 41 ( Peptide number 60) , SEQ ID NO 42 ( Peptide number 61) , SEQ ID NO 43 ( Peptide number 62) , SEQ ID NO 44 ( Peptide number 63) , SEQ ID NO 45 ( Peptide number 64) , SEQ ID NO 46 ( Peptide number 65) , SEQ ID NO 47 ( Peptide number 66) , SEQ ID NO 48 ( Peptide number 68) , SEQ ID NO 49 ( Bae Peptide number 69) , SEQ ID NO 50 ( Peptide number 70) , SEQ ID NO 51 ( Peptide number 71) , SEQ ID NO 52 ( Peptide number 72) , SEQ ID NO 53 ( Peptide number 73) , SEQ ID NO 54 ( Peptide number 74) , SEQ ID NO 55 ( Peptide number 78) , SEQ ID NO 56 ( Peptide number 79) , SEQ ID NO 57 ( Peptide number 86) , And SEQ ID NO 58 ( Peptide number 87) The peptide according to [1], selected from the group consisting of:
[3] SEQ ID NO 14( Peptide number 14) , SEQ ID NO 16 ( Peptide number 17) , SEQ ID NO twenty two( Peptide number 29) , SEQ ID NO 28 ( Peptide number 37) , SEQ ID NO 29 ( Peptide number 38) , SEQ ID NO 34 ( Peptide number 48) , SEQ ID NO 48 ( Peptide number 68) , SEQ ID NO 49 ( Peptide number 69) , SEQ ID NO 50 ( Peptide number 70) , And SEQ ID NO 51 ( Peptide number 71) The peptide according to [1], selected from the group consisting of:
[4] Cedar pollen allergen Cry j II At least one of T Encodes a peptide containing a cellular epitope DNA ,
[5] The peptide is SEQ ID NO: 6 ( Peptide number 1) , SEQ ID NO 7 ( Peptide number Four) , SEQ ID NO 8 ( Peptide number Five) , SEQ ID NO 9 ( Peptide number 6) , SEQ ID NO Ten( Peptide number 7) , SEQ ID NO 11 ( Peptide number 8) , SEQ ID NO 12 ( Peptide number 9) , SEQ ID NO 13( Peptide number Ten) , SEQ ID NO 14( Peptide number 14) , SEQ ID NO 15 ( Peptide number 16) , SEQ ID NO 16 ( Peptide number 17) , SEQ ID NO 17 ( Peptide number 18) , SEQ ID NO 18 ( Peptide number twenty five) , SEQ ID NO 19 ( Peptide number 26) , SEQ ID NO 20 ( Peptide number 27) , SEQ ID NO twenty one( Peptide number 28) , SEQ ID NO twenty two( Peptide number 29) , SEQ ID NO twenty three( Peptide number 30) , SEQ ID NO twenty four( Peptide number 31) , SEQ ID NO twenty five( Peptide number 32) , SEQ ID NO 26 ( Peptide number 33) , SEQ ID NO 27 ( Peptide number 34) , SEQ ID NO 28 ( Peptide number 37) , SEQ ID NO 29 ( Peptide number 38) , SEQ ID NO 30 ( Peptide number 41) , SEQ ID NO 31 ( Peptide number 42) , SEQ ID NO 32 ( Peptide number 44) , SEQ ID NO 33 ( Peptide number 47) , SEQ ID NO 34 ( Peptide number 48) , SEQ ID NO 35 ( Peptide number 49) , SEQ ID NO 36 ( Peptide number 50) , SEQ ID NO 37 ( Peptide number 51) , SEQ ID NO 38 ( Peptide number 52) , SEQ ID NO 39 ( Peptide number 53) , SEQ ID NO 40 ( Peptide number 54) , SEQ ID NO 41 ( Peptide number 60) , SEQ ID NO 42 ( Peptide number 61) , SEQ ID NO 43 ( Peptide number 62) , SEQ ID NO 44 ( Peptide number 63) , SEQ ID NO 45 ( Peptide number 64) , SEQ ID NO 46 ( Peptide number 65) , SEQ ID NO 47 ( Peptide number 66) , SEQ ID NO 48 ( Peptide number 68) , Sequence number 49 ( Peptide number 69) , SEQ ID NO 50 ( Peptide number 70) , SEQ ID NO 51 ( Peptide number 71) , SEQ ID NO 52 ( Peptide number 72) , SEQ ID NO 53 ( Peptide number 73) , SEQ ID NO 54 ( Peptide number 74) , SEQ ID NO 55 ( Peptide number 78) , SEQ ID NO 56 ( Peptide number 79) , SEQ ID NO 57 ( Peptide number 86) , And SEQ ID NO 58 ( Peptide number 87) [4] is selected from the group consisting of DNA ,
[6] The peptide is SEQ ID NO: 14( Peptide number 14) , SEQ ID NO 16 ( Peptide number 17) , SEQ ID NO twenty two( Peptide number 29) , SEQ ID NO 28 ( Peptide number 37) , SEQ ID NO 29 ( Peptide number 38) , SEQ ID NO 34 ( Peptide number 48) , SEQ ID NO 48 ( Peptide number 68) , SEQ ID NO 49 ( Peptide number 69) , SEQ ID NO 50 ( Peptide number 70) , And SEQ ID NO 51 ( Peptide number 71) [4] is selected from the group consisting of DNA ,
[7] Cedar pollen allergen Cry j II At least one of T A preventive or therapeutic agent for cedar pollinosis containing a peptide containing a cell epitope, or a mixture thereof as an active ingredient,
