KR20040098213A - Pseudomonas sp. capable of dissolving oil and method of treating oil material which involves pollution using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유류(油類) 분해능을 갖는 슈도모나스 속 미생물 및 상기 미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 디젤유 등과 같은 유류 오염 물질에 대하여 분해능이 우수한 미생물 슈도모나스 제네코-1(GENECO-1) 및 이러한 미생물을 이용하여, 고농도의 유류 오염 물질을 처리하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a Pseudomonas genus microorganism having an oil resolution and a method for treating oil pollutants using the microorganism, and more specifically, microorganism Pseudomonas geneco having excellent resolution against oil pollutants such as diesel oil. 1 (GENECO-1) and a method for treating high concentrations of oil contaminants using such microorganisms.
전 세계적으로 유류는 중요한 에너지 자원으로서 널리 사용되고 있으며, 그 사용량 및 사용 범위는 계속적으로 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 이러한 증가 추세와 더불어 유류 유출 빈도 및 유류 유출로 인한 오염도 또한 급증하고 있는 실정이다. 예를 들면, 석유 화학 물질의 이송 파이프 또는 주유소의 지하 저장 탱크의 관리 미흡 및 각종 사고로 인한 유류 유출, 고의적인 유류 유출 등은 전지구적으로 엄청난 규모의 환경 오염을 야기시키고 있다.Oil is widely used as an important energy source around the world, and its use and range of use are steadily increasing. However, in addition to this increasing trend, the frequency of oil spills and pollution due to oil spills are also rapidly increasing. For example, poor management of transfer pipes of petrochemicals or underground storage tanks at gas stations, oil spills caused by various accidents, and deliberate oil spills cause global environmental pollution.
그 중 토양 오염은 대기 오염이나 수질 오염에 비하여 오염 물질의 확산 속도가 낮은 반면, 피해 정도가 광범위하고 피해 양상이 지속적으로 나타난다는 특징이 있어, 일단 오염된 토양을 복원하기 위하여 시간 및 비용이 많이 필요하며 정화기술 면에서도 대기 및 수질 오염과는 상이한 방식으로 접근하여야 한다.Among these, soil pollution is characterized by a lower spread rate of pollutants than air pollution or water pollution, but a wide range of damages and a continuous appearance of damages. It is necessary to approach in a different way from air and water pollution in terms of purification techniques.
일반적인 유류 오염 토양 복원 기술은 물리적 처리 기술, 화학적 처리 기술 및 생물학적 처리 기술을 포함한다.Common oil contaminated soil restoration techniques include physical treatment techniques, chemical treatment techniques and biological treatment techniques.
이 중, 고화 처리 등과 같은 물리적 처리 기술은, 오염 물질의 이동을 통제하여 주위 환경에의 노출을 방지하여 그 위해성을 제거하는 방법으로서 오염 물질을 근본적으로 제거하는 방법이 아니라는 한계점을 갖고 있다. 한편, 토양 세척 등과 같은 화학적 처리 기술은, 화학적 촉매를 사용하여 토양 중에 흡착되어 있는 오염 물질을 토양으로부터 분리시키는 방법으로서, 오염 물질 처리에 사용된 각종 화학 물질로 인한 2차 오염이 수반된다는 한계점을 갖고 있다.Among them, the physical treatment technology such as the solidification treatment has a limitation in that it is not a method of fundamentally removing pollutants as a method of controlling the movement of pollutants to prevent exposure to the surrounding environment and removing the risks. On the other hand, chemical treatment techniques such as soil washing are a method of separating the contaminants adsorbed in the soil from the soil using chemical catalysts, and have the limitation that secondary pollution is caused by various chemicals used in the contaminant treatment. Have
이러한 한계점을 갖고 있는 물리적 처리 기술 및 화학적 처리 기술의 대체 기술로서, 미생물을 이용한 생물학적 복원 기술(bioremediation)이 현재 활발히 연구되고 있다. 유류 분해 효소를 갖고 있는 미생물은 각종 유류 등을 탄소원으로 분해하여 이를 물질 생합성의 기질로 이용하기 때문에 이를 이용하는 생물학적 복원 기술은 2차 오염을 유발시키지 않는 친환경적인 방법으로서 현재 각광받고 있으며, 이와 관련된 출원도 증가 추세에 있다.As an alternative to the physical and chemical treatment techniques having such limitations, bioremediation using microorganisms is currently being actively studied. Since microorganisms with oil-degrading enzymes decompose various oils into carbon sources and use them as substrates for material biosynthesis, biological restoration technology using them is currently in the spotlight as an environmentally friendly method that does not cause secondary pollution. There is also an increasing trend.
그러나, 이러한 생물학적 복원 기술은 물리 화학적 복원 방법에 비하여 유류 분해 속도가 느리다는 단점이 있어, 유류 분해능이 매우 우수하고 고농도의 유류 오염 물질에도 적용이 가능한 균주의 분리 및 선별은 관련 기술 분야의 핵심이다. 또한 유류 분해능이 우수한 균주를 바탕으로 한 미생물 처리제로 오염된 토양을 정화시키는 경우, 경제적이고 효율적으로 유류 오염 물질을 정화할 수 있으므로, 이러한 처리제가 상품화되어 판매되고 있으며 보다 나은 제품을 위한 개발과 연구도 계속적으로 수행되고 있다.However, this biological restoration technology has a disadvantage in that the oil degradation rate is slower than the physicochemical restoration method. Therefore, the isolation and selection of strains having excellent oil resolution and being applicable to high concentrations of oil contaminants are the core of the related art. . In addition, when the soil contaminated with microbial treatment agents based on strains with excellent oil resolution can be purified economically and efficiently, these treatment agents are commercialized and sold, and development and research for better products are possible. Is also being performed continuously.
