JP3634883B2 - Thermostable trehalose phosphorylase, method for producing the same, fungus used for the production, and method for producing trehalose using the enzyme - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及びその用途に関するものであり、さらに詳しくは、バチルス属に属する好熱性細菌が産生する高い熱安定性を有する新規なトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、該好熱性細菌、並びに該酵素を用いるトレハロースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質である。
従来、トレハロースを調製する方法としては、酵母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細菌による発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られている。しかし、これらの方法で調製したトレハロースは、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くなり、非常に高価である。
【０００３】
一方、安価にトレハロースを調製する有効な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、茸類であるグリフォラ・フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）（日本農芸化学会誌、６８、５８０、１９９４）やシゾフィラム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、アガリカス・ビスポーラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、プルロータス・オストレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、リフィラム・ウルマリウム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｕｌｍａｒｉｕｍ）（特開平６−１８９７７９）が産生するトレハロースホスホリラーゼを用い、α−グルコース−１−リン酸とグルコースからトレハロースを製造する方法がある。しかし、本製造方法で用いる酵素は熱安定性が低く、反応温度が２５〜５０℃であるため、製造工程で雑菌汚染が起こる可能性が高いといった問題がある。
【０００４】
また、別な酵素法として、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを用い、マルトースを基質としてβ−グルコース−１−リン酸を経てトレハロースを製造する方法がある（特公昭６３−６０９９８）。しかし、本製造法に使用可能な、既知のトレハロースホスホリラーゼは、緑藻であるユーグレナ・グラチリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３２２３〜３２２８，１９７２）が産生するのみで、この酵素の至適温度は４０℃で温度安定性が悪く、しかも調製が非常に難しいので工業的に利用するのは困難であるといった問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
トレハロースを安価に、且つ、工業的規模で製造する方法としてはトレハロースホスホリラーゼを用いた酵素法が最も有効であると考えられる。
一方、工業的に酵素反応で生産を行う場合、雑菌汚染の低減の目的から、反応温度の高温化が一般的に採られている。また、反応温度の高温化は、基質と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くすることができる、酵素反応速度が早くなり反応時間の短縮化ができる等の利点があり、コスト的にも有効である。
このように高温での酵素反応でトレハロースの製造を行うためには、高い熱安定性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼが要求される。しかし、前述の茸類や緑藻類起源のトレハロースホスホリラーゼは熱安定性は必ずしも高くない。
従って、実際の高温酵素反応に適する酵素、具体的には５５℃以上で安定な酵素の提供が求められていた。
【０００６】
本発明者らは高い熱安定性を有し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸からトレハロースを生成する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを自然界より探索した結果、バチルス属に属する好熱性細菌が上記目的にかなう酵素をよく産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明による耐熱性トレハロースホスホリラーゼ標品の性質は以下の通りである。耐熱性トレハロースホスホリラーゼ標品としては実施例１で得られたものを使用した。
尚、トレハロースホスホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２ｇ／ｄｌトレハロース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、２０分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣＩＩ−テストワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該測定値から生成グルコース量を求めた。またトレハロースホスホリラーゼ活性の定義については、上記測定条件下で１分間に１μｍｏｌのトレハロースを加リン酸分解する酵素量を１単位とした。
【０００８】
（１）作用
式（１）で示すように、トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
【０００９】
【化１】
（２）基質特異性
トレハロース、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行ったところ、トレハロース以外にはグルコースの生成がほとんど認められなかった（表１）。
（３）至適温度
４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたところ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベートし、残存活性を測定したところ、６５℃、１５分間処理で無処理の９５％以上の活性を示した（図２）。
【００１１】
（５）至適ｐＨ
２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜７．７）及び２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．７〜９．０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至適ｐＨは６．５〜７．５であった（図３）。
（６）ｐＨ安定性
１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）及び１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いて６０℃で２４時間インキュベートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図４）。
（７）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
（８）分子量
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア・バイオテク（株））を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子量を求めた結果、本酵素の分子量は１１万〜１５万であった。
（９）等電点
等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移動度から等電点は４．６〜５．２であった。
（１０）阻害剤
１ｍＭのＨｇＣｌ２ で９９％、ＺｎＳＯ４ で８０％の活性阻害が見られた（表２）。
【００１２】
本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及び従来公知の微生物由来のトレハロースホスホリラーゼの酵素学的性質を比較して表３に示す。表３から明らかなように、本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼは、既知のトレハロースホスホリラーゼと比べ、少なくとも起源とする菌種、至適温度及び熱安定性が異なるので、新規であると判断された。
【００１３】
本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼはバチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取することによって製造される。
【００１４】
本発明に使用される微生物としてはバチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよい。好適な微生物としてはバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物があげられる。具体的には本発明者らが神奈川県の山中の土壌から分離したバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）が挙げられる。
【００１５】
本菌の菌学的性質は表４に示す通りである。
これらの性質により、「バージェーズ・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー」第８版に基づき本菌をバチルス・ステアロサーモフィラスと同定した。