[8] The peptide is SEQ ID NO: 6 ( Peptide number 1) , SEQ ID NO 7 ( Peptide number Four) , SEQ ID NO 8 ( Peptide number Five) , SEQ ID NO 9 ( Peptide number 6) , SEQ ID NO Ten( Peptide number 7) , SEQ ID NO 11 ( Peptide number 8) , SEQ ID NO 12 ( Peptide number 9) , SEQ ID NO 13( Peptide number Ten) , SEQ ID NO 14( Peptide number 14) , SEQ ID NO 15 ( Peptide number 16) , SEQ ID NO 16 ( Peptide number 17) , SEQ ID NO 17 ( Peptide number 18) , SEQ ID NO 18 ( Peptide number twenty five) , SEQ ID NO 19 ( Peptide number 26) , SEQ ID NO 20 ( Peptide number 27) , SEQ ID NO twenty one( Peptide number 28) , SEQ ID NO twenty two( Peptide number 29) , SEQ ID NO twenty three( Peptide number 30) , SEQ ID NO twenty four( Peptide number 31) , SEQ ID NO twenty five( Peptide number 32) , SEQ ID NO 26 ( Peptide number 33) , SEQ ID NO 27 ( Peptide number 34) , SEQ ID NO 28 ( Peptide number 37) , SEQ ID NO 29 ( Peptide number 38) , SEQ ID NO 30 ( Peptide number 41) , SEQ ID NO 31 ( Peptide number 42) , SEQ ID NO 32 ( Peptide number 44) , SEQ ID NO 33 ( Peptide number 47) , SEQ ID NO 34 ( Peptide number 48) , SEQ ID NO 35 ( Peptide number 49) , SEQ ID NO 36 ( Peptide number 50) , SEQ ID NO 37 ( Peptide number 51) , SEQ ID NO 38 ( Peptide number 52) , SEQ ID NO 39 ( Peptide number 53) , SEQ ID NO 40 ( Peptide number 54) , SEQ ID NO 41 ( Peptide number 60) , SEQ ID NO 42 ( Peptide number 61) , SEQ ID NO 43 ( Peptide number 62) , SEQ ID NO 44 ( Peptide number 63) , SEQ ID NO 45 ( Peptide number 64) , SEQ ID NO 46 ( Bae Peptide number 65) , SEQ ID NO 47 ( Peptide number 66) , SEQ ID NO 48 ( Peptide number 68) , SEQ ID NO 49 ( Peptide number 69) , SEQ ID NO 50 ( Peptide number 70) , SEQ ID NO 51 ( Peptide number 71) , SEQ ID NO 52 ( Peptide number 72) , SEQ ID NO 53 ( Peptide number 73) , SEQ ID NO 54 ( Peptide number 74) , SEQ ID NO 55 ( Peptide number 78) , SEQ ID NO 56 ( Peptide number 79) , SEQ ID NO 57 ( Peptide number 86) , And SEQ ID NO 58 ( Peptide number 87) The preventive or therapeutic agent according to [7], selected from the group consisting of:
[9] The peptide is SEQ ID NO: 14( Peptide number 14) , SEQ ID NO 16 ( Peptide number 17) , SEQ ID NO twenty two( Peptide number 29) , SEQ ID NO 28 ( Peptide number 37) , SEQ ID NO 29 ( Peptide number 38) , SEQ ID NO 34 ( Peptide number 48) , SEQ ID NO 48 ( Peptide number 68) , SEQ ID NO 49 ( Peptide number 69) , SEQ ID NO 50 ( Peptide number 70) , And SEQ ID NO 51 ( Peptide number 71) The preventive or therapeutic agent according to [7], selected from the group consisting of:
[0014]
(1) Elucidation of the complete amino acid sequence of Cry j II
(1) Cloning of cDNA
a. RNA extraction
When extracting RNA, proteins are usually removed at an early stage. Therefore, as a general method, there are a phenol extraction method, a guanidinium salt, a surfactant, a method using a protein denaturing agent such as urea.
[0015]
RNA extraction from cedar pollen can be performed by improving the method of Breiteneder et al. (Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 87: 19-24, 1988).
[0016]
Cedar pollen, 10-20 times the amount of extraction buffer (100 mM LiCl, 10 mMa₂Suspend in EDTA, 1% SDS, 20% mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl pH 9.0) and add homogenized mixture of phenol and chloroform (phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 24: 24: 1). . Next, it is centrifuged (10,000 g, 10 to 15 minutes), and separated into two layers, a phenol / chloroform layer and an aqueous layer. At this time, the denatured protein is transferred to the phenol / chloroform layer, and the nucleic acid is transferred to the aqueous layer. A phenol / chloroform mixture is added to the aqueous layer and shaken to remove impurities such as proteins remaining in the aqueous layer by transferring to the phenol / chloroform layer. Such an operation is repeated twice.
