JP3640791B2

JP3640791B2 - Organochlorine compound decomposition method and organochlorine compound-decomposing fungus

Info

Publication number: JP3640791B2
Application number: JP07106198A
Authority: JP
Inventors: 裕子今村; 理夫池田
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1998-03-19
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2018-03-19
Also published as: JPH11266859A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物により有機塩素化合物を分解する方法と、有機塩素化合物分解能を有する微生物の有機塩素化合物分解能を制御する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種の工場で洗浄剤等として使用されてきたトリクロロエチレン（ＴＣＥ）やジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素化合物の環境への漏出が大きく問題視されている。こうした有機塩素化合物の使用は規制されてきているが、すでに現在までに有機塩素化合物で汚染された環境、例えば汚染土壌や汚染地下水の問題は依然として残っている。
【０００３】
そこで、有機塩素化合物で汚染された土壌や地下水等の環境を浄化することが検討されている。例えば、真空抽気や燃焼等の物理的方法で汚染環境を浄化することも提案されているが、より低コストで環境負荷の少ない手法として、微生物を利用して汚染環境中の有機塩素化合物を分解する方法が注目されている。また、有機塩素化合物の直接的な処理技術として、活性炭を用いた吸着法や熱・光による分解法等も知られているが、同様にコストや操作性の面から微生物を用いた生物分解法が注目されている。
【０００４】
例えば、上述した微生物を用いた有機塩素化合物の生物分解法としては、メタン資化性菌を利用する方法（特開平２−９２２７４公報参照）や、フェノ−ル、トルエン、クレゾ−ル等の芳香族化合物による誘導を必要とする菌を利用する方法（特開平６−２９６７１１公報参照）等が提案されている。
【０００５】
しかしながら、上述した従来の有機塩素化合物の生物分解法は、いずれも添加物や誘導物質が必要であるため、分解活性、処理効率等を維持・向上させることが難しい。さらに、汚染環境の浄化等に適用する場合には、添加物や誘導物質を含めて新たな物質を環境に加えることになるため、別の汚染（２次汚染）を引き起こす恐れがあり、真の環境浄化にはならないという問題を有している。特に、後者の方法は環境に有害なフエノール、トルエン、クレゾール等の芳香族化合物による誘導が必要な菌を使用するため、新たな環境汚染を引き起こす恐れが大きい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、従来の微生物を用いた有機塩素化合物の生物分解法においては、微生物の分解活性を発現させるために資化物質や誘導物質を添加する必要がある。したがって、環境に有害な誘導物質等を必要とする場合には、２次汚染を引き起こす恐れが大きく、有機塩素化合物により汚染された環境の浄化法としては満足のい＜ものではなかった。また、資化物質や誘導物質の添加が必要であるため、高い分解活性を維持することが難しいという問題を有している。
【０００７】
以上のようなことから、環境等に有害な誘導物質等を添加することなく、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解活性を維持し、さらにその分解活性を向上させることで処理効率を高めることのできる、微生物による有機塩素化合物分解方法が強く求められている。
【０００８】
本発明はこのような課題に対処するためになされたもので、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解能を、環境等に有害な誘導物質等を添加することなしに制御することができる、微生物による有機塩素化合物分解方法、および、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解能を制御する新規微生物を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載したように、本発明に係る有機塩素化合物分解方法は、有機塩素化合物分解能を有する第１の微生物と前記第１の微生物の有機塩素化合物分解能を制御する第２の微生物または前記第２の微生物の抽出物とを有機塩素化合物に接触させて分解する有機塩素化合物分解方法であって、前記第２の微生物は、アシネトバクター属に属するアシネトバクターｓｐ．（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＥＮＡ１ＦＥＲＭＢＰ−６２９５菌株を含むことを特徴としている。
【００１０】
第２の微生物の制御機構としては、第２の微生物または第２の微生物の抽出物が、直接的または間接的に、第１の微生物の生育、増殖、分解活性に物理的、化学的、生物学的に作用して分解能を制御することができる。
【００１１】
例えば、第２の微生物または第２の微生物の抽出物が、第１の微生物の生育、増殖、分解活性等を阻害する要因を抑制または排除するために、第１の微生物の生育、増殖、分解活性等を維持増強するという制御をすることができる。また、第２の微生物または第２の微生物の抽出物が、直接的または間接的に第１の微生物の生育、増殖、分解活性を向上させるという制御をすることができる。
【００１２】
これにより、環境等に有害な誘導物質等を添加することなく、第１の微生物の分解能を制御することができる。したがって、第２の微生物あるいはその抽出物による制御が、第１の微生物の有機塩素化合物分解能の活性化として働く場合には、第１の微生物の分解活性を維持・向上させることで有機塩素化合物分解効率を高めることもでき、汚染環境の浄化等にも非常に利用価値の高いものである。
【００１３】
制御能を有する第２の微生物は一種類である必要はなく、分解対象となる有機塩素化合物の種類に応じて、二種類以上の微生物を組み合わせて使用することも可能である。
【００１４】