유류 분해 미생물 등은, 한국 특허 공개 번호 제2002-0060009호 "신규한 원유분해 균주 및 그 생산방법" 및 공개 번호 제1996-014329호 "유류 분해능을 갖는 아시네토박터 속 미생물" 등에 기재되어 있다. 이 중, 한국 특허 공개 번호 제2002-0060009호에는, 상기 특허 공보에 기재되어 있는 미생물 슈도모나스 속 CU1을 이용하여 원유 1%(v/w)로 오염된 토양을 7 일간 처리한 결과 토양 내 57.17 % 의 원유를 분해하였다고 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 현재 유류 오염 물질로 인한 오염 빈도 및 오염 정도의 증가 추세에 비추어 볼 때, 유류 오염 물질을 효율적이고도 경제적으로 제거하기 위하여, 유류 오염 물질 처리 속도 및 분해능 등을 개선할 필요성은 여전히 남아 있다.Oil-degrading microorganisms and the like are described in Korean Patent Publication No. 2002-0060009, "Novel crude oil degradation strain and production method thereof", and Publication No. 1996-014329, "Acinetobacter genus microorganisms having oil resolution." Among these, Korean Patent Publication No. 2002-0060009 discloses 57.17% of soil contaminated with crude oil 1% (v / w) for 7 days using the microorganism Pseudomonas CU1 described in the patent publication. It is said to have decomposed crude oil. Nevertheless, in view of the current trend of increasing the frequency and degree of contamination caused by oil pollutants, there is still a need to improve oil pollutant processing speed and resolution in order to remove oil pollutants efficiently and economically. Remains.
따라서, 본 발명자들은 이와 같은 유류 오염 물질 제거를 위한 생물학적 복원 기술 분야의 문제점을 충분히 인식하고, 유류 오염 물질의 분해 속도 및 분해능을 혁신적으로 높일 수 있는 본 발명의 미생물을 밝혀내었다.Accordingly, the inventors have fully recognized the problems in the field of biological restoration technology for removing oil contaminants, and have discovered the microorganisms of the present invention that can revolutionarily increase the decomposition rate and resolution of oil contaminants.
본 발명의 주된 목적은 유류 분해능을 갖는 미생물 슈도모나스 제네코-1 (KCCM 10435)을 제공하는데 있다.The main object of the present invention is to provide a microorganism Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) having an oil resolution.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법을 제공하는데 있다.Still another object of the present invention is to provide a method for treating oil pollutants using the microorganism.
도 1 은 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 제네코-1(수탁 번호 : KCCM 10435)의 전자 현미경 사진이다.1 is an electron micrograph of the novel microorganism Pseudomonas sp. Geneco-1 (Accession No .: KCCM 10435) of the present invention.
도 2 는 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 이용하여 디젤유를 처리하는 경우, 배양 시간대별 상기 미생물의 유화 활성도를 상이한 디젤유 농도에 따라 나타낸 그래프이다.2 is a graph showing the emulsification activity of the microorganisms according to different diesel oil concentrations according to culture time when the diesel microorganism Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) of the present invention is treated.
도 3 은 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 이용하여 디젤유를 처리한 후, 상기 미생물 배양액 중 잔류 디젤유를 가스 크로마토그래피로 분석하여, 그 결과를 대조구인 디젤유를 분석한 결과와 함께 나타낸 그래프이다. (A) 는 미생물 배양에서 사용한 디젤유와 동일한 디젤유를 미생물없이 4 일간 교반한 후 수거하여 GC(가스 크로마토그래피) 분석한 결과이고, (B) 와 (C) 는 본 발명의 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 디젤유에 접종한 후, 각각 2, 4 일간 교반시켜 배양한 후 배양액 중의 잔류 디젤유를 수거하여 분석한 결과이다.Figure 3 is treated with diesel oil using the novel microorganism Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) of the present invention, the residual diesel oil in the microbial culture solution is analyzed by gas chromatography, and the result is diesel oil as a control. This graph shows the results of analysis. (A) shows the same diesel oil used in microbial culture after stirring for 4 days without microorganisms, collected and analyzed by GC (gas chromatography), (B) and (C) is the microorganism Pseudomonas geneco of the present invention -1 (KCCM 10435) was inoculated in diesel oil, and then stirred and cultured for 2 to 4 days, respectively, and the residual diesel oil in the culture was collected and analyzed.
도 4 는 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 이용하여 TPH가 5,000, 10,000, 15,000 mg/kg 이 되도록 디젤유로 인공 오염시킨 실제 오염된 토양을 처리한 후, 잔류 디젤유를 측정하여 시간별 디젤유 제거율을 나타낸 그래프이다.FIG. 4 shows the residual diesel oil after treating the actual contaminated soil artificially contaminated with diesel oil using the novel microorganism Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) of the present invention so that TPH is 5,000, 10,000, 15,000 mg / kg. It is a graph showing the diesel oil removal rate over time by measuring the.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 유류 분해능이 우수한 미생물 슈도모나스 제네코-1(GENECO-1)을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, there is provided a microorganism Pseudomonas geneco-1 (GENECO-1) excellent in oil resolution.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 유류 분해능이 우수한 미생물 슈도모나스 제네코-1을 이용한 유류 오염 물질 처리 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, there is provided a method for treating oil pollutants using microorganism Pseudomonas geneco-1 having excellent oil resolution.