[0017]
To extract RNA from the resulting aqueous layer, high concentrations of LiCl (2-4M) or CH_ThreeIn the presence of COO Na (3M), DNA and protein remain in the supernatant, and RNA other than tRNA precipitates. Add the same amount of 2-4M LiCl to the aqueous layer to precipitate the RNA. Next, this aqueous layer is dissolved in water, and 0.1 to 0.3 volume of cold ethanol (−20 ° C.) is added to precipitate RNA (ethanol precipitation). Subsequently, the precipitate is recovered by centrifugation (10,000 g, 30 minutes) and dissolved in water to obtain a total RNA fraction.
[0018]
b. Preparation of mRNA and synthesis of cDNA
Cry j II mRNA has a poly (A) chain at the 3 ′ end, so an oligo dT cellulose column (made by Clontech Laboratories Inc.) bound with 12-18 bases of deoxythymidine (dT) as a complementary ligand. , CA, USA)Adsorb. Buffer solution (3M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) is added to cedar pollen RNA, and mRNA is adsorbed onto the column. The mRNA is eluted with a buffer solution (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) that does not contain NaCl 2 to 3 times the bed volume.
[0019]
A cDNA library can be prepared from the obtained mRNA using a cDNA library preparation kit (Amersham International plc., Buckinghamshare, England) using a commercially available phage as a vector.
[0020]
c. Screening of Cry j II cDNA
Although the C-residue N-terminal 10 amino acid residues are already known, Cry j II cDNA can be screened using a synthetic DNA having a base sequence deduced from this amino acid sequence as a probe. When synthesizing DNA to be used as a probe, it is desirable to design an oligonucleotide that hybridizes to a plurality of possible codon sequences rather than synthesizing all oligonucleotides containing potential codons. The 5 ′ end of this synthetic oligonucleotide probe is [γ-³²Label with P] ATP and polynucleotide kinase and screen positive clones from the cDNA library by plaque hybridization.
[0021]
Phage DNA is prepared from the obtained positive clone, and the inserted cDNA fragment is isolated and subcloned into a plasmid such as pUC18. If necessary, oligonucleotide primers are synthesized, the nucleotide sequence is determined by the Sanger method or the like, and the clone is identified. The full-length base sequence of Cry j II cDNA isolated by the present inventors is shown in SEQ ID NO: 5.
[0022]
The cDNA encoding Cry j II consists of a total of 1733 bp and contains an open reading frame from the codon assumed to start translation (nucleotide ATG at positions 45-47) to the stop codon (nucleotides TAA at positions 1587-1589). , Which codes for 514 amino acids. The base sequence of the open reading frame portion is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 1. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 may have polymorphism due to allelic variation between individuals and the resulting amino acid sequence variation, but the nucleotide sequence of Cry j II having such a variation And amino acid sequences are also encompassed by the present invention. The amino acid sequence encoded by the DNA sequence at positions 207 to 236 is Ala, Ile, Asn, Ile, Phe, Asn, Val, Glu, Lys, Tyr, and the N-terminal amino acid sequence of mature Cry j II (Sakaguchi, M. , et al., Allergy 45, 309-312, 1990). The 54 amino acids at the N-terminal are considered to be signal peptides because they are rich in hydrophobic amino acids found in other signal peptides and are not contained in mature Cry j II.
[0023]
Sequence number Five ofCry j II encoded by the DNA sequence from position 207 to stop codon 1587 to 1589 is composed of 460 amino acid residues from Nla-terminal Ala to C-terminal Pro, and is considered to be mature Cryj II. The base sequence corresponding to the mature Cry j II is encoded by SEQ ID NO: 4 and the base sequence.MatureThe amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The theoretical molecular weight of Cry j II consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 50,444 Da. On the other hand, the natural mature form of Cry j II shows a band at a position of 45 KDa by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions (Sakaguchi, M., et al., Allergy 45, 309-312, 1990). This suggests that the C-terminal of Cry j II is processed. In the amino acid sequence of mature Cry j II, Asn-X-Ser / Thr with the possibility of N-glycoside bond is present.Three Location (SEQ ID NO: 2 Of amino acid sequence 375 ~ 377 Rank, 406 ~ 408 And 418 ~ 420 Rank)Exists.
[0024]
DNA containing the full length or a part of the DNA encoding Cry j II encodes a biochemical test or a protein containing a related protein or a similar sequence by labeling with a fluorescent label, a radioactive label or an enzyme label. It can be used as a probe or primer for DNA screening. It can also be connected to an expression vector to express a protein or peptide comprising at least one epitope.
[0025]
(2) Expression of recombinant Cry j II (rCry j II)
rCry j IIproteinOr at least one Cry j IIT cellEpitopeContaining peptidesIncorporates cDNAs encoding each into expression vectors and introduces them into E. coli, insect cells, yeast or mammals,ExpressCan be obtained. However, in expression systems using prokaryotic cells such as E. coli, it may be preferable to use eukaryotic cells such as yeast for the expression of rCry j II because appropriate glycosylation is not performed. is there.