また、請求項２に記載したように、本発明に係る新規微生物は、有機塩素化合物分解能を有する微生物の有機塩素化合物分解能を制御するアシネトバクタ−属に属するアシネトバクタ−ｓｐ．（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＥＮＡ１ＦＥＲＭＢＰ−６２９５菌株であることを特徴としている。この菌株およびその抽出物は、有機塩素化合物分解能を有する種々の微生物の分解能を制御するが、なかでも特願平８−３０９７１９に記載したコマガテラブレビス（Ｋｏｍａｇａｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓ）ＹＭＣＴ−００１ＦＥＲＭＢＰ−５２８２菌株（以下ＹＭＣＴ−００１株と記す）の分解活性を顕著に向上させることができる。
【００１５】
前述したように、本発明に係る有機塩素化合物分解方法は、有機塩素化合物分解能を有する第１の微生物を、前記該微生物の分解能を制御する第２の微生物または前記第２の微生物からの抽出物と共に有機塩素化合物に接触させて分解することを基本としている。
【００１６】
第２の微生物が第１の微生物の有機塩素化合物分解能を制御する方法としては、例えば、第１の微生物と第２の微生物の物理的関わり合いによるものがある。第２の微生物が第１の微生物を取り囲むことにより、第１の微生物の発育を阻害する物質の作用が減じられる場合、または、第２の微生物により第１の微生物の生存に適した物理的、空間的環境が形成される場合等である。第２の微生物の存在により、第１の微生物の生育、増殖が維持増強され、その結果として、第１の微生物の有機塩素化合物分解能が増強されるため、第２の微生物が存在する間はその活性が維持される。
【００１７】
他の制御方法としては、例えば、第２の微生物が菌体外へ放出する制御物質によるものがある。この方法では、第１の微生物と第２の微生物とが必ずしも同一点に存在する必要が無く、第２の微生物の放出する制御物質が及ぶ範囲において第１の微生物の分解能を制御することができる。また、第２の微生物自体を第１の微生物と共に汚染環境中等に添加した場合には、第２の微生物の生育・増殖により、汚染環境中においても制御物質の生産を継続することが可能であり、制御作用が長期に渡り維持される。したがって、例えば制御物質が第１の微生物の分解能を活性化する場合には、第１の微生物の分解能を長期に渡って活性化することができる。
【００１８】
また、第２の微生物の生育に適さない環境であっても、その抽出物を適用することで、第１の微生物の分解能を制御することが期待できる。こうした抽出物は、例えば、第２の微生物が培養液中に放出した代謝産物や体外酵素や、菌体を溶菌酵素（リゾチウム等）やホモジナイザ−で破砕したものから調製できる。
【００１９】
第２の微生物から放出される制御物質が、第１の微生物の有機塩素化合物分解能の活性化物質として働く場合には、次の二つの作用機序が例示される。
【００２０】
一つは、活性化物質が第１の微生物の生育、増殖、分解活性等を阻害する代謝産物の作用を抑制することにより、第１の微生物の分解活性を増強するというものである。こうした代謝産物を活性化物質により化学的に変化させることで阻害作用を抑制し、有機塩素化合物分解活性を向上させることができる。
【００２１】
二つ目は、活性化物質自身が第１の微生物の生育、増殖、分解活性等を促進することによって第１の微生物の分解活性を増強するというものである。活性化物質を体外へ放出することにより、有機塩素化合物分解能を有する微生物（第１の微生物）の分解能を活性化するものと考えられる。
【００２２】
活性化物質としては、何らかの糖（グルコース、サッカロース、トレハロース、キシロース、マンノース等）、有機酸（酢酸、リンゴ酸、マロン酸等）、アミノ酸（アラニン、グルタミン、ヒスチジン等）等の炭素源、または窒素源（アンモニア、硝酸塩、亜硝酸塩等）、微量元素（マグネシウム、ニッケル、マンガン等）、電子受容体（酸素、硫酸イオン、硝酸イオン、ＮＡＤＰ等）、酵素（メタンモノオキシゲナーゼ誘導酵素、プロテイナ−ゼ、アンモニア酸化酵素等）等が例示される。この場合には、第２の微生物がそれ自体の生命活動と同時に活性化物質を供給し続けるため、第１の微生物の分解活性を維持することが容易となる。
【００２３】
こうした活性化物質は単一物質とは限らず、複数の活性化物質が相乗的に分解能を向上させることも可能である。例えば、第１の微生物の生産する阻害物質であるハロ酢酸を分解する酵素と、生育を促進する糖であるＤ−フルクトースとが共に活性化物質として作用する場合もある。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の有機塩素化合物分解方法を汚染環境の浄化に適用した実施形態を示す。
【００２５】
本実施形態においては、有機塩素化合物に汚染された環境中に有機塩素化合物分解能を有する第１の微生物と前記第１の該微生物の分解能活性化能を有する第２の微生物あるいはその抽出物を共に添加する。ここで、汚染環境としては、有機塩素化合物に汚染された環境であれば特に限定されるものではなく、例えば汚染土壌、汚染地下水、汚染河川水、汚染湖沼水等が挙げられる。汚染対象となる有機塩素化合物についてもＴＣＥ、ｃｉｓ−ＤＣＥ、ｔｒａｎｓ−ＤＣＥ、１、１−ＤＣＥ、ＰＣＢ等、特に限定されるものではない。
【００２６】
有機塩素化合物分解能を有する微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、アクチノミセス属、アミコラータ属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、クラビバクター属、ゴルドナ属、ミクロコッカス属、ミコバクテリウム属、ノカルディア属、ピメロバクター属、レニバクテリウム属、ロドコッカス属、ツカムレラ属、コリネバクテリウム属、メチロシスティス属、シュードモナス属、ブルクホルデリア属、コマガテラ属、ジャニバクター属等の細菌が挙げられる。
【００２７】
また、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解能を制御する微生物としては、これも特に限定されるものではないが、有機塩素化合物分解能を有する微生物の生育・増殖あるいは分解活性を制御する物質、例えば、糖、有機酸、アミノ酸、タンパク質等を生産することにより分解能を制御する微生物として、アシネトバクター属、フラボバクテリウム属、メチロバクテリウム属、メチロモナス属、パラコッカス属、シュードモナス属、バシラス属、アルスロバクター属、セルロモナス属等が挙げられる。
【００２８】
また、アルカリを生成してｐＨ環境を変化させることにより有機塩素化合物分解能を有する微生物の生理的活動を制御する微生物としてアルカリゲネス属等が挙げられる。