본 발명의 유류 오염 물질 처리 방법에 있어서, 유류 오염 물질로 오염된 토양의 TPH(총석유계탄화수소)는 바람직하기로는 2,000 - 10,000 ppm 이고, 더욱 바람직하기로는 5,000 - 10,000 ppm 이다.In the oil pollutant treatment method of the present invention, TPH (total petroleum hydrocarbon) of soil contaminated with oil pollutant is preferably 2,000 to 10,000 ppm, more preferably 5,000 to 10,000 ppm.
본 발명의 유류 오염 물질 처리 방법에 있어서, 상기 유류에는 가솔린, 디젤유, 등유, 가황유 등이 포함되며, 바람직하기로는 디젤유이다.In the oil pollutant treatment method of the present invention, the oil includes gasoline, diesel oil, kerosene, vulcanized oil and the like, preferably diesel oil.
본 발명에 있어서, "TPH" 라는 용어는, 총석유계탄화수소(Total Petroleum Hydrocarbon)로서, 물 또는 토양 등에 포함되어 있는 원유 농도를 의미한다. 이와 같은 TPH 의 측정은 예를 들면, 미국의 EPA 법 3550M 에 의하여 소닉(sonic) 추출한 후 EPA 8015B 에 의하여 정량분석될 수 있다.In the present invention, the term "TPH" is a total petroleum hydrocarbon (Total Petroleum Hydrocarbon), means a crude oil concentration contained in water or soil. Such measurement of TPH can be quantitated by EPA 8015B after sonic extraction, for example, by US EPA method 3550M.
본 발명에 있어서, "유류(油類)"란 용어는, 광의로는 동ㆍ식물성 기름 및 광물성 기름을 모두 포함한다. 주성분은 탄화수소로서, 원유를 증류시킨 결과 얻을 수 있는 나프타(가솔린), 등유, 디젤유 및 이들을 다양한 사용 목적에 맞추어 가공 처리한 각종 기름도 포함한다.In the present invention, the term "oil" broadly includes both animal and vegetable oils and mineral oils. The main component is a hydrocarbon, and includes naphtha (gasoline), kerosene, diesel oil obtained by distilling crude oil, and various oils processed for various purposes.
본 발명에 있어서 "유류 오염 물질"이라는 용어는, 상기 정의된 바와 같은 유류 중 예를 들면 유류 이송 파이프, 유류 저장 탱크 등에 의하여 통제되지 않은 채, 물(담수 및 해수를 포함함) 또는 토양 등에 유출되어 환경 오염을 야기하는 유류를 의미한다.In the present invention, the term "oil contaminants" refers to the outflow of water (including freshwater and seawater), soil, and the like, out of the oil as defined above, for example, by oil transfer pipes, oil storage tanks, or the like. Means oil that causes environmental pollution.
본 발명에 있어서 "디젤유"란 용어는, 디젤 엔진의 연료로서 알맞은 유류로서 원유를 증류시켜 얻을 수 있으며, 경유 또는 중유 등이 이에 포함된다.In the present invention, the term "diesel oil" can be obtained by distilling crude oil as a suitable oil as a fuel of a diesel engine, and includes light oil or heavy oil.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위하여 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)의 분리 방법을 설명한다.Hereinafter, the separation method of Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) will be described in order to describe the present invention in more detail.
본 발명은 유류 분해능이 탁월한 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 제공한다. 본 발명의 균주는 2002년 10월 12일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KCCM 10435로 기탁되었다.The present invention provides a novel microbial Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) with excellent oil resolution. The strain of the present invention was deposited with the accession number KCCM 10435 to the Korea Microbial Conservation Center on October 12, 2002.
본 발명의 미생물은 다음과 같은 과정에 의하여 분리될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The microorganism of the present invention may be separated by the following process, but is not limited thereto.
오랜 기간 유류 오염에 노출되었던 토양으로부터 디젤을 탄소원으로 한 고체 배지를 이용하여 생육 가능한 균주를 1차 분리한 다음, 1차 분리된 균주를 디젤을 유일한 탄소원으로 첨가한 액체 배지에서 4 일간 배양한 후, 유화 활성도를 측정하여 유화 활성능이 우수한 균주를 2차 분리한다. 2차 분리된 각각의 균주를 단일 탄소원으로서 디젤을 첨가한 액체 배지에 접종하여 4 일간 배양한 후, 배양액 중의 잔류 디젤유의 양을 분석하여 이 중 디젤 분해능이 가장 우수한 균주를 최종 선별하여 동정한다.The isolates were grown on soil that had been exposed to oil pollution for a long time using a solid medium containing diesel as a carbon source, and the first isolated strains were incubated in a liquid medium containing diesel as the only carbon source for 4 days. , By measuring the emulsification activity is separated secondary strain excellent in emulsification activity. Each of the secondary isolates was inoculated in a liquid medium supplemented with diesel as a single carbon source, incubated for 4 days, and then analyzed for the amount of residual diesel oil in the culture, and finally selected and identified among the strains having the highest diesel resolution.