[0026]
someExamples of expression systems are shown below.
[0027]
a. Expression in E. coli
System using T7 phage promoter and RNA polymerase (FW Studier, AH Rosenberg, JJ Dunn, JW Dubendonff, "Methods in Enzymology", ed. By DDV Goeddel, vol. 185, p. 60, Academic Press, New York, 1990 ) Has a very high success rate of expression and can be suitably used in the present invention. This system introduces a recombinant plasmid in which the gene of interest is inserted into the multicloning site downstream of the T7 phage promoter into E. coli host BL21 (DE3) carrying the polymerase gene of T7 phage, and in the presence of IPTG, It is a system for gene expression. For example, pGEMEX-1 (Promega) can be used as an expression vector.
[0028]
In addition, systems for fusing and expressing a target protein with a protein that can be expressed in large quantities are commercially available. These systems can use an affinity column for purification, have high purification efficiency, and can be suitably used in the present invention. For example, when an expression vector pUEX (Amersham) having β-galactosidase as a fusion protein is used, rCry j II is obtained as a fusion protein with β-galactosidase and can be efficiently purified with an affinity column. In addition, pGEX (Pharmacia) with glutathione S-transferase and pMAL (New England Biolabs, Berverly, MA) using maltose-binding protein have a cleavage site for blood coagulation factor Xa introduced at the fusion site. Cry j II can be isolated.
[0029]
b. Expression in yeast
The yeast host system is capable of glycosylation of the expression product, which is advantageous for the expression of the glycoprotein Cry j II. For example, as a heterologous protein expression system using yeast, methods using Pichia yeast as a host are known (Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-108383, 61-173781, and 63-44899). JP-A-1-128790, etc.) and can be suitably used in the present invention. Other yeast expression systems are described in detail in D. Emr Scott, "Methods in Enzymology", ed. By DV Goeddel, vol. 185, p.231, Academic Press, New York (1990). Can be used in the invention.
[0030]
c. Expression in insect cells
A system using an insect cell as a host is capable of glycosylation of an expression product. A foreign gene expression system using baculovirus is commercially available (PharMingen, San Diego, CA, USA) and can be suitably used in the present invention. This system is described in Luckow, V. A. et al., Trends in the Development of Baculovirus Expression Vector, Bio / Technology (September 11, 1987).
[0031]
d. Expression in mammalian cells
High expression can be achieved by incorporating it into an expression vector having a mammalian promoter (eg, metallothionein), a viral promoter (eg, SV40 early promoter) and the like and introducing it into mammalian cells.
[0032]
(2) Synthesis of overlapping peptides
To elucidate the T cell epitope of Cry j II recognized by T cells of hay fever patients at the molecular level, SEQ ID NO: 2Amino acid sequence describedBased on the above, an overlapping peptide covering all 460 amino acid residues from Ala at the N-terminal to Pro at the C-terminal is prepared. These overlapping peptides can be easily synthesized by a commercially available peptide automatic synthesizer. Among these overlapping peptides, peptides containing at least one epitopeIdentify. T Cell epitopeTherefore, it is necessary to establish a T cell line that specifically recognizes Cry j II and proliferates from peripheral blood lymphocytes of hay fever patients. In general, since the T cell epitopes that react with each patient are different, it is desirable to establish a T cell line for each patient.
[0033]
(3) Establishment of T cell line
To establish a Cry j II antigen-specific T cell line, peripheral blood lymphocytes of normal patients are cultured for about 7 days in the presence of Cry j II antigen, and T cells are activated by antigen stimulation. An antigen-specific T cell line can be prepared by repeating antigen-stimulated by repeating culturing T cells with antigen and antigen-presenting cells for 7 days several times. However, if T cells are proliferating well in the presence of the growth factor IL-2, antigen stimulation is desirable only at the beginning. When a T cell line is antigen-stimulated several times, a T cell with a high proliferation rate can be selectively removed, and when a peptide containing a T cell epitope is identified, some epitopes may not exhibit a sufficient proliferative response.
[0034]
In principle, natural Cry j II antigen is desirable as the antigen to be used, but since only a very small amount can be extracted from cedar pollen, a recombinant Cry j II (rCry j II) or a mixture of overlapping peptides is also suitable. Can be used. rCry j II can be expressed and purified in E. coli.
[0035]
(4) Establishment of antigen-presenting cells (B cell line)
Antigen-presenting cells are preferably those in which peripheral blood lymphocytes of the same person as the T cell line have lost their proliferation ability by treatment with mitomycin C or irradiation. However, due to the increased number of blood samples collected, Epstein-Barr virus (EBV) infected with its own B lymphocytes caused transformation and continued to proliferate in vitro. Therefore, this B cell line may be used as an antigen-presenting cell. A method for establishing a B cell line has already been established [Tissue Culture Technology 2nd Edition, pp. 187-191, edited by the Japanese Histological Society (1988.8.10)].