【００２９】
さらに、酸を生成してｐＨ環境を変化させることにより有機塩素化合物分解能を有する微生物の生理的活動を制御する微生物としてアセトバクター属、アグロバクテリウム属、エリスロバクタ−属、フラボバクテリウム属等が挙げられる。
【００３０】
アンモニウムイオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン等を消費あるいは放出して、有機塩素化合物分解能を有する微生物の環境を変化させることにより分解能を制御する微生物としてアシネトバクタ−属、メチロバシラス属、フエニロバクテリウム属等が挙げられる。
【００３１】
大気中の窒素を固定化することで、有機塩素化合物分解能を有する微生物の生理活動における窒素源を供給することにより分解能を制御する微生物としては、アグロモナス属、アゾトバクター属等が挙げらる。
【００３２】
物理的環境の制御の場合には、粘液の分泌や糸状体の形成によって、様々の微生物、土壌、無機的粒子、有機的粒子と共に集合体を形成し、有機塩素化合物分解能を有する微生物を空間的に最適な状態に維持することにより分解能を制御する微生物として、ズーグレア属、ノカルディア属、ロドコッカス属等が挙げられる。
【００３３】
発明者らは上記有機塩素化合物分解能を有する微生物（第１の微生物）と第１の微生物の有機塩素化合物分解能を制御する微生物（第２の微生物）とのいくつかの組合わせ試験を行なった。
【００３４】
その結果、第１の微生物の分解活性を増強させるのは、表１に○、◎で示した組み合わせであることが分かった。さらに、◎の組み合わせでは、第１の微生物単独の場合の２倍以上の時間、分解能を維持することができた。
【００３５】
これらの微生物は、用途によっては単一の組み合わせでもよいが、特に限定されるものではなく、種々の組み合わせで用いることができる。表１に記載した以外の組合わせでも良い。また、３種類以上の微生物を組合わせて使用することもできる。
【００３６】
【表１】

次に、本発明の新規微生物、アシネトバクタ−ｓｐ．ＥＮＡ１ＦＥＲＭＢＰ−６２９５菌株について詳述する。
【００３７】
本菌株の菌学的性質は、以下に示す通りである。
【００３８】

以上の菌学的性質から、「バージェイズマニュエルオブシステマティックバクテリオロジーボリューム２、１９８６（Ｂｅｒｇｅｙｓ´ ＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２、１９８６）」にしたがって検索を行なったところ、アシネトバクターのー種であると考えられた。しかし、炭素源の資化性が既存の種とは異なることから本菌株を新種と認定し、アシネトバクタ− スピ−シズＥＮＡ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＥＮＡ１）と命名し、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６２９５）。以下本菌株をＥＮＡ１株と記す。
【００３９】
ＥＮＡ１株の生育可能な温度範囲は５〜４０℃であり、増殖に好ましい温度範囲は１５〜３７℃、さらに好ましくは２０〜３５℃である。ＥＮＡ１株は、生育可能な温度範囲内であれば、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解能を活性化することができるが、特に活性化に好ましい温度は１０〜３５℃である。
【００４０】
ＥＮＡ１株の生育および活性化能発現が可能なｐＨは、５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、さらに好ましくは６．５〜７．５である。
【００４１】
培地としては、−般細菌用のＬＢ培地、ＮＢ培地等、および各種無機塩培地で成育可能である。
【００４２】
ＥＮＡ１株あるいはその抽出物を、有機塩素化合物分解能を有する種々の微生物と共に用いることにより、その分解能を活性化することができる。また、ＥＮＡ１株自体を使用した場合には、長期に渡ってその活性化能を維持することが可能である。したがって、有機塩素化合物に汚染された環境を微生物により分解・浄化処理等する際にも、有効かつ幅広く利用することができ、実用性に非常に優れるものである。
【００４３】
また、ＥＮＡ１株は、ＹＭＣＴ−００１株の有機塩素化合物分解活性を顕著に向上させることができる。この場合には、ＥＮＡ１株の生産するＬ−ピログルタミン酸、Ｌ−リンゴ酸、コハク酸やその他の有機酸、有機物等が、活性化物質の一つとしてＹＭＣＴ−００１株の増殖を促進させていることが考えられる。
【００４４】
したがって、ＥＮＡ１株あるいはその抽出物をＹＭＣＴ−００１株と共にバイオリアクタ化し、菌数を調整することによって、より高濃度の有機塩素化合物を効率良く分解することができる。
【００４５】
なお、ＥＮＡ１株を自然に、もしくは人工的手段によって変異させて得られる変異株であっても、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解能を制御できる限り、すべて本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
【実施例】
次に、本発明の具体的な実施例について説明する。
【００４７】
実施例１
前述した有機塩素化合物分解能を有するＹＭＣＴ−００１株と当該分解能を活性化するＥＮＡ１株を用いて、各種の有機塩素化合物の分解試験を行った。
【００４８】
まず、バイアルビンに表２に示した組成の無機塩培地２５ｍＬを入れ、ＹＭＣＴ−００１株を１０^８ＣＦＵ／ｍＬとなるように懸濁し、さらにＥＮＡ１株を１０^６ＣＦＵ／ｍＬになるように懸濁した。これを複数用意した。別々のバイアルビンに、ＴＣＥ、ｃｉｓ−ＤＣＥ、ｔｒａｎｓ−ＤＣＥをそれぞれ１０ｐｐｍとなるように加えた。これらを２５℃、１００ｒｐｍで振盪培養し、各有機塩素化合物濃度の経時変化をガスクロマトグラフィを用いて測定した。結果を図１に示す。
【００４９】
図１から明らかなように、いずれの有機塩素化合物も８時間以内で検出されなくなった。なお、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、塩化ビニル、テトラクロロエチレン、ジクロロベンゼン、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）類に対しても同様の分解試験を行なったところ、表３に示すような分解活性が認められた。
【００５０】
【表２】

【表３】

比較例１
ＹＭＣＴ−００１株のみを用いて、実施例１と同様の試験条件で有機塩素化合物分解試験を実施した。結果を図２に示す。