더욱 구체적으로, 다음과 같은 과정에 의하여 분리될 수 있다.More specifically, it may be separated by the following process.
유류 분해능이 있는 미생물을 분리하기 위하여, 오랜 기간 동안 유류 오염에 노출되었던 토양의 시료(예를 들면, 주유소 근처의 토양)를 채취하여 멸균 식염수에 현탁한 다음, 1.0 % 디젤유를 첨가한 기본 배지(Bushnell Hass Medium : Difco)로 제조한 고체 배지를 사용하여 37℃에서 4일간 배양하여 생육 가능한 균주를 1차 분리한다. 상기 1차 분리된 균주를 회수하여 0.2 - 1 % 의 디젤이 유일한 탄소 공급원으로서 함유되어 있는 디젤분해최소배지(Yeast extract 0.1 g/l, NH4NO31 g/l, K2HPO41.5 g/l, NaH2PO40.2 g/l, MgSO4ㆍ7H2O 0.25 g/l, MnSO4ㆍ4H2O 0.05 g/l, CaCl2ㆍ2H2O 0.05g/l)에서 30℃, 180rpm으로 24시간 배양한다. 이 후, 일정량의 배양액을 무균적으로 채취하여 Bioscreen C(Labsystem co, Finlan)로 유화 활성화도를 측정한다. 유화 활성화도가 높은 우수한 균주를 2차 분리하여 이를 다시 디젤분해최소배지에 접종하여 30℃, 180rpm으로 4일간 배양한 후, 가스 크로마토그래피를 이용하여 배양액 중의 잔류 디젤유를 분석하여 균주별 디젤유 분해능을 비교한다. 이와 같이 유류로 오염된 토양으로부터 분리한 각 균주의 유화 활성도 및 디젤유 분해능을 각각 비교하여, 유화 활성도 및 디젤유 분해능이 우수한 균주를 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물 슈도모나스 제네코-1의 세부적인 형태와 크기를 광학현미경(Olympus BS51TR-3200, Japan) 및 주사전자현미경(FE-SEM, HITACHI-S4500II)으로 관찰하여, 그 결과를 표 1 에 기재하였다.To isolate oil-degradable microorganisms, samples of soil that have been exposed to oil contamination for a long time (e.g., soil near gas stations) are taken, suspended in sterile saline, and then based with 1.0% diesel oil. Using a solid medium prepared by (Bushnell Hass Medium: Difco) is cultured for 4 days at 37 ℃ to isolate the first viable strain. By recovering the primary isolated strain, diesel decomposition minimum medium containing 0.2-1% of diesel as the only carbon source (Yeast extract 0.1 g / l, NH4NO31 g / l, K2HPO41.5 g / l, NaH2PO40.2 g / l, MgSO47H2O 0.25 g / l, MnSO44H2O 0.05 g / l, CaCl2ㆍ 2H2Incubate at 30 ° C., 180 rpm for 24 hours at 0.05 g / l. Thereafter, a predetermined amount of the culture is aseptically collected and the emulsion activation is measured by Bioscreen C (Labsystem co, Finlan). Secondary isolates of excellent strains with high emulsification activity were inoculated again in a diesel decomposition minimum medium and incubated at 30 ° C. and 180 rpm for 4 days, followed by analysis of residual diesel oil in culture medium using gas chromatography. Compare the resolution. Thus, the emulsion activity and the diesel oil resolution of each strain isolated from the soil contaminated with oil were compared, respectively. Excellent strains can be isolated. The detailed shape and size of the microorganism Pseudomonas geneco-1 according to the present invention were observed with an optical microscope (Olympus BS51TR-3200, Japan) and a scanning electron microscope (FE-SEM, HITACHI-S4500II), and the results are shown in Table 1. Described.
본 발명에 따른 미생물 슈도모나스 제네코-1의 배양 특성을 표 2 에 기재하였다.The culture characteristics of the microorganism Pseudomonas geneco-1 according to the present invention are described in Table 2.
본 발명의 슈도모나스 제네코-1의 생리생화학적 검사를 API 20NE test strip(bioMerieux Co, France)로 실시하여 그 결과를 각각 표 3 및 표 4 에 기재하였다.The physiological biochemical test of Pseudomonas geneco-1 of the present invention was carried out with an API 20NE test strip (bioMerieux Co, France) and the results are shown in Tables 3 and 4, respectively.
이어서 본 발명의 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 이용하여 유류 오염 물질을 처리하는 방법을 설명한다.Next, a method for treating oil contaminants using the microorganism Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) of the present invention will be described.
본 발명의 미생물을 사용하여 유류 오염 물질을 처리하는 하나의 방법은 본 발명의 미생물을 이용하여 유류로 오염된 토양을 직접 처리(인 시튜(in situ) 생물학적 토양 정화)하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 처리 방법은 오염 토양 주변에 건물이나 지하 관망 등이 있어서 오염 토양을 굴착하기 어려운 상황에서 사용하는데, 바이오벤팅(bioventing) 및 공기 주입법 등을 포함할 수 있으며, 통상적으로 유류 분해능이 있는 미생물을 토양 중에서 활성화시키기 위하여 산소 및 미생물 영양원 등을 공급하여 오염 지역을 복원하는 기술이다.One method of treating oil contaminants using the microorganisms of the present invention may include directly treating (in situ biological soil purification) soils contaminated with oil using the microorganisms of the present invention. This treatment method is used in a situation in which it is difficult to excavate contaminated soil due to a building or underground pipe network around the contaminated soil, and may include bioventing and air injection. It is a technology for restoring contaminated areas by supplying oxygen and microbial nutrient sources for activation.