[0036]
(5) T cell epitopeContaining peptidesIdentification
A peptide containing a T cell epitope recognized by each patient-specific T cell line is identified as follows. The term “recognize” here means that the T cell receptor specifically binds to an antigenic epitope (including MHC molecules), and as a result, the T cell is activated. It is observed by measuring lymphokine production and DNA synthesis using [3 H] thymidine incorporation as an index. That is, a T cell line and a mitomycin C-treated B cell line of the same person were seeded on a 96-well flat bottom plate, mixed and cultured with overlapping peptides, and [3 H] thymidine uptake (cpm) was measured using a liquid scintillation counter. taking measurement. At that time, since [3 H] thymidine incorporation differs in each culture system, for example, the amount of [3H] thymidine incorporation (cpm) of the T cell line for each peptide is set to [3 H] of the control without addition of antigen. ] The number (stimulation index: SI) divided by thymidine incorporation (cpm) of 2 or more is identified as a peptide containing a T cell epitope. Peptides containing the identified T cell epitopes are listed in FIG.
[0037]
The following may be considered for the peptide containing at least one T cell epitope of Cry j II of the present invention thus obtained. The length of the peptide presented as an antigen by binding to an HLA class II molecule is approximately 10 to 10 from the results of peptide analysis (Chicz, RM et al .: J. Exp. Med., 178: 27-47, 1993). Since it is thought that it consists of 34 amino acid residues, the peptide containing the T cell epitope of the present invention includes such a peptide. Further, by modifying the peptide of the present invention such as amino acid substitution, deletion or addition, and measuring the proliferation response of the T cell line for each patient against these modified peptides, at least one of the Cry j II of the present invention. Since it is easy for those skilled in the art to easily produce modified peptides having immunologically the same function as peptides containing T cell epitopes, these modified peptides are also included in the present invention.
[0038]
Currently, the desensitizing agent used in the desensitization therapy is a crude antigen extracted from cedar pollen and contains a large amount of polysaccharides. There are considerable lot differences, and once sensitization therapy is started, anaphylaxis may occur when changing lots. In addition, the therapeutic effect of desensitization has not improved much since desensitization treatment was started, and about 30% of patients are diagnosed as effective with desensitization therapy.
[0039]
Among the peptides containing the T cell epitope of the present invention, each peptide that reacts with the T cell line of more than half of hay fever patients is desensitized by using these peptides alone or a mixture of several peptides. If treated, desensitization may be possible in more than half of the treated patients. Moreover, since the peptide to be used is a chemically synthesized peptide, it is considered that the possibility of causing side effects such as anaphylaxis is reduced. For example, FIG. 5 shows the overlap peptide recognized by each T cell line established from 18 hay fever patients. The importance index [“average stimulation coefficient” (“T cell line by overlap peptide stimulation [^ThreeH] Thymidine incorporation (cpm) "^ThreeH] The average value of the thymidine uptake (cpm) divided by “cpm”) and “frequency (%)” (“T cell line that recognized the test peptide as a T cell epitope” relative to “all T cell lines tested”) The ratio (%) is multiplied by the value], but the peptides with

numbers

14, 17, 29, 38, 48, 68, 70 and 71 in the figure have an average stimulation coefficient of about 3.9 or more. In addition, the importance index exceeds 200, which is considered to be particularly effective for desensitization treatment.
[0040]
In addition, among the peptides containing at least one T cell epitope shown in FIG. 5 clarified by the present inventor, a peptide having a common part with two types of peptides found to contain the B cell epitope described later Is not included. Therefore, since the peptide of the present invention is considered not to stimulate the B cell epitope, it can be put to practical use as a desensitizer.
[0041]
It is also considered that oral tolerance can be performed by orally administering a peptide containing the T cell epitope of the present invention. Oral tolerance (oral desensitization) is a treatment currently under development, but results showing efficacy are beginning to be reported. For example, it has been reported that myelin basic protein T cell epitopes (peptide sequences 21-40 and 71-90) were orally administered to mice, which suppressed the development of "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (abbreviated as EAE)" [Shuichi Uenogawa , Kusunoki Hiroshi, Yamura Toshi, Molecular biology of oral tolerance, protein nucleic acid enzyme, 39, 2090-2101 (right page 2098, lines 9-24) 1994]. From these examples, even in Japanese cedar pollinosis, if the identified T cell epitope peptide is orally administered as it is or if it is administered orally by some means such as encapsulating it so that it is not digested in the stomach, the immune tolerance state There is a possibility. Epitope peptide is orally administered before the cedar pollen dispersal period, specifically in the December-January period to induce immune tolerance. In this state, even if cedar pollen is scattered and pollen adheres to the nasal mucosa, it is expected that no symptom appears or the symptom is reduced.
[0042]
Furthermore, an analog peptide in which the peptide containing the T cell epitope of the present invention is modified with amino acid substitutions, deletions or additions is synthesized and binds to the HLA class II molecule, but the T cell has information. Identify analog peptides that are not transmitted. When these peptides are used for patients as nasal drops, for example, natural T cell epitopes are competitively inhibited, and thus prevention of onset is expected.