【００５１】
図２から明らかなように、いずれの有機塩素化合物も２４時間以内で検出されなくなった。しかし、実施例１の結果と比較すると、いずれも２倍以上の分解時間を要した。
【００５２】
以上の結果より、ＥＮＡ１株をＹＭＣＴ−００１株と共に有機塩素化合物に添加すれば、有機塩素化合物分解活性が向上することが解った。
【００５３】
実施例２
ＥＮＡ１株が、ＹＭＣＴ−００１株の分解活性の維持に及ぼす影響を調べた。まず、実施例１と同様に、無機塩培地２５ｍＬにＹＭＣＴ−００１株とＥＮＡ１株を懸濁したバイアルビンを複数用意した。各バイアルビンに、ＴＣＥを１０ｐｐｍの濃度になるように加えた。これらを２５℃、１００ｒｐｍで振盪培養し、２４時間ごとにＴＣＥを１０ｐｐｍずつ再添加し、ＴＣＥ濃度の経時変化をガスクロマトグラフィを用いて測定した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、再添加１０回目においても完全な分解活性が維持されていた。
【００５４】
比較例２
ＹＭＣＴ−００１株のみを用いて、実施例２と同様の試験条件においてＴＣＥ分解試験を実施した。ただし、６回目の再添加後はＴＣＥの濃度が１ｐｐｍ以下とならなかったため、再添加は行なわずにＴＣＥ濃度測定のみを行った。
【００５５】
結果を図４に示す。図４から明らかなように、再添加４回まではＴＣＥ濃度が検出下限以下まで低下しているが、５回目の添加の２４時間後には約１ｐｐｍ濃度のＴＣＥが残存し、分解活性の低下がみられた。さらに、６回目の添加後４日を過ぎてもＴＣＥ濃度は１ｐｐｍ以下にならず、分解活性の消失が認められた。
【００５６】
以上の結果より、本発明に係るＥＮＡ１株を有機塩素化合物分解活性を有する微生物ＹＭＣＴ−００１株と共に有機塩素化合物に適用することで、ＹＭＣＴ−００１株の分解活性が維持されることが明らかとなった。
【００５７】
実施例３
ＥＮＡ１株の抽出物とＹＭＣＴ−００１株とをバイオリアクタに適用し、トリクロロエチレン分解試験を行った。
【００５８】
バイオリアクタの運転条件は半バッチ方式で、処理水５００ｍＬ、処理時間８時間、入れ換え処理水量３００ｍＬ、温度２５℃、撹拌羽による撹拌方式とした。
【００５９】
ＹＭＣＴ−００１株はキトサン担体（富士紡績製；キトパ−ルＨＰ２５２０）に担持させて使用した。ＬＢ培地５００ｍＬにキトパ−ル１５０ｍＬ容量を投入し、ＹＭＣＴ−００１株を２５℃で３日間振盪培養した。菌担持担体を無機塩培地で洗った後、バイオリアクタへ投入した。
【００６０】
ＥＮＡ１株は２００ｍＬのＬＢ培地で３日間振盪培養した後、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた菌体０．２ｇを無機塩培地５ｍＬに再懸濁してホモジナイザ−を用いて破砕した。このＥＮＡ１株抽出液５ｍＬを処理水３００ｍＬに予め添加し、バイオリアクタで分解処理を行った。なお、処理水はトリクロロエチレン１０ｐｐｍ濃度の水溶液とした。
【００６１】
処理開始後、４時間ごとにバイオリアクタ内からサンプリングを行い、ピア−スバイアル３本に各１ｍＬずつ入れ、ガスクロマトグラフィを用いて、バイアル内のヘッドスペ−スガスのトリクロロエチレン濃度の測定を行った。その結果を図５に示す。
【００６２】
図５から明らかなように、処理回数６回でもトリクロロエチレンは４時間以内に検出されなくなり、ＹＭＣＴ−００１株の分解活性が維持されていることがわかった。
【００６３】
比較例３
ＹＭＣＴ−００１株のみを用いて、実施例３と同様の条件でトリクロロエチレン分解試験を実施した。その結果を図６に示す。
【００６４】
図６から明らかなように、処理回数２回目までは完全な分解活性がみられたが、３、４回目では、４時間後のサンプリング時にトリクロロエチレンの残存が確認され、６回目では分解活性がほとんど認められなかった。
【００６５】
以上の結果より、バイオリアクタを用いた場合にも、ＥＮＡ１株抽出液によって、ＹＭＣＴ−００１株の分解活性が維持されることが明かになった。
【００６６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の有機塩素化合物分解方法によれば、二次的汚染を引き起こすことなく、有機塩素化合物分解能を有する微生物の分解活性を簡便に向上させることができ、またその分解活性を長期に渡って維持できるため、汚染環境の浄化等にも非常に利用価値の高いものである。
【００６７】
また、本発明に係る新規微生物であるアシネトバクタ−ｓｐ．（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＥＮＡ１ＦＥＲＭＢＰ−６２９５菌株は、有機塩素化合物分解能を有する微生物の有機塩素化合物分解能を制御することができるため、有機塩素化合物分解能を有する微生物と共に汚染環境中に適用することにより、その分解能を向上・維持させることができ非常に利用価値の高いものである。特にコマガテラブレビス（Ｋｏｍａｇａｔｅｌｌａｂｒｅｖｉｓ）ＹＭＣＴ−００１株の分解活性を顕著に向上させることができるため、ＹＭＣＴ−００１株と共にバイオリアクタ化することで、さらに高濃度の有機塩素化合物を効率良く分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における各種有機塩素化合物分解試験の結果を示すグラフである。
【図２】比較例１における各種有機塩素化合物分解試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例２におけるトリクロロエチレン分解活性維持試験の結果を示すグラフである。
【図４】比較例２におけるトリクロロエチレン分解活性維持試験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例３におけるバイオリアクタを使用したトリクロロエチレン分解活性維持試験の結果を示すグラフである。
【図６】比較例３におけるバイオリアクタを使用したトリクロロエチレン分解活性維持試験の結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for decomposing an organic chlorine compound by a microorganism and a novel microorganism for controlling the organic chlorine compound resolution of a microorganism having an organic chlorine compound resolution.