본 발명의 미생물을 사용하는 유류 오염 물질을 처리하는 또 다른 방법은, 본 발명의 미생물, 담체, 영양 염류 등을 포함하는 오염 토양 정화용 조성물을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 토양 안정용 또는 개량용 물질 또는 수질 개선제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 미생물 또는 유류로 오염된 물 또는 토양의 토착 미생물의 활동성 또는 오염 물질 분해 효소의 발현을 촉진시키는 가속 영양제를 추가로 포함할 수 있다.Another method for treating oil contaminants using the microorganism of the present invention may include providing a composition for purification of contaminated soil comprising the microorganism, carrier, nutrients, etc. of the present invention. Such compositions may further include soil stabilizing or improving substances or water quality improving agents and the like, and accelerated nutrients for promoting the activity of contaminant degrading enzymes or activity of indigenous microorganisms of water or soil contaminated with the microorganisms or oils of the present invention. It may further include.
본 발명의 미생물을 사용하여 유류 오염 물질을 처리하는 또 다른 방법은 본 발명의 미생물을 유류로 오염된 물 또는 토양과 동시에 또는 순차적으로 반응기 내에서 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 반응기는 오염 토양 정화 시스템의 일부를 구성할 수 있다. 이러한 반응기는 통상적으로 오염토양저장조, 오염토양처리조, 배출수저장조와 유수분리기를 포함하며, 외부 기후 변화에 따른 온도 저하로 미생물에 의한 처리효율 저하를 방지하기 위하여 토양 온도를 높이는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물을 반응기 내에서 생장에 적합한 온도, pH 및 영양 염류 조건(본 발명 미생물의 배양 특성은 상기 표 2 에 기재되어 있음)으로 배양하면서, 유류로 오염된 물 또는 토양을 반응기 내로 연속적으로 또는 불연속적으로 공급하므로써 본 발명의 미생물과 오염된 유류를 접촉시킬 수 있다.Another method of treating oil contaminants using the microorganisms of the present invention may include contacting the microorganisms of the present invention in a reactor simultaneously or sequentially with oil or water contaminated. The reactor may form part of a contaminated soil purification system. Such a reactor typically includes a contaminated soil storage tank, a contaminated soil treatment tank, an effluent storage tank and an oil / water separator, and further includes a device for raising the soil temperature to prevent treatment efficiency degradation by microorganisms due to temperature decrease due to external climate change. can do. Continuously introducing oil-contaminated water or soil into the reactor while culturing the microorganism of the present invention at a temperature, pH and nutrient salt conditions suitable for growth in the reactor (the culture characteristics of the microorganism of the present invention are described in Table 2 above). Alternatively, by discontinuous feeding, the microorganism of the present invention can be brought into contact with contaminated oil.
본 발명의 미생물을 사용하여 유류 오염 물질을 처리하는 방법은 단독으로 또는 본 발명의 미생물의 생장 및 유류 분해능을 저해하지 않는 범위 내에서 물리 화학적 방법과 함께 유류로 오염된 물 또는 토양에 사용하는 것을 포함할 수 있다. 통상적인 물리적 오염 토양 처리 방법은 고화 처리, 지중 가열, 지중 유리화 및 지반 동결, 차폐 및 차수막에 의한 방법 등을 포함할 수 있으며, 통상적인 화학적 오염 토양 처리 방법은 토양 세척 및 추출 기술, 토양증기 세척법, 공기 주입법(Air Sparging), 용매추출법 등과 같은 방법을 포함할 수 있다.The method for treating oil contaminants using the microorganism of the present invention is to use oil contaminated water or soil alone or in combination with physicochemical methods within the range that does not inhibit the growth and oil resolution of the microorganism of the present invention. It may include. Conventional physically contaminated soil treatment methods may include solidification treatments, ground heating, ground vitrification and ground freezing, shielding and screening methods, and conventional chemically contaminated soil treatment methods include soil washing and extraction techniques, soil vapor washing, and the like. Method, air sparging, solvent extraction, and the like.
다음의 실시예로서 본 발명을 예시할 수 있다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 좀더 자세하게 설명하고자 하는 것이며, 본 발명의 보호 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.The present invention can be illustrated by the following examples. However, these examples are intended to explain the present invention in more detail, and the protection scope of the present invention is not limited thereto.
실시예 1 : 유류로 오염된 토양으로부터 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)의 분리Example 1 Isolation of Pseudomonas Geneco-1 (KCCM 10435) from Oil-Contaminated Soils
(1) 1차 균주 분리 : 유류로 오염된 토양으로부터 생육 가능한 균주의 분리(1) Primary strain isolation: Isolation of viable strains from oil contaminated soil
유류 분해능이 있는 미생물을 분리하기 위하여, 오랜 기간동안 유류 오염에 노출되었던 토양의 시료(주유소 근처의 토양)를 채취하여 멸균 식염수에 현탁한 다음, 1.0 % 디젤유를 첨가한 기본 배지(Bushnell Hass Medium : Difco)로 제조한 고체 배지를 사용하여 생육 가능한 균주를 1차 분리하였다. 이와 같이 1차 분리된 균주를 다음의 유화 활성화도 평가에서 사용하였다.To isolate oil-degradable microorganisms, samples of soil that have been exposed to oil contamination for a long time (soils near gas stations) are taken, suspended in sterile saline, and then basal medium (Bushnell Hass Medium added 1.0% diesel oil). : The viable strain was first isolated using a solid medium prepared by Difco). This primary isolated strain was used in the next emulsion activation evaluation.