しかしながら、これまでにバチルス・ステアロサーモフィラスと同定された微生物中でトレハロースホスホリラーゼを産生するものは知られていない。従って、本発明に用いる耐熱性トレハロースホスホリラーゼ生産菌は新規なものであると考えられる。これを確認するために公的菌株機関が保持する同種の菌株のトレハロースホスホリラーゼ生産能について調べたが、トレハロースホスホリラーゼを生産するものはなかった（比較例１）。
【００１６】
本発明で使用する微生物は野性株に限らず、野性株例えば上記ＳＫ−１株を紫外線、エックス線、放射線、薬品〔ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホネート）等〕等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変異株も、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する限り使用できる。
【００１７】
本発明に使用する栄養培地としては炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマルトース、トレハロース、グルコース、フラクトース、糖 、デキストリン、デンプン、グリセリンなどの炭水化物などが用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物が用いられる。
【００１８】
窒素源としてはまたペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテインなどの窒素含有天然物も使用できる。
無機物としてはリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどが用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じ使用する。
【００１９】
次に本発明においては培地中にトレハロースやマルトースをトレハロースホスホリラーゼの誘導物質として存在せしめることなく耐熱性トレハロースホスホリラーゼを生産することが可能であるが、トレハロースやマルトースの存在によって、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの生成量を増加せしめることができる場合がある。
【００２０】
培養法としては液体培養法（振盪培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は４０〜６５℃の範囲で行うことができるが、４５〜６０℃が好適である。ｐＨは６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件によって変わってくるが、通常２４〜８４時間程度であり、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。
【００２１】
このようにして得られた培養物から本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取するには、まず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体画分に分画する。耐熱性トレハロースホスホリラーゼは前述の両画分に検出されるが、主に培養液画分から得られるので、この画分をさらに、限外ろ過、塩析、透析、溶媒沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点沈澱等の周知の単離・精製方法の単独或いは組み合わせに付すことにより、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの濃縮或いは精製標品を得ることができる。本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの単離・精製の具体例を実施例１に示す。
【００２２】
本発明はまた上記耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下にグルコースとβ−グルコース−１−リン酸とを反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法を包含する。この反応は水性媒体中で行う。
この場合に用いられる耐熱性トレハロースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．０の緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、さらに好ましくは６０〜６５℃のいずれかの温度で、特に６５℃で、１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有するものが好適に用いられる。具体的には上記（１）〜（１０）の酵素化学的性質のうち、少なくとも（１）〜（６）および（８）の性質を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は精製酵素であっても、上記トレハロースの製造方法に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有した粗酵素であっても良い。粗酵素としては上記培養液画分等の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ含有画分から塩析または溶媒沈澱により沈澱させた粗酵素、またはこれをさらに前記したような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定化酵素を用いることも可能である。
【００２３】
この反応に用いるグルコースとβ−グルコース−１−リン酸は試薬等であってもよいし、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属細菌が産生する既知のマルトースホスホリラーゼ（特開平１−９７７８、特開昭６０−５４０３６）や市販のマルトースホスホリラーゼをマルトースに作用させて生成したグルコースとβ−グルコース−１−リン酸であってもよい。
水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸・水酸化ナトリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２４】
グルコースとβ−グルコース−１−リン酸の使用比率はモル比で３：１〜１：３、好ましくは１：１が適当であり、酵素は両者のうち少量成分０．１モルに対して０．０５〜１０単位、好ましくは０．１〜１単位が適当である。
上記反応は温度、一般に５５℃以上、雑菌汚染をさらに避けるとともに収率を上げるため好ましくは６０〜７０℃、ｐＨ一般に４．５〜９．０、好ましくは５．５〜８．５で行うのが適当である。上記条件下で十分なトレハロースの生成が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常３０分〜７２時間で終了する。
【００２５】
反応終了後、反応液の加熱による酵素の失活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、エタノール晶出処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせてトレハロースを得ることができる。
【００２６】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。
（培養）
ＳＫ−１株を、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、ポリペプトン１ｇ／ｄｌ、マルトース１ｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）からなる、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌した液体培地に１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養後、遠心分離によって菌体と培養液とを分離した。
【００２７】
（粗酵素の調製）
分離した培養液に硫安を４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、粗酵素液とした。
（イオン交換クロマトグラフィー）
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、５カラム容量の０〜０．４ｍＭＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩後、更に、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
【００２８】
（疎水クロマトグラフィー）
４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、８カラム容量の４０〜０％飽和硫酸アンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
（吸着クロマトグラフィー）
０．３ｍＭとなるようにＣａＣｌ２ を溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＰＥＮＴＡＸ ＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、１０カラム容量の１０〜３００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
【００２９】
（ゲル濾過クロマトグラフィー）
０．２ＭとなるようにＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテク（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
（ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動）