[0043]
B cell epitopeIdentification can be performed by a known method such as measurement of reactivity between overlap peptide and patient serum IgE antibody, detection of inhibition of binding between patient serum and antigen by overlap peptide (JP-A-6-69336). Issue). Already, monovalent B cell epitopes are known to be useful for suppressing allergic reactions. This is believed to be due to the monovalent B cell epitope binding to the corresponding IgE molecule on mast cells or basophils and inhibiting the formation of IgE molecular bridges by the multivalent epitope. The present inventors synthesized overlapping peptides covering the entire amino acid sequence of Cry j II of the present invention, and measured the reaction of these peptides with the cedar pollinosis patient serum IgE antibody by the enzyme antibody method. "Gln Cys Lys Trp Val Asn Gly Arg Glu Ile Cys (amino acid sequence 113-123)" and "Cys Thr Ser Ala Ser Ala Cys Gln Asn (amino acid sequence 293-301)" are found to contain B cell epitopes I made it. Such a peptide containing a Cry j II B cell epitope is useful for diagnosis, prevention and treatment of Japanese cedar pollinosis.
[0044]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
[0045]
<Collecting cedar pollen>
The cedar pollen was collected from male flowers that were planted on cedar branches cut in February in Shizuoka and Kanagawa prefectures. Cedar pollen for Cryj II antigenic purification was stored at -70 ° C, and cedar pollen for RNA preparation was snap frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
[0046]
<Extraction of RNA>
RNA was extracted from cedar pollen by making improvements based on the method of Breiteneder et al. (Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 87: 19-24 1988).
[0047]
15 ml of extraction buffer (100 mM LiCl, 10 mMa₂It was suspended in EDTA, 1% SDS, 20% 2-mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl, pH 9.0), and 15 ml of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (24: 24: 1) was added. This suspension was transferred to a Teflon homogenizer, and 20-30 stroke homogenization was performed while rotating the Teflon Pester with a motor at the maximum rotation. Thereafter, the aqueous layer and the organic layer were separated by centrifugation (10,000 g, 15 minutes) to obtain an aqueous layer. The same amount of phenol: chloroform: isoamyl alcohol was added to the aqueous layer. After shaking for 5 minutes, the aqueous layer was obtained by centrifugation (10,000 g, 15 minutes). The same operation was repeated twice and once more with 15 ml of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1). The same amount of 4M LiCl was added to the obtained aqueous layer and left overnight at -20 ° C. The frozen solution was dissolved at room temperature, and a precipitate was obtained by centrifugation (20,000 g, 30 minutes). Dissolve the precipitate in a small amount of sterile distilled water and add 0.3 volume of 3M CH._ThreeCOONa, pH 5.2 and 2.5 volumes of ethanol were added and left at -20 ° C for 60 minutes. The precipitate collected by centrifugation (10,000 g, 30 minutes) was redissolved in sterile distilled water to obtain a total RNA fraction.
[0048]
<Preparation of cedar pollen mRNA and cDNA synthesis>
After adding the same amount of binding buffer (3M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) using 1 mg of cedar pollen total RNA as a starting material, a span column pre-packed with oligo dT cellulose (CLONETECH Laboratories Inc. (About 10 μg of mRNA was purified by elution with elution buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) (according to the protocol attached to CLONETECH Lab. Inc.) . Subsequently, about 4 μg of cDNA was synthesized from 5 μg of the purified mRNA using cDNA synthesis system plus (Amersham International plc., Buckinghamshare, England) according to the attached protocol.
[0049]
<Synthesis of oligonucleotide probe>
The amino acid sequence of 10 residues from the N-terminus of Cry j II is shown in FIG. 1A. The cDNA sequence predicted from this amino acid sequence is shown in FIG. 1B. As an oligonucleotide probe (Oligo CJII), complementary to the sequence, and since two types of bases were used at four locations, a total of 16 types of mixtures were synthesized (FIG. 1C). G: T base pairs are allowed to reduce the variety as a mixture.