(2) 2차 균주 분리 : 유화 활성화도 평가에 의한 유류 분해능이 우수한 균주의 분리(2) Separation of secondary strains: Isolation of strains excellent in oil resolution by emulsion activation evaluation
상기 1차 분리된 균주를 수거하여 1 % 의 디젤이 유일한 탄소 공급원으로서 함유되어 있는 디젤분해최소배지(Yeast extract 0.1 g/l, NH4NO31 g/l, K2HPO41.5 g/l, NaH2PO40.2 g/l, MgSO4ㆍ7H2O 0.25 g/l, MnSO4ㆍ4H2O 0.05 g/l, CaCl2ㆍ2H2O 0.05g/l)에서 30℃, 180rpm으로 24 일간 배양하였다. 이 후, 일정량의 배양액을 무균적으로 채취하여 Bioscreen C(Labsystem co, Finlan)로 유화 활성화도를 측정하였다. 유화 활성화도가 높은 우수한 균주를 분리하여 다음의 디젤유 분해능 평가에서 사용하였다.The first isolated strain was collected to obtain a diesel decomposition minimum medium containing 1% of diesel as the only carbon source (Yeast extract 0.1 g / l, NH 4 NO 3 1 g / l, K 2 HPO 4 1.5 g / l). , NaH 2 PO 4 0.2 g / l, MgSO 4 .7H 2 O 0.25 g / l, MnSO 4 .4H 2 O 0.05 g / l, CaCl 2 .2H 2 O 0.05 g / l), 30 ° C., 180 rpm, 24 Incubated daily. Thereafter, a predetermined amount of the culture was aseptically collected and the emulsion activation was measured by Bioscreen C (Labsystem co, Finlan). Excellent strains with high emulsification activity were isolated and used in the following diesel oil resolution evaluation.
(3) 최종 선별 : 잔류 디젤유 분석에 의한 최우수 균주의 분리(3) Final screening: Isolation of the best strains by residual diesel analysis
상기 2차 분리된 균주를 다시 디젤분해최소배지에 접종하여 30℃, 180rpm으로 4일간 배양한 후, 가스 크로마토그래피를 이용하여 잔류 디젤유를 측정하여 균주별 디젤유 분해능을 비교하였다. 이렇게 얻은 액체 배양액을 분액 깔때기에 넣은 후, 배양액 내의 유분을 회수하기 위하여 상기 배양액의 2 배에 해당하는 n-헥산을 넣고 잘 혼합되도록 하여 잔류 디젤유가 n-헥산 층으로 옮겨지도록 하였다. 이 후, 혼합물의 n-헥산층이 완전히 분리될 때까지 정치해 둔 다음, n-헥산층을 회수하였다. 이와 같은 과정을 3 회 반복하여 배양액 내의 유분을 완전히 분리하였다. 회수된 n-헥산층을 수거하여 무수 황산 나트륨 20 g 을 채운 화학분석용 여지(Whatma No. 1)에 통과시켜 탈수시켰다. 여액의 용매를 진공 건조기를 이용하여 완전히 제거하여 가스 크로마토그래피의 분석 시료로 사용하였다. 사용된 가스 크로마토그래피는 불꽃 이온화 검출기가 장착된 HP-5890 Plus II(Hewlett Packard)였다. 가스 크로마토그래피의 운반 기체로서 질소를 사용하였으며, 운반 기체의 유속을 13.1 ml/min 로 하였다. 가스 크로마토그래피의 컬럼은 DB-5 GC 컬럼(30 m ×0.53 mm, 1.5 ㎛)을 사용하였다. 컬럼 온도를 2 단계로 나누어 승온시켰는데, 1 단계 승온 온도는 50 - 210 ℃ 로 분당 8 ℃ 씩 증가시켰으며, 2 단계 승온 온도는 210 - 270 ℃ 로 분당 60 ℃ 씩 증가시켰으며, 승온 단계 이후 최종적으로 5 분간 270 ℃ 의 온도를 유지시켰다. 주입구 및 검출기의 온도를 250 ℃ 로 조정한 후 1 ㎕ 의 시료를 주입하여 분석하였다.The secondary isolate was inoculated again in a diesel decomposition minimum medium and incubated at 30 ° C. and 180 rpm for 4 days, and the residual diesel oil was measured using gas chromatography to compare the diesel oil decomposition ability of each strain. The liquid culture solution thus obtained was placed in a separatory funnel, and then n-hexane corresponding to twice the culture medium was added and mixed well to recover the oil in the culture medium so that the residual diesel oil was transferred to the n-hexane layer. Thereafter, the mixture was left to stand until the n-hexane layer of the mixture was completely separated, and then the n-hexane layer was recovered. This process was repeated three times to completely separate the oil in the culture medium. The recovered n-hexane layer was collected and dehydrated by passing it through a chemical analysis room (Whatma No. 1) filled with 20 g of anhydrous sodium sulfate. The solvent in the filtrate was completely removed using a vacuum dryer and used as an analytical sample of gas chromatography. The gas chromatography used was HP-5890 Plus II (Hewlett Packard) with flame ionization detector. Nitrogen was used as a carrier gas for gas chromatography, and the flow rate of the carrier gas was 13.1 ml / min. As a column of gas chromatography, a DB-5 GC column (30 m × 0.53 mm, 1.5 μm) was used. The temperature of the column was increased by dividing the column into two stages. The temperature of the first stage was increased by 8 ℃ per minute to 50-210 ℃, and the temperature of the second stage was increased by 60 ℃ per minute to 210-270 ℃. Finally, the temperature of 270 degreeC was kept for 5 minutes. After adjusting the temperature of the injection hole and the detector to 250 ° C, 1 μl of sample was injected and analyzed.