[0002]
[Prior art]
In recent years, leakage of organic chlorine compounds such as trichlorethylene (TCE) and dichloroethylene (DCE), which have been used as cleaning agents in various factories, to the environment has been regarded as a major problem. Although the use of such organochlorine compounds has been regulated, the problems of environments contaminated with organochlorine compounds such as contaminated soil and contaminated groundwater still remain to date.
[0003]
Therefore, it has been studied to purify the environment such as soil and groundwater contaminated with organochlorine compounds. For example, it has also been proposed to purify the polluted environment by physical methods such as vacuum bleed or combustion, but as a lower cost and less environmental burden method, microorganisms are used to decompose organochlorine compounds in the polluted environment. The method to do is attracting attention. In addition, as a direct treatment technology for organochlorine compounds, adsorption methods using activated carbon and decomposition methods using heat and light are also known. Similarly, biodegradation methods using microorganisms from the viewpoint of cost and operability. Is attracting attention.
[0004]
For example, as the biodegradation method of organochlorine compounds using the above-mentioned microorganisms, a method using a methane-utilizing bacterium (see JP-A-2-92274), aroma such as phenol, toluene and cresol A method using a bacterium that requires induction by a group compound (see JP-A-6-296711) has been proposed.
[0005]
However, since the conventional biodegradation methods for organochlorine compounds described above all require additives and inducers, it is difficult to maintain and improve degradation activity, treatment efficiency, and the like. Furthermore, when applied to the purification of polluted environments, new substances including additives and inducers are added to the environment, which may cause another pollution (secondary pollution). It has a problem that it does not clean the environment. In particular, the latter method uses a fungus that needs to be induced by an aromatic compound such as phenol, toluene, or cresol that is harmful to the environment, and thus has a high risk of causing new environmental pollution.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in the conventional biodegradation method of organochlorine compounds using microorganisms, it is necessary to add an assimilating substance or an inducing substance in order to develop the degradation activity of microorganisms. Accordingly, when an inducer harmful to the environment is required, there is a great risk of causing secondary contamination, and it is not satisfactory as a purification method for an environment contaminated with an organic chlorine compound. Further, since it is necessary to add an assimilating substance or an inducing substance, there is a problem that it is difficult to maintain high decomposition activity.
[0007]
From the above, it is possible to increase the treatment efficiency by maintaining the degradation activity of microorganisms having the ability to decompose organochlorine compounds and further improving the degradation activity, without adding inducers harmful to the environment, etc. There is a strong demand for a method for decomposing organochlorine compounds by microorganisms.
[0008]
The present invention has been made to cope with such problems, and it is possible to control the resolution of microorganisms having organochlorine compound resolution without adding an inducer or the like harmful to the environment. It is an object of the present invention to provide a method for decomposing organochlorine compounds, and a novel microorganism that controls the resolution of microorganisms having organochlorine compound resolution.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As described in claim 1, the organochlorine compound decomposition method according to the present invention includes a first microorganism having an organochlorine compound resolution and a second microorganism that controls the organochlorine compound resolution of the first microorganism, or the A method for decomposing an organochlorine compound by contacting an extract of a second microorganism with an organochlorine compound , wherein the second microorganism is Acinetobacter sp. Belonging to the genus Acinetobacter. (Acinetobacter sp. ) ENA1 FERM It contains BP-6295 strain .
[0010]
As a control mechanism of the second microorganism, the second microorganism or the extract of the second microorganism is directly or indirectly directly related to the growth, proliferation, and degradation activities of the first microorganism, physically, chemically, and biologically. The resolution can be controlled by acting scientifically.
[0011]
For example, in order to suppress or eliminate a factor that the second microorganism or the extract of the second microorganism inhibits the growth, proliferation, degradation activity, etc. of the first microorganism, the growth, proliferation, degradation of the first microorganism It can be controlled to maintain and enhance activity and the like. In addition, the second microorganism or the extract of the second microorganism can be controlled to directly or indirectly improve the growth, proliferation, and degradation activities of the first microorganism.
[0012]
Thereby, the resolution | decomposability of a 1st microorganisms can be controlled, without adding an inducer etc. which are harmful to the environment. Therefore, when the control by the second microorganism or its extract acts as activation of the organochlorine compound resolution of the first microorganism, the decomposition activity of the first microorganism is maintained and improved, thereby decomposing the organochlorine compound. The efficiency can be increased, and it is very useful for purification of polluted environments.
[0013]
The second microorganism having the control ability is not necessarily one kind, and two or more kinds of microorganisms can be used in combination depending on the kind of the organic chlorine compound to be decomposed.
[0014]
Further, as described in claim 2, the novel microorganism according to the present invention is an Acinetobacter sp. Belonging to the genus Acinetobacter that controls the organochlorine compound decomposing ability of a microorganism having an organochlorine compound decomposing ability. ( Acinetobacter sp.) ENA1 FERM BP-6295 strain. This strain and its extract control the resolution of various microorganisms having organochlorine compound resolution. Among these strains, Komagataella brevis YMCT-001 FERM BP-5282 strain described in Japanese Patent Application No. 8-309719 (in particular ) (Hereinafter referred to as YMCT-001 strain) can be significantly improved.