上記精製酵素溶液をネイティブアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバンドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認できた。
【００３０】
実施例２
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
酵母エキス ２ｇ／ｄｌ、ポリペプトン １ｇ／ｄｌ、マルトース １ｇ／ｄｌを含有する培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、ＳＫ−１株を１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離に付して菌体を分離し、上清液に硫安を４０〜８０％飽和となるように溶解し、析出したタンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、１２単位／ｍｌ粗酵素液８ｍｌを得た。
【００３１】
（トレハロースの生成）
この様にして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液０．３ｍｌ（１．５単位／ｍｌ）、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、蒸留水０．２８ｍｌからなる反応液を５５℃、１時間、２時間、１６時間、及び７０℃、１時間インキュベートした。反応の停止は、１０分間の煮沸によって行った。反応終了後、各反応液を、ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｏ８０カラム（２５０ｘ４．６ｍｍφ）（東ソー（株））、溶離液アセトニトリル／水（７６／２４（ｖ／ｖ） ）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））（検出手段）を用いる高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。結果を表５に示す。５５℃、１６時間の反応で生成したトレハロースは２４．３ｍＭであった。
【００３２】
実施例３
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
実施例１で調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液１００ｍｌをＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥト−ヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））１６０ｍｌを充鎮したカラムに吸着させた後、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）と塩化ナトリウム０．４Ｍを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いて８００ｍｌの直線濃度勾配溶出を行った。溶出液８ｍｌずつ分取したところ、フラクション番号５５〜７５の画分に目的の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ活性が認められた。この画分を限外濾過により濃縮、脱塩し、酵素単位１５．５単位／ｍｌの部分精製酵素液２０ｍｌを得た。
【００３３】
（トレハロースの生成）
この様にして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液を約１０倍に希釈したもの０．３ｍｌ（０．４単位／ｍｌ）、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍ，、蒸留水０．２８ｍｌからなる反応液を６５℃で１時間インキュベートした。反応の停止は、１０分間の煮沸によって行った。反応終了後、反応液を、実施例１と同じ条件での高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。生成したトレハロースは１０．９ｍＭであった。
【００３４】
実施例４
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及びマルトースホスホリラーゼの調製）耐熱性トレハロースホスホリラーゼは実施例１と同様にＳＫ−１株の培養液から硫安沈澱によって得た。活性は１．５単位／ｍｌであった。
一方、既知マルトースホスホリラーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）の調製は以下のように行った。酵母エキス０．２ｇ／ｄｌ、ペプトン１ｇ／ｄｌ、マルトース１ｇ／ｄｌ、酢酸ナトリウム１ｇ／ｄｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．０２ｇ／ｄｌ、硫酸マンガン４水和物０．０００２ｇ／ｄｌを含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、ラクトバチルス ブレビスＩＦＯ３３４５を１白金耳植菌し、３０℃で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離に付して菌体を集め、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁後、超音波細胞破砕機により菌体を破砕し、菌体破砕物を遠心分離に付し、上清液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の活性は０．８単位／ｍｌであった。
【００３５】
（トレハロースの生成）
まず、このようにして調製したマルトースホスホリラーゼ粗酵素液０．５ｍｌ（０．４単位／ｍｌ）、７．２ｇ／ｄｌマルトース０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０８ｍｌ、蒸留水０．２２ｍｌからなる反応液を３７℃で１時間インキュベートした。この反応液中には７．０ｍＭのβ−グルコース−１−リン酸が生成していた。
さらに、この反応液１ｍｌに耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液０．１４ｍｌを加え、７０℃で１時間インキュベートした後、１０分間煮沸して反応を停止した。反応終了後、反応液を実施例１と同じ条件での高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。その結果、反応液中には４．６ｍＭのトレハロースが生成していた。
【００３６】
比較例１
これまでにトレハロースホスホリラーゼを産生するバチルス・ステアロサーモフィラスの報告はなく、（財）発酵研究所保存の同種菌株について活性の有無を調べたがトレハロースホスホリラーゼ活性は検出されなかった。すなわち、バチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０、ＩＦＯ１２９８３、ＩＦＯ１３７３７及びＳＫ−１を液体培地（酵母エキス１ｇ／ｄｌ、ポリペプトン２ｇ／ｄｌ、Ｃ源としてトレハロースまたはマルトース２ｇ／ｄｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養し、遠心分離によって菌体と培養液に分けた。菌体は洗浄後、超音波細胞破砕によって菌体内粗酵素液を調製した。培養液は硫安を８０％飽和になるように溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離で回収した。これをリン酸緩衝液に溶解した後、透析を行い菌体外粗酵素液とした。それぞれの粗酵素液は以下の条件で反応を行い、トレハロースの合成を調べることでトレハロースホスホリラーゼ活性の有無を判定した。結果を表６に示す。
【００３７】
反応液：粗酵素液０．３ｍｌ、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、蒸留水０．２８ｍｌ
反 応：５５℃、１６時間
検 出：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））を用いる高速液体クロマトグラフィーによってトレハロースのピークの検出を行った。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によって提供されるトレハロースホスホリラーゼは耐熱性を有し、グルコースとグルコース−１−リン酸からトレハロースを生成する。この酵素を用いて高い反応温度で酵素反応を行うことにより、トレハロースを、雑菌汚染の低減、反応時間の短縮化を図りつつ、工業的に有利に製造することができる。
【００３９】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適温度を示す。
【図２】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの熱安定性を示す。
【図３】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適ｐＨを示す。
【図４】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼのｐＨ安定性を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a novel trehalose phosphorylase, a method for producing the same, a bacterium used for the production, and a use thereof, and more specifically, a novel thermostability produced by a thermophilic bacterium belonging to the genus Bacillus. The present invention relates to trehalose phosphorylase, a production method thereof, the thermophilic bacterium, and a production method of trehalose using the enzyme.