이와 같이 유화 활성도 및 디젤유 분해능을 각각 비교한 결과, 유류로 오염된 토양에서 분리된 미생물 중 유화 활성도 및 디젤유 분해능이 가장 우수한 미생물을 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)로 명명하고 2002년 10월 12일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁 번호 KCCM 10435 로 기탁하였다.As a result of comparing the emulsification activity and diesel oil resolution, the microorganisms having the highest emulsification activity and diesel oil resolution among the microorganisms separated from the soil contaminated with oil were named Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435). It was deposited with the accession number KCCM 10435 to the Korea Microbiological Conservation Center on the 12th of January.
실시예 2 : 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)의 유화 활성화도 및 디젤 분해능 측정Example 2 Determination of Emulsification Activity and Diesel Resolution of Pseudomonas Geneco-1 (KCCM 10435)
실시예 1 에서와 같이 유류로 오염된 토양으로부터 분리, 선별한 미생물 슈도모나스 제네코-1의 유류 오염 물질 정화 능력을 측정하고자, 다음과 같이 유화 활성화도 및 디젤 분해능을 평가하였다.In order to measure the oil pollutant purification ability of the microorganism Pseudomonas geneco-1 separated and selected from the soil contaminated with oil as in Example 1, the emulsion activation and diesel resolution were evaluated as follows.
(1) 전배양 과정(1) Pre-cultivation process
유화 활성도 및 디젤 분해능 조사를 위하여, 1.0 % 의 디젤이 첨가된 기본 배지(Nutrient Broth : Difco) 5 ml 에 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 한 백금이 접종한 후 30 ℃ 에서 24 시간 동안 180 rpm 으로 진탕 배양하였다.In order to investigate emulsification activity and diesel resolution, 1.0% diesel was added to the basal medium (Nutrient Broth: Difco). 5 ml of Pd inoculated with Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) was incubated at 30 ° C. for 24 hours at 180 rpm.
(2) 유화 활성도 측정(2) emulsion activity measurement
3 개의 Bioscreen C 의 용기에 디젤 농도가 각각 2,000 ppm, 5,000 ppm, 10,000 ppm 인 멸균된 디젤분해최소배지 380 ㎕ 를 첨가한 다음, 상기 (1) 전배양 과정에서 얻은 전배양액을 5 % 의 농도로 접종하여, 30 ℃ 에서 교반없이 7 일간 배양하면서 540 nm 에서의 흡광도를 자동 측정하였다. 흡광도 0.1 을 유화 활성도 1 unit 로 나타내었다. 실험 결과 2,000 - 10,000 ppm 의 다양한 유류 오염 물질 농도 범위에서 본 발명 미생물의 적용이 가능한 것으로 나타났으며, 특히, 10,000 ppm 의 고농도에서도 적용이 가능한 것으로 밝혀졌다.380 μl of sterilized diesel digestion medium containing 2,000 ppm, 5,000 ppm, and 10,000 ppm of diesel concentration were added to three Bioscreen C vessels, and then (1) the pre-culture solution obtained in the pre-culture process was prepared at a concentration of 5%. Inoculation was performed and the absorbance at 540 nm was automatically measured while incubating at 30 ° C. for 7 days without stirring. The absorbance 0.1 was represented by 1 unit of emulsifying activity. Experimental results have shown that the microorganisms of the present invention can be applied to various oil contaminant concentration ranges of 2,000 to 10,000 ppm, and in particular, high concentrations of 10,000 ppm have been found.