[0015]
As described above, the organochlorine compound decomposition method according to the present invention uses the first microorganism having organochlorine compound decomposing ability, the second microorganism that controls the decomposing ability of the microorganism, or the extract from the second microorganism. At the same time, it is basically brought into contact with organochlorine compounds for decomposition.
[0016]
As a method for controlling the organochlorine compound resolution of the first microorganism by the second microorganism, for example, there is a method based on the physical relationship between the first microorganism and the second microorganism. When the second microorganism surrounds the first microorganism, the action of the substance that inhibits the growth of the first microorganism is reduced, or physical suitable for the survival of the first microorganism by the second microorganism, This is the case when a spatial environment is formed. The presence of the second microorganism maintains and enhances the growth and proliferation of the first microorganism. As a result, the organochlorine compound resolution of the first microorganism is enhanced, so that the second microorganism is present while the second microorganism is present. Activity is maintained.
[0017]
As another control method, for example, there is a method using a control substance that the second microorganism releases to the outside of the cell. In this method, the first microorganism and the second microorganism do not necessarily have to exist at the same point, and the resolution of the first microorganism can be controlled within the range covered by the control substance released by the second microorganism. . In addition, when the second microorganism itself is added to the contaminated environment together with the first microorganism, the production of the control substance can be continued even in the contaminated environment by the growth and proliferation of the second microorganism. The control action is maintained for a long time. Therefore, for example, when the control substance activates the resolution of the first microorganism, the resolution of the first microorganism can be activated over a long period of time.
[0018]
Moreover, even in an environment unsuitable for the growth of the second microorganism, it is expected that the resolution of the first microorganism can be controlled by applying the extract. Such an extract can be prepared from, for example, a metabolite or extracorporeal enzyme released by the second microorganism into the culture solution, or a product obtained by disrupting the microbial cell with a lytic enzyme (such as lysozyme) or a homogenizer.
[0019]
In the case where the control substance released from the second microorganism acts as an activator of organochlorine compound resolution of the first microorganism, the following two mechanisms of action are exemplified.
[0020]
One is that the activating substance enhances the degradation activity of the first microorganism by suppressing the action of metabolites that inhibit the growth, proliferation, degradation activity and the like of the first microorganism. By chemically changing these metabolites with an activating substance, the inhibitory action can be suppressed and the activity of decomposing organochlorine compounds can be improved.
[0021]
The second is that the activating substance itself enhances the degradation activity of the first microorganism by promoting the growth, proliferation, degradation activity and the like of the first microorganism. By releasing the activating substance out of the body, it is considered that the resolution of the microorganism (first microorganism) having the organochlorine compound resolution is activated.
[0022]
Activating substances include carbon sources such as some sugar (glucose, saccharose, trehalose, xylose, mannose, etc.), organic acids (acetic acid, malic acid, malonic acid, etc.), amino acids (alanine, glutamine, histidine, etc.), or nitrogen Sources (ammonia, nitrate, nitrite, etc.), trace elements (magnesium, nickel, manganese, etc.), electron acceptors (oxygen, sulfate ion, nitrate ion, NADP, etc.), enzymes (methane monooxygenase-inducing enzyme, proteinase, Examples thereof include ammonia oxidase and the like. In this case, since the second microorganism continues to supply the activating substance simultaneously with its own life activity, it becomes easy to maintain the degradation activity of the first microorganism.
[0023]
Such an activating substance is not limited to a single substance, and a plurality of activating substances can synergistically improve resolution. For example, an enzyme that degrades haloacetic acid, which is an inhibitory substance produced by the first microorganism, and D-fructose, which is a sugar that promotes growth, may both act as activators.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, an embodiment in which the organic chlorine compound decomposition method of the present invention is applied to purification of a contaminated environment will be described.
[0025]
In the present embodiment, both the first microorganism having the ability to decompose organochlorine and the second microorganism having the ability to activate the first microorganism or the extract thereof in an environment contaminated with the organochlorine compound are combined. Added. Here, the contaminated environment is not particularly limited as long as it is an environment contaminated with an organic chlorine compound, and examples thereof include contaminated soil, contaminated ground water, contaminated river water, and contaminated lake water. The organochlorine compounds to be contaminated are not particularly limited, such as TCE, cis-DCE, trans-DCE, 1, 1-DCE, and PCB.
[0026]
The microorganism having organochlorine compound resolution is not particularly limited, for example, Actinomyces genus, Amycolata genus, Arthrobacter genus, Brevibacterium genus, Krabibacter genus, Gordona genus, Micrococcus genus, Mycobacterium genus Bacteria, Nocardia, Pimelobacter, Renibacterium, Rhodococcus, Tucumrela, Corynebacterium, Methylocystis, Pseudomonas, Burkholderia, Komagatella, Janibacter, etc. .
[0027]
In addition, the microorganism that controls the resolution of a microorganism having an organochlorine compound resolution is not particularly limited, but a substance that controls the growth / proliferation or decomposition activity of a microorganism having an organochlorine compound resolution, for example, Microorganisms that control resolution by producing sugars, organic acids, amino acids, proteins, etc., include Acinetobacter, Flavobacterium, Methylobacteria, Methylomonas, Paracoccus, Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter Genus, Cellulomonas genus and the like.
[0028]
Examples of microorganisms that control the physiological activity of microorganisms capable of decomposing organochlorine compounds by generating alkali and changing the pH environment include the genus Alkagenes.
[0029]
Furthermore, Acetobacter genus, Agrobacterium genus, Erysrobacter genus, Flavobacterium genus, etc. are mentioned as microorganisms that control the physiological activity of microorganisms having organochlorine compound resolution by generating acid and changing pH environment. It is done.