[0002]
[Prior art]
Trehalose is a disaccharide widely distributed in yeast, fungi, bacteria, insects, etc., and is more stable than other disaccharides, so it can be used as a dry protection agent for proteins and the like (Japanese Patent Publication No. Sho 63-5000056). It is a useful carbohydrate.
Conventionally, as a method for preparing trehalose, an extraction method from yeast (JP-A-5-292986), a fermentation method using bacteria (JP-A-5-21882), and the like are known. However, trehalose prepared by these methods is very expensive due to high production costs because mass production is difficult in terms of operation and equipment, and the impurity removal process is complicated.
[0003]
On the other hand, an enzyme method is an effective method for preparing trehalose at low cost. One of them is the moss, Grifola frontosa (Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry, 68, 580, 1994), Schizophyllum commune, Agaricus bisporus, and Pletus Lotus. There is a method of producing trehalose from α-glucose-1-phosphate and glucose using trehalose phosphorylase produced by (Pleurotus ostereatus) and Lyophyllum ulmarium (Japanese Patent Laid-Open No. 6-189779). However, the enzyme used in this production method has low heat stability and a reaction temperature of 25 to 50 ° C., and therefore there is a problem that contamination with bacteria is likely to occur in the production process.
[0004]
As another enzyme method, there is a method of producing trehalose through β-glucose-1-phosphate using maltose as a substrate and maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase (Japanese Patent Publication No. 63-60998). However, the known trehalose phosphorylase that can be used in this production method is only produced by the green alga Euglena gracilis (J. Biol. Chem., 274, 3223-3228, 1972). There is a problem that the optimum temperature is 40 ° C., the temperature stability is poor, and the preparation is very difficult, so that it is difficult to use industrially.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As a method for producing trehalose at low cost and on an industrial scale, an enzymatic method using trehalose phosphorylase is considered to be most effective.
On the other hand, in the case of industrially producing by enzymatic reaction, increasing the reaction temperature is generally employed for the purpose of reducing contamination. In addition, increasing the reaction temperature has the advantages that the solubility of the substrate and the product can be increased to increase the amount charged per unit volume, the enzyme reaction rate can be increased, and the reaction time can be shortened. It is also effective in terms of cost.
Thus, in order to produce trehalose by an enzymatic reaction at a high temperature, a thermostable trehalose phosphorylase having high thermal stability is required. However, trehalose phosphorylase derived from moss and green algae described above is not necessarily high in heat stability.
Accordingly, it has been desired to provide an enzyme suitable for an actual high-temperature enzyme reaction, specifically, an enzyme that is stable at 55 ° C. or higher.
[0006]
As a result of searching for a thermostable trehalose phosphorylase having high thermostability and generating trehalose from glucose and β-glucose-1-phosphate from nature, the present inventors have found that a thermophilic bacterium belonging to the genus Bacillus has the above purpose. The inventors have found that the enzyme can be produced well and completed the present invention.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The properties of the thermostable trehalose phosphorylase preparation according to the present invention are as follows. As the thermostable trehalose phosphorylase sample, the one obtained in Example 1 was used.
Trehalose phosphorylase activity was measured as follows. 0.4 ml of enzyme solution, 0.06 ml of 0.5 M potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0), 0.6 ml of 2 g / dl trehalose, and 0.14 ml of distilled water were mixed and reacted at 60 ° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by boiling for 10 minutes. Next, 0.02 ml was collected from this reaction stop solution, 3 ml of a glucose test reagent (glucose CII-Test Wako; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, reacted at room temperature for 20 minutes, and then the absorbance at 505 nm. Was measured using a spectrophotometer, and the amount of produced glucose was determined from the measured value. Regarding the definition of trehalose phosphorylase activity, the amount of enzyme that phosphorylates 1 μmol of trehalose per minute under the above measurement conditions was defined as 1 unit.
[0008]
(1) As shown by the action formula (1), trehalose is reversibly phosphorolyzed. That is, when it acts on trehalose in the presence of phosphoric acid, it produces equimolar glucose and β-glucose-1-phosphate, and when it acts on glucose and β-glucose-1-phosphate, equimolar trehalose and Produces phosphoric acid.
[0009]
[Chemical 1]
(2) Substrate-specific trehalose, maltose, isomaltose, neotrehalose, cellobiose, sucrose, p-nitrophenyl-α-D-glucoside, p-nitrophenyl-β-D-glucoside as a substrate for phosphorolysis As a result, almost no glucose was observed except for trehalose (Table 1).
(3) Optimal temperature When reacted at various temperatures (40 to 90 ° C.) in 40 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0), the optimal temperature for trehalose phosphorolysis is 70 ° C. to In the vicinity of 75 ° C., about 50% or more of the maximum activity was exhibited in the range of 60 ° C. to 75 ° C. (FIG. 1).
(4) Thermal stability After incubation in 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0) and measurement of residual activity, it showed an activity of 95% or higher when treated at 65 ° C. for 15 minutes. (FIG. 2).