[0050]
<Cloning of Cry j II cDNA>
A cDNA library was prepared using a cDNA cloning system λgt10 (Amersham International plc., Buckinghamshare, England) according to the attached protocol. 1 μg of the above cDNA was incorporated into λgt10 to prepare a cDNA library. About 5,000 clones out of about 500,000 libraries were spread on one 150mm diameter plate. As a probe for screening, the above oligonucleotide (Oligo CJII) was conjugated with T4 polynucleotide kinase [γ-³²It was labeled with P] ATP (7,000 Ci / mmol ICN Biochemicals, Inc.). A nitrocellulose filter on which phage DNA is immobilized is placed in 5 x SSPE (1 x SSPE: 0.18 M NaCl, 10 mM sodium phosphate, 1 mM EDTA), 5 x FBP (1 x FBP: 0.02% Ficoll, 0.02% bovine serum albumin, 0.02 % Polyvinylpyrrolidone), 0.3% SDS, and 100 μg / ml tRNA were prehybridized by immersing them at 48 ° C. for 1 hour or longer. After that, immerse the nitrocellulose filter in the newly prepared solution,³²P-labeled probe (Oligo CJII) was added and hybridization was performed overnight at 48 ° C. Thereafter, the filter was washed with a solution containing 6 × SSC (1 × SSC: 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate) and 0.1% SDS at room temperature of 30 ° C. and 48 ° C. for 5 minutes, and then autoradiography was performed. Four strong signals were detected. One of the phage DNAs was extracted and cut with the restriction enzyme EcoRI, and it was found that a DNA fragment of about 1.7 Kbp was inserted. The inserted fragment was subcloned into pUC118, and a deletion mutant was prepared using a kilosequence deletion kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) and used for determination of the entire nucleotide sequence. The base sequence was determined by performing a primer extension reaction using a synthetic primer and a dye-labeled dideoxy terminator and reading with an automatic sequencer (Model 370A, Applied Biosystems, Japan). The determined cDNA whole base sequence is shown in SEQ ID NO: 5. In addition, the base sequence of only the open reading frame is SEQ ID NO: 3 (the amino acid sequence encoded by the base sequence is SEQ ID NO: 1), and the base sequence encoding mature Cry j II is SEQ ID NO: 4 (the base sequence is encoded). The amino acid sequence to be shown is shown in SEQ ID NO: 2.
[0051]
<Expression of recombinant Cry j II in E. coli>
E. coli expression vector pGEMEX-1 commercially available from Promega has a T7 promoter, T7 gene10 coding sequence and T7 terminator, and inserts an open reading frame into the multiple cloning site downstream of T7 gene10 to express T7 RNA polymerase. It is a vector that achieves high expression by introduction into E. coli (eg BL21 (DE3)). The Cry j II cDNA was digested with BamHI (the adapter ligated to both ends of the cDNA contains the BamHI site), and the cDNA fragment was excised and incorporated into the BamHI site of pGEMEX-1 to construct the Cry j II expression vector pEXCJII. pEXCII can express a fusion protein (T7 Cry j II, 73 kD) of a T7 gene10 expression product (23 kD) and a Cry j II protein (50 kD). Transformants in which pEXCII was introduced into E. coli BL21 (DE3) were cultured, and T7 RNA polymerase was induced with IPTG to express Cry j II. The expressed E. coli cell extract was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis. In BL21 (DE3) carrying pEXCII, a band of about 73 kD, which seems to be T7 Cry j II, was observed. However, these bands were not seen in BL21 (DE3) or parental strain BL21 (DE3) carrying the control pGEMEX-1.
[0052]
<Reactivity of Cry j II and T7 gene10 fusion protein (T7Cry j II) with cedar pollinosis patient serum>
The extract of E. coli expressing T7 Cry j II was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and then Western Blotting on a Millipore PVDF membrane to obtain the serum of 5 cedar pollinosis patients and 3 healthy persons. The reactivity of was examined. As a control, BL21 containing pGEMEX-1 and a BL21 extract expressing a T7 gene10-Cry j I fusion protein (T7 Cry j I) and natural Cry j I purified from cedar pollen were simultaneously blotted and reacted. I investigated. As shown in FIG. 2, two patient sera reacted with T7 Cry j II. Both patient sera reacted with T7 Cry j II and native Cry j I, but not with BL21 extract containing pGEMEX-1 and T7 Cry j I. From these results, it was confirmed that T7Cry j II has antigenicity that reacts with IgE in the sera of Japanese cedar pollinosis patients.
[0053]
<Synthesis of overlapping peptides>
The overpeptide was synthesized using Peptide Synthesizer PSSM-8 (manufactured by Shimadzu Corporation). Based on the primary structure of Cry j II shown in SEQ ID NO: 2, 90 types of 15-mer overlapping peptides starting from the N-terminal 55th Ala to the C-terminal Pro and containing 10-residue overlapping parts Was synthesized. 3 to 6 show all overlapping peptides synthesized using the one-letter code for amino acids.
[0054]
<Establishment of B cell line>
Peripheral blood lymphocytes obtained by Ficoll-Paque specific gravity centrifugation (1 × 10⁶), About 1 x 10⁶Cells were infected with virus by incubating with Epstein-Barr virus (EBV) of PFU (plaque forming units) at 37 ° C. for 1 hour. When this virus-infected cell is transferred to a 24-well culture plate and cultured for about 2 weeks in the presence of 100 ng / ml cyclosporin A, B cell colonies appear. At this point, they were split in half and planted in new wells. If this procedure is repeated in succession and subculture is performed, self-proliferating B cells may appear. After expanding the cells in the well containing this self-proliferating B cell and confirming the growth, 25 cm²The cells were transferred to a culture flask and further cultured for 30 to 50 days to obtain an EBV-transformed B cell line. A portion of the B cell line was stored frozen.