[0030]
Acinetobacter genus, Methylobacillus genus, Phenylobacterium genus, etc. as microorganisms that control the degradation by consuming or releasing ammonium ions, nitrate ions, nitrite ions, etc., and changing the environment of microorganisms having organochlorine compound resolution Is mentioned.
[0031]
Examples of microorganisms that control the resolution by immobilizing nitrogen in the atmosphere to supply a nitrogen source in the physiological activity of microorganisms having the ability to decompose organochlorine compounds include the genera Agromonas and Azotobacter.
[0032]
In the case of control of the physical environment, the formation of aggregates with various microorganisms, soil, inorganic particles, and organic particles by the secretion of mucus and the formation of filaments, and the microorganisms having the ability to decompose organochlorine compounds are spatially Examples of microorganisms whose resolution is controlled by maintaining them in an optimal state include the genus Zoglea, the genus Nocardia, and the genus Rhodococcus.
[0033]
The inventors conducted several combination tests of the microorganism having the organochlorine compound resolution (first microorganism) and the microorganism controlling the organochlorine compound resolution of the first microorganism (second microorganism).
[0034]
As a result, it was found that the combination indicated by ○ and ◎ in Table 1 enhances the degradation activity of the first microorganism. Furthermore, with the combination of ◎, the resolution could be maintained for more than twice as long as the case of the first microorganism alone.
[0035]
These microorganisms may be a single combination depending on the application, but are not particularly limited, and can be used in various combinations. Combinations other than those listed in Table 1 may be used. Also, three or more kinds of microorganisms can be used in combination.
[0036]
[Table 1]

Next, the novel microorganism of the present invention, Acinetobacter sp. The ENA1 FERM BP-6295 strain will be described in detail.
[0037]
The mycological properties of this strain are as follows.
[0038]

Based on the above bacteriological properties, a search was conducted according to “Burjays Manuel of Systematic Bacteriology Volume 2, 1986” (Bergeys' Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2, 1986), and it is considered to be a species of Acinetobacter. It was. However, since the assimilability of the carbon source is different from the existing species, this strain was recognized as a new species and named Acinetobacter spices ENA1 strain ( Acinetobacter sp. ENA1). Deposited at the laboratory (accession number: FERM BP-6295). Hereinafter, this strain is referred to as ENA1 strain.
[0039]
The temperature range in which ENA1 can grow is 5 to 40 ° C., and the preferred temperature range for growth is 15 to 37 ° C., more preferably 20 to 35 ° C. The ENA1 strain can activate the resolving power of microorganisms having the ability to decompose organochlorine compounds as long as it is within the viable temperature range, but the preferred temperature for the activation is 10 to 35 ° C.
[0040]
The pH at which the ENA1 strain can grow and express its activating ability is 5.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0, and more preferably 6.5 to 7.5.
[0041]
As the medium, it can grow on LB medium for general bacteria, NB medium, and various inorganic salt media.
[0042]
By using ENA1 strain or an extract thereof together with various microorganisms having an organochlorine compound resolution, the resolution can be activated. In addition, when the ENA1 strain itself is used, its activation ability can be maintained for a long period of time. Therefore, when the environment contaminated with the organic chlorine compound is decomposed and purified by microorganisms, it can be used effectively and widely, and is extremely practical.
[0043]
Moreover, ENA1 strain can remarkably improve the organochlorine compound decomposition activity of YMCT-001 strain. In this case, L-pyroglutamic acid, L-malic acid, succinic acid, other organic acids, organic substances and the like produced by ENA1 strain promote the growth of YMCT-001 strain as one of the activation substances. It is possible.
[0044]
Therefore, the ENA1 strain or an extract thereof is converted into a bioreactor together with the YMCT-001 strain and the number of bacteria is adjusted, whereby a higher concentration of organochlorine compound can be efficiently decomposed.
[0045]
In addition, even if it is a mutant strain obtained by mutating ENA1 strain naturally or by an artificial means, all are included in the scope of the present invention as long as the resolution of the microorganism having the organochlorine compound resolution can be controlled.
[0046]
【Example】
Next, specific examples of the present invention will be described.
[0047]
Example 1
Using the YMCT-001 strain having the above-mentioned organochlorine compound decomposing ability and the ENA1 strain that activates the decomposing ability, various organochlorine compound decomposition tests were conducted.
[0048]
First, 25 mL of an inorganic salt medium having the composition shown in Table 2 is placed in a vial, and the YMCT-001 strain is suspended at 10 ⁸ CFU / mL, and the ENA1 strain is suspended at 10 ⁶ CFU / mL. It became cloudy. Several of these were prepared. TCE, cis-DCE, and trans-DCE were added to separate vials to 10 ppm each. These were cultured with shaking at 25 ° C. and 100 rpm, and the change with time in the concentration of each organochlorine compound was measured using gas chromatography. The results are shown in FIG.
[0049]
As is apparent from FIG. 1, no organochlorine compound was detected within 8 hours. When a similar decomposition test was performed on carbon tetrachloride, dichloroethane, trichloroethane, tetrachloroethane, vinyl chloride, tetrachloroethylene, dichlorobenzene, and polychlorinated biphenyls (PCB), the decomposition activity shown in Table 3 was obtained. Admitted.
[0050]
[Table 2]

[Table 3]

Comparative Example 1
An organochlorine compound decomposition test was conducted under the same test conditions as in Example 1 using only the YMCT-001 strain. The results are shown in FIG.
[0051]
As is apparent from FIG. 2, no organochlorine compound was detected within 24 hours. However, as compared with the result of Example 1, all of them required twice or more decomposition time.
[0052]
From the above results, it was found that when the ENA1 strain was added to the organochlorine compound together with the YMCT-001 strain, the organochlorine compound decomposition activity was improved.