[0011]
(5) Optimum pH
When the reaction was performed at 60 ° C. using 25 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 4.0 to 7.7) and 25 mM Tris / HCl buffer (pH 7.7 to 9.0), the optimum pH was It was 6.5 to 7.5 (FIG. 3).
(6) pH stability Incubate for 24 hours at 60 ° C. with 100 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 4.0 to 8.0) and 100 mM Tris / HCl buffer (pH 7.5 to 9.0). When the residual activity at each pH was measured, the enzyme was stable at pH 6.0 to 8.0 (FIG. 4).
(7)
(8) Molecular weight The molecular weight of this enzyme was 110,000-150,000 by gel filtration chromatography using Superdex 200 pg (Pharmacia Biotech Co., Ltd.) from the relative elution retention time with various standard proteins. It was.
(9) Isoelectric point The isoelectric point was 4.6 to 5.2 from the relative mobility with various standard proteins by isoelectric focusing.
(10) Inhibitor 99% inhibition of activity was observed with 1 mM HgCl 2 and 80% inhibition with ZnSO 4 (Table 2).
[0012]
Table 3 compares the enzymatic properties of the thermostable trehalose phosphorylase of the present invention and the conventionally known microorganism-derived trehalose phosphorylase. As is apparent from Table 3, the thermostable trehalose phosphorylase of the present invention was judged to be novel because at least the bacterial species originating from it, the optimum temperature and the thermal stability were different from those of known trehalose phosphorylase.
[0013]
The thermostable trehalose phosphorylase of the present invention belongs to the genus Bacillus, and is produced by culturing a microorganism having the ability to produce thermostable trehalose phosphorylase in a nutrient medium and collecting the thermostable trehalose phosphorylase produced from the culture.
[0014]
The microorganism used in the present invention may be any microorganism as long as it belongs to the genus Bacillus and has the ability to produce thermostable trehalose phosphorylase. Suitable microorganisms include those belonging to Bacillus stearothermophilus and capable of producing thermostable trehalose phosphorylase. Specifically, Bacillus stearothermophilus SK-1 (FERM P-14567) which the present inventors separated from the soil in the mountains of Kanagawa Prefecture is mentioned.
[0015]
The bacteriological properties of this bacterium are as shown in Table 4.
Based on these properties, the bacterium was identified as Bacillus stearothermophilus based on the 8th edition of “Burgers Manual of Deterministic Bacteriology”.
However, none of the microorganisms identified to date as Bacillus stearothermophilus produces trehalose phosphorylase. Therefore, the thermostable trehalose phosphorylase-producing bacterium used in the present invention is considered to be novel. In order to confirm this, the ability of trehalose phosphorylase production of the same kind of strain held by a public strain organization was examined, but none of them produced trehalose phosphorylase (Comparative Example 1).
[0016]
Microorganisms used in the present invention are not limited to wild strains, but wild strains such as the SK-1 strain described above are ultraviolet rays, X-rays, radiation, chemicals [NTG (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine), EMS (ethyl). Mutants that have been mutated by known artificial mutation means using methanesulfonate, etc.) can be used as long as they have the ability to produce thermostable trehalose phosphorylase.
[0017]
The nutrient medium used in the present invention may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and, if necessary, micronutrients required by the strain used. As the carbon source, carbohydrates such as maltose, trehalose, glucose, fructose, sugar, dextrin, starch and glycerin are used. As the nitrogen source, amino acid such as ammonium chloride, ammonium sulfate, urea, ammonium nitrate, sodium nitrate, and glutamic acid, and inorganic organic nitrogen compounds such as uric acid are used.
[0018]
Nitrogen-containing natural products such as peptone, polypeptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soy flour, soybean meal, dried yeast, casamino acid, soluble vegetable protein can also be used as the nitrogen source.
As the inorganic substance, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and the like are used. In addition, micronutrients such as biotin and thiamine are used as necessary.
[0019]
Next, in the present invention, it is possible to produce thermostable trehalose phosphorylase without causing trehalose or maltose to be present as an inducer of trehalose phosphorylase in the medium, but the presence of trehalose or maltose produces thermostable trehalose phosphorylase. It may be possible to increase the amount.
[0020]
As the culture method, a liquid culture method (shaking culture method or aeration stirring culture method) is preferable, and industrially, the aeration stirring culture method is most suitable. The culture temperature can be in the range of 40 to 65 ° C, but 45 to 60 ° C is preferred. The pH is preferably 6.5 to 7.5. Although the culture period varies depending on the culture conditions, it is usually about 24 to 84 hours. When the production of thermostable trehalose phosphorylase is confirmed, preferably the culture is stopped when the production reaches the maximum.
[0021]
In order to collect the thermostable trehalose phosphorylase of the present invention from the culture thus obtained, first, the culture is fractionated into a culture solution fraction and a cell body fraction by a centrifugal separation method, a filtration method or the like. Thermostable trehalose phosphorylase is detected in both of the above-mentioned fractions, but since it is mainly obtained from the culture broth fraction, this fraction is further purified by ultrafiltration, salting out, dialysis, solvent precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobicity. A heat-stable trehalose phosphorylase concentrated or purified preparation can be obtained by subjecting to well-known isolation / purification methods such as ionic chromatography, gel chromatography, adsorption chromatography, isoelectric point precipitation, etc. alone or in combination. A specific example of isolation and purification of the thermostable trehalose phosphorylase of the present invention is shown in Example 1.
[0022]
The present invention also includes a method for producing trehalose, characterized in that glucose and β-glucose-1-phosphate are reacted in the presence of the thermostable trehalose phosphorylase. This reaction is carried out in an aqueous medium.
The thermostable trehalose phosphorylase used in this case is preferably at a temperature of 50 to 65 ° C. in a pH 6.0 buffer solution such as a 10 mM potassium phosphate / citrate buffer solution (pH 6.0), preferably Those having an activity of 95% or more without treatment after 15 minutes treatment at any temperature of 55 to 65 ° C., more preferably at any temperature of 60 to 65 ° C., particularly at 65 ° C., are suitably used. . Specifically, among the enzyme chemical properties (1) to (10) above, an enzyme having at least the properties (1) to (6) and (8) can be mentioned. These enzymes may be purified enzymes or crude enzymes containing other enzymes that do not adversely affect the trehalose production method. Examples of the crude enzyme include a crude enzyme precipitated from a heat-resistant trehalose phosphorylase-containing fraction such as the above-mentioned culture solution fraction by salting out or solvent precipitation, or a crude enzyme in the middle of purification, which is further purified by the purification means as described above. Can be mentioned. Furthermore, it is also possible to use an immobilized enzyme obtained by immobilizing these enzymes on a carrier by a conventional method.
[0023]
Glucose and β-glucose-1-phosphate used in this reaction may be reagents, etc., or known maltose phosphorylase produced by Lactobacillus or Streptococcus bacteria (Japanese Patent Laid-Open No. 1-9778, Japanese Patent Laid-Open No. 60- 54036) and commercially available maltose phosphorylase may act on maltose and may be glucose and β-glucose-1-phosphate.
Examples of the aqueous medium include water and a buffer solution. As the buffer solution, an acetate buffer solution, potassium phosphate / citrate buffer solution, citrate buffer solution, succinic acid / sodium hydroxide buffer solution, Tris / hydrochloric acid buffer solution and the like can be used.
[0024]
Glucose and β-glucose-1-phosphate are used in a molar ratio of 3: 1 to 1: 3, preferably 1: 1, and the enzyme is 0 per 0.1 mol of the minor component of both. .05 to 10 units, preferably 0.1 to 1 unit is suitable.
The above reaction is carried out at a temperature of generally 55 ° C. or higher, preferably 60 to 70 ° C., and pH of 4.5 to 9.0, preferably 5.5 to 8.5, in order to further avoid contamination and increase the yield. Is appropriate. The reaction is completed when sufficient trehalose is produced under the above conditions, but the reaction is usually completed in 30 minutes to 72 hours.
[0025]
After completion of the reaction, the reaction is stopped by an appropriate means such as deactivation of the enzyme by heating the reaction solution, deactivation of the enzyme by lowering the pH (addition of acid such as hydrochloric acid), activated carbon treatment, ion exchange resin treatment, ethanol Trehalose can be obtained by appropriately combining isolation and purification means such as crystallization treatment.
[0026]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
Example 1
Production and purification of thermostable trehalose phosphorylase by Bacillus stearothermophilus SK-1 (FERM P-14567) was performed as follows.
(culture)
The SK-1 strain was inoculated with 1 platinum ear in a liquid medium consisting of yeast extract 0.5 g / dl, polypeptone 1 g / dl, maltose 1 g / dl (pH 7.0), autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, 55 After aeration and agitation culture at 72 ° C. for 72 hours, the cells and the culture solution were separated by centrifugation.
[0027]
(Preparation of crude enzyme)
Ammonium sulfate is dissolved to 40-60% saturation in the separated culture solution, and the resulting protein precipitate is recovered by centrifugation, dissolved in 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0), and the same. Dialysis was performed against the buffer solution to obtain a crude enzyme solution.
(Ion exchange chromatography)
The crude enzyme solution was added to a column packed with TSKgel DEAE Toyopearl 650M (Tosoh Corp.) equilibrated with 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0). The eluate was collected by elution with a rising concentration gradient of 4 mM NaCl. The active fractions were combined, concentrated and desalted, and further purified by a series of the same chromatographic operations.
[0028]
(Hydrophobic chromatography)
The above partially purified enzyme was packed in a column packed with TSKgel Phenyl Toyopearl 650M (Tosoh Corp.) equilibrated with 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0) in which ammonium sulfate was dissolved to 40% saturation. The solution was added and eluted with a descending concentration gradient of 8 column volumes of 40-0% saturated ammonium sulfate solution to separate the eluate. The active fractions were combined and concentrated and desalted.
(Adsorption chromatography)
The above partially purified enzyme solution was added to a PENTAX GH-0810M column equilibrated with 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0) in which CaCl 2 was dissolved so as to have a concentration of 0.3 mM. Was eluted with an ascending concentration gradient of 10 to 300 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0), and the eluate was collected. The active fractions were combined and concentrated and desalted.