(3) 잔류 디젤의 분석(3) analysis of residual diesel
3 개의 배양 용기에 동일한 양의 디젤(1%)을 포함하는 멸균된 디젤분해최소배지 50 ml 를 첨가한 다음, 그 중 2 개의 용기에 상기 (1) 의 전배양 과정에서 얻은 전배양액을 2.0 % 농도로 접종한 다음, 30℃에서 4일간 180rpm으로 진탕 배양하였다(단, 전배양액을 접종한 2 개의 용기 중 하나는 2 일간만 배양하였음). 이후, 실시예 1 의 잔류 디젤 분해능 분석 실험 절차와 동일한 절차로 상기 3 가지 배양 용기 내의 배양액에 대하여 가스 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 가스 크로마토그래피 분석으로 얻은 크로마토그램의 각 피크의 면적을 적분법으로 계산한 결과, 본 발명의 미생물은 저분자 탄화수소는 물론 C16이상의 비교적 고분자의 알칸 계열 탄화수소를 분해 96시간 이내에 95% 이상 분해할 수 있는 것으로 나타났다. 크로마토그램의 각 피크 적분값 및 디젤유 분해율은 하기 표 5에 기재된 바와 같다.Add 50 ml of sterile diesel digestion medium containing the same amount of diesel (1%) to the three culture vessels, and then add 2.0 ml of the preculture obtained in the preculture process (1) to two of them. After inoculation at a concentration, the culture was shaken at 180 rpm for 4 days at 30 ° C. (However, one of the two vessels inoculated with the preculture was incubated for only 2 days). Thereafter, gas chromatography analysis was performed on the culture medium in the three culture vessels in the same procedure as the residual diesel resolution analysis experimental procedure of Example 1. The area of each peak of the chromatogram obtained by gas chromatography analysis was calculated by the integrating method. As a result, the microorganism of the present invention can decompose not only low molecular hydrocarbons but also C 16 or higher relatively alkane hydrocarbons of 95% or more within 96 hours of decomposition. Appeared. Each peak integral value and diesel oil decomposition rate of the chromatogram are as described in Table 5 below.
도 3 및 표 5 에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 미생물은 저분자 탄화수소는 물론 C16이상의 비교적 고분자의 알칸 계열 탄화수소를 분해 96 시간 이내에 95 % 이상 분해할 수 있는 것으로 나타났다. As can be seen in Figure 3 and Table 5 the microorganism of the present invention is a low molecular hydrocarbon as well as C16It has been shown that more than 95% of the relatively high molecular alkanes can be decomposed within 96 hours of decomposition.
실시예 3 : 비교 실시예Example 3: Comparative Example
슈도모나스 제네코-1의 유화활성의 우수성을 확인하기 위하여 n-alkanes의분해능이 있는 슈도모나스 애루지노사 KCTC1636(ATCC 15522, 미국 특허)와 유화활성을 비교하였다. 1.0%의 디젤이 첨가된 기본 배지(Nutrient Broth : Difco) 5 ml에 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)과 슈도모나스 애루지노사 KCTC1636을 한 백금이 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 180rpm으로 진탕배양하였다. 디젤 1%가 첨가된 디젤분해최소배지 5ml 전배양액을 2.0%로 접종한 다음, 30℃에서 4일간 180rpm으로 진탕배양하였다. 배양 후 540nm에서의 흡광도를 측정하여, 흡광도 0.1을 유화 성도 1unit로 하여 유화 활성도를 각각 측정하였는 바, 그 결과를 하기 표 6 에 나타내었다.In order to confirm the excellent emulsification activity of Pseudomonas geneco-1, Pseudomonas aeruginosa KCTC1636 (ATCC 15522, US patent) having a resolution of n-alkanes was compared. 5 ml of 1.0% diesel-containing basic broth (Nutrient Broth: Difco) was inoculated with platinum containing Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) and Pseudomonas aeruginosa KCTC1636 and incubated at 180 rpm for 24 hours at 30 ° C. It was. Inoculated with 2.0% of the pre-culture medium of 5 ml of diesel decomposition medium added with 1% of diesel was shaken at 180 ℃ for 4 days at 30 ℃. After incubation, the absorbance at 540 nm was measured, and emulsification activity was measured using an absorbance of 0.1 as 1 unit, and the results are shown in Table 6 below.
실험 결과 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)이 슈도모나스 애루지노사 KCTC1636에 비하여 우수한 유화활성도를 나타내었다.As a result, Pseudomonas geneco-1 (KCCM 10435) showed better emulsification activity than Pseudomonas aeruginosa KCTC1636.
실시예 4 : 실제 유류 오염 물질의 정화Example 4 Purification of Actual Oil Pollutants
TPH가 각각 5,000, 10,000, 15,000 mg/kg 이 되도록 디젤유로 인공 오염시킨 실제 토양을 슈도모나스 제네코-1으로 처리하여 본 발명의 미생물의 생물학적 분해능을 평가하였다. Batch 실험 결과는, TPH가 5,000 mg/kg인 토양의 디젤유 제거율이 가장 높게 나타났으나, 28일 후에는 TPH가 10,000 mg/kg 인 토양이 67% 로 가장 높은 디젤유 분해율을 나타냈다. 이는 초기 TPH의 농도가 5,000 mg/kg보다 높은 경우, 미생물이 최적 반응 조건을 형성하는데 소요되는 적응 기간이 필요하기 때문인것으로 사료된다.The actual soil artificially contaminated with diesel oil so as to have TPH of 5,000, 10,000, and 15,000 mg / kg was treated with Pseudomonas geneco-1 to evaluate the biodegradability of the microorganism of the present invention. Batch test results showed the highest removal rate of diesel oil in soils with TPH of 5,000 mg / kg, but after 28 days, 67% of soils with 10,000 mg / kg of TPH had the highest diesel oil degradation rates. This may be because if the initial TPH concentration is higher than 5,000 mg / kg, the adaptation period required for the microorganism to form the optimum reaction conditions is necessary.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 다양한 농도의 유류 오염 물질을 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 이용하여 처리하는 경우, 이러한 오염 물질들을 효과적으로 분해, 제거할 수 있다.As described above, according to the present invention, when various concentrations of oil pollutants are treated using Pseudomonas Geneco-1 (KCCM 10435), such pollutants may be effectively decomposed and removed.
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