[0053]
Example 2
The effect of the ENA1 strain on the maintenance of the degradation activity of the YMCT-001 strain was examined. First, as in Example 1, a plurality of vials were prepared by suspending the YMCT-001 strain and ENA1 strain in 25 mL of an inorganic salt medium. To each vial, TCE was added to a concentration of 10 ppm. These were cultured with shaking at 25 ° C. and 100 rpm, 10 ppm of TCE was added again every 24 hours, and the change in TCE concentration with time was measured using gas chromatography. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 3, complete degradation activity was maintained even after the 10th re-addition.
[0054]
Comparative Example 2
A TCE degradation test was carried out under the same test conditions as in Example 2 using only the YMCT-001 strain. However, since the TCE concentration did not become 1 ppm or less after the sixth re-addition, only the TCE concentration was measured without re-addition.
[0055]
The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 4, the TCE concentration decreased to the detection limit or less until the 4th re-addition, but about 1 ppm concentration of TCE remained 24 hours after the 5th addition, and the degradation activity decreased. It was seen. Furthermore, even after 4 days after the sixth addition, the TCE concentration did not fall below 1 ppm, and the disappearance of the degradation activity was observed.
[0056]
From the above results, it is clear that the degradation activity of the YMCT-001 strain is maintained by applying the ENA1 strain according to the present invention to the organochlorine compound together with the microorganism YMCT-001 strain having the organochlorine degradation activity. It was.
[0057]
Example 3
The extract of ENA1 strain and YMCT-001 strain were applied to a bioreactor, and a trichlorethylene degradation test was performed.
[0058]
The operating conditions of the bioreactor were a semi-batch method, in which 500 mL of treated water, a treatment time of 8 hours, a replacement treated water amount of 300 mL, a temperature of 25 ° C., and a stirring method using stirring blades were used.
[0059]
The YMCT-001 strain was used by being supported on a chitosan carrier (Fuji Boseki; Chitopar HP2520). A 500 mL volume of chitopar was added to 500 mL of LB medium, and the YMCT-001 strain was cultured with shaking at 25 ° C. for 3 days. The bacterium-supporting carrier was washed with an inorganic salt medium and then charged into the bioreactor.
[0060]
The ENA1 strain was shake-cultured in 200 mL of LB medium for 3 days and then centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes. 0.2 g of the obtained microbial cells were resuspended in 5 mL of an inorganic salt medium and crushed using a homogenizer. 5 mL of this ENA1 strain extract was added in advance to 300 mL of treated water, and the bioreactor was decomposed. The treated water was an aqueous solution having a concentration of 10 ppm of trichlorethylene.
[0061]
Sampling was performed from within the bioreactor every 4 hours after the start of the treatment, 1 mL each was placed in three pierce vials, and the trichlorethylene concentration of the head space gas in the vials was measured using gas chromatography. The result is shown in FIG.
[0062]
As is apparent from FIG. 5, trichlorethylene was not detected within 4 hours even when the number of treatments was 6, and it was found that the degradation activity of the YMCT-001 strain was maintained.
[0063]
Comparative Example 3
A trichlorethylene decomposition test was carried out under the same conditions as in Example 3 using only the YMCT-001 strain. The result is shown in FIG.
[0064]
As is clear from FIG. 6, complete degradation activity was observed up to the second treatment, but in the third and fourth treatments, trichlorethylene remained at the time of sampling after 4 hours, and almost no degradation activity was observed at the sixth time. I was not able to admit.
[0065]
From the above results, it was revealed that the degradation activity of the YMCT-001 strain was maintained by the ENA1 strain extract even when the bioreactor was used.
[0066]
【The invention's effect】
As described above, according to the organochlorine compound decomposition method of the present invention, it is possible to easily improve the degradation activity of microorganisms having organochlorine compound resolution without causing secondary contamination, and the degradation activity thereof. Can be maintained over a long period of time, so it is extremely valuable for purification of polluted environments.
[0067]
Moreover, Acinetobacter-sp., Which is a novel microorganism according to the present invention. Since ( Acinetobacter sp.) ENA1 FERM BP-6295 strain can control the organochlorine compound resolution of microorganisms having organochlorine compound resolution, by applying it in a contaminated environment together with microorganisms having organochlorine compound resolution, The resolution can be improved and maintained, which is very useful. In particular, the degradation activity of Komagataella brevis ( Komagataella brevis ) YMCT-001 strain can be significantly improved, so that bioreactor together with YMCT-001 strain can efficiently decompose higher concentrations of organochlorine compounds. it can.
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the results of various organochlorine compound decomposition tests in Example 1. FIG.
2 is a graph showing the results of various organochlorine compound decomposition tests in Comparative Example 1. FIG.
3 is a graph showing the results of a trichlorethylene decomposition activity maintenance test in Example 2. FIG.
4 is a graph showing the results of a trichlorethylene decomposition activity maintenance test in Comparative Example 2. FIG.
5 is a graph showing the results of a trichlorethylene decomposition activity maintenance test using the bioreactor in Example 3. FIG.
6 is a graph showing the results of a trichlorethylene decomposition activity maintenance test using the bioreactor in Comparative Example 3. FIG.

Claims

First microorganism and the first second microorganism or said second and extracts of microorganisms into contact with an organic chlorine compound decomposing organic chlorinated to control the organic chlorine compounds resolution of microorganism having an organic chlorine compounds resolution A compound decomposition method comprising:
The second microorganism is Acinetobacter sp. Belonging to the genus Acinetobacter. (Acinetobacter sp. ) ENA1 FERM A method for decomposing organochlorine compounds , comprising BP-6295 strain .

Acinetobacter sp. Sp. Belonging to the genus Acinetobacter by controlling the organochlorine compound resolving power of microorganisms having organochlorine compound resolving power. (Acinetobacter sp. ) ENA1 FERM BP-6295 strain.