[0029]
(Gel filtration chromatography)
A column packed with Superdex 200 pg (Pharmacia Biotech Co., Ltd.) equilibrated with 10 mM potassium phosphate / citrate buffer solution (pH 6.0) in which NaCl was dissolved to 0.2 M was charged with the partially purified enzyme solution. Added and eluted with the same buffer and fractionated eluate. The active fractions were combined and concentrated and desalted.
(Native acrylamide gel electrophoresis)
When the purified enzyme solution was subjected to native acrylamide gel electrophoresis and the gel was subjected to CBB staining to examine the protein band, only one band was detected, confirming that it was a single protein.
[0030]
Example 2
(Preparation of thermostable trehalose phosphorylase)
100 ml of medium (pH 6.5) containing yeast extract 2 g / dl, polypeptone 1 g / dl, maltose 1 g / dl was placed in a 500 ml Meyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Inoculated with ears and cultured with aeration at 55 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged to separate the cells, and ammonium sulfate was dissolved in the supernatant so as to be 40 to 80% saturated, and the precipitated protein was collected by centrifugation. This was dissolved in 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (pH 6.0) and dialyzed against the same buffer to obtain 8 ml of 12 units / ml crude enzyme solution.
[0031]
(Generation of trehalose)
0.3 ml (1.5 units / ml) of a thermostable trehalose phosphorylase crude enzyme solution thus prepared, 0.12 ml (40 mM) of 6 g / dl glucose, 6 g / dl β-glucose-1-phosphate sodium salt A reaction solution consisting of 2 ml (40 mM), 0.1 ml of 0.5 M acetate buffer (pH 6.0) and 0.28 ml of distilled water was incubated at 55 ° C., 1 hour, 2 hours, 16 hours, and 70 ° C. for 1 hour. . The reaction was stopped by boiling for 10 minutes. After completion of the reaction, each reaction solution was mixed with TSKgelAmido80 column (250 × 4.6 mmφ) (Tosoh Corp.), eluent acetonitrile / water (76/24 (v / v)), flow rate 0.8 ml / min,
[0032]
Example 3
(Preparation of thermostable trehalose phosphorylase)
After adsorbing 100 ml of the thermostable trehalose phosphorylase crude enzyme solution prepared in Example 1 to a column packed with 160 ml of TSKgel DEAE Toyopearl 650M (Tosoh Corp.), 10 mM potassium phosphate / citrate buffer (
[0033]
(Generation of trehalose)
A 10-fold diluted thermostable trehalose phosphorylase crude enzyme solution prepared in this way 0.3 ml (0.4 units / ml), 6 g / dl glucose 0.12 ml (40 mM), 6 g / dl β-glucose- A reaction solution comprising 0.2 ml (40 mM) of 1-phosphate sodium salt, 0.1 m of 0.5 M acetate buffer (pH 6.0) and 0.28 ml of distilled water was incubated at 65 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped by boiling for 10 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography under the same conditions as in Example 1 to quantify the produced trehalose. The produced trehalose was 10.9 mM.
[0034]
Example 4
(Preparation of thermostable trehalose phosphorylase and maltose phosphorylase) In the same manner as in Example 1, thermostable trehalose phosphorylase was obtained from the culture solution of SK-1 strain by ammonium sulfate precipitation. The activity was 1.5 units / ml.
On the other hand, a known maltose phosphorylase (Agric. Biol. Chem., 37, (12), 2813 to 2819, 1973) was prepared as follows. Contains yeast extract 0.2 g / dl, peptone 1 g / dl, maltose 1 g / dl, sodium acetate 1 g / dl, magnesium sulfate heptahydrate 0.02 g / dl, manganese sulfate tetrahydrate 0.0002 g /
[0035]
(Generation of trehalose)
First, 0.5 ml (0.4 units / ml) of maltose phosphorylase crude enzyme solution thus prepared, 0.2 ml (40 mM) of 7.2 g / dl maltose, 0.5 M potassium phosphate / citrate buffer ( A reaction solution consisting of 0.08 ml (pH 6.0) and 0.22 ml distilled water was incubated at 37 ° C. for 1 hour. In this reaction solution, 7.0 mM β-glucose-1-phosphate was produced.
Furthermore, 0.14 ml of a thermostable trehalose phosphorylase crude enzyme solution was added to 1 ml of this reaction solution, and incubated at 70 ° C. for 1 hour, followed by boiling for 10 minutes to stop the reaction. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography under the same conditions as in Example 1 to quantify the produced trehalose. As a result, 4.6 mM trehalose was produced in the reaction solution.
[0036]
Comparative Example 1
There have been no reports of Bacillus stearothermophilus that produces trehalose phosphorylase so far, and the presence or absence of activity was examined for the same strains stored at the Fermentation Laboratory, but no trehalose phosphorylase activity was detected. That is, Bacillus stearothermophilus IFO12550, IFO12983, IFO13737 and SK-1 were inoculated into a liquid medium (yeast extract 1 g / dl, polypeptone 2 g / dl, trehalose or maltose 2 g / dl, pH 7.0 as C source). The culture was aerated and stirred at 55 ° C. for 72 hours, and the cells were separated into cells and culture solution by centrifugation. After washing the cells, a crude enzyme solution was prepared by ultrasonic cell disruption. In the culture solution, ammonium sulfate was dissolved to 80% saturation, and the resulting protein precipitate was collected by centrifugation. This was dissolved in a phosphate buffer and then dialyzed to obtain an extracellular crude enzyme solution. Each crude enzyme solution reacted under the following conditions, and the presence or absence of trehalose phosphorylase activity was determined by examining the synthesis of trehalose. The results are shown in Table 6.
[0037]
Reaction solution: 0.3 ml of crude enzyme solution, 0.12 ml (40 mM) of 6 g / dl glucose, 0.2 ml (40 mM) of 6 g / dl β-glucose-1-phosphate sodium salt, 0.5 M acetate buffer (
Reaction: 55 ° C., 16 hours Detection: Trehalose peak was detected by high performance liquid chromatography using TSKgel Amido80 column (Tosoh Corporation).
[0038]
【The invention's effect】
The trehalose phosphorylase provided by the present invention has heat resistance and produces trehalose from glucose and glucose-1-phosphate. By carrying out an enzyme reaction at a high reaction temperature using this enzyme, trehalose can be advantageously produced industrially while reducing contamination and reducing the reaction time.
[0039]
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
[Table 4]
[Table 5]
[Table 6]
[Brief description of the drawings]
1 shows the optimum temperature of the thermostable trehalose phosphorylase obtained in Example 1. FIG.
FIG. 2 shows the thermal stability of the thermostable trehalose phosphorylase obtained in Example 1.
FIG. 3 shows the optimum pH of the thermostable trehalose phosphorylase obtained in Example 1.
4 shows the pH stability of the thermostable trehalose phosphorylase obtained in Example 1. FIG.
Claims (6)
（１）作用
トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
（２）基質特異性
トレハロースに特異的に作用する。
（３）至適温度
トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６５℃、１５分間処理後に無処理の９５％以上の活性を有する。
（５）至適ｐＨ
６．５〜７．５
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ６．０〜８．０で安定。
（７）分子量
１１万〜１５万（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇを用いるゲルろ過クロマトグラフィーによる）。Thermostable trehalose phosphorylase with the following enzymatic chemistry:
(1) Action Trehalose is reversibly phosphorolyzed. That is, when it acts on trehalose in the presence of phosphoric acid, it produces equimolar glucose and β-glucose-1-phosphate, and when it acts on glucose and β-glucose-1-phosphate, equimolar trehalose and Produces phosphoric acid.
(2) Acts specifically on substrate-specific trehalose.
(3) Optimum temperature The optimum temperature for the trehalose phosphorolysis reaction is about 70 ° C to 75 ° C, and shows about 50% or more of the maximum activity in the range of 60 ° C to 75 ° C.
(4) Thermal stability In a 10 mM potassium phosphate / citrate buffer solution (pH 6.0), it has an activity of 95% or more without treatment after being treated at 65 ° C. for 15 minutes.
(5) Optimum pH
6.5-7.5
(6) pH stability Stable at pH 6.0 to 8.0.
(7) Molecular weight 110,000-150,000 (by gel filtration chromatography using Superdex 200 pg).
（１）作用
トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
（２）基質特異性
トレハロースに作用するが、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドには作用しない。
（３）至適温度
トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６５℃、１５分間処理後に無処理の９５％以上の活性を有する。
（５）至適ｐＨ
６．５〜７．５
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ６．０〜８．０で安定。
（７）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
（８）分子量
１１万〜１５万（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇを用いるゲルろ過クロマトグラフィーによる）。
（９）等電点
４．６〜５．２。
（１０）阻害剤
Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋で活性が著しく阻害される。Thermostable trehalose phosphorylase with the following enzymatic chemistry:
(1) Action Trehalose is reversibly phosphorolyzed. That is, when it acts on trehalose in the presence of phosphoric acid, it produces equimolar glucose and β-glucose-1-phosphate, and when it acts on glucose and β-glucose-1-phosphate, equimolar trehalose and Produces phosphoric acid.
(2) Acts on substrate-specific trehalose but does not act on maltose, isomaltose, neotrehalose, cellobiose, sucrose, p-nitrophenyl-α-D-glucoside, p-nitrophenyl-β-D-glucoside .
(3) Optimum temperature The optimum temperature for the trehalose phosphorolysis reaction is about 70 ° C to 75 ° C, and shows about 50% or more of the maximum activity in the range of 60 ° C to 75 ° C.
(4) Thermal stability In a 10 mM potassium phosphate / citrate buffer solution (pH 6.0), it has an activity of 95% or more without treatment after being treated at 65 ° C. for 15 minutes.
(5) Optimum pH
6.5-7.5
(6) pH stability Stable at pH 6.0 to 8.0.
(7) Deactivation 100% deactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes.
(8) Molecular weight 110,000-150,000 (by gel filtration chromatography using Superdex 200 pg).
(9) Isoelectric point 4.6-5.2.
(10) Activity is significantly inhibited by the inhibitors Hg 2+ and Zn 2+ .
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