[0055]
<Establishment of Cry j II antigen-specific T cell line>
Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of 18 cedar pollinosis patients by the commonly used Ficoll-paque specific gravity centrifugation method and stored in liquid nitrogen until use. Peripheral blood lymphocytes (4 × 106 cells) from a cedar pollinosis patient were suspended in RPMI-1640 supplemented with 2 ml of 20% autologous plasma, expressed in 10 µg / ml of E. coli, and purified. The cells were cultured together with the antigen on a 24-well culture plate for 7-8 days. When T cells activated upon stimulation with Cry j II antigen (weakening reaction, blastogenesis) were confirmed under a microscope, 5 Unit / ml IL-2 was added and cultured overnight. From the next day, the cells were cultured for 9 days with RPMI-1640 supplemented with 20 Unit / ml IL-2 and 20% human AB type serum (commercially available) every day. At this point, a portion of the expanded T cell line that specifically recognizes the Cry j II antigen was cryopreserved. Furthermore, the T cell line is cultured in the above culture medium for 4 days,T cellCells were used for epitope identification.
[0056]
<T cell epitopeContaining peptidesIdentification>
T cell lines established from 18 hay fever patients were cultured with cedar pollen allergen overlapping peptides, respectively, and peptides containing Cry j II antigen-specific T cell epitopes were identified.
[0057]
A cultured B cell line established from the same patient as the T cell line was treated with 50 μg / ml mitomycin C for 30 minutes, and the cells were washed 4 times with RPMI-1640. Seed these B cells in a 96-well flat-bottomed plate (5 × 10^FourCry j II (25 μg / ml final concentration) or each overlapping peptide (final concentration 0.5 μM) was added to each well and incubated for about 60 to 90 minutes. T cell line (2 x 10^Four/ well) in each well, cultured for 48 hours, then 0.5 μl / Ci [^ThreeH] thymidine was added to the wells and incubated for an additional 16 hours. The cells were collected on a glass filter using a cell harvester, dried, and taken up into the cells [^ThreeH] thymidine counts (cpm) were measured with a liquid scintillation counter.
[0058]
The measurement was performed in triplicate culture, and the results were as follows: [3 H] thymidine uptake (cpm) in the T cell line stimulated by overlapping peptides, and [3 H] thymidine uptake (cpm) in the absence of antigen (control) Calculated by the stimulation index (SI), which is the value divided by, and the overlapping peptide with a SI of 2 or more,At least oneT cell epitopeContaining peptidesIdentified(FIGS. 7 and 8). Figure 9, “Average stimulation coefficient” (average value of stimulation coefficients obtained by a plurality of experiments) “appearance frequency (%)” and “importance index” of all overlapping peptides.
[0059]
【The invention's effect】
At least Cry j II of the present inventionOne T Cell epitopeIs useful for diagnosis, prevention and treatment of Japanese cedar pollinosis.
[0060]
Furthermore, it is also possible to synthesize analog peptides that bind to HLA class molecules but do not transmit information to T cells, and use these peptides to prevent the development of cedar pollinosis by competitive inhibition.
[0061]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an amino acid sequence (A) of 10 residues from the N terminus of a cedar pollen allergen Cry j II. A DNA sequence deduced from the amino acid sequence of 10 residues from the N-terminus of the cedar pollen allergen Cry j II (B). DNA sequence of a probe for screening a cDNA encoding the cedar pollen allergen Cry j II (C).
FIG. 2 shows the results of Western blot analysis of T7 Cry j II antigenicity using sera from two cedar pollinosis patients. Lane 1 is BL21 (DE3) holding pMGEMEX-1 (negative control), Lane 2 is BL21 (DE3) expressing T7 Cry j I, Lane 3 is BL21 (DE3) expressing T7Cry j II, Lane 4 is Cry j I purified from cedar pollen is shown. A and B are the same except for the patient from whom the serum is derived.
[Fig. 3]Mature Cry j II (Sequence number 2 )An overlapping peptide covering the entire amino acid sequence is shown.
[Fig. 4]Mature Cry j II (Sequence number 2 )An overlapping peptide covering the entire amino acid sequence is shown.
[Figure 5]Mature Cry j II (Sequence number 2 )An overlapping peptide covering the entire amino acid sequence is shown.
[Fig. 6]Mature Cry j II (Sequence number 2 )An overlapping peptide covering the entire amino acid sequence is shown.
FIG. 7 shows a peptide comprising at least one T cell epitope of Cry j II.
FIG. 8 shows a peptide comprising at least one T cell epitope of Cry j II.
FIG. 9 shows the importance index of overlapping peptides recognized by T cell lines specific for Cry j II allergens established from 18 cedar pollinosis patients.

Claims

SEQ ID NO: 14 (peptide number 14), SEQ ID NO: 16 (peptide number 17), SEQ ID NO: 22 (peptide number 29), SEQ ID NO: 28 (peptide number 37), SEQ ID NO: 29 (peptide number 38), SEQ ID NO: 34 (peptide) Cedar pollen allergen selected from the group consisting of SEQ ID NO: 48), SEQ ID NO: 48 (PEPTIDE NO. 68), SEQ ID NO: 49 (PEPTIDE NO. 69), SEQ ID NO: 50 (PEPTIDE NO. 70), and SEQ ID NO: 51 (PEPTIDE NO. 71). A peptide comprising at least one T cell epitope of Cry j II.

DNA encoding the peptide according to claim